Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Зорина, Анна Алексеевна

• Зорина, Анна Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зорина, Анна Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Цианобактерии как модельный объект.

Серин-треониновые протеинкиназы цианобактерий.

Структура серин-треониновых протеинкиназ.

Классификация СТПК цианобактерий.

Расположение СТПК в сигнальном каскаде.

Регуляция активности протеинкиназ.

Исследование функций СТПК.

Современные методы исследования протеома.

Системы восприятия и передачи высокотемпературного стрессового сигнала.

Ответ на тепловой стресс.

Шаперонные системы Synechocystis.

Роль фосфорилирования в регуляции активности шаперонных систем.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы, использованные в работе, и условия культивирования.

2.2. Конструирование мутантных штаммов Synechocystis дефектных по генам СТПК и hrcA.

2.3. Штаммы Е. coli, использованпые в работе.

2.4. Трансформация клеток цианобактерий.

2.5. Условия культивирования.

2.6. Измерение параметров роста.

2.7. Исследование ультраструктуры клеток Synechocystis методом электронной микроскопии.

2.8. Выделение общей клеточной РНК.

2.9. Нозерн-блот гибридизация.

2.10. Выделение фракции растворимых белков.

2.11. Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным электрофорезом (2-DE).

2.12. Вестерн блоттинг.

2.13. Получение рекомбинантного белка GroES.

2.14. Фосфорилирование GroES in vitro.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание коллекции мутантов по генам СТПК.

3.2. Скрининг коллекции мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации.

3.3. Изучение параметров роста и морфологических характеристик мутантов AspkH и AspkK, отобранных по результатам первичного скрининга.

3.4. Анализ динамики экспрессии генов, индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации.

3.5. Исследование динамики экспрессии стресс-индуцируемых генов у двойного мутанта AspkH IAspkK.

3.6. Фосфорилирование фракции растворимых белков Synechocystis по серину и треонину в ответ на высокотемпературное воздействие.

3.7. Идентификация фосфорилированных белков при помощи MALDI-TOFMS

3.8. Получение рекомбинантного белка GroES.

3.9. Белок GroES - субстрат фосфорилирования in vitro для протеинкиназ SpkC/F/K.

3.10. Серин-треониновое фосфорилирование растворимых белков в клетках мутантов ДhrcA и Ahik34: возможное взаимодействие серин-треониновых протеинкиназ с транскрипционным фактором НгсА и/или с гистидинкиназой Hik34.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803»

Каждый организм в течение жизни подвергается воздействию огромного количества факторов. «Успешность» его приспособления к изменяющимся условиям окружающей среды зависит от слаженности работы систем восприятия и передачи сигналов, от перестройки внутриклеточных процессов, от эффективности работы шаперонных систем и протеаз.

Ключевым регуляторным механизмом при передаче сигналов, как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, является фосфорилирование белков. Этот процесс катализируется ферментами - протеинкиназами, которые подразделяются на несколько групп в зависимости от их субстратной специфичности: гистидиновые, серин-треониновые и тирозиновые протеинкиназы.

В клетках эукариот основными компонентами систем передачи сигналов являются серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), тогда как для прокариот долгое время характерными считались исключительно двухкомпонентные системы восприятия и передачи сигналов, состоящие из сенсорных гистидинкинз и соответствующих им регуляторов ответа.

В настоящее время благодаря проектам по определению нуклеотидных последовательностей целых геномов, гомологи СТПК эукариотического типа были обнаружены у множества бактерий (Kennelly, 2002; 2003). Так, в геноме Bacillus subtilis обнаружено 4 гена (Kunst et al., 1997), у Mycobacterium tuberculosis - 11 генов (Molle & Kremer, 2010), а в геноме Myxococcus xanthus закодировано почти 100 генов протеинкиназ эукариотического типа (Nariya & Inoue, 2005). Изученные СТПК бактерий вовлечены в регуляцию работы ферментов первичного метаболизма, а также контролируют экспрессию некоторых генов.

Среди цианобактерий распространение данного типа ферментов неоднородно. Например, в геноме Anabaena sp. РСС 7120 (Kaneko et al., 2001; Ohmori et al., 2001) и Synechocystis sp. PCC 6803 (Kaneko et al., 1996; 2003) обнаружено, соответственно, 52 и 12 генов, кодирующих СТГПС (Leonard et al., 1998).

К настоящему времени функционально охарактеризованы лишь немногие СТПК. Показано, что гены spkA (Kamei et al., 2001; Panichkin et al., 2006) и spkB (Kamei et al., 2003) кодируют белки, принимающие участие в формировании пилей и контролирующие подвижность клеток Synechocystis. Протеинкиназа SpkC может участвовать в регуляции азотного метаболизма (Галкин с соавт., 2003), a SpkD, по всей видимости, вовлечена в регуляцию соотношения метаболитов цикла трикарбоновых кислот в зависимости от количества неорганического углерода в питательной среде (Laurent et al., 2008). Тем не менее, функции большинства СТПК цианобакггерий остаются неизученными. Кроме того, сведения о потенциальных субстратах протеинкиназ в клетках этих организмов скудны и разрозненны.

В связи с этим исследование участия протеинкиназ эукариотического типа в ответе на тепловой стресс представляет значительный научный интерес.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящей работы было изучение роли серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Получить мутантные штаммы Synechocystis дефектные по генам СТПК и изучить фенотипические проявления мутаций в нормальных условиях и при высокотемпературном стрессе.

2. Изучить динамику транскрипции генов, индуцируемых высокими температурами, в клетках дикого типа и в полученных мутантных штаммах.

3. Изучить влияние высокотемпературного стресса на фосфорилирование in vitro белков, выделенных из клеток Synechocystis.

4. Провести поиск предполагаемых клеточных субстратов СТПК.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Зорина, Анна Алексеевна

выводы

1. Мутант /\spkK по сравнению с диким типом и АяркН характеризуется повышенной жизнеспособностью в условиях теплового шока.

2. Показаны различия в ультраструктуре клеток дикого типа и мутантных штаммов ЬдркН и АзркК, свидетельствующие о связи повышенной жизнеспособности мутанта АчркК в условиях стресса с особенностями накопления включений на начальных стадиях теплового шока.

3. У мутантов по серин-треониновым протеинкиназам БркК и БркН экспрессия генов, индуцируемых тепловым стрессом, снижается.

4. Мутант АъркК отличается от дикого типа и АъркН по кинетике экспрессии генов, активируемых повышенной температурой, в то время как у двойного мутанта АчркН/АчркК этих отличий не обнаружено.

5. Отличий в наборе фосфорилируемых белков у дикого типа и мутантов в оптимальных условиях роста не выявлено, тогда как уровни фосфорилирования индивидуальных полипептидов различались.

6. Идентифицированы белки, подвергающиеся модификации по остаткам серина и/или треонина в условиях теплового стресса.

7. Показано участие серин-треониновых протеинкиназ БркС, 8ркР и 8ркК в фосфорилировании рекомбинантного белка ко-шаперонина ОгоЕ8.

8. Предложена возможная схема участия серин-треониновых протеинкиназ в формировании функционального комплекса ОгоЕ8Ь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Скрининг библиотеки мутантов Synechocystis дефектных по генам СТПК показал, что транскрипция генов, кодирующих белки теплового шока, у штаммов AspkH и AspkK существенно отличается от дикого типа. Различия касаются, в основном, динамики накопления транскриптов, что свидетельствует об участии этих протеинкиназ в регуляции экспрессии генов белков теплового шока. Изучение влияния теплового стресса на транскрипцию генов у двойного мутанта AspkH/AspkK свидетельствует о наличии каких-то дополнительных участников в пути регуляции ответов клеток на тепловой стресс.

СТПК фосфорилируют несколько белков в оптимальных условиях роста. Тепловой стресс вызывает изменения в интенсивности фосфорилирования этих белков. Нам удалось показать, что низкомолекулярный ко-шаперонин GroES, подобно 60-кДа шаперону GroEL, подвергается фосфорилирустся серин-треониновыми киназами. Мы обнаружили, что серин-треониновые протеинкиназы SpkC, SpkF и SpkK отвечают за фосфорилирование рекомбинантного белка GroES in vitro. Фосфорилирование по остаткам серина и треонина в клетках Synechocystis протекает интенсивно и конститутивно при нормальной температуре роста, хотя эксперименты in vitro с рекомбинантным GroES свидетельствует о возможности активации СТПК при тепловом стрессе.

Основываясь на полученных в нашей работе данных, можно представить последовательность событий, происходящих в клетках Synechocystis, испытывающих кратковременный температурный стресс.

В клетках дикого типа гистидинкиназа Hik34 и фактор транскрипции НгсА репрессируют транскрипцию оперона groESL при оптимальной для роста температуре. Тем не менее, экспериментально подтверждено присутствие и GroES, и GroEL в фосфорилированной форме в экстрактах белков из клеток, выращенных при 32°С. Это указывает на то, что Hik34 и/или НгсА репрессируют транскрипцию не полностью.

Мы предполагаем, что фосфорилирование по остаткам серина и треонина, по крайней мере, в случае ОгоЕЭ и ОгоЕЬ, осуществляется конститутивно и зависит только от количества доступного субстрата. Чем больше вгоЕБ синтезируется в клетках, тем выше наблюдаемая степень фосфорилирования.

Тепловой стресс вызывает индукцию транскрипции оперона groESL, накопление в клетке ОгоЕЬ и ОгоЕБ и обеспечивает достаточные количества субстрата для СТПК, которые фосфорилируют эти шаперонины, что, согласно принятой в настоящее время схеме, облегчает их олигомеризацию.

Мутации в генах Мк34 и ИгсА выражаются в конститутивной экспрессии groESL оперона. Белки ОгоЕЬ и ОгоЕ8 накапливаются в значительных количествах и подвергаются фосфорилированию СТПК, которое не зависит от температуры. Таким образом, полученные нами данные о существовании фосфорилированной формы вгоЕ8 дают основания предполагать, что серин-треониновое фосфорилирование этого ко-шаперонина может быть чрезвычайно важным механизмом формирования функционального олигомерного ОгоЕ комплекса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зорина, Анна Алексеевна, 2010 год

1. Галкин А.Н., Михеева Л.Е., Шестаков С.В. (2003) Инсерционная инактивация генов, кодирующих серин/треониновые протеинкиназы эукариотического типа у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Микробиология, 71, 64-69.

2. Маркелова А.Г., Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1990) Ультраструктурная локализация РБФК в клетках водорослей. Физиология растений, 37, 907-911.

3. Absalon С., Obuchowski М., Madec Е., Delattre D., Holland I.B., Seror S.J.2009) CpgA, EF-Tu and the stressosome protein YezB are substrates of the Ser/Thr kinase/phosphatase couple, PrkC/PrpC, in Bacillus subtilis. Microbiology SGM, 155, 932-943.

4. Akamine P., Madhusudan, Wu J., Xuong N.-H., Ten Eyck L.F., Taylor S.S.2003) Dynamic features of cAMP-dependent protein kinase revealed by apoenzyme crystal structure. J. Mol. Biol, 327, 159-171.

5. Ashby M.K., Houmard J. (2006) Cyanobacterial two-component proteins: structure, diversity, distribution, and evolution. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 472509.

6. Ayub N.D., Pettinari M.J., Ruiz J.A., Lopez N.I. (2004) A polyhydroxybutyrate-producing Pseudomonas sp. isolated from antarctic environments with high stress resistance. Curr. Microbiol, 49, 170-174.

7. Besant P.G., Attwood P.V (2009) Detection and analysis of protein histidine phosphorylation. Mol Cell Biochem., 329, 93-106.

8. Bhattacharya A., Kurochkin A.V., Yip G.N.B., Zhang Y., Bertelsen E.B., Zuiderweg E.R.P. (2009) Allostery in the Hsp70 chaperones is transduced by subdomain rotations. J. Mol. Biol., 388, 475-490.

9. Bigotti M.G, Clarke A.R, Burston S.G. (2006) The Hsp60 chaperonins from prokaryotes and eukaryotes. Topics in Current Genetics, 16, 251-283.

10. Buchner J. (2010) Bacterial Hsp90 desperately seeking clients. Mol. Microbiol, 76, 540-544.

11. Caspers G.J., Leunissen J.A., de Jong W.W. (1995) The expanding small heat-shock protein family, and structure predictions of the conserved "a-crystallin domain". J. Mol. Evol. 40, 238-248.

12. Chaba R., Raje M., Chakraborti P.K. (2002) Evidence that a eukaryotic-type serine/threonine protein kinase from Mycobacterium tuberculosis regulates morphological changes associated with cell division. Eur. J. Biochem., 269, 10781085.

13. Chao J.D., Papavinasasundaram K.G., Zheng X., Chavez-Steenbock A., Wang

14. X., Lee G.Q., Av-Gay Y. (2010) Convergence of Ser/Thr and two-componentsignaling to coordinate expression of the dormancy regulon in Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem., 285, 29239-29246.

15. Digel I., Kayser P., Artmann G.M. (2008) Molecular processes in biological thermosensation. J. Biophys., 2008, Article ID 602870, 9 pages, 2008. doi: 10.1155/2008/6028702008.

16. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. (2002) Protein folding and degradation in bacteria: To degrade or not to degrade? That is the question. Cell. Mol. Life Sci., 59, 1607-1616.

17. Dutta R., Quin L., Inouye M. (1999) Histidine kinases: diversity of domain organization. Mol. Microbiol., 34, 633-640.

18. Enami M., Ishihama A. (1984) Protein phosphorylation in Escherichia coli and purification of a protein kinase. J. Biol. Chem., 259, 526-533.

19. Eymann C., Becher D., Bernhardt J., Gronau K, Klutzny A., Hecker M. (2007) Dynamics of protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis Proteomics, 7, 3509-3526.

20. Fabret C., Feher V.A., Hoch J.A. (1999) Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world. J. Bacteriol., 181, 1975-1983.

21. Giese K.C., Basha E., Catague B.Y., Vierling E. (2005) Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102, 18896-18901.

22. Gonzalez L., Phalip V., Zhang C.-C. (2001) Characterization of PknC, a Ser/Thr kinase with broad substrate specificity from the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. Eur. J. Biochem., 268, 1869-1875.

23. Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. (2004) Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics, 4, 3665-3685.

24. Grallert H., Buchner J. (2001) A structural view of the GroE chaperone cycle. J. Struct. Biol, 135, 95-103.

25. Grigorieva G.A., Shestakov S.V. (1982) Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Lett., 13, 367-370.

26. Han G., Zhang C.-C. (2001) On the origin of Ser/Thr kinases in a prokaryote. FEMS Microbiol Lett., 200, 79-84.

27. Hanks S.K. (2003) Genomic analysis of the eukaryotic protein kinase superfamily: a perspective. Genome Biol., 4, 111.

28. Hanks S.K., Hunter T. (1995) Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. J.FASEB, 9, 576596.

29. Hanlon W.A., Inouye M., Inouye S. (1997) Pkn9, a Ser/Thr protein kinase involved in the development of Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol, 23, 459-471.

30. Harris S.F., Shiau A.K., Agard D.A. (2004) The crystal structure of the carboxy-terminal dimerization domain of HtpG, the Escherichia coli Hsp90, reveals a potential substrate binding site. Structure, 12, 1087-1097.

31. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci., 59, 1649-1657.

32. Haslbeck M., Franzmann T., Weinfurtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 842-846.

33. Hermann T., Pfefferle W., Baumann C., Busker E., Schaffer S., Bott M., Sahm H., Dusch N., Kalinowski J., Piihler A., Bendt A.K., Kramer R., Burkovski A.2001) Proteome analysis of Corynebacterium glutamicum. Electrophoresis, 22, 1712-1723.

34. Horwich A.L., Farr G.W., Fenton W.A. (2006) GroEL-GroES-mediated protein folding. Chem. Rev., 106, 1917-1930.

35. Huckauf J., Nomura C., Forchhammer K., Hagemann M. (2000) Stress responses of Synechocystis sp. strain PCC 6803 mutants impaired in genes encoding putative alternative sigma factors. Microbiology SGM, 146, 2877-2889.

36. Ikeuchi M., Tabata S. (2001) Synechocystis sp. PCC 6803 a useful tool in the study of the genetics of cyanobacteria. Photosynth. Res., 70, 73-83.

37. Inaba M., Suzuki I., Szalontai B., Kanesaki Y., Los D.A., Hayashi H., Murata N.2003) Gene-engineered rigidification of membrane lipids enhances the cold inducibility of gene expression in Synechocystis. J. Biol Chem., 278, 12191-12198.

38. Jakob U., Meyer I., Bugl H., Andre S., Bardwell J.C.A., Buchner J. (1995) Structural organisation of prokaryotic and eukaryotic Hsp90. J Biol Chem., 270, 14412-14419.

39. Johnson L.N., Lewis R.J. (2001) Structural basis for control by phosphorylation. Chem Rev, 101, 2209-2242.

40. Johnson L.N., Lowe E.D., Noble M.E.M., Owen D.J. (1998) The structural basis for substrate recognition and control by protein kinases. FEBSLett., 430, 1-11.

41. Johnson L.N., Noble M.E.M., Owen D.J. (1996) Active and inactive Protein Kinases: Structural Basis for Regulaton. Cell. 85, 149-158.

42. Johnson S.A., Hunter T. (2005) Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nature methods, 2, 17-25.

43. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y. (2005) Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates Critical Rev. Microbiol, 31, 55-67.

44. Kamei A., Yoshihara S., Yuasa T., Geng X., Ikeuchi M. (2003) biochemical and functional characterization of a eukaryotic-type protein kinase, SpkB, in the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Curr. Microbiol, 46, 296-301.

45. Kamei A., Yuasa T., Geng X., Ikeuchi M. (2002) Biochemical examination of the potential eukaryotic-type protein kinase genes in the complete genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Res., 9, 71-78.

46. Kamei A., Yuasa T., Orikawa K., Xing Geng X., Ikeuchi M. (2001) A eukaryotic-type protein kinase, SpkA, is required for normal motility of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J! Bacteriol., 183, 1505-1510.

47. Kaneko T., Nakamura Y., Sasamoto S., Watanabe A., Kohara M., Matsumoto M., Shimpo S., Yamada M., Tabata S. (2003)" Structural analysis of four large plasmids harboring in a unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803 DNARes., 10, 221-228.

48. Kennelly P.J. (2002) Protein kinases and protein phosphatases in prokaryotes: a genomic perspective. FEMS Microbiol. Lett., 206, 1-8.

49. Kennelly P.J. (2003) Archaeal protein kinases and protein phosphatases: insights from genomics and biochemistry. J. Biochem., 370, 373-389.

50. Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H.-H., Buchner J. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Nature Biotechnology, 9, 825-829.

51. Kiseleva L.L., Serebriiskaya T.S., Horvath I., Vigh L., Lyukevich A.A., Los D.A.2000) Expression of the gene for the A9 acyl-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J. Mol Microbiol. Biotechnol., 2, 331-338.

52. Klumpp S., Krieglstein J. (2002) Phosphorylation and dephosphorylation of histidine residues in proteins. Eur. J. Biochem., 269, 1067-1071.

53. Koksharova O.A., Wolk C. P. (2002) Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 123-137.

54. Koonin E.V., Mushegian A.R., Galperin M.Y., Walker D.R. (1997) Comparison of archaeal and bacterial genomes: computer analysis of protein sequences predicts novel functions and suggests a chimeric origin for the archaea. Mol. Microbiol., 25, 619-637.

55. Krupa A., Srinivasan N. (2005) Diversity in domain architectures of Ser/Thr kinases and their homologues in prokaryotes. BMC Genomics, 6, 129.

56. Kumar C.M., Khare G., Srikanth C.V., Tyagi A.K., Sardesai A.A., Mande S.C.2009) Facilitated oligomerization of mycobacterial GroEL: evidence for phosphorylation-mediated oligomerization. J. Bacteriol, 191, 6525-6538.

57. Labarre J., Chauvat F., Thuriaux P. (1989) Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol, 171, 3449-3457.

58. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

59. Laurent S., Jang J., Janicki A., Zhang C.-C., Bedu S. (2008) Inactivaton of spkD, encoding a Ser/Thr kinase, affects the pool of the TCA cycle metabolites in Synechocyctis sp. strain PCC 6803. Microbiology SGM, 154, 2161-2167.

60. Lee S., Owen H.A., Prochaska D.J., Barnum S. (2000) HSP16.6 is involved in the development of thermotolerance and thylakoid stability in the unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Curr. Microbiol., 40, 283-287.

61. Lehel C., Los D.A., Wada H., Gyorgyey A., Horvath I., Kovacs E., Murata N., Vigh L. (1993) A second groEL-like gene, organized in a groESL operon is present in the genome of Synechocystis sp. PCC6803. J. Biol. Chem., 268, 1799-1804.

62. Leonard C.J., Aravind L., Koonin E.V. (1998) Novel families of putative protein kinases in bacteria and archaea: evolution of the "eukaryotic" protein kinase superfamily. Genome Res., 8, 1038-1047.

63. Lin W.-J., Walthers D., Connelly J.E., Burnside K., Jewell K.A., Kenney L.J., Rajagopal L. (2009) Threonine phosphorylation prevents promoter DNA binding of the Group B Streptococcus response regulator CovR Mol. Microbiol., 71, 1477-1495.

64. Lin Z., Madan D., Rye H.S. (2008) GroEL stimulates protein folding through forced unfolding. Nature Structural & Molecular Biol., 15, 303-311.

65. Los D.A., Zorina A, Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V.2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors, 10, 23862415.

66. Lux R., Shi W. (2005) A novel bacterial signalling system with a combination of a Ser/Thr kinase and a His/Asp two-component system. Mol. Microbiol., 58, 345-348.

67. Macek B., Gnad F., Soufi B., Kumar C., Olsen J.V., Mijakovic I., Mann M.2008). Phosphoproteome analysis of E. coli reveals evolutionary conservation of bacterial Ser/Thr/Tyr phosphorylation. Mol. Cell Proteomics, 7, 299-307.

68. Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 933 p.

69. Mann M., Ong S.-En, Grenborg M., Steen H., Jensen O.N., Pandey A. (2002) Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. Trends in Biotechnology, 20, 261-268.

70. Mascher T., Helmann J.D., Unden G. (2006) Stimulus perception in bacterial signal-transducing histidine kinases Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 910-938.

71. Mayer M.P., Bukau B. (2005) Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 62, 670-684.

72. Merrill R.A., Strack S. (2007) Protein kinases and phosphatases. In: Molecular Pain. Zhuo M. ed., Chapter 15, Higher Education Press, Beijin, China, p. 187-205.

73. Mizuno T. (1997) Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal transducers in the genome of Escherichia coli. DNA Res., 4, 161-168.

74. Molle V., Kremer L. (2010) Division and cell envelope regulation by Ser/Thr phosphorylation: Mycobacterium shows the way. Mol. Microbiol., 75, 1064-1077.

75. Muñoz -Dorado J., Inouye, S., Inouye M. (1991) A gene encoding a protein serine/threonine kinase is required for normal development of Myxococcus xanthus, a gram-negative bacterium. Cell, 67, 995-1006.

76. Nakamoto H., Honma D. (2006) Interaction of a small heat shock protein with light-harvesting cyanobacterial phycocyanins under stress conditions. FEBS Lett., 580, 3029-3034.

77. Nakamoto H., Suzuki M., Kojima K. (2003). Targeted inactivation of the hrcA repressor gene in cyanobacteria. FEBS Lett., 549, 57-62.

78. Nakamoto H., Vígh L. (2007) The small heat shock proteins and their clients. Cell. Mol. Life ScL, 64, 294-306.

79. Nariya H., Inouye S. (2002) Activation of 6-phosphofructokinase via phosphorylation by Pkn4, a protein Ser/Thr kinase of Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol., 46, 1353-1366.

80. Nariya H., Inouye S. (2003) An effective sporulation of Myxococcus xanthus requires glycogen consumption via Pkn4-activated 6-phosphofructokinase. Mol. Microbiol, 49, 517-528.

81. Nariya H., Inouye S. (2005) Identification of a protein Ser/Thr kinase cascade that regulates essential transcriptional activators in Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol, 58, 367-379.

82. Nariya H., Inouye S. (2006) A protein Ser/Thr kinase cascade negatively regulates the DNA-binding activity of MrpC, a smaller form of which may be necessary for the Myxococcus xanthus development. Mol Microbiol, 60, 1205-1217.

83. Neuhoff V., Stamm R., Eibl H. (1985) Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in poly aery 1 amide gels: A systematic analysis. Electrophoresis, 6,427-448.

84. Nitta K, Suzuki N., Honma D., Kaneko Y., Nakamoto H. (2005) Ultrastructural stability under high temperature or intensive light stress conferred by a small heat shock protein in cyanobacteria. FEBS Lett., 579, 1235-1242.

85. Nováková L., Bezouková S., Pompach P., Spidlová P., Sasková L., Weiser J., Branny P. (2010) Identification of Multiple Substrates of the StkP Ser/Thr Protein Kinase in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol., 192, 3629-3638.

86. O'Farrell P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007-4021.

87. Peake P., Winter N., Britton W. (1998) Phosphorylation of Mycobacterium leprae heat-shock 70 protein at threonine 175 alters its substrate binding characteristics. Biochim. Biophys. Acta, 1387, 387-394.

88. Pearl L.H., Prodromou C. (2006) Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu. Rev. Biochem., 75, 271-294.

89. Pérez J., Castañeda-García A., Jenke-Kodama H', Müller R., Muñoz-Dorado

90. J. (2008) Eukaryotic-like protein kinases in the prokaryotes and the myxobacterial kinome. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 105, 15950-15955.

91. Petrickova K. and Petricek M. (2003) Eukaryotic-type protein kinases in Streptomyces coelicolor. variations on a common theme. Microbiology SGM, 149, 1609-1621.

92. Phalip V., Li J.-H., Zhang C.-C. (2001) HstK, a cyanobacterial protein with both a serine/threonine kinase domain and a histidine kinase domain: implication for the mechanism of signal transduction. J. Biochem., 360, 639-644.

93. Prentki P., Binda A., Epstein A. (1991). Plasmid vectors for selecting IS 1-promoted deletions in cloned DNA: sequence analysis of the omega interposon. Gene, 103, 17-23.

94. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H.1997) Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell, 90, 65-75.

95. Rastogia R.P., Sinha R.P. (2009) Biotechnological and industrial significance of cyanobacterial secondary metabolites. Biotechnology Advances, 27, 521-539.

96. Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17, 208-212.

97. Rose R.E. (1988) The nucleotide sequence of pACYC184. Nucl. Acids Res., 16, 35.

98. Saskova L., Novakova L., Basler M., Branny P. (2007) A eukaryotic-type serine/threonine protein kinase StkP is a global regulator of gene expression in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol., 189, 4168-4179.

99. Sato T., Minagawa S., Kojima E., Okamoto N., Nakamoto H. (2010) HtpG, the prokaryotie homologue of Hsp90, stabilizes a phyeobilisome protein in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Mol. Microbiol., 76, 576-589.

100. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sei., 21, 289-296.

101. Schmelzle K., White F.M. (2006) Phosphoproteomic approaches to elucidate cellular signaling networks. Curr. Opin. Biotech., 17, 406-414.

102. Schweizer H.D. (1993) Small broad-host-range gentamycin resistance gene cassettes for site-specific insertion and deletion mutagenesis. Biotechniques, 15, 831834.

103. Sharp S., Workman P. (2006) Inhibitors of the HSP90 molecular chaperone: current status. Adv. Cancer Res., 95, 323-348.

104. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1992) Heat shock in Escherichia coli alters the protein-binding properties of the chaperonin groEL by inducing its phosphorylation. Nature, 357, 167-169.

105. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1993) Heat shock of Escherichia coli increases binding of dnaK (the hsp70 homolog) to polypeptides by promoting its phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8648-8652.

106. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1994) Heat shock-induced phosphorylation of GroEL alters its binding and dissociation from unfolded proteins. J. Biol. Chem., 269, 31479-31483.

107. Shi L., Potts M., Kennelly P.J. (1998) The serine, threonine, and/or tyrosine-specific protein kinases and protein phosphatases of prokaryotic organisms: a family portrait. FEMS Microbiology, 22, 229-253.

108. Shiau A.K., Harris S.F., Southworth D.R., Agard D.A. (2006) Structural analysis of E. coli hsp90 reveals dramatic nucleotide-dependent conformational rearrangements. Cell, 127, 329-340.

109. Shults M.D., Janes K.A., Lauffenburger D.A., Imperiali B. (2005) A multiplexed homogeneous fluorescence-based assay for protein kinase activity in cell lysates. Nat. Methods, 2, 277-283.

110. Sigler P.B., Xu Z., Rye H.S., Burston S.G., Fenton W.A., Horwich A.L. (1998) Structure and function in GroEL-mediated protein folding. Annu. Rev. Biochem., 67, 581-608.

111. Singh A.K., Summerfield T.C., Li H., Sherman L.A. (2006) The heat shock response in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 and regulation of gene expression by HrcA and SigB. Arch. Microbiol., 186, 273-286.

112. Slabas A.R., Suzuki I., Murata N., Simon W.J., Hall J.J. (2006) Proteomic analysis of the heat shock response in Synechocystis PCC 6803 and a thermally tolerant knockout strain lacking the histidine kinase 34 gene. Proteomics, 6, 845-864.

113. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. (1971) Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chlorococcales). Bacteriol. Rev., 35, 171-205.

114. Stock J.B., Surette M.G., Levit M., Park P. (1995) Two-component signal transduction systems: structure-function relationships and mechanisms of catalysis. In: Two Component Systems.Hoch J, Silhavy T. (Eds.), Washington, DC: ASM Press, p. 25-51.

115. Studer S., Obrist M., Lentze N., Narberhaus F. (2002) A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial a-heat shock proteins. Eur. J. Biochem., 269, 3578-3586.

116. Suzuki I., Kanesaki Y., Hayashi H., Hall J.J., Simon W.J., Slabas A.R., Murata N. (2005) The histidine kinase Hik34 is involved in thermotolerance by regulating the expression of heat shock genes in Synechocystis. Plant Physiol., 138, 1409-1421.

117. Suzuki I., Simon W.J, Slabas A.R. (2006) The heat shock response of Synechocystis sp. PCC 6803 analysed by transcriptomics and proteomics. J. Exp. Bot., 57, 1573-1578.

118. Tanaka N., Hiyama T., Nakamoto H. (1997) Cloning, characterization and functional analysis of groESL operon from thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Biochim. Biophys. Acta 1343, 335-348.

119. Tanaka N., Nakamoto H. (1999) HtpG is essential for the thermal stress management in cyanobacteria. FEBSLett., 458, 117-123.

120. Thingholm T.E., Jensen O.N., Larsen M.R. (2009) Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics, 9, 1451-1468.

121. Throup J.P., Koretke K.K., Bryant A.P., Ingraham K.A., Chalker A.F., Ge Y., Marra A., Wallis N.G., Brown J.R., Holmes D.J., Rosenberg M., Burnham

122. M.K. (2000) A genomic analysis of two-component signal transduction in Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol., 35, 566-576.

123. Tuominen I., Pollari M., Tyystjarvi E., Tyystjarvi T. (2006) The SigB sigma factor mediates high-temperature responses in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEBS Lett., 580, 319-323.

124. Udo H., Inouye M., Inouye S. (1996) Effects of overexpression of Pkn2, a transmembrane protein serine/ threonine kinase, on development of Myxococcus xanthus. JBacteriol., 178, 6647-6649.

125. Udo H., Lam C.K., Mori S., Inouye M., Inouye S. (2000) Identification of a substrate for Pkn2, a protein Ser/ Thr kinase from Myxococcus xanthus by a novel method for substrate identification. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2, 557-563.

126. Udo H., Munoz-Dorado J., Inouye M., Inouye S. (1995) Myxococcus xanthus, a gram-negative bacterium, contains a transmembrane protein serine/threonine kinase that blocks the secretion of beta-lactamase by phosphorylation. Genes Dev., 9, 972983.

127. Vieira J., Messing J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268.

128. Vigh L., Maresca B., Harwood J.L. (1998) Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? Trends Biochem. Sci., 23, 369374.

129. Walter S., Buchner J. (2002) Molecular chaperones-cellular machines for protein folding. Angew. Chem. Int. Ed., 41, 1098-1113.

130. Wandinger S.K., Richter K., Buchner J. (2008) The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem., 283, 18473-18477.

131. Wang L., Sun Y.-P., Chen W.L., Li J.-H., Zhang C.-C. (2002) Genomic analysis of protein kinases, protein phosphatases and two-component regulatory systems of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. FEMS Microbiol. Lett.,211, 155-165.

132. Wehenkel A., Bellinzoni M., Grana M., Duran R., Villarino A., Fernandez P., Andre-Leroux G., England P., Takiff H., Cervenansky C., Cole S.T., Alzaria

133. P.M. (2008) Mycobacterial Ser/Thr protein kinases and phosphatases: Physiological roles and therapeutic potential. Biochim. Biophys. Acta (BBA) Proteins & Proteomics, 1784, 193-202.

134. Williams, J. G. K. (1988) Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis. 6803. Methods Enzymol. 167, 766-778.

135. Wurgler-Murphy S.M., Saito H. (1997) Two-component signal transducers and MAPK cascades. Trends Biochem. Sci., 22, 172-176.

136. Xu Z., Horwich A. L., Sigler P.B. (1997) The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature, 388, 741-750.

137. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

138. Young J.C., Moarefi I., Hartl F.U. (2001) Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. J. Cell. Biol., 154, 267-273.

139. Zhang C.-C. (1993) A gene encoding a protein related to eukaryotic protein kinases from the filamentous heterocystous cyanobacterium Anabaena PCC 7120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11840-11844.

140. Zhang C.-C., Gonzalez L., Phalip V. (1998) Survey, analysis and genetic organization of genes encoding eukaryotic-like signaling proteins on a cyanobacterial genome. Nucl. Acids Res. 26, 3619-3625.

141. Zhang C.-C., Libs L. (1998) Cloning and characterization of the pknD gene encoding an eukaryotic-type protein kinase in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol. Gen. Genet., 258, 26-33.

142. Zhang X., Zhao F., Guan X., Yang Y., Liang C., Qin S. (2007) Genome-wide survey of putative Serine/Threonine protein kinases in cyanobacteria. BMC Genomics, 8, 395.

143. Zhao H.Y., Li H.M., Qin L.F., Wang H.H., Chen G.-Q. (2007) Disruption of the polyhydroxyalkanoate synthase gene in Aeromonas hydrophila reduces its survival ability under stress conditions. FEMS Microbiol. Lett., 276, 34-41.