Антикоагулянтная активность фракции сапропеля: Получение, природа и механизм действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Яковлева, Наталья Владимировна

• Яковлева, Наталья Владимировна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яковлева, Наталья Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. НЕФЕРМЕНТАШВНЫЙ ЭТАП ОБРАЗОВАНИЯ ФИБРИНА И ПРИГОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ЭТОГО ПРОЦЕССА (обзор литературы).

2.1. Механизм самосборки фибрина.

2.2. Антиполимеризационная активность комплексов гепарина.

2.3. Пептидные ингибиторы полимеризации фибрина.

2.4. Ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена растительного происхождения.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Количественная оценка антиполимеризационной активности фракции сапропеля.

4.2. Разработка оптимального способа получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью.

4.2.1. Выбор экстрагента.

4.2.2. Выбор концентравди экстрагента.

4.2.3. Выбор оптимального времени экстрагирования.

4.2.4. Выбор температурного режима экстракции.

4.2.5. Выбор количественного соотношения сырьеэкстрагент.

4.3. Разработка приемов очистки антикоагулянтной фракции сапропеля.

4.4. Состав фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью и природа носителя.

4.5. Механизм ограничения свертывания крови антикоагулянтами из сапропеля

4.6. Происхождение носителя антикоагулянтной активности, содержащегося в сапропеле.

-34.7. Предварительная оценка состояния гемокоагуляции при внутривенном введении экстракта из сапропеля лабораторным животным.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антикоагулянтная активность фракции сапропеля: Получение, природа и механизм действия»

Актуальность проблемы. В настоящее время остается актуальной проблема поиска и изучения антикоагулянтов прямого действия. Широко применяемый в медицинской практике единственный официальный прямой антикоагулянт - гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным действием, не лишен ряда недостатков. К важнейшим из них можно отнести сложность дозирования, поскольку действие гепарина зависит от уровня антитромбина Ш в плазме крови больного; способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Bertele V. et al., 1983; Cimo P. et al., 1979/ и тромбощтопе-нию /Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J., 1986/. Известны случаи гепаринре-зистентности /Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/. Наиболее существенным недостатком гепарина является "эффект бумеранга": после гипокоагулемии возникает гиперкоагулемия, нередко сопровождающаяся тромбоэмболиче-скими осложнениями и требующая очередной терапевтической коррекции /Nordon et al., 1981/.

Как известно гепарин ограничивает плазмокоагуляцию на уровне тром-бинзависимого превращения фибриногена, угнетая активность тромбина и, в некоторой степени, тормозя скорость аутополимеризации фибринмономеров /Кудряшов Б.А. и соавт., 1975/. Ингибиторы, ограничивающие неферментативные превращения фибриногена и имеющие практическое применение, до настоящего времени не известны. Однако эффекторы такого типа упорно исследуются до настоящего времени. Так, Laudano A., Doolittle R. /1978; 1979/ получили серию пептидов - аналогов N-концевого участка а-цепи фибриногена, имеющих последовательность Gly-Pro-Arg и способных ингибировать полимеризацию мономерного фибрина посредством возникновения малоактивных комплексов мономер-пептид /Петросян М.Т. и соавт., 1984/. Подобные пептиды могут быть вьщелены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1991/. В то же время применение этой группы пептидов в качестве антикоагулянтов прямого действия in vivo невозможно вследствие их быстрой элиминации из кровотока /Чипенс Г.И., 1982; Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1991/.

В лабораториях кафедр биохимии, фармакологии и фармакогнозии Тюменской государственной медицинской академии установлено, что в ряде растений содержатся антикоагулянты прямого действия, представляющие собой гликопептиды, механизм действия которых отличен от гепарина (следовательно, свободных от его недостатков), но имеющий сходство с механизмом ограничения плазмокоагуляции пептидами - аналогами N-концевого участка ос-цепи фибриногена и пептидами, выделенными из плазмы крови человека и животных /Дементьева И.А., 1991; Русакова О.А., 1993/. Их эффект реализуется на уровне заключительной фазы свертывания - превращении фибриногена в фибрин, преимущественно на ранних этапах образования олиго- и полимеров. По данным Дементьевой И.А. /1991/, Русаковой О.А. /1993/ и Губаева А.Г. /1996/ растительные гликопептиды действуют достаточно продолжительно (до 24 ч после однократной инъекции), не вызывают гиперкоагулемии и не обладают токсическим действием. В то же время следует отметить, что сырьевая база для получения антикоа1улянтов прямого действия растительного происхождения ограничена. Это обстоятельство, наряду с изучением ассортимента растений, диктует необходимость поиска альтернативных источников сырья для получения препаратов аналогичного действия.

Известно, что водные растения, (в т.ч. ряска, стрелолист, сине-зеленые водоросли и др.) обеспечивают до 80% органической фазы донных иловых грязей. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов-антикоагулянтов, однако процесс естественного концентрирования путем формирования сапропелей может принести свой результат. Немаловажную роль играет и неограниченность сырьевой базы.

Предварительные исследования показали, что водные извлечения из сапропеля действительно обладают антикоагулянтным эффектом, реализующимся на уровне коагулящонного превращения фибриногена. Учитывая это обстоятельство, а также то, что найденные в растениях пептиды-ингибиторы оказались достаточно устойчивыми соединениями, нам представилось логичным изучить фракции сапропеля на содержание антикоагулянтов прямого действия.

Цель исследования - изучение возможности получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью, предварительная характеристика эффектора свертывания и механизма влияния на плазмокоагу-ляцию.

Задачи исследования. 1. Разработать оптимальный способ получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью. 2. Разработать способ количественной оценки антикоагулянтной активности. 3. Определить состав активной фракции сапропеля и установить природу носителя. 4. Расшифровать механизм ограничения свертывающей активности плазмы крови полученной фракцией. 5. Дать предварительную оценку состояния гемо-коагуляции при внутривенном введении фракции экстракта сапропеля лабораторным животным.

Научная новизна. Впервые установлено, что сапропель содержит антикоагулянты прямого действия. Впервые разработан способ выделения фракции сапропеля, обогащенной по антикоагулянту. Определена природа носителя антикоагулянтной активности и механизм действия. Показана перспективность исследований по созданию нового средства фармакологической коррекции гемостаза.

Практическая ценность. Впервые предложен "Способ получения средства, обладающего антикоа1улянтной активностью" (Патент № 2101023, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 января 1998 г), который позволяет получать его в достаточных для исследовательской работы количествах и может явиться основой для промышленного способа.

Выявлена принципиальная возможность создания нового средства фармакологической коррегащи свертывающей активности крови с точкой приложения на заключительном этапе фибринообразования и показано, что источником нового антикоагулянта прямого действия может служить сапропель, ресурсные запасы которого не ограничены.

Получены данные, которые обосновывают перспективность и целесообразность дальнейшего глубокого фармакологического и биохимического исследования ингибитора свертывания сапропеля по схеме, предусмотренной Фармакологическим комитетом для доклинических испытаний антикоагулянтов прямого действия, и могут быть использованы в лабораториях, занимающихся поиском новых средств фармакологической коррекции гемостаза.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на проблемной комиссии "Фармация" Тюменской медицинской академии, опубликованы в материалах конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины" (Тюмень, 1994), международного симпозиума в рамках международной выставки «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1995), юбилейной научно-практической конференции посвященной 25-летию фармацевтического факультета Самарского медицинского университета (Самара, 1996), а также в межвузовском сборнике научных трудов "Актуальные проблемы фармации" и Медико-биологическом вестнике им. ЯД Витебского.

Объем и структура работы. Материалы работы, включая указатель литературы, изложены на 141 странице машинописного текста. В тексте работы содержится 37 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 7 подразделов), в которой изложены результаты

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Яковлева, Наталья Владимировна

выводы

1. Установлен новый источник антикоагулянтов прямого действия - сапропель. Содержащиеся в нем антикоагулянты являются веществами растительного происхождения, в частности, продуктами жизнедеятельности сине-зеленых водорослей.

2. Разработан способ количественного определения антикоагулянтной активности во фракциях сапропеля, позволяющий стандартизировать фракции экстрактов по содержанию антикоагулянта.

3. Разработан способ получения и очистки фракции сапропеля с антикоагулянтной активностью, включающий экстракцию 0,1 М водным раствором аммиака, вымораживание, ультрафильтрацию на полупроницаемой мембране и гель-фильтрацию на геле Sephadex G-150. Предложенный способ может явиться основой для полупромышленного получения антикоагулянта (Патент № 2101032 от 10.01.1998).

4. В качестве основного действующего вещества высокоочи-щенная фракция сапропеля содержит пептид, а в качестве сопутствующих примесей - гуминовые кислоты.

5. Антикоагулянтная активность преимущественно реализуется на III фазе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена в фибрин. Носитель антикоагулянтной активности ограничивает процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном, а также скорость аутополимеризации фибрина путем образования малоактивных комплексов преимущественно с фибринмономером и полимерами ранней степени зрелости за счет электростатических взаимодействий.

-1166. Внутривенное введение фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным вызывает стойкую (до 18 ч), дозозависимую гипокоагулемию, не изменяющуюся при ежедневном введении в течении 2-х недель. 7. Превентивное введение фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным, предупреждает гибель животных от тромбоза, обусловленного инъекцией экзогенного тромбопластина.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Недостаточность арсенала противосвертывающих средств, высокая потребность в них, связанная с ростом частоты заболеваний, осложняющихся тромбозами, определяет необходимость дальнейшего поиска антикоагулянтов, в том числе антикоагулянтов прямого действия, так как последние представлены по существу только гепарином.

Коагуляционные превращения фибриногена, по данным Б.А. Кудряшова и соавт. /1970 - 1988/, а также Triantaphyllopoulos /1964/, М.А. Розенфельд и соавт. /1973/, Д.М. Зубаирова и соавт. /1981/, ограничивает вышеуказанный прямой антикоагулянт - гепарин и его комплексы с многочисленными биологически активными веществами. Эти комплексы характеризуются однотипным действием: тормозят превращение фибриногена в фибрин на стадии самосборки и лизируют нестабилизированный фибрин. Лизис нестабилизированного фибрина обусловлен тем, что комплексы гепарина взаимодействуют с фибриллярными структурами, конкурируя за связи, которые обеспечивают существование полимера. Под воздействием комплексов фибрин распадается на частицы, приобретающие характер мономерного фибрина.

Способность комплексов гепарина взаимодействовать с мономерным фибрином, находящимся в полимере, подразумевает их взаимодействие со свободным фибринмономером, что подтверждено Е.С. Житниковой и A.M. Ульяновым /1979/. Естественно, в присутствии гепарина или его комплексов, мономерный фибрин теряет способность к аутополимеризации. Однако вопрос о физиологическом значении гепарина и его комплексов в ограничении самосборки фибрина остается открытым. Доказано лишь, что гепарин, в количестве, во много раз превышающем физиологическое, тормозит самосборку in vitro /Михалева И.В., 1988/, a in vivo таким же эффектом (в высоких концентрациях) обладают искусственно созданные комплексы этого вещества с белковыми соединениями /Тажудинова С.И., 1987/.

В последние годы появились указания на возможность тормозить в организме заключительный этап коагуляционных превращений фибриногена - самосборку фибрина - синтетическими пептидами /Kuyas, Doolittle, 1983/. Выраженный антикоагулянтный эффект указанных пептидов привлек пристальное внимание исследователей и в последние годы активно изучаются синтетические производные, включающие этот трипептид, как перспективные антикоагулянты прямого действия /Kuyas, Doolittle, 1983; Miraglia, Grenberg, 1985; Laudano, Doolittle, 1979/, синтезировали серию пептидов, соответствующих концевым фрагментам С- и N-цепей фибрина и показали, что пептиды Gly-Pro-Arg-Pro и Gly-Gys-Arg-Pro избирательно и обратимо связываются с фибриногеном. Инги-бирование процесса самосборки фибрина пептидами этого типа обусловлено электростатической природой связей, возникающих при комплексообразовании пептид-мономера /Петросян М.Т. и соавт., 1984/. Установлено, что укорочение пептида с С- или N-конца, замена или перестановка одной из аминокислот, приводит к снижению или потере ингибиторной активности. Из синтезированных пептидов Gly-Pro, Pro-Arg, Gly-Pro-Arg, Gly-Ser-Arg-Pro, Gly-Gys-Arg-Pro, Gly-Pro-Arg-Pro наиболее активен последний, несколько менее - Gly-Pro-Arg, остальные неактивны. Следовательно, для проявления антиполимеризационной активности необходимо наличие в пептиде природной последовательности Gly-Pro-Arg, причем глицин должен находиться в первом положении.

Указанный тип пептидов не только тормозит самосборку, но и ингибирует взаимодействие фибриногена с тромбоцитами, что предотвращает их агрегацию /Васильева Г.А. и соавт., 1983/, являются вазоактивными агентами, улучшая микроваскулярную проницаемость /Цейтин В.М. и соавт., 1982/.

Недостатком короткоцепочечных пептидов как антикоагулянтов прямого действия является их быстрая элиминация из кровотока /Чипенс Г.И., 1982/.

Ассортимент изучаемых пептидных антикоагулянтов не ограничивается только синтетическими пептидами. Так, Е.А. Чирятьевым и соавт. /1980-1996 гг./ были обнаружены и изолированы пептиды из плазмы крови человека и животных, тормозящие процесс самосборки фибрина in vitro и in vivo. Расшифрован их аминокислотный состав и последовательность. Определена их физиологические роль и значение. При этом установлено, что обнаруженные пептидные ингибиторы являются наиболее древними регуляторами коагуляционного превращения фибриногена, их уровень в крови и тканях животных уменьшается по мере филогенетического и онтогенетического «старения», т.е. по мере уменьшения удельной значимости коагуляционного превращения фибриногена в цепи реакций, ведущих к образованию фибрина. Это согласуется с теорией о том, что биологически активные пептиды относятся к наиболее древним регуляторам многих биохимических и физиологических процессов, протекающих в организме в целом и отдельной живой клетке /Ашмарин И.П. 1979, 1982; Климов П.К., 1984/.

В то же время, использование естественных пептидов животного происхождения с целью фармакологической коррекции гемостаза не представилось возможным; развивающаяся после инъекции пептидов гипокоагулемия чрезвычайно кратковременна в силу той же причины - быстрой элиминации из кровотока /Чирятьев Е.А., 1990; Умутбаева М.К., 1984/.

Одну из возможностей получения антикоагулянтов прямого действия представляют растения, относительно которых имеются указания на свойственную им гемокоагуляционную активность /Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983; Gabbs, Green, 1984; Киселева А.В., 1983/. В частности, публикации, вышедшие за последние годы из лабораторий кафедры биохимии, фармакогнозии и фармакологии Тюменской медицинской академии, свидетельствуют, что из растений возможно получение прямых антикоагулянтов, предотвращающих образование фибрина за счет ограничения превращений фибриногена. Такие данные были получены в отношении травы медуницы мягчайшей /Герберт И.Я., 1990; Дементьева И.А., 1992/ и сабельника болотного /Нохрина Н.Э., 1993/, что продемонстрировало целесообразность более систематических исследований растений с целью поиска источников подобных веществ.

О.А. Русаковой /1993/ был проведен скрининг 200 видов растений, произрастающих в Тюменской области, либо характерных для флоры Западной Сибири. Автором установлено, что некоторые из растений содержат прямые антикоагулянты, реализующие свой эффект на уровне заключительной фазы свертывания крови. Среди них выделяются медуница мягчайшая, нонея темная, кривоцвет полевой, окопник лекарственный, относящиеся к семейству бурачниковых и отличающиеся высоким содержанием прямых антикоагулянтов. Гораздо больше установлено растений с малым содержанием антикоагулянтов, и эти растения не представляют интереса в плане промышленного получения ингибиторов, хотя среди них встречаются такие широко распространенные растения, как сине-зеленые водоросли, сырьевые ресурсы которых практически не ограничены.

После того, как был разработан способ изоляции носителей антикоагулянтной активности, оказалось, что по химической природе они принадлежат к классу пептидов, имеющих тот же набор аминокислотных остатков, что и пептиды животного происхождения, но существенно отличающихся в большую сторону длиной пептидной цепи /Русакова О.А., 1993/. По-видимому, за счет последнего обстоятельства, внутривенное введение растительных пептидов вызывает стойкий и дозозависимый гипокоагуляционный эффект, значительно превышающий по продолжительности эффект гепарина. Подробные фармакологические исследования растительных пептидов показали перспективность создания на их основе новой, принципиально отличающейся от известных, группы средств фармакологической коррекции гемостаза: помимо антикоа-гулянтного эффекта они не изменяют состояние основных физиологических процессов в организме.

Исходя из того, что сырьевые ресурсы растений с высоким содержанием прямых антикоагулянтов существенно ограничены, мы обратились к группе сине-зеленых водорослей. Этот шаг продиктован и тем, что по данным О.А. Русаковой /1993/ и Е.А. Чирятье-ва /1990/ основные характеристики антикоагулянтов из растений (в том числе и сине-зеленых водорослей) и из плазмы крови и тканей животных совпадают между собой.

Хорошо известно, что сине-зеленые водоросли после отмирания естественным образом концентрируются в иловых донных отложениях некоторых озер - в сапропелях. По сведениям Н.В. Кор-дэ /i960/ в некоторых случаях до 80% органической фазы са-пропелей может быть обусловлено сине-зелеными водорослями. В связи с этим предполагаемым источником антикоагулянтов мы избрали сапропель, как концентрат сине-зеленых водорослей.

Прежде всего, основываясь на ранее разработанных принципах выделения антикоагулянтов из растений, включающих экстракцию дистиллированной водой, отстаивание экстракта, упаривание водной фракции и ее фильтрацию через полупроницаемую мембрану Т-100, нами получена стандартная фракция сапропеля. Используя эту фракцию, мы разработали способ количественного определения антикоагулянтной активности в условных единицах активности (ЕА), что позволило устанавливать изменения удельного содержания ингибиторов в процессе выделения и контролировать их содержание в экспериментах in vitro и in vivo.

Разработку оптимального способа получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью, существенно облегчило то, что мы ориентировались, по аналогии с растительными антикоагулянтами, на пептидную природу носителя, а также то, что регистрацию ингибитора проводили с помощью специфической реакции - по влиянию получаемых фракций на скорость превращения фибриногена в фибрин под действием тромбина in vitro в стандартных условиях.

Прежде всего мы определились с экстрагентом. Используя в качестве экстрагента наиболее распространенные растворители, такие как дистиллированную вода, 0,1М водный раствор аммиака, 0,1М раствор едкого натра, 40% этанол и 0,1М раствор уксусной кислоты, пришли к заключению, что при такой постановке эксперимента наиболее эффективным экстрагентом является 0,1М водный раствор аммиака. Экстракция сапропеля растворами аммиака в концентрациях от 0,05 до 0,ЗМ показала, что оптимальной служит концентрация аммиака, равная 0,1М. Извлечения, полученные с помощью этого экстрагента, мы и использовали в дальнейших исследованиях.

Несомненно, что на степень экстракции биологически активных веществ из сырья, существенное влияние оказывают продолжительность экстракции, ее температурный режим, а также количественное соотношение сырье:экстрагент.

Изучение влияния на степень экстракции ее продолжительности в интервале времени от 30 до 180 мин, температурном режиме в 5, 20 и 60°С и соотношении сырье:экстрагент 1:1, 1:2, 1:3, 1:5 и 1:7 позволило установить, что наиболее полно антикоагулянт экстрагируется из сапропеля за 60 мин при температуре реакционной смеси, равной 20°С, и соотношении сырье:экстрагент - 1:3.

Предпринятая нами попытка добиться максимальной очистки антикоагулянтной фракции, полученной описанным выше способом, привела к следующим результатам. Прежде всего следует отметить, что предлагаемая нами схема выделения фракции сапропеля уже подразумевает частичную очистку носителя: в процессе ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану фракции освобождаются от низкомолекулярных компонентов (солей и т.п.), а после концентрирования и центрифугирования осаждаются мелкодисперсные частицы. Среди разнообразных препаративных приемов, направленных на очистку полученной фракции (обработка при высоких температурах, обработка органическими растворителями, осаждение примесей солями тяжелых металлов и др.), наибольшее внимание привлекло глубокое (при -20°С) и длительное (24 ч) замораживание фракции с последующим самопроизвольным размораживанием при комнатной температуре. При этом выпадает обильный осадок, легко удаляемый центрифугированием, а анти-коагулянтная активность фракции практически не изменяется.

Далее мы уточнили оптимальные параметры этой операции, замораживая фракции при температурах от -10 до -25°С в течении от 1 до 30 ч и показали, что замораживание должно производиться при -20°С 24 ч.

Заключительным приемом очистки явилась гель-фильтрация на гелях Sephadex с различным пределом исключения. Элюатом служил 0,05М аммонийно-ацетатный буферный раствор с рН 7,6. Наилучший эффект был достигнут при использовании геля Sephadex G-150 или G-200, хотя он и сопровождался 40%-й потерей антикоагулянтной активности.

Таким образом, нами предлагается следующая схема выделения и очистки антикоагулянта.

Сапропель

Экстракция 0,1М раствором аммиака, 1 ч, 1:3, 20°С, отстаивание, концентрирование, центрифугирование, ультрафильтрация на мембране Т-100

Фракция сапропеля Замораживание при -20°С,

24 ч, размораживание, центрифугирование

Фракция сапропеля

Гель-фильтрация на Sephadex G-150

Конечный продукт (пиковая фракция элюата)

Мы накопили антикоагулянт, содержащийся в пиковой фракции элюата после гель-фильтрации на Sephadex G-150 и использовали его во всех дальнейших исследованиях.

Несмотря на предпринятые нами усилия по очистке носителя антикоагулянтной активности из сапропеля, мы не смогли получить гомогенный эффектор. Хроматография на бумаге высокоочи-щенной фракции указала на наличие как минимум двух различных веществ; одно из них достаточно четко локализовано и окрашивается нингидриновым реактивом, другое - размытое и флуоресцирует голубовато-желтым цветом. Установлено, что антикоагулянтная активность сосредоточена в области нингидринположительного пятна. Это укрепило нас во мнении, что носитель имеет N-концевые аминокислоты, т.е. относится к группе пептидов. Окончательным подтверждением этому явились эксперименты, в которых изолированный носитель антикоагулянтной активности, полученный после хроматографии на бумаге, подвергали кислотному и ферментативному гидролизу в условиях, оптимальных для этих операций. В результате после кислотного гидролиза мы наблюдали полное отсутствие антикоагулянтного эффекта, причем носитель (по данным хроматографии на бумаге) распадался на ряд аминокислот. Ферментативный гидролиз также приводил к изменению исходной антикоагулянтной активности: последовательный трип-синово-папаиновый полностью инактивировал ингибитор, папаино-вый - на 65%, а трипсиновый - на 6,5%. Следовательно носитель антикоагулянтной активности - пептид - в получаемых нами фракциях экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением.

Анализ данных литературы показал, что в этом плане наиболее подходящей кандидатурой являются гуминовые кислоты в значительном количестве содержащиеся в сапропеле. Об этом свидетельствует следующее.

1. Гуминовые кислоты достаточно хорошо растворимы в воде и, особенно, в щелочном растворе. Следовательно, они хорошо экстрагируются 0,1М раствором аммиака.

2. Изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах рН от 1,0 до 1,5, что обусловливает их высокий общий отрицательный заряд и выраженную способность к электростатическим взаимодействиям с другими компонентами смеси.

3. Молекулы гуминовых кислот отличаются гетерогенностью, а их молекулярная масса составляет от 50 до 10 ООО кДа. Этим, а также изложенным в п. 2, объясняется неэффективность использования гелей Sephadex для отделения гуминовых кислот от пептидной части фракции.

Рядом приемов, подробно описанных а разделе «Собственные исследования», мы подтвердили, что получаемая высокоочищенная активная фракция сапропеля наряду с носителем антикоагулянт-ной активности - пептидом, в качестве постоянно присутствующей примеси содержит комплекс гуминовых кислот.

При расшифровке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови прежде всего мы с помощью объективного способа (регистрация процесса свертывания плазмы в динамике коагулографом Н 334) убедились, что полученная нами высоко-очищенная фракция сапропеля обладает выраженной антикоагу-лянтной активностью. При этом в качестве субстрата использовали пулированную донорскую плазму, а в качестве эффектора -фракцию сапропеля, содержащую 100 ЕА/мл. При такой концентрации эффектора время, затраченное на формирование сгустка фибрина, возросло на 8,3% при увеличении общей продолжительности свертывания на 64,3%, а время от момента инициации свертывания до начала формирования фибринового сгустка соотносится в опыте и контроле как 6:1. Возрастание времени, затрачиваемого на формирование фибрина может свидетельствовать об определенном влиянии эффектора на этот процесс. Такое предположение требует исключения или подтверждения проявления гепариноподобной активности изучаемого носителя, т.к. из широко известных антикоагулянтов прямого действия только гепарин и его комплексы обладают способностью ограничивать скорость процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Изучение эффективности торможения скорости реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном исследуемым экстрактом, гепарином, сывороткой крови, разведенной в 10 раз, как источника антитромбина III, порознь, а также в сочетании гепарин-сыворотка, экстракт-сыворотка, экстракт-гепарин показало, что при совместном влиянии на реакцию тромбина с фибриногеном гепарина и сыворотки обнаруживается выраженный синергизм - экспериментально установленная суммарная эффективность торможения выше теоретической на 32,8%. При влиянии на эту же реакцию экстракта и гепарина обнаруживается некоторое снижение экспериментально установленной эффективности торможения по отношению к рассчитанной теоретически - на 2,6% что статистически недостоверно. При исследовании пары экстракт-антитромбин III, мы наблюдали статистически достоверное снижение эффективности торможения по сравнению с теоретически рассчитанной - на 14,8%. Следовательно, механизм ограничения скорости реакции тромбина с фибриногеном гепарина и экстракта из сапропеля принципиально различается.

Нами также показано, что изучаемый эффектор практически в равной степени реализует свою активность, независимо от того, протекает ли свертывание по внешнему или по внутреннему пути. Следовательно, вероятнее всего, носитель антикоагулянтной активности оказывает преимущественное влияние на этапах, следующих за образованием тромбина. Тем не менее мы провели серию экспериментов по выяснению влияния ингибитора на различные этапы плазмокоагуляции, используя в качестве субстрата фактор-дефицитные плазмы, а именно плазмы дефицитные по факторам II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам. Оказалось, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратных плазм, дефицитных по фактору II и кининам, а эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII (различия в контрольных и опытных тестах не достоверны).

Выраженная зависимость степени эффективности торможения изучаемой фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм (за исключением плазмы, децифитной по кининам), дополнительно свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной активности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции - тромбинзависимое превращение фибриногена; недостаток образующегося тромбина приводит к удлинению процесса свертывания фибриногена и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

В то же время, невозможно отрицать полное отсутствие ин-гибиторного эффекта на этапы, предшествующие процессу тромбинзависимого превращения фибриногена. Для разрешения этого вопроса мы провели серию экспериментов, дифференцирующих влияние ингибитора на этапы предшествующие взаимодействию тромбина с фибриногеном (I и II фазы свертывания) и этап коагуляционного превращения фибриногена (III фаза свертывания). Это позволило нам констатировать тот факт, что до 60% общей антикоагулянтной активности реализуется на уровне III фазы свертывания крови.

Взаимодействие тромбина с фибриногеном протекает в два этапа, один из которых ферментативный, приводящий к образованию мономерного фибрина, а второй - аутореакция, в результате которой формируется трехмерная структура фибрина. В свою очередь в аутополимеризации мономерного фибрина также можно выделить несколько стадий: первичное накопление мономерного фибрина и формирование олигомеров, взаимодействие олигомеров между собой и их латеральная агрегация, сопровождающаяся формированием протофибрилл и, наконец, агрегация протофибрилл и образование сети нестабилизированного фибрина. С помощью разработанных нами приемов, таких как дифференцированная оценка влияния ингибитора на ферментативную и неферментативную фазы превращения фибриногена в изолированной системе, содержащей фибриноген и тромбин, изучение влияния ингибитора на разные стадии самосборки фибрина, использование метода «тестирования стадий», разработанного В.А. Белицером /1975/, мы убедились в том, что исследуемый нами эффектор преимущественное влияние (до 70% от общей антикоагулянтной активности) оказывает на неферментативный этап превращений фибриногена под действием тромбина, и, одновременно, несколько ограничивает сам процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном (но не активность тромбина). Таким образом, основной точкой приложения изучаемой антикоагулянтной активности можно считать заключительную фазу свертывания с преимущественным влиянием эффектора на самосборку мономерного фибрина. Исследование самосборки в присутствии и отсутствии ингибитора в зависимости от условий среды, в которой протекает процесс (изменение рН, ионной силы, содержания веществ, конкурирующих за водородные связи и температуры среды), позволило установить, что доминирующими силами, обеспечивающими взаимодействие субстрата с эффектором в физиологических условиях, являются электростатические силы.

Выше мы говорили о вероятности того, что источником антикоагулянта в сапропеле могут явиться растения, в частности, сине-зеленые водоросли. В связи с этим мы предприняли попытку идентифицировать ингибитор, содержащийся в водорослях и ингибитор, выделенный из сапропеля. С этой целью из высушенной массы сине-зеленых водорослей способом, предназначенным для выделения антикоагулянта из сапропеля (см. выше), получили высо-коочищенный ингибитор и сравнили его основные параметры механизма ограничения свертывания с антикоагулянтом из сапропеля. Изучали зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси фибриноген-тромбин в присутствии ингибитора растительного происхождения, использовали метод «тестирования стадий», а также зависимости скорости самосборки от значений рН среды и величины ионной силы в присутствии и отсутствии ингибитора. Результаты этих экспериментов при использовании адекватных количеств ингибитора из водорослей и при условиях, описанных выше, однозначно свидетельствуют в пользу нашего предположения - кривые, характеризующие изучаемые зависимости имеют тот же характер, что и аналогичные кривые, описывающие антикоагулянт из сапропеля. Если учесть ранее полученные данные /О.А. Русакова, 1993/ о природе и механизмах ингибирования коагуляционных превращений фибриногена антикоагулянтами растительного происхождения вообще, то сомнений о том, что носитель из сапропеля имеет растительное происхождение, не возникает.

В заключительной серии экспериментов мы попытались оценить состояние гемокоагуляции при внутривенном введения высо-коочищенной фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным. Следует оговориться, что в данном случае мы не пытались детально проанализировать состояние плазмокоа-гуляции в ответ на внутривенное ведение экстракта из сапропеля, полагая, что при позитивных предварительных результатах, указывающих на перспективность дальнейшего изучения новых антикоагулянтов, подобная работа должна быть проведена как самостоятельное исследование. В связи с этим мы определяли лишь те показатели, которые интегрально отражают общую свертывающую активность плазмы крови (время рекальцификации), скорость взаимодействия тромбина с фибриногеном (тромбиновое время) и аутополимеризации мономерного фибрина (время самосборки фибрина в плазме), а также исследовали защитное действие антикоагулянта при экзогенной тромбинемии, вызванной инъекцией взвеси тромбопластина.

Предварительные исследования показали, что ингибитор из сапропеля обладает противосвертывающим действием не только in vitro, но и в организме животных и что заметный эффект достигается при введении его в дозе, не обнаруживающей видимого токсического влияния. В связи с этим, обоснованным представилось изучить изменения вышеуказанных показателей плазмокоагуляции в зависимости от вводимой дозы. Оказалось, что при дозе вводимого эффектора свертывания 660 ЕА/100 г массы тела животного время рекальцификации по сравнению с контролем увеличивается в 1,9 раза, тромбиновое время - в 1,7 и время самосборки - в 3,6 раза. При увеличении дозы антикоагулянта до 960 ЕА/100 г (в 1,

-1134 раза) эти же показатели становятся выше контрольных значений в 2,1, 3,3 и 4, 8 раза. При дальнейшем увеличении дозы вводимого эффектора до 1260 ЕА /100 г массы тела животного время рекаль-цификации по сравнению с контролем возрастает в 3,9 раза, тром-биновое время - в 3,4 и время самосборки мономерного фибрина в плазме крови - в 8,2 раза.

Исследование изменения тех же показателей свертывания в динамике при вводимой дозе, равной 960 ЕА/100 г массы тела и отборе проб крови для анализа через 3, 30, мин, 1, 3, 6, 12 и 18 ч показало, что уже на 3 мин после внутривенной инъекции экстракта наблюдается явная тенденция снижения скорости реакции плазмокоагуляции: время рекальцификации увеличилось на 150%, тромбиновое время - на 208%, время самосборки фибрина - на 268%. Эффект антикоагулянта нарастает в течение первого часа, что характеризуется увеличением BP на 293%, ТВ на 370%, ВС на 674%, затем постепенно снижается, при этом выраженная ги-покоагулемия регистрируется в течение еще 12-ти часов. Обращает на себя внимание то, что по истечении 18-ти часов наряду с нормализацией BP и ТВ , время самосборки увеличено по отношению к контрольному значению на 318%.

Ежедневное введение антикоагулянта из сапропеля в течении 14 дней в той же дозе и отборе проб крови через 3 ч после инъекции, сдвига изучаемых показателей относительно друг друга практически не наблюдается и составляют не более 11-14%. Это свидетельствует о том, что динамика гипокоагулемии оказалась примерно одинаковой как после первой единичной инъекции, так и после инъекции, выполненной в четырнадцатый раз.

Высокая эффективность фракции экстракта из сапропеля проявилась и его выраженным протективным действием при активации тромбиногенеза. Так, при внутривенных инъекциях тромбопластина в дозе 40 мг/кг, вызывающей гибель 70% подопытных животных, предварительное введение экстракта в дозе 960 ЕА/ЮО г снизило частоту гибели животных на 73,4%, предварительное введение экстракта в дозе 1260 ЕА/100 г до инъекции тромбопластина вызывало гибель уже только 6,6% подопытных животных, т.е. в 10,5 раза меньшую в сравнении с контролем. Таким образом, экстракт можно рассматривать как эффективное средство предупреждение тромбозов путем его введения перед воздействием, сопровождающимся тромбопластинемией.

Таким образом, наши исследования свидетельствуют, что сапропель содержит антикоагулянты прямого действия, по-видимому пептидной природы, принципиально отличающиеся по механизму действия от применяющихся в настоящее время в медицинской практике, оказывающие выраженное дозозависимое и продолжительное гипокоагуляцонное действие при введении in vivo лабораторным животным, а также эффективно предотвращающие развитие тромбоза при угрозе развития массированного внутрисосуди-стого свертывания, вызванного инъекцией тромбопластина. Предложена принципиальная схема получения очищенной фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт (Патент № 2101023 от 10.01.1998). Все это, в сочетании с неограниченными сырьевыми запасами сапропеля, свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения новых антикоагулянтов прямого действия и может служить обоснованием необходимости их детального исследования согласно рекомендациям Фармакологического Комитета для антикоагулянтов прямого действия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Яковлева, Наталья Владимировна, 1998 год

1.Ашмарин И.П. Нейромедиаторы и нейромодуляторы. Эволюция соединений и эволюция гипотез / / Журн. эвол. биохим. и физиол. - 1979. - №3. - С. 278-282.

2. Балабанова Л.Ф., Русакова О.А., Чирятьев Е.А. Ингибитор коагуляционного превращения фибриногена из полыни обыкновенной // В сб. Физиология и патология перекисного окислении, гемостаза и иммуногенеза. Полтава. - 1992. - С. 4-4.

3. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. -М.: Наука, 1984. 160с.

4. Белицер В.А. Домены крупные, функционально важные блоки молекул фибриногена и фибрина / / Биохимия человека и животных. - 1982. - N 6. - С. 38-57.

5. Белицер В.А., Варецкая Т.В. Модифицирование самосборки фибрина как путь к изучению механизма этого процесса / / Укр. биохим. журн. 1975. - N 5. - С. 567-573.

6. Бычков С.М. Новые данные о гепарине / / Вопр. мед. химии. 1981. - Т. 27, вып. 6. - С. 726-736.

7. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Левен П.И. и др. Регуляция коагуляционных превращений фибриногена. Свердловск, 1987.

8. Бышевский А.Ш., Кожевников В.Н. Свертываемость крови при реакций напряжения. Свердловск, 1986. - 142с.

9. Бышевский А.Ш., Леонова О.П., Чирятьев Е.А. и др. О регуляции самосборки фибрина / / В сб. : Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области. Тюмень. - 1993. - С. 103-105.

10. Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К., Чирятьев Е.А. К биологической роли ингибитора самосборки фибрина пептидной природы // В кн.: Физиология и фармакология полипептидов. Чита. - 1985. - С. 45-46.

11. Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К., Чирятьев Е.А. Аминокислотный состав ингибитора самосборки фибрина из тканей крыс // Биохимия. 1984. - N 12. - С. 1934-1939.

12. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. К механизму торможения самосборки термостабильным ингибитором сыворотки крови / / Вопр. мед. химии. 1983. - N 5. - С. 22-27.

13. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. Ингибитор самосборки фибрина // Укр. биохим. журн. 1983. - Т.55, N 3. - С. 260-265.

14. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. Физиологический ингибитор аутополимеризации фибринмономера // В кн. : Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии. М.: Медицина. - 1982. - С. 89-93.

15. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Дементьева И.А. и др. Антикоагулянты недиализующейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы мягчайшей / / Укр. биохимический журнал. -1991. N 6. - С. 26-33.

16. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К. О возможной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции свертывания крови / / Гематология и трансфузиология. 1985. - Т. 30, N 1. - С. 35-38.

17. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К., Тажу-динова С.И. Пептид регулятор агрегатного состояния крови на этапе самосборки фибрина / / Гематология и трансфузиология. -1986. - N 6. - С. 26-31.

18. Варецкая Т.В. Строение и свойства фибриногена и фибрина: Дисс. . докт. биол. наук. Киев, 1977. - 357с.

19. Васильева Г.А., Унковский В.И., Свиридов С.И., Евстигнеев Р.П. Синтез физиологически активного аналога а-цепи фибрина и его производных / / Докл. VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига. - 1983. - С. 344-345.

20. Гаврилов O.K. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М., 1981.

21. Герберт И.Я. К изучению антикоагулянтных свойств медуницы мягчайшей // В кн.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тез. докл. конф. молодых ученых. Тюмень, 1983. - С. 120-121.

22. Герберт И.Я. Природа и свойства антикоагулянта прямого действия из травы медуницы мягчайшей: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Л., 1990. - 24 с.

23. Герберт И.Я., Левен П.И., Бышевский А.Ш. Противосвер-тывающее действие полифенол-содержащей фракции из надземной части медуницы мягчайшей // Раст. ресурсы. 1988. - Т. 22, № 3. - С. 429-434.

24. Губаев А.Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, 1996. - 25 с.

25. Губаев А.Г., Ортенберг Э.А., Русакова О.А., Чирятьев Е.А. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея // В сб. : Актуальные проблемы фармации. Тюмень. - 1994. - С. 153-158.

26. Дементьева И.А. Природа и свойства антикоагулянтов из недиализующейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, 1991. - 25 с.

27. Дементьева И.А. Противосвертывающее действие недиализующейся фракции экстракта медуницы / / Тез. докл. науч.-практ. конф. Полтава, 1989. - С. 275.

28. Дементьева И.А., Левен П.И. Влияние водно-спиртовых экстрактов медуницы на образование фибрина в изолированных системах / / Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тез. докл. конф. молодых ученых. Тюмень, 1988. - С. 153.

29. Дементьева И.А., Леонова О.П., Умутбаева М.К. Препарат противосвертывающего действия из медуницы мягчайшей / / Молодежь практ. здравоохранению: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф. мол. ученых. - М., 1990. - С. 42-43.

30. Дементьева И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза // В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 30.

31. Доменяка С.С., Краснов Е.А. Антикоагулянты растительного происхождения // В кн.: Вопросы физиологии и патологии иммуногенеза и гемостаза. Чита, 1982, С. 78-79.

32. Ефимов B.C., Усов А.И., Ольский Т.С. Сравнительное исследование антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов красных морских водорослей / / Фармакология и токсикология. 1983. - № 3. - С. 61-67.

33. Ерзинкян К.Л., Розенфельд М.А., Тер-Макарян А.Г. и др. Спекстрофотометрические исследования реакции комплексообра-зования фибриногена с антикоагулянтом гепарином / / Изв. АН СССР, сер. Биол. 1974. - N 6. - С. 920-924.

34. Житникова Е.С., Ляпина Л.А., Кудряшов Б.А. Длительность неферментативного фибринолитического действия вторичного комплекса адреналин-гепарин-фибриноген / / Вестн. Московского ун-та, сер. Биол. 1977. - N 1. - С. 15-18.

35. Ильина А.В., Давыдович Ю.А., Рогожин С.В. Синтез аналога N-концевого пептида а-цепи фибрина с последовательностью Gly-Pro-Arg / / Докл. VI Всесоюзн. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 342-343.

36. Исакова Б.И., Омелич A.M., Филипова Л.И., Яковлева Л.В. Изучение противовоспалительной и желчегонной активности полисахаридов // В кн.: Актуальные вопросы поиска и технологии лекарств: Тез. докл. республ. научн. конф. Харьков, 1981. -С. 268-269.

37. Кайб И.Д., Русакова О.А., Чирятьев Е.А. и др. Фармакологическая характеристика антикоагулянта из окопника лекарственного // В сб.: Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области. Тюмень. - 1993. -С. 130-132.

38. Калихевич В.И., Ардемасова З.А., Розенфельд М.А. Анти-коагулянтные свойства синтетических пептидов / / Докл. VI Все-союзн. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983.- С, 391-392.

39. Киселева А.В. Медуница мягчайшая как возможный источник гепариноподобных средств. В кн.: Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. Все-союзн. конф. Новосибирск, 1983, С. 115-116.

40. Климов П.К. Современной состояние исследований по физиологии пептидов / / Система мозговых и внемозговых пептидов.- Л., 1984. С. 3-4.

41. Колхир В.К. Исследование влияния некоторых тритерпеновых гликозидов на свертывающую систему крови. В кн.: Физиологически активные вещества медицине. Тез. докл. V Всесо-юзн. съезда фармакологов. - Ереван, 1982, С. 148-148.

42. Колхир В.К., Соколов С.Я. Антикоагулянтные свойства галеновых препаратов левзеи. В кн.: Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. Тез. Всесоюзн. конф. Томск, 1986, С. 80-82.

43. БО.Кордэ Н.В. Биостратификация и типология русских сапро-пелей. М.: Изд-во Академии наук СССР, 1960. - 219 с.

44. Кудряшов Б.А. Фибринолитические и антикоагулянтные комплексы низкомолекулярного гепарина с тафцином / / Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. - Т. 114, N 12. - С. 609-611.

45. Кудряшов Б.А., Житникова Е.С., Ляпина Л.А., Образцов

46. B.В. Образование вторичного комплекса адреналин-гепарин-фибриноген и его свойства / / Вопр. мед. химии. 1975. - N 1.1. C. 65-69.

47. Кудряшов Б.А., Калишевская Т.М., Ляпина Л.А. Комплекс фибриногена с гепарином как естественный агент физиологической противосвертывающей системы / / Вопр. мед. химии. 1968. - N 3. - С. 277-283.

48. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Комплекс гепарин-мочевина и его физико-химические свойства / / Вопр. мед. химии. 1975. - N 2. - 165-168.

49. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Физиологические свойства комплекса гепарин-тромбопластин / / Физиол. журн. СССР. -1979. N 6. - С. 771-776.

50. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Григорьева Е.А. Взаимодействие гепарина с фибринмономером и комплексом фибринмономер-фибриноген / / Вопр. мед. химии. 1980. - N 3. - С. 318-321.

51. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Житникова Е.С., Крюкова М.Г. Сравнительное изучение свойств комплекса фибриноген-гепарин полученного и выделенного из плазменной фракции продуктов деградации фибриногена / / Научн. докл. высш. школы. -1979. N 9. - С. 58-62.

52. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Молчанова Л.В., Рустамова Б.А. О природе литического действия на фибрин соединений фибриногена с гепарином и тироксина с гепарином / / Вопр. мед. химии. 1970. - N 2. - С. 161-168.

53. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Значение комплекса антитромбин Ш-гепарин-тромбин в защитной реакции противосвертывающей системы // Вопр. мед. химии. 1988. - N 2. - С. 38-42.

54. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Ульянов A.M. Наличие активного комплекса фибриноген-гепарин в суммарной реакции продуктов деградации фибриногена плазмы крови / / Биохимия. -1977. N 3. - С. 451-459.

55. Левен П.И., Герберт И.Я. Антикоагулянты прямого действия из медуницы мягчайшей // V Всесоюзн. биохим. съезд. М., Наука. - 1986. - С. 280-280.

56. Левен П.И., Чирятьев Е.А. Особенности торможения самосборки фибринмономеров фосфатидилсерином и ингибитором самосборки // В сб. : Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тюмень, 1981. - С. 39-39.

57. Левицкая Н.Г., Клейменов А.Н., Петросян М.Т., Розен-фельд М.А. и др. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин / / Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987ю - N 8. - С. 190-192.

58. Левицкая Н.Г., Петросян М.Т., Розенфельд М.А. Антикоа-гулянтные свойства низкомолекулярных пептидов // В сб.: Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов. Рига, 1982. - С. 38-38.

59. Литвинов Р.И., Слабанов Ю.Д., Зубаиров Д.М. О механизме неферментативного фибринолиза / / Вопр. мед. химии. -1981. N 4. - С. 478-481.

60. Литвинов Р.И., Зубаиров Д.М. Влияние фибронектина на самосборку фибрина // Биохимия. 1988. - № 7. - С. 1203-1213.

61. Луговской Э.В. Влияние неорганических солей и солянокислого гуанидина на полимеризацию фибрина / / Укр. биохим. журн. 1967. - N 4. - С. 430-437.

62. Луговской Э.В. Первичная структура фибриногена, её связь с конформацией и функцией молекулы / / Укр. биохим. журн. 1982. - N 5. - С. 578-594.

63. Луговской Э.В., Белицер В.А. Исследование механизма полимеризации фибрина с помощью нейтральных солей / / Биохимия. 1971. - N 1. - С. 129-137.

64. Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г., Белицер В.А. Свойства двух форм мономерного фибрина, различающихся по степени активации тромбином. Характеристика последовательно образующихся активных центров / / Биохимия. 1978. - N 6. -С. 1045-1053.

65. Луговской Э.В., Ляпина Л.А., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. N-концевые аминокислоты белка, полученного при растворении нестабилизированного мономерного фибрина комплексом адреналин-гепарин // Биохимия. 1979. - N 10. - С. 2196-2200.

66. Лысенко А.И., Гончаров А.И., Чернявский В.И., Кулакова С.С. Влияние полисахаридного комплекса на синтез антител в эксперименте // В кн.: Микробиология, эпидемиология и клиника инфекционных болезней. Харьков, 1984. - С. 63-65.

67. Ляпина Л.А. Свойства продуктов лизиса нестабилизированного фибрина комплексом адреналин-гепарин / / Вестн. Московского ун-та. 1981. - N 3. - С. 42-46.

68. Ляпина Л.А. Влияние ингибиторов протеиназ и блокаторов гепарина на фибринолитические свойства комплексов гепарина // Вестн. Московского ун-та. 1980. - N 2. - С. 60-63.

69. Ляпина Л.А., Ульянов A.M. Комплексообразование гепарина с белками и его физиологическая роль / / Физиол. человека. 1978ю - N 2. - С. 295-305.

70. Малиновский Н.Н., Козлов В.А. Антикоагулянтная и тромболитическая терапия в хирургии // М.: Медицина, 1976. -426с.

71. Миронов Г.П., Молчанова Л.В. Реакция перехода при образовании фибрина / / Вопр. мед. химии. 1971. - N 3. - С.301-306.

72. Михалева И.В. Тканевой тромбопластин ингибитор гепарина, механизм действия, биологическое значение: Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Ленинград, 1988. - 29 с.

73. Михаловская Л.И., Варецкая Т.В., Белицер В.А. Взаимодействие фибриногена и фибрина с протаминсульфатом / / Укр. биохим. журн. 1988. - N 4. - С. 3-9.

74. Нохрина Н.Э. Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного: Дисс. . канд. биол. наук. Тюмень, 1993.

75. Нохрина Н.Э., Леонова О.П. Антиполимеризационный компонент растительного происхождения // В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 71.

76. О регуляции фибрина в кровотоке / А.Ш. Бышевский, С.Л. Галян, П.И. Левен и др. // В кн.: Клинические и экспериментальные аспекты регуляции агрегатного состояния крови. Саратов, 1984. - С. 88-94.

77. Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Петров А.К. и др. Анти-коагулянтные свойства пептидов аналогов N-концевого участка ос-цепи фибрина / / Система мозговых и внемозговых пептидов. -Л., 1984. - С. 67-68.

78. Позднякова Т.М., Рыбачук В.Н. Комплексы N-концевого дисульфидного узла фибриногена с фибрином / / Укр. биохим. журн. 1985. - N 1. - С. 3-8.

79. Позднякова Т.М., Рыбачук В.Н., Угарова Т.П. Роль D Е центров междоменного связывания мономерного фибрина при со-полимеризации фибриногена с N-концевым дисульфидным узлом // Биохимия. - 1987. - N 4. - С. 592-598.

80. Потребин А.В., Данилина И.А. Влияние комплексных соединений гепарина с фибриногеном на процессы фибринообразова-ния // Вопр. мед. химии. 1978. - N 3. - С. 404-407.

81. Розенфельд М.А., Ерзинкян К.Л., Пирузян Л.А. Исследование молекулярного механизма реакции комплексообразованияфибриногена с гепарином / / Докл. АН СССР. 1975. - N 3. - С. 419-427.

82. Розенфельд М.А., Клейменов А.Н.,Пирузян JI.A., Сирота Т.И. Микрокалориметрические исследования реакции перехода фибриногена в фибрин, катализируемого тромбином / / Известия АН СССР. 1976. - N 6. - С. 804-811.

83. Русакова О.А. Растения флоры Сибири, как источники антикоагулянтов прямого действия // В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 84.

84. Русакова О.А. Антикоагулянты растительного происхождения: Дисс. . канд. биол. наук. Тюмень, 1993. - 142 с.

85. Русакова О.А., Балабанова Л.Ф. Чирятьев Е.А. Ограничение свертывающей активности крови ингибиторами растительного происхождения // В сб.: Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза. Полтава. - 1992. -С. 71-71.

86. Русакова О.А., Кайб И.Д., Чирятьев Е.А., Чабанов М.К. Природа и некоторые свойства прямого антикоагулянта растительного происхождения / / Докл. Межвуз, и 49 научн.- практ. конф. проф. преп. состава: Тез. докл. Пермь, 1993. - С. 122-123.

87. Русакова О.А., Миколенко Л.Ф., Кайб И.Д., Чирятьев Е.А. Растения флоры Сибири как источник антикоагулянтов прямого действия / / Там же, С. 124-125.

88. Рустамова Б.А. Влияние гепарина на реакцию образования фибрина // Вестн. Московского ун-та. 1970. - N 2. - С. 76-80.

89. Тажудинова С.И. Влияние адреналина на продолжительность самосборки / / Некоторые вопросы клинической и экспериментальной гемокоагулологии/Под ред. А.Ш. Бышевского. Тюмень, 1984. - С. 144-145.

90. Тажудинова С.И. Продолжительность самосборки фибрина при изменениях гемостатического потенциала: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ленинград, 1987. - 20 с.

91. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. М.: Медицина, 1983. - С. 288.

92. Ульянов A.M., Житникова Е.С. Электронно-микроскопические исследования нестабилизированного фибрина комплексными соединениями гепарина / / Биохимия. 1978. - N 4. - С. 646-652.

93. Ульянов A.M., Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Комплексо-образование гепарина с фибринстабилизирующим фактором плазмы // Биохимия. 1973. - N 6. - С. 1281-1286.

94. Ферстрате М. Проблемы и перспективы клинического применения гепарина / / Кардиология. 1981. - N 8. - С. 28-31.

95. Хушбактова З.А., Сыряв В.Н., Джухарова М.Х. Исследования гиполипидемических свойств полисахаридов, выделенных из флоры Средней Азии / / Хим.-фарм. журнал. 1987. - № 11. - С. 1348-1352.

96. Чазов Е.И., Лакин К.М. Антикоагулянты и фибринолити-ческие средства. М.: Медицина, 1977.

97. Чипенс Г.И. Дизайн лекарственных препаратов на базе пептидов / / Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов. Рига, 1982. - С. 7-9.

98. Чирятьев Е.А. Ингибитор самосборки фибрина // Пато-химия обмена веществ и механизмы его регуляции. Тюмень, 1982. - С. 114-114.

99. Чирятьев Е.А. Радиоизотопное исследование взаимодействия пептидного ингибитора с мономерным фибрином / / XI Съезд врачей Кузсбасса. Тез. докл.: Кемерово, 1986. С. 219-221.

100. Чирятьев Е.А. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 1990. - 45с.

101. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Дороднева Е.Ф. Природа антикоагулянта из травы медуницы мягчайшей / / Докл. Всероссийской научн.-практ. конф. мол. учёных (Куйбышев, ноябрь, 1988): Тез. докл. Куйбышев, 1988. - С. 186-188.

102. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Леонова О.П. Орегуля-ции свертывания крови на уровне самосборки фибрина.//Докл. Всес. конф. "Физиология и патология гемостаза ": Тез. докл. -Полтава, 1991. С. 28-28.

103. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Леонова О.П. Эндогенные пептиды физиологические регуляторы коагуляционного превращения фибриногена.//Гематол. и трансфузиол. - 1991. - N 4. -С. 28-31.

104. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Леонова О.П., Михалёва И.В. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена // Укр. биохим. журн. 1991. - 63, N 1. - С. 26-33.

105. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К. Обмен ингибитора самосборки фибрина у крыс / / Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987. - N 5 - С. 562-564.

106. Чирятьев Е.А., Левен П.И. Антиполимеризационная активность сыворотки крови // В сб.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тюмень, 1981. - С. 38-38.

107. Чирятьев Е.А., Левен П.И., Дементьева И.А. и др. Изучение ингибиторов свертывания крови растительного происхождения / / Докл. научн.- практ. конф. посвященной 50-летию фарм. фак-та Томского мед. ин-та: Тез. докл. Томск, 1991. - Т. 1. - С. 201-203.

108. Чирятьев Е.А., Левкин А.А., Мухачев А.И. и др. Эндогенные пептиды регуляторы самосборки / / Всесоюзн. конф."Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике". Тез. докл. - М.: Медицина, 1987. - С. 174-174.

109. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Взаимодействие пепетидного ингибитора с двумя формами мономерного фибрина, различающимися по степени активации / / Укр. биохим. журн. 1989. - Т. 61, N 1. - С. 3-9.

110. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природы // Биохимия. 1988. - Т. 53, N 6. - С. 1025-1032.

111. Чирятьев Е.А., Мухачев А.И. О перспективности использования бычьей плазмы как источника ингибитора самосборки фибрина / / Научн.-техн. конф. по химии и химической технологии. Тез. докл.: Тюмень, 1985. С.189-189.

112. Чирятьев Е.А., Русакова О.А. Виды флоры Сбири как источники антикоагулянтов прямого действия / / Раст. ресурсы. -1994. вып. 4. - С. 21-28.

113. Чирятьев Е.А., Русакова О.А. К механизму ограничения реакции тромбина с фибриногеном ингибиторами растительного происхождения //В сб.: обмен веществ в норме и патологии. -Тюмень. 1992. - С. 112-112.

114. Чирятьев Е.А., Русакова О.А., Балабанова Л.Ф. К механизму влияния на плазмокоагуляцию антикоагулянтов растительного происхождения / / Докл. Всес. конф. "Физиология и патология гемостаза": Тез. докл. Полтава, 1991. - С. 125-125.

115. Чирятьев Е.А., Тажудинова С.И., Галян С.Л. и др. Регуляция заключительного этапа свертывания крови / / Актуальные проблемы физиологических и структурно-функциональных основ жизнедеятельности (научные труды) СО АМН СССР. Новосибирск. - 1987. - С. 211.

116. Abilgaard U. Inhibition of the thrombin-fibrinogen reaction by heparin in the absense of cofactor / / Scand. J. Haemotol. 1968. -N 6. - P. 432-439.

117. Allison P., Bang N. The possible role of Ca britges in fibrin polymerization / / Thromb. a. Haemost. 1983. - N 1. - P. 356-356.

118. Ansell J., Deykin D. Heparin-induced thrombocytopenia and recurrent thromboembolism // Amer. J. Haemat. 1980. - Vol. 8. -P. 325-332.

119. Arnesen H. The effects of the products D and E on the thrombin induced. Convertion of fibrinogen to fibrin / / Scand. J. Haemotol. 1974. - N 3. - P. 165-172.

120. Arnesen H., Godal A. Studies on the thrombin clotting time. 1. The influense of fibrinogen degradation products // Scand. J. Haemotol. 1973. - N 3. - P. 232-240.

121. Aznar G., Reganon E., Vila V. Bioquimica estatica у fun-cionel del fibrinogeno // Sunge, 1978, №5B. - P. 620-630.

122. Belitser V., Khodorova E., Smekhova E. Ynduction of rats and pathway lenght changes in fibrin polimerization / / Thromb. Res. 1975. - N 1. - P. 25-35.

123. Benabid Y., Cocord E., Suscillon M. Solubl fibrin complexes: seperation of pH and characterization / / Thromb. a. Hemost. 1977. - N 1. - P. 144-153.

124. Bertele V., Roncaglioni M.C., Donati M.B., Coetano G. Heparin conteracts the antiaggregating platelet aggregation / / Thrombos. Haemost. 1983. - Vol. 49, N2. - P. 81-83.

125. Biggs R. Human blood coagulation. Haemostasis and Thrombosis. Black scientific publication / / Oxford. London Edinburgh - Melbourn, 1972. - 697p.

126. Blomback В., Okada M. Fibrin gel structure and clotting time // Thromb. Res. 1982. - N 1/2. - P. 51-70.

127. Blomback В., Okada M., Therkildsen L. Activation and polymerisation of fibrinogen / / Thromb. a. Haemost. 1983. - № 1. -P. 200-200.

128. Hl.Borg J.Y., Flecht В., Legedve M. et al. Heparin and low molecular weight heparins-induced thrombocytopenias / / Thromb. Res. 1986. - Suppl. 6. - p. 96.

129. Carvajal Z., Arocha-Pinango C. Un metodo semplice e rapido per la purificaziono dei fragmenti D e E derivanti dalla degradazione del fibrinogeno ad opera della plasmina // Haematologica. 1983. - N 3. - P. 336-340.

130. Cimo P.L., Moake J.L., Weiniger R.S. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: association with platelet aggregation and arterial thrombosis // Amer. J. Haemat. 1979. - Vol. 6. - P. 125-133.

131. Clark H., Puryear H., Casper К. Fibrin polimerization in flow filds // Amer. Chem. Soc. Prepr. 1978. - № 1. - P. 314-314.

132. Cockar D., Pezz H., Gzaham M. Heparin induced specific protein release from human intestinal smooth muscle pells / / Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987 - V. 142, N 2. - P. 542-551.

133. Collen D., Vandereycken C., Mayer L. Influence of hydrostatic pressure on the reverssible polymerization of fibrin monomers // Nature. 1970. - № 5272. - P. 669-691.

134. Deacon-Smith R., Lee-Potter J., Rogers D. Platelet agrega-tion in the presence of extracts of Britich marine algae / / Med. Lab. Sci. 1985. - № 4. - P. 404-405.

135. Doolittle R. Fibrinogen and fibrin / / Haemostasis and Thrombosis / Edinburgh, 1981. P. 163-191.

136. Electron spin resonance study of the role of Ca in the fibrinogen-fibrin reaction/Earland C., Keighley J., Ramsden D., Turner R. // Polymer. 1972. - N 12. - P. 579-583.

137. Elias Т., Jyer G. Some inhibitors of the fibrinogen-fibrin convertion // Thromb. Diath. Haemorrh. 1967. - N 3-4. - P. 499509.

138. Endres G., Swenson M., Scheraga H. Structural aspect of thrombin specifity // Arch. Bichem. Biophys. 1975. - V. 188. - P. 180-189.

139. Endres G., Scheraga H. Equilibria in the fibrinogen conversion. IX. Effect of calcium ions on the reversibl polymerization of fibrin monomer / / Arch. Biochem. Biophys. 1972. - № 1. - P. 266278.

140. Ferry J. The conversion of fibrinogen to fibrin: events and recollections from 1942-1982 / / Molecular biology of fibrinogen and fibrin / New-York, 1983. P. 1-10.

141. Freyssinet J., Torbet J., Hudry-Clergeon G., Maret G. Kinetics of thrombin formation and structure of fibrinogen and fibrin using magnrtic orientation / / Thromb. a. Haemost. 1983. - N 1. -P. 355-355.

142. Gaffney P. Heterogeneity of human fibrinogen / / Nature. -1974. N 230. - P. 54-54.

143. GaffneyP., Templeman J., Mahmoud M., Perry M. Fibrin formation: the influence of plasminogen, thrombin and calcium / / Thromb and Haemost.- 1983. № 1 . - P. 355-355.

144. Girdmood R. Metabolism of antithrombin III (heparin cofactor) / / Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

145. Gibbs., Green G., Doctor V. Isolation and anticoagulant properties of polysaccharides of Typha angustata and Daemonorops species // Thromb. Res. 1984. - N3. - P. 97-108.

146. Collen D., Vandereycken C., Mayr L. Influence of hydrostatic pressure on the reverssible polimerization of fibrin monomers // Nature. 1970. - N 5272. - P. 669-671.

147. Hantgan R., Hermans J. Assembly of fibrin. A light scattering study // J. Biol. chem. 1979. - N 22. - P. 11272-11281.

148. Henschen A., Edman P. Large scale preparation of S-carboxymethylated chains of human fibrin and fibrinogen and the occurence of y-chain variants / / Biochim. Biophys. Acta. 1972. - N 2. - P. 351-367.

149. Henschen A., Lottspeich E. Sequence homologe between y-chain and p-chain in human fibrin // Thromb. Res. 1977. - Nil. -P. 869-880.

150. Hermans J. Models of fibrin // Proc. Nat. Acad. USA. -1979. № 3. - P. 1189-1193.

151. Hessel В., Kudryk В., Blomback b. Domains in fibrinogen of importance for the fibrinogen- fibrin formation / / Bibl. Haemotol. -1978. N 44. - 117-122.

152. Hsich K., Mudd M., Wilner G. Fibrin polymerization. 1. Alkylating peptide inhibitors of fibrin polymerization //J. Med. Chem. 1981. - V. 24. - P. 322-327.

153. Ishida Y., Takiuchi A., Matsushima A., Inada Y. Functional concequences of tryptophan modification of human fibrinogen / / Biochem. Biophys. Acta. 1978. - N 1. - P. 70-77.

154. Ivanada S., Wallen P., Grondahl N., Henschen A., Blomback B. On the primary structure of human fibrinogen. Isolation and characterization of N-terminal fragments from plasmic digests / / Europ. J. Biochem. 1969. - N 2. - -P. 189-199.

155. Jamet V., Levy C. Action des enzymes Protolytiques sur le fibrinogene // Ann. Anesthesiol. Franc. 1978. - № 8. - P. 687-691.

156. Kanaide H., Uranishi Т., Nacamura M. Effects of divalent cations on the cjnversion of fibrinogen to fibrin and fibrin polymerization // Amer. J. Haemotol. 1982. - № 3. - P. 229-237.

157. Kowalska M., Cierniewski C. The intrinsic fluorescence of human fibrinogen and fragment D and E // Thromb. a. Haemost. -1982. N 1. - P. 21-23.

158. Kudryashov В., Liapina L. Der Heparin-Adrenolin-Komplex als ein humoralen Factor des Anticoagulation systems / / Folia Haemotol. 1971. - N 3. - S. 272-284.

159. Kudryk В., Collen D., Moods K„ Blomback B. Evidense for localisation of polimerization sites of fibrinogen / / J. Biol. Chem. -1974. V. 249. - P. 3322-3325.

160. Laudano A., Coffrell В., Doolittle R. Syntetic peptides modeled of fibrin polymerization sites / / Molecular biology of fibrinogen and fibrin/ New-York, 1983. P. 315-329.

161. Laudano A., Doolittle R. Syntetic pptide derivates that bing fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - N 7. - P. 3085-30-98.

162. Lewis S„ Higgins D„ ShaferJ. Effects of EDTA, Gly-Pro-Arg-Pro and amino-acid replacement onthe thrombin catalysed releas of fibrinopeptides / / Molecular biology of fibrinogen and fibrin/New-York, 1983. P. 669-670.

163. Lorand L., Jacobsen A. Isonicotinic acid hydrozide as on inhibitor of transpeptidation: releas for blood coagulation / / Nature. 1967. - N 5114. - P. 508-509.

164. Lorand L., Jacobsen A. Specific inhibitors and the chemistry of fibrinogen polymerization / / Biochemistry. 1964. - N 12. - P. 1939-1943.

165. Lundblad R., Nesheim M., Straight D., Mann K. Binding of a and (3-thrombin to fibrinogen / / Circulation. 1982. - № 4. - P. 294-294.

166. Machin S. Clinical usage of heparin / / Scand. J. Haemotol. 1980. - N 36. - P. 188.

167. Marguerie G., Chagniel G., Suscillon M. The binding of Ca to bovine fibrinogen // Biochem. Biophys. Acta. 1977. - N 1. - P. 94-103.

168. Matsuda H., Kubo M. Pharmacological study on Panax ginseng C.A. Meyer. 1. Effects of red Ginseng on the experimental disseminated intravascular coagulation (1). J. pharm. Soc. Japan, 1983, V. 103, № 12, P. 1269-1277.

169. Matsushima A., Takiuchi H., Saito Y., Inada Y. Significance of tryptophan residues in the D-domain of hte fibrin molecule in fibrin polymer formation // Biochem. Biophys. Acta. 1980. - N 2. - P. 230-236.

170. Matthias F., Носке G. On the separation of fibrinogen degradation prodacts D and E // Biochem. Biophys. Acta. 1976. -V. 427. - P. 569-574.

171. Medved L., Gorcum 0., Manyakov V., Belitser V. The role of fibrinogen aC-domains in the fibrin assembly process / / FEBS Lett. 1985. - N 1. - P. 109-112.

172. Mial J., mende T. A syntetic iodinated polypeptide that inhibits polymerization of fibrinogen / / Blut. 1971. - N 2. - P. 7679.

173. Mills D. A molecular model for the proteolysis of human fibrinogen by plasmin / / Biochim. Biophys. Acta. 1972. - №263. - P. 619-619.

174. Miraglia C., Greenberg C. Measuriment of blood of blood coagulation factor XHIa formation in plasma containing glycyl-l-prolyl-1-arginyl-l-prolyn // Anal. Biochem. 1985. - N1. - P. 165-171.

175. Miraglia C., Greenberg C. Measuriment of blood coagulation factor XIHa formation in plasma containing Gly-Pro-Arg-Pro // Anal. Biochem. 1985. - N 1. - P. 165-167.1 /ч /-v-IJbf

176. Muller M., Burchard W. Fibrinogen fibrin transformation on characterized during the course of reaction by their intermediate structures // Prepr. Short. Commun. IUPAC. - 1980. - V. 3. - P. 1531-1534.

177. Muller M., Lasarcyk H., Burchardt W. Fibrinogen fibrin transformation. 2.Influence of temperature, pH and various enzymes on the intermediate structures //J. Biol. Macromol. - 1981. - N l. -P. 19-24.

178. Murano G., Alving В., Williams L„ Wflz D. Rabbit fibrin: Characterization of the separated chains / / Thromb. Res. 1982. -№ 1. - P. 125-131.

179. Muzaffar Т., Stalker A., Bryce W. Quantitative studies of fibrin formation and effects of dextran / / Bibl. Anat. 1973. - N 2. -P. 340-344.

180. Nair C., Shan G., Dhell D. Effect of temperature, pH and ionic strength and composition on fibrin network structure and its development // Thromb. Res. 1986. - N 6. - P. 809-816.

181. Nakamura Т., Shosuke Okamoto, Saito V., Kuwaki Т., Mat-sumoto H. Characteristic inhibithions of thrombin and plasmin by active ingredients of Chinese herbs. Thromb. a. Haemost., 1983, V. 50, №1, P. 199-199.

182. Nakanishi E., Sabo H., Nakajama A. Kinetik study on the effects of acidic polysaccharides on the interaction of fibrinogen and thrombin // Polym. Bull. 1980. - N 12. - P. 655-664.

183. Niwa M., Vuasa K., Kondo Sh., Sakuragawa N. Studies on Wakan-Vakus ( tradithional herbal drags): especially on the effects of Gaivoh ( Artemiae folium ) on blood coagulation. Thromb. Res., 1985, V. 38, № 6, P. 671-673.

184. Nossel H., Kaplan R., Spanondis K., Soland Т., Butler J. The generation of fibrinopeptide A in clinical blood samplex. Evidencefor thromin activity // J. Clin. Invest. 1976. - V. 58. - P. 11361144.

185. Nossel H., Hurlet-Jensen A., Liu Ch. Fibrinopeptide releast from fi,rinogen / / Molecular biology of fibrinogen a. fibrin / New-York, 1983. P. 269-278.

186. Nossel M. Relative proteolysis of the fibrinogen p-chain by thrombin and plasmin as a determinant of thrombosis / / Nature. -1981. -V. 291. P. 165-167.

187. Olexa S., Budzynski A. Evidence for four different polymerization sites involved in human fibrin formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. - N 3. - P. 1374-1378.

188. Olexa S., Budzynski A. Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin fragment D // Reseach. Corp. Pat. 4455290, USA.

189. Philips H., York I., Lindal H. Bovine fibrinogen. 11. Effects of tyrosine modification of fibrin monomer aggregation / / Biochemistry. 1973. - N 19. - P. 3642-3647.

190. Pouit L., Hudry-Cleorgeon G., Sisillon M. Electron microscopi study of positiv chagres on fibrin fibres / / Biochem. Biophys. Ata. 1973. - N 1. - P. 99-105.

191. Root-Bernstein R., Westall R. Fibrinopeptide A binds Gly-Pro-Arg-Pro // Proc. Nat. Acad.Sci. USA. 1980. - V. 81. - P. 43394342.

192. Shimisu A., Iano Т., Saito J., Inada J. Tryptophan residue in polymerization site of the carboxyl terminal domain of fibrinogen / / J. Biol. Macromol. 1986. - N 5. - P. 301-305.

193. Smith R., Green J. Actions and interactions of antithrombin and heparin // Brit. J. Haemotol. 1987. - V. 66, N 2. - P. 415-421.

194. Triantaphyllopoulos D., Triantophyllopoulos E. Solubility of fibrin clots in solutions of heparin / / Nature. 1964. - 4963. - P. 1096-1098.

195. Vincente G., Alberga S., Lopex B. Does subunit В // Thromb. a. Haemost. 1983. - N 2. - P. 621-621.

196. Williams R. Morphology of bovine fibrinogen monomers and fibrin oligomers // J. Mol. Biol. 1981. - N 3. - P. 399-408.

197. Williams R. Morphology of fibrinogen monomers and fibrin protofibrils // Molecular Biology of fibrinogen and fibrin/NYAS, 1983. P. 180-194.

198. Wong D. Effect of sodium bicarbonate on in vivo conversion of fibrinogen to fibrin //J. Pharm. Sch. 1980. - N 8. - P. 978-980.

199. Yoshimoto Т., Saito Y., Inada Y. Non-clottable fibrinogen by photooxydation in blood plasma / / Photochem. a. Photobiol. 1987. - N 5. - P. 675-676.

200. Zimmermann E. Die heterogenitat das fibrinogens structur-probleme in der gerinnungstorschund / / Struct, und Func. Fibrinogens Blutgerinn. und Microzirculat Verhandlungaber/New-York, 1976. S. 22-25.

201. Zimmermann R., Materna H., Kleine-Katthafer R. The mechanism of fibrinmonomer aggregation / / Hope Sculers J. Physiol. Chem. 1978. - N 9. - P. 1169-1169.