Влияние антикоагулянтных фракций сапропеля на плазмокоагуляцию и тромбоцитарный гемостаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Калинин, Евгений Павлович

• Калинин, Евгений Павлович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калинин, Евгений Павлович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ (Обзор литературы).

2.1. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена.

2.1.1. Синтетические пептидные антикоагулянты.

2.1.2. Физиологические пептидные ингибиторы.

2.2. Ингибиторы агрегации тромбоцитов.

2.2.1. СР ПЬ/Ша-рецепторы тромбоцитов.

2.2.2. Моноклональные антитела.

2.2.3. Непептидные ингибиторы НЬ/Ша-рецепторов тромбоцитов.

2.2.4. Пептидные ингибиторы НЬ/Ша-рецепторов тромбоцитов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Разработка приемов очистки эффекторов из сапропеля.

4.2. Природа эффекторов свертывания крови.

4.3. Механизм ограничения плазмокоагуляции пептидными эффекторами.

-34.4. Влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов.

4.5. Гемокоагуляционные изменения при внутривенном введении эффекторов из сапропеля лабораторным животным.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние антикоагулянтных фракций сапропеля на плазмокоагуляцию и тромбоцитарный гемостаз»

Актуальность проблемы. Физиологический гемостаз является сложным многоступенчатым процессом, основная роль которого - сохранение жидкого состояния крови и предупреждение крово-потери при повреждении сосудов. Формирование гемостатического потенциала, адекватного внешним и внутренним условиям существования организма, определяется содержанием или активностью и характером взаимодействия плазменных и тромбоцитарных факторов свертывания крови. Нормальный гемостаз обеспечивается равновесием между постоянно осуществляемой с невысокой интенсивностью активацией факторов свертывания и их ингибиторов, и функционированием фибринолитической системы /Гаврилов O.K., 1981/. Однако при существенном напряжении гемостаза (травмы, инфекционные процессы, атеросклеротические изменения сосудов, хирургические вмешательства и т.д. /Бышевский А.Ш., Кожевников В.Н., 1986/), свертывающий потенциал крови преобладает над антикоагулянтным, антитромбоцитарным и фибринолитическим, что может привести к закупорке просвета сосуда гемостатическим тромбом. Для предотвращения этого явления широко применяются прямые антикоагулянты и антиагреганты, арсенал которых во-первых, недостаточен, во-вторых, имеющиеся эффекторы свертывания, как правило, полифункциональны, что существенно затрудняет их использование.

Так, прямой антикоагулянт - гепарин, отличается сильным, но кратковременным действием. Его недостатками являются сложность дозирования, связанная с зависимостью от уровня антитромбина III в плазме крови; способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Cimo е.а., 1979; Bertele е.а., 1983/ и тромбоцитопению /Ansell, Deykin, 1980; Borg, 1986/, "эффект бумеранга", когда после гипокоагулемии возникает гиперкоагулемия, часто сопровождающаяся тромбоэмболическими осложнениями и требующая очередной коррекции /Nordon е.а., 1981/. Известны случаи гепарин-резистентности /Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/.

К числу применяемых антикоагулянтов прямого действия относятся гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных /Чазов Е.И., Лакин K.M., 1977; Ена Я.М., 1992/ и об-, ладающие антитромбиновым действием /Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988/. Однако, широкого распространения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны /Баскова И.П., 1991/.

В отношении ограничения агрегации тромбоцитов общая картина выглядит еще более удручающей, поскольку истинных эффекторов агрегации тромбоцитов, имеющих практическое применение, не существует, а применяемые антагонисты этой функции тромбоцитов помимо агрегации изменяют многие другие параметры систем организма /Бышевский А.Ш. и соавт., 1996/. К ним, прежде всего, относится ацетилсалициловая кислота, которая необратимо ингибирует циклооксигеназу тромбоцитов / Jaffe, Weksler, 1979/, синтез тромбоксана А2 и простациклина /Vane, 1971; Burch е.а., 1978; Fuster, Jang, 1994/. Однако, поскольку эндотелиальные клетки способны к регенерации циклооксигеназы, ингибирующее действие аспирина на эндотелиальный простациклин кратковременно, то агрегация тромбоцитов может происходить даже в присутствие аспирина, так как он значительно не ингибирует другие важные активаторы тромбоцитов типа тромбина и АДФ. В то же время длительное применение аспирина в высоких дозах вызывает негативные явления - образование желудочных язв, внутричерепные и желудочно-кишечные геморрагии и др. /CAPRIE Steering Committee, 1996; Hass е.а., 1989/.

Более новыми антиагрегантами являются производные тиено-пиридинов (тиклопидин, клопидогрель), которые ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. По данным клинических исследований, они эффективней аспирина / CAPRIE Steering Committee, 1996/, но вызывают тяжелейшие побочные эффекты — нейтропению, апластическую анемию, тромбоцитопению и др. /Yeh е.а., 1998; Bennett е.а., 1998/.

В связи с этим уже много лет остается актуальной проблема поиска новых антикогулянтов прямого действия и антиагрегантов. Так, проходят этап доклинических испытаний пептиды - антифакторы Ха, в частности Антистазин, состоящий из 119 аминокислот /Ohta, Brush, Jacobs, 1994; Ostrem е.а., 1998/, клещевой пептидный антикоагулянт, содержащий 60 аминокислот /Fioravanti е.а.,. 1993; Мао е.а., 1995; Lynch е.а., 1995/, полипептид (133 аминокислоты), выделенный из слюны медицинской пиявки /Kornowski е.а., 1996/.

Исследования новых эффекторов агрегации тромбоцитов в настоящее время преимущественно сосредоточены на антагонистах GP IIb/Ша-рецептора ввиду его стержневой роли как медиатора агрегации. Среди них можно отметить разработку искуственных антител (с мышиными и человеческими компонентами) / Coller е.а., 1983; Coller, 1995; Charo е.а., 1987/, пептидных антиагрегантов, имитирующих RGD-последовательность a-цепи фибриногена, распознаваемую GP IIb/111а, и действующих как конкурентные антагонисты фибриногена /Lefkovits е.а., 1995/.

Исследуются пептидные ингибиторы, ограничивающие тром-бинзависимое превращение фибриногена, имеющие в своем составе аналоги N-концевого участка a-цепи фибриногена с последовательностью GPR /Laudano, Doolittle, 1978; 1979/. Подобные пептиды выделены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/. В то же время применение этой группы пептидов в качестве антикоагулянтов прямого действия in vivo пока невозможно вследствие их быстрой элиминации из кровотока /Чипенс Г.И., 1982; Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/.

В лабораториях ТМА из ряда растений выделены гликопепти-ды, механизм действия которых отличен от гепарина, но имеет сходство с пептидами - аналогами N-концевого участка а-цепи фибриногена и пептидами, выделенными из плазмы крови человека и животных /Дементьева И.А., 1991; Русакова O.A., 1993/. По данным И.А. Дементьевой (1991), O.A. Русаковой (1993) и А.Г. Губаева (1996) растительные гликопептиды действуют достаточно продолжительно (до 24 ч после однократной инъекции), не вызывают гиперкоагулемии и не обладают токсическим действием. Однако их сырьевая база незначительна.

Пептидные эффекторы содержатся во многих водных растениях, обеспечивающих до 80% органической фазы донных иловых грязей. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов-антикоагулянтов, однако в процессе естественного концентрирования, в ходе формирования сапропелей, их содержание может достигать значительных величин /Яковлева Н.В., 1998/, а сырьевая база неограничена.

Предыдущие исследования подтвердили наличие в экстрактах сапропеля веществ, эффект которых реализуется на заключительном этапе свертывания крови /Яковлева Н.В., 1998/. Однако, на наш взгляд, эти работы не дают возможности однозначно трактовать результаты экспериментов, поскольку в них использована сумма биологически активных веществ, содержащая помимо пептидного компонента гуминовые кислоты. Для последних установлено участие в процессах свертывания крови /Yang е.а., 1998/, антиоксидантная активность /Комиссаров И.Д., Климова A.A., 1971/ и генотоксичность /Ribas е.а., 1997/. Кроме того, исследования не затрагивали тромбоцитарный компонент свертывания крови, хотя известно, что фибриноген - ключевой субстрат заключительной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии тромбоцитов, взаимодействуя с рецепторами тромбоцитар-ных мембран /Панченко Е.П., 1997/.

Цель исследования - изучение возможности получения индивидуальных эффекторов свертывания крови из сапропеля, определение их природы, характеристика механизма влияния на плаз-мокоагуляцию и агрегацию тромбоцитов in vitro, предварительная оценка состояния гемокоагуляции при внутривенном введении эффекторов лабораторным животным.

Задачи исследования. 1. Разработать способ получения из сапропеля индивидуальных эффекторов свертывания крови. 2. Определить природу эффекторов. 3. Расшифровать механизм ограничения свертывающей активности плазмы крови полученными эффекторами in vitro. 4. Определить влияние эффекторов свертывания на процесс агрегации тромбоцитов in vitro. 5. Дать предварительную характеристику влияния эффекторов на свертывающую систему крови при их внутривенном введении лабораторным животным.

Научная новизна. Впервые разработан способ выделения двух индивидуальных эффекторов свертывания крови, обладающих антикоагулянтной активностью. Установлено, что носителями ан-тикоагулянтных свойств являются соединения пептидной природы.

Расшифрован механизм ограничения эффекторами процесса плазмокоагуляции: ингибирование фибринообразования реализуется на уровне коагуляционных превращений фибриногена.

Впервые установлено, что полученные эффекторы из сапропеля угнетают АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro.

Установлено, что при внутривенном введении эффекторов лабораторным животным развивается продолжительная и дозазави-симая гипокоагулемия, обусловленная угнетением плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза.

Практическая ценность. Впервые разработан способ получения антикоагулянтов из сапропеля - дешевого сырья с неограниченными запасами, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условиях.

Эффекторы из сапропеля способны эффективно ограничивать как плазменный, так и тромбоцитарный компоненты гемостаза in vivo, что может обусловить их ценность, как перспективных средств коррекции гемостаза.

Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз.

Основные положения выносимые на защиту.

1. В сапропеле содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть получены в индивидуальном виде.

2. По химической природе зффекторы-антикоагулянты являются пептидами.

3. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемыми эффекторами отличен от механизма известных прямых антикоагулянтов и реализуется на заключительном этапе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена.

-104. Эффекторы из сапропеля способны ингибировать агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме при ее индуцировании растворами АДФ и адреналина.

5. При внутривенном введении лабораторным животным суммы эффекторов развивается стойкая гипокоагулемия за счет угнетения плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза.

Апробация и публикации. Материалы работы опубликованы в Медико-биологическом вестнике им. Я.Д.Витебского (Курган, 1996); Научном вестнике Тюменской медицинской академии (Тюмень, 1999); доложены на Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1997, 1998); Международном симпозиуме «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (С-Петербург, 1999).

Объем и структура работы. Материалы работы, включая указатель литературы, изложены на 142 страницах машинописного текста. В тексте работы содержится 35 рисунков, 12 таблиц и 1 схема. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 5 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы представлен 75 отечественными и 161 иностранным авторами.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Калинин, Евгений Павлович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан способ, позволяющий получать из сапропеля два индивидуальных высокоочищенных эффектора свертывания крови с антикоагулянтной активностью.

2. По химической природе эффекторы-антикоагулянты принадлежат к пептидам.

3. Ингибиторный эффект реализуется на этапе аутополимери-зации мономерного фибрина путем образования малоактивных комплексов эффекторов с фибринмономером посредством электростатических связей.

4. Один из эффекторов ограничивает формирование из олиго-меров протофибрилл, другой - образование олигомеров. При их совместном влиянии на коагуляционное превращение фибриногена наблюдается синергизм эффектов.

5. Эффекторы из сапропеля обладают антиагрегационной активностью, ограничивая АДФ- и адреналин-зависимую агрегацию тромбоцитов.

6. Внутривенное введение лабораторным животным суммы эффекторов приводит к развитию стойкой гипокоагулемии, обусловленной угнетением плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза. Превентивное введение эффекторов предотвращает гибель животных от тромбоза при экзогенной тромбопластинемии.

7. Сочетание антикоагулянтных и антиагрегантных свойств эффекторов из сапропеля определяет возможность их дальнейшего изучения, как перспективных средств коррекции гемостаза.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Недостаточность арсенала прямых эффекторов свертывания крови, применяемых в медицинской практике, а также неуклонный рост частоты заболеваний, осложняющихся тромбозами, диктует необходимость поиска новых эффективных антикоагулянтов прямого действия.

Самым распространенным эффектором свертывания является гепарин. Однако использование гепарина сопряжено с рядом побочных эффектов. Так, самыми опасными и наиболее распространенными побочными эффектами гепарина являются кровотечения /Girdwood, 1985/, связанные с резким и необратимым падением коагуляционной активности факторов IX, X, XI. В результате нарушения образования протромбина индуцированные гепарином кровотечения носят упорный характер и не всегда поддаются коррекции /Дмитриев В.В., 1991/, а риск появления геморрагий возрастает по мере увеличения продолжительности применения гепарина.

Распространенным побочным эффектом при введении гепарина является тромбоцитопения /Павлищук С.А., 1975; King, Kelton, 1984; Barradas е.а., 1987/ с последующим тромбозом /Башков A.C., 1993; Zucker, 1979; Kelton, Levine, 1986; Cohen, 1999/.

Важным отрицательным моментом является кратковременность эффекта, что требует определенной частоты инъекций /Метелица В.И., 1987; Савельев B.C. и соавт., 1989/.

В последние годы появились сообщения о гепаринах с низкой молекулярной массой (НМГ). НМГ имеют ряд преимуществ перед обычным гепарином: они вызывают значительно более продолжительный антитромботический эффект /Bergquist е.а., 1983; Са-ranobe е.а., 1985/; в значительно меньшей степени и реже повышают агрегационную функцию тромбоцитов /Bertele е.а., 1983; Dunn е.а., 1984; Chong е.а., 1989/. Однако, по данным Huisse /1983/, Lerou е.а. /1985/, Gonault-Heilmann е.а. /1987/и НМГ способны провоцировать тромбоцитопению и тромботические осложнения.

Как и при введении нефракционного гепарина, отмечается широкая индивидуальная вариабельность в антикоагулянтном ответе на вводимую дозу НМГ /Cutter, 1991; Rostin е.а., 1990/. Кроме этого, при применении НМГ нередко наблюдается увеличение частоты кровотечений вдвое /Bergquist е.а., 1987; Levine, 1989; Huul, 1991/.

К числу антикоагулянтов прямого действия относятся также гирудин и гирудиноиды /Чазов Е.И., Лакин K.M., 1977/.

Гирудин является мощным ингибитором фермента тромбина и оказывает выраженное тромболитическое действие /Баскова И.П. и соавт., 1984; Hoffmann, Markwardt, 1984/. Антикоагулянтный эффект проявляется моментально и продолжается 1-2 ч, при подкожном и внутримышечном введении - через 1-2 ч и длится 6-8 ч /Исаханян Г.С., 1991; Tanaka, Tomoite, 1988/.

Исходным материалом для получения гирудина является обыкновенная Hirudo medicinalis /Лукин Е.И., 1976/, что создает определенные трудности. Единственным методом добычи пиявок, является их вылавливание с последующим искусственным выращиванием /Агакишиев Д.Д., Абдуллаев Ш.Г., 1987; Каменев Ю.Д., 1993/. Другими препятствиями для выхода в широкую практику гирудина являются его дороговизна и трудности в получении высо-коочищенных препаратов /Исаханян Г.С., 1989; Каменев Ю.Д., 1993/, а синтезированные препараты значительно уступают природному ингибитору в антитромбиновой активности и имеют высокую токсичность /Alderman, Harsen, 1986; Stone, 1987/.

В настоящее время в мире широко исследуются естественные эффекторы свертывания крови, получаемые из различных источников, и, преимущественно, представленные соединениями пептидной природы. Некоторые из них находятся на стадии доклинических и клинических испытаний. Это Antistasin, ТАР и Yagin, получаемые из мексиканской пиявки (Haementeria officinalis), из мягкого клеща (Ornihtodoros moubata) и слюны медицинской пиявки (Hirudo me-dicinalis) соответственно /Ohta, Brush, Jacobs, 1994; Vlasuk е.a., 1991; Sitko e.a., 1992; Vlasuk, 1993; Mao e.a., 1995; Lynch e.a., 1995/. Все вышеуказанные эффекторы являются антифакторами Xa.

В литературе приводятся сведения о выделении из слюны летучей мыши (Desmodus rotundus) гликопептида, который ингиби-рует фактор IXa /Fernandez e.a., 1998/, пептида из морской звезды (Acanthaster planci), получившего название Plancinin, который ограничивает скорость взаимодействия фактора Ха и протромбина /Koyama е.а., 1998/.

Из слюнной железы пиявки Haementeria ghilianti получен новый пептидный ингибитор фактора XHIa - Trigenin, имеющий молекулярную массу 7,3 кДа и состоящий из 66 аминокислот. Trigenin -наиболее мощный избирательный ингибитор фактора XlIIa из описанных, при этом Trigenin не оказывает влияния на предыдущие этапы свертывания крови /Finney е.а., 1997/.

Нельзя не отметить серию работ, посвященных клиническим испытаниям новых препаратов Argatroban и Novastan - низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, разаработанных как альтернатива гепарину, и, по сведениям авторов, по ряду параметров существенно его превосходящих /Lewis е.а., 1997; Hantgan, Jerome, Hursting, 1998; Walenga e.a., 1999; Jang e.a., 1999/. Argatroban синтезируется из L-аргинина и имеет молекулярную массу около 500 Да. Argatroban ограничивает взаимодействия фибриногена с тромбином и активацию тромбина, способен ограничивать агрегацию тромбоцитов у пациентов с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией, усиливает фибринолитическую активность. Argatroban одобрен для использования в Японии и в настоящее время находится на II-III стадиях клинических исследований в США /Lewis е.а., 1997/.

В лабораториях Тюменской медицинской академии установлено, что физиологические пептидные эффекторы свертывания могут быть выделены из плазмы крови человека. Они преимущественно тормозят процесс полимеризации мономерного фибрина /Чирятьев Е.А., Левен П.И., 1981; Чирятьев Е.А., 1990/. В тоже время внутривенное введение этих пептидов белым крысам не приводит к длительной гипокоагулемии /Умутбаева М.К., 1984/, что обусловлено их быстрым перераспределением между кровью и другими тканями организма /Чирятьев Е.А., 1990/.

Так же установлено, что в тканях некоторых растений содержатся гликопептиды, ограничивающие процесс коагуляционного превращения фибриногена /И.Я. Герберт, 1989; И.А. Дементьева, 1991; Н.Э. Нохрина, 1993; Русакова O.A., 1993; Губаев А.Г., 1996/, механизм действия которых идентичен таковому для пептидов, выделенных из плазмы крови человека /Чирятьев Е.А. и соавт., 1991/. При внутривенном введении растительные гликопептиды вызывают стойкую дозазависимую гипокоагулемию, постепенно уменьшающуюся к 20-24 ч /Герберт И.Я., 1982; 1983/, не проявляют кумулятивных свойств /Герберт И.Я., 1982; Чирятьев Е.А. и соавт., 1989/, и обладают низким токсическим потенциалом /Дементьева И.А., Леонова О.П., Умутбаева М.К., 1990; Дементьева И.А., 1992; Губаев А.Г., 1996/.

Известно, что сапропели представляют собой коллоидальные отложения пресноводных водоемов с высоким содержанием органических веществ, формирующиеся за счет отмирающих планктонных, растительных и донных организмов. Установлено также, что водные растения, (в т.ч. ряска, стрелолист, сине-зеленые водоросли и др.) обеспечивают до 80% органической фазы донных иловых грязей /Кордэ Н.В., 1960/. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов-антикоагулянтов /Русакова O.A., 1993/, однако процесс естественного концентрирования при формировании сапропелей может принести свой результат. Немаловажную роль играет и неограниченность сырьевой базы. Поэтому, исходя из необходимости расширения арсенала естественных антикоагулянтов, и принимая во внимание результаты предыдущих исследований, мы сочли целесообразным провести изучение сапропелей озер Тюменской области с позиции получения новых эффекторов свертывающей системы крови.

Мы разработали оригинальный способ изоляции носителей антикоагулянтной активности из сапропеля (Калинин Е.П., Чирятьев Е.А., Русакова O.A. приоритетная справка «Способ получения антикоагулянта из сапропеля» № 006760 от 16 марта 2000 г).

В данной части работы мы не приводим подробного изложения способа, поскольку он описан в разделе «Собственные исследования», а ограничиваемся только технологической схемой процесса (схема 1).

Этот способ позволяет получать высокоочищенный носитель антикоагулянтной активности без примеси гуминовых кислот, с которыми он образует прочные электростатические связи.

Оказалось, что при гель-фильтрации очищенного носителя на колонке, заполненной гелем сефадекса G-50, носитель разделяется на два индивидуальных компонента, различающихся по молекулярной массе: объем выхода наиболее активной фракции первого компонента составил 35 мл (внешний объем колонки - 15 мл), а второго - 46 мл.

Схема 1. Технологический процесс получения носителей анти-коагулянтной активности из сапропеля.

Учитывая, что предел исключения сефадекса 0-50 составляет до 30 кДа /Остерман Л.А., 1985/, а также то обстоятельство, что носители антикоагулянтной активности способны фильтроваться через мембрану гидратцеллюлозную Т-100 (мембрана применяется для гемодиализа и фильтрует низкомолекулярные соединения, в частности, токсины и пептиды, сохраняя высокомолекулярные), средний размер пор которой составляет 1,74 ангстрема /Мышкин К.И., Леонов В.Н., Староверов А.Т., 1967/, можно было предположить пептидную природу носителей.

Это предположение мы подтвердили двумя независимыми друг от друга способами.

1. Носители, полученные порознь, гидролизовали, как описано Т. Дэвени, Я. Гергей /1976/ для соединений пептидной и белковой природы. Полученные гидролизаты, а также негидролизован-ные индивидуальные носители (далее мы их обозначаем как эффектор I и эффектор II) и стандартную смесь 20 аминокислот (контроль) и хроматографировали на бумаге в системах растворителей по Т. Дэвени, Я. Гергей /1976/. Хроматограмму проявляли нингидриновым реагентом, специфично взаимодействующим с концевыми аминогруппами а-аминокислот.

В результате этих операций мы получили картину, характерную для соединений, имеющих в своем составе ос-аминокислоты: негидролизованные носители антикоагулянтной активности не имеют свободных аминокислот, а гидролизованные образуют спектр аминокислот, сходный с контролем. Одновременно мы получили данные о том, что в гидролизатах полностью отсутствует антикоагулянтная активность.

2. Индивидуальные носители порознь гидролизовали с помощью протеолитических ферментов - трипсина, папаина и их смесью в соотношении 1:1 по Т. Дэвени, Я. Гергей /1976/. Результаты показали, что оба эффектора расщепляются ферментами: после воздействии трипсина антикоагулянтная активность эффектора I составила около 94% от исходной, эффектора II - около 48%. После обработки носителей папаином эти показатели составили 35 и 30% соответственно. В случае же, когда на эффекторы действовали трипсиново-папаиновой смесью, антикоагулянтная активность обоих эффекторов полностью исчезала.

Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о пептидной природе изучаемых эффекторов свертывания.

Имея в своем распоряжении чистые эффекторы свертывания и зная их природу, мы перешли к изучению механизмов ограничения свертывания эффекторами I и II порознь.

Для этого прежде всего мы определили характер влияния в зависимости от их концентрации на весь процесс плазмокоагуля-ции, когда задействованы все факторы внутреннего пути свертывания; на процесс коагуляционного превращения фибриногена - в реакции участвуют только тромбин и фибриноген; на процесс ау-тополимеризации мономерного фибрина - используется активированный фибриноген и реакция состоит из формирования прото-фибрилл с последующей их агрегацией.

Результаты этих экспериментов показали, что в каждом из них характер зависимости для эффекторов I и II примерно одинаков - направленность кривых однотипна. В то же время, чем сложнее тест, тем выше концентрация эффекторов, требуемая для достижения одной и той же эффективности торможения реакции свертывания. Так, если принять за 100% концентрацию эффекторов, обусловливающих 30%-е торможение реакции в тесте "Время рекальцификации", то эта же эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном достигается 71% концентрации тех же эффекторов. Торможение аутополимеризации требует еще меньшие концентрации - около 30%.

Это свидетельствует об однотипности действия эффекторов I и II на процесс плазмокоагуляции и о наибольшей чувствительности к ним процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Процесс коагуляционного превращения фибриногена включает ферментативный этап - взаимодействие тромбина с фибриногеном, в результате чего от фибриногена отщепляются фибринопептиды А и В и образуется мономерный фибрин с обнаженными центрами связывания (центры D и Е). В свою очередь мономерный фибрин спонтанно полимеризуется сначала с образованием олигомеров и протофибрилл, затем наступает процесс латеральной агрегации, сопровождающийся формированием регулярной трехмерной сети фибрина /Бышевский А.Ш. и соавт., 1987/.

Расшифровка влияния исследуемых эффекторов на процесс коагуляционного превращения фибриногена показала (для этого мы поставили эксперимент, в котором эффекторы вносили в разные моменты времени от начала реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном, что позволяло проследить их влияние на различные этапы процесса), что оба эффектора преимущественно ограничивают накопление олигомеров, в меньшей степени - протофибрилл, и не влияют на агрегацию протофибрилл. Это было подтверждено экспериментом, проведенным по методу В.А. Белицера (метод тестирования стадий), использумому для изучения эффекторов самосброрки фибрина /Белицер В.А., Варецкая Т.В., 1975/. Проведенный нами анализ свидетельствует о неодинаковой чувствительности к эффекторам разных этапов процесса самосборки, а полученные данные с полной определенностью свидетельствуют, что наиболее восприимчивы к действию эффекторов мономеры фибрина и его олигомеры. По мере созревания протофибрилл ингибирующий эффект снижается и по истечении 62% времени, необходимого для завершения образования фибрина, действие димого для завершения образования фибрина, действие эффекторов на процесс самосборки прекращается.

Поскольку ведущую роль в формировании фибрина играют электростатические взаимодействия, мы допустили, что и эффекторы с мономерами связываются посредством электростатических связей. Это предположение в полной мере подтвердилось при изучении характера влияния эффекторов на самосборку в зависимости от величины ионной силы и рН среды, в которой происходит процесс: налицо увеличение эффективности торможения по мере повышения ионной силы. То же происходит при изменении значений рН в среде самосборки (особенно в пределах от 7,0 до 9,0). Из этого следует, что эффекторы служат донорами отрицательно заряженных функциональных групп для образования связи с мономерным фибрином. По всей видимости, эффекторы не взаимодействуют с активными центрами мономеров, но образуя связи с кластерами положительных зарядов, расположенных на поверхности молекулы мономера помимо центров связывания фибрин-фибрин, создают стерические препятствия на пути формирования фибрина. Об этом говорит тот факт, что эффекторы способны связываться как с нативным фибриногеном, имеющим открытые Е-центры связывания, так и с фибрином, уже не имеющим свободных активных центров.

Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали процесс свертывания плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза в цифровом выражении.

Уже на этом этапе исследований стало ясно, что влияние изучаемых эффекторов на свертывание крови различно. Эффектор I почти по всем определяемым показателям оказался активнее эффектора II. Так, эффектор I увеличивает латентный период до начала свертывания в 2 раза, эффектор II его не изменяет. Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II - только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II - в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагулограммой, записанной в присутствии суммы эффекторов I и II: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм, полученных при использовании эффекторов I и II порознь.

Выше мы показали, что чем архитектурно сложнее тест свертывания, тем больше требуется эффектора для достижения одной и той же эффективности торможения. Следовательно, не исключена возможность действия эффекторов на этапах, предшествующих коагуляционному превращению фибриногена, на которых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных тестах были бы равны, или, по крайней мере, сопоставимы. Это сомнение усиливается тем, что, до данным электрокоагулограммы, эффектор I удлиняет период до начала формирования фибринового сгустка.

Для разрешения данного вопроса мы разработали методику, позволяющую вычленить из общего каскада реакций свертывания процесс коагуляционного превращения фибриногена. Суть этой методики заключается в том, что пулированную донорскую плазму освобождают от фибриногена путем мягкой тепловой денатурации (56°С, 3 мин). Если к такой дефибринированной плазме прибавить фибриноген, эффекторы и затем провоцировать процесс свертывания, то эффекторы могут влиять на любой из этапов плазмокоагуляции. Если же в дефибринированной плазме сначала инициировать активацию каскада свертывания, а после сформирования тромбина прибавить фибриноген и эффекторы, то последние могут оказать влияние только на коагуляционное превращение фибриногена.

Результаты такого эксперимента показали, что эффективность торможения в обоих вышеописанных случаях практически равна между собой при использовании как эффектора I, так и эффектора II. Следовательно, первоначальное предположение о том, эффекторы реализуются на уровне коагуляционного превращения фибриногена, оказалось верным, а различия в механизме влияния эффекторов на свертывание наблюдаются именно на этапе превращений фибриногена.

Для подтверждения этого вывода мы определили эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном эффекторами порознь и их суммой, сопоставляя при этом ожидаемый эффект (расчитан по Уэбб Л., /1966/) и полученный фактически. Ожидаемый (теоретический) эффект был существенно ниже (в среднем на 70%), что говорит о синергизме эффекторов. Одновременно эти данные свидетельствуют и о том, что механизм влияния исследуемых эффекторов на коагуляционное превращение фибриногена различен: в случае одинакового механизма мы наблюдали бы суммацию эффектов при недостатке эффекторов в системе, или антагонизм - при их избытке.

Еще более объективные сведения о различии в механизме действия эффекторов мы получили, наблюдая процесс коагуляционного превращения фибриногена с помощью нефелометра с автоматической регистрацией этапов этого процесса.

Эффектор I, по сравнению с контролем, в среднем всего на 9,7% задерживает формирование олигомеров и на 81% увеличивает время, необходимое для формирования фибринового сгустка. Так как агрегация протофибрил - это практически мгновенный процесс, то эффектор I в основном тормозит аутополимеризацию достаточено зрелых олигомеров. В отличие от этого эффектор II преимущественно блокирует сборку мономеров и олигомеров — на нефелограмме нет фазы увеличения агрегатов до критического значения. Однако при этом время формирования фибринового сгустка увеличивается в среднем на 70% по отношению к контролю.

Мы провели исследования влияния эффекторов (в равных концентрациях) из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10 мкг/мл) и адреналин, так как результаты значений интенсивности агрегации, вызываемые вышеуказанными индукторами, наиболее удовлетворительны, причем интенсивность агрегации, вызываемая АДФ, хорошо коррелирует с интенсивностью агрегации, вызываемой адреналином /АуепагшБ, ОетЬагсН:, 1980/.

Оба изучаемых эффектора в этих условиях ингибируют агрегацию тромбоцитов, но их механизм действия, как и влияние на процесс коагуляционного превращения фибриногена, существенно различается.

Так, при использовании АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл эффекторы I и II практически не изменяют первую волну агрегации, характеризующую агрегацию тромбоцитов под влиянием индуктора, но заметно угнетают вторую волну, характеризующую высвобождение внутренних медиаторов агрегации. Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II практически не отличаются между собой и меньше контрольного значения на 33,8 и 37,5% соответственно. Эффекторы I и II укорачивают время, необходимое для достижения максимальной величины второй волны, но с разной интенсивностью - на 62,5 и 37,5% соответственно. Кроме этого, эффектор I активирует процесс дезагрегации, а эффектор II на него не влияет.

Существенные различия в механизме антиагрегационного действия наблюдаются при повышении концентрации индуктора до 10 мкг/мл. В этом случае в контроле первой волны агрегации не наблюдается. Нет ее и в присутствии эффектора И, но первая волна агрегации появляется в присутствии эффектора I.

Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II меньше контрольного значения на 46,9 и 33,2% соответственно. Эффектор II существенно не изменяет время наступления максимальной величины второй волны, а эффектор I увеличивает его в среднем на 17%.

При использовании в качестве индуктора адреналина эффектор I сглаживает первую волну агрегации, вполовину уменьшает максимальную величину второй и на 12,7% удлиняет время достижения ее максимума. В отличие от этого, эффектор II, не изменяя величины максимума первой волны агрегации, в два раза увеличивает время, необходимое для его достижения, на 50,4% уменьшает максимальную величину второй и на 20,6% удлиняет время достижения ее максимума.

Предварительные исследования показали, что эффекторы из сапропеля обладают противосвертывающим действием не только in vitro, но и in vivo.

При изучении действия эфекторов на свертывание крови in vivo использовали сумму очищенных индивидуальных эффекторов примерно в той же пропорции, в которой они содержатся в натив-ном сапропеле. Использование в данных экспериментах суммы эффекторов определяется тем, что, как это показано выше, они, обладая различающимся механизмом ограничения свертывания, действуют как синергисты, следовательно, возможно получение более выраженного эффекта in vivo.

Состояние плазмокоагуляции оценивали по изменению времени рекальцификации - интегральному показателю, отражающему общее состояние свертывания крови, тромбинового времени - характеризующему состояние III фазы свертывания, времени самосборки фибрина в плазме, а также АДФ- и адреналин-индуцированной аргегации тромбоцитов до и после внутривенного введения эффекторов белым крысам.

Прежде всего мы изучили изменение вышеуказанных показателей плазмокоагуляции в зависимости от вводимой дозы.

Оказалось, что при дозе вводимых эффекторов свертывания

4.8 мг/кг массы тела животного время рекальцификации по сравнению с контролем увеличивается в 1,9 раза, тромбиновое время -в 1,7 и время самосборки - в 3,6 раза. При увеличении дозы эффекторов до 7,0 мг/кг эти же показатели становятся выше контрольных значений в 2,1; 3,3 и 4,8 раза. При дальнейшем увеличении дозы вводимого эффектора до 9,2 мг/кг массы тела животного время рекальцификации по сравнению с контролем возрастает в

3.9 раза, тромбиновое время - в 3,4 и время самосборки мономерного фибрина в плазме крови - в 8,2 раза.

Исследование изменения тех же показателей свертывания в динамике при вводимой дозе, равной 7,0 мг/кг массы тела (средняя эффективная доза) и отборе проб крови для анализа через 3; 30 мин, 1; 3; 6; 12 и 18 ч показало, что уже на 3 мин после внутривенной инъекции эффекторов наблюдается снижение скорости реакций плазмокоагуляции: время рекальцификации увеличилось на 150%, тромбиновое время - на 208%, время самосборки фибрина - на 268%. Эффект антикоагулянта нарастает в течение первого часа, что характеризуется увеличением времени рекальцификации на 293%, тромбинового времени на 370%, времени самосборки на 674%; затем постепенно снижается, при этом выраженная гипокоагулемия регистрируется в течение еще 12-ти часов.

По истечении 18-ти часов нормализуются время рекальцифи-кации и тромбиновое время, но время самосборки остается увели-ченнным по отношению к контрольному значению на 318%.

Эффективность изучаемых пептидов как прямых антикоагулянтов проявилась и его выраженным протективным действием при активации тромбиногенеза. Так, при внутривенных инъекциях тромбопластина в дозе 40 мг/кг, вызывающей гибель 70% подопытных животных, предварительное введение экстракта в дозе 7,0 мг/кг снизило частоту гибели животных на 73,4% (в 2,6 раза), а предварительное введение экстракта в дозе 9,2 мг/кг до инъекции тромбопластина вызывало гибель уже только 6,6% подопытных животных, т.е. в 10,5 раза меньшую в сравнении с контролем.

Антиагрегационную активность эффекторов in vivo оценивали после внутривенного их введения в дозе 5 мг/кг массы тела животного. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10,0 мкг/мл) и раствор адреналина.

Уже на 3 мин после инъекции эффекторов мы наблюдали максимальное снижение степени агрегации тромбоцитов: при АДФ-индуцированной (2,5 и 10,0 мкг/мл) максимум агрегации меньше контрольного значения почти в 2 раза; при адреналин-индуцированной агрегации интенсивность агрегации тромбоцитов снижалась на 33,6%. Далее антиагрегационная активность эффекторов постепенно снижается, нивелируясь к 6 ч после однократной иъекции.

Таким образом, обобщая результаты исследований, можно заключить, что основным этапом свертывания, на котором эффекторы могут реализовать свой потенциал, является процесс коагуляционного превращения фибриногена и, преимущественно, его неферментативный этап - аутополимеризация мономерного фибрина.

Механизм действия эффекторов различен: эффектор I оказывает слабое влияние на формирование олигомеров фибрина, но выраженное — на сборку протофибрилл. Наоборот, эффектор II блокирует начальные стадии полимеризации фибрина.

Оба эффектора являются антиагрегантами, оба ограничивают высвобождение внутренних медиаторов агрегации. При этом эффектор I по сравнению с эффектором II сильнее угнетает реакцию высвобождения при АДФ-индуцированной агрегации и наоборот, эффектор II мощнее реализует свой антиагрегационный потенциал при адреналин-индуцированной агрегации.

При внутривенном введении эффекторов лабораторным животным они достаточно длительно циркулируют в кровотоке, создавая продолжительную гипокоагулемию за счет угнетения как плазменного, так и тромбицитарного компонентов гемостаза. Антикоагу-лянтное действие эффекторов дозазависимо, а их превентивное введение эффективно предупреждает развитие тромбозов при воздействиях, сопровождающихся тромбопластинемией.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости дальнейшего подробного изучения эффекторов из сапропеля, как перспективных антикоагулянтов прямого действия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калинин, Евгений Павлович, 2000 год

1. Агакишиев Д.Д., Абдуллаев Ш.Г. Гирудинотерапия больных хроническим простатитом. Баку, 1987. - 7 с.

2. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования гемостаза. Томск. - 1980. - 315 с.

3. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. -М.: Мед., 1988. 528 с.

4. Баркаган З.С. О применении фраксипарина для профилактики и лечения тромбоэмболий с индуцированной гепарином тром-боцитопенией//Тер. арх. 1993. - Т. 65. - № 10. - С. 77-82.

5. Баркаган З.С., Лычев В.Г., Бишевский K.M. и др. Механизмы гепаринорезистентности и их клиническое значение/ /Терапевт, арх. 1982. Т. 54, № 8. - С. 77-82.

6. Баскова И.П. Механизмы регуляции гемостаза и фибрино-лиза секретом слюнных желез медицинской пиявки. Биохимия животных и человека: Респуб. межвед. сб. науч. трудов /А.Н.Украины, 1991. - С. 28-39.

7. Баскова И.П., Миссельвид Ф., Никонов Г.И. и др. Секрет слюнных желез медицинской пиявки // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1984. - Т. 97, № 6. - С. 696-697.

8. Башков A.C. Низкомолекулярные гепарины//Эксперим. и клин, фармакология. 1993. № 4. - С. 66-76.

9. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. - С. 34-38.

10. Белицер В.А., Варецкая Т.В. Модифицирование самосборки фибрина как путь к изучению механизма этого процесса//Укр. биохими. журн. 1975. - № 5. - С. 567-573.

11. Бессмертный B.C. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине. М.:1. Медицина, 1967. 303 с.

12. Бышевский А.Ш., Галян C.JL, Дементьева И.А., Нелаева А.А., Соловьев В.Г. Тромбоциты. Тюмень, 1996. - 189 с.

13. Бышевский А.Ш., Кожевников В.Н. Свертываемость крови при реакции напряжения. Свердловск, 1986. - 176 с.

14. Бышевский А.Ш., Галян C.JL, Левен П.И. и др. Регуляция коагуляционных превращений фибриногена. Свердловск: Средне-Уральское кн. изд-во, 1987. 205 с.

15. Бышевский А.Ш., Леонова О.П, Чирятьев Е.А. и др. О регуляции самосборки фибрина //В сб.: Комплексное изучение медико- биологических проблем здоровья населения Тюменской области. Тюмень. - 1993. - С. 103-105.

16. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. Физиологический ингибитор аутополимеризации фибрин-мономера // В кн.: Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии: Тез. докл. Всесоюз. совещания, октябрь 1982. М., 1982. - С. 89-93.

17. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К. О возможной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции свертывания крови / / Гематология и трансфузиология. 1985. - Т. 30, № 1. - С. 35-38.

18. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К., Тажу-динова С.И. Пептид-регулятор агрегатного состояния крови на этапе самосборки фибрина / / Гематология и трансфузиология. -1986. № 6. - С. 26-31.

19. Васильева Г.В., Свиридова С.И. Синтез физиологически активного аналога цепи фибрина и его производных / / VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 344-345.

20. Венецкий И.Г. Вариационные ряды и их характеристика. -М.: Статистика, 1970. 158 с.

21. Гаврилов O.K. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М., 1981.

22. Герберт И.Я. Влияние некоторых растений из флоры Тюменской области на процесс гемокоагуляции // В кн.: Биохимия и патохимия обмена веществ. Тюмень, 1982. - С. 99-100.

23. Герберт И.Я. К изучению антикоагулянтных свойств медуницы мягчайшей //В кн.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тез. докл. конф. молодых ученых. Тюмень, 1983. - С. 120-121.

24. Герберт И.Я. Природа и свойства антикоагулянта прямого действия из травы медуницы мягчайшей. Дисс. . канд. биол. наук. Тюмень. 1989. - 121 с.

25. Губаев А.Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, 1996. - 25 с.

26. Дементьева И.А. Природа и свойства антикоагулянтов из недиализирующейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы/ /Дис. . канд. мед. наук. Тюмень. - 1991. - 139 с.

27. Дементьева И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза / / Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 30.

28. Дементьева И.А., Леонова О.П., Умутбаева М.К. Препарат противосвертывающего действия из медуницы мягчайшей / / Молодежь практ. здравоохранению: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. мол. ученых. - М., 1990. - С. 42-43.

29. Дмитриев В.В. Гепаринотерапия ДВС крови при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей / / Анестезиология и реаниматология. 1991. - № 1. - С. 69-72.

30. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки. Пер. с англ.: М.: Мир, 1976. - 364 с.

31. Ена Я.M. Всесоюзное совещание, посвященное применению пиявки // Врачебное дело. 1992. - № 5. - С. 115-117.

32. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. Пре. с англ.: М.: Мир, 1968. - 364 с.

33. Ильина A.B., Давидович Ю.А., Рогожин C.B. Синтез аналога N-концевого пептида ос-цепи фибрина с последовательностью Gly-Pro-Arg //VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 342-343.

34. Исаханян Г.С. Изменение некоторых показателей крови при гирудино-терапии / / Эксперим. и клин, медицина. 1989. - Т. 29, № 2. - С. 107-111.

35. Исаханян Г.С. Влияние гирудотерапии на агрегацию тромбоцитов у больных с острым инфарктом миокарда / / Кровообращение. 1991. - Т. 24, № 3. - С. 32-34.

36. Калихевич В.И., Ардемасова З.А., Розенфельд М.А. Анти-коагулянтные свойства синтетических пептидов / / Докл. VI Все-союзн. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. -С. 391-392.

37. Каменев Ю.Я. Пиявки (гирудотерапия). С-Петерб. мед. центр культуры здоровья им. А.С.Залманова, 1993. - 17 с.

38. Комиссаров И.Д., Климова A.A. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы //В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. Тюмень, 1971. - С. 225-242.

39. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. К вопросу о молекулярной массе гуминовых кислот //В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. -Тюмень, 1971. С. 125-130.

40. Кордэ Н.В. Биостратификация и типология русских сапро-пелей. Издательство Академии Наук СССР. - М. - 1960. - 219с.

41. Кудряшов Б.А. Фибринолитические и антикоагулянтные комплексы низкомолекулярного гепарина с тафцином // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. - Т. 114, № 12. - С. 609-611.

42. Кузник Б.И., Цибиков H.H., Арушанян Л.Г. Полипептиды как регуляторы микроциркуляторного гемостаза//Актуальные вопросы нарушений гемодинамики и регуляции микроциркуляции в клинике и эксперименте. М., 1984. - С. 185-186.

43. Левен П.И., Чирятьев Е.А. Особенности торможения самосборки фибринмономеров фосфатидилсерином и ингибитором самосборки //В сб.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тюмень, 1981. - С. 39-39.

44. Левицкая Н.Г., Клейменов А.Н., Петросян М.Т. и др. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин / / Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987. - № 8. - С. 190-192.

45. Левицкая Н.Г., Петросян М.Т., Розенфельд М.А. Антикоагулянтные свойства низкомолекулярных пептидов / / Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов. Рига, 1982. - С. 38-39.

46. Луговской Э.В., Белицер В.А. Исследование механизма полимеризации фибрина с помощью нейтральных солей / / Биохимия. 1971. - т. 36, №1. - С. 129-135

47. Лукин Е.И. Фауна СССР. Пиявки. Т. 1. Пиявки пресных и солоноватых водоемов. Новая серия № 109 зоолог, инс-та АН СССР. Л., 1976.

48. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. М.: Медицина, 1987. - С. 280-287.

49. Мышкин К.И., Леонов Н.В., Староверов А.Т. Сравнительная характеристика некоторых образцов целлофана, применяемыхдля экстракорпорального гемодиализа / / Сов. медицина 1967. -№6. - С. 55-58

50. Нохрина Н.Э. Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного: Дис. . канд. биол. наук. Тюмень, 1993.

51. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - 536с.

52. Павлищук С.А. Новое о взаимоотношении гепарин-кровяные пластинки / / Функциональное состояние тромбоцитов в норме и при патологических состояниях. Обнинск, 1975. - С. 65.

53. Панченко Е.П. Ингибиторы Ilb/Illa рецепторов тромбоцитов новое направление в антитромботической терапии //Терапевтический архив - 1997. - № 9. - С. 66-71.

54. Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Петров А.К. и др. Анти-коагулянтные свойства пептидов аналогов N-концевого участка цепи фибрина / / Система мозговых и внемозговых пептидов. - JL, 1984. - С. 67-68.

55. Радзевич И.М., Ходорова E.JI. Получение фибринмономера из нефракционированной плазмы крови//Укр. биохим. журн. -1969. № 4. - С. 367-370.

56. Русакова O.A. Антикоагулянты растительного происхождения: природа и механизм действия: Дис. . канд. биол. наук. -Тюмень, 1993. С. 63-64.

57. Савельев B.C., Яблоков Е.Г., Кириенко А.И. Тромбоэмболия легочной артерии. М.: Медицина, 1989. - С. 263.

58. Стрельцова И.Н., Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Спектры поглощения гуминовых кислот //В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. Тюмень, 1971. - С. 75-90.

59. Угарова Т.П., Белицер В.А. Исследование равновесной системы фибрин-фрагмент Д-протектор//Укр. биохим. журн.1978. № 3. - С. 357-363.

60. Умутбаева M.K. К биологической роли полипептида с ан-типолимеризациоииой активностью. Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Челябинск, 1984, - 22с.

61. Уэбб JI. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М., Мир, 1966, - 862 с.

62. Чазов Е.И., Лакин K.M. Антикоагулянты и фибринолити-ческие средства. М.: Медицина, 1977.

63. Чипенс Г.И. Дизайн лекарственных препаратов на базе пептидов / / Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов: Сб. трудов. Рига: Изд-во ун-та, 1982. - С. 7-9.

64. Чирятьев Е.А. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1990.

65. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Яковлева Н.В., Платонов Е.В. /Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью / / Патент на изобретение №2101023, зарегестриро-ван в Государственном реестре изобретений 10.01.1998г.

66. Чирятьев Е.А., Дороднева Е.Я., Патрианова А.Н. и др. Ан-тикоагулянтный эффект извлечений из некоторых растений Западной Сибири / / Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюз. конф. Томск, 1989. - С. 189-190.

67. Чирятьев Е.А., Левен П.И. Антиполимеризационная активность сыворотки крови //В сб.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тюмень, 1981. - С. 38-38.

68. Чирятьев Е.А., Левен П.И., Герберт И.Я. и др. Изучение ингибиторов свертывания крови растительного происхождения / / Тез. докл. Томск, 1991. - С. 201-202.

69. Чирятьев Е.А., Левкин А.Н., Мухачева А.И., Бышевский А.Ш. Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике. -М„ 1987. С. 174-174.

70. Чирятьев Е.А., Левкин А.Н., Мухачева И.А. и др. О регуляции агрегатного состояния крови на уровне самосборки фибрина / / Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике: Тез. докл. Всесоюз. конф. М., 1987. - С. 131.

71. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природы // Биохимия. 1988. - № 6. - С. 1025-1032.

72. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Взаимодействие пептидного ингибитора с двумя формами мономерного фибрина, различающимися по степени активации. //Укр. биохим. журн. 1989. Т. 61. № 1. С. 3 9.

73. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях: Пер. с англ. -М.: Мир, 1965. 508 с.

74. Яковлева Н.В. Антикоагулянтная активность фракции сапропеля. Получение, природы и механизм действия//Дис. . канд. биол. наук. Тюмень. - 1998. - 141 с.

75. Achyuthman К., Dobson J., Greenberg Ch. Gly-Pro-Arg modifies the glutamine residues in the a- and y-chain in fibrinogen: inhibitor of transglutaminase cross-linking//Biochem. Biophys. Acta. -1986. № 3. P. 261-268.

76. Alderman M.D., Hansen A.G. Effects of naturally occurring and synthetic thrombin inhibitors / / Arch. Intern. Med. 1986.1. Vol. 148. P. 1400-1407.

77. Ansell J., Deykin D. Heparin-induced thrombocytopenia and recurrent thromboembolism / / Amer. J. Hemat. 1980. - Vol. 8. - P. 325-332.

78. Asch A.S., Barnwell J., Silverstein R.L., Nachman R.L. Isolation of the thrombospondin membrane receptor / /J. Clin. Invest. -1987. Vol. 79, N 4. - P. 1054-61.

79. Avenarius H.J., Deinhardt J. Durchfuhrung und Auswertung von Aggregationstesten // Prakt. Anwend. Thrombozytenfunktions-diagn. Stuttgart - New York, 1980. - P. 57-68.

80. Bagdy D., Diozegi M., Sebestyent J. e.a. A D-Phe-Pro-Arg-A anticoagulants lemezke funktio ot gatlo Lataso in vivo//Kiserl. Or-voshud. 1984. - № 1. - P. 26-46.

81. Barker P.L., Bullens S„ Bunting S„ Burdick D.J., Chan K.S., Deisher T., Eigenbrot C., Gadek T.R., Gantzos R., Lipari M.T., et all Cyclic RGD peptide analogues as antiplatelet antithrombotics / /J. Med. Chem. 1992. - Vol.35, N.ll. - P.2040-8.

82. Barradas M.A., Mikhailidis D.P., Epemolu O. et al. Comparison of the platelet proaggregatory effect of conventional unfraction-ated heparins and low molecular weight heparin fraction (CY-222) / / Brit. J. Haemost. 1987. - Vol. 67, N 4. - P. 451-458.

83. Bennett C.L., Weinberg P.D., Rozenberg-Ben-Dror K., Yar-nold P.R., Kwaan H.C., Green D. Thrombotic thrombocytopenic purpura associated with ticlopidine. A review of 60 cases / /Ann. Intern. Med. 1998. - Vol.128, N.7. - P.541-4.

84. Bennett J.S. Structural biology of glycoprotein Ilb-IIIa //Trends. Cardiovasc. Med. 1996. - Vol.6, N.l. - P.31-36

85. Bergquist D., Frisell J., Halbook T. et al. Anticoagulant effect of low molecular weight heparin / / Thromb. Haemost. 1987. - Vol. 57, Suppl. 1. - P. 1339a.

86. Bergquist D., Hedner U., Siorin E. et al. Anticoagulant effects of two types of low molecular weight heparin administered subsequently // Thromb. Res. 1983. - N 3. - P. 381-391.

87. Berkowitz S.D., Harrington R.A., Rund M.M., Tcheng J.E. Acute profound thrombocytopenia after C7E3 Fab (abciximab) therapy //Circulation 1997. - Vol.95, N.4 - P.809-13.

88. Bertele V., Roncaglioni M.C., Donati M.B., Caetano G. Heparin conteracts the antiaggregating effect of prostacyclin by potentiating platelet aggregation // Thrombos. Haemost. 1983. - Vol. 49, N 2. - P. 81-83.

89. Borg J.Y., Flecht B., Legendve M. et al. Heparin and low molecular weight heparins-induced thrombocytopenias // Thromb. Res. 1986. - Suppl. 6. - P. 96.

90. Burch J.W., Stanford N„ Majerus P.W. Inhibition of platelet prostaglandin synthetase by oral aspirin //J. Clin. Invest. 1978. -Vol.61, N.2. - P.314-9.

91. Calvete J.J. Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet glycoprotein lib/Ilia complex //Thromb. Haemost. 1994. - Vol.72, N1. - P.l-15.

92. Calvete J.J., Schafer W., Mann K. Mass spectrometric analysis state of human platelet GP Ilia //Platelets. 1995. - 6.- 5.

93. CAPRIE Steering Committee: A randomised, blinded, trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events //Lancet. 1996. - Vol.348, N.9038. - P.1329-39.

94. The CAPTURE Study: Randomised placebo-controlled trial of abciximab before and during coronary intervention in refractory unstable angina / /Lancet 1997. - Vol.349, N.9063 - P. 1429-35.

95. Caranobe C., Barret A., Gabaig A. et al. Disappearance of circulating anti-Xa acting after intravenous injection of standart heparin and of low molecular weight heparin (CY-216) / / Thromb. Res. -1985. N 1. - P. 129-133.

96. Carteaux J.P., Steiner B., Roux S. Ro 44-9883, a new non-peptidic GPIIb-GPIIIa antagonist prevents platelet loss in a guinea pig model of extracorporeal circulation //Thromb. Haemost. 1993. -Vol.70, N.5 - P.817-21.

97. Charo I.F., Bekeart L.S., Phillips D.R. Platelet glycoprotein Ilb-IIIa-like proteins mediate endothelial cell attachment to adhesive proteins and the extracellular matrix //J. Biol. Chem. 1987. -Vol.262, N.21. - P.9935-8.

98. Chong B.H., Ismail F., Cade J. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: studies with a new low molecular weight hepari-noid, Opg. 10172 // Blood. 1989. - Vol. 73, N 6. - P. 1592-1596.

99. Cimo P.L., Moake J.L., Weiniger R.S. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: association with platelet aggregation and arterial thrombosis // Amer. J. Hemat. 1979. - Vol. 6. - P. 125-133.

100. Cohen M. Heparin-induced thrombocytopenia and the clinical use of low molecular weight heparins in acute coronary syndromes//Semin. Haematol. 1999. - V. 36. - N. 1. - P. 33-36.

101. Collen D., Lijnen H.R. Molecular basis of fibrinolysis, as relevant for thrombolytic therapy / /Thromb. Haemost. 1995. -Vol.74, N.l - P. 167-71.

102. Coller B.S. A new murine monoclonal antibody reports an activation-dependent change in the conformation and/or microenvironment of the platelet glycoprotein libXIlia complex //J. Clin. Invest. 1985. - Vol.76, N.l - P. 101-8.

103. Coller B.S. Blockade of platelet GP lib/Ilia receptors as an antithrombotic strategy //Circulation 1995. - Vol.92,N.9. -P.2373-2380.

104. Coller B.S. GP II r III antagonists: pathophysiologic and thera- b a peutic insights from studies of c7E3 Fab //Thromb. Haemost. 1997. - Vol.78, N.l. - P.730-735.

105. Cox D., Aoki T., Seki J., Motoyama Y„ Yoshida K. The pharmacology of the integrins //Med. Res. Rev. 1994. - Vol.14, N2. - P. 195-228.

106. Dennis S., Wallace A., Hofsteenge J., Stone S.R. Use of fragments of hirudin to investigate thrombin-hirudin interaction

107. Eur. J. Biochem. 1990. - Vol.188, N.l. - P.61-6.

108. Dunn F., Soria C., Thomaidis A. et al. Interaction of platelet with standart heparin and low molecular weight fractions / / Nouv. Rev. Franc. Hemat. 1984. - Vol. 26. - 249 p.

109. The EPIC Investigation. Use of a monoclonal antibody directed against the platelet glycoprotein lib/Ilia receptor in high-risk coronary angioplasty //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330,N14. -P. 956-61.

110. The EPILOG Investigators: Platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptor blockade and low-dose heparin during percutaneous coronary revascularization //N. Engl. J. Med. 1997. - Vol.336, N.24 -P.1689-96.

111. Farrell D.H., Thiagarajan P. Binding of recombinant fibrinogen mutants to platelets //J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269, N1. -P.226-31.

112. Farrell D.H., Thiagarajan P., Chung D.W., Davie E.W. Role of fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol.89, N22. - P.10729-32.

113. Ferguson J.J. 3rd EPILOG and CAPTURE trials halted because of positive interim results news. / /Circulation 1996. -Vol.93, N4. - P. 637.

114. Finney S., Seale L., Sawyer R., Wallis R. Trigenin, a new peptidic inhibitor of factor XHIa, from the blood-suking leech Haementeria ghulianii//Biochem. J. 1997. - N 324. - P. 797-805.

115. Fioravanti C., Burkholder D., Francis B., Siegl P., Gibson R. Antithrombotic activity of recombinant tick anticoagulant peptide and heparin in a rabbit model of venous thrombosis//Thromb. Res. — 1993. V. 71. - N 4. - P. 317-324.

116. Fitzgerald D.J. Platelet inhibition with an antibody to GP Ilb/IIIa // Circulation. 1989. - 80. - 6. - P. 1918-1919.

117. Fuster V., Jang I-K. Role of platelet-inhibitor agents in coronary artery disease. In: Topol EJ, editor. Textbook of interventional cardiology. Philadelphia: W.B. Saunders; 1994. p. 3-22.

118. Gartner T.K., Bennett J.S. The tetrapeptide analogue of the cell attachment site of fibronectin inhibits platelet aggregation and fibrinogen binding to activated platelets //J. Biol. Chem. 1985. — Vol.260, N22. - P.l 1891-4.

119. Girdwood R.H. Metabolism of antithrombin III (heparin co-factor) / / Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

120. Gonault-Helimann M., Huet Y., Adnof S. et al. Low molecular weight heparin fractions as an alternative therapy in heparin-indu-ced thrombocytopenia / / Haemostasis. 1987. - Vol. 17. - P. 134140.

121. Grotemeyer K.H., Scharaíinski H.W., Husstedt I.W. Two-year follow-up of aspirin responder and aspirin non responder. A pilot-study including 180 post-stroke patients //Thromb. Res. 1993. -Vol.71, N.5. - P.397-403.

122. Hand E.L., Gilbert J.D., Yuan A.S., Olah T.V., Hichens M. Determination of MK-383, a non-peptide fibrinogen receptor antagonist, in human plasma and urine by radioimmunoassay //J. Pharm. Biomed. Anal. 1994. - Vol.12, N.8. - P.1047-53.

123. Hantgan R., Jerom W., Hursting M. No effects of clot age or thrombolysis on Argatrobans inhibition of thrombin//Blood. -1998. V. 92. - N 6. - P. 2064-2074.

124. Henschen A., Edman P. Large scale preparation of S-carboxymethylated cheins of human fibrin and fibrinogen and the occurence of y-chein variants//Biochem. Biophys. Acta. 1972. - N 2. - P. 351-367.

125. Hoffman A., Markwardt F. Inhibition of the thrombin-platelet reaction by hirudin / / Haemostasis. 1984. - Vol. 14, N 7. -P. 164-169.

126. Hsiech K., Mudd M., Wilner G. Fibrin polymerization. 1. Alkilating peptide Inhibitors of fibrin polymerization//J. Mtd. Chem. 1981. - V. 24. - P. 322-327.

127. Huang T.F., Holt J.C., Kirby E.P., Niewiarowski S. Tri-gramin: primary structure and its inhibition of von Willebrand factor binding to glycoprotein Ilb/lIIa complex on human platelets //Biochemistry 1989. - Vol.28, N2. - P.661-6.

128. Huang T.F., Niewiarowski S. Disintegrins: the naturally-occurring antagonists of platelet fibrinogen receptor //J. Toxicol. Toxin Rev. 1994. -Vol.13 - P.253-273.

129. Huisse M.G. Thrombopenie incluite par l'heparine standard. Tentative therapeutique a l'aide il'une heparine de bas moleculaire //

130. Press med. 1983. - Vol. 12. - P. 643-645.

131. Huul R.S. Therapeutic use of low molecular weight heparins: the knowledge to date and their application to therapy / / International Symposium on Low Molecular Weight Heparins and Related Polysaccharides. Munich, 1991. - P.21.

132. Hynes R.O. Integrins: a family of cell surface receptors //Cell. 1987. - Vol. 48, N 4. - P. 549-54

133. Jaffe E.A., Weksler B.B. Recovery of endothelial cell prostacyclin production after inhibition by low doses of aspirin / /J. Clin. Invest. 1979. - Vol.63, N.3. - P.532-5.

134. Kaiser B., Markwardt F. Antithrombotic and haemorrhagic effects of the naturally occuring thrombin inhibitor hirudin / / Folia Haemat. 1988. - Vol. 115, N 1-2. - P. 41-46.

135. Kelton J., Levine M. Heparin-induced thrombocytopenia // Sem. Thrombosis and Haemostasis. 1986. - Vol. 12, N 1. - P. 59-62.

136. King D.L., Kelton J.G. Heparin-associated thrombocytopenia // Ann. Intern. Med. 1984. - Vol. 100. - P. 535-540.

137. Kuyas C., Doolittle L. A synthetic Gly-Pro-Arg derivate that binds to plasma albumin and inhibits fibrin formation / / Thromb. and Haemost. 1983. - Vol. 50, N 1. - P. 356.

138. Lam S. C.-T., Plow E.F., Ginsberg E.H. Platelet membrane GP lib heavy chain forms a complex with GP Ilia that binds Arg-Gly-Asp peptides // Blood. 1989. - 733. - 6. - P. 1513-1518.

139. Laudano A., Doolittle R. Syntetic pptide derivates that bing fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - N 7. - P. 3085-30-98.

140. Laudano A., Doolittle R. Fed. Proc., Biochem. 1979. - V. 38. - P. 2968-2968.

141. Laudano A., Coffrell B., Doolittle R. Syntetic peptides modeled of fibrin polymerization sites//Molecular biology of fibrinogen and fibrin/ New-York, 1983. P. 315-329.

142. Lefkovits J., Plow E.F., Topol E.J. Platelet glycoprotein lib/Ilia receptors in cardiovascular medicine //N. Engl. J. Med. -1995. Vol.332, N.23. - P.1553-9.

143. Leger D., Karniguian A., Soria J. Inhibition of some activates of thrombin by a collagen-derived octapeptide//Haemostasis. -1985. N 5. - P. 293-299.

144. Lerou J., Leelers M.H., Delahousse B. et al. Treatment of heparin associated thrombocytopenia and thrombosis with low molecular weight heparin (CY-216) // Semin. Thrombos. Haemost. 1985.- Vol. 11, N 3. P. 326.

145. Leung L., Bennett J.S., Schwartz B. New antithrombotic agents //ASH Educational Materials 1998. - P. 136-153.

146. Levine M. Low molecular weight heparin / / Agressologie.- 1989. Vol. 30, N 6. - P. 347-348.

147. Lewis B., Grassman E., Wrona L., Rangel Y. Novastan anticoagulation during renal stent implant in a patient with heparin-induced thrombocytopenia//Blood Coagulation And Fibrinolysis. -1997. V. 8. - N. 1. - P. 54-58.

148. Lewis S„ Higgins D„ Shafer J. Effect of EDTA, Gly-Pro-Arg-Pro and aminoacid replecement on the thrombin catalysed release of fibrinopeptides//Molecular biology of fibrinogen and fibrin. New York. - 1983. - P. 669-670.

149. Liem T.K., Teel R., Shukla S., Silver D. The glycoprotein lib /Ilia antagonist c7E3 inhibits platelet aggregation in the presence of heparin-associated antibodies //J. Vase. Surg. 1997. - Vol.25, N.l - P. 124-30.

150. Lynch J., Sitko G., Lehman E., Vlasuk G. Primary prevention of coronary arterial thrombosis with the factor Xa inhibitor rTAP in a canine electrolytic injuri model//Thromb. Haemost. 1995. -V. 74. - N 2. - P. 640-645.

151. Mao S., Huang J., Welebob C., Neeper M., Garsky V., Shafer J. Identification and characterization of variants of tick anticoagulant peptide with increased inhibitory potency toward human factor Xa//Biochemistry. 1995. - V. 34. - N 15. - P. 5098-5103.

152. Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin //Meth. in Enzym. 1970. -Vol.80. - P.924-32.

153. Markwardt F. Pharmacology of hirudin, one hundred years after the first report of the anticoagulant agent in medicinal leeches // Biomed. Biochim. Acta. 1985. - Vol. 44, N 5. - P. 1007-1013.

154. Martin P.D., Robertson W., Turk D„ Huber R„ Bode W„ Edwards B.F. The structure of residues 7-16 of the A alpha-chain of human fibrinogen bound to bovine thrombin at 2.3-A resolution / /J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, N.ll. - P.7911-20.

155. Miale J., Mende T. A syntetic iodinated polypeptides thatinhibits polymerization of fibrinogen//Blut. 1971. - N 2. - P. 7679.

156. Miraglia C., Greenberg C. Measurement of blood coagulation factor XHIa formation in plasma containing Gly-Pro-Arg-Pro / / Anal. Biochem. 1985. - N 1. - P. 165-171.

157. Mousa S.A., De Grado W.F., Mu D.X., Kapil R.P., Lucchesi B.R., Reilly T.M. Oral antiplatelet, antithrombotic efficacy of DMP 728, a novel platelet GPIIb/lIIa antagonist //Circulation 1996. -Vol.93, N.3. - P.537-43.

158. Newman P.J., Allen R.W., Kahn R.A. et al. Quantitation of membrane GP Ilia on intact human platelets using the monoclonal antibody // Blood. 1985. - 65. - 1. - P. 227-232.

159. Niewiarowski S., McLane M.A., Kloczwiak M., Stewart G.J. Disintegrins and other naturally occurring antagonists of platelet fibrinogen receptors //Semin. Hematol. 1994. - Vol.31, N.4. -P.289-300.

160. Nugaent D.J., Kunicki T.J., Berglund C. et al. A human monoclonal autoantibody recognizes a neoantigen on GP IIIA expressed on stored an activated platelets / / Blood. 1987. - 70. - 1. -P. 16-22.

161. Ohta N., Brush M., Jacobs J. Interaction os antistasin-related peptides with factor Xa: identification of a core inhibitory sequence/ /Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. - N 6. - P. 825-830.

162. Patrono C. Aspirin as an antiplatelet drug //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330, N.18. - P.1287-1294.

163. Phillips D.R., Charo I.F., Parise L.V., Fitzgerald L.A. The platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex //Blood 1988. -Vol. 71 N 4. -P. 831-43.

164. Phillips D.R., Scarborough R.M. Clinical pharmacology of eptifibatide //Am. J. Cardiol. 1997. - Vol.80, N.4A. - P.11B-20B.

165. Pierschbacher M.D., Ruoslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule //Nature 1984. - Vol.309, N5963. - P30-33.

166. Perutelli P., Pisano E., Mon P.G. Inhibizione recettore specific della funzione piastrinica antagonisti delle GP Ilb/lIIa: Una ras-segna // Gaslini. 1994. - 26. - 3. - P. 162-169.

167. Plow E.F., D'Souza S.E., Ginsberg M.H. Ligand binding to GPIIb-IIIa: a status report //Semin. Thromb. Hemost. 1992. -Vol.18, N3. - P.324-32.

168. Plow E.F., Ginsberg M.H. Specific and saturable binding of plasma fibronectin to thrombin-stimulated human platelets //J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, N18, - P. 9477-82.

169. Plow E.F., Srouji A.H., Meyer D., Marguerie G., Ginsberg M.H. Evidence that three adhesive proteins interact with a common recognition site on activated platelets //J. Biol. Chem. 1984. -Vol.259, N9. - P.5388-91.

170. PRISM Study Investigators: Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management. A comparison of aspirin plus tirofi-ban with aspirin plus heparin for unstable angina //N. Engl. J. Med.- 1998. Vol.338, N.21. - P.1498-505.

171. Ribas G., Carbonell E., Creus A., Xamena N., Marcos R. Genotoxicity of humic acid in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide

172. Environmental And Molecular Mutagenesis. 1997. - Vol.29, N.3.- P.272-276.

173. Root-Bernstein R., Westall R. Fibrinopeptide A binds Gly-Pro-Arg-Pro//Proc. Nat. Acad.Sci. USA. 1980. - V. 81. - P. 43394342.

174. Rostin M., Moutestruc J., Monin G. et al. Fraxiparine -clinical applications / / Fundam. Clin. Pharmacol. 1990. - N 4. - P. 17-23.

175. Ruoslahti E., Pierschbacher M.D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins //Science 1987.-Vol.238, N.4826. -P.491-7.

176. Sandercock P. Antiplatelet therapy with aspirin in acute ischeamic stroke //Thromb. Haemost. 1997. - Vol.78, N.l. -P.180-182.

177. Schror K. Antiplatelet drugs. A comparative review //Drugs 1995. - Vol.50, N.l - P.7-28.

178. Brashears L., Gottdiener P., Mee C., Kitt M.M., Gerstenblith G. Effects of Integrelin, a platelet glycoprotein II r III receptor b a antagonist, in unstable angina. A randomized multicenter trial //Circulation 1996. - Vol.94, N.9. - P.2083-2089.

179. Shattil S.J., Kashiwagi H., Pampori N. Integrin signaling: the platelet paradigm //Blood 1998. - Vol.91, N.8 - P.2645-57.

180. Smyth S.S., Joneckis C.C., Parise L.V. Regulation of vascular integrins //Blood 1993. - Vol. 81, N 11. - P. 2827-43.

181. Stone S.R. Effect of heparin on the interaction between thrombin and hirudin // Eur. J. Biochem. 1987. - Vol. 169, N 2. -P. 373-376.

182. Takagi K., Suzuki S. Anticoagulant peptides jbtained from human fibrinogen degradation products by plasmin//Thromb. Res. -1979. N 16. - P. 737-746.

183. Tanaka S., Tomoike H. Antithrombotic and haemorrhagic effects of hirudin // Jpn. Heart J. 1988. - Vol. 29. - P. 77-79.

184. Tandon N.N., Kralisz U., Jamieson G.A. Identification ofglycoprotein IV (CD36) as a primary receptor for platelet-collagen adhesion //J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264, N 13. - P. 7576-83.

185. Teng C.M., Huang T.F. Snake venom constituents that affect platelet function / /Platelets 1991. - Vol.2 - P.77-87.

186. O'Toole T.E., Katagiri Y., Faull R.J., Peter K., Tamura R., Quaranta V., Loftus J.C., Shattil S.J., Ginsberg M.H. Integrin cytoplasmic domains mediate inside-out signal transduction / /J. Cell. Biol. 1994. - Vol.124, N.6 - P. 1047-59.

187. Tsao P.W., Bozarth J.M., Jackson S.A., Forsythe M.S., Flint S.K., Mousa S.A. Platelet GPIIb/lIIa receptor occupancy studies using a novel fluoresceinated cyclic Arg-Gly-Asp peptide //Thromb. Res. 1995. - Vol.77, N.6 - P.543-56.

188. Uszynsky M. Anticoagulant activity peptides from the human placenta//Thromb. Res. 1979. - V. 16. - P. 689-694.

189. Vane J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs //Nat. New. Biol. 1971. -Vol.231, N.25. - P.2352-6.

190. Vlasuk J. Structural and functional characterization of tick anticoagulant peptide (TAP): a potent and selective inhibitor of blood coagulation factor Xa//Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - N 1. - P. 212-216.

191. Walenga J., Fasanella A., Iqbal O., Hoppensteadt D., Ahmad S., Wallis D., Bakhos M. Coagulation laboratory testing in patients treated with argatroban//Semin. Thromb. Haemost. 1999. - V. 25. - Suppl. 1. - P. 61-66.

192. Wehmeier A., Schneider W. Platelet volume parameters as a diagnostic tool: the influence of anticoagulation and storage conditions on platelet impedance volume //Klin. Wochenschr. 1989. -Vol.67, N19. - P.980-4

193. Weisel J.W., Nagaswami C., Vilaire G., Bennett J.S. Examination of the platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex and its interaction with fibrinogen and other ligands by electron microscopy //J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, N23. - P. 16637-43.

194. Wenkel-Drace J.D. Evidence for a cycking receptor pool // Amer. J. Pathol. 1990. - 136. -1. - P. 61-70.

195. Watt K., Cotrell B., Strong D„ Doolittle R. Amino acid sequence studies on the a-chein of human fibrinogen//Biochemistry.-142 1979. N 24. - P. 5410-5416.

196. Yang H.L., Hseu Y.C., Lu F.J., Tsai H.D. Humic acid reduces protein-C-activating cofactor activity of thrombomodulin of human umbilical vein endothelial cells // British Journal Of Haematol-ogy. 1998. - Vol.101, N.l. - P. 16-23.

197. Yeh C.H., Peng H.C., Yih J.B., Huang T.F. A new short chain RGD-containing disintegrin, accutin, inhibits the common pathway of human platelet aggregation //Biochim. Biophys. Acta. -1998. Vol.1425, N.3. - P.493-504.

198. Yeh S.P., Hsueh E.J., Wu H„ Wang Y.C. Ticlopidine-associated aplastic anemia. A case report and review of literature //Ann. Hematol. 1998. - Vol.76, N.2. - P.87-90.

199. Zucher M. Heparin and platelet function//Fed. Proc. -1979. V. 36. - P. 47-52.