Эффекторы свертывания крови природного происхождения: экспериментальное исследование тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кортусов, Вадим Леонидович

• Кортусов, Вадим Леонидович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кортусов, Вадим Леонидович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. АНТИКОАГУЛЯНТЫ ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ

Обзор литературы)

2.1. Антиполимеризационная активность гепарина

2.2. Синтетические и природные пептидные антикоагулянты

2.3. Эффекторы агрегации тромбоцитов

2.3.1. GP IIb/IIIa-рецепторы тромбоцитов

2.3.2. Моноклональные антитела

2.3.3. Непептидные ингибиторы IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов

2.3.4. Пептидные ингибиторы IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Выделение и очистка эффекторов из сапропеля

4.2. Механизм действия эффекторов из сапропеля на плазмокоа-гуляцию

4.3. Влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов

4.4. Гемокоагуляционные изменения при внутривенном введении эффекторов из сапропеля лабораторным животным

4.5. Влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов при их внутривенном введении лабораторным животным

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эффекторы свертывания крови природного происхождения: экспериментальное исследование»

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагий, несет ограничительную и защитную функции, препятствуя распространению из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутотоксинов (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1982; Баркаган З.С., 1988). Нарушения в этой системе предопределяют развитие геморрагий, тромбогеморрагий, ишемических изменений в органах, создают предрасположенность к тромбозам. Все эти нарушения, как известно, являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови.

Независимо от этиопатогенеза тромбоэмболических осложнений одним из средств их предупреждения и коррекции являются антикоагулянты, введением которых достигается либо угнетение синтеза прокоагулянтов (антибиотики, цитостатики), либо ограничение по-стрибосомального формирования прокоагулянтов (антивитамины К). Эти группы антикоагулянтов (антикоагулянты непрямого действия) используются для создания медленно развивающейся стабильной ги-покоагулемии. Однако, практическая медицина нуждается, как правило, в быстром эффекте, который обеспечивается антикоагулянтами прямого действия. Среди них чаще других применяется гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным эффектом (Кудряшов Б.А., 1992). Хотя гепарин и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность вызывать агрегацию тромбоцитов (Bertele V. е.а., 1983; Cimo P.L. е.а., 1979) и тромбоцитопению (Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J.Y. e.a., 1986). Известны данные и о существовании гепаринорезистентности (Барка-ган З.С. и соавт., 1982; 1988). Нередко отмечаются тромбоэмболиче-ские осложнения после отмены гепарина, связанные с так называемым "эффектом бумеранга" (Nordon е.а., 1981).

К числу применяемых антикоагулянтов прямого действия относятся гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных /Чазов Е.К., Лакин К.М., 1977; Ена Я.М., 1992; Никонов Г.И. и соавт., 1999/ и обладающие антитромбиновым действием /Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988/. Практического применения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны/Баскова И.П., 1991/.

Исследования в области поиска естественных или создания новых синтетических средств направленного воздействия на гемостаз не прекращаются уже много лет. В этом плане активно изучаются ингибиторы тромбина (Markwardt, 1974), активаторы фибринолиза и фиб-ринолитики (Терешин И.М., Гринберг Г.Е., 1981; Андреенко Г.В., 1981), исследуются иммобилизированные ферменты и комплексные препараты (Мамедов Я.Д. и соавт., 1981). Не остались в стороне и растения, как источники веществ, модифицирующих гемостаз, среди которых найдены как активаторы (Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983), так и ингибиторы свертывания крови (Рогов А.В., и соавт., 2003; Кол-хир В.К., Соколов С.Я., 1982; Wang е.а., 1984). Вместе с тем большинство проведенных исследований посвящены поиску средств фармакологической коррекции гемостаза, влияние которых реализуется либо через ограничение тромбиногенеза, либо дезагрегацию тромбоцитов /Чирятьев Е.А., Калинин Е.П., 2001/.

В отношении ограничения агрегации тромбоцитов общая картина выглядит еще более удручающей, поскольку истинных эффекторов агрегации тромбоцитов, имеющих практическое применение, не существует, а применяемые антагонисты этой функции тромбоцитов помимо агрегации изменяют многие другие параметры систем организма /Бышевский А.Ш. и соавт., 1996/. К ним прежде всего относится ацетилсалициловая кислота, которая необратимо ингибирует циклоок-сигеназу тромбоцитов/Jaffe, Weksler, 1979/, синтез тромбоксана Аг и простациклина/Уапе, 1971; Burch е.а., 1978; Fuster, Jang, 1994/. Однако, поскольку эндотелиальные клетки способны к регенерации циклоокси-геназы, ингибирующее действие аспирина на эндотельальный проста-циклин кратковременно, а агрегация тромбоцитов может происходить даже в присутствие аспирина, поскольку он значительно не ингибирует другие важные активаторы тромбоцитов типа тромбина и АДФ. В то же время длительное применение аспирина в высоких дозах вызывает негативные явления - образование желудочных язв, внутричерепные и желудочно-кишечные геморрагии и др. /CAPRIE Steering Committee, 1996; Hass е.а., 1989/.

Более новыми антиагрегантами являются производные тиено-пиридинов (тиклопидин, клопидогрель), которые ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. По данным клинических исследований они эффективней аспирина /CAPRIE Steering Committee, 1996/, но вызывают тяжелейшие побочные эффекты - нейропению, апластическую анемию, тромбоцитопению и др. /Yeh е.а., 1998; Bennett е.а., 1998/.

В связи с этим уже много лет остается актуальной проблема поиска новых антикогулянтов прямого действия и антиагрегантов. Так, проходят этап доклинических испытаний пептиды - антифакторы Ха, в частности Антистатин, состоящий из 119 аминолислот /Ohta, Brush, Jacobs, 1994; Ostrem e.a., 1998/, клещевой пептидный антикоагулянт, содержащий 60 аминокислот /Fioravanti e.a., 1993; Мао e.a., 1995; Lynch e.a., 1995/, полипептид (133 аминокислоты), выделенный из слюны медицинской пиявки /Kornowski e.a., 1996/.

Исследуются пептидные ингибиторы, ограничивающие тром-бинзависимое превращение фибриногена, имеющие в своем составе аналоги N-концевого участка а-цепи фибриногена с последовательностью GPR /Laudano, Doolittle, 1978; 1979/. Подобные пептиды выделены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/. В то же время применение этой группы пептидов в качестве антикоагулянтов прямого действия in vivo пока невозможно вследствие их быстрой элиминации из кровотока /Чипенс Г.И., 1982; Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/.

Исследования новых эффекторов агрегации тромбоцитов в настоящее время преимущественно сосредоточены на антагонистах GP IIb/IIIa-рецепторов ввиду стержневой роли GP Ilb/IIIa как медиатора агрегации. Среди них можно отметить разработку искуственных антител (с мышиными и человеческими компонентами) /Coller, 1995; Coller е.а., 1983; Charo e.a., 1987/, пептидых антиагрегантов, имитирующих RGD-последовательность а-цепи фибриногена, распознаваемую GP Ilb/IIIa, и действующих как конкурентные антагонисты фибриногена /Lefkovits е.а., 1995/.

В лабораториях ТГМА из некоторых растений выделены глико-пептиды, механизм действия которых отличен от гепарина, но имеющий сходство с пептидами - аналогами N-концевого участка а-цепи фибриногена и пептидами, выделенными из плазмы крови человека и животных /Дементьева И. А., 1991; Русакова О.А., 1993/. По данным

И.А. Дементьевой (1991), О.А. Русаковой (1993) и А.Г. Губаева (1996) растительные гликопептиды действуют достаточно продолжительно (до 24 ч после однократной инъекции), не вызывают гиперкоагулемии и не обладают токсическим действием. Однако их сырьевая база незначительна.

Пептидные эффекторы содержатся во многих водных растених, обеспечивая до 80% органической фазы донных иловых грязей. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов-антикоагулянтов, однако в процессе естественного концентрирования путем формирования сапропелей их содержание в сапропеле может достигать значительных величин /Яковлева Н.В., 1998/, а сырьевая база неограничена.

Предыдущие исследования подтвердили наличие в экстрактах сапропеля веществ, эффект которых реализуется на заключительном этапе свертывания крови /Яковлева Н.В., 1998/. Но полученные данные не полны, исследования не затрагивали тромбоцитарный компонент свертывания крови, хотя известно что фибриноген - ключевой субстрат заключительной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии тромбоцитов взаимодействуя с рецепторами тромбо-цитарных мембран /Панченко Е.П., 1997/. Кроме этого, не исследовалось наличие токсичности в эксперименте с изучаемыми эффекторами.

Цель исследования - выделить из сапропеля фракции, обладающие антикоагулянтной активностью, установить их механизм действия на плазмокоагуляцию и тромбоцитарный гемостаз.

Задачи исследования. 1. Разработать способ получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью. 2. Изучить ее механизм действия на плазмокоагуляцию. 3. Выделить и очистить эффекторы свертывания крови из сапропеля. 4. Изучить влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов in vitro и in vivo.

Научная новизна. Впервые разработан способ выделения двух индивидуальных эффекторов свертывания крови, обладающих анти-коагулянтной активностью. Установлено, что носителями антикоагу-лянтных свойств являются соединения пептидной природы.

Расшифрован механизм ограничения эффекторами процесса плазмокоагуляции: ингибирование фибринообразования реализуется на уровне коагуляционных превращений фибриногена.

Впервые установлено, что полученные эффекторы из сапропеля угнетают АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vivo и in vitro.

Практическая ценность. Впервые разработан способ получения антикоагулянтов из сапропеля - дешевого сырья с неограниченными запасами, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условиях.

Эффекторы из сапропеля способны эффективно ограничивать как плазменной, так и тромбоцитарный компоненты гемостаза in vivo и in vitro, что обусловливает их ценность, как перспективных средств коррекции гемостаза.

Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В сапропеле содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть получены в индивидуальном виде.

2. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемыми эффекторами отличен от механизма известных прямых антикоагулянтов и реализуется на заключительном этапе свертывания крови - коагуля-ционном превращении фибриногена.

3. Эффекторы из сапропеля способны ингибировать агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме при ее индуцировании растворами АДФ и адреналина.

4. При внутривенном введении лабораторным животным суммы эффекторов развивается стойкая гипокоагулемия за счет угнетения плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза.

Апробация и публикации. Материалы работы опубликованы в журналах: «Медицинская наука и образование Урала», «Медицинская наука и образование Урала и Сибири», «Тромбоз, гемостаз и реология», доложены на научно-практической конференции Урал ФО «Актуальные вопросы лекарственного обеспечения населения УралФО в системе дополнительного лекарственного обеспечения.

Объем и структура работы. Материалы исследования, включая указатель литературы, изложены на 154 страницах машинописного текста. В работе содержатся 37 рисунков, 1 схема и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (представленным 96 отечественных и 156 зарубежных автора), главы (содержащей 5 подраздела), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кортусов, Вадим Леонидович

6. выводы

1. Установлен источник антикоагулянтов прямого действия -сапропель.

2. Разработан способ, позволяющий получать из сапропеля два индивидуальных высокоочищенных эффектора свертывания крови с антикоагулянтной активностью.

3. Механизм действия эффекторов из сапропеля отличается от механизма действия прямого антикоагулянта - гепарина. Ингибитор-ный эффект реализуется на уровне коагуляционного превращения фибриногена, в частности, на этапе аутополимеризации мономерного фибрина путем образования малоактивных комплексов эффекторов с фибринмономером посредством электростатических связей.

4. Механизм действия эффекторов I и II не идентичен между собой. Эффектор I ограничивает формирование из олигомеров протофибрилл, а эффектор II - образование олигомеров. При их совместном влиянии на коагуляционное превращение фибриногена наблюдается синергизм эффектов.

5. Эффекторы из сапропеля обладают антиагрегационной активностью, ограничивая АДФ- и адреналин-зависимую агрегацию тромбоцитов. Эффектор I перимущественно ингибирует АДФ-индуцированную агрегацию, а эффектор II - адреналин-зависимую, угнетая высвобождение внутренних факторов агрегации тромбоцитов.

6. Внутривенное введение лабораторным животным суммы эффекторов из сапропеля приводит к развитию стойкой гипокоагулемии, обусловленной угнетением плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза. Превентивное введение эффекторов предотвращает гибель животных от тромбоза при экзогенной тромбопластинемии.

7. Сочетание антикоагулянтных и антиагрегантных свойств эффекторов из сапропеля определяет необходимость их дальнейшего изучения, как перспективных средств коррекции гемостаза.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Недостаточность арсенала противосвертывающих средств, высокая потребность в них, связанная с ростом частоты заболеваний, осложняющихся тромбозами, определяет необходимость дальнейшего поиска антикоагулянтов, в том числе антикоагулянтов прямого действия, так как последние представлены по существу только гепарином.

Коагуляционные превращения фибриногена, по данным Б.А. Кудряшова и соавт. (1970-1988), а также Triantaphyllopoulos (1964), М.А. Розенфельд и соавт. (1973), Д.М. Зубаирова и соавт. (1981), ограничивает вышеуказанный прямой антикоагулянт - гепарин и его комплексы с многочисленными биологически активными веществами. Эти комплексы характеризуются однотипным действием: тормозят превращение фибриногена в фибрин на стадии самосборки и ли-зируют нестабилизированный фибрин. Лизис нестабилизированного фибрина обусловлен тем, что комплексы гепарина взаимодействуют с фибриллярными структурами, конкурируя за связи, которые обеспечивают существование полимера. Под воздействием комплексов фибрин распадается на частицы, приобретающие характер мономерного фибрина.

Способность комплексов гепарина взаимодействовать с мономерным фибрином, находящимся в полимере, подразумевает их взаимодействие со свободным фибринмономером, что подтверждено Е.С. Житниковой и A.M. Ульяновым (1979). Естественно, в присутствии гепарина или его комплексов, мономерный фибрин теряет способность к аутополимеризации. Однако вопрос о физиологическом значении гепарина и его комплексов в ограничении самосборки фибрина остается открытым. Доказано лишь, что гепарин, в количестве, во много раз превышающем физиологическое, тормозит самосборку in vitro (Михалева И.В., 1988), a in vivo таким же эффектом (в высоких концентрациях) обладают искусственно созданные комплексы этого вещества с белковыми соединениями (Тажудинова С.И., 1987).

В последние годы появились указания на возможность тормозить в организме заключительный этап коагуляционных превращений фибриногена - самосборку фибрина - синтетическими пептидами (Kuyas, Doolittle, 1983). Выраженный антикоагулянтный эффект указанных пептидов привлек пристальное внимание исследователей и в последние годы активно изучаются синтетические производные, включающие этот трипептид, как перспективные антикоагулянты прямого действия (Kuyas, Doolittle, 1983; Miraglia, Grenberg, 1985; Lau-dano, Doolittle, 1979), синтезировали серию пептидов, соответствующих концевым фрагментам С- и N-цепей фибрина и показали, что пептиды Gly-Pro-Arg-Pro и Gly-Gys-Arg-Pro избирательно и обратимо связываются с фибриногеном. Ингибирование процесса самосборки фибрина пептидами этого типа обусловлено электростатической природой связей, возникающих при комплексообразовании пептид-мономера (Петросян М.Т. и соавт., 1984). Установлено, что укорочение пептида с С- или N-конца, замена или перестановка одной из аминокислот, приводит к снижению или потере ингибиторной активности. Из синтезированных пептидов Gly-Pro, Pro-Arg, Gly-Pro-Arg, Gly-Ser-Arg-Pro, Gly-Gys-Arg-Pro, Gly-Pro-Arg-Pro наиболее активен последний, несколько менее - Gly-Pro-Arg, остальные неактивны. Следовательно, для проявления антиполимеризационной активности необходимо наличие в пептиде природной последовательности Gly-Pro-Arg, причем глицин должен находиться в первом положении.

Указанный тип пептидов не только тормозит самосборку, но и ингибирует взаимодействие фибриногена с тромбоцитами, что предотвращает их агрегацию /Васильева Г.А. и соавт., 1983/, являются вазоактивными агентами, улучшая микроваскулярную проницаемость /Цейтин В.М. и соавт., 1982/.

Недостатком короткоцепочных пептидов, как антикоагулянтов прямого действия, является их быстрая элиминация из кровотока /Чипенс Г.И., 1982/.

Ассортимент изучаемых пептидных антикоагулянтов не ограничивается только синтетическими пептидами. Так, Е.А. Чирятьевым и соавт. /1980-2000 гг/ были обнаружены и изолированы пептиды из плазмы крови человека и животных, тормозящие процесс самосборки фибрина in vivo и in vitro. Расшифрован их аминокислотный состав и последовательность, определена физиологическая роль. При этом установлено, что обнаруженные пептидные ингибиторы являются наиболее древними регуляторами коагуляционного превращения фибриногена: их уровень в крови и тканях животных уменьшается по мере филогенетического и онтогенетического «старения», т.е. по мере уменьшения удельной значимости коагуляционного превращения фибриногена в цепи реакций, ведущих к образованию фибрина. Это согласуется с теорией о том, что биологически активные пептиды относятся к наиболее древним регуляторам многих биохимических и физиологических процессов, протекающих в организме в целом и отдельной живой клетке /Ашмарин И.П., 1979; Климов П.К., 1984/.

В то же время использование пептидов животного происхождения с целью фармакологической коррекции гемостаза не представляется возможным - развивающаяся после инъекции пептидов гипокоагулемия черезвычайно кратковременна в силу той же быстрой элиминации из кровотока /Чирятьев Е.А., 1990; Умутбаева М.К., 1984/.

Одну из возможностей получения антикоагулянтов прямого действия представляют растения, относительно которых имеются указания на свойственную им гемокоагуляционную активность (Туро-ва А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983; Gabbs, Green, 1984; Киселева А.В., 1983). В частности, публикации, вышедшие за последние годы из лабораторий кафедры биохимии, фармакогнозии и фармакологии Тюменской медицинской академии, свидетельствуют, что из растений возможно получение прямых антикоагулянтов, предотвращающих образование фибрина за счет ограничения превращений фибриногена. Такие данные были получены в отношении травы медуницы мягчайшей (Герберт И.Я., 1990; Дементьева И.А., 1992) и сабельника болотного (Нохрина Н.Э., 1993), что продемонстрировало целесообразность более систематических исследований растений с целью поиска источников подобных веществ.

О.А. Русаковой (1993) был проведен скрининг 200 видов растений, произрастающих в Тюменской области, либо характерных для флоры Западной Сибири. Автором установлено, что некоторые из растений содержат прямые антикоагулянты, реализующие свой эффект на уровне заключительной фазы свертывания крови. Среди них выделяются медуница мягчайшая, нонея темная, кривоцвет полевой, окопник лекарственный, относящиеся к семейству бурачниковых и отличающиеся высоким содержанием прямых антикоагулянтов. Гораздо больше установлено растений с малым содержанием антикоагулянтов и эти растения не представляют интереса в плане промышленного получения ингибиторов, хотя среди них встречаются такие широко распространенные растения, как сине-зеленые водоросли, сырьевые ресурсы которых практически не ограничены.

Хорошо известно, что сине-зеленые водоросли после отмирания естественным образом концентрируются в иловых донных отложениях некоторых озер - в сапропелях. По сведениям Н.В. Кордэ

1960) в некоторых случаях до 80% органической фазы сапропелей может быть обусловлено сине-зелеными водорослями.

В связи с этим источником антикоагулянтов мы избрали сапропель, как концентрат сине-зеленых водорослей.

Рядом приемов, включающих экстракцию сапропеля дистиллированной водой, отстаивание экстракта, упаривание водной фракции и ее фильтрацию через полупроницаемую мембрану Т-100 и гель-фильтрации, нами получена стандартная фракция сапропеля. Используя эту фракцию, мы разработали способ количественного определения антикоагулянтной активности в условных единицах активности (ЕА), что позволило устанавливать изменения удельного содержания ингибиторов в процессе выделения и контролировать их содержание в экспериментах in vitro.

При расшифровке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови прежде всего мы с помощью объективного способа (регистрация процесса свертывания плазмы в динамике коагуло-графом Н 334) убедились, что полученная нами высокоочищенная фракция сапропеля обладает выраженной антикоагулянтной активностью. При этом в качестве субстрата использовали пулированную донорскую плазму, а в качестве эффектора - фракцию сапропеля, содержащую 100 ЕА/мл. При такой концентрации эффектора время, затраченное на формирование сгустка фибрина, возросло на 8,3% при увеличении общей продолжительности свертывания на 64,3%, а время от момента инициации свертывания до начала формирования фибри-нового сгустка соотносится в опыте и контроле как 6:1. Возрастание времени, затрачиваемого на формирование фибрина может свидетельствовать об определенном влиянии эффектора на этот процесс. Такое предположение требует исключения или подтверждения проявления гепариноподобной активности изучаемого носителя, т.к. из широко известных антикоагулянтов прямого действия только гепарин и его комплексы обладают способностью ограничивать скорость процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Изучение эффективности торможения скорости реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном исследуемым экстрактом, гепарином, сывороткой крови, разведенной в 10 раз, как источника антитромбина III, порознь, а также в сочетании гепарин-сыворотка, экстракт-сыворотка, экстракт-гепарин показало, что при совместном влиянии на реакцию тромбина с фибриногеном гепарина и сыворотки обнаруживается выраженный синергизм - экспериментально установленная суммарная эффективность торможения выше теоретической на 32,8%. При влиянии на эту же реакцию экстракта и гепарина обнаруживается некоторое снижение экспериментально установленной эффективности торможения по отношению к рассчитанной теоретически - на 2,6% что статистически недостоверно. При исследовании пары экстракт-антитромбин III, мы наблюдали статистически достоверное снижение эффективности торможения по сравнению с теоретически рассчитанной - на 14,8%. Следовательно, механизм ограничения скорости реакции тромбина с фибриногеном гепарина и экстракта из сапропеля принципиально различается.

Нами также показано, что изучаемый эффектор практически в равной степени реализует свою активность, независимо от того, протекает ли свертывание по внешнему или по внутреннему пути. Следовательно, вероятнее всего, носитель антикоагулянтной активности оказывает преимущественное влияние на этапах, следующих за образованием тромбина. Тем не менее мы провели серию экспериментов по выяснению влияния ингибитора на различные этапы плазмокоагуля-ции, используя в качестве субстрата фактор-дефицитные плазмы, а именно плазмы дефицитные по факторам II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам.

Оказалось, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратных плазм, дефицитных по фактору II и кининам, а эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII (различия в контрольных и опытных тестах не достоверны).

Выраженная зависимость степени эффективности торможения изучаемой фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм (за исключением плазмы, децифитной по кининам), дополнительно свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной активности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции -тромбинзависимое превращение фибриногена; недостаток образующегося тромбина приводит к удлинению процесса свертывания фибриногена и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

В то же время, невозможно отрицать полное отсутствие ин-гибиторного эффекта на этапы, предшествующие процессу тром-бинзависимого превращения фибриногена. Для разрешения этого вопроса мы провели серию экспериментов, дифференцирующих влияние ингибитора на этапы,предшествующие взаимодействию тромби на с фибриногеном (I и II фазы свертывания) и этап коагуляцион-ного превращения фибриногена (III фаза свертывания). Это позволило нам констатировать тот факт, что до 60% общей антикоагулянтной активности реализуется на уровне III фазы свертывания крови.

Взаимодействие тромбина с фибриногеном протекает в два этапа, один из которых ферментативный, приводящий к образованию мономерного фибрина, а второй - аутореакция, в результате которой формируется трехмерная структура фибрина. В свою очередь в ауто-полимеризации мономерного фибрина также можно выделить несколько стадий: первичное накопление мономерного фибрина и формирование олигомеров, взаимодействие олигомеров между собой и их латеральная агрегация, сопровождающаяся формированием протофибрилл и, наконец, агрегация протофибрилл и образование сети нестабилизи-рованного фибрина. С помощью разработанных нами приемов, таких как дифференцированная оценка влияния ингибитора на ферментативную и неферментативную фазы превращения фибриногена в изолированной системе, содержащей фибриноген и тромбин, изучение влияния ингибитора на разные стадии самосборки фибрина, использование метода «тестирования стадий», разработанного В.А. Бе-лицером (1975), мы убедились в том, что исследуемый нами эффектор преимущественное влияние (до 70% от общей антикоагулянтной активности) оказывает на неферментативный этап превращений фибриногена под действием тромбина, и, одновременно, несколько ограничивает сам процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном (но не активность тромбина). Таким образом, основной точкой приложения изучаемой антикоагулянтной активности можно считать заключительную фазу свертывания с преимущественным влиянием эффектора на самосборку мономерного фибрина. Исследование самосборки в присутствии и отсутствии ингибитора в зависимости от условий среды, в которой протекает процесс (изменение рН, ионной силы, содержания веществ, конкурирующих за водородные связи и температуры среды), позволило установить, что доминирующими силами, обеспечивающими взаимодействие субстрата с эффекторами в физиологических условиях, являются электростатические силы.

Далее мы разработали оригинальный способ выделения чистых эффекторов свертывания. В данном разделе диссертации мы не приводим подробного изложения способа, поскольку он описан в разделе «Собственные исследования», а ограничиваемся только технологической схемой процесса (схема 1).Этот способ позволяет получать высо-коочищенный носитель антикоагулянтной активности без примеси гуминовых кислот, с которыми он образует прочные электростатические связи.

Оказалось, что при гель-фильтрации очищенного носителя на колонке, заполненной гелем сефадекса G-50, носитель разделяется на два индивидуальных компонента, различающихся по молекулярной массе: объем выхода наиболее активной фракции первого компонента составил 35 мл (внешний объем колонки - 15 мл), а второго - 46 мл.

Имея в своем распоряжении чистые эффекторы свертывания и зная их природу, мы перешли к изучению механизмов ограничения свертывания эффекторами I и II порознь. Для этого прежде всего мы определили характер влияния в зависимости от их концентрации на весь процесс плазмокоагуляции, когда задействованы все факторы внутреннего пути свертывания; на процесс коагуляционного превращения фибриногена - в реакции участвуют только тромбин и фибриноген; на процесс аутополимеризации мономерного фибрина - используется активированный фибриноген и реакция состоит из формирования протофибрилл с последующей их агрегацией.

Размораживание (24°C)j

Схема 1. Технологический процесс получения носителей антикоагулянтной активности из сапропеля.

Результаты этих экспериментов показали, что в каждом из них характер зависимости для эффекторов I и II примерно одинаков - направленность кривых однотипна. В то же время, чем сложнее тест, тем выше концентрация эффекторов, требуемая для достижения одной и той же эффективности торможения реакции свертывания. Так, если принять за 100% концентрацию эффекторов, обусловливающих 30%-е торможение реакции в тесте "Время рекальцификации» то эта же эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном достигается 71% концентрации тех же эффекторов. Торможение аутополимеризации требует еще меньшие концентрации - около 30%. Это свидетельствует об однотипности действия эффекторов I и II на процесс плазмокоагуляции и о наибольшей чувствительности к ним процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали процесс свертывания плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза в цифровом выражении.

Уже на этом этапе исследований стало ясно, что влияние изучаемых эффекторов на свертывание крови различно. Эффектор I почти по всем определяемым показателям оказался активнее эффектора II. Так, эффектор I увеличивает латентный период до начала свертывания в 2 раза, эффектор II его не изменяет. Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II - только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II - в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагуло-граммой, записанной в присутствии суммы эффекторов I и II: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм.

Выше мы показали, что чем архитектурно сложнее тест свертывания, тем больше требуется эффектора для достижения одной и той же эффективности торможения. Следовательно, не исключена возможность действия эффекторов на этапах, предшествующих коагуляцион-ному превращению фибриногена, на которых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных тестах были бы равны, или, по крайней мере, сопоставимы. Это сомнение усиливается тем, что, до данным электрокоагулограммы, эффектор I удлиняет период до начала формирования фибринового сгустка.

Для разрешения данного вопроса мы разработали методику, позволяющую вычленить из общего каскада реакций свертывания процесс коагуляционного превращения фибриногена. Суть этой методики заключается в том, что пулированную донорскую плазму освобождают от фибриногена путем мягкой тепловой денатурации (56°С, 3 мин). Если к такой дефибринированной плазме прибавить фибриноген, эффекторы и затем провоцировать свертывания, то эффекторы могут влиять на любой из этапов плазмокоагуляции. Если же в дефибринированной плазме сначала инициировать активацию каскада свертывания, а после сформирования тромбина прибавить фибриноген и эффекторы, то последние могут оказать влияние только на коагуляционное превращение фибриногена.

Результаты такого эксперимента показали, что эффективность торможения в обоих вышеописанных случаях практически равна между собой при использовании как эффектора I, так и эффектора II. Следовательно, первоначальное предположение о том, эффекторы реализуются на уровне коагуляционного превращения фибриногена, оказалось верным, а различия в механизме влияния эффекторов на свертывание наблюдаются именно на этапе превращений фибриногена.

Для подтверждения этого вывода мы определили эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном эффекторами порознь и их суммой, сопоставляя при этом ожидаемый эффект (расчитан по Уэбб JL, /1966/) и полученный фактически. Ожидаемый (теоретический) эффект был существенно ниже (в среднем на 70%), что говорит о синергизме эффекторов. Одновременно эти данные свидетельствуют и о том, что механизм влияния исследуемых эффекторов на коагуляционное превращение фибриногена различен: в случае одинакового механизма мы наблюдали бы суммацию эффектов при недостатке эффекторов в системе, или антагонизм - при перенасышении системы эффекторами.

Еще более объективные сведения о различии в механизме действия эффекторов мы получили, наблюдая процесс коагуляционного превращения фибриногена с помощью нефелометра с автоматической регистрацией этапов этого процесса.

Эффектор I, по сравнению с контролем, в среднем всего на 9,7% задерживает формирование олигомеров и на 81% увеличивает время, необходимое для формирования фибринового сгустка. Так как агрегация протофибрил - это практически мгновенный процесс, то эффектор I в основном тормозит аутополимеризацию достаточено зрелых олигомеров. В отличие от этого эффектор II преимущественно блокирует сборку мономеров и олигомеров - на нефелограмме нет фазы увеличения агрегатов до критического значения. Однако при этом время формирования фибринового сгустка увеличивается в среднем на 70% по отношению к контролю.

Мы провели исследования влияния эффекторов (в равных концентрациях) из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10 мкг/мл) и адреналин (раствор Тоногена), так как результаты значений интенсивности агрегации, вызываемые вышеуказанными индукторами, наиболее удовлетворительны, причем интенсивность агрегации, вызываемая АДФ, хорошо коррелирует с интенсивностью агрегации, вызываемой адреналином /Avenarius, Deinhardt, 1980/.

Оба изучаемых эффектора в этих условиях ингибируют агрегацию тромбоцитов, но их механизм действия, как и влияние на процесс коагуляционного превращения фибриногена, существенно различается.

Так, при использовании АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл эффекторы I и II практически не изменяют первую волну агрегации, характеризующую агрегацию тромбоцитов под влиянием индуктора, но заметно угнетают вторую волну, характеризующую высвобождение внутренних медиаторов агрегации. Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II практически не отличаются между собой и меньше контрольного значения на 33,8 и 37,5% соответственно. Эффекторы I и II укорачивают время, необходимое для достижения максимальной величины второй волны, но с разной интенсивностью -на 62,5 и 37,5% соответственно. Кроме этого, эффектор I активирует процесс дезагрегации, а эффектор II на него не влияет.

Существенные различия в механизме антиагрегационного действия наблюдаются при повышении концентрации индуктора до 10 мкг/мл. В этом случае в контроле первой волны агрегации не наблюдается. Нет ее и в присутствии эффектора II, но первая волна агрегации появляется в присутствии эффектора I.

Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II меньше контрольного значения на 46,9 и 33,2% соответственно. Эффектор II существенно не изменяет время наступления максимальной величины второй волны, а эффектор I увеличивает его в среднем на 17%.

При использовании в качестве индуктора адреналина эффектор I сглаживает первую волну агрегации, вполовину уменьшает максимальную величину второй и на 12,7% удлиняет время достижения ее максимума. В отличие от этого, эффектор II, не изменяя величины максимума первой волны агрегации, в два раза увеличивает время, необходимое для его достижения, на 50,4% уменьшает максимальную величину второй и на 20,6% удлиняет время достижения ее максимума.

Антиагрегационную активность эффекторов in vivo оценивали после внутривенного их введения в дозе 5 мг/кг массы тела животного. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10,0 мкг/мл) и раствор Тоногена.

Уже на 3 мин после инъекции эффекторов мы наблюдали максимальное снижение степени агрегации тромбоцитов: при АДФ-индуцированной (2,5 и 10,0 мкг/мл) максимум агрегации меньше контрольного значения почти в 2 раза; при адреналин-индуцированной агрегации интенсивность агрегации тромбоцитов снижалась на 33,6%. Далее антиагрегационная активность эффекторов постепенно снижается, нивелируясь к 6 ч после однократной иъекции.

Таким образом, обобщая результаты исследований, можно заключить, что основным этапом свертывания, на котором могут реализоваться эффекторы, является процесс коагуляционного превращения фибриногена и, преимущественно, его неферментативный этап - ауто-полимеризация мономерного фибрина.

Механизм дейстрия эффекторов различен: эффектор I оказывает слабое влияние на формирование олигомеров фибрина, но выраженное - на сборку протофибрилл. Наоборот, эффектор II блокирует начальные стадии полимеризации фибрина. Оба эффектора являются антиаг-регантами, оба ограничивают высвобождение внутренних медиаторов агрегации. При этом эффектор I по сравнению с эффектором II сильнее угнетает реакции высвобождения АДФ-индуцированной агрегации и наоборот, эффектор II мощнее реализует свой антиагрегационный потенциал при адреналин-индуцированной агрегации.

При внутривенном введение эффекторов лабораторным животным они достаточно длительно циркулируют в кровотоке, создавая продолжительную гипокоагулемию за счет угнетения как плазменного, так и тромбицитарного компонентов гемостаза. Антикоагулянтное действие эффекторов дозазависимо, а их превентивное введение эффективно предупреждает развитие тромбозов при воздействиях, сопровождающихся тромбопластинемией.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости дальнейшего подробного изучения эффекторов из сапропеля, как перспективных антикоагулянтов прямого действия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кортусов, Вадим Леонидович, 2007 год

1. Азарова, Л.А. Антикоагулянты прямого действия на основе химически модифицированных природных полисахаридов: дисс. .,. канд. мед. наук./ Л.А. Азарова //М., 1990. С. 14.

2. Андреев, В.М. Случай острого гепатита от гепарина / В.М. Андреев, И.А. Анисимова, Ф.Р. Нугманова //Казанский мед. журн. -1983.-№3.-с. 220.

3. Андреенко, Г.В. Биохимические аспекты тромболизиса / Андре-енко Г.В. // Актуальные проблемы гемостазиологии / Под ред. Е.И. Чазова.-М.: Наука, 1981.-С. 109-116.

4. Балуда, В.П. Лабораторные методы исследования гемостаза / В.П. Балуда, З.С. Баркаган, Е.Д. Гольдберг и др. // Томск. 1980. -315с.

5. Баркаган, З.С. Геморрагические заболевания и синдромы / З.С. Баркаган // М.: Мед., 1988. 528 с.

6. Баркаган, З.С. Механизмы гепаринорезистентности и их клиническое значение / З.С. Баркаган, В.Г. Лычев, К.М. Бишевский и др. //Терапевт, арх. 1992. Т. 54, № 8. - С. 77-82.

7. Баркаган, З.С. О применении фраксипарина для профилактики и лечения тромбоэмболий с индуцированной гепарином тромбоци-топенией/ З.С. Баркаган //Тер. арх. 1993. - Т. 65. - № 10. - С. 77-82.

8. Баскова, И.П. Биологически активные вещества, продуцируемыемедицинской пиявкой (Н.ш.) и механизмы их действия: Автореф.126дисс. докт. биол. наук./ И.П. Баскова // М., 1986. 46 с.

9. Башков, А.С. Низкомолекулярные гепарины / А.С. Башков //Эксперим. и клин, фармакология. 1993. № 4. - С. 66-76.

10. Беленький, M.JI. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / M.JT. Беленький// М.: Мед., 1963. С. 34-38.

11. М.Белицер, В.А. Модифицирование самосборки фибрина как путь к изучению механизма этого процесса / В.А. Белицер, Т.В. Варец-кая // Укр. биохими. журн. 1975. - № 5. - С. 567-573.

12. Белоусов, Ю.В. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. / Ю.В. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Ле-пахин // М.: Универсум, 1993.

13. Бессмертный, B.C. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине / B.C. Бессмертный // М.: Медицина, 1967. 303 с.

14. П.Бочоришвили, В.Г. Диагностика и лечение сепсиса / В.Г. Бочоришвили //Воен. мед. журн. 1983. - № 5. - С. 35-40.

15. Бычков, С.М. Новые данные о гепарине / С.М. Бычков //Вопросы мед. химии. -1981. Т. 27. - № 6. - С. 726-736.

16. Бышевский, А.Ш. О возможной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции свертывания крови / А.Ш. Бышевский, Е.А. Чирятьев, М.К. Умутбаева // Гематология и трансфузиология. -1985.-Т.30,№1.-С. 35-38.

17. Бышевский, А.Ш. Регуляция коагуляционных превращений фиб127риногена./ А.Ш. Бышевский, C.JI. Галян, П.И. Левен и др. //Свердловск: Средне-Уральское кн. изд-во, 1987. 205 с.

18. Бышевский, А.Ш. Тромбоциты / А.Ш. Бышевский, C.JI. Галян, И.А. Дементьева, А.А. Нелаева, В.Г. Соловьев // Тюмень, 1996. -189 с.

19. Бышевский, А.Ш. Физиологический ингибитор аутополимериза-ции фибрин-мономера / А.Ш. Бышевский, Е.А. Чирятьев // В кн.: Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии: Тез. докл. Всесоюз. совещания, октябрь 1982. М., 1982. -С. 89-93.

20. Валиев, Б.Н. Нарушения гепаринового обмена при острой пневмонии у детей раннего возраста / Б.Н. Валиев, Р.С. Сабирова //Вопросы детской пульмонологии и аллергических заболеваний у детей. Ташкент. 1980. - Вып. 2. - С- 18-22.

21. Васильева, Г.В. Синтез физиологически активного аналога цепи фибрина и его производных / Г.В. Васильева, С.И. Свиридова // VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983.-С. 344-345.

22. Гаврилов, O.K. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови./ O.K. Гаврилов // М., 1981.

23. Герберт, И.Я. Природа и свойства антикоагулянта прямого действия из травы медуницы мягчайшей. Дисс. канд. биол. наук. / И .Я. Герберт// Тюмень. -1989. 121 с.

24. Герберт, И.Я. Противосвертываюшее действие полифенол-содержащей фракции из надземной части медуницы мягчайшей / И.Я. Герберт, П.И. Левен, А.Ш. Бышевский // Раст. ресурсы. -1988.-Т. 22,№3.-С. 429-434.

25. Гершкович, А.А. Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином: Обзор / А.А. Гершкович // Биополимеры и клетки,-1992.-Т. 8, № 1. С. 5-22128

26. Губаев, А.Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: автореф. дис. канд. мед. наук./ А.Г Губаев. //Челябинск, 1996. - 25 с.

27. Дементьева, И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза / И.А. Дементьева // Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 30.

28. Дементьева, И.А. Препарат противосвертывающего действия из медуницы мягчайшей / И.А. Дементьева, О.П. Леонова, М.К. Умутбаева // Молодежь практ. здравоохранению: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. мол. ученых. - М., 1990. - С. 42-43.

29. Дементьева, И.А. Природа и свойства антикоагулянтов из недиа-лизирующейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы: дисс. канд. мед. наук. / И.А Дементьева / Тюмень. 1991. -139 с.

30. Дмитриев, В.В. Гепаринотерапия ДВС крови при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей / В.В Дмитриев // Анестезиология и реаниматология. -1991. № 1. - С. 69-72.

31. Дрозд, Н.Н. Механизмы антикоагулянтного действия сернокислого эфира хитозана / Н.Н. Дрозд // Вопр. мед. химии. 1992. - Т. 38, №5. -С. 12-14.

32. Ена, Я.М. Всесоюзное совещание, посвященное применению пиявки / Я.М Ена // Врачебное дело. 1992. - № 5. - С. 115-117.

33. Ефимов, B.C. Нежелательные эффекты длительного применения гепарина и подходы к их устранению /B.C. Ефимов, А.Г. Румянцева // Эксперим. и клин, фармакол. 1992. - Т. 55, № 6. - С. 7376.

34. Ефимов, B.C. Сравнительное исследование антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов красных морских водорослей / B.C. Ефимов, А.И. Усов, Т.С. Ольский

35. Ильина, А.В. Синтез аналога N-концевого пептида а-цепи фибрина с последовательностью Gly-Pro-Arg / А.В. Ильина, Ю.А. Давидович, С.В. Рогожин // VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 342-343.

36. Исаханян, Г.С. Изменение некоторых показателей крови при ги-рудино-терапии / Г.С. Исаханян // Эксперим. и клин, медицина. -1989.-Т. 29,№2.-С. 107-111.

37. Каменев, Ю.Я. Пиявки (гирудо-терапия)./ Ю.Я. Каменев // С-Петерб. мед. центр культуры здоровья им. А.С.Залманова, 1993. -17 с.

38. Кириченко, JI.JI. Лечение гепарином / JI.JI. Кириченко // Кардиология. 1986. - № 9. - С. 119-123.

39. Киселев, С.В. Влияние волчаноподобного антикоагулянта на взаимодействие протромбина и тромбоцитов/ С.В. Киселев, Д.М. Зубаиров, И.А. Андрушко, Ю.Л. Кацадзе// Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2004. - Т. 137. - №6. - С. 614-617.

40. Киселева, А.В. Медуница мягчайшая как возможный источник гепариноподобных средств / А.В. Киселева // В кн.: Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюзн. конф. Новосибирск, 1983. - С. 115-116.

41. Колхир, В.К. Влияние некоторых препаратов, содержащих три-терпеновые гликозиды на свертывание крови / В.К. Колхир, С.Я Соколов // Хим.-фарм. журнал. 1982. - № 5. - С. 532-537.

42. Комиссаров, И.Д. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы / И.Д. Комиссаров, А.А. Климова // В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. Тюмень, 1971. - С. 225-242.

43. Комиссаров, И.Д. К вопросу о молекулярной массе гуминовых кислот / И.Д. Комиссаров, Л.Ф. Логинов // В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. Тюмень, 1971.-С. 125-130.

44. Кудряшов, Б.А. Фибринолитические и антикоагулянтные комплексы низкомолекулярного гепарина с тафцином / Б.А. Кудря-шов // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. - Т. 114, № 12. - С. 609-611.

45. Кузник, Б.И. Форменные элементы крови. / Б.И. Кузник, В.П. Скипетров //М.: Медицина, 1974. С. 17.

46. Левен, П.И. Антикоагулянт пептид растительного происхождения / П.И. Левен, И.А. Дементьева // Нов. лек. препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюз. конф. -Томск, 1986.-С. 93-94.

47. Левицкая, Н.Г. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин / Н.Г. Левицкая, А.Н. Клейменов, М.Т. Петросян, М.А. Розенфельд и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987. - № 8. - С. 190-192.

48. Луговской, Э.В. Первичная структура фибриногена, её связь с конформацией и функцией молекулы / Э.В. Луговской // Укр. биохим. журн. 1982. - № 5. - С. 578-594.

49. Лычев, В.Г. Диагностика и лечение ДВС крови. / В.Г. Лычев // М.: Медицина, 1993. 114 с.

50. Мазаев, А.В. Клиническое применение гепарина и его низкомолекулярных фракций / А.В. Мазаев, К.Е. Саргин // Кардиология. -1986.-Т. 26,№9.-С. 122-124.

51. Мазур, Н.М. Основы клинической фармакологии и фармакотерапии в кардиологии./ Н.М. Мазур // М.: Медицина, 1988. С. 194195.

52. Макаров, В.А. Современные проблемы лекарственной регуляции функции гемостаза / В.А. Макаров // Фарм. и токсикология. -1989. -Т. 52,№4. -С.9-13.

53. Маркосян, А.А. Физиология свертывания крови. / А.А. Марко-сян// М.: Медицина, 1966. 464 с.

54. Машковский, М.Д. Лекарственные средства:. / М.Д. Машковский // М.: Новая волна, 2005, 1200с.

55. Метелица, В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. / В.И. Метелица // М.: Медицина, 1987. С. 280

56. Мурина, М.А. Противотромботическая активность N, N ди-хлортаурина in vivo на модели тромбоза у мышей/ М.А. Мурина, О.Д. Фесенко, В.И. Сергиенко, Н.А. Чудина, Д.И. Рощупкин // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2002. - Т. 134. - №7. - С. 44-47.

57. Назаров, В.Г. Лекарственные средства, влияющие на гемостаз / В.Г. Назаров // Акушерство и гинекология. 1993. - № 2. - С. 5253.

58. Нетяженко, В.З. Противотромботическая терапия в клинической практике, новое в терапии, диагностике и лечении. / В.З. Нетя-женко, Е.Н. Амосова, Л.А. Гирина и др. \\ М.: Медицина, 1982. -87 с.

59. Панченко, Е.П. Ингибиторы Ilb/IIIa рецепторов тромбоцитов -новое направление в антитромботической терапии / Е.П. Панчен-ко //Терапевтический архив 1997. - № 9. - С. 66-71.

60. Петросян, М.Т. Антикоагулянтные свойства пептидов аналогов N-концевого участка цепи фибрина / М.Т. Петросян, М.А. Ро-зенфельд, А.К. Петров и др. // Система мозговых и внемозговых пептидов. - Л., 1984. - С. 67-68.

61. Радзевич, И.М. Получение фибринмономера из нефракциониро-ванной плазмы крови / И.М. Радзевич, Е.Л. Ходорова //Укр. био-хим. журн. 1969. - № 4. - С. 367-370.

62. Рогов, А.В. Растительные пептиды перспективный источник создания новых лекарственных средств/ А.В. Рогов, Н.Ф.Минеева, Е.В. Колхир, Т.А. Соколовская, В.А. Быков //Фармация. - 2003. - №6. - С. 41-46.

63. Розкин, М.Я. Изучение механизма антикоагулянтного действия фукоиданов / М.Я. Розкин, М.Н. Левина, Н.С. Каменева и др. //

64. Фармакология и токсикология. 1989. - № 3. - С. 48-51.133

65. Ройтман, Е.В. Влияние окисленных форм фибриногена на свертывание крови/ Е.В. Ройтман, О.А. Азизова, Ю.А. Морозов, А.В. Асейчев // Биофизика и биохимия. 2004. - Т. 138. - №9. - С.277-279.

66. Русакова, О.А. Антикоагулянты растительного происхождения: природа и механизм действия: дисс. канд. мед. наук./ О.А. Русакова. Тюмень, 1993. - С. 63-64.

67. Сабирова, М.Н. Влияние розанола на некоторые показатели ге-мокоагуляции у крыс/ М.Н. Сабирова, О.О. Бустонов, Ф.Н. Ма-мадалиева // В кн.: Материалы конф. молодых ученых АН Таджикской ССР, посвященной 113-й годовщине В.И.Ленина. Душанбе, 1983.-С. 85-86.

68. Савельев, B.C. Тромбоэмболия легочной артерии. / B.C. Савельев, Е.Г. Яблоков, А.И. Кириенко // М.: Медицина, 1989. С. 263.

69. Стрельников, Ю.Е.Сравнительное исследование биологических свойств ряда бактериальных полисахаридов / Ю.Е. Стрельников, Н.П. Лабикова, Е.И. Милевский и др. // Радиобиология. 1986. -№ 3. - С. 323-328.

70. Стрельцова, И.Н. Спектры поглощения гуминовых кислот / И.Н. Стрельцова, И.Д. Комиссаров, Л.Ф. Логинов //В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. Тюмень, 1971. - С. 75-90.

71. Терешин, И.И. Перспективы поиска антитромботических ферментных препаратов / И.И. Терешин, Г.Е. Гринберг //Акт. пробл. гемостазиологии/Под. Ред. Б.В. Петровского и др. М.: Наука, 1981.-С. 400-410.

72. Турова, А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. / А.Д. Турова, Э.Н. Сапожникова // М.: Медицина, 1983. С. 288.

73. Угарова, Т.П., Белицер В.А. Исследование равновесной системы фибрин-фрагмент Д-протектор / Т.П. Угарова, В.А. Белицер //Укр. биохим. журн. 1978. - № 3. - С. 357-363.

74. Уэбб, Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. / Л. Уэбб// М., Мир, 1966,-862 с.

75. Фролова, М.А. Поиск биологически активных веществ с предполагаемой антитромботической активностью, среди N-замещенных имидазола / М.А. Фролова // Сб. науч. тр.: Синтез и контроль качества лекарств. Рязань, 1991. - С. 36-41.

76. Хомутов, А.Е. Физиологическая роль гепарина: Учебное пособие по специальному курсу "Современные проблемы физиологии и биохимии крови". / А.Е. Хомутов, Б.И. Орлов // Горький, 1987. -С. 77.

77. Чазов, Е.И. Антикоагулянты и фибринолитические средства./ Е.И. Чазов, К.М. Лакин //М.: Медицина, 1977.

78. Чипенс, Г.И. Дизайн лекарственных препаратов на базе пептидов / Г.И. Чипенс // Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов: Сб. трудов. Рига: Изд-во унта, 1982. - С. 7-9.

79. Чирятьев, Е.А. Взаимодействие пептидного ингибитора с двумя формами мономерного фибрина, различающимися по степени активации. / Е.А. Чирятьев, О.П. Леонова, А.Ш. Бышевский. //Укр. биохим. журн. 1989. Т. 61. № 1. С. 3 9.

80. Чирятьев, Е.А. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природы / Е.А. Чирятьев, О.П. Леонова, А.Ш. Бышевский // Биохимия. 1988. - № 6. - С. 1025-1032.

81. Чирятьев, Е.А. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: дис. докт. биол. наук./Е.А. Чирятьев // М., 1990.-С. 68-73.

82. Чирятьев, Е.А.Способ получения средства, обладающего анти-коагулянтной активностью / Е.А. Чирятьев, А.Ш. Бышевский, Н.В. Яковлева, Е.В. Платонов // Патент на изобретение №2101023, зарегестрирован в Государственном реестре изобретений 10.01.1998г.

83. Шталь, Э. Хроматография в тонких слоях / Э.Шталь // Пер. с англ. М.: Мир, 1965. - 508 с.

84. Яковлева, Н.В. Антикоагулянтная активность фракции сапропеля. Получение, природы и механизм действия: дисс. канд. биол. наук./Яковлева Н.В. //Тюмень. 1998. - 141 с.

85. Ansell, J. Heparin-induced thrombocytopenia and recurrent thromboembolism /Ansell J., Deykin D. //Amer. J. Hemat. 1980. -Vol. 8. - P. 325-332.

86. Banssillion, V. Fraxiparine Analytical and Structural Data, Pharmacology, Clinical Trials./ Banssillion V., Besson L., Azzar D et al. //Paris, 1987. P. 13.

87. Barker P.L. Cyclic RGD peptide analogues as antiplatelet antithrombotics /Barker P.L., Bullens S., Bunting S., et all //J. Med. Chem.1992. Vol.35, N. 11. - P.2040-8.

88. Barrowchiffe, T.W. Heparin /Barrowchiffe T.W., Merton R.E., Gray E., Thomas D.P. // Thrombos. Haemostas. 1988. - Vol. 60, N 3.-P. 434-436.

89. Bennett, C.L. Thrombotic thrombocytopenic purpura associated with ticlopidine. A review of 60 cases / Bennett C.L., Weinberg P.D., Rozenberg-Ben-Dror K., Yarnold P.R., Kwaan H.C., Green D.//Ann. Intern. Med. -1998. Vol.128, N.7. - P.541-4.

90. Bennett, J.S. Structural biology of glycoprotein Ilb-IIIa /Bennett J.S.//Trends. Cardiovasc. Med. 1996.-Vol.6,N.1.-P.31-36.

91. Bergquist, D. Anticoagulant effects of two types of low molecular weight heparin administered subsequently / Bergquist D., Hedner U., Siorin E. et al. //Thromb. Res. 1983. - N 3. - P. 381-391.

92. Berkowitz, S.D. Acute profound thrombocytopenia after C7E3 Fab (abciximab) therapy /Berkowitz S.D., Harrington R.A., Rund M.M., Tcheng J.E. //Circulation -1997. Vol.95, N.4 - P.809-13.

93. Boeckel, A.A. Pentasaccharides and tetrasaccharides antithrombotic activity. /Boeckel A.A., Best M., Petiton M. et al. // Па137тент 4841041 США. Опубл. 20.06.88. НКИ 536/118.

94. Borg, J.Y. Heparin and low molecular weight heparins-induced thrombocytopenias / Borg J.Y., Flecht В., Legendve M. et al. // Thromb. Res. 1986. - Suppl. 6. - P. 96.

95. Bottiger, L.E. The heparin story. To search of the early history of heparin /Bottiger L.E. // Acta Med. Scand. 1987. - Vol. 222, N 3. - P. 195-200.

96. Bousgust, E. Activity thrombolutique de heparine et d'une fraction de las poids molecular /Bousgust E., Doutremepuich C., Gestrean S„ e.a. //Therapic. 1983. - № l.-P. 13-16.

97. Brase, L.D. Heparin-induced platelet aggregation (H-IPA) dose/response weight heparin preparations Brase L.D., Fareed J. // Thromb. and Haemost. 1987. - Vol. 58, N 1. - P. 18.

98. Browse, N.L. Diseases of the veins. Pathology, diagnosis and treatment. /Browse N.L., Burnard K.G., Thomas M.L. // London: Edward Arnold, 1988.

99. Burch, J.W. Inhibition of platelet prostaglandin synthetase by oral aspirin / Burch J.W., Stanford N., Majerus P.W. //J. Clin. Invest. -1978.-Vol.61,N.2.-P.314-9.

100. Calvete, J.J. Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex /Calvete J.J. //Thromb. Haemost. 1994. - Vol.72, N1. - P.l-15.

101. Calvete, J.J. Mass spectrometric analysis state of human platelet GP Ilia /Calvete J.J., Schafer W., Mann K.//Platelets. 1995. - №6. -P.5.

102. CAPRIE Steering Committee: A randomised, blinded, trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events //Lancet. -1996. Vol.348, N.9038. - P.1329-39.

103. CAPTURE Study: Randomised placebo-controlled trial of ab-ciximab before and during coronary intervention in refractory unstable angina //Lancet 1997. - Vol.349, N.9063 - P. 1429-35.

104. Caranobe, C. Disappearance of circulating anti-Xa acting after intravenous injection of standart heparin and of low molecular weight heparin (CY-216) / Caranobe C., Barret A., Gabaig A. et al. // Thromb. Res. 1985. - N 1. - P. 129-133.

105. Carrigan, J.J.Jr. Heparin therapy in bacterial septicemia /Carrigan J.J.Jr. // J. Pediatric. 1987. - Vol. 41. - P. 695-704.

106. Charo, I.F. Platelet glycoprotein Ilb-IIIa-like proteins mediate endothelial cell attachment to adhesive proteins and the extracellular matrix / Charo I.F., Bekeart L.S., Phillips D.R. //J. Biol. Chem. -1987. Vol.262, N.21. - P.9935-8.

107. Chong, B.H. Heparin-induced thrombocytopenia: studies with a new low molecular weight heparinoid, Opg. 10172 / Chong B.H., Ismail F., Cade J. et al. // Blood. 1989. - Vol. 73, N 6. - P. 1592-1596.

108. Cines, D.B. Immune endothelial cells injury in heparin-associated throbocytopenia /Cines D.B., Tomaski A., Tannenbaum S. //New Engl. J. Med. 1987. - Vol. 316, N 10. - P. 581-589.

109. Cockar, D.L. Heparin induced specific protein release from human intestinal smooth muscle cells /Cockar D.L., Pezz H.A., Gza-ham M.F. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - Vol. 142, N 2.-P. 542-551.

110. Cohen, M. Heparin-induced thrombocytopenia and the clinical use of low molecular weight heparins in acute, coronary syndromes / Cohen M //Semin. Haematol. -1999. V. 36. - N. 1. - P. 33-36.

111. Collen, D. Molecular basis of fibrinolysis, as relevant for thrombolytic therapy /Collen D., Lijnen H.R. //Thromb. Haemost. -1995. Vol.74, N.l-P.167-71.

112. Coller, B.S. A new murine monoclonal antibody reports an activation-dependent change in the conformation and/or microenviron-ment of the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex /Coller B.S. //J. Clin. Invest.- 1985.-Vol.76,N.l -P.101-8.

113. Coller, B.S. Blockade of platelet GP Ilb/IIIa receptors as an antithrombotic strategy / Coller B.S. //Circulation 1995. - Vol.92,N.9. -P. 2373-2380.

114. Coller, B.S. GP II r III antagonists: pathophysiologic and thera-b a peutic insights from studies of c7E3 Fab /Coller B.S. //Thromb. Haemost. -1997. Vol.78, N. 1. - P.730-735.

115. Copplestone, A. Heparin-induced thrombocytopenia in pregnancy /Copplestone A., Oscier D.G. // Br. J. Haematol. 1987. - Vol. 56, N2.-P. 248.

116. Cox, D. The pharmacology of the integrins /Сох D., Aoki Т., Seki J., Motoyama Y., Yoshida K. //Med. Res. Rev. 1994. -Vol.14, N2.-P.195-228.

117. Daecon-Smith, R. Platelet aggregation in the presens of extracts of British marine algae /Daecon-Smith R., Loe-Potter, Rogers D. // Med. Lab. Sch. 1985. - N 4. - P. 404-405.

118. Dennis, S. Use of fragments of hirudin to investigate thrombinhirudin interaction /Dennis S., Wallace A., Hofsteenge J., Stone S.R.140

119. Eur. J. Biochem. 1990. - Vol.188, N.l. - P.61-6.

120. Dunn, F. Interaction of platelet with standart heparin and low molecular weight fractions / Dunn F., Soria C., Thomaidis A. et al. // Nouv. Rev. Franc. Hemat. 1984. - Vol. 26. - 249 p.

121. Dustan, H.P. Anticoagulant therapy /Dustan H.P., Tarazi R.C. // Arch. Intern. Med. 1980. - Vol. 140. - P. 2265-2268.

122. EPIC Investigation. Use of a monoclonal antibody directed against the platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptor in high-risk coronary angioplasty //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330,N14. - P. 956-61.

123. EPILOG Investigators: Platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptor blockade and low-dose heparin during percutaneous coronary revascularization //N. Engl. J. Med. 1997. - Vol.336, N.24 - P.l689-96.

124. Fareed, J. A prospect of firther developments of low molecular weight heparin in the 1990's /Fareed J. // International Symposium on Low Molecular Weight Heparin and Related Polysaccharides. Munich, 1991. - P. 29.

125. Fareed, J. Molecular composition of low molecular weight heparins: relevance to biochemical and pharmacologic effects /Fareed J., Walenga J.M. // Fraxiparine. Second International Symposium. -Monte Carlo, 1989.-P. 30-31.

126. Farrell, D.H. Binding of recombinant fibrinogen mutants to platelets /Farrell D.H., Thiagarajan P. //J. Biol. Chem. 1994. -Vol.269, N1.-P.226-31.

127. Farrell, D.H. Role of fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation /Farrell D.H., Thiagarajan P., Chung D.W., Davie E.W. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol.89, N22. - P.10729-32.

128. Ferguson, J.J. 3rd EPILOG and CAPTURE trials halted because of positive interim results news. /Ferguson J.J. //Circulation -1996.-Vol.93,N4.-P. 637.

129. Ficker, A.M. Studies on the site of action of prothrombin biosynthesis /Ficker A.M., Mauzac M. // Biomaterials. 1985. - Vol. 6. -P. 198-202.

130. Fioravanti, C. Antithrombotic activity of recombinant tick anticoagulant peptide and heparin in a rabbit model of venous thrombosis / Fioravanti C., Burkholder D., Francis В., Siegl P., Gibson R. //Thromb. Res. 1993. - V. 71. -N 4. - P. 317-324.

131. Fitzgerald, D.J. Platelet inhibition with an antibody to GP Ilb/IIIa /Fitzgerald D.J. // Circulation. 1989. - 80. - 6. - P. 19181919.

132. Frohlish, E.D. Heparin: chemistry and clinical usage /Frohlish E.D., Alderman S.A. // Lancet. 1988. - N 4. - P. 1349-1354.

133. Furi,l B.C. Possible mechanism for activating the fibrinolytic system by synthetic agents /Furil B.C., Grimby G., Ruddel H. et al. // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 348. - P. 2471.

134. Fuster, V. Role of platelet-inhibitor agents in coronary artery disease./ Fuster V., Jang I-K. In: Topol EJ, editor. Textbook of interventional cardiology. Philadelphia: W.B. Saunders; 1994. p. 3-22.

135. Gartner, Т.К. The tetrapeptide analogue of the cell attachment site of fibronectin inhibits platelet aggregation and fibrinogen binding to activated platelets /Gartner Т.К., Bennett J.S. //J. Biol. Chem. -1985. Vol.260, N22. - P. 11891-4.

136. Gibbs, A.Isolation and anticoagulant properties of polysaccharides of Typha angustata and Daemonorops species /Gibbs A., Green G., Doctor V. //Thromb. Res. 1984. - N. 3. - P. 97-108.

137. Girdwood, R.H. Metabolism of antithrombin III (heparin cofac-tor) / Girdwood R.H. // Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

138. Gonault-Helimann, M. Low molecular weight heparin fractions as an alternative therapy in heparin-induced thrombocytopenia / Gonault-Helimann M., Huet Y., Adnof S. et al. // Haemostasis. 1987. -Vol. 17.-P. 134-140.

139. Haas, S. Prophylaxis of thromboembolism with various low molecular weight heparins /Haas S., Blumel G. // Haemostasis. -1988. Vol. 18, Suppl. 3. - P. 82-87.

140. Hayashi, Y. Discovery and structure-activity relationship studies of a novel and specific peptide motif, Pro-X-X-X-Asp-X, as aplatelet fibrinogen receptor antagonist /Hayashi Y., Katada J., Sato143

141. Y., Igarashi К., Takiguchi Y., Harada Т., Muramatsu M., Yasuda E., Uno I. //Bioorg. Med. Chem. 1998. - Vol.6, N.3. - P.355-64.

142. Helgeland, A. Uber die thromboseverhutende Wirkung des Neodyms /Helgeland A. // Z. exp. Med. 1981. - Bd. 328. - S. 144.

143. Hirano, S. International Conference of Chitin and Chitosan, 3rd: Proceedings./ Hirano S., Kinngava J., Nishioka A. // Ancoma, 1985.-P. 461-467.

144. Hirsh, J. Low molecular weight heparin /Hirsh J., Levine M.N. // Blood. 1992. - Vol. 79, N 1. - P. 1-17.

145. Hoffman A. Inhibition of the thrombin-platelet reaction by hirudin /Hoffman A., Markwardt F. // Haemostasis. 1984. - Vol. 14, N 7.-P. 164-169.

146. Huang, T.F. Disintegrins: the naturally-occurring antagonists of platelet fibrinogen receptor / Huang T.F., Niewiarowski S. //J. Toxicol. Toxin Rev. -1994. -Vol.13 P.253-273.

147. Huang, T.F. Trigramin: primary structure and its inhibition of von Willebrand factor binding to glycoprotein Ilb/IIIa complex on human platelets /Huang T.F., Holt J.C., Kirby E.P., Niewiarowski S.//Biochemistiy 1989. - Vol.28, N2. - P.661-6.

148. Huisse, M.G. Thrombopenie incluite par l'heparine standard.144

149. Tentative therapeutique a l'aide il'une heparine de bas moleculaire / Huisse M.G. //Press med. 1983. - Vol. 12. - P. 643-645.

150. Huul, R.S. Therapeutic use of low molecular weight heparins: the knowledge to date and their application to therapy /Huul R.S. // International Symposium on Low Molecular Weight Heparins and Related Polysaccharides. Munich, 1991. - P. 21.

151. Hynes, R.O. Integrins: a family of cell surface receptors /Hynes R.O. //Cell. 1987. - Vol. 48, N 4. - P. 549-54

152. Jaffe, E.A. Recovery of endothelial cell prostacyclin production after inhibition by low doses of aspirin / Jaffe E.A., Weksler B.B. //J. Clin. Invest. 1979. - Vol.63, N.3. - P.532-5.

153. Kaiser, B. Antithrombotic and haemorrhagic effects of the naturally occuring thrombin inhibitor hirudin / Kaiser В., Markwardt F. // Folia Haemat. 1988. - Vol. 115, N 1-2. - P. 41-46.

154. Kelton, J. Heparin-induced thrombocytopenia / Kelton J., Le-vine M. // Sem. Thrombosis and Haemostasis. 1986. - Vol. 12, N 1. -P. 59-62.

155. Kelton, J.G. Acute thrombocytopenia and thrombosis. Heparin-induced thrombocytopenia and thrombotic thrombocytopenic purpura /Kelton J.G. // Amer. N.-Y. Acad. Sci. 1987. - Vol. 509. - P. 205211.

156. Khan, S. Physiology and pathology and blood coagulation /Khan S., Smith A.D. //Brit. J. Pharmacol. 1983. - Vol. 78. - P.l 81.

157. King, D.L. Heparin-associated thrombocytopenia/ King D.L.,

158. Kelton J.G. // Ann. Intern. Med. 1984. - Vol. 100. - P. 535-540.145

159. Klocking, H. Tierexperimentelle untersuhungen zur thromboly-schen wirkung von pentosanpolysulfat /Klocking H., Richter M. // Wiss. Z. S. Arhdt.-Unin., Greifswall Med. K. 1988. - Bd. 37, N 2-3. -S. 135-137.

160. Kosure, T. Studies on active substances in the herbs used for Oketsu, blood coagulation, in Chinese medicine /Kosure Т., Ishida H., Vamazaki H., Ishiii M. //J. Pharm. Soc. Japan. 1984. - V. 104. - N 10.-P. 1050-1053.

161. Krupinsk,i K. Anticoagulant and antithrombotic effects of chemically modified heparins and pentosanpolysulfate /Krupinski K., Breddin H.K., Casu B. // Haemostasis. 1990. - Vol. 20, N 2. - P. 8192.

162. Kuyas, C. A syntetic Gly-Pro-Arg derivative that binds to plasma albumin and inhibits fibrin formation /Kuyas C., Doolittle R. //Thromb. Haemost. 1983. -N l.-P. 356-356.

163. Lam, S. C.-T. Platelet membrane GP lib heavy chain forms a complex with GP Ilia that binds Arg-Gly-Asp peptides /Lam S. C.-T., Plow E.F., Ginsberg E.H. // Blood. 1989. - 733. - 6. - P. 1513-1518.

164. Laudano, A. Syntetic pptide derivates that bing fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers / Laudano A., Doolittle R. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. - N 7. - P. 3085-30-98.

165. Lefkovits, J. Platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptors in cardiovascular medicine / Lefkovits J., Plow E.F., Topol E.J. //N. Engl. J. Med. 1995. - Vol.332, N.23. - P.1553-9.

166. Lerou, J. Treatment of heparin associated thrombocytopenia and thrombosis with low molecular weight heparin (CY-216) /Lerou J., Leelers M.H., Delahousse B. et al. // Semin. Thrombos. Haemost. -1985.-Vol. 11,N3.-P. 326.

167. Leung, L. New antithrombotic agents /Leung L., Bennett J.S., Schwartz B. //ASH Educational Materials 1998. - P.136-153.

168. Levine, M. Low molecular weight heparin /Levine M. // Agres-sologie. 1989. - Vol. 30, N 6. - P. 347-348.

169. Liem, Т.К. The glycoprotein Ilb/IIIa antagonist c7E3 inhibits platelet aggregation in the presence of heparin-associated antibodies /Liem Т.К., Teel R., Shukla S., Silver D. //J, Vase. Surg. 1997. -Vol.25, N.l-P.124-30.

170. Losito, R. Molecular weight of heparin versus biologic activity. Some additional considerations /Losito R., Losito C. // Semin. thrombosis and hemostasis.- 1985.-Vol. 11,N l.-P. 29-33.

171. Lynch, J. Primary prevention of coronary arterial thrombosis with the factor Xa inhibitor rTAP in a canine electrolytic injuri model / Lynch J., Sitko G., Lehman E., Vlasuk G. //Thromb. Haemost. -1995. V. 74. - N 2. - P. 640-645.

172. Machin, S.J. Clinical usage of heparin /Machin S.J. // Scand. J. Haematol. 1980. - N 36. - P. 188.

173. March, N. The effect of pentosan polysulphate (SPSU) on the fibrinolytic enzyme system /March N., Gaffney P., Stiff G. // Haemo-stasis. 1984. - Vol. 14, N 1. - P. 36-38.

174. Markwardt, F. Pharmacology of hirudin, one hundred years after the first report of the anticoagulant agent in medicinal leeches /Markwardt F // Biomed. Biochim. Acta. 1985. - Vol. 44, N 5. - P. 1007-1013.

175. Martin, P.D. The structure of residues 7-16 of the A alpha-chain of human fibrinogen bound to bovine thrombin at 2.3-A resolution /Martin P.D., Robertson W., Turk D., Huber R., Bode W., Edwards

176. B.F. //J. Biol. Chem. 1992.-Vol.267, N.11.-P.7911-20.148

177. Massonef-Castel, S. Prophylaxic thromboembolism of low molecular weight heparin /Massonef-Castel S., Pelissier E., Dreyfus G. et al.//Lancet. 1984.-Vol. l.-P. 1182-1183.

178. Meraihi, Z. Heparin: biochemical acts /Meraihi Z., Lutz O., Frey A., Buch A.C. // Arch. Int. Pharmac. 1989. - Vol. 297. - P. 286293.

179. Mikhailidis, P. Comparision of the effect a conventional heparin and a low molecular weight heparin on platelet function /Mikhailidis P., Barradas M., Mikhailidis A. et al. // Brit. J. Clin. Pharmacol. 1984. - Vol. 17, N 1. - P. 43-48.

180. Miraglia, C. Measurement of blood coagulation factor XIHa formation in plasma containing Gly-Pro-Arg-Pro /Miraglia C., Green-berg C. // Anal. Biochem. 1985. - N 1. - P. 165-171.

181. Morin, Y. Fraxiparine: analytical and structural data. Pharmacology, clinical trials. /Morin Y. // Paris, 1987. 14 p.

182. Newman, P.J. Quantitation of membrane GP Ilia on intact human platelets using the monoclonal antibody / Newman P.J., Allen R.W., Kahn R.A. et al. // Blood. 1985. - 65. - 1. - P. 227-232.

183. Niewiarowski, S. Disintegrins and other naturally occurring antagonists of platelet fibrinogen receptors /Niewiarowski S., McLane M.A., Kloczwiak M., Stewart G.J. //Semin. Hematol. 1994. -Vol.31, N.4.-P.289-300.

184. Nugaent, D.J. A human monoclonal autoantibody recognizes a neoantigen on GP IIIA expressed on stored an activated platelets /Nugaent D.J., Kunicki T.J., Berglund C. et al. // Blood. 1987. - 70.l.-P. 16-22.

185. Ohta, N. Interaction os antistasin-related peptides with factor Xa: identification of a core inhibitory sequence / Ohta N., Brush M., Jacobs J. //Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. - N 6. - P. 825-830.

186. Patrono, C. Aspirin as an antiplatelet drug /Patrono C. //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330, N.18. - P.1287-1294.

187. Perutelli, P. Inhibizione recettore specific della funzione pias-trinica antagonisti delle GP Ilb/IIIa: Una rassegna /Perutelli P., Pisano E., Mon P.G. // Gaslini. 1994. - 26. - 3. - P. 162-169.

188. Phillips, D.R. Clinical pharmacology of eptifibatide /Phillips

189. D.R., Scarborough R.M. //Am. J. Cardiol. 1997. - Vol.80, N.4A. -P.11B-20B.

190. Phillips, D.R. The platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex /Phillips D.R., Charo I.F., Parise L.V., Fitzgerald L.A. //Blood 1988. - Vol. 71N 4. -P. 831-43.

191. Pierschbacher, M.D., Ruoslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule /Pierschbacher M.D., Ruoslahti E. //Nature 1984. -Vol.309, N5963.-P30-33.

192. Plow E.F,. Ligand binding to GPIIb-IIIa: a status report /Plow

193. E.F., D'Souza S.E., Ginsberg M.H. //Semin. Thromb. Hemost. 1992. - Vol.18, N3.-P.324-32.

194. Ramirez-Lassepas, M. Heparin-induced thrombocytopenia inpatients with cerebrovascular ischemic disease /Ramirez-Lassepas M.,150

195. Cipolle R.J., Redvold K.A. et al. //Neurology. 1984. - Vol. 34. - P. 7

196. Rostin, M. Fraxiparine clinical applications /Rostin M., Moutestruc J.s Monin G. et al.// Fundam. Clin. Pharmacol. - 1990. - N 4.-P. 17-23.

197. Ruoslahti, E. New perspectives in cell adhesion: RGD and in-tegrins /Ruoslahti E., Pierschbacher M.D. //Science 1987.-Vol.238, N.4826.-P.491-7.

198. Salzman, E.W. Heparin. Chemical and biology properties, clinical applications /Salzman E.W., Deykin D., Shapiro R.M. // New Eng. J. Med. 1982. - Vol. 292. - P. 1046-1050.

199. Samama, M. Low molecular weight heparin clinical use /Samama M., Hemker H.C. // Haemostasis. - 1988. - Vol. 26, N 4. -P. 4-14.

200. Samama, M. The European Fraxiparin Study Group /Samama M., Bernard P., Bounardot J.P. et al. // Brit. J. Surg. 1988. - Vol. 75, N2.-P. 128-131.

201. Sandercock, P. Antiplatelet therapy with aspirin in acute ischeamic stroke /Sandercock P. //Thromb. Haemost. 1997. -Vol.78, N.I.-P. 180-182.

202. Schraden, J. Nidermolekulare heparine /Schraden J. // Arz151mimittel therapie. 1988. - Bd. 6, N 5. - S. 147-155.

203. Schror, K. Antiplatelet drugs. A comparative review /Schror K. //Drugs 1995. - Vol.50, N.l - P.7-28.

204. Shattil, S.J. Integrin signaling: the platelet paradigm /Shattil S.J., Kashiwagi H., Pampori N. //Blood 1998. - Vol.91, N.8 -P.2645-57.

205. Smith, R. Actions and interactions of antithrombin and heparin /Smith R., Green J. //Brit. J. Haemotol. 1987. - V. 66, N 2. - P. 415421.

206. Smyth, S.S. Regulation of vascular integrins /Smyth S.S., Joneckis C.C., Parise L.V. //Blood -1993. Vol. 81, N 11. - P. 282743.

207. Stremberger, A. Actionof radix Salvia milthiorrhizae decoctions on cjagulation and fibrinolysis /Stremberger A., Stohr R., Ziegler L., Blumel G. //Thromb. Haemost. 1983. - V. 50. - N 1. - P. 198-198.

208. Tandon, N.N. Identification of glycoprotein IV (CD36) as a primary receptor for platelet-collagen adhesion /Tandon N.N., Kralisz U., Jamieson G.A. //J. Biol. Chem. -1989. Vol. 264, N 13. - P. 7576-83.

209. Teng, C.M. Snake venom constituents that affect platelet function /Teng C.M., Huang T.F. //Platelets -1991. Vol.2 - P.77-87.152

210. Thomas, D.P. Heparin. In: Clinics in haematology, thrombosis. /Thomas D.P. / London, 1981. P. 443-458.

211. Tsao, P.W. Platelet GPIIb/IIIa receptor occupancy studies using a novel fluoresceinated cyclic Arg-Gly-Asp peptide /Tsao P.W., Bo-zarth J.M., Jackson S.A., Forsythe M.S., Flint S.K., Mousa S.A. //Thromb. Res. 1995. - Vol.77, N.6 - P.543-56.

212. Van Ryn Me Kenna, J. Antithrombotic effects of glycosaminoglycans with different degrees of sulphation /Van Ryn Me Kenna J., Ofosu F., Hirsh J., Buchman M. // Brit. J. Haematol. -1989.-Vol. 71, N2.-P. 265-269.

213. Van Zyl, W.B. Production of a recombinant antithrombotic and fibrinolytic protein, PLATSAK, in Escherichia coli /van Zyl W.B., Pretorius G.H., Hartmann M., Kotze H.F. //Thromb. Res. 1997. -Vol.88, N.5.-P.419-26.

214. Vane, J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs / Vane J.R.//Nat. New. Biol. -1971. -Vol.231,N.25.-P.2352-6.

215. Verstrate, M. Clinical usage of heparin /Verstrate M. // Triangle. 1984. - Vol. 23, N 2. - P. 49-55.

216. Verstrate, M. Clinical Usage of heparin. Present and future frends /Verstrate M., Machin S.J. // Scand. J. Haematol. 1980. - Vol. 25.-P. 188.

217. Walenga, J.M. Fraxiparine Recent Pharmacological and Clinical Data. /Walenga J.M., Fareed J., Hoppensteadt D et al. // Stuttgart, 1990.-P. 103-118.

218. Wang, J. Antihemostatic effect of Hsien-Ho-Tsao (Agrimonia pilosa) / Wang J., Hsu M., Тегу C. // Amer. J. Clin. Med. 1984. -Vol. 12,N 1-4. -P. 116-121.

219. Wanga, Z. Heparin in the treatment of thrombosis /Wanga Z., Herkwardt F. //Med. J. Aust. 1984. - Vol. 121. - P. 17-21.

220. Weis H.J. Antiplatelet therapy /Weis H.J. // N. Engl. J. Med. -1988.-Vol. 298.-P. 1344-1347.

221. Wenkel-Drace, J.D. Evidence for a cycking receptor pool /Wenkel-Drace J.D. // Amer. J. Pathol. 1990. - 136. -1. - P. 61-70.

222. Yeh, C.H. A new short chain RGD-containing disintegrin, accu-tin, inhibits the common pathway of human platelet aggregation / Yeh C.H., Peng H.C., Yih J.B., Huang T.F //Biochim. Biophys. Acta. -1998. Vol.1425, N.3. -P.493-504.