Антиангиогенная активность экстрактов растений и их фракций тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Соломко, Элисо Шаликовна

• Соломко, Элисо Шаликовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соломко, Элисо Шаликовна

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Роль ЭК в организме человека

1.2. Ангиогенез в норме и при онкологических болезнях (этапы

формирования, механизмы и факторы)

1.2.1 Этапы формирования кровеносных сосудов при ангиогенезе

1.2.2. Механизмы формирования новых кровеносных сосудов в норме

1.2.3. Созревание вновь сформированной кровеносной сети

1.2.4. Особенности ангиогенеза при солидных злокачественных новообразованиях

1.3. Антиангиогенная терапия опухолей

1.3.1. Ингибиторы ангиогенеза, одобренные для клинического использования

1.3.2. Непрямые ингибиторы ангиогенеза

1.3.3. Ингибиторы ангиогенеза растительного происхождения

1.3.4. Особенности скрининга веществ растительного происхождения на

антиангиогенную активность

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы

2.1.3. Приготовление основных сред и буферов

2.1.4. Соединения, использованные для исследования антиангиогенных свойств

2.1.4.1 Противоопухолевые препараты и известные ингибиторы ангиогенеза

2.1.4.2 Экстракты растений

2.1.4.2. Фракции, полученные из корней и листьев лопуха

2.1.4.3. Фракции гидролизуемых таннинов, выделенные из Кипрея узколистого(СЬатаепеиоп а^шйГоНит)

2.1.5. Клеточные линии

2.2. Методы исследований

1.2.1. Культивирование клеточных линий

1.2.2. Снятие клеток с культуральных матрасов

1.2.3. Замораживание клеток

1.2.4. Размораживание клеток

1.2.5. Определение количества клеток

1.2.6. Инкубация клеток с тестируемыми веществами in vitro

2.2.7. Метод оценки цитотоксического действия веществ

2.2.8. Метод оценки эффективности блокирования пролиферации

2.2.9. Метод оценки блокирования миграционной способности клеток в камере Бойдена

2.2.10. Метод оценки блокирования миграционной способности клеток по

методу «заживления раны»

2.2.11 .Метод оценки блокирования формирования СПС

2.2.12. Имплантат Матригеля

2.2.13. Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание

2.2.14.Статистический анализ

Глава 3. Характеристика и функциональная активность in vitro культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10

3.1. Экспрессия маркеров эндотелиальных клеток на клеточной линии SVEC-4-10

3.2. Оценка влияния VEGF165 и bFGF на функциональную активность ЭК SVEC-4-10

3.3. Оценка влияния известных ингибиторов ангиогенеза на

функциональную активность ЭК SVEC-4-10

3.4 Оценка влияния известных противоопухолевых препаратов на

функциональную активность ЭК SVEC-4-10

Глава 4. Изучение антиангиогенной активности фракций растений in vitro и in vivo

4.1. Изучение антиангиогенных свойств экстрактов растений

4.2. Антиангиогенные свойства веществ, выделенных из лопуха обыкновенного (Arctium Lappa)

4.2.1. Антиангиогенные свойства сока корней Лопуха обыкновенного

4.2.2. Антиангиогенные свойства сока листьев Лопуха обыкновенного

4.2.3. Антиангиогенные свойства н-бутанольной фракции сока корней Лопуха обыкновенного

4.2.3. Антиангиогенные свойства н-бутанольной фракции СЛЛ

4.2.4. Антиангиогенные свойства этилацетатной фракции сока корней Лопуха обыкновенного

4.2.5. Антиангиогенные свойства этилацетатной фракции СЛЛ

4.2.6. Антиангиогенные свойства Арктиина из семян Лопуха обыкновенного

4.2.7. Антиангиогенные свойства других фракций сока корней Лопуха

обыкновенного (полисахаридная фракция, водная фракция без полисахаридов, водная фракция)

4.2.8. Обобщение полученных результатов по влиянию CKJT и CJIJI и отдельных фракций Лопуха обыкновенного на ангиогенез in vitro

4.2.9. Изучение свойств сока Лопуха обыкновенного и его фракций на ангиогенез in vivo на модели имплантата Матригеля

4.2.10. Антиангиогенные свойства фракций гидролизуемых таннинов, выделенных из Кипрея узколистого (Chamaenerion angustifolium)

4.2.11. Анализ взаимосвязи антиангиогенной активности веществ in vitro и

in vivo

Глава 5. Обсуждение полученных результатов

Заключение

Выводы

Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭК - эндотелиальная клетка

ил - интерлейкин

БМ - базальная мембрана

ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс

СПС - сосудисто-подобные структуры

ВИЛАР Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

ДМСО - диметил сульфоксид

СКЛ - сок корней лопуха

слл - сок листьев лопуха

ж - ингибирующая константа

- ангиопоэтин-1

Апё2 - ангиопоэтин-2

Не - тирозинкиназа

г-РА - активатор плазминогена тканевого типа

- фактор Фон Виллебранда

1САМ1 - внутриклеточная адгезионная молекула 1 типа

ШР1а - гипоксия-индуцируемый фактор альфа

ММР - матриксные металлопротеиназы

Т1МР - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ

и-РА - урокиназный активатор плазминогена

РБвР - тромбоцитарный фактор роста

РвБ - фактор роста фибробластов

свМР - циклический гуанозин монофосфат

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа

УЕвРЯ - рецептор фактора роста эндотелия сосудов

ТСР Ье1а - фактор роста опухоли бета

РЬОР - плацентарный фактор роста

Б1к1/КЛЖ - рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 типа

АР-1 - активаторный протеин

- протеин раннего роствого ответа

№кВ - транскрипционный фактор

Нег2/пеи - рецептор эпидермального фактора роста 2 типа

РАМ - ингибитор активатора плазминогена

с-кй - рецептор фактора роста

N0 - нитрит азота

ШУЕС Эндотелиальные клетки из пупочного канатика человека

ОАР - ГТФ-активируемый протеин

АБМЕТ - исследования по введению препарата, распределению, метаболизму, выведению и токсикологии

В0Р1 - метод биоактивность-прямое фракционирование-изоляция

РВ8 - фосфатно-солевой буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антиангиогенная активность экстрактов растений и их фракций»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одним из важных направлений исследований в области становления и прогрессии злокачественных заболеваний является изучение механизмов опухолевого неоангиогенеза. Неоангиогенез, или формирование новых микрососудов на основе уже существующей в ткани сети сосудов, является необходимым началом для роста опухоли и формирования отдаленных метастазов.

Показано, что эндотелиальные клетки (ЭК) опухоли отличаются по фенотипу от ЭК нормальной ткани, что создает предпосылки для поиска веществ, специфично блокирующих формирование опухолевых микрососудов.

В настоящее время активно разработываются новые подходы к лекарственному лечению злокачественных опухолей. Среди них -ингибирование роста новых микрососудов опухоли - антиангиогенная терапия, и уничтожение уже сформированных опухолевых микрососудов -васкулярная терапия. Новые направления в лечении рака требуют совершенно иной методологии скрининга активных соединений.

На сегодняшний день разработаны основные методики тестирования веществ на антиангиогенную активность in vitro. К ним относятся пролиферативный, миграционный тест, тест на блокирование образования СПС. В качестве ЭК берутся клетки из пупочного канатика человека (HUVEC). Однако их использование в экспериментальной онкологии ограничено несколькими пассажами, и в большинстве случаев они применяются для тестирования нескольких агентов и не подходят для широкого скрининга антиангиогенных веществ. До сих пор не разработаны стандарты критериев оценки антиангиогенных свойств вещества.

В предклинических исследованиях in vitro и in vivo описано более 2000 различных ингибиторов ангиогенеза, и их количество продолжает расти. Но только несколько препаратов ингибиторов VEGF рецептор-лигандной системы (Авастин, Сунитиниб и другие) показали эффективность в III фазе клинических испытаний и одобрены для клинического применения. Такой дисбаланс между данными предклинических и клинических исследований требует коррекции методов тестирования веществ, обладающих антиангиогенными свойствами.

Основной мишенью, одобренных для клинического исследования антиангиогенных препаратов, является блокирование активности VEGF рецептор-лигандной системы. Однако, как показали клинические исследования, к такому блокированию может возникать резистентность. Большой интерес вызывает поиск веществ, блокирующих несколько механизмов стимуляции ангиогенеза в опухоли.

В последнее время возрос интерес к скринингу противоопухолевых и антиангиогенных веществ природного происхождения [Gragg G., 1997, Harvey А., 1999]. Преимуществом данного подхода является то, что вещества-кандидаты уже обладают некоторыми свойствами, необходимыми для лекарств, а также высоким химическим разнообразием, необходимым для изучения корреляций активность-структура [Harvey А., 1999]. Выделенные из природных источников лидерные вещества могут быть оптимизированы с помощью методов комбинаторной химии или

f w тл

другими подходами современной клиническом химии. В настоящее время во многих странах (США, Южная Америка, Китай и других) имеются программы, направленные на разработку противоопухолевых препаратов на основе веществ, полученных из природных источников [Mans D., 2000, Normile D., 2003, Loboda A., 2005].

Комплексный подход к изучению антиангиогенных свойств, основанный на механизмах действия ингибиторов, может иметь

фундаментальное значение и определять создание новых терапевтических подходов на рациональной основе.

Цель работы:

Разработать комплексную систему исследования антиангиогенной активности веществ и оценить способность экстрактов растений и их фракций блокировать ангиогенез in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. разработать систему анализа и критерии оценки антиангиогенных свойств веществ in vitro с использованием линии ЭК мыши SVEC-4-10;

2. исследовать in vitro антиангиогенную активность различных экстрактов и фракций, выделенных из растений;

3. исследовать in vivo антиангиогенную активность экстрактов и фракций, выделенных из растений;

4. проанализировать взаимосвязь антиангиогенной активности веществ in vitro и in vivo.

Научная новизна

Разработан комплексный подход к определению антиангиогенных свойств веществ in vitro с использованием культуры ЭК мыши SVEC-4-10. На основании изучения антиангиогенных свойств известных ингибиторов ангиогенеза было показано, что данный подход может быть использован для характеристики антиангиогенных свойств различных экстрактов и их фракций, синтетических соединений и противоопухолевых препаратов.

В работе впервые изучены антиангиогенные свойства экстрактов растений и их фракций, перспективных для дальнейшего исследования с целью создания отечественного антиангиогенного противоопухолевого

препарата. Были отобраны 4 экстракта (Лопуха обыкновенного, Валерианы лекарственной, Эвкоммии вязолистной и Пассифлоры инкартной), которые являются наиболее перспективными для дальнейшего исследования. Данные экстракты обладали цитотоксическим эффектом in vitro как в отношении опухолевых культур, так и ЭК. Впервые показано, что этилацетатная и н-бутанольная фракции сока листьев и корней лопуха обладают антиангиогенными свойствами in vitro и in vivo. Обнаружено, что фракции 2 (Хаменерин I) и 3 (Хаменерин II) Кипрея узколистого (Chamaenerion angustifolium) блокируют формирование СПС in vitro, а также ангиогенез в имплантате Матригеля in vivo.

Научно-практическая значимость:

Разработанные и стандартизированные методы оценки ангиогенеза in vitro и in vivo широко используются в Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН для оценки антиангиогенных свойств экстрактов различных растений и их фракций, а также синтетических соединений. При исследовании известных ингибиторов ангиогенеза опухоли было показано, что разработанная система скрининга может быть использована для практического скрининга антиангиогенных веществ.

Отобраны н-бутанольные и этилацетатные фракции сока корней и листьев Лопуха обыкновенного, обладающих антиангиогенным действием для дальнейшего углубленного изучения в предклинических моделях опухолей. Нами показано, что эти фракции блокируют ангиогенез in vitro и in vivo, а также проявляют значительный цитотоксический эффект на различных опухолевых клетках. Данные фракции могут быть использованы в дальнейшем для создания нового оригинального отечественного антиангиогенного препарата.

Нами были отобраны две фракции гидролизируемых таннинов Кипрея узколистого (Хаменерин I и II), которые обладают антиангиогенными свойствами in vitro и in vivo и могут быть использованы для дальнейшей разработки противоопухолевых веществ, блокирующих ангиогенез.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ОПУХОЛЕВЫЙ АНГИОГЕНЕЗ И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО

БЛОКИРОВАНИЯ

1.1. Роль ЭК в организме человека

Длина кровеносных сосудов взрослого человека может доходить до 100 тысяч километров. Долгое время единственной функцией кровеносных сосудов считалась только транспортная - перенос питательных веществ, кислорода и регуляторных молекул. Сегодня кровеносная система является одним из важных органов организма, играющим основную роль в поддержании целостности организма.

Кровеносные сосуды формируют несколько типов клеток:

1. ЭК, которые непосредственно контактируют с кровью,

2. перицитов, локализованных субэндотелиально,

3. гладкомышечных клеток,

4. фибробластов.

Кровеносные сосуды окружены базальной мембраной (БМ) и экстрацелюллярным матриксом (ЭЦМ). В зависимости от локализации внутри органа клеточный состав кровеносных сосудов, БМ и ЭЦМ различается фенотипический, структурно и функционально [Rajotte., 1998].

Эндотелиальные клетки формируют монослой в каждом одиночном кровеносном сосуде и активно вовлечены в некоторые регуляторные процессы в организме.

Кроме метаболической активности и регуляции селективной проницаемости для низкомолекулярных растворенных веществ и пептидов/протеинов,

ЭК регулируют свертываемость крови. Если целостность сосуда сохранена, они проявляют антикоагуляционные свойства, синтезируя тромбомодулин - ингибитор тканевого фактора (tissue factor, TF), и активатор

плазминогена тканевого типа (t-PA). При активации или повреждении ЭК быстро высвобождается фактор фон Виллебранда (vWF), активирующий адгезию и агрегацию тромбоцитов, и ингибитор активатора плазминогена 1 типа (PAI-1). Высокая экспрессия TF в эндотелии, в таких условиях, ведет к активации внешнего пути коагуляции крови [Verstraete., 1995].

Другая важная особенность ЭК - способность регулировать привлечение клеток иммунной системы к определенному месту внутри организма. Для привлечения иммунных клеток к лимфоидным органам или местам воспаления в ЭК повышается экспрессия различных адгезивных молекул (например, Е-селектина и внутриклеточной адгезионной молекулы 1 типа (ICAM-1)) и растворимых факторов (хемоаттрактантов, цитокинов и хемокинов) [Carlos., 1994].

1.2. Ангиогенез в норме и при онкологических болезнях (этапы формирования, механизмы и факторы)

Формирование новых кровеносных сосудов из предсуществующих капилляров получило название ангиогенез (неоангиогенез). Ангиогенез является ключевым событием для большого количества различных физиологических и патологических процессов.

ЭК, выстилающие кровеносные сосуды, являются длительно живущими, как и клетки нервной системы. Физиологический круговорот ЭК в ткани занимает примерно несколько лет, что не требует постоянной активации ангиогенеза. Есть только несколько тканей человека, в которых активируется ангиогенез: репродуктивные органы, органы, требующие физиологического роста, и поврежденные ткани [Hanahan D., 1996].

Развитие и рост нормальных тканей в эмбриональном и постнатальном периоде, заживление раны и менструальный цикл зависят от формирования новых сосудов, необходимых для снабжения тканей кислородом и питательными веществами, а также удаления продуктов жизнедеятельности. При эмбриональном развитии имеет место

васкулогенез - новые ЭК дифференцируются из стволовых клеток и клеток-предшественников [Risau., 1997]. У человека физиологические стимулы, активирующиеся при заживлении ран и репродуктивном цикле женщин, стимулируют ангиогенез, тогда как васкулогенез, в основном, отсутствует.

Огромное количество независимых друг от друга заболеваний ассоциируется с формированием новых кровеносных сосудов. Среди патологических процессов встречаются такие, где ангиогенез снижен и должен быть усилен для улучшения состояния человека, - ишемическая болезнь, сердечная недостаточность и другие [Carmeliet., 1999; Ferrara N., 1999].

При некоторых болезнях частью патологии является стимуляция ангиогенеза. К ним относятся злокачественные опухоли (солидные и гематологические), кардиоваскулярные болезни (атеросклероз), хронические воспаления (ревматоидный артрит, болезнь Крона), диабет (диабетическая ретинопатия), псориаз, эндометриоз и ожирение. В активной фазе ремоделирования сосудов ЭК опухоли пролиферируют в 20200 раз быстрее, чем эндотелий нормальных тканей человека [Denekamp., 1984]. Одним из подходов к лечению этих болезней может быть использование препаратов, ингибирующих ангиогенез [Folkman J., 1995; Hanahan., 1996].

Несмотря на комплексность регуляции ангиогенных процессов и сложность анализа функций ЭК in vitro и in vivo, на сегодняшний день, в основном, изучены и стали понятными молекулярные и клеточные механизмы стимулирования/ингибирования ангиогенеза, а также особенности образования новых сосудов при различных патологических процессах.

1.2.1 Этапы формирования кровеносных сосудов при ангиогенезе

Формирование новых микрососудов может реализоваться тремя основными путями: ангиогенеза (формирование новых микрососудов делением ЭК посткапиллярных венул), васкулогенез (образование новых микрососудов из клеток-предшественников гематопоэза) [Cragg О., 1997] и интуссуцептивный ангиогенез (формирование новых микрососудов из капиллярных сплетений без врастания) [^ига К., 2001]. Ведущее значение придается ангиогенезу.

В ответ на ангиогенные стимулы образование новых кровеносных сосудов происходит в несколько этапов:

(а) миграция перицитов от БМ капилляра;

(б) секреция различных протеаз «активированными» ЭК;

(в) деградация ЭЦМ вокруг капилляра;

(г) миграция и пролиферация ЭК;

(д) образование мигрирующими клетками сосудисто-подобных структур (СПС);

(е) образование анастомозов с близлежащими кровеносными сосудами;

(ж) запуск кровотока по вновь сформированному капилляру.

В последние несколько десятилетий были охарактеризованы некоторые молекулярные пути формирования новых кровеносных сосудов.

1.2.2. Механизмы формирования новых кровеносных сосудов в норме

Инициация ангиогенеза. Ангиогенез запускается в ответ на гипоксию или ишемию. Сосудистая релаксация, активированная, например, нитритом оксида (N0), необходима ЭК для запуска ангиогенного каскада. Вероятно, морфологические изменения ЭК, возникающие при этом, ведут к уменьшению конфлюэнтности, что делает их восприимчивыми к

митогенезу [Folkman., 1997]. При ангиогенезе (физиологическом и патологическом) активация ЭК является первым запускающимся процессом.

В ответ на гипоксию или ишемию в нормальных и опухолевых клетках ткани секретируются различные цитокины. Полагают, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является основным участником инициации процесса ангиогенеза, т.к. он способен индуцировать вазодилятацию через продукцию NO эндотелиальными клетками и увеличивать проницаемость ЭК [Ziehe., 1997]. Это приводит к выходу и накоплению белков плазмы в окружающей ткани, что приводит к формированию богатой фибрином сети [Dvorak, 1986]. В пользу данной гипотезы свидетельствуют также наблюдения, что синтез YEGF находится под контролем гипоксия-индуцируемого фактора 1 альфа (HIFIа) и экспрессия рецепторов к VEGF (VEGFR) повышается при гипоксии или ишемии [Forsythe., 1996].

Высокий уровень VEGF наблюдается в гипоксических опухолевых клетках, макрофагах и других клетках иммунной системы [Brown., 1997]. Кроме воздействия на вазодилятацию и сосудистую проницаемость, VEGF может индуцировать экспрессию протеаз и рецепторов, важных для клеточной инвазии и ремоделирования тканей, а также способен предотвращать апоптоз ЭК [Ferrara N., 1997]. Однако ангиогенез является зависимым не только от продукции VEGF, что было показано некоторыми исследователями [Hansen-Algenstaedt, 1999].

Миграция активированных ЭК в гипоксические участки ткани осуществляется при действии матриксных металлопротеиназ (ММР), которые расщепляют БМ. Эти экстрацеллюлярные эндопептидазы секретируются как зимогены, которые становятся активированными только в ЭЦМ и частично разрушают его определенные компоненты [Stivenson., 1999]. Они продуцируются различными клетками, включая ЭК,

фибробласты, воспалительные клетки и эпителиальные клетки. Активность ММР, а, следовательно, ангиогенеза, нейтрализуется через семейство тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (TIMP) [Gomez., 1997].

Миграция и пролиферация ЭК. Активаторы плазминогена урокиназного (и-РА) и тканевого типа (t-PA) переводят плазминоген в плазмин. Плазмин обладает широким спектром тирозин-подобной активности и разрушает фибронектин, ламинин и белки оболочки -протеогликанов. Также, плазмин активирует определенные ММР. Плазмин, как полагают, является одним из важных протеаз для мобилизации основного фактора роста фибробластов (bFGF) из его «хранилища» в ЭЦМ.

Члены семейства FGF действуют как прямые проангиогенные молекулы. bFGF существует в двух модификациях: низкомолекулярной (18 кДа) и высокомолекулярной (22-24 кДа) формах. Во время ангиогенеза низкомолекулярный bFGF связывается с эндотелием, индуцируя снижение экспрессии рецептора к FGF, увеличивая подвижность, пролиферацию клеток и активность протеиназ, а также модулируя уровень интегринов. Высокомолекулярный bFGF может стимулировать пролиферацию ЭК после его транслокации в ядро [Klein 1997].

Под контролем VEGF находится также пролиферация ЭК. Этот эффект может быть частично вызван NO-зависимой активацией семейства митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК). Наблюдения последних лет показывают, что ЭК очень чувствительны к малым изменениям уровня VEGF и bFGF, что может быть важным для их использования в лечении ангиогенез-зависимых болезней [Czubayko., 1997].

1.2.3. Созревание вновь сформированной кровеносной сети. Взаимодействие ЭК с ЭЦМ и стромальными клетками является предпосылкой для формирования стабильной сосудистой сети. После формирования первичной кровеносной сети ЭК рекрутируются

окружающие ее поддерживающие клетки (перициты - в малых сосудах и гладкомышечные клетки - в больших сосудах). ЭК могут привлекать перициты путем секреции тромбоцитарного фактора роста (PDGF) -митогена и хемоаттрактанта для различных мезенхимальных клеток.

Более поздняя дифференцировка поддерживающих клеток, как полагают, является зависимым от контактов клетка-клетка. При контакте ЭК-поддерживающая клетка участвует латентная форма опухоль трансформирующего фактора бета (TGF-beta), продуцируемая как эндотелием, так и поддерживающими клетками. TGF-beta активируется плазмин-зависимым путем. Активированный TGF-beta может индуцировать изменения в миофибробластах и перицитах, которые привлекаются к формированию зрелых сосудов, продукции ЭЦМ и поддержании контроля роста. Таким образом, при заживлении ран рост кровеносных сосудов может регулироваться и перицитами, которые могут блокировать ангиогенез, формируя неактивные кровеносные сосуды, окруженные базальной мембраной [Hirschi., 1997].

Ангиопоэтины и их рецепторы Tie-1 и Tie-2 играют критическую роль на поздних стадиях созревания кровеносных сосудов [Maisonpierre., 1997]. Функция Tie-1 связана с дифференцировкой ЭК и установления целостности кровеносных сосудов. Tie-2, напротив, чрезвычайно важен для активации формирования кровеносной сети [Puri., 1995; Sato., 1995]. Экспрессия Tie-2 ограничена ЭК [Wong., 1997].

Ангиопоэтин-1, связываясь с Tie-2 рецептором, индуцирует фосфорилирование рецептора. Основная функция ангиопоэтина-1 в ЭК -стабилизация микрососудов. Ang-1 обеспечивает сосудистую целостность сосудов и стимулирует миграцию эндотелиальных клеток в культуре [Maisonpierre., 1997; Asahara., 1998]. В исследованиях in vivo было показано, что присутствие ангиопоэтина-1 требуется для привлечения и удержания поддерживающих гладко-мышечных клеток и перицитов.

Постоянное действие ангиопоэтина-1 необходимо для поддержания жизнеспособности ЭК, при прерывании сигналов, индуцируемых этим фактором, в ЭК активируется апоптоз.

Ангиопоэтин-2 является антагонистом ангиопоэтина-1. Ангиопоэтин связывается с Tie-2 рецептором, но не активирует его. Действие ангиопоэтина-2 необходимо для дестабилизации зрелых сосудов, что делает их чувствительными к действию ангиогенных стимуляторов.

1.2.4. Особенности ангиогенеза при солидных злокачественных новообразованиях.

Важной характеристикой, отличающей «нормальный» ангиогенез от патологического, является тонко регулируемый баланс про- и антиангиогенных сигналов. Во время нормального физиологического ангиогенеза новые сосуды быстро созревают и становятся стабильными. Ангиогенез опухоли можно характеризовать как «рану, которая никогда не заживает» [Dvorak Н. F., 1986]. При васкуляризации опухоли стирается баланс между про- и антиангиогенными стимулами. Характерной особенностью сосудов опухоли является их неспособность становиться зрелыми из-за постоянно повышенного уровня стимуляторов ангиогенеза в микроокружении.

Обнаружены уникальные особенности опухолевой кровеносной сети, которые позволяют отличить ее от нормальной. Опухолевые кровеносные сосуды архитектурно отличаются от их нормальных двойников - они имеют нерегулярную форму, дилятированы, высокопроницаемы и способны к регрессии. Они не организованы в морфологически различающиеся венулы, артериолы и капилляры, как в нормальной кровеносной сети, но обладают некоторыми свойствами всех из них. Васкулярная сеть, которая формируется в опухоли, высокопроницаема, что часто приводит к геморрагиям. При этом поддерживающие клетки, которые в нормальных тканях стабилизируют сосуды, контактируя с ЭК,

часто отсутствуют в незрелой опухолевой сети [Benjamin L. Е., 1999]. Кровеносные сосуды, могут ассоциироваться с опухолевыми клетками в кровеносной стенке [Folberg R., 2000]. В некоторых опухолях наблюдается запуск васкулогенеза, путем рекрута предшественников ЭК из костного мозга [Lyden D., 2001].

Ток крови в опухолевых сосудах становится нерегулярным, более медленным и иногда он может осуществляться в обратную сторону. Это ведет к появлению дисфункциональных капилляров. Опухоли могут быть гетерогенны в отношении плотности сосудистой сети: часто, в одних участках - плотность сосудов внутри опухоли повышена по сравнению с нормальной тканью, а в других - понижена. Предполагается, что это является результатом несбалансированной экспрессии ангиогенных факторов.

При формировании нормальной кровеносной сети требуется кооперативная активность различных цитокинов и их ингибиторов, каждый их которых должен синтезироваться в определенном количестве и временном порядке [Carmeliet Р., 2000]. Среди них VEGF и другие члены этого семейства, такие как плацентарный фактор роста (P1GF), и другие цитокины, как TGF-beta, PDGF, эфрины, FGF, ангиопоэтин-1 и -2 и их соответствующие рецепторы и ингибиторы. Как показывают исследования, опухолевая кровеносная сеть формируется с помощью аналогичных «упрощенных» механизмов, отличаясь от нормальной сети количеством вовлеченных цитокинов.

Исследования последних 25 лет показывают, что VEGF-A - способен самостоятельно, без участия других стимуляторов, индуцировать формирование опухоль-ассоцированных сосудов и соединительной стромальной ткани [Brown LF., 1997; Dvorak HF., 1999]. VEGF-A был открыт в результате микроскопических исследований трансплантируемых

опухолей на ранних стадиях после их имплантации сингенным животным [Dvorak HF, 1979].

1.3. Антиангиогенная терапия опухолей

Одним из наиболее важных достижений в лечении злокачественных новообразований в последние несколько лет является увеличение эффективности химиотерапии при ее комбинировании с антиангиогенной терапией. Такая комбинация может увеличивать продолжительность жизни больных колоректальным раком, раком легких, почек, и других на 2-5 месяцев по сравнению с химиотерапией.

Антиангиогенная терапия направлена на блокирование образования новых сосудов в опухоли и уничтожение уже существующих опухолевых сосудов [Chistofalli М., 2002]. Данная стратегия основана на том, что процесс ангиогенеза необходим для роста и прогрессии опухолей. Недостаток в питательных веществах и кислороде, необходимых для роста опухоли, приводит к появлению клонов опухолевых клеток, выделяющих ангиогенные факторы. Высокоангиогенные опухоли имеют больше возможностей индуцировать рост новых сосудов при метастазировании, по сравнению с низкоангиогенными, метастазирующие клоны которых находятся в «дремлющем» состоянии. Экспериментальные исследования in vivo, иммуногистохимические и биохимические исследования различных опухолей человека неоднократно демонстрировали зависимость роста опухоли и метастазирования от ангиогенной активности первичного очага [HanahanD, 1996].

При блокировании данного процесса рост злокачественных опухолей в эксперименте прекращается и в опухоли наблюдается гибель опухолевых клеток из-за нехватки питательных веществ и кислорода.

Также показано, что использование антиангиогенной терапии приводит к «нормализации» кровотока внутри опухоли, что ассоциируется со снижением интерстициального давления и при сочетании с

химиотерапией может повысить концентрацию противоопухолевых препаратов в ткани опухоли.

1.3.1. Ингибиторы ангиогенеза, одобренные для клинического использования

Прямые ингибиторы ангиогенеза действуют непосредственно на ЭК, блокируя пролиферацию, миграцию и индуцируя апоптоз в активированных эндотелиальных клетках. Показано, что к прямым ингибиторам ангиогенеза не возникает лекарственной резистентности.

Аеастин (Avastin, Bevacizumab)

Авастин - химерное человеческое рекомбинантное антитело против VEGF. Он распознает все изоформы VEGF, но не связывается с другими ангиогенными факторами, такими как факторы роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста и др [Aggarwal В., 2004]. В настоящее время ведутся клинические испытания во II-III фазах.

Самостоятельная активность Авастина при резистентном раке молочной железы составляет 11-20%. При II фазе испытаний у 110 больных метастатическим раком почки показано, что использование препарата в высоких дозах (10 мг/кг каждые 2 недели) в 2,5 раза удлиняет время до прогрессирования болезни по сравнению с плацебо [Dolle R., 1999].

Однако опубликованные в сентябре 2002 года данные об эффективности Авастина в комбинации с Кселодой в III фазе клинических испытаний не утешительные [Brakenhielm Е., 2001]. В исследование были включены 462 женщины, страдающие метастатическим раком молочной железы, резистентным к антрациклинам и таксанам, которые рандомизированно получали Кселоду+Авастин. Хотя общая эффективность терапии была выше у больных, получавших Кселоду и Авастин, не наблюдалось значительных различий во времени до прогрессирования и 1-летней общей выживаемости. На сегодняшний день

в Европе продолжается исследование комбинации Оксалиплатин+Авастин как первой линии химиотерапии при метастатическом раке молочной железы. Перспективным представляется также использование комбинации Авастина и химиотерапии при колоректальном раке.

Витаксин (Vitaxin)

Витаксин - представляет собой моноклональное антитело к сш[33 интегрину, экспрессирующегося на мембранах активированных ЭК [Cao Y., 2002]. В ряде клиник проводится I-II фаза клинического изучения Витаксина при разных типах опухолей. Однако результаты исследований пока не опубликованы. Отдельные успешные примеры применения препарата имеются при лейкомиосаркоме.

Другие ингибиторы ангиогенеза прямого действия проходят начальные стадии клинического изучения, поэтому судить о перспективах их использования еще рано.

1.3.2. Непрямые ингибиторы ангиогенеза

Непрямые ингибиторы блокируют синтез ангиогенных стимуляторов опухолевыми клетками. Так, они могут предотвращать активность онкогенов, стимулирующих ангиогенез или блокировать рецепторы на ЭК.

Для многих онкогенов доказана возможность активирования синтеза стимуляторов ангиогенеза (особенно VEGF) и блокирования ингибиторов ангиогенеза (тромбоспонбин 1).

Большинство успешных непрямых ингибиторов участвует в модуляции нескольких механизмов контроля за ангиогенной активностью опухоли. Так, антиангиогенная активность показана для Герцептина (моноклональные антитела против HER2/neu) [Chang С., 1995]. Он ингибирует синтез TGF-P, ангиопоэтина-1, ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) и, возможно, VEGF. Кроме того, он индуцирует синтез тромбоспондина (ингибитор ангиогенеза). Ингибитор рецептора

эпидермального фактора роста - Иресса блокирует продукцию VEGF, bFGF, TGF-a и интерлейкина 8 опухолевыми клетками [Arakaki N., 2004].

Семаксаниб (SU5416)

Другим анти-VEGF препаратом в клинических испытаниях является Семаксаниб - синтетическая «малая молекула» - ингибитор рецептора VEGF 2 типа (Flk-1/KDR).

Большие надежды возлагают на препараты нового поколения SU6668 и SU 11248 (SUGEN), которые блокируют несколько типов рецепторов (рецепторы VEGF, bFGF, c-kit, PDGF и др). В настоящее время проводятся I и II фазы клинических испытаний этих препаратов.

Ингибиторы матриксных металлопротеиназ

Матриксные металлопротеиназы (ММР) - семейство ферментов, участвующих в деградации базальной мембраны и стимулирующих ангиогенез, инвазию и метастазирование опухоли. На сегодняшний день различают более 15 матриксных металлопротеиназ. Предклинические исследования показали, что некоторые ингибиторы ММР (сами или в комбинации с химиопрепаратами) могут ингибировать рост опухолей in vivo.

На сегодняшний день идут клинические испытания пяти ингибиторов ММР: Маримастат при ранних стадиях рака поджелудочной железы, BMS-275291 при прогрессирующем немелкоклеточном раке легкого, Приномастат при ранних стадиях солидных опухолей, Метастат (тетрациклиновый ингибитор ММР) при саркоме Капоши, Неовастат (экстракт из хряща акулы) при нерезектабельном раке почки.

Разрабатываются ингибиторы ММР, обладающие высокой избирательностью к ММР одного типа. Кроме того, проводится активное изучение биологического и прогностического значения ММР для определенных типов опухолей.

Талидомид

Талидомид-низко молекулярное соединение, которое приобрело печальную известность как тератогенный препарат около 40 лет назад, когда назначался беременным женщинам в качестве седативного средства. Первичным дефектом плода при этом были анормально укороченные конечности. На сегодняшний день Талидомид активно изучается как антиангиогенный препарат. Точный механизм действия препарата не ясен. Известно, что Талидомид ингибирует синтез bFGF, ИЛ-6, и ИЛ-8. Показано, что он также снижает экспрессию циклооксигеназы 2.

Интерфероны

Интерфероны альфа и бета могут ингибировать некоторые этапы неоангиогенеза опухолей (блокирование bFGF-стимулированной пролиферации и миграции ЭК, снижать синтез bFGF, ИЛ-8 и коллагеназы VI типа опухолевыми клетками) [Cragg G., 1997].

Показано, что интерферон альфа эффективен у больных с высоким уровнем bFGF в сыворотке или моче больных. Терапия интерферонами таких больных приводила к значительному снижению уровня bFGF в сыворотке, моче или опухоли больного. В экспериментах in vivo также было выявлено, что наибольший антиангиогенный эффект интерферона альфа наблюдается при частом использовании небольших доз препарата.

1.3.3. Ингибиторы ангиогенезарастительного происхождения

В течение последних 50 лет создан определенный арсенал эффективных противоопухолевых препаратов [Yarbro J., 1992, Chabner В., 1991], что позволило достигнуть значительных успехов в лечении злокачественных опухолей человека [Jessup J., 1996]. Однако большинство новообразований являются/становятся резистентными к проводимой противоопухолевой химиотерапии [Yarbro J., 1992], ограничивая эффективность лечения [Yarbro J., 1992, Chabner В., 1991]. Из этого

следует, что требуется разработка новых современных высокоэффективных противоопухолевых препаратов.

Одной из причин редкого появления новых противоопухолевых препаратов в онкологической практике и их высокой стоимости называется несбалансированность показателя «цена-успех» традиционной методологии поиска и усовершенствования новых лекарств. В настоящее время основной методологией является проведение химического синтеза большого количества химически подобных веществ и скрининга высокой плотности [Harvey А., 1999]. Используя комбинаторный химический подход, синтезируется большое количество структурно связанных веществ [Dolle R., 1997], которые затем исследуются на противоопухолевую биологическую активность с помощью скрининга высокой плотности. С помощью данного подхода были синтезированы и исследованы множество потенциально биоактивных пептидов, олигонуклеотидов и небольших органических молекул [Nefzi А., 1997].

Однако результаты, полученные с помощью данной методологии, часто не оправдывают всех ожиданий. Большинство полученных пептидов и олигонуклеотидов не имеют полезных фармакологических свойств, тогда как химическое разнообразие большинства органических соединений, которые по физико-химическим свойствам пригодны для создания лекарств, было меньше, чем ожидалось [Nefzi А., 1997].

В последнее время возрос интерес к другому часто используемому походу - к скринингу веществ природного происхождения [Gragg G., 1997, Harvey А., 1999]. Преимуществом данного подхода является то, что вещества-кандидаты уже обладают некоторыми свойствами, необходимыми для лекарств (например, абсорбцией в желудочно-кишечном тракте и метаболизмом), а также высоким химическим разнообразием, необходимым для изучения корреляций активность-структура [Harvey А., 1999]. Выделенные из природных источников

вещества могут быть использованы в скрининге высокой плотности, и лидерное соединение может быть оптимизировано с помощью методов комбинаторной химии или другими подходами современной клинической химии.

Однако стратегия создания новых противоопухолевых препаратов, основанная на использовании веществ растительного происхождения, имеет ряд сложностей, которые не возникают при использовании методов рационального синтеза. Они связаны с получением полной коллекции растений, произрастающих на определенной территории, трудностями изоляции и получения фармакологически активных веществ и правами на интеллектуальную собственность. Даже с учетом всех сложностей, скрининг природных веществ может быть более эффективным, чем скрининг рационально созданных соединений.

В настоящее время во многих странах имеются программы, направленные на разработку противоопухолевых препаратов на основе веществ, полученных из природных источников. Такие программы существуют в США, Южной Америке, Китае и других странах [Mans D., 2000, Normile D., 2003, Loboda А., 2005].

Вещества, которые мы получаем с пищей, могут влиять на ангиогенную активность различных типов клеток организма. В ряде случаев это влияние косвенное, через различные патофизиологические изменения организма. Так, соблюдение определенной диеты приводит к снижению количества холестерина в крови, что может снижать синтез VEGF в различных клетка (макрофагах, гладкомышечных клетках и других) [Ramos M., 1998, Inoue M., 2001]. Длительные изменения в составе липидов крови, которые являются результатом неправильной диеты, могут влиять на ангиогенез и быть частью патогенеза кардиоваскулярной болезни у человека. Возможность использования составляющих пищи для успешного модулирования ангиогенеза человека еще до конца не доказана,

хотя экспериментальные данные свидетельствуют в пользу такой точки зрения. Существует множество съедобных растений, которые с давних времен используются человеком для предотвращения и/или лечения онкологических заболеваний. Однако их эффективность в большинстве случаев не доказана и часто очень сложна для оценки, поэтому их использование в онкологии обсуждаются с некоторым скептицизмом [Cragg G., 2001]. Так исследования показывают, что регулярное употребление некоторых фруктов и овощей может снизить статистический риск возникновения определенных типов опухолей [Cragg G., 2001]. Эффект данных растений связан с определенными соединениями, которые находят в них. Среди них наиболее активными являются ресвератрол, катехины, генистейн, куркумин. Активно изучаются и другие вещества, такие как диаллил сульфид, S-аллил цистеин, аллицин, ликопен, капсаицин, 6-джинджерол, эллаговая кислота, урсолиевая кислота, силимарин, анетол и евгенол [Aggarwal В., 2004, Dorai Т., 2004]. Они, как показано в исследованиях in vivo и in vitro, блокируют пролиферацию клеток, ингибируют сигнальные пути ростовых факторов, индуцируют апоптоз [Dorai Т., 2004] .

Считается, что первое антиангиогенное вещество растительного происхождения было выделено в 1990 году Ингбером и соавторами, которые сообщили об антиангиогенных свойствах фумагилина, секретируемого антибиотика гриба Aspergillus fumifatus [Ingber D., 1990].

Различные про - и антиангиогенные вещества растительного происхождения с недавнего времени тестируются для потенциального клинического использования [Dulak J., 2005]. Таблице 1 приведены соединения, выделенные из различных растений и обладающие антиангиогенной активностью. Однако стоит помнить, что у большей части описанных веществ, активность подтверждена только в предварительных исследованиях in vitro и требуется больше данных для

подтверждения перспектив их использования в клинической практике. Необходима тщательная и аккуратная характеристика активных химических соединений, определение молекулярных механизмов их действия, оценки в исследованиях in vivo на адекватных моделях болезней человека и, наконец, доказательства их безопасности и эффективности в клинических исследованиях [Dulak J., 2005].

В настоящее время признано, что полифенолы являются самой активно изучаемой группой соединений для профилактики и лечения различных болезней человека. Среди них флаваноиды занимают первое место. Флавоноиды принадлежат к группе природных веществ с разнообразной фенольной структурой. Идентифицировано более 4000 видов флавоноидов, из которых боле 500 находятся в свободном состоянии (негликозилированы). Это низкомолекулярные соединения, имеющие 3 бензольных кольца с различными заместителями. Выделяют несколько субклассов флавоноидов: антоцианиды, выделяемые из ягод и винограда, флаванолы - из чая, флавононы - из цитрусов, флавоны - из различных растений и перца и изофлавоны - из сои. Среди них флавоны и катехины представляют наибольший интерес.

Важным эффектом флавоноидов является ингибирование свободных форм радикалов. Эксперименты in vitro показали, что флавоноиды обладают противовоспалительным, антиаллергическим, противовирусным, и антиканцерогенным свойствами. Противовоспалительные и антиоксидантные свойства флавоноидов являются основными механизмами их антиангиогенного действия.

Ресвератрол был впервые выделен в 1940 году как составная часть корней чемерицы белой (Veretrum grandiflorum) [Aggarwal В., 2004]. Ресвератрол в дальнейшем был обнаружен в различных растениях, включая виноград, ягоды и арахис. Кроме кардиопротекторного эффекта он проявляет и противоопухолевые свойства. Он блокирует рост

Таблица 1.

Биоактивные растительные вещества и их эффект на ангиогенез

Общее название Химическое название Источник Активность Ссылка

Ресвератрол 3,5,4'- trihydroxy-trans-stilbene Виноград Ингибирование синтеза АФК и АФК-зависимое болкирование ангиогенеза (пролиферации ЭК, синтеза VEGF, bFGF, ИЛ-8) Lin МТ, 2003; Brakenhielm Е, 2001

Куркумин diferuloymethane Curcuma longa Ингибирование VEGF, Angl и Ang2 Ингибирование VEGF и bFGF-зависимого ангиогенеза Gururaj АЕ, 2002 Arbiser JL, 1998

Катехины чая (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epigallocatechin 3,5-di-O-gallate, epitheaflagallin 3-O-gallate Camellia sinensis Ингибирование МТ1-ММР и формирования активной ММР-2 Блокирование VE-кадхерина и фосфорилирования Akt Ингибирование VEGF рецепторов на ЭК Снижение активности c-fos, c-jun и Ets-1 Yamakawa S, 2004; Fassina G, 2004 Tang FY, 2003 Kojima-Yuasa A, 2003 Lai HC, 2004

Флавон Родственные соединения флавоноидов Различные растения Ингибирование Rb, фосфорилирования Cdk2 и Cdk4 Ингибирование пролиферации ЭК Arakaki N, 2004

Лютеолин Tetrahydroxyflavone Петрушка, артишок, перец, оливковое масло, лимон, мята, тимьян, Ингибирование PI3K и VEGF-индуцированной пролиферации ЭК Bagli Е,2004

Генистейн Семейство Leguminosae (включая соевые бобы) Ингибирование тирозин-киназ Ингибирование VEGF и ММР-9 Radzikowski С, 2004 Ravindranath МН, 2004

Апигенин 5,7,4'-trihydroxyflavone Яблоки, фасоль, брокколи, вишня, виноград, лук, петрушка, помидоры, чай и вино Ингибирование HIF-1 и синтеза VEGF Osada М, 2004

Поницидин и оридонин Rabdosia rubescens Ингибирование Akt и МАРК киназ Sartippour MR, 2005

Ginseng Ginsenosides (triterpene dammarenes) Panax ginseng Ингибирование ангиогенеза (опухоль) Sengupta S, 2004; Sato К, 1994

Ginseng Ginsenosides (triterpene Radix rubra Стимуляция ангиогенеза (заживление Sengupta S, 2004;

dammarenes) ран) MorisakiN, 1995

Полисахаропептид PSP Съедобные грибы Coriolus versicolor Ингибирование опухолевого ангиогенеза, блокирование VEGF Но JC, 2004

Полиацетилен (травяной чай) Bidens pilosa Ингибирование пролиферации ЭК, повышение активности p27(Kip) и p21(Cipl) Wu LW, 2004

Баикалеин, эпикатехин, бреберин и ацетозид ? Травы, входящие в состав сборов китайской медицины (Berberís paraspecta, Taxus chinensis и другие) Снижение активности ММР-1,-2,-9 Ингибирование АФК Блокирование пролиферации ЭК и ангиогенеза Wartenberg М, 2003 Wang S, 2004

Птерогинидин ? Alchornea grandulosa Блокирование образования трубочко-подобных структур ЭК Снижение активности NFkB Lopes FCM, 2009

Артесунат ? Полусинтетическое соединение артемизина из Artemisia annua Ингибирование пролиферации ЭК Ингибирование VEGF рецептор-лигандной системы Chen HH, 2004

лимфоидных и миелоидных опухолей, рака молочной железы, простаты пищевода, толстой кишки, поджелудочной и щитовидной желез, меланомь и многих других [Aggarwal В., 2004]. Молекулярный механизм ингибирования пролиферации опухолевых клеток ресвератролом изучеь только частично. Показано, что вовлечено блокирование некоторые транскриптационных факторов, таких как NFkB, АР-1и Egr-1, снижение экспрессии антиапоптотических генов и активация каспаз [Aggarwal В. 2004].

В отношении ангиогенеза ресвератрол снижает экспрессик некоторых ангиогенных цитокинов, включая VEGF и интерлейкин 8 (ИЛ-£ [Cao Y., 2002]. Защитное влияние ресвератрола на ЭК реализуется инактивацией активных форм кислорода (АФК) [Igura К., 2001]. АФК такие как перекись водорода, играет важную роль в механизмах опухолевого ангиогнеза [Maulik N., 2002], запуская экспрессию ангиогенных стимуляторов, среди которых и VEGF [Sen С., 2002. Grzenkowicz-Wydra J., 2004]. В исследованиях in vitro показано, что ЭК пупочного канатика человека HUVEC при инкубировании с ресвератролом значительно блокирует VEGF-зависимую миграцию клеток и формирование СПС, но не пролиферацию ЭК. Ресвератрол эффективнс блокирует YEGFR2 тирозинкиназную активность, а также связывание VE-кадхерина с (3-катенином [Lin M., 2003]. В экспериментах m vivo ресвератрол, вводимый животным вместе с питьевой водой, блокирует ангиогенез в модели стимуляции ангиогенеза в роговице мыши [Brakenhielm Е., 2001]. Эффект связан с блокированием как VEGF, так и bFGF-рецептор-лигандного ответа с вовлечением фосфорилирования MAP киназы. Ресвератрол может ингибировать опухолевый рост in vivo путем ингибирования ангиогенеза и на других моделях ангиогенеза [Brakenhielm Е., 2004]. Введение ресвератрола per os ингибирует рост фибросаркомы мыши и значительно снижает заживление раны, процесса также

зависимого от ангиогенеза [Brakenhielm Е., 2004]. Ресвератрол также супрессирует ангиогенез и рост глиомы [Tseng S., 2004]. Этот эффект связан с проапототическим действием вещества на опухолевые клетки и снижением синтеза VEGF. Короткое или длительное инкубирование гладкомышечных клеток сосудов с полифенольными соединениями красного вина ингибирует синтез VEGF и его высвобождение в ответ на действие PDGF АВ, TGF-J31 или тромбина [OakM., 2003].

Подобный эффект оказывает ресвератрол, выделенный и из других растений, например из корней Polygonum cuspidatum, предотвращая опухолевый рост карциномы Льюиса мыши, метастазирование в легкие и ангиогенез [KimuraY., 2000, Kimura Y.,2001].

Куркумин - низкомолекулярное соединение, выделенное из традиционно используемой специи куркумы. Куркумин снижает активность транскриптационного фактора NFkB, АР-1 и Egr-1, ингибирует экспрессию циклоксигеназы 2, активатора плазминогена урокиназного типа, фактора некроза опухоли альфа, хемикинов, молекул адгезии клеточной поверхности и циклина D1, ингибирует активность рецепторов факторов роста (например, эпидермального фактора роста 1 и 2 типа). Также он блокирует активность c-Jun киназы, других тирозинкиназ и серин/треониновых киназ [Aggarwal В., 2003, Witek-Zavada В.,2003] . Блокирование NFkB и АР-1 куркумином снижает экспрессию ИЛ-8 в клетках рака молочной железы, но не влияет на синтез VEGF [Bobrovnikova-Marjon Е., 2004].

По другим данным, куркумин полностью предотвращает индукцию синтеза VEGF микроваскулярными ЭК, стимулированную конечными продуктами гликолиза [Okamoto Т., 2002]. Недавно было показано, что куркумин и его производные значительно ингибируют bFGF-зависимую неоваскуляризацию роговицы у мышей [Arbiser J., 1998]. Однако он не оказывал эффект на продукцию VEGF, стимулированную форболовым

эфиром [Arbiser J., 1998]. Также куркмин блокирует синтез некоторых матриксных металлопротеиназ, в частности ММР-9 и аминипептидазу N [Shim J., 2003]. На моделях in vivo было показано, что куркумин ингибирует прогрессию химически индуцированного рака толстой кишки и кожи [Arbiser J., 1998]. Куркумин также ингибирует рост меланомы В16 in vivo, возможно через ингибирование ангиогенеза и снижение синтеза N0 и фактора некроза опухоли альфа [Leyon P., 2003].

Однако куркумин плохо адсорбируется из желудочно-кишечного тракта. В I фазе клинических исследований хотя больные и получали per os очень высокую дозу (до 1 гр.) куркумина, однако в сыворотке крови концентрация соединения определялась в наномолярных концентрациях [Sharma R., 2004]. Таким образом, эффективную дозу куркумина для осуществления фармакологической активности невозможно достичь у человека, его применение может быть только местным.

Чай, также как и вода, является одним из самых потребляемых жидкостей в мире. Некоторые эпидемиологические исследования показывают, что те люди, которые употребляют большое количество зеленого чая, имеют более низкий риск развития некоторых типов рака [Jung Y., 2001]. Основными действующими активными веществами зеленого чая являются катехины, в частности (-)-эпигаллокатехин галлат (EGCG), (-)-эпигаллоктахин (EGC), (-)-эпикатехин галлат (ECG) и (-)-эпикатехин (ЕС) [Kanthou С., 2002]. EGCG является основным активным компонентом зеленого чая. Он активирует апоптоз в опухолевых клетках, а также ингибирует опухолевую инвазию и ангиогенез.

Экспериментальные исследования показывают, что потребление зеленого чая мышами значительно снижает ангиогенез [Jung Y., 2001]. Механизмом антиангиогенного действия является ингибирование пролиферации ЭК в ответ на стимуляцию ангиогенными ростовыми факторами [Kojima-Yuasa., 2003]. Данные эффекты достигаются

блокированием рецепторов к VEGF, фосфорилированием VE-кадхерина и Akt, активацией некоторых транскриптационных факторов, таких как АР-1, NFkB и Ets-1 [Tang F., 2003, Lai H., 2004, Park M., 2003]. Также EGCG блокирует синтез металлопротеиназ, необходимых для миграции ЭК и инвазии опухолевых клеток [Kojima-Yuasa., 2003,Lai Н., 2004,]. Он также блокирует синтез VEGF, bFGF, и ИЛ-8 [Sartippor М., 2002, Sartippor М.,2005].

Однако II фаза клинических исследований зеленого чая у больных раком простаты не показало увеличения эффективности лечения [Jatoi А., 2003]. Из 42 больных, которые получали больше зеленого чая, простата-специфический антиген снизился только у одного больного. В настоящее время проводятся дополнительные исследования эффективности катехинов зеленого чая [Greenwald Р., 2004].

Для клинического использования в США одобрена мазь Полифенон Е (Polyphenon Е, Verregen, 15% мазь Bradley/MediGene). Мазь является определенной смесью полифенольных катехинов, эстрагированных из листьев зеленого чая. Она показана для местного действия при доброкачественных опухолях половой системы.

Комбретастатины были выделены из коры южно-африканского дерева Combretum caffrum (Eckl. & Zeyh) Kuntze (Combretaceae) [Pettit G., 1998]. Комбретастатины это производные стильбенов, которые обладают антиваскулярными свойствами (разрушают вновь образованные сосуды), что приводит к некрозу опухоли [Pettit G., 1998]. Они ингибируют полимеризацию тубулина [Kanthou С., 2002]. Комбретастатин А-4 исследуется у больных раком толстой кишки, легких и лейкозами. Исследования показывают, что он является многообещающим противоопухолевым антиангиогенным фитопрепаратом, выделенным в последнее время [Ohsumi К., 1998, Pettit G., 1995, Evans D., 2009,32 Hida Т., 2010].

1.3.4. Особенности скрининга веществ растительного происхождения на антиангиогенную активность

Успехи в молекулярной биологии опухолевой клетки позволили создать новые подходы к противоопухолевой терапии больных, основанные на блокировании определенных механизмов роста и прогрессии опухолей. Поиск препаратов направленного действия требует усовершенствования специализированной методологии проведения скрининга. Требуется поиск не только цитотоксических веществ, но и ингибиторов ангиогенеза и метастазирования [Dark G., 1997], активаторов иммунной системы [Gopalakrishna R., 1994], антагонистов митогенных сигналов роста клеток [Kensil С., 1991], блокаторов клеточного цикла [Zhang D., 1994, Chang С., 1995].

Не только отдельные активные соединения, но также активные фракции (экстракты) или валидированные и улучшенные рецепторные составы из нескольких растений, могут исследоваться для изучения их противоопухолевых и антиангиогенных свойств. При этом должен проводиться строгий анализ при переходе от фольклорного к основному международному использованию, который включает контроль состава, качества, безопасности и эффективности. Кроме того должны быть гарантированы высокое качество, постоянство от лота к лоту и эффективность/безопасность каждого этапа в создании стандартизированного нового препарата (одиночного или многокомпонентного) растительного происхождения в соответствии с контролем качества измерений GAP (Good Agricultiral Practice), GMP (Good Manufacturing Practice) и GCP (Good Clinical Practice), [Lee K., 2005].

Во многих лабораториях поиск ведется методом биоактивность-прямое фракционирование-изоляция (BDFI, bioactivity-directed fractionation and isolation) с последующим циклическим процессом оптимизации препарата. Подобный подход включает синтез, скрининг и анализ

улучшенных аналогов с оценкой взаимосвязи структура-активность, изучение механизмов действия, метаболизма препарата, молекулярного моделирования и параллельного исследовательского синтеза, а также проведение исследований по введению препарата, распределению, метаболизму, выведению и токсикологии (ADMET, drug administration, distribution, metabolism, excretion, and toxicological studies) и клинические испытания [Lee К., 2004, Lee К., 2005].

Для скрининга природных веществ с антиангиогенными свойствами используются различные методы [Miller К., 2001, Wang S., 2004 ,Kruger Е., 2001, Соломко Э., 2007].

Разработаны методы оценки ангиогенной и антиангиогенной активности различных типов веществ in vitro с учетом основных этапов формирования новых кровеносных сосудов. Каждый из этих этапов: разрыв базальной мембраны, миграция, пролиферация и формирование трубочки - может являться мишенью для воздействия и может быть протестирован in vitro. Эти методы (пролиферации, миграции и формирования трубочек) могут быть использованы для идентификации ангиогенных факторов роста и прямых ингибиторов ангиогенеза. Например, антиангиогенная активность может быть оценена путем способности вещества ингибировать миграцию ЭК через камеру Бойдена. In vitro тесты сравнительно недороги и отнимают не много времени. Однако способность ингибировать пролиферацию ЭК, миграцию и формирование СПС in vitro может не коррелировать с эффектом in vivo. Окончательные выводы об антиангиогенных свойствах вещества не могут быть сделаны только на основе анализа in vitro экспериментов.

In vitro тесты сравнительно недороги и отнимают не много времени. Однако способность ингибировать пролиферацию ЭК, миграцию и формирование СПС in vitro может не коррелировать с эффектом in vivo.

Окончательные выводы об антиангиогенных свойствах вещества не могут быть сделаны только на основе анализа in vitro экспериментов.

. Методы анализа включают введение в глаз животным имплантата, индуцирующего ангиогенез, систему введения подкожно мышам имплантата Матригеля, оценка ангиогенеза на модели ксенографтов опухолей человека и мышей. Анализ in vivo обеспечивает более полную физиологическую оценку ангиогенеза, однако подобный подход более длительный и дорогой.

Большинство химиопрепаратов с антиангиогенными свойствами проявляют свою активность при введении в высоких дозах. В клинической практике особенно большой интерес вызывают соединения, которые проявляют свою активность при введении в низких дозах. Эти препараты имеют сравнительно низкую токсичность и могут проявлять более высокий терапевтический эффект.

В настоящее время проводятся клинические исследования эффективности антиангиогенных препаратов, выделенных из растений. Тесная взаимосвязь между фундаментальными и клиническими исследователями обеспечит создание новых высокоэффективных антиангиогенных препаратов из растений, произрастающих на территории Российской Федерации.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Соломко, Элисо Шаликовна

выводы

1. Проведена фенотипнчеекая и функциональная характеристика культуры ЭК мыши SVEC-4-10. Выявлено, что она имеет фенотип, характерный для микроваскулярных клеток, и может быть использована для изучения антиангиогенной активности соединений.

2. Выявлены 4 экстракта растений (Лопуха обыкновенного, Валерианы лекарственной, Эвкоммии вязолистной, Пассифлоры инкартной), обладающих цитотоксическим действием на ЭК в концентрациях, сравнимых с концентрациями, вызывающими гибель культур опухолевых клеток.

3. Впервые выявлены 3 экстракта растений (Репешка опущенного, Сабельника болотного и Эхинацеи пурпуровой), блокирующих миграцию клеток и формирование СПС культурой SVEC-4-10.

4. Показано, что н-бутанольная и этилацетатная фракции СКЛ и СЛЛ блокируют ангиогенную активность ЭК in vitro и in vivo.

5. Показано, что фракции гидрализуемых танинов, выделенные из Кипрея узколистого, Хаменерин I и Хаменерин II блокируют ангиогенную активность ЭК in vitro и in vivo.

6. Выявлено, что способность образцов ингибировать миграцию ЭК и способность формировать СПС более чем на 50% in vitro ассоциирована с блокированием ангиогенеза в имплантате Матригеля in vivo. Разработан комплексный подход определению антиангиогенных свойств веществ in vitro и in vivo с использованием культуры ЭК мыши SVEC-4-10.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование направлено на изучение способности экстрактов различных растений и их фракций блокировать ангиогенез in vitro и in vivo.

Был исследован комплекс методов анализа антиангиогенной активности различных веществ in vitro с использованием трансформированной культуры ЭК мыши SVEC-4-10. Проведеная фенотипическая и функциональная характеристика культуры показала, что она имеет фенотип микроваскулярных клеток, характерный, в том числе, для микрососудов опухоли. Анализ антиангиогенной активности известных ингибиторов ангиогенеза (эндостатина и ресвератрола) выявил спектр активности, аналогичный данным литературы по исследованиям, проведенным на культуре клеток HUVEC человека. Таким образом, нами было показано, что культура ЭК мыши SVEC-4-10 может быть использована для изучения антиангиогенной активности соединений.

На протесированных 18 экстрактах растений с использованием разработанной системы тестирования in vitro были обнаружены 4 экстракта (Лопуха обыкновенного, Валерианы лекарственной, Эвкоммии вязолистной, Пассифлоры инкартной), обладающих цитотоксическим действием на ЭК в концентрациях, сравнимых с концентрациями, вызывающими гибель культур опухолевых клеток. Также выделены 3 экстракта (Репешка опущенного, Сабельника болотного и Эхинацеи пурпуровой), блокирующих миграцию клеток и формирование СПС культурой SVEC-4-10.

Исследованы фракции, выделенные из соков корней и листьев Лопуха обыкновенного. Н-бутанольная и этилацетатная фракции СКЛ и СЛЛ блокировали ангиогенную активность ЭК in vitro в тестах на цитотоксическое действие, блокирование пролиферации, ингибирования миграционной активности и способности формировать СПС. Полученные in vitro данные были подтверждены в исследовании in vivo в тесте на ингибирование ангиогенеза в имплантате Матригеля. Наблюдалось статистически значимое ингибирование образования микрососудов под действием н-бутанольной и этилациетатной фракции CKJI (100 мг/кг, перорально, в 1, 3 и 5 дни после имплантации Матригеля) и CJ1JI (50 мг/кг, перорально, в 1, 3 и 5 дни после имплантации Матригеля) по сравнению с положительным контролем (р<0,05).

Показано, что фракции гидролизуемых танинов, выделенные из Кипрея узколистого, Хаменерин I и Хаменерин II блокируют ангиогенную активность SVEC-4-10 in vitro и in vivo. Наблюдалось статистически значимое снижение количества микрососудов в имплантате Матригеля при внутрибрюшинном введении фракций Хаменерин I и Хаменерин II в дозе 15 мг/кг на 1 и 3 день после имплантации (р<0,05).

Изученные CKJI и CJIJI, которые обладали цитотоксическим действием и не ингибировали миграцию и формирование СПС клетками SVEC-4-10 in vitro, также не блокировали образование микрососудов в имлантате Матригеля in vivo.

Таким образом, выявлено, что способность образцов ингибировать миграцию ЭК и способность формировать СПС in vitro была ассоциирована с блокированием ангиогенеза в имплантате Матригеля in vivo. Циотоксическая активность экстрактов растений in vitro не является необходимым условием для блокирования ангиогенеза in vivo. Разработанный комплексный подход определению антиангиогенных свойств веществ in vitro с использованием культуры ЭК мыши SVEC-4-10 показал эффективность in vivo.

Полученные результаты имеют большое научно-практическое значение и могут быть использованы для разработки новых отечественных антиангиогенных препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Соломко, Элисо Шаликовна, 2011 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гершанович, М.Л. Обоснование клинического изучения проспидина при саркоме Капоши и кожных лимфомах, ассоциированных со СПИДом/ М.Л.Гершанович, И.М.Разнатовский, В.В.Ястребов // Материалы 3-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы». - 1995. - С. 58.

2. Соколова, А.С. Сравнение механизмов антимитотического действия проспидина, спиробромина, фопурина и фотрина на модели регенирирующей печени мыши/ А.С.Соколова, В.М.Фактор, И.В.Урываева // Противоопухолевые препараты". - Сб. научн. трудов ВНИХФИ. - М. - 1984. - С. 132-135.

3. Соломко, Э.Ш. Оценка антиангиогенной активности in vitro: опыт российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина / Э.Ш.Соломко, Е.В.Степанова, М.Р. Личиницер, А.Ю.Барышников// Российский биотерапевтический журнал 2007, №3 Т 6, С 3-7.

4. Чернов, В.А. О роли плазматической мембраны в механизме противоопухолевого действия проспидина/ В.А.Чернов, С.В.Геодакян С.В, // Химико-фармацевтический журнал. - 1976. - № 12. - С. 7-13.

5. Чистякова, И. А. Тридцать лет применения проспидина в дерматологии/ И.А.Чистякова, В.А.Самсонов // Вестник дерматологии и венерологии. - 1999. - № 3. - С. 41^12.

6. Aggarwal, В.В. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies/B.B. Aggarwal, A. Bhardwaj, R.S. Aggarwal RS et al // Anticancer Res 2004; Vol .24: P. 2783-840

7. Aggarwal, B.B. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies/ B.B. Aggarwal, A. Kumar, A.C. Bharti// Anticancer Res 2003; Vol.23: P. 363-98.

8. Arakaki, N. Induction of G1 cell cycle arrest in human umbilical vein endothelial cells by flavone's inhibition of the extracellular signal regulated kinase cascade/ N.Arakaki, A.Toyofuku, Y.Emoto et al // Biochem Cell Biol Vol. 2004; 82: P. 583-8.

9. Arbiser, J.L.Curcumin is an in vivo inhibitor of angiogenesis/ J.L. Arbiser, N. Klauber , R. Rohan et al // Mol Med 1998; Vol. 4:P. 376-83.

1 O.Arthur, HM. Endoglin, an ancillary TGF receptor, is required for extraembryonic angiogenesis and plays a key role in heart development/ HM Arthur, J Ure,AJ Smith, et al// Dev Biol 2000;Vol217:P.42-53.

11. Asahara T, (1998) Tie2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2, modulate VEGF-induced postnatal neovascularization / T Asahara, D Chen, T Takahashi, K Fujikawa , (1998) Circ Res Vol 83:P.233-240.

12.Auerbach, R. Vascular endothelial cell differentiation: organ-specificity and selective affinities as the basis for developing anticancer strategies/R Auerbach // Int. J. Radiat. Biol. - 1991. - Vol. 60. - P. 1-10.

13.Awale, S.. Identification of arctigenin as an antitumor agent having the ability to eliminate the tolerance of cancer cells to nutrient starvation/ S. Awale, J. Lu, S.K.Kalauni, Y.Kurashima, Y.Tezuka, S.Kadota, H.Esumi // Cancer Res. 2006 Feb 1; Vol 66(3):P1751-7.

14.Bagli, E. Luteolin inhibits vascular endothelial growth factorinduced angiogenesis; inhibition of endothelial cell survival and proliferation by targeting phosphatidylinositol 3'-kinase activity/ E.Bagli, M. Stefaniotou, L. Morbidelli et al // Cancer Res 2004; Vol. 64: P. 7936-46.

15. Benjamin, LE. (1999) Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal / LE Benjamin, D Golijanin, A Itin, D Pode // (1999) Vol 103 :P. 159-165.

16.Bobrovnikova-Marjon, E.V. Expression of angiogenic factors vascular endothelial growth factor and interleukin-8/CXCL8 is highly responsive to ambient glutamine availability: role of nuclear factor-kappaB and activating protein-1/ E.V. Bobrovnikova-Marjon, P.L. Marjon, O. Barbash et al // Cancer Res 2004;Vol. 64: P. 4858-69.

17.Brakenhielm, E. Suppression of angiogenesis, tumor growth, and wound healing by resveratrol, a natural compound in red wine and grapes/ E. Brakenhielm, R.Cao, Y.Cao // FASEB J 2001; Vol .15: P. 1798-800.

18. Browder, T., Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer/ T.Browder, CE Butterfield, BM Kraling, B Sh, B Marshal, MS O'Reilly, J Folkman // Cancer Res. - 2000. -Vol. 60. -P.1878-1886.

19.Cao, Y. Antiangiogenic mechanisms of diet-derived polyphenols/ Y.Cao, R.Cao, E.Brakenhielm // J Nutr Biochem 2002; Vol .13: P. 380-390.

20. Carlos, TM. Leukocyte-endothelial adhesion molecules/ TM Carlos// Harlan JM (1994). Blood Vol 84:P.2068-2101.

21. Carmeliet, P Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188/ P Carmeliet, YS Ng, D Nuyens , G

Theilmeier, K Brusselman, I Cornelissen// Folkman J (1996). Nat Med Vol 5:P.495-502.

22.Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis/ P Carmeliet // Nat Med. 2000 Apr.Vol 6(4):P.89-95.

23.Chabner BA. Anti-cancer drugs./ B.A.Chabner. DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg AS, eds // (Chapter 18). Cancer: Principles and Practice, Fourth Edition. Philadelphia: Lippincott, 1991 :P325-417.

24.Chang, C.J. Oncogene signal transduction inhibitors from medicinal plants /

C.J.Chang, C.L. Ashendel, R.L.Geahlen et al // Anti-cancer Res 1995; Vol. 15: P.1740-1741.

25. Chatterjee, SS,. In vitro and in vivo investigations on the cardio-protective effects of oligomeric procyanidins in a Crataegus extract from leaves and flowers/ SS. Chatterjee, E Koch , H Jaggy , T Krzeminski //Arzneimittelforschung 1997;Vol 47 II. :P821-825.

26.Chen, H.H. Inhibitory effects of artesunate on angiogenesis and on expressions of vascular endothelial growth factor and VEGF receptor KDR/FLK-1 / H.H. Chen, H.J. Zhou, X.E. Lou // Pharmacology 2004; Vol. 7:P. 1-9.

27.Chistofalli, M. Angiogenesis modulation in cancer researcnovel clinical approaches / M Chistofalli, C Charnsangavej, GN Hortobagyi // Nature Reviews. 2002; Vol 1: P.415-426.

28.Cragg GM, Newmann DJ, Snader KM. Natural products in drug discovery and development. Nat Prod 1997;60:52-60.

29.Cragg, G.M. Medicináis for the millennia: the historical record / G.M.Cragg,

D.J. Newman , N.Y. Ann // Acad Sci 2001; Vol. 953: P. 3-25.

30.Cragg, G.M. Plants as source of anticancer agents/ G.M. Cragg, D.J.Newman // J Ethnopharmacol. 2005; Vol. 100: P. 72-79.

31. Czubayko, F. A secreted FGF-binding protein can serve as the angiogenic switch in human cance r/ F Czubayko, A Liaudet, ED Coopman , A Aigner, Nat Med (1997) Vol 3 :P. 1137-1140.

32.Dark GG, Hill SA, Prise VE at al. Combretastatin A-4, an agent that displays potent and selective toxicity toward tumor vasculature. Cancer Res 1997;57:1829-1834.

33. Denekamp, J Vascular endothelium as the vulnerable element in tumours / J Denekamp// Acta Radiol Oncol (1984) Vol 23 :P.217-225.

34.Deyama, T, Constituents and pharmacological effects of Eucommia and Siberian ginseng / T.Deyama, S. Nishibe, Y.Nakazawa // Acta Pharmacol Sin. 2001 Dec;Vol 22(12):P1057-70.

35.Dolle, R.E. Comprehensive survey of chemical libraries yielding enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists, and other biologically active agents/ R.E.Dolle //Mol Divers 1997; Vol .2:2 P. 23-236.

36.Dolle, R.E. Comprehensive survey of combinatorial library synthesis/ R.E. Dolle, K.H. Nelson // Jr.: 1998. J Comb Chem 1999; Vol .4: P. 235-282.

37.Dorai, T. Aggarwal, B.B. Role of chemopreventive agents in cancer therapy /T. Dorai, B.B.Aggarwal // Cancer Lett 2004; Vol. 215: P. 129-40.

38.Dulak, J. Nutraceuticals as anti-angiogenic agents: Hopes and reality/ J. Dulak // Journal of physiology and pharmacology 2005,Vol. 56, Suppl 1,P 51-69.

39.Dvorak, HF. Tumors: Wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing / HF Dvorak // N Engl J Med (1986) Vol 315:P.1650-1659.

40.Emmenegger, U. A comparative analysis of low-dose metronomic cyclophosphamide reveals absent or low-grade toxicity on tissues highly sensitive to the toxic effects of maximum tolerated dose regimens/ U. Emmenegger,S. Man, Y.Shaked, G.Francia, JW Wong, DJ.Hicklin., RS.Kerbel // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64. - P. 3994-4000.

41.Evans D. and Cozens R. Combination Effects Following Addition of the Tumour-Vascular Disrupting Agent ASA404 (Vadimezan) to Taxane-Containing Regimens of Trastuzumab and Bevacizumab in Human Breast Cancer Xenograft Models / D.Evans , and R.Cozens // Cancer Res., Dec 2009; Vol. 69: P.3142.

42.Fact sheet. Twelve major cancers. Scientific Am 1996; Vol. 275: P. 92-98.

43.Fassina, G. Mechanisms of inhibition of tumor angiogenesis and vascular tumor growth by epigallocatechin-3-gallate / G,Fassina, R.Vene, M. Morini et al // Clin Cancer Res 2004; Vol. 10: P. 4865-73.

44.Ferrara ,NRole of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis/ N Ferrara// (1999) Kidney (1999) Int Vol 56:P.794-814.

45.Folberg, R. Vasculogenic mimicry and tumor angiogenesis/ R Folberg, MJ Hendrix, and Maniotis // Am. J. Patho., 2000 Voll56, P. 361-381

46. Folkman, J. Angiogenesis and angiogenesis inhibition: An overviem / J Folkman// (1997) EXS (1997) Vol 79:P.l-8.

47. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease/ J Folkman // Nat Med(1995) Vol 1 :P.27-31.

48. Forsythe, J A. Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-Inducible Factor 1/ JA Forsythe, BN Jian, NV Iyer, F Agani // Mol Cell Biol(1996) Vol 16:P.4604-4613.

49. Gomez, DE. Thorgeirsson UP (Tissue inhibitors of metalloproteinases: Structure, regulation and biological functions/ DE Gomez, DF Alonso, H Yoshiji // Eur J Cell Biol(1997) Vol 74:P.l 11-122.

50.Gopalakrishna, R. Chelerythrine and sanguinarine alkaloids induce membrane translocation and irreversible inactivation of protein kinase C by modifying thiol residues / R.Gopalakrishna, Z.Chen, K.Yoolee et al // Proc Am Assoc Cancer Res 1994; Vol. 35:A3666.

51.Greenwald, P. Clinical trials in cancer prevention: current results and perspectives for the future / P. Greenwald // J Nutr 2004; Vol ..134: P.3507S-3512S.

52.Grzenkowicz-Wydra, J. Gene transfer of CuZn superoxide dismutase enhances the synthesis of vascular endothelial growth factor / J.Grzenkowicz-Wydra, J.Cisowski , J.Nakonieczna et al // Mol Cell Biochem 2004; Vol. 264: P. 169-81.

53.Gururaj, A.E. Molecular mechanisms of anti-angiogenic effect of curcumin / A.E. Gururaj, M. Belakavadi , D.A. Venkatesh et al // Biochem Biophys Res Commun 2002; Vol. 297: P. 934-42.

54. Hanahan, D. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis/ Cell Folkman J (1996) Vol 86:P.353-364.

55.Hansen-Algenstaedt, N (1999) Second wave of angiogenesis during KDR/Flk-1 antibody therapy (Abstract)/ N Hansen-Algenstaedt, D Fukumura, B Stoll, D Hicklin //Proc Am Assoc Cane Res(1999) Vol 40:P.620.

56.Harvey, A.L. Advances in Drug Discovery Techniques / A.L. Harvey // Chicester: John Wiley & Sons, 1998.

57.Harvey, A.L. Medicines from nature: are natural products still relevant to drug discovery? / A.L.Harvey // Trends Pharmacol Sci 1999; Vol .20: P .196-198.

58.Harvey, A.L. What can toxins tell us for drug discovery/ A.L.Harvey , K.N.Bradley, A.S.Cochran et al // Toxicon 1998; Vol.36: P. 1635-1640.

59.Hida, T. A safety and tolerability study of vadimezan in combination with docetaxel in Japanese patients with advanced or recurrent solid tumors / T.Hida, K. Takeda, H. Daga ,H // J Clin Oncol 2010;Vol. 28: el3106.

60. Hirschi, KK. Control of angiogenesis by the pericyte: Molecular mechanisms and significance/ KK Hirschi, AF D'Amore (1997) PA EXS Vol 79:P.419-428.

61.Ho, J.C. Fungal polysaccharopeptide inhibits tumor / J.C. Ho, M.A. Konerding, A.Gaumann et al//

62.Hogan JC. Directed combinatorial chemistry /J.C. Hogan // Nature 1996; Vol. 384(suppl): P. 17-19.

63.1gura, K. Resveratrol and quercetin inhibit angiogenesis in vitro / K.Igura , T. Ohta , Y. Kuroda et al // Cancer Lett 2001; Vol. 171: P. 11-6.

64.1ngber, D. Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumor growth / D.Ingber, T.Fujita , S.Kishimoto , et al // Nature 1990; Vol .348: P. 55-57.

65.Inoue, M. Oxidized LDL regulates vascular endothelial growth factor expression in human macrophages and endothelial cells through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma / M. Inoue , H.Itoh , T.Tanaka et al // Arterioscler Thromb Vase Biol 2001;Vol. 21: P. 560-6.

66.Inoue, M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions: possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis / M.Inoue, H. Itoh , M.Ueda et al // Circulation 1998;Vol. 98: P. 2108-16.

67.Jatoi, A. A phase II trial of green tea in the treatment of patients with androgen independent metastatic prostate carcinoma / A. Jatoi , N.Ellison , P.A.Burch et al// Cancer 2003; Vol.97: P.1442-6.

68.Jessup, J.M. Clinical highlights from the National Cancer Database / J.M.Jessup, L.S.McGinnis , D.P.Winchester et al // CA Cancer J Clin 1996; Vol. 46: P. 185-187.

69.Jiang, YL, Natural products as anti-invasive and anti-metastatic agents/. YL Jiang, ZP Liu// Curr Med Chem. 2011;Vol 18(6):P808-29.

70.Jung, Y.D. Inhibition of tumour invasion and angiogenesis by epigallocatechin gallate (EGCG), a major component of green tea / Y.D.Jung , L.M.Ellis // Int J Exp Pathol 2001; Vol. 82: P. 309-16.

71.Kanthou, C. The tumor vascular targeting agent combretastatin A-4-phosphate induces reorganization of the actin cytoskeleton and early membrane blebbing in human endothelial cells / C. Kanthou , G.M. Tozer //.Blood 2002, Vol. 99(6): P.2060-9.

72.Kao, ES, Effects of polyphenols derived from fruit of Crataegus pinnatifida on cell transformation, dermal edema and skin tumor formation by phorbol ester application./ E.S Kao , C.J Wang , W.L Li , C.YChu , T.H Tseng// Food Chem Toxicol. 2007 Oct;Vol45(10):795-804

73.Kensil, C.R. Development of a genetically engineered vaccine against feline leukemia virus infection / C.R. Kensil, C.Barrett, N.Kushner et al //J Am Vet Med Assoc 1991; Vol. 199: P .1423-1427.

74.Kim, J.H. Microarray-based analysis of anti-angiogenic activity of demethoxycurcumin on human umbilical vein endothelial cells: crucial involvement of the down-regulation of matrix metalloproteinase / J. H.Kim, J.S,Shim, S.K.Lee et al // Jpn J Cancer Res 2002; Vol. 93: P. 1378-85.

75.Kimura, Y. Effects of naturally occurring stilbene glucosides from medicinal plants and wine, on tumour growth and lung metastasis in Lewis lung carcinoma-bearing mice / Y. Kimura, H. Okuda // J Pharm Pharmacol 2000; Vol. 52: P .1287-95.

76.Kimura, Y. Resveratrol isolated from Polygonum cuspidatum root prevents tumor growth and metastasis to lung and tumor-induced neovascularization in Lewis lung carcinoma bearing mice / Y.Kimura , H.Okuda H // J Nutr 2001; Vol. 131: P .1844-9.

77. Klein, S, Roghani M, Fibroblast growth factors as angiogenesis factors: New insights into their mechanism of action S Klein, M Roghani // Rifkin DB (1997) EXS Vol 79:P.159-192.

78.Kojima-Yuasa, A. Green tea extract inhibits angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells through reduction of expression of VEGF receptors / A. Kojima-Yuasa, J.J.Hua , D.O. Kennedy et al // Life Sci 2003; Vol.73: P. 1299-313.

79. Krause, DS. CD34: structure, biology, and clinical utility/ DS Krause, MJ Fackler, CI Civin, WS May // Blood 1996;Vol87:P.l-12.

80.Kruger, E.A. Approaches to preclinical screening of antiangiogenic agents/ EA Kruger, PH Dura, DK Price et al // Semin Oncol 2001; Vol. 28:P. 5706.

81.Kwan, C-Y Endothelium-dependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. leaf and bark: implications on their antihypertensive action/ C-Y Kwan, C-XChena T. Deyamab and S. Nishibec //Vascular Pharmacology Vol 40, Issue 5, December 2003, P 229-235

82.Lai, H.C. Effect of EGCG, a major component of green tea, on the expression of Ets-1, c-Fos, and c-Jun during angiogenesis in vitro / H.C. Lai, W.T. Chao, Y.T. Chen et al // Cancer Lett 2004;Vol. 213: P .181-8.

83.Laquente, B, Metronomic chemotherapy: an antiangiogenic scheduling/. B.Laquente, F. Vinalis F, J.RGerma // Clin. Transl. Oncol. - 2007. - Vol. 9(2).-P. 93-98.

84.Lee, K.-H. Antitumor agents 231 and anti-AIDS agents 59. Current developments in the discovery and design of new drug candidates from plant natural product leads / K.-H. Lee // Journal of Natural Products, 2004, Vol. 67: P. 273-283.

85.Lee, K.-H. Recent Advances in the Discovery and Development of Plant-derived Chemotherapeutic Agents / K.-H. Lee // International Journal of Applied Science and Engineering 2005.Vol. 3, 3: P .151-155

86.Leyon P.V. Studies on the role of some synthetic curcuminoid derivatives in the inhibition of tumour specific angiogenesis / P.V.Leyon, G.Kuttan // J Exp Clin Cancer Res 2003; V ol.22: P. 77-83.

87.Lin, M.T. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis by resveratrol through interruption of Src-dependent vascular endothelial cadherin tyrosine phosphorylation / MT Lin, ML Yen, CY Lin et al // Mol Pharmacol 2003; Vol. 64: P. 1029-36.

88.Loboda, A. Effect of plant extracts on angiogenic activities of endothelial cells and keratinocytes/ A Loboda, IJ Cisows A Zarebski, A Wa //. Journal of physiology and pharmacology 2005, 56, Suppl 1, PI 25-137

89.Lopes, F.C.M. and Soares R. Anti-angiogenic effects of pterogynidine alkaloid isolated from Alchornea glandulos /F.C.M. Lopes, A. Rocha, A. Pirraco // BMC Complementary and Alternative Medicine 2009, Vol. 9: P .15-25.

90.Man, S, Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents./ S. Man, W Gao, Y Zhang, L Huang , C Liu// Fitoterapia. 2010 Oct;Vol81(7):P703-14.

91.Mans, DR.A. Anti-Cancer Drug Discovery and Development in Brazil: Targeted Plant Collection as a Rational Strategy to Acquire Candidate AntiCancer Compounds / DR.A. Mans , Da A.B.Rocha , G.Schwartsmann // The Oncologist 2000; Vol. 5: P. 185-198.

92. Matsumoto, T. Antiproliferative and apoptotic effects of butyrolactone lignans from Arctium lappa on leukemic cells/ T. Matsumoto , K. Hosono-Nishiyama , H. Yamada// Planta Med. 2006 Feb;Vol72(3):276-8.

93.Maulik, N. Redox signaling of angiogenesis /N. Maulik // Antioxid Redox Signal 2002; Vol. 4: P. 805-15.

94.Meijer, L. Roscovitine and other purines as kinase inhibitors. From starfish oocytes to clinical trials / L. Meijer , E. Raymond // Accounts Chem Res. 2003; Vol. 36: P. 417-25.

95.Millauer, B. High affinity VEGF binding and developmental expression suggest FLK-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis/ B Millauer,S Wizigmann-Voos, H Schnurch , et al // Cell 1993;Vol 72:P.835-46.

96.Miller, K.D. Redefining the target: chemotherapeutics as antiangiogenics / K.D. Miller, C.J. Sweeney, G.M. Sledge // J Clin Oncol 2001; Vol. 19: P. 1195-206.

97. Min, BS Cytotoxic triterpenes from Crataegus pinnatifida/ B.SMin , Y.H.Kim , S.M.Lee , H.J Jung , J.SLee , M.K Na , C.O Lee ,J.P Lee K.Bae //. Arch Pharm Res. 2000 Apr;Vol23(2): 155-8.;

98.Morisaki, N. Mechanism of angiogenic effects of saponin from ginseng Radix rubra in human umbilical vein endothelial cells / N.Morisaki, S.Watanabe , M.Tezuka et al // Br J Pharmacol 1995; Vol. 115: P. 1188-93.

99.Nefzi, A. Combinatorial chemistry: from peptides and peptidomimetics to small organic heterocyclic compounds / A.Nefzi, J.M.Ostresh, R.A.Houghten // Chem Rev 1997; Vol. 97: P. 449-472.

100. Normile, D. Asian medicine. The new face of traditional Chinese medicine / D.Normile// Science 2003; Vol .299: P. 188-90.

101. O'Connel, K., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by SV40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells/K. O'Connel , M.AEdidin // J. Immunol. - 1990. - Vol. 144. - P. 5-21.

102. Oak, M.H. Red wine polyphenolic compounds inhibit vascular endothelial growth factor expression in vascular smooth muscle cells by preventing the activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway / M.H.Oak, M.Chataigneau, T.Keravis et al // Arterioscler Thromb Vase Biol 2003; Vol. 23: P.1001-7.

103. Ohsumi, K. New combretastatin analogues effective against murine solid tumors: design and structure-activity relationship / K.Ohsumi, R.Nakagawa, Y.Fukuda et al // J Med Chem. 1998; Vol. 41: P. 705-06.

104. Okamoto, T. Angiogenesis induced by advanced glycation end products and its prevention by cerivastatin. T.Okamoto, S.Yamagishi ,Y. Inagaki et al // FASEB J 2002; Vol. 16: P. 1928-30.

105. Osada, M. Apigenin suppresses the expression of VEGF, an important factor for angiogenesis, in endothelial cells via degradation of HIF-1 alpha protein / M.Osada, S.Imaoka , Y Funae // FEBS Lett 2004; Vol. 575: P. 5963.

106. Park, A.M. Signal transduction pathways: targets for green and black tea polyphenols / A.M.Park , Z.Dong // J Biochem Mol Biol 2003; Vol. 36: P. 66-77.

107. Passaniti, A,. Methods in laboratory investigation: a simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using

reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor./ A.Passaniti , R.M Naylor , R.Pili.,Y. Guo., P.V.Long ., J.A.Haney, R.R.Pauly ,D.S Grant, G.R Martin// .Lab. Invest 1992;Vol 67:519-528.

108. Peng, S.Y. Decreased mortality of Norman murine sarcoma in mice treated with the immunomodulator, acemannan / S.Y.Peng, J.Norman, G.Curtin et al // Mol Biotherl991; Vol. 3:P. 79-87.

109. Perry, NB, 4-Hydroxy-2-cyclopentenone: an anti-Pseudomonas and cytotoxic component from Passiflora tetrandra/ N.B Perry, G.D Albertson, J.W Blun, A.L Cole, M.H Munro J.P // Planta Med. 1991 Apr;Vol 57(2):P129-31.

110. Pettit, G.R. Antineoplastic agents. 291. Isolation and synthesis of combretastatins A-4, A-5 and A-6 / G.R. Pettit, S.B.Singh , M.R.Boyd et al // J Med Chem. 1995; Vol. 38: P. 1666-72.

111. Pettit, G.R. Antineoplastic agents 389. New syntheses of the combretastatin A-4 prodrug / G.R. Pettit, M.R. Rhodes // Anticancer Drug Des 1998, Vol .13(3): P. 183-91.

112. Pettit, G.R. Isolation, structure, and synthesis of combretastatins A-l and B-l, potent new inhibitors of microtubule assembly, derived from Combretum caffrum /G.R.Pettit,S.B.Singh, M.L.Niven et al // J Nat Prod. 1987; Vol. 50: P. 119-20.

113. Predes, FS, Antioxidative and in vitro antiproliferative activity of Arctium lappa root extracts/ F.S Predes, A.L Ruiz, J.E Carvalho, M.A Foglio, H. // BMC Complement Altern Med. 2011 Mar 23;Voll 1 :P25.

114. Puri, MC. (1995) The receptor tyrosine kinase TIE is required for integrity and survival of vascular endothelial cells/ MC Puri, J Rossant, K Alitalo, A Bernstein// EMBO J(1995) Vol 14:P.5884-5891.

115. Radzikowski C. [Genistein: a soy isoflavone revealing a pleiotropic mechanism of action - clinical implications in the treatment and prevention of cancer / C.Radzikowski, J.CWietrzyk , G.Grynkiewicz et al // Postepy Hig Med Dosw (Online) 2004; Vol.58: P.128-39.

116. Ramos, M.A. Induction of macrophage VEGF in response to oxidized LDL and VEGF accumulation in human atherosclerotic lesions / M.A. Ramos, M. Kuzuya , T.Esaki et al // Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; Vol. 18: P. 1188-96.

117. Rao, K. Recognition and evaluation of lapachol as an antitumor agent /K.Rao, T.J..McBride , J.J.Oleson // Cancer Res 1968; Vol. 28: P. 19521954.

118. Ravindranath, M.H. Anticancer therapeutic potential of soy isoflavone, genistein / M.H. Ravindranath , S.Muthugounder , N.Presser et al // Adv Exp Med Biol 2004; Vol. 546: P. 121-65.

119. Risau, W. Vasculogenesis / Risau, W. and Flamme, I. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. - 1995.-№ 11.-P.73-91.

120. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis/ W Risau// Nature (1997) (Lond) Vol 386:P.671-674.

121. Sartippour, M.R. cDNA microarray analysis of endothelial cells in response to green tea reveals a suppressive phenotype /M.R. Sartippour, D.Heber, S.Henning et al//Int J Oncol 2004; Vol.25: P. 193-202.

122. Sartippour, M.R. Inhibition of fibroblast growth factors by green tea / M.R.Sartippour, D.Heber L., Zhang et al // Int J Oncol 2002;Vol. 21 :P. 48791.

123. Sartippour, M.R. Rabdosia rubescens inhibits breast cancer growth and angiogenesis / M.R.Sartippour, N.P.Seeram , D.Heber et al// Int J Oncol 2005; Vol.26: P.121-7.

124. Sato K, Mochizuki M, Saiki I et al. Inhibition of tumor angiogenesis and metastasis by a saponin of Panax ginseng, ginsenoside-Rb2 / K.Sato, M.Mochizuki, I.Saiki et al // Biol Pharm Bull 1994; Vol.l7:P. 635-9.

125. Sen, C.K. Oxygen, oxidants, and antioxidants in wound healing: an emerging paradigm / C.K.Sen, S.Khanna, G.Gordillo et al // Ann N Y Acad Sci 2002; Vol.957: P.239-49.

126. Sengupta S, Toh SA, Sellers LA et al. Modulating angiogenesis: the yin and the yang in ginseng / S. Sengupta, S.A.Toh, L.A.Sellers et al // Circulation 2004; Vol.110:P. 1219-25.

127. Sharma, R.A. Phase I clinical trial of oral curcumin: biomarkers of systemic activity and compliance /R.A.Sharma, S.A.Euden , S.L.Platton et al // Clin Cancer Res 2004; Vol.l0:P. 6847-54.

128. Shim, J.S. Irreversible inhibition of CD 13/aminopeptidase N by the antiangiogenic agent curcumin / J.S.Shim, J.H.Kim, H.Y. Cho et al // Chem Biol 2003; Vol.10: P.695-704.

129. Tang, F.Y. Green tea catechins inhibit VEGF-induced angiogenesis in vitro through suppression of VE-cadherin phosphorylation and inactivation of Akt molecule / F.Y.Tang, N.Nguyen, M.Meydani // Int J Cancer 2003; Vol.106: P.871-8.

130. Tseng, S.H. Resveratrol suppresses the angiogenesis and tumor growth of gliomas in rats / S.H.Tseng, S.M.Lin,J.C. Chen et al // Clin Cancer Res 2004; Vol.10: P.2190-202.

131. Uretsky, BF, Randomized study assessing the effect of digoxin withdrawal in patients with mild to moderate chronic congestive heart failure; results of the PROVED study/.B.F Uretsky , J.BYoung , F.E Shahidi , L.G Yellen , M.CHarrison , M.K Jolly // JACC 1993;Vol 22:P955-962.

132. Verstraete, M. Endothelial Cell-Mediated Coagulation, Anticoagulation and Fibrinolysis, in The Endothelial Cell in Health and Disease/ M Verstraete ds// Vane JR, Born GVR, Welzel D (Schattauer, Stuttgart, New York) (1995), P. 147-164.

133. Wang S, Zheng Z, Weng Y et al. Angiogenesis and anti-angiogenesis activity of Chinese medicinal herbal extracts / S.Wang, Z.Zheng, Y.Weng et al Life // Sei 2004; Vol.74: P.2467-78.

134. Wartenberg, M. Inhibition of tumor-induced angiogenesis and matrix-metalloproteinase expression in confrontation cultures of embryoid bodies and tumor spheroids by plant ingredients used in traditional Chinese medicine /M. Wartenberg, P.Budde , De M.Marees et al // Lab Invest 2003; Vol.83: P.87-98.

135. Witek-Zawada, B. Regulation of expression of stromyelysin-1 by proinflammatory cytokines in mouse brain astrocytes / B.Witek-Zawad , A.Koj A // J Physiol Pharmacol 2003; Vol.54: P.489-96.

136. Wu, L.W. Polyacetylenes function as anti-angiogenic agents / L.M.Wu, Y.M.Chiang, H.C.Chuang et al Pharm Res 2004; Vol.21: P.2112-9.

137. Yamakawa, S. (-)-Epigallocatechin gallate inhibits membrane-type 1 matrix metalloproteinase, MT1-MMP, and tumor angiogenesis/ S Yamakawa, T Asai, T Uchida et al // Cancer Lett 2004; Vol.210: P.47-55.

138. Yarbro JW. The scientific basis of cancer chemotherapy (Chapter 1) In: The Chemotherapy Source Book. Baltimore/ JW Yarbro, MC Perry, // Williams & Wilkins, 1992:P2-14.

139. Zhang, D. Structural interaction of natural and synthetic inhibitors with the venom metalloproteinase, atrolysine C (from d) / D.Zhang, I.Botos, F.X.Gomis-Ruth et al // Proc Natl Asad Sei USA 1994;Vol.91: P.8447-8451.

140. Zhao, F. In vitro anti-inflammatory effects of arctigenin, a lignan from Arctium lappa L., through inhibition on iNOS pathway/ FZhao, LWang, K. Liu // J Ethnopharmacol. 2009 Apr 21 Vol 122(3):P457-62.

141. Ziehe, M. Nitric oxide synthase lies downstream from vascular endothelial growth factor-induced but not basic fibroblast growth factor-induced angiogenesis/ M Ziehe, L Morbidelli, R Choudhuri, HT Zhang, S Donnini, HJ Granger// Bicknell R J Clin Invest(1997) Vol 99:P.2625-2634.