Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Дмитриев, Дмитрий Александрович

• Дмитриев, Дмитрий Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дмитриев, Дмитрий Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о биспецифических антителах

2.1.1. История создания биспецифических антител и области их применения

2.1.2. Способы получения биспецифических моноклональных антител

2.1.3. Тестирование биспецифических моноклональных антител

2.1.4. Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах

2.1.5. Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител

2.1.6. Применение биспецифических моноклональных антител в твердофазных методах

2.2. Принцип работы и устройство биосенсора IAsys

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами»

Гибридомная технология, наряду с обычными моноклональными антителами (МКА), позволяет получать биспецифические моноклональные антитела (БИАТ), конструируемые методами клеточной инженерии [2, 3]. Достоинство этого метода заключается в возможности получать совершенно однородные молекулы БИАТ, сохраняющие структуру «полумолекул» родительских антител (рис. 1). Основное различие БИАТ (класса IgG) и обычных моноклональных антител состоит в следующем. Молекула МКА имеет два антигенсвязывающих сайта. БИАТ также имеют два сайта связывания, но их специфичность различна: первый из сайтов специфичен к одному антигену, второй - к другому (рис. 1).

Ш * Ф W

II II 11 11 a б в

Рисунок 1. Возможная структура комплексов при связывании антител с антигенами, а) Биспецифические моноклональные антитела связываются с двумя разными антигенами; б) и в) родительские моноклональные антитела связываются с двумя одинаковыми антигенами.

Актуальность проблемы. БИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и маркерной молекулой (например, ферментом). Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА [4-7]. Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах [8-16]. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, но и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами.

УУ ■"> ■ \ -/Твёрдая фаза / / / / / / / а б в г

Рисунок 2. Возможная структура комплексов при связывании антител и Fab фрагментов с иммобилизованным антигеном, а) Моновалентное связывание моноспецифических антител; б) бивалентное связывание моноспецифических антител; в) моновалентное связывание биспецифических антител; г) моновалентное связывание Fab фрагментов.

С иммобилизованным антигеном МКА (класса IgG) могут связываться как одним антигенсвязывающим сайтом, моновалентно (рис. 2 а), так и двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно, бивалентно (рис. 2 б), а БИАТ (класса IgG) представляют собой моновалентные молекулы в отношении каждого из антигенов (рис. 2 в).

При использовании МЕСА в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, иммуноферментном анализе (ИФА) и других твердофазных системах необходима количественная оценка процесса связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины: аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпитопу антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антиген-антитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител (например, класса IgG) бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе [17-28].

Из-за стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары антитело—антиген, но и для каждого клона антител к данному антигену [21].

Ранее бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном доказывали и изучали путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов [17-28] - относительно небольших фрагментов антител, которые включают антигенсвязывающий сайт и образуются в результате обработки антител папаином. Fab фрагменты могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно (рис. 2 г) и, таким образом, служат в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования [29, 30]. Следует отметить, что упомянутое сравнение не является достаточно полноценным. Несовершенство подобного сравнения заключается в том, что структура Fab фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител. Имеются данные, что Fc участок может иметь значение для антигенсвязывающей способности антител (например, он может влиять на гибкость молекулы) [31].

С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе [32]. При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе (например, на поверхности иммунного планшета) часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства [33, 34]. Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура «полумолекул» БИАТ тождественна структуре «полумолекул» нативных родительских антител (рис. 1). И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3, 35, 36].

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось количественное изучение взаимодействия родительских моноклональных и и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Получить аффинно-очищенные моноклональные и образованные от них биспецифические моноклональные антитела. В качестве антигенов были выбраны следующие протеины: пероксидаза хрена (HRP), миоглобин человека (Мб) и иммуноглобулин G человека (hlgG).

2) Теоретически рассмотреть равновесные и кинетические закономерности взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами различной структуры.

3) Экспериментально изучить характер и определить количественные характеристики иммунохимического взаимодействия с различными иммобилизованными антигенами, на примере трех клонов обычных антител: антимиоглобиновых (анти-Мб), антипероксидазных (анти-HRP) и антител против IgG человека (анти-hIgG); и двух клонов образованных от них биспецифических антител (биспецифические антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена (анти-Мб/HRP), и биспецифические антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена (анти-hIgG/HRP)). Провести сравнение с использованием иммуноферментного, радиоиммунологического методов и с помощью оптического биосенсора, основанного на принципе «резонансное зеркало» (IAsys). Соотнести результаты, полученные тремя методами.

4) Апробировать иммунохимическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моновалентного связывания использовать биспецифические моноклональные антитела.

5) Определить условия бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования впервые теоретически и экспериментально были сравнены свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованными антигенами. Изучение этого вопроса имеет большое значение для использования БИАТ в различных твердофазных системах. Экспериментально эффективность связывания БИАТ с иммобилизованными антигенами в сравнении с родительскими антителами изучалась ранее только одной группой исследователей [37], к сожалению, их результаты не интерпретируются существующей теорией.

Впервые апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). Теперь для внедрения новых методов исследования предлагается использовать именно эту иммунологическую модель. В то время как обычно используют иммунологическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания антител и их F(ab) фрагментов с иммобилизованным антигеном [29, 30].

Также впервые с помощью иммуноферментного метода показано наличие бивалентного связывания БИАТ с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе.

Важный методический аспект имеет сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью современного оптического биосенсора IAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало» [29, 38-46]. Это метод нового поколения, который в настоящее время начинает активно использоваться для количественной оценки иммунохимических взаимодействий.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Дмитриев, Дмитрий Александрович

выводы

1. Получены аффинно-очшценные моноклональные антимиоглобиновые антитела (анти-Мб), антипероксидазные антитела (анти-HRP), антитела против иммуноглобулина G человека (анти-hIgG) и образованные от них моноклональные биспецифические антитела со специфичностью к миоглобину и пероксидазе хрена (анти-Мб/HRP) и со специфичностью к иммуноглобулину G человека и пероксидазе хрена (анти-hIgG/HRP).

2. Теоретически разобраны закономерности взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. а) Доказано, что наблюдаемая равновесная константа ассоциации родительских антител по крайней мере в два раза превышает наблюдаемую равновесную константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном, моновалентного или бивалентного. б) Доказано, что коэффициент кривой связывания родительских антител больше, чем коэффициент кривой связывания биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном. в) Доказано, что наблюдаемая кинетическая константа ассоциации родительских антител в два раза превышает наблюдаемую кинетическую константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном. А наблюдаемые кинетические константы диссоциации родительских и биспецифических антител совпадают, если родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном только моновалентно. Если же родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном бивалентно, то их наблюдаемая кинетическая константа диссоциации меньше, чем наблюдаемая кинетическая константа диссоциации биспецифических антител.

3. Экспериментально взаимодействие антител с иммобилизованным антигеном изучено тремя методами. а) Твердофазным иммуноферментным методом проанализированы коэффициенты кривой связывания обычных моноклональных (анти-Мб, анти-hIgG и анти-HRP) и образованных от них биспецифических антител (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP) с антигенами, адсорбированными на поверхности иммунных планшетов. б) Радиоиммунологическим методом определенны наблюдаемые равновесные константы ассоциации родительских (анти-hIgG и анти-HRP) и биспецифических моноклональных антител (анти-hIgG/HRP) с адсорбированными на поверхности иммунных планшетов антигенами. в) С помощью биосенсора IAsys определенны кинетические и равновесные константы ассоциации и диссоциации родительских (анти-hlgG и анти-HRP) и биспецифических моноклональных антител (анти-hlgG/HRP) с ковалентно иммобилизованными антигенами. г) Результаты, полученные тремя различными методами совпадают. Антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно бивалентно, а антитела против hlgG связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно.

4. Предложена и апробирована тремя различными методами иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител, для определения характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного).

5. Показано бивалентное связывание биспецифических антител со специфичностью к пероксидазе и миоглобину при одновременной адсорбции на поверхности иммунных планшетов смеси двух антигенов. т к

2.3. Заключение

Как подробно теоретически доказано в приложении, обычные МКА более эффективно взаимодействуют с иммобилизованным антигеном, чем ассоциации (Кш, М"1) и наблюдаемой равновесной константой диссоциации (Kdiss, М) следующим образом:

16)

17) образованных от них БИАТ. Следует заметить, что мы рассмотрели самый простой случай взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном, подобный тестированию антигена в иммуноблоттинге или иммуногистохимии. Для более сложных систем анализа, таких как сэндвич-метод или конкурентный анализ, необходимо проводить отдельные исследования сравнительной эффективности БИАТ и МКА.

Основной задачей, ради которой была сделана данная работа, является апробация сравнительного анализа связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами для определения типа взаимодействия антител (моновалентного или бивалентного). Изучение бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов является предметом постоянных исследований и публикации [17-30]. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования [29, 30]. Мы предлагаем во всех этих случаях использовать вместо Fab фрагментов, биспецифические моноклональные антитела, так как за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3].

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Реагенты и оборудование

В работе были использованы следующие реактивы: изофермент С пероксидазы из корней хрена, RZ>3.0, ("Biozyme", Великобритания); бычий сывороточный альбумин (БСА), о-фенилендиамина гидрохлорид (ОФД), этаноламин, диэтаноламин, гексагидрат п-нитрофеннилфосфата натрия, азид натрия, хлорамин Т, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS), глицин ("Sigma", США); твин 20, 2-меркаптоэтанол ("Ferak Berlin", Германия); трис, додецилсульфат натрия (SDS) ("Serva", Германия); перекись водорода 30% ("Chemapol", Чехословакия); сефадекс G-25, BrCN-Сефароза 4В ("Pharmacia", Швеция); гидроокись натрия, лимонная кислота моногидрат, марки "чда" ("Lachema", Чехословакия); аммиак, уксусная кислота, серная кислота, соляная кислота, марки "осч" ("Мосреактив" Россия); ацетат, гидрокарбонат, карбонат натрия; хлориды натрия и магния; сульфат аммония; одно- и двузамещенные гидраты фосфатов натрия; марок "осч" и "чда" ("Мосреактив", Россия);

125 натрий I («Изотоп», Россия). Иммуноглобулин G человека (подкласс 1) был любезно предоставлен Баталовой Т.Н, Институт имени Габричевского, Москва. Миоглобин человека был предоставлен Массино Ю.С. из института ВНД и НФ РАН, Москва.

Центрифугирование проводили на центрифуге «Весктапп» (Швеция). Для гель фильтрации использовали оборудование "LKB" (Швеция). Спектрофотометрические измерения проводились на плашечном ридере Labsystems (США), спектрофотометре DU 8В ("Becman", США). Для SDS-электрофореза использовали установки и реактивы «Bio-Rad» (США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор низкомолекулярных стандартов для электрофореза фирмы "Farmacia".

Радиоиммунологические измерения проводили на сцинтиляционном у-счетчике GammaTrac 1191 (США).

4.2. Методы исследований

4.2.1. Клеточные линии

В качестве источников моноспецифических и биспецифических антител использовали панель гибридом и тетрадом, полученных в лаборатории нейроиммунологии ИВНД и НФ РАН под руководством Ю.С. Массино. В работе применяли антитела к трем антигенам: миоглобину (Мб), пероксидазе хрена (HRP) и IgG человека (hlgG); три клона обычных моноклональных антител (анти-Мб, анти-hIgG и анти-HRP) и два клона образованных от них биспецифических моноклональных антител (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP). Специфичность продуцируемых антител и их изотипы приведены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дмитриев, Дмитрий Александрович, 2005 год

1. Littlefield, W. (1964) Selectiion of hybrids from matings of fibroblasts invitro and their presumed recombinations. Science, 145, 709-710.

2. Milstein, C., and Cuello, A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use inimmunohistochemistry. Nature, 305, 537-548.

3. Milstein, C., and Cuello A. C. (1984) Hybrid hybridomas and the productionof bispecific monoclonal antibody. Immunol. Today, 5, 299-304.

4. Cao, Y., and Suresh, M.R. (1998) Bispecific antibodies as novelbioconjugates. Bioconjug. Chem., 9, 635-645.

5. Fanger, M.W., Morganelli, P.M., and Guyre, P.M. (1992) Bispecificantibodies. Crit Rev Immunol, 12,101-124.

6. Fanger, M.W., and Guyre, P.M. (1991) Bispecific antibodies for targetedcellular cytotoxicity. Trends Biotechnol, 9, 375-380.

7. Self, C.H., and Cook, D.B. (1996) Advances in immunoassay technology.

8. Curr Opin Biotechnol, 7, 60-65.

9. Berkova, N., Karawajew, L., Korobko, V., Behrsing, O., Micheel, В.,

10. Bugari, G., Polesi, C., Beretta, A., Ghelmi, S., and Albertini, A. (1990)

11. Quantitative immunoenzymatic assay of human lutropin, with use of a bispecific monoclonal antibody. Clin. Chem., 36, 47-52.

12. Cao, Y., Christian, S., and Suresh, M.R. (1998) Development of abispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules. J. Immunol. Methods., 220, 8591.

13. Karawajew, L., Behrsing, O., Kaiser, G., and Micheel, B. (1988)

14. Production and ELISA application of bispecific monoclonal antibodies against fluorescein isothiocyanate (FITC) and horseradish peroxidase (HRP). J. Immunol. Methods, 111, 95-99.

15. Koelemij, R., Kuppen, P.J., van de Velde, C.J., Fleuren, G.J., Hagenaars,

16. M., and Eggermont, A.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy, from the laboratory to the clinic. J. Immunother. 22, 514-524.

17. Kreutz, F.T., and Suresh, M.R. (1997) Novel bispecific immunoprobe forrapid and sensitive detection of prostate-specific antigen. Clin. Chem. 43, 649-56.

18. Segal, D.M., Weiner, G.J., and Weiner, L.M. (1999) Bispecific antibodiesin cancer therapy. Curr. Opin. Immunol., 11, 558-62.

19. Songsivilai, S., and Lachmann, P.J. (1990) Bispecific antibody: a tool fordiagnosis and treatment of disease. Clin. Exp. Immunol., 79, 315-21.

20. Takahashi, M., and Fuller, S. A. (1988) Production of murine hybridhybridomas secreting bispecific monoclonal antibodies for use in urease-based immunoassays. Clin. Chem., 34, 1693-1696.

21. Crothers, D.M., and Metzger, H. (1972) The influence of polyvalency onthe binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-357.

22. Davis, K.A., Abrams, В., Iyer, S.B., Hoffman, R.A., and Bishop, J.E.1998) Determination of CD4 antigen density on cells: role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry, 33, 197-205.

23. Dower, S.K., Titus, J.A., DeLisi, C., and Segal, D.M. (1981) Mechanism ofbinding of multivalent immune complexes to Fc receptors. 1. Equilibrium binding. Biochemistry, 20, 6326-34.

24. Dower, S.K., Titus, J.A., DeLisi, C., and Segal, D.M. (1981) Mechanism ofbinding of multivalent immune complexes to Fc receptors. 2. Kinetics of binding. Biochemistry, 20, 6335-40.

25. Dower, S.K., Ozato, К., and Segal, D.M (1984) The interaction ofmonoclonal antibodies with MHC class I antigens on mouse spleen cells. I. Analasys of the mechanism of binding. J. Immunol., 132, 751-758.

26. Hornick, C. L., and Karush, F. (1972) Antibody affinity. III. The role ofmultivalence. Immunochemistry, 9, 325-343.

27. Karulin, A.Yu., and Dzantiev, B.B. (1990) Polyvalent interaction ofantibodies with bacterial cells. Mol. Immunol., 27, 965-971.

28. Kaufman, E.N., and Jain, R.K. (1992) Effect of bivalent interaction uponapperant antibody affinity: experimantal confirmation of theory using fluorescence photobleaching and implications for antibody binding assays. Cancer res, 52, 4157-4167.

29. Mason, D.W., and Williams, A.F. (1980) Kinetics of antibody reactions andthe analysis of cell surface antigens. In: Weir, D.M., editor. Handbook of Experimental Immunology, fourth ed. Blackwell Scientific, Oxford, 38.1-38.17.

30. Mattes, M.J. (1997) Binding parameters of antibodies reacting withmultivalent antigens: functional affinity or pseudo-affinity. J. Immunol. Methods, 202, 97-98.

31. Roubey, R.A., Eisenberg, R.A., Harper, M.F., and Winfield, J.B. (1995)

32. Anticardiolipin" autoantibodies recognise beta 2-glycoprotein I in the absence of phospholipid. Importance of Ag density and bivalent binding. J. Immunol., 154, 954-960.

33. George, A.J.T., French, R.R., and Glennie, M.J. (1995) Measurement ofkinetic binding constants of a panel of anti-saporin antibodies using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Methods, 183, 51-63.

34. Roggenbuck, D., Konig, H., Niemann, В., Schoenherr, G., Jahn, S., and

35. Porstmann, T. (1994) Real-time biospecific interaction analysis of a natural human polyreactive monoclonal IgM antibody and its Fab and scFv fragments with several antigens. Scand J. Immunol., 40, 64-81.

36. Operational aspects of antibody affinity constants measured by liquid-phase and solid-phase assays. J Mol Recogn, 5, 9-18.

37. Frankel, M.E. and Gerhard,, W. (1979) The rapid determination of bindingconstants for antiviral antibodies by a radioimmunoassay. An analysis of the interaction beetween hybrydoma proteins and influenza virus. Mol. Immunol. 16, 101-106.

38. Allard, W.J., Moran, C.A., Nagel, E., Collins, G., and Largen, M.T. (1992)

39. Antigen binding properties of highly purified bispeciflc antibodies. Mol Immunol, 29, 1219-1227.

40. Smirnova, M.B., Dergunova, N.N., Kizim, E.A., Massino, Yu.S., Nikulina,

41. V.A. Segal, O.L., Tereshkina, E.B., Kolyaskina, G.I. and Dmitriev, A.D. (1997) Study of antigen-binding properties of bispecific antibodies. Biochemistry (Moskow), 62, 41-48.

42. Horenstein, A., Poiesi, C., Camagna, M., de Monte, L., Mariani, M.,

43. Albertini, A. and Malavasi, F. (1994) Biosensor analysis of antigenantibody interactions as a priority step in the generation of monoclonal bispecific antibodies. Cell Biophys. 24-25, 109-117.

44. Buckle, P.E., Davies, R.J., Kinning, Т., Yeng, D., Edwards, P.R., Pollard

45. Knight, D., and Lowe, C.R. (1993) The resonant mirror: a novel optical sensor for direct sensing of biomolecular interactions Part II: Applications. Biosensors Bioelectron., 8, 355-363.

46. Cush, R., Cronin, J. M., Stewart, W.J., Maule, C.H., Molloy, J., and

47. Goddard, N.J. (1993) The resonant mirror: a novel optical biosensor for direct sensing of biomolecular interactions Part I: Principle of operation and associated instrumention. Biosensors Bioelectron., 8, 347-353.

48. Davies, R.J., Edwards, P.R.,Watts, H.J., Lowe, C.R., Buckle, P.E., Yeng,

49. D., Kinning, T.M., and Pollard-Knight, D.V. (1994) The Resonant Mirror: a versatile tool for the study of biomolecular interaction. In: Crabb, J.W. (Ed.), Techniques in Protein Chemistry V. Academic Press, London, p. 285-293.

50. IAsys Cuvette System FASTfit Guide. (1993) Fisons Applied Sensor

51. Technology. Cambridge, England.

52. IAsys Cuvette System Methods Guide. (1993) Fisons Applied Sensor

53. Technology. Cambridge, England.

54. IAsys Cuvette System Users's Guide. (1993) Fisons applied sensortechnology. Cambridge, England.44. http ://www. affinity-sensors, со .uk45. http://www.biochem.northwestern.edu/Keck/PDF%20documents/IAsys

55. Yeung, D., Gill, A., Maule, C.H., and Davies, R.J. (1995) Detection andquantification of biomolecular interactions with optical biosensors. Trends Anal. Chem., 14,49-54.

56. Nissonoff, A., and Rivers, M. M. (1961) Recombination of a mixture ofunivalent antibody fragments of different specificity. Arch. Biochem. Biophys., 93, 460-462.

57. Cook, A.G., and Wood P.J. (1994) Chemical synthesis of bispecificmonoclonal antibodies: potential advantages in immunoassay systems. J. Immunol. Methods. 171, 227-37.

58. Ward, E.S., Gussow, D., Griffits, A.D., Jones, P.T. and Winter, G. (1989)

59. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherihia coli. Nature, 341, 544- 546.

60. Holliger, P., Prospero, Т., and Winter, G. (1993) "Diabodies": smallbivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6444-6448.

61. Pack, P., and Plutckthun, A. (1992) Miniantibodies: Use of amphipathichelices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry, 31,1579-1584.

62. Coloma, M.J., and Morrison, S.L. (1997) Design and production of noveltetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159-63.

63. Hudson, P.J. (1999) Recombinant antibody constructs in cancer therapy.

64. Curr Opin Immunol, 11, 548-557.

65. Kipriyanov, S.M., Dubel, S., Breitling, F., Kontermann, R.E., and Little, M.1994) Recombinant single-chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent and biotinylated miniantibodies. Mol. Immunol., 31,1047-58.

66. Kruif, J., and Logtenberg, T. J.(1996) Leucine zipper dimerized bivalentand bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library. Biol. Chem., 271, 7630-4.

67. Muller, K.M., Arndt, K.M., and Pluckthun, A. (1998) A dimeric bispecificminiantibody combines two specificities with avidity. FEBS Letters, 432, 45-48.

68. Pluckthun, A., and Pack, P. (1997) New protein engineering approaches tomultivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnoiogy, 3, 83-105.

69. Santos, A.D., Kashmiri, S.V., Hand, P.H., Schlom, J., and Padlan

70. E.A.(1999) Generation and characterization of a single gene-encoded single-chain-tetravalent antitumor antibody. Clin Cancer Res., 5, 3118s-3123s.

71. Todorovska, A., Roovers, R.C., Dolesal, O., Kortt, A.A., Hoogenboom,

72. H.R., and Hudson, P.J. (2001) Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods, 248, 47-56.

73. Bosslet, K., Stainstraesser, A., Hermentin, P., Kuhlmann, L., Bruynck, A.,

74. Magerstaedt, M., Seemann, G., Schwarz, A., and Sedlacek, H. H. (1991) Generation of bispecific monoclonal antibodies for two phase radioimmunotherapy. Br. J. Cancer, 63, 681-686.

75. Reardan, D.T., Meares, C.F., Goodwin, D.A., Mc.Tigne, T.N., David, G.S.,

76. Stone, M.R., Leung, J.P., Bartholomew, R.M., and Frincke, J.M. (1985) Antibodoes against metal chelates. Nature, 316, 265-268.

77. Чехонин, В.П., Жирков, Ю.А., и Дмитриева, Т.Б. (1995) Направленныйтранспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. Моноклональные антитела в нейробиологии. Под ред. М.Б. Штарка, М.В. Старостиной.- Новосибирск: АО "Офсет", 171-182.

78. Cotton, R.G.H., and Milstein, С. (1973) Fusion of two immunoglobulinproducing myeloma cells. Nature, 244, 42-43.

79. Kohler, G., and Milstein, C. (1975) Continuous culture of fused cellssecreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.

80. Ленинджер, A. (1985) "Основы биохимии", Москва, "Мир", т.2.

81. Wong, J.,Т., and Colvin R. В. (1987) Bi-specific monoclonal antibodies:selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens. J. Immunol., 139, 1369-1374.

82. Tada, H., Toyoda, Y., and Iwasa S. (1989) Bispecific antibody-producinghybrid hybridoma and its use in one-step immunoassays for human lymphotoxin. Hybridoma, 8, 73-83.

83. Reading, C.L., and Bator, J.M. (1988) Proceedings for the 5th Annual1.dustry Conference and Exhibition, San Francisco, CA.

84. Staerz, U.D., and Bevan, M.J. (1986) Hybrid hybridoma producing abispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,1453-1457.

85. Tiebout, R.F., Van Boxtel-Oosterhof, F., Strieker, E.A.M., and Zeijlemaker,

86. W. P. (1987) A human hybrid hybridoma. J. Immunol, 139, 3402-3405.

87. Suresh, M.R., Cuello, A.C., and Milstein, C. (1986) Advantages ofbispecific hybridomas in one-step immunocytochemistry and in immunoassays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7989-7993.

88. De Lau, W.B.M., Van Loon, A.E., Heije, K., Valerio, D., and Bast,

89. B.J.E.G. (1989) Production of hybrid hybridoma based on HATS -neomycin1 double mutants. J. Immunol. Methods, 117, 1-8.

90. Koolwijk, P., Rosemuller, E., Kees Stad, R., De Lau, W.B.M., and Bast,

91. B.J.E.G. (1988) Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluorescent-activated cell sorting. Hybridoma, 7, 217-225.

92. Jantcheff, P., Winkler, L., Karawajew, L., Kaiser, G., Bottger, V., and

93. Micheel, B. (1993) Hybrid hybridomas producing bispecific antibodies to CEA and peroxidase isolated by a combination of HAT medium selection and fluorescence-activated cell sorting. J. Immunol. Methods, 163,91-97.

94. De Preval, C., and Fougereau, M. (1976) Specific interaction between VHand Vl regions of human monoclonal immunoglobulins. J. Mol. Biol., 102, 657-678.

95. Hamel, P.A., Klein, M.H., and Dorrington, K.J. (1986) The role of the VLand Vh segments in the preferential reassociation of immunoglobulin subunits. Mol. Immunol., 23, 503-510.

96. Hamel, P.A., Klein, M.H., Smith-Gill, S.J., and Dorrington, K.J. (1987)

97. Relative noncovalent association constant between immunoglobulin H and L chains is unrelated to their expression or antigen-binding activity. J. Immunol., 139, 3012-3020.

98. Hendershot, L.M., Bole, D.G., and Kearney, J.F. (1987) The role of « immunoglobulin heavy chain binding protein. Immunol. Today, 8, 111115.

99. Knarr, G., Gething, M.J., Modrow, S., and Bucher, J. (1995) BIP bindingsequences in antibodies. J. Biol. Chem., 270, 27589-27594.

100. Hendershot, L., Bole, D., Koller, G., and Kearney, J.F. (1987) Assemblyand secretion of heavy chains that do not associate posttranslationally with immunoglobulin heavy chain binding protein. J. Cell. Biol., 104, 761-767.

101. Hendershot, L.M. (1990) Immunoglobulin heavy chain and binding proteincomplexes are dissociate in vivo by light chain addition. J. Cell. Biol., 111,829-837.

102. De Lau, W.B.M., Heije, K., Neefjes, J.J., Oosterwegel, M., Rosemuller, E., * and Bast, B.J.C.G. (1991) Absence of preferential homologous H/Lchain association in hybrid hybridomas. J. Immunology, 146, 906-914.

103. Massino, Y.S., Dergunova, N.N., Kizim, E.A., Smirnova, M.B.,

104. Tereshkina, E.B., Kolyaskina, G.I., and Dmitriev, A.D. (1997) Quantitative analysis of the products of IgG chain recombination in hybrid hybridomas based on affinity chromatography and radioimmunoassay. J. Immunol. Methods, 201, 57.

105. Smith-Gill, S.J., Hamel, P.A., Klein, M.H., Rudikoff, S., and Dorrington,

106. K.J. (1986) Contribution of the Vk4 light chain to antibody specificity for lysozyme and b(l,6) D-galactan. Mol. Immunol., 23, 919-926.

107. Somasundaram, C., Matzku, S., Schuhmacher, J., and Zoller, M. (1993)

108. Development of a bispecific monoclonal antibody against a gallium-67 chelate and the human melanoma-associated antigen p 97 for potential use in pretargeted immunoscintiography. Cancer Immunol. Immunother., 36, 337-345.

109. Hudson, N.W., Mudgett, M., Panka, D.J., and Margolies, M.N. (1987)1.munoglobulin chain recombination among antidigoxin antibodies by hybridoma-hybridoma fusion. J. Immunol., 139, 2715-2723.

110. Morelli, L., Plotkin, L., Leoni, J., Fossati, C.A., and Margni, R.A. (1993)

111. Mol. Immunol., 3, 695-700.

112. Варфаломеев, С.Д., Зайцев, C.B., и Мевх, А.Т. (1985) Физикохимические исследования молекулярных механизмов действия физиологически активных соединений. Рецепция. "Биоорганическая ^ химия" (Итоги науки и техники) ВИНИТИ, Москва, "Мир", т. 3, стр.51.55.

113. Scubitz, К.М, O'Hara, D.S., and Smith, I.W. (1977) Antibody-haptenreaction kinetics: a comparison of hapten interactions with IgG and Fab preparations. J. Immunology, 118,1971-1976.

114. Kranz, D.M., Herron, J.N., and Voss, E.W. (1982) Mechanisms of ligandbinding by monoclonal anti-fluorecyl antibodies. J. Biol. Chem., 257, 6987-6995.

115. Auriol, J., Guesdon, J.L., Masc, J.C., and Nato F. (1994) Development of abispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation. J. Immunol. Methods, 169, 123-133.

116. Nakane, P.K., and Kawaoi, A. (1974) Peroxidase-labelled antibody. A newmethod of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 22, 1084-1099.

117. Klotz, I.M. (1982) Numbers of receptor sites from Scatchard graphs: factsand fantasies. Science,; 217, 1247-1249.

118. Thompson, R.J., and Jackson, A.P. (1984) Cyclic complexes and highavidity antibodies. Trends Biochem. Sci., 9,1-15.

119. Greenbury, C.L., Moore, D.H., and Nunn, L.A.C. (1965) The reaction withred cells of 7S antibody, its subunits and their recombinants. Immunology, 8, 420-431.

120. Lamarre, A., and Talbot, P.J. (1995) Protection from lethal coronavirusinfection by immunoglobulin fragments. J. Immunol., 154, 3975-3984. s 100. Смирнова, М.Б., Никулина, В.А., Сегал, О.JI., Кизим, Е.А., Массино,V

121. Handbook of biochemistry and molecular biology. (1976) Ed. Faseuau,

122. G.O. V. II. P. 383. 3rd ed. CRC Press.

123. Ishikawa, E., Imagava, M., Hashida, S., Yoshitake, S., Hamaguchi, Y.,and Ueno, T. (1983) Enzyme-labelling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J Immunoassay, 4, 209-260.a

124. Greenwood, F.G., Hunter, W.M., and Glover, J.S. (1963) The preparation1 о 1of I-labeled human growth hormone of high specific activity. Biochem J, 89, 114-123.

125. Чард, Т. Радиоиммунологические методы. (1981) Варшавский, Я.,М.1. Ред.) "Мир", Москва.

126. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4. Nature, 277, 680-685.

127. Dmitriev, D.A., Massino, Yu.S., and Segal, O.L. (2003) Kinetic analysisof interactions between bispecific monoclonal antibodies and immobilized antigens using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Meth.,280, 183-202.

128. Leatherbarrow, R.J. (1990) Use linear and non-linear regression to fit t biochemical data. Trends Biol. Sci. 15, 455-458.

129. O'Shannessy, D.J., Brigham-Burke, M., Soneson, K.K., Hensley, P., and

130. Brooks, I. (1993) Detemination of rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions using surface plasmon resonance: use of nonlinear least squares analysis methods. Anal. Biochem., 212,457.

131. Davies, O.L., and Goldsmith, P.L. (1977) Statistical Methods in Researchand Production. Longman.

132. Motulsky, H.J., and Ransnas, L.A. (1987) Fitting curves to data using nonlinear regression: a practical and nonmathematical review. FASEB J. 1, 365-74.

133. Gomes, P., and Andreu, D. (2002) Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor. J. Immunol. Methods, 259, P217-230.

134. O'Shannessy, D.J., and Winsor, D.J. (1996) Interpretation of deviationsfrom pseudo-first order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology. Anal. Biochem. 236, 275.

135. Edwards, P.R., Gill, A., Pollard-Knight, D.V., Hoare, M., Buckle, P.E.,1.we, P.A. and Leatherbarrow, R.J. (1995) Kinetics of protein-protein interactions at the surface of an optical biosensor. Anal. Biochem. 231, 210-223.

136. Edwards, P.R., Maule, C.H., Leatherbarrow, R.J., and Winzor, D.J. (1998)

137. Second-order kinetic analysis of IAsys biosensor data: Its use and applicability. Anal. Biochem. 263, 1-17.

138. Gill, A., Leatherbarrow, R.J., Hoare, M., Pollard-Knight, D.V., Lowe, P.A., and Fortune, D.H. (1996) Analysis of kinetic data of antibody-antigen interaction from an optical biosensor by exponential curve fitting. J. Biotechnol. 48, 117-132.

139. Hall, D.R., Gorgani, N.N., Altin, J.G., and Winzor, D.J. (1997) Theoretical and Experimental Considerations of the Pseudo-First-Order Approximation in Conventional Kinetic Analysis of IAsys Biosensor Date. Anal. Biochem. 253, 145-159.

140. Schuck, P., and Minton, A.P. (1996) Analysis of mass transport-limited binding kinetics in evanescent wave biosensors. Anal. Biochem. 240, 262281.

141. Muller, K.M., Arndt, K.M., and Pluckthun, A. (1998) Model and simulation of multivalent binding to fixed ligands. Anal. Biochem. 261, 149-171.

142. Pellequer, J.L., and Van Regenmortel, M. H. (1993) Measurement of kinetic binding constants of viral antibodies using a new biosensor technology. J. Immunol. Methods, 166, 133.

143. Nygren, H., Czerkinski, C., and Stenberg, M. (1985) Dissociation ofantibodies bound to surface-immobilized antigen. J. Immunol, methods, 85, 87.

144. Nygren, H., Werthen, M., and Stenberg, M. (1987) Kinetics of antibodybinding to solid-phase-immobilised antigen. Effect of diffusion rate limitation and steric interaction. J Immunol Methods, 16, 63-71.1. БЛАГОДАРНОСТИ