Выживаемость патогенных бактерий в почвах: на примере Coxiella burnetii и амебо-резистентных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.27, кандидат биологических наук Евстигнеева, Анна Сергеевна

• Евстигнеева, Анна Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Евстигнеева, Анна Сергеевна

ГЛАВА 1. ПОЧВА КАК БИОТОП ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ 10-35 ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

1.1. Роль почвы в возникновении эпидемий 10

1.2. Патогенные бактерии, обнаруживаемые в почвах 15

1.3. Факторы, определяющие выживаемость патогенных 18-25 микроорганизмов в почвах

1.4. Coxiella burnetii и Q-лихорадка 25

1.5. Свободноживущие амебы и потенциально патогенные 31-35 микроорганизмы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36

2.1. Структура исследования (модель экспериментов) 36

2.1.1. Определение выживаемости Coxiella burnetii в почвах 36

2.1.2. Обнаружение амебо-резистентных бактерий (АРБ) в 38-39 почвах

2.2. Объекты исследования 40

2.2.1. Почвы, используемые для определения выживаемости 40-41 Coxiella burnetii

2.2.2. Почвы, используемые для обнаружения АРБ 41

2.3. Методы исследования 42

2.3.1. Методика почвенных исследований 42

2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ

2.3.3. Co-культура амеб 45

2.3.3.1. Подготовка образцов. «Российская» и «французская» 45-46 методики

2.3.3.2. Инокуляция образцов в культуру амеб 46

2.3.3.3. Наблюдение за со-культурой

2.3.3.4. Выделение и морфологическая идентификация 48-49 штаммов

2.3.3.5. Цитопатогенный эффект 49

2.3.3.6. Клонирование 50

2.3.3.7. Молекулярная идентификация изолятов 52-

ГЛАВА 3. ВЫЖИВАЕМОСТЬ COXIELLA BURNETII 54-58 В ПОЧВАХ

3.1. Выживаемость С. burnetii в почвах различных типов 54

3.2. Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii 56-

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АМЕБ ДЛЯ 59-71 ОБНАРУЖЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ

4.1. Разнообразие амебо-резистентных бактерий (АРБ) в почвах

4.2. Лизис амеб и цитопатогенные свойства изолятов 60

4.3. Идентификация изолятов 61

4.4. Выделение нового вида 63

4.5. Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий 65-66 (сравнение методик)

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ВЫЖИВАНИЯ 72-82 ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выживаемость патогенных бактерий в почвах: на примере Coxiella burnetii и амебо-резистентных бактерий»

Актуальность темы

Теоретическая предпосылка настоящей работы - проблема сохранения в разных почвах патогенных микроорганизмов. Естественные почвы обычно обладают самоочищающей способностью (Мишустин и др., 1979). Она определяется комплексом почвенных свойств, препятствующих сохранению в почвах большинства возбудителей болезней. Однако современное техногенное воздействие на почву приводит к быстрому расширению спектра патогенных агентов человека, выживающих в объектах окружающей среды. Создание таких условий заложено в самом техническом прогрессе, когда появляются многочисленные разнообразные новые местообитания и экологические ниши, весьма благоприятные для потенциально патогенных микроорганизмов на фоне неуклонного снижения иммунных барьеров человека (Литвин и др., 1997).

Для оценки патогенной опасности почвенных объектов важно, чтобы используемый метод позволял провести быстрый и точный скрининг почвы на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Когда речь идет об уменьшении риска заболевания человека, именно быстрота обнаружения и точность определения патогена выходят на первый план.

Поэтому в рамках настоящей работы представлялось важным оценить почву как биотоп, где возможно сохранение патогенных микроорганизмов, и попытаться, с одной стороны, вскрыть механизм взаимодействия конкретного патогена со сложной системой - почвой, а с другой, - провести скрининг почвенных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, для оценки риска заражения.

Цель работы

Определить выживаемость патогенных бактерий в почвах различных типов (на примере Coxiella burnetii и амебо-резистентных бактерий) и изучить влияние свойств почв на выживаемость патогенных микроорганизмов.

Задачи исследования

1) Определить выживаемость С. burnetii в исследуемых почвах после инокуляции в эксперименте.

2) Оценить динамику количества С. burnetii в различных почвах при разных температурах.

3) Выделить амебо-резистентные бактерии (АРБ) из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей.

4) Дать характеристику выделенным АРБ методом построения филогенетического дерева.

5) Выявить почвенные свойства, влияющие на выживаемость патогенных бактерий в почве.

6) Провести оценку применимости метода амебного со-культивирования для скрининга почв на наличие амебо-резистентных бактерий.

Защищаемые положения

1. Патогенные бактерии (С. burnetii, АРБ) выживают (сохраняют жизнеспособность) в почвенной среде, в почвах разных типов в течение длительного времени.

2. Выживаемость патогенных бактерий (С. burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается.

3. Метод амебного со-культивирования позволяет выявлять наличие в почвах потенциально патогенных бактерий и обнаруживать новые виды.

Научная новизна

Проведенное исследование позволило выделить из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, 33 вида потенциально патогенных бактерий, многие из которых ранее не выделяли из почвенной среды.

Обнаружены 4 потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%), а также новый вид рода Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9%), идентифицированные последовательности генов которых помещены в GenBank.

Впервые определена выживаемость патогенной у-протеобактерии С. burnetii в разных почвах (дерново-подзолистой, серой лесной, черноземе, каштановой и болотной почве высокогорья), которая составляет не менее 20 дней.

Установлено, что из всех почвенных свойств наибольшее ингибирующее влияние на выживаемость С. burnetii в черноземе оказывает содержание органического углерода: выживаемость С. burnetii в черноземе при +20°С уменьшается при увеличении содержания органического углерода.

Показано, что у коксиеллы существует широкий диапазон экологической толерантности по отношению к температуре почвы (от -20 до +20°С), при этом количество сохранившихся в почве коксиелл увеличивается с уменьшением температуры независимо от типа почвы, а при температуре исследуемых почв -20°С имеет место консервация С. burnetii в жизнеспособном состоянии.

Впервые для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий использован метод амебного со-культивирования, который, как показало данное исследование, также позволяет каталогизировать почвенные микроорганизмы и выявлять новые виды/роды бактерий в почвенной среде.

Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что почвы и пески в местах частого и массового пребывания людей содержат потенциально патогенные для человека бактерии.

Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование территории на наличие амебо-резистентных бактерий в комплекс необходимых мер по оценке эпидемиологической опасности мест проживания людей.

Метод амебного со-культивирования позволяет с достаточной быстротой и точностью проводить скрининг почв на наличие потенциальных патогенов человека и обнаруживать новые виды микроорганизмов.

Увеличение содержания органического углерода в черноземах способствует снижению выживаемости С. burnetii, возбудителя Q-лихорадки.

Автор выражает большую благодарность ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в лице его директора академика РАМН A.JI. Гинцбурга и руководителя лаборатории экологии риккетсий академика РАМН И.В. Тарасевич за предоставленную возможность выполнения данной работы и ценные научные консультации, а также руководителю Центра ВОЗ Средиземноморского Университета, профессору Д. Раулю и профессору Б. Jla Скола за содействие в проведении эксперимента.

Заключение диссертации по теме «Почвоведение», Евстигнеева, Анна Сергеевна

выводы

1. Почвы (дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая, болотная почва высокогорья и городские почвы) представляют собой биотоп, в котором выживают патогенные бактерии.

2. Из 11 почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, выделено 33 вида амебо-резистентных бактерий, 20 из которых - ранее описанные патогены человека.

3. Спектр естественных почв, в которых может выживать Coxiella burnetii (возбудитель Q-лихорадки) не менее 20 дней, достаточно широк: дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая и болотная почва высокогорья.

4. Выживаемость патогенных бактерий (Coxiella burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается.

5. Обнаружено четыре потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%): candidatus "Bradyrhizobium massiliensis", "Acinetobacter timonensis", "Flavobacterium massiliensis" и "Sphingobacterium massiliensis", а также новый вид рода

Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9% к А. tandoii). Полученные последовательности генов помещены в GenBank. 6. Доказана применимость метода амебной со-культуры для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трансмиссия микроорганизмов в окружающей среде определяется рядом факторов, как чисто экологических, так и внутрисистемных (Harvey, Harms, 2001) в данном случае, почвенных. Подобная мультифакторность требует комплексного подхода с учетом максимального количества параметров. Даже потенциально существующая возможность снижения риска возникновения эпидемии делает такое исследование практически значимым.

Обнаруженная способность Coxiella burnetii выживать в почвах (в течение не менее 20 дней) при ведущем аспирационном пути передачи инфекции заставляет в некотором смысле по-другому взглянуть на очаги Q-лихорадки - обратить внимание эпидемиологов, экологов и просто людей на почву как еще на один фактор сохранения возбудителя. При этом выявленная обратно пропорциональная зависимость выживаемости данного микроба от содержания в почве органического углерода позволяет разрабатывать экологические методы борьбы с его трансмиссией, снижая таким образом риск заражения людей в очаге.

До сегодняшнего дня большинство моделей по изучению взаимодействия бактерий с простейшими были сфокусированы на водах больниц и стояков водного охлаждения. Однако, как отмечено Snelling и др. (2006), исследования структуры и последовательности генов 16S и 18S рРНК абсолютно необходимы для составления каталога разнообразия бактерий и простейших, населяющих как различные воды, так и различные типы почв. Почва считается одной из сложнейших природных систем для жизни микробов, насчитывающей около 109 бактериальных клеток на грамм и ~104 различных видов (Crawford, 2005). Культивирование всего разнообразия видов пока представляется недосягаемой целью, так как дает такое огромное количество изолятов, которые невозможно индивидуально прокультивировать и определить (Janssen, 2006). Поэтому в случае с патогенными микроорганизмами необходим направленный метод, способствующий быстрому и эффективному их обнаружению в почвенной среде.

По результатам, представленным в этой работе, мы можем заключить, что амебная со-культура является подходящим методом как для каталогизации почвенных микроорганизмов, с выделением редких и даже новых видов, так и для чисто практического скрининга почв на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Интересно отметить, что С. burnetii также сохраняется внутри свободно-живущих амеб (в течение 18 дней) (La Scola, Raoult, 2001), что указывает на возможность последних играть роль и в естественных почвенных условиях - предоставлять дополнительную нишу для выживаемости патогенных микроорганизмов.

Подводя итоги, обратим внимание, что некоторые известные ранее факультативные патогены человека, выделяемые из почвы, являются АРБ, при этом почвы и пески в местах проживания человека содержат АРБ, являющиеся новыми видами бактерий.

В будущем представляется необходимым исследовать другие типы почв, к примеру, расположенные в районах с более влажным климатом (по сравнению с сухим средиземноморским климатом Марселя) как с целью скрининга новых территорий на наличие потенциальных патогенов человека, так и для оценки разнообразия АРБ в разных природных зонах, а также расширить и углубить наши представления о роли температуры в вопросе выживаемости в почве патогенных микроорганизмов (Coxiella burnetii, в частности) и роли амеб в выживании коксиеллы в почвах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Евстигнеева, Анна Сергеевна, 2007 год

1. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1972.

2. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск, 1988.

3. Воронкевич И.В. Выживаемость фитопатогенных бактерий в природе. М., 1974.

4. Друганова Л.П. Эпидемиология лихорадки Ку в ЦЧР. Дисс. . канд. мед. наук. М., 1985.

5. Дубровский Ю.А., Шустрова Н.М., Кузнецов Г.Г. Ассоциации энтеробактерий и неферментирующих микроорганизмов зимних гнезд обыкновенных полевок и поверхности почвы в бесснежную половину года // Бюлл. МОИП, отд. биол. 1990. 95(4): 28-35.

6. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987.

7. Звягинцев Д.Г. Адсорбция микроорганизмов почвой и ее влияние на их жизнедеятельность. Дисс. . докт. биол. наук. М., 1970.

8. Здродовский П.Ф. Ку-лихорадка. М., 1955.

9. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Ку-лихорадка // Учение о риккетсиях и риккетсиозах. М.: Медгиз, 1972.

10. Зубков М.Н. Неферментирующие бактерии. Acinetobacter spp.: таксономия и классификация, характеристика, клиническое значение, идентификация, антибиотикорезистентность // Инф. и антимикроб, терап. 2003, 2. Доступно на: http://www.consilium-medicum.com/

11. Кайырманова Г.К., Шупшибаев К.К., Абишева К.К., Баубекова А .С. Изучение взаимосвязи гидрофобности дрожжевых клеток с их сорбционной активностью в отношении различных носителей, 2004. Доступно на: http://www.kazsu.kz/articles/bio/23article.htm.

12. Касьяненко A.M., Вернер О.М., Завирюха А.И., Синяк К.М. Характеристика почв в стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктах // Журн. микробиол. 1984,1: 90-95.

13. Классификация патогенных для человека микроорганизмов. Приложение 5.1. Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности. Госкомсанэпиднадзор России. М., 2003.

14. Кравченко А.Т., Шишулина JI.M. Распространение возбудителей ботулизма и столбняка на территории СССР. М., 1970.

15. Куделина Р.И. Фазовые варианты риккетсий Бернета и их значение для диагностики и профилактики лихорадки Ку. Дисс. . докт. мед. наук. М., 1970.

16. Литвин В.Ю., Гинцбург A.JI., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1997.

17. Максименкова И.А., Карпачевский JI.O. Характеристика почв природного очага лептоспирозов, псевдотуберкулеза и кишечногого иерсиниоза//Почвоведение. 1985, 10: 107-115.

18. Максименкова И.А., Литвин В.Ю. Влияние некоторых почвенных факторов на динамику численности псевдотуберкулезного микроба // Вопросы микробиол., патогенеза и лабораторной диагностики иерсиниозов. Новосибирск, 1985.

19. Милановский Е.Ю., Шеин Е.В. Функциональная роль амфифильных компонентов гумусовых веществ в процессах гумусо-структурообразования и в генезисе почв // Почвоведение. 2002, 10: 1201-1213.

20. Мишустин Е.Н., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М., 1979.

21. Найштейн С .Я., Тарков М.И., Меренюк Г.В., Тимченко Л.А. Актуальные вопросы гигиены почвы. Кишинев, 1975.

22. Никульшин С.В., Онацкая Т.Г., Луканина Л.М. и др. Изучение ассоциаций почвенных амеб Hartmanella rhysodes с бактериями -возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте // Журн. микробиол. 1992, 9-10: 2-4.

23. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Гульченко Л.П., Федоров Ю.М. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговымиинфекциями и меры по их профилактике // Журн. микробиол. 1999, (4): 14-18.

24. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М, 1990.

25. Пиковская Р.И., Рцхиладзе С.И., Гелашвили М.Г. К вопросу о самоочищающих свойствах основных типов почв Грузинской ССР.-Гигиена и санитария, 1956, №1.

26. Проблемы коксиеллеза на рубеже третьего тысячелетия. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2002. Доступно на: http:// www. pasteur. socspb. ru/ news/publication/2002/04/05/events9442/

27. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование). Автореф. дисс. . докт. биол. наук. М., 1994.

28. Пушкарева В.И. Экспериментальная оценка взаимодействия Yersinia pestis с почвенными инфузориями и возможности длительного сохранения бактерий в цистах простейших // Журн. микробиол. 2003, 4: 40-44.

29. Романова Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 1997.

30. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1999, 3: 25-34.

31. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, 1988.

32. Тарасевич И.В. Коксиеллез (лихорадка Ку). Частная эпидемиология. Т.2. М., 2002.

33. Терских В.И. Сапронозы. (О болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания) // Журн. микробиол. 1958. (8): 118-122.

34. Федотов Г.Н., Добровольский Г.В., Путляев В.И., Гаршев А.В., Иванов В.К., Пахомов Е.И. Гелевые структуры в почвах // Почвоведение. 2006, 7: 824-835

35. Федотов Г.Н., Путляев В.И., Гаршев А.В., Иванов В.К., Пахомов Е.И., Баранчиков А.Е. Органо-минеральные гели почв и оценка возможности получения подобных структур диспергационными методами // Доклады по экологическому почвоведению. 2006, 1: 116.

36. Шеин Е.В., Милановский Е.Ю. Роль и значение органического вещества в образовании и устойчивости почвенных агрегатов // Почвоведение. 2003,1: 53-61.

37. Шустрова Н.М., Дубровский Ю.А. Природные резервуары условно-патогенных бактерий // Потенциально патогенные бактерии в природе. М., 1991-6. С. 30-42.

38. Abd Н, Weintraub A, Sandstrom G (2005) Intracellular survival and replication of Vibrio cholerae 0139 in aquatic free-living amoebae. Environ Microbiol 7: 1003-1008.

39. Adekambi T, Reynaud-Gaubert M, Greub G, Gevaudan MJ, La Scola B, Raoult D, Drancourt M (2004) Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. J Clin Microbiol 42: 5493-5501.

40. Adeleke AA et al. (2001) Legionella drozanskii sp. nov., Legionella rowbothamii sp. nov. and Legionella fallonii sp. nov.: three unusual new Legionella species. Int J Syst Evol Microbiol 51: 1151-1160.

41. Arricau-Bouvery N, Rodolakis A (2005) Is Q fever an emerging or re-emerging zoonosis? Vet. Res. 36: 327-349.

42. Barker J & Brown MRW (1994) Trojan horses of the microbial world: protozoa and the survival of bacterial pathogens in the environment. Microbiology 140: 1253-1259.

43. Beier S, Witzel KP, Marxsen J (2005) Bacterial community composition in Central European running waters examined by TGGE and sequence analysis of 16S rDNA. Unpublished.

44. Birtles RJ, Rowbotham TJ, Michel R, Pitcher DG, La Scola B, Alexiou-Daniel S, Raoult D (2000) 'Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. IntJ Syst Evol Microbiol 50:63-72.

45. Brown MRW & Barker J (1999) Unexplored reservoirs of pathogenic bacteria: protozoa and biofilms. Trends Microbiol 7: 46-50.

46. CDC. Available from: http://www.cdc.gov/agent/agentlist.asp.

47. Crawford RL (2005) Microbial diversity and its relationship to planetary protection. Appl Environ Microbiol 71: 4163-4168.

48. Cutler SJ, Paiba GA, Howells J, Morgan KL (2002) Q fever a forgotten disease? Lancet Infect Dis. 2: 717-718.

49. Dasch GA, Weiss E (2000) Coxiella burnetii as a Bioterrorist Agent. //Topley and Wilson's Microbiology and Microbiological Infections, New York, p. 78-87.

50. Daoud Z, Cocozaki A, Hakime N (2006) Antimicrobial susceptibility patterns of Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae isolates in a Beirut general university hospital between 2000 and 2004. Clin Microbiol Infect 12: 86-90.

51. Davis GE, Cox HR (1938) A filter passing infections agent isolated from ticks. Isolation from Dermacentor Andersoni, reactions in animals and filtrations experiments. Pub Health Rep 53: 2259-2261.

52. Derrick EH (1937) Q-fever a new entity. Clinical features, diagnosis and laboratory investigation. Med J Aust 2: 281-299.

53. Derrick EH (1939) Rickettsia burneti. The cause of a Q-fever. Med J Aust 1: 14.

54. Drancourt M, Roux V, Fournier PE, Raoult D (2004) rpoB gene sequence-based identification of aerobic gram-positive cocci of the genera

55. Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia, and Granulicatella. J Clin Microbiol 42: 497-504.

56. Dworkin MS, Ma X, Golash RG (2002) Fear of bioterrorism and implications for public health preparedness. Available from: http:// www.cdc.gov/ncidod/EID/vol9no4/02-0593.htm.

57. Fenner L, Richet H, Raoult D, Papazian L, Martin C, La Scola В (2006) Are clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa more virulent than hospital environmental isolates in amebal co-culture test? Crit Care Med 34: 823-828.

58. Garcia MM & McKay KA (1970) Pathogenic microorganisms in soil: an old problem in a new perspective. Can J Comp Med 34: 105-110.

59. Greub G & Raoult D (2003) Rhodobacter massiliensis sp. nov., a new amoebae-resistant species isolated from the nose of a patient. Res Microbiol 154: 631-635.

60. Greub G & Raoult D (2004) Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 17: 413-433.

61. Greub G, La Scola B, Raoult D (2004) Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerg Infect Dis 10: 470-477.

62. Haas W, Kaushal D, Sublett J, Obert C, Tuomanen EI (2005) Vancomycin stress response in a sensitive and a tolerant strain of Streptococcus pneumoniae. J Bacterid 187: 8205-8210.

63. Harakeh S, Yassine H, El-Fadel M (2006) Antimicrobial-resistance of Streptococcus pneumoniae isolated from the Lebanese environment. Mar Environ Res 62: 181-193.

64. Janssen PH (2006) Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol 72: 17191728.

65. Juni E (1984) Bergey's manual of systematic bacteriology// Eds. N.R.Krieg, J.G.Holt. Baltimore: Willam& Willcins Co. 9th ed., V.l: 303-307.

66. Koide M, Arakaki N, Saito A (2001) Distribution of Legionella longbeachae and other legionellae in Japanese potting soils. Infect Chemother 7: 224-227.

67. La Scola В, Raoult D (2001) Survival of Coxiella burnetii within free-living amoeba Acanthamoeba castellanii. Clin Microbiol Infect 7: 75-79.

68. La Scola B, Michel G, Raoult D (1997) Use of amplification and sequencing of the 16S rRNA gene to diagnose Mycoplasma pneumoniae osteomyelitis in a patient with hypogammaglobulinemia. Clin Infect Dis 24: 1161-1163.

69. La Scola B, Barrassi L, Raoult D (2000) Isolation of new fastidious alpha. Proteobacteria and Afipia felis from hospital water supplies by direct plating and amoebal co-culture procedures. FEMS Microbiol Ecol 34: 129-137.

70. La Scola B, Barrassi L, Raoult D (2004) A novel alpha-Proteobacterium, Nordella oligomobilis gen. nov., sp. nov., isolated by using amoebal co-cultures. Res Microbiol 155: 47-51.

71. La Scola B, Mezi L, Weiller PJ, Raoult D (2001) Isolation of Legionella anisa using an amoebic coculture procedure. J Clin Microbiol 39: 365366.

72. La Scola B, Boyadjiev I, Greub G, Khamis A, Martin C, Raoult D (2003) Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerg Infect Dis 7: 815-821.

73. La Scola В, Birtles RJ, Greub G, Harrison TJ, Ratcliff RM, Raoult D (2004) Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int J Syst Evol Microbiol 54: 699-703.

74. La Scola B, Audic S, Robert C, Jungang L, Lamballerie de X, Drancourt M, Birtles R, Claverie JM, Raoult D (2003) A giant virus in amoebae. Science 29: 2033.

75. Landers P, Kerr KG, Rowbotham TJ, Tipper JL, Keig PM, Ingham E, Denton M (2000) Survival and growth of Burkholderia cepacia within the free-living amoeba Acanthamoeba polyphaga. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19:121-123.

76. Li X, Zhang D, Chen F, Ma J, Dong Y, Zhang L (2004) Klebsiella singaporensis sp. nov., a novel isomaltulose-producing bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 54: 2131-2136.

77. Martinez J, Martinez L, Rosenblueth M, Silva J, Martinez-Romero E (2004) How are gene sequence analyses modifying bacterial taxonomy? The case of Klebsiella. Int Microbiol 7: 261-268.

78. Maurin M, Raoult D (1999) Q fever. Clin Microbiol Rev 10: 518-553.

79. McCaul TF (1991) The developmental cycle of Coxiella burnetii// J.C. Williams, H.A. Thompson H.A. Q fever: the biology of Coxiella burnetii. CRC Press, p. 223-258.

80. Molmeret M, Horn M, Wagner M, Santic M, Kwaik YA (2005) Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl Environ Microbiol 71: 20-28.

81. Pettenkofer M. Boden und Grundwasser in ihrer Beziehungen zur Cholera und Typhus. Zeitschrift fur Biologie, V, Heft. 2. Munchen, 1869.

82. Rehacek J., Tarasevich I.V. Acari-borne Rickettsiae & Rickettsioses in Eurasia. Bratislava, 1988.

83. Rosenblueth M, Martinez L, Silva J, Martinez-Romero E (2004) Klebsiella variicola, a novel species with clinical and plant-associated isolates. Syst Appl Microbiol 27: 27-35.

84. Simpson JM, Santo Domingo JW, Reasoner DJ (2004) Assessment of equine fecal contamination: the search for alternative bacterial source-tracking targets. FEMS Microbiol Ecol 47: 65-75.

85. Snelling WJ, Moore JE, McKenna JP, Lecky DM, Dooley JSG (2006) Bacterial-protozoa interactions; an update on the role these phenomena play towards human illness. Microbes and Infection 8: 578-587.

86. Stackebrandt E & Ebers J (2006) Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standarts. Microbiology today 10: 846-849.

87. Stackebrandt E & Goebel BM (1994) Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 44: 846-849.

88. Steele TW, Moore CV, Sangster N (1990) Distribution of Legionella longbeachae serogroup 1 and other legionellae in potting soils in Australia. Appl Environ Microbiol 56: 2984-2988.

89. Thornsberry C, Ogilvie PT, Holley HP, Sahm DF (1999) Survey of susceptibilities of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis. Antimicrob Agents Chemother 11: 2612-2623.

90. Tissot-Dupont H, Amadei M-A, Nezri M, Raoult D (2004) Wind in November, Q fever in December. EID 7: 1264-1269.

91. Todar's Online Textbook of Bacteriology (TOTB). Available at: http://textbookofbacteriology.net.

92. Waksman SA & Woodruff HB (1940) Survival of bacteria added to soil and resultant modification of the soil population. Soil Sci., 50: 421-427.

93. Wang X & Ahearn DG (1997) Effect of bacteria on survival and growth of Acanthamoeba castellanii. Curr Microbiol 34: 212-215.

94. Williams MM, Domingo JW, Meckes MC, Kelty CA, Rochon HS (2004) Phylogenetic diversity of drinking water bacteria in a distribution system simulator. Appl. Microbiol. 96: 954-964.

95. Zhang R, Zeng R, Zhao J, Lin N (2003) 16S rDNA diversity of bacteria in penguin droppings sediments from Ardley Island, Antarctica. Unpublished.