Выделение и структурно-функциональные свойства сексстероидсвязывающего глобулина крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сурвило, Леонид Иосифович

• Сурвило, Леонид Иосифович
• кандидат химических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сурвило, Леонид Иосифович

ввдаш.з-б

Глава I. БЕЛКИ ПЛАЗЛЫ КРОВИ МЛЖ0ПИТАЩИХ, СШШВАЩИЕ П0Л0

ШЕ СТЕРОИДНЫЕ ГОШОШ (Обзор литературы) .7

1.1. Основные свойства сексстероидсвязывающего глобулина

ССГ) в составе плазмы 1фош. 7

1.2. Выделение и очистка ССГ .13

1.3. Физико-химические свойства ССГ.17

1.4. Краткие сведения о не специфических стероидсвязыващих белках сыворотки крови.25

1.5. Физиологическая роль ССГ. 29

Глава II. ШДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ССГ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. 35

11.1. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на ДГТ-сефарозе . 36

11.2. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле. 45

11.3. Очистка ССГ . 54

Глава III. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ССГ. 62

111.1. Электрофоретические и гидродинамические свойства ССГ 62

111.2. Стероидсвязывающие свойства ССГ . 70

111.3. Спектральные свойства ССГ

111.4. Химические свойства ССГ . 79

Глава 1У. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ССГ С ПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ

КЛЕТОК ДЕВДЦУАЛЪНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА.87

Глава У. ЭКСПЕРШЕНТАЛШАЯ ЧАСТЬ.I0I-I3I вывода

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и структурно-функциональные свойства сексстероидсвязывающего глобулина крови человека»

Важное место в процессах биорегуляции, обеспечивающих жизнедеятельность организма, принадлежит стероидным горюнам. В русле крови большая часть стероидов находится в связанном с белками состоянии. Стероидные горюны связываются как специфическими, так и неспецифическими глобулинами плазмы крови млекопитающих. Связанные стероидные гормоны на пути к тканям-мишеням защищаются от действия ферментов, неспецифической адсорбции в крови и лимфатических узлах, чрезмерного метаболизма в печени и повышенной почечной экскреции. „ Эти белки облегчают перенос гормонов от места их биосинтеза в ток крови. Считают, что связывающие глобулины выполняют в организме регуляторную функцию, ограничивая поступление гормонов в ткани-мишени. Однако, наряду с экспериментальными подтверждениями биологической инертности связанных стероидов, имеются факты, указывающие на возможную активную роль связывающих глобулинов крови. Так, в экспериментах с адреналэктамированными крысами было обнаружено повышение активности тирозинаминотрансферазы в печени и уменьшение концентрации лимфоцитов в периферической крови при инъекции как свободного кортизола, так и комплекса транскортин-кортизол. В нашей лаборатории было показано, что асиалотранскортин и нативный комплекс транскортин-кортизол специфически связываются плазматическими мембранами клеток печени человека - ткани-мишени для глюкокор-тикоидных гормонов. Физиологическое значение этого явления может состоять в том, что в организме человека имеется специальный механизм регуляции уровня транскортина в крови, отличный от известного общего механизма десиалирования гликопротеинов в крови и катаболизма асиалогликопротеинов в печени. Кроме того, взаимодействие комплекса транскортин-кортизол с мембранами клеток печени может способствовать проникновению гормона в клетки-мишени, увеличивая in ИЖО локальную концентрацию комплекса транскортин-гормон в ткани-мишени.

В плане систематического изучения в нашей лаборатории взаимодействий комплексов специфические связывающие глобулины крови -стероидные горюны с плазматическими мембранами клеток тканей-мишеней стероидных гормонов представляло интерес исследовать взаимодействие сексстероидсвязывающего глобулина (ССГ) крови человека в комплексе с эстрадиолом с плазматическими мембранами клеток де-цвдуальной ткани человека - ткани-мишени эстрадиола. В этой связи было необходимо разработать эффективную методику выделения и очистки данного глобулина и детально изучить его физико-химические свойства, так как анализ литературных данных показал, что имеющиеся сведения о свойствах ССГ крайне противоречивы.

Целью настоящего исследования явилась разработка методики препаративного выделения и очистки ССГ из сыворотки крови человека, а также исследование структурно-функциональных свойств данного глобулина крови.

Настоящая работа выполнена в рамках научно-технической проблемы 0. 74. 05. "Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное хозяйство".

Приступая к исследованию ССГ человека мы располагали сведениями об уровнях этого глобулина в крови. Были предложены способы выделения и очистки глобулина, изучались его некоторые физико-химические свойства.

Научная новизна данной работы состоит в том, что впервые проведено структурно-функциональное изучение ССГ человека. В результате выдвинуты и обосноваш следующие положения.

Разработана высокоэффективная методика препаративного выделения ССГ из сыворотки крови человека, включающая стадии аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле, сульфат-аммонийного фракционирования, гель-хроматографии и аффинной хроматографии на иммобилизованном конканавалине А. Методика позволяет из 2 л сыворотки ретроплацентарной крови человека выделить до 10 мг ССГ в чистом виде (выход белка составляет, примерно, 25%).

ССГ состоит из одной полипептидной цепи, содержит 10,5% углеводов и имеет молекулярную массу ~ 50 ООО. Этот белок имеет коэффициент седиментации 4,7 5 , из о электрическую точку при рН 5,75, коэффициент экстинкции (А^зq jcm) 10,5, константы ассоциации ССГ с дигидротестостероном, тестостероном и эстрадиолом равны 4,5'Ю8 М"1, 2,7,1081Г1, 2,2*108 1Г1, соответственно. Выяснено влияние ряда физико-химических факторов на комплексообразование ССГ со стероидами. Установлены аминокислотный и моносахаридный составы ССГ.

Показано, что комплекс ССГ-эстрадиол избирательно и с высоким сродством взаимодействует с плазматическими мембранами клеток де-цидуальной ткани человека - ткани-мишени эстрадиола. Определены следующие равновесные параметры данного взаимодействия: константа диссоциации равна (3,2 ± 1,9)М и максимальная связывающая ёмкость 5 фмоль/мг мембранного белка.

Найдено, что после солюбилизации плазматических мембран с помощью 2%-еото холата натрия компоненты мембран в растворе сохраняют способность связывать комплекс ССГ-эстрадиол, что открывает принципиальную возможность выделения и изучения их физико-химических свойств.

Указанные положения выносятся на защиту.

Полученные данные о взаимодействии комплекса ССГ-эстрадиол с плазматическими мембранами клеток децидуальной ткани заставляют по-новому взглянуть на роль специфических связывающих глобулинов крови в механизме гормонального действия стероидов. Полученные результаты могут иметь практическое значение в области здравоохранения. В диагностических целях и при терапии заболеваний, связанных с нарушениями функционирования эндокринной системы, по-видимому, следует учитывать уровень ССГ в крови. Разработанный в ходе выполнения настоящей работы способ выделения ССГ из сыворотки крови человека признан Государственным Комитетом СССР по делам изобретений и открытий изобретением.

Г I А В A I

БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЛЖОПИТАЩИХ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПОЛОВЫЕ

СТЕРОИДНЫЕ ГОРМОНЫ (Обзор литературы).

I. I. Ооновше свойства сексстероидсвязывающего глобулина

ССГ) в составе плазмы крови.

Первое сообщение о наличии в плазме крови человека белка, специфически связывающего половые стероидные гормоны, относится к 1958 году. В этом году Дофадей /I/ методом равновесного диализа обнарушья, что фракция плазш крови 1У по Кону, содержащая в основном оС- и ^-глобулины, проявляет к тестостерону большее сродство, чем альбумин. В последующие годы это наблюдение подтвердили другие авторы, которые использовали равновесный диализ /2/, ультрафильтрацию /3/ и гель-хроматографию /4/. Первое более детальное исследование ССГ было проведено в 1966 году. В работе /5/ исследовалась фракция ^-глобулинов, полученная при электрофорезе на бумаге плазш крови человека. Оказалось, что данная фракция связывает радиоактивный эстрадиол с высоким сродством и тлеет низкую ёмкость. Эти же авторы показали, что специфический связывающий белок устойчив при диализе, многократном замораживании-размораживании плазмы, а при хранении в замороженном состоянии при -20° сохраняет в течение года стероидсвязывающие свойства. Однако, инкубация плазмы при 40° в течение часа приводила к его частичной инактивации, а при 60-65° наблюдалась полная потеря способности плазмы крови специфически связывать половые стероидные горюны.

Затем было показано /6/, что способность сыворотки крови человека связывать тестостерон оставалась практически постоянной при значениях рН 6-8. При значениях рН меньше 5 и больше 10 наблюдалось её резкое падение. В работе /7/ методом равновесного диализа было показано, что уровень связывания тестостерона сывороткой крови человека резко возрастает при беременности, однако мало меняется при нормальном менструальном цикле. Авторами работы /8/ была проведена количественная оценка связывающей способности сыворотки крови человека в норме и при беременности. В нормальном состоянии сыворотка крови способна связывать тестостерон в количестве 1-2 мкг/100 мл сыворотки. При беременности связывающая способность возрастает до 6 мкг/ЮО мл сыворотки. В этой же работе отмечено, что связывающая способность сыворотки 1фови человека значительно возрастает при эстрогенной терапии. Так, при приёме пациентами по 0,5 мг этинилэстрадиола ежедневно на протяжении 10 дней, связывающая способность сыворотки крови возрастала до 4,6-6 мкг/ЮО ше. На основании данных равновесного диализа и ультрафильтрации в работе /9/ был сделан вывод о том, что связывающая способность сыворотки крови мужчин в отношении половых стероидных гормонов, примерно, в 2 раза ниже, чем женщин. В работе /10/ для адсорбции из сыворотки крови человека комплекса ССГ с радиоактивным дигидротестостероном (Д1Т) были использованы диски ДЕАЕ-целлюлозы. Полученные данные показывают, что связывающая способность сыворотки крови небеременных женщин в 4 раза ниже связывающей способности сыворотки беременных, но в свою очередь, примерно, в 2 раза превосходит связывающую способность сыворотки крови мужчин. Авторы работы /II/ обнаружили свойство ССГ сыворотки 1фови человека адсорбироваться на матрице, содержащей иммобилизованный конканавалин А. Используя такие матрицы, авторы работы /II/ определили связывающую способность сыворотки крови женщин равную в норле 2,6 мкг ДГТ/ГОО мл сыворотки, а при беременности - 6,05 мкг JCTT/I00 т сыворотки. Используя данный подход, авторы работы /12/ определили концентрацию ССГ в плазме крови мужчин и женщин, которая составила 18,4 нмоль и 33,1 нмоль, соответственно. Вывод о возрастании связыващей способности сыворотки крови человека при беременности и эстрогенной терапии сделан также в работах /13-16/. В таблице I представлена совокупность данных по связыващей способности сыворотки крови человека при различных физиологических состояниях организма.

Таблица I

Связывающая способность сыворотки крови человека по отношению к половым стероидным гормонам при различных физиологических состояниях организма. Связывающая способность, мкг/100 мл шизиологиче скии источник

10/ :/ II/ :/12/ :/ 14/ :/ 15/ :/ 16/

Мужская кровь Женская кровь Кровь мужчин и женщин после эстрогенной терапии Кровь беременных женщин

1,2 0,6 2,9 2,6 0,9

1,1 1,4 1,5 2,5 2,8 3,3

14,0 6,1

7,2

4,3

6,0 7,8

Данные о распределении ССГ у млекопитающих фрашентарны и в некоторых случаях противоречивы. Мурфи /17/ обнаружила тесто-стеронсвязывающие свойства у сыворотки крови коровы, но не обнаружила их у сывороток крови крысы, кролика и собаки. Вен /18/ сообщил о наличии ССГ у обезьян ftesus топМу, коров, овец, слонов, собак, львов, кроликов, кенгуру. У свиней, верблвдов, ослов, крыс и мышей ССГ, по данным Вена, отсутствует. По данным работы /19/ ССГ отсутствует у крыс, морских свинок, хомяков, собак и котов. В крови коров, овец и кроликов ССГ присутствует. В работе /20/ было показано, что у крыс-самцов ССГ появляется только в шестинедельном возрасте. В крови крыс-самок ССГ отсутствует в возрасте 5-43 дня. Возможно, данный факт объясняет то, что некоторые исследователи /17-19/ не обнаружили ССГ в сыворотке крови крысы.

В ранних работах была изучена специфичность цельной плазмы крови человека и фракции -глобулинов по отношению к половым стероидным гормонам. Стино /6/ нашел, что эстрон замещает тестостерон в связывающем центре бежа, в то время как эстриол, добавленный в равных количествах в бесстероидную плазму крови человека не оказывает такого действия. В работе /21/ было показано, что кор-тизол, црогестерон, эпитестостерон и Д4-андростерон не конкурировали с тестостероном за связывающий центр ССГ сыворотки крови человека. Напротив, 17 <к -метилтестостерон обладал таким же сродством к белку, как и тестостерон, а эстрадиол был лишь несколько менее конкурентноспособен, чем последний. Рознер /22/, используя плазму крови человека, показал, что эстрон, эстрадиол, дегидроэпи-андростерон, андростерон, 17 d -оксипрогестерон и 19-нортестосте-рон конкурируют с тестостероном за активный центр молекулы ССГ. Авторы работы /23/ использовали фракцию 17 по Кону сыворотки крови человека после её хроматографии на DEhE -целлюлозе и сефадексе Б -200. Методом равновесного диализа было установлено, что связывающий центр молекулы ССГ один и тот же для тестостерона и эстра-диола. Константы диссоциации (Кдис) при 4° для тестостерона и

Q —Q эстрадиола имели значения 0,6'10 ^ М и 1,7*10 ^ М, соответственно. Впоследствии эти же авторы /24/, также используя фракцию ТУ по Кону сыворотки крови человека, привели значения констант ассоциации (Ка) для тестостерона (1,2*ТО9 М"1) и эстрадио т ола (0,5*10 М ). Другие авторы /25/ получили более низкие значения KQ ССГ с данными гормонами (4,5*108 М"1 и 0,4* Ю8 М"1 для тестостерона и эстрадиола, соответственно). В работе /26/ было показано, что тестостерон, 3/,17у5-диокси-5оС-андростан, ЗЫ> ,T7c/L-диокси-5оС-андростан, 3fi %Ylfi -диокси-андрост-5-ен, llcL -метил-17у0-окси-андрост-1,4-диен-3-он связываются ССГ примерно одинаково сильно. Слабее связывались 3fi -окси-5<* -андростан-17-он, и 3сС -окси-5сС -андростан-17-он. Наконец, 17<?С -окси-андрост-4-ен-З-он, TM,3fi -диокси-андрост-5-ен, 3J5 -окси-андрост-5-ен-17-он и 3fi-окси-5яС-андростан-17-он связывались слабо. В таблице 2 приведена стероидная специфичность ССГ человека на основании данных ряда работ /13, 16, 29/.

Авторы работы /27/ показали, что с ростом температуры KQ ССГ с тестостероном заметно уменьшается. Так, при 4° Ка=3,1*109 при 25° Ka=I,2*I09 М""1, при 37° KQ=0,7*I09 М"1. Аналогичную закономерность обнаружили и другие исследователи /28/.

Используя цельную плазму и частично очищенные препараты ССГ человека и кролика отдельные группы исследователей /29-36/ изучили некоторые физико-химические свойства данных белков. Так, в работах /29-31/ гель-фильтрацией оценили кажущуюся молекулярную массу ССГ человека, которая оказалась равной 100 000-120 000. Корвел /32/ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) вычислил молекулярную массу ССГ человека, которая составила 98 ООО. Значение 52 ООО было получено равновесным ультрацентрифугированием /24/. В последнем случае Рознер /28/ обнаружил ошибку в расчетах молекулярной массы и нашел, основываясь на дан

Таблица 2

Стероидная специфичность ССЙ Относительное сродство

Стероид : стероида к ССГ, % /13/ /16/ : /29/

7/ -окси-5о( -андростан-3-он 300 165 240 о(-метил-17/ -окси-5о( -андростан-3-он — — 189

5/ ,17/ -диокси-5с( -андростан 160 — 141

W ,17/ -диокси-5о( -андростан 160 - 98

Тестостерон 100 100 100

1d -метил-17/ -окси-андрост-4-ен-З-он — — 100 р ,17/ -диокси-андрост-4-ен 93 — — с{ ,17/ -диокси-андрост-5-ен — — 83

Эстрадиол 62 44 28

7/-окси-андрост-1,4-диен-З-он - - 48 fi , Ytfi -диокси-андрост-5-ен 50 — —

7d -метилтестостерон 38 — 65 lot -метил-17/ -окси-андрост-4-ен-З-он — - 46 fi ,17/ -диокси-5/ -андростан 24 —

9-нортестостерон 22 — — s Радиоактивномеченным стероидом был тестостерон. ных работы /24/, что её величина должна составить 104 ООО. Поздо нее появились данные о радиусе Стокса ССГ (45-47 А), его коэффициенте седиментации ( 5^=5,3 ) и фрикционном отношении {{Ifо =1»48) /32-36/. ССГ сыворотки крови мужчин фокусировался в градиенте рН от 3 до 10 в виде одной полосы с pl=5,4 /33/. В более узком градиенте рН от 4 до 10 была обнаружена микрогетерогенность белка /34/.

Для ССГ кролика /35/ значения величин радиуса Стокса (44-43 о п

А), коэффициента седиментации (5^=4,4 ) и изоэлектрической точки (pl=5,2) были несколько ниже, чем для ССГ человека /35/. По данным гель-электрофореза в ПААГ была вычислена кажущаяся молекулярная масса ССГ кролика, равная 74 000-75 000 /35,36/. Этот белок более отрицательно заряжен, чем ССГ человека. При 0° комплекс ССГ кролика с ДГТ диссоциирует значительно быстрее ( bi/2=5t2 мин), чем комплекс этого стероида с ССГ человека (£j/2=67 мин). Стероидная специфичность данных белков подобна и может быть представлена следующим образом: ДЕТ > андростандиол> >тестостерон» прогестерон, 4-андростен-3,17-дион и кортизол. В работе /35/ была также вычислена Ка ССГ кролика с ДГТ, которая оказалась равной 1,9*Ю9 М"1 при 0° и 1,2'Ю8 М"1 при 37°. Близкое значение Ка=1,4'Ю9 М-** при 4° было получено ранее /37/. Сродство ССГ кролика к тестостерону (Ка=6,16*Ю8 при 4°) было выяснено также в работе /35/.

I. 2. Выделение и очистка ССГ.

В ряде ранних работ были предприняты попытки получения ССГ в чистом виде /24,30,31,38,39/. Для этого сыворотку крови первоначально фракционировали сульфатом аммония /30,38/ или полиэти-ленгликолем /39/. В работе /24/ в качестве исходного материала была выбрана фракция ТУ по Кону. Дальнейшая очистка ССГ осуществлялась хроматографией на ДЕАБ-целлкшозе. Заключительной стадией очистки была хроматография на сефадексе 6 -200 /24, 30, 38/. Другие исследователи после хроматографии фракции 17 по Кону на ДЕАБ-целлншозе, осуществляли сульфат-аммонийное фракционирование и хроматографию на сефадексе б -200,/31/. Конечный результат, достигнутый авторами этих работ, - получение частично очищенных препаратов ССГ, связывающая способность которых была значительно ниже, чем в исходной сыворотке крови.

Бурнштейн /40/ впервые предпринял попытку выделить ССГ сыворотки крови человека с помощью аффинной хроматографии. Аффинный сорбент был получен присоединением 3J3 -амино-17^ -окси-5гС-андрос-тана к сефарозе, активированной бромцианом. Инкубация сыворотки крови с аффинным сорбентом приводила к уменьшению стероидсвязыва-ющей активности сыворотки крови на 75$. Однако, в аффинном элюате удалось обнаружить только 0,4$ секстероидсвязывающей активности сыворотки. Авторы считают, что такой низкий выход связан с инактивацией ССГ в течение всего процесса выделения. Рознер /41/ показал, что добавление в сыворотку ионов кальция, глицерина, а также проведение процесса выделения при низких температурах, заметно уменьшает инактивацию ССГ. Было также найдено, что связывающая способность конечных препаратов ССГ выше, если процесс выделения проводить в трис-малеиновом буфере, а не в фосфатном, глицин-ацетатном и ими-дазольном буферах. После установления этих фактов Рознер /42/ применил аффинную хроматографию для выделения ССГ. Аффинный сорбент был приготовлен путём последовательного присоединения к сефарозе 4 В эшшюргидрина, азодианилина и 3-гемисукцината андростандиола. Источником ССГ служила фракция 1У по Кону сыворотки крови человека. Схема выделения включала фракционирование сульфатом аммония, аффинную хроматографию, гель-хроматографию на сефадексе б -150 и изоэлектрофокусирование в градиенте. рН 4-6. При данной схеме выделения из 280 г сырья было получено 6,5 мг конечного продукта, который хотя и сохранял стероидсвязывающую активность (2,3 мкг ДГТ/ мг белка), но содержал около 20% примесей. Введя в данную схему выделения дополнительную хроматографию на сефадексе б -150 и дополнительное изоэлектрофокусирование эти же авторы /28/ получили ССГ в чистом виде с выходом около 1%, Гомогенность полученного препарата белка доказывалась электрофорезом в ПААГ и электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (D5 ~Н& ). Дополнительным указанием на гомогенность служило обнаружение одного связывающего участка на молекулу белка.

В работе /43/ было исследовано несколько типов аффинных матриц, использованных для выделения ССГ из сыворотки крови человека. Сравнивались матрицы, содержащие связанный через различные гидрофобные пространственные вставки 17р -эстрадиол-3-0-гемисукцинат и 14fi -гемисукцинатдигидротестостерон. Матрицы, содержащие иммобилизованный эстрадиол, оказались мало эффективными. Наиболее удачной оказалась З-О-дигидротестостерон-З^'-диаминодипропил-агароза. Схема выделения состояла из фракционирования сыворотки крови сульфатом аммония, аффинной хроматографии и препаративного гель-электрофореза. При использовании данной методики из I л сыворотки крови было выделено 0,5 мг гомогенного ССГ с выходом Ъ%, Низкий выход авторы объясняли инактивацией ССГ в процессе выделения. Позднее /44, 45/ эта группа исследователей модифицировала процедуру выделения и очистки ССГ. Был предложен новый аффинный сорбент - Ъск -ди-гидротестостерон-17у6 -гемисукциниламиноэтил-(1,4-бутандиол дигли-цидиловый эфир)-агароза. Используя прежнюю схему выделения, авторы из I л сыворотки крови получили 3,4 мг чистого ССГ с выходом 34%. Такой положительный эффект, по мнению авторов, дало применение нового аффинного сорбента, снижение температуры элюции белков с аффинной колонки с 25° до 4°, а также применение прибора для электрофореза в ПААГ более совершенной конструкции. Наконец, Петра и Левис /46/ синтезировали аффинную матрицу, которая содержала иммобилизованный за I7d, -положение ДГТ. По мнению авторов, для специфического связывания ДГТ с ССГ важны свободные 3-кето и Ylfi -оксигруппа стероида. Заменив в схеме выделения /44/ стадию сульфат-аммонийного фракционирования на ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, авторы работы /46/ из 2 л сыворотки крови человека получили 12,6 мг ССГ с выходом 63$. Игбел и Джонсон /47/ предложили свой способ выделения и очистки ССГ. Схема выделения включала аффинную хроматографию на авдростандиол-сефарозе, хроматографию на сефарозе, содержащей иммобилизованный краситель кибакрон голубой и гель-хроматографию на сефадексе б -150. Такая схема выделения позволяла из 4 л сыворотки крови человека получать 5 мг ССГ с выходом около Группа французских исследователей /48/ предложила использовать следующую схему выделения и очистки ССГ: фракционирование сыворотки крови сульфатом аммония, аффинная хроматография на IоС-карбоксиметил-5оС-дигидротестостероне, коньюгированном с аминогексил-сефарозой, и препаративный гель-электрофорез. Данная схема выделения и очистки позволяла получать ССГ из сыворотки крови человека с выходом 28%, Группа исследователей из Швеции /49/ эбнаружила, что аффинная хроматография сыворотки крови на кортизол-зефарозе приводит к выделению двух специфических стероидсвязываю-цих белков - транскортина и ССГ. Разделение" последних осуществляюсь хроматографией на фенил-сефарозе. Выход чистого ССГ составил жоло 18%.

Наряду с изучением ССГ сыворотки крови человека были предприняты попытки выделения и очистки данного белка из сывороток крови млекопитающих. В работе Рознера /37/ ССГ кролика был частично очищен по следующей схеме: насыщение сыворотки крови 50%-ным сульфатом аммония, препаративный гель-электрофорез и гель-хроматография на сефадексе б -200. Петра /45/, использовав аффинный сорбент и методику, разработанную для выделения и очистки ССГ человека /44/, выделил ССГ кролика в чистом виде с выходом около 25%. Группа японских исследователей для выделения ССГ быка /50/, собаки /51/, крысы и кролика /20/ в качестве аффинного сорбента использовала тестостерон, модифицированный у Сц?) и коньюгированный с аминогексил-сефа-розой. Очистка белка осуществлялась на колонке с гидроксиапатитом. Выход ССГ из сыворотки крови быка, собаки, крысы и кролика составил, соответственно, 4,8% /50/, 2,1% /51/, 12% /20/, 16% /20/.

Оценивая описанные выше методики выделения и очистки ССГ крови человека и млекопитающих,следует отметить, что наилучшей с точки зрения выхода ССГ является методика, предложенная в работе /46/. К. недостаткам данной методики можно отнести использование в процессе очистки белка препаративного электрофореза в ПААГ, так как эти ке авторы /44/ отмечали неадекватность используемых систем для пре-заративного гель-электрофореза.

I. 3. Физико-химические свойства ССГ.

Устойчивость природного комплекса ССГ-гормон понижается по яере очистки, а без стероида данный белок постепенно теряет свои звязывающие свойства даже в присутствии белков сыворотки /44/. Эта фоблема ранее специально не изучалась, и первые попытки очистить 5СГ человека закончились неудачей /24, 30, 39, 40/. Позднее Рознер '41/ показал, что ионы кальция, трис-(оксиметил) аминометан и глицерин стабилизируют стероидсвязывающие свойства ССГ. В последующих работах, посвшдённых выделению и очистке ССГ, преимущественно использовали трис- И СЕ буферы, содержащие глицерин и (или) ионы кальция /28, 42-49/.В работе /43/ была изучена стероидсвязывающая активность ССГ во фракции, полученной при осаждении белков сыво -ротки крови человека сульфатом аммония.Было показано, что насыщающие концентрации ДГГ или высокие концентрации глицерина (10-50%) дают возможность в течение нескольких часов сохранять практически неизменными стероидсвязывающие свойства белка. Отделение стероида из чистого бинарного комплекса ССГ-гормон приводит к быстрой и необратимой инактивации белка в растворе /43/.

Основные физико-химические параметры чистого ССГ представлены в таблицах 3 и 4. Из этих данных следует, что значения молекулярной массы ССГ человека, рассчитанные разными авторами, варьируют в широких пределах. Они, в первую очередь, зависят от метода анализа, хотя существуют серьёзные расхождения в результатах, полученных с помощью одного и того же метода. По-видимому, это связано с тем, что ССГ содержит олигосахаридные цепи, а также необходимо принять во внимание склонность белка к агрегации /44/. В работе /44/ после проведения равновесного ультрацентрифутирования гомогенного ССГ в трубочках ПААГ было выявлено несколько белковых зон. Проведение электрофореза в ПААГ в присутствии OS-Na и fi -меркаптоэтанола выявило одну белковую зону. На основании данных экспериментов был сделан вывод о том, что происходит агрегация белка в процессе ультрацентрифугирования.

Аномально высокие значения кажущейся молекулярной массы ССГ (100 ООО - 120 000), определённые гель-фильтрацией и высокие значения фрикционного отношения (табл. 3), вероятно, могут свидетельствовать о высокой степени гидратации белка и (или) ассиметрии белковой глобулы. Молекулярную массу ССГ крови беременных женщин не удалось определить равновесным ультрацентрифутированием в на-тивных условиях, так как белок агрегировал. Значение молекулярной массы ССГ, равное 36 335, было получено ультрацентрифугированием белка в 6 М гуанидинхлоргидрате (табл. 3). Сопоставляя эти результаты с данными гель-электрофореза, автор работы /45/ высказал предположение, что ССГ представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субьединиц. Игбел и Джонсон /47/ на оснований данных электрофореза в ДААГ в присутствии bS~No. рассчитали молекулярную массу ССГ, которая оказалась равной 86 ООО. Однако, при добавлении в пробы перед электрофорезом 1% fi -мер-каптоэтанола электрофоретическая подвижность белка соответствовала молекулярной массе 20 ООО. По мнению авторов, молекула ССГ состоит из четырех идентичных субьединиц. По данным Бона /52/, проведение электрофореза ССГ в ПААГ в присутствии bS~N(l с добавлением и без добавления fi -меркаптоэтанола свидетельствует о том, что молекула ССГ человека состоит из четырех субьединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу 16 ООО. Французские исследователи /48/ на основании данных электрофореза в денатурирующих условиях также склонны считать, что молекула ССГ состоит из субьединиц, однако количество последних не указывается. В то же время Рознер /28/ показал, что присутствие в денатурирующей среде -^б-меркаптоэтанола не влияет на электрофорети-ческую подвижность ССГ человека. Аналогичное наблюдение сделали авторы работы /44/. В литературе имеются также сведения о молекулярных массах (табл. 3) и строении ССГ быка /50/, собаки /51/, крысы /20/ и кролика /45/. Молекула ССГ быка, по-видимому, состоит из трех субьединиц, а кролика из двух.

Изученные физико-химические свойства ССГ млекопитающих показывают, что эти белки тлеют много общего. Так, молекулы этих белков содержат олигосахаридные цепи, имеют близкие молекулярные массы (табл. 3) и характеризуются субьединичным составом. Для них характерно высокое содержание гидрофобных аминокислот (табл. 4). На основании выполненных аминокислотных анализов ОСГ трудно сделать какие-либо другие выводы, так как для ССГ человека количественный состав аминокислот значительно различается в отдельных работах /28, 45, 48, 49/, а для ССГ других видов имеются только единичные сообщения /20, 45, 50, 51/. В работе /20/ было показано, что связывающие свойства ССГ крысы и кролика подобны: данные белки проявляют высокое сродство к тестостерону, ДГТ, 3d ,11 fi -диокси-5оС-ан-дростану и слабо взаимодействовали с эстрадиолом, прогестероном и кортизолом.

Однако между отдельными представителями ССГ млекопитающих имеются и существенные различия. Так, ССГ кролика имеет значительно более низкую KQ с эстрадиолом, чем ССГ человека. ССГ ролика и человека проявляют более высокое сродство к ДГТ, чем к тестостерону. Обратная зависимость имеет место в случае ССГ быка (табл. 3). ССГ ролика заметно отличается по электрофоретической подвижности от ССГ других видов и его поведение в нативных условиях подобно оС-глобулинам. ССГ кролика более чувствителен к тиольным реагентам, чем ССГ человека. В свою очередь последний теряет активность в присутствии дитиотреита и после обработки глиоксалем и циклогек-сандиолом. Это предполагает, что дисульфидные связи, а также остатки аргинина и лизина важны для связывания стероидов /45/.

Содержание Сахаров в молекулах ССГ млекопитающих различается в широких пределах, причём самое низкое значение получено для ССГ собаки, а самое высокое - для ССГ кролика.

Выделение ССГ человека и кролика в чистом виде дало возможность получить к ним моноспецифические антитела /45/. Антитела, j. ашшца о

Физико-химические параметры ССГ млекопитающих.

Параметры :ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ быка:ССГ соба-:ССГ кровека /28/:века /45/:века /47/:века /48/:века /49/: /50/ :ки /51/ :лика /45/

I : 2 : 3 : 4:5:6:7: 8:9

4,6 см3/г 0,692

Молекулярная масса

94 ООО ж

Радиус Стокса, $ к1%

280,1см

Электрофоретическая подвижность

PI

1,87 55,5 5,5

0,707 36 335й

52 ООО325 20 ООО30* 67 ООО®6 52 ООО3®

88 ООО 1,26

37,4

12,34

ЗЙВё

94 ООО39® 1,27

38,0

5,3 0,730 28 400

ЗЕ

1,42 10,1

5,0

0,730 0,698

76 000й' 36 478й 57 000й35

1,26 12,46 to

I—I I

5,51

4,78 I

2: 3: 4: 5: 6: 7: 8: 9

Содержание угле- водов, % 32,1 18,0 34,0 17,0 30,0

Ка при 4°, М"1 1,1'Ю8 5,58-Ю8 з,о-ю8 с тестостероном 1,1'Ю9 ' 1,1-Ю9 с дат 2,4'109 2,4*109 1,43'Ю8 1,2-Ю9 с эстраднолом 0,6-Ю9 0,21'Ю9 0,12*10®

Число связывающих участков на молекулу один один один один один s Молекулярная масса определена равновесным ультрацентрифугированием в денатурирующих условиях. -"Молекулярная масса определена электрофорезом в ПМГ в денатурирующих условиях. *®%олекулярная масса определена электрофорезом в ПАЯ1 в нативных условиях.

Таблица 4

Аминокислотный и углеводный состав ССГ млекопитающих.

Амино-: ССГ че-:ССГ че-: ССГ че-:ССГ че-: ССГ :ССГ кро-:ССГ со-кисло-: ловека :ловека : ловека :ловека : быка: лика : баки ты : /28/ : /45/ : /47/ . : /49/ :/50/ : /45/ : /51/

1:2 : 3 : 4:5:6:7 :8

Asp 67 25,1 76,8 31 51,6 21,7 44,1

Thr 26 17,7 36,8 14 30,5 10,9 27,5

Ser 34 27,9 52,3 27 49,0 23,8 41,7

Glu 56 25,1 68,6 33 63,1 26,3 62,6

Pro 26 21,4 46,6 32 49,1 23,9 32,8

Gly 45 33,1 67,0 31 53,0 •4 CM 49,5

Ala 48 18,5 72,6 23 40,9 17,9 33,5

Val 36 14,3 71,7 18 30,3 14,8 23,4

2Cys 37 6,0 - 4 - 3,2 2,6

Met 9 3,1 - 6 9,3 2,9 2,1 lie 15 8,5 35,1 9 21,3 6,4 17,0

Leu 35 35,3 71,0 52 88,2 34,1 90,1

Tyr 19 3,3 23,1 2 3,3 1,4 7,1

Phe 23 9,6 24,7 9 21,8 7,5 17,2

His 14 8,0 15,8 11 17,1 3,5 9,0

Lys 43 11,3 - 12 13,8 9,6 14,6

Arg 19 11,6 - 20 29,0 10,9 20,9

Trp 9 2,4 - - - 1,2 12,5

Vttto— • • • • ♦ ♦ •

V X viv • ♦ t • • • • воды : 2 : 3: 4:5: 6:7: 8

Puc 2 Man 25 Gal 27 GlcNAc 45 NeuAc 35

2,2

20,2

19,8 15,4

14,6 22,0 26,0 34,0 29,2

1,1 31,6 33,0 12,9 7,7

5,3

49,5

30,0 30,7

1,1 6,5 5,2 7,0 2,0

Содержание отдельных аминокислот выражено в молях на моль белка, кроме работы /45/, в которой использовали молекулярную массу олигопептида, равную 29 795 (для ССГ человека) и 25 533 (для ССГ кролика). Содержание отдельных моносахаридов выражено в молях на моль белка. полученные к ССГ человека, не реагировали с чистым ССГ кролика и с сыворотками котов, собак, коров, овец, козлов и телят. В то же время эти антитела перекрёстно реагировали с сыворотками обезьян Macaco. nmesirCna и РарСо cynoctphaius. моноспецифические антитела к ССГ кролика не давали перекрёстной реакции с сыворотками крови человека, обезьян, котов, собак, козлов, коров и телят.

I. 4. Краткие сведения о не специфических стероидсвязыващих белках сыворотки крови.

Альбумин способен взаимодействовать с многочисленными веществами самой различной химической природы /53/. Этот белок легко получить в чистом виде /54/ и в настоящее время исследователи располагают многочисленными данными о его физико-химических свойствах /55/. Альбумин образует комплексы со всеми стероидными соединениями /53/. Величина KQ для альбумин-стероидных комплексов невелио л т ка и составляет порядка 10-10 М . Обобщение богатого экспериментального материала по связыванию альбумином 68 стероидов различной химической структуры позволило Вестфалю /53/ сформулировать "цравило полярности". Согласно этому правилу, Кдис стероид-белковых комплексов находится в обратной зависимости от числа полярных групп в молекуле стероида. В соответствии с данным правилом, более гидрофобные метаболиты стероидных гормонов связываются альбумином с большей KQ, чем сами гормоны. Так как альбумин находится в плазме крови в высокой концентрации (концентрация альбумина в плазме 1фови человека составляет 42 г/л /55/) и каждая молекула имеет несколько участков связывания, то его связывающая способность очень высока. По данным работы /56/ с альбумином связано примерно 40$ тестостерона, циркулирующего в плазме крови мужчин и 20$ тестостерона плазмы крови женщин.

Стероидсвязывающие характеристики альбумина зависят от содержания липидов в препарате /57/. Предварительное удаление сопутствующих жирных кислот органическими растворителями или активированным углем увеличивало KQ комплекса альбумин-стероид в 4 раза. Ре-ассоциация альбумина с липидами приводила к ингибированию взаимодействия белка со стероидом. Повышение температуры в общем случае приводит к уменьшению сродства лигандов к альбумину /58/. Однако, при связывании стероидных гормонов этот эффект не наблюдается. Для системы бычий сывороточный альбумин-тестостерон было отмечено даже увеличение KQ при возрастании температуры от 4° до 25° /53/.

Для альбумина характерна высокая температурная устойчивость. Так, в работе /59/ было показано, что при возрастании температуры до 60° Ка хотя и уменьшается, однако количество участков связывания остаётся постоянным. Уменьшение KQ было полностью обратимым. В температурном интервале 60-80° наблюдалась лишь частичная обратимость KQ, а выше 80° наступала полная денатурация альбумина. Способность альбумина сохранять стероидсвязывакщие свойства при температурах, значительно превышающих физиологические, широко использовалась исследователями /60, 61/ для дифференциации вкладов специфического и неспецифического связывания гормонов белками крови.

Из литературных данных /62/ по влиянию концентрации ионов водорода на Ка комплексов альбумина со стероидами следует, что депротонизация альбумина при рН 11,0 разрушает эти комплексы. В работе /63/ показано, что максимальное значение Ка наблюдалось при рН 9,5, а при рН 2,3 сродство тестостерона к бычьему сывороточному альбумину составило только 10% от максимальной величины. Ком-плёксообразованию со стероидами благоприятствует увеличение ионной силы раствора. Так, Ка прогестерона с альбумином сыворотки крови человека возрастала вдвое, когда концентрацию NaCt повышали от О до 4 М /64/. Интересно отметить тот факт, что 0,25-1 М СаС(гещё в большей степени стимулировал связывание епинмеченного ДГТ /65/. Возможно, влияние CaCt^ носит более специфический характер, чем действие других солей, так как для ионов кальция имеется около 10 участков связывания на молекуле альбумина /65/.

Орозомукоид, или <К j-кислый гликопротеин был ввделен из плазмы крови человека в 1950 году /66/, но лишь спустя десятилетие было открыто его свойство образовывать обратимые комплексы со стероидами /67/. Разработана методика /68/ выделения больших количеств орозомукоида из плазмы и в настоящее время ^ -кислый гликопротеин является одним из наиболее охарактеризованных белков плазмы крови /53, 68-70/.

Для j -кислого гликопротеина также характерна способность образовывать комплексы со стероидными соединениями /53/. Орозомукоид обладает большой устойчивостью к нагреванию /68-69/. Этот белок выдерживал 24-часовую инкубацию при 60° без потери связывающей способности. Лишь более продолжительная инкубация (72 ч) при этой температуре несколько снижала концентрацию активных стероид связывающих участков. Даже кратковременное кипячение /69/ не приводило к полной потере орозомукоидом стероидсвязыванцей активности.

Комплексы этого белка со стероидами устойчивы в широком интервале рН /68/. Уменьшение значения рН до 2,0, или увеличение до II приводило к частичной необратимой инактивации. Как и в случае альбумина, присутствие в препаратах орозомукоида неконтролируемых количеств эндогенных липидов явилось причиной расхождений в результатах определения параметров связывания стероидов /70/. Освобождение препаратов белка от липидов повышало величину Ка примерно в 8 раз. Реассоциация орозомукоида с липидами вновь снижала число связывающих участков и KQ /71/. Орозомукоид образует комплексы с различными стероидными гормонами. Прочность комплексов, как и в случае альбумина, согласуется с "правилом полярности" /53/. Однако, <Л-кислый гликопротеин обладает несколько большей избирательностью при взаимодействии со стероидами, чем альбумин. Сродство данного белка к различным стероидным гормонам, по данным работ /70,72/, можно представить следующим образом (табл. 5).

Таблица 5.

Параметры связывания некоторых стероидных горюнов eCj-кислшл гликопротеином.

Стероид :Ка'Ю"5, М : й : ка, Ю"5

Прогестерон 9,0 0,98 8,9

Тестостерон 7,3 0,78 6,0

Дезоксикортикостерон 2,2 1,12 2,3

Кортикостерон 0,87 1,27 1,0

Кортизол 0,16 1,24 0,2

Эстрадиол 0,14 7,0 1,0 s Количество связывающих участков на молекулу белка.

В работах /70,72/ было показано, что ионы таких тяжелых металлов, как Нд2? Си**оказывают ингибирующее влияние на комплексооб-разование между орозомукоидом и стероидными гормонами.

I. 5. Физиологическая роль ССГ.

В процессах биорегуляции, обеспечивающих жизнедеятельность организма, существенную роль играют половые стероидные гормоны. Важным этапом механизма действия стероидных гормонов является их взаимодействие со связывающими глобулинами крови - ССГ и альбумином. Комплексы с данными белками - естественное состояние гормонов в крови. Так, только около 2% тестостерона в плазме крови человека находится в свободном состоянии /56/. Считают /73/, что ССГ и альбумин транспортируют стероидные гормоны в биологически неактивной форме и ограничивают таким образом поступление гормонов в ткани. Когда биосинтез стероидов усиливается, доля свободного, активного стероида возрастает. Данные глобулины защищают гормоны от действия ферментов и кислорода, препятствуют адсорбции стероидов на стенках кровеносных сосудов, торлозят их метаболизм и экскрецию, а также облегчают перенос гормонов с места их биосинтеза в ток крови. ССГ проявляет большее сродство к тестостерону, чем к эстрадиолу. Альбумин же образует более црочные комплексы с эстрадиолом. На основании этого авторы работы /74/ предположили, что предпочтительное связывание тестостерона или эстрадиола в плазме крови должно зависеть от концентраций ССГ и альбумина'. Для проверки данного предположения были измерены концентрации свободных, несвязанных белками гормонов в различных биологических источниках, которые заметно различались по содержанию в них ССГ. Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что по мере увеличения в сыворотке крови концентрации ССГ доля свободного тестостерона понижается в большей степени, чем доля свободного эстрадиола. Таким образом, концентрация ССГ в крови может регулировать баланс свободных, несвязанных специфическим белком половых гормонов.

Таблица 6

Содержание свободных тестостерона и эстрадиола в сыворотке крови человека при различных физиологических состояниях.

Физиологический : Содержание свободного : Содержание свобод-источник : тестостерона, % : ного эстрадиола, %

Сыворотка крови: мужчин 2,41 2,84 женщин 1,69 2,54 беременных женщин 0,81 1,35

Показано /75/, что на биосинтез ССГ влияют долговременные физиологические изменения уровней в плазме крови эстрогенов и ан-дрогенов, которые происходят в начале периода половой зрелости и после менопаузы. В течение беременности ССГ может защищать некоторые органы от повышенных уровней андрогенов. Данный белок может регулировать эффективные концентрации андрогенов и эстрогенов в крови. Биосинтез ССГ не чувствителен к краткосрочным гормональным изменениям, таким как флуктуации уровня эстрадиола в течение менструального цикла. Это по мнению авторов работы /75/, свидетельствует в пользу того, что ССГ является буферным белком, который усредняет биологическую реакцию на резкие изменения в концентрации половых гормонов.

Согласно гипотезе, выдвинутой Сэндбергом и Слаунвайтом /76/, только небольшие количества свободных, несвязанных белками гормонов выполняют биологическую функцию. Доказательствами биологической инертности связанных гормонов послужили следующие факты. Так, несмотря на значительный рост концентрации тестостерона в плазме крови беременных женщин, большие концентрации ССГ в этом состоянии препятствуют вирилизации /77/. Скорости метаболизма тестостерона и 3d ,17/5 -диокси-5о( -андростана /78/ в плазме крови человека пропорцианальны количеству гормонов, не связанных с ССГ. В работе /79/ эксплантаты брюшной простаты крысы инкубировали с Н-тестостероном и затем в паралельных опытах вводили в среду сыворотки крови крысы, лошади и теленка, а также сыворотки крови мужчин и беременных женщин. При одинаковых концентрациях сывороток поглощение тестостерона и 3d -диокси-5с( -андростана, а также количества образовавшихся 5оС-ДГТ и андростандиола, были значительно ниже в эксплантатах, которые инкубировались с сывороткой беременных женщин. В работе /80/ была изучена трансформация тестостерона микросомами плаценты человека. Уже в первые минуты реакции исследователи наблюдали уменьшение концентрации тестостерона и пропорциональное увеличение концентрации эстрадиола. Этот процесс замедлялся при связывании тестостерона "активной фракцией белков", полученной из сыворотки крови беременных женщин и высокими концентрациями альбумина. После предварительного прогревания "активной фракции белков" при 60° в течение 30 минут их тормозящее действие полностью исчезало.

Для выяснения вопроса, что же является лучшим параметром ан-дрогенности в ряде работ /81-83/ были определены общий тестостерон и концентрация свободного гормона в плазме крови здоровых и больных людей. Нашли, что уровень свободного тестостерона понижается с возрастом. Это особенно ощутимо в возрастной группе 50-70 лет. В то же время общий тестостерон плазмы остается на прежнем уровне. В период полового развития подростков концентрации общего тестостерона и свободного горлона растут. Последний параметр достигает величины, характерной для взрослых лвдей, при полной половой зрелости. У мужчин с гипогонадизмом и гирсутных женщин более выражены, по сравнению с нормой, изменения концентраций свободного тестостерона. При беременности и у больных гиперти-реозом обоего пола, несмотря на увеличение уровня общего тестостерона в плазме крови, концентрация свободного гормона остается практически неизменной. На основании цриведенных фактов, в работе /82/ был сделан вывод о том, что лучшим индексом андрогенности является концентрация свободного тестостерона в плазме крови.

Наряду с экспериментальными подтверждениями того, что только небольшие количества свободных, несвязанных белками горлонов выполняют биологическую функцию, накапливаются данные, которые не укладываются в общепринятые представления. Эти данные были получены в экспериментах, в которых использовались родственные ССГ по способности связывать в крови стероидные гормоны глобулины - тран-скортин и альбумин. Так, Рознер /84, 85/ в параллельных экспериментах ввел внутривенно адреналэктамированным крысам кортизол, транскортин вместе с кортизолом и контрольный физиологический раствор. Он обнаружил повышение активности тирозинтрансферазы в печени и уменьшение концентрации лимфоцитов в периферической крови в случае инъекции как свободного кортизола, так и комплекса транскортин-кортизол. Эти данные, возможно, свидетельствуют о биологической активности связанного гормона. Данные, опубликованные в работе /86/ , также могут указывать на возможную биологическую активность связанного гормона. Было найдено, что асиалотранскортин и нативный комплекс транскортин-кортизол специфически связываются плазматическими мембранами клеток печени человека - ткани-мишени для глюкокортикоидных гормонов. Данное взашлодействие характеризуется высокой специфичностью. Так, меченый

J-асиалотранскортин не вытеснялся из комплекса с мембранами родственными транскортину по своей способности связывать в крови низкомолекулярные гормоны ССГ и тироксинсвязывающим глобулином. Физиологическое значение обнаруженного явления, по мнению авторов, может состоять в том, что в организме человека имеется специальный механизм регуляции уровня транскортина в крови, отличный от известного общего механизма десиалирования гликопротеинов в крови и катаболизма асиалогликопротеинов в печени. Кроме того, взаимодействие комплекса транскортин-кортизол с мембранами клеток печени может способствовать проникновению гормона в клетки-мишени, увеличивая Ш ШгО локальную концентрацию комплекса тран-скортин-гормон в ткани-мишени.

Авторы работы /87/ показали, что бычий сывороточный альбумин имеет на поверхности гепатоцитов один сайт высокого сродства (^„„=(25 ± 7)*10"^ М) и один сайт низкого сродства. Связанный •^J -меченый бычий сывороточный альбумин не вытеснялся овальбу-мином, бычьим /'-глобулином, трансферрином человека и пролакти-ном овцы (соотношение 1:10), тогда как немеченый альбумин и сывороточный альбумин крысы вытесняли меченый белок из его комплекса с мембранами. В работе /87/ был сделан вывод о том, что поверхность гепатоцитов содержит рецептор альбумина, катализирующий захват связанной с белком олеиновой кислоты и, возможно, других лигандов альбумина.

В работе /88/ исследовалась биологическая активность ксенобиотиков, связанных с сывороточным альбумином человека. Было найдено, что чем больше Ка ксенобиотиков с альбумином, тем выше их биологическое действие.

Эти данные послужили основанием для систематического изучения в нашей лаборатории взаимодействия комплексов связывающий глобулин-гормон с тканями-мишенями стероидных гормонов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сурвило, Леонид Иосифович

выводы

1. Разработана высокоэффективная методика препаративного выделения ССГ из сыворотки крови человека, включающая стадии аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле, сульфат-аммонийного фракционирования, гель-хроматографии и аффинной хроматографии на иммобилизованном конканавалине А.

2. Установлено, что ССГ состоит из одной полипептидной цепи, содержит 10,5$ углеводов и имеет молекулярную массу ~ 50 ООО. Данный белок имеет коэффициент седиментации 4,7S , изоэлектри-ческую точку при рН 5,75, коэффициент экстинции (Aggg jCM) 10,5. Константы ассоциации ССГ с дигидротестостероном, тестостероном и эстрадиолом равны, соответственно 4,5'Ю8 2,7*ТО8

8 —Т и 2,2*10 М . Выяснено влияние ряда физико-химических факторов на комплексообразование ССГ со стероидами. Определены аминокислотный и углеводный составы, N - и С-концевые аминокислоты ССГ.

3. Установлено, что комплекс ССГ-эстрадиол избирательно и с высоким сродством взаимодействует с плазматическими мембранами клеток децидуальной ткани человека - ткани-мишени эстрадиола.

4. Показано, что ССГ может активно участвовать во "взаимодействии эстрадиола с плазматическими мембранами клеток децидуальной ткани человека.

5. Найдено, что при солюбилизации с помощью 2%-ного холата натрия компоненты плазматических мембран клеток децидуальной ткани человека переходят в раствор, сохраняя способность специфически связывать комплекс ССГ-эстрадиол, что открывает принципиальную возможность их выделения и изучения молекулярных свойств.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сурвило, Леонид Иосифович, 1985 год

1. Daughaday W. H., Kozak J. Binding of corticosteroids and related hormones by human protein fractions as measared by equilibrium dialysis.-J. Clin. 1.vest., 1958, v.37, No.4, p.511-518.

2. Slaunwhite W.R.Jr., Sandberg A.A. Transcortin: A corticostero-id-binding protein of plasma.-J. Clin. Invest., 1959, v.38, No.3, p.384-391.

3. Chen P.S.Jr., Mills J.H., Batter P.C. Ultrafiltration studies of steroid-protein binding.-J. Endocr., 1961, v.23, No.1, p.129-137.

4. De Moor P., Heirwegh K., Heremans J.P., Declerck-Raskin M. Protein binding of corticoids studied by gel filtration.-J. Clin. Invest., 1962, v.41, No.6, p.816-827.

5. Rosenbaum W., Christly K.P., Kelly W.G. Electrophoretic evidence for the presence of an estrogen-binding B-globulin in human plasma.-J. Clin. Endocr., 1966, v.26, Ко.12, p.1399-1443.

6. Steeno 0., Heyns V/., van Baelen H., de Moor P. Testosterone binr? ding in human plasma.-Ann. Endocr., 1968, v.29, Ho.1, p.141-149»

7. Pearlman W.H., Murphy M. Testosterone-binding levels in the serum of women during the normal menstrual cycle, pregnancy and the post-partum period.-J. Clin. Endocr. Metab., 1967, v.27, No.7,p.1012-1018.

8. Vermeulen A., Verdonck L. The binding of testosterone to plasma.-Ann. Endocr., 1968, v.29, No.1, p.49-52.

9. Porest M.G., Rivarola M.A., Migeon C.J. Percentage binding of testosterone, androstendione and dehydroisoandrosterone in human plasma.-Steroids, 1968, v.12, Ho.3, p.323-343.

10. Mickelson K.E., Petra P.H. A filter assay for the sex steroid binding protein (SBP) of human serum.-Pebs Letters, 1977, v.44, Ho.1, p.34-37.

11. Ratajczak Т., Hahnel R. An assay for sex hormone binding globulin based on affinity chromatography.-Clin. Chim. Acta, 1976, v.73, Ho.3, p.379-385.

12. Prolich M., Margo G., van Schie H., Brand E.G. Sex hormone binding globulin: binding capacity and studies on the binding of cyprotcrone acetate and other steroids.-Clin. Chim. Acta, 1978, v.87, Ho.2, p.239-244.

13. Murphy B.E.P. Binding of testosterone and estradiol in plasma. -Canad. J. Biochem., 1968, v.46, Ho.4, p.299-302.

14. Suzuki Y., Ito M., Sinohora H. Isolation and characterization of sex steroid binding protein from rat and rabbit plasma.-J. Bio-chem., 1981, v.89, Ho.1, p.231-236.

15. Mercier C., Baulieu E.E. Testosterone-binding plasma protein. -Ann. Endocr., 1968, v.29, No.1, p.159-165.

16. Pearlman W.H., Pond J.F1F., Tou I.H. Testosterone-binding component of human pregnancy serum.-J. Biol. Chem., 1969, v.244, N0.5, p.1373-1380.

17. Heyns W., van Baelen H., de Moor P. Specificity of the steroid-binding I3-globulin in human plasma.-J. Endocr., 1969, v.43, No.1, p.67-71.

18. Lutz R.A., Lutz-Ewan L., Weder H.G. Futher studies on the temperature dependence of the binding of the testosterone to human pregnancy plasma proteins.-Steroids, 1973, v.21, No.3, p«423-431«

19. Van Baelen H., Heyns W., Schoone В., de Moor P. An estradiol-binding globulin in human serum; partial purification.-Ann. Endocr., 1968, v.29, No.1, p.153-156.

20. Gueriqucan I.L., Pearlman W.H. Some properties of a testosterone binding component of human pregnancy serum.-J. Biol. Chem., 1968, v.243, Ко.20, p.5226-5233.

21. Gorvol P.L., Glrambach A., Rodbard D., Bardin C.W. Physical properties and binding capacity of testosterone-estradiol binding globulin in human plasma, determined by polyacrylamide gel electrophoresis .-J. Biol. Chem., 1971, v.246, No.11, p.3435-3443.

22. Mahoudeau J.A., Corvol P. Rabbit testosterone-binding globulin. Physiсоchemical properties.-Endocrinology, 1973, v.92, No.4, p.1113-1119.

23. Rosner W., Darmstadt R.A. Demonstration and partial characterization of a rabbit serum protein which binds testosterone anddihydrotestosterone.-Endocrinology,1973,v.92, No.6, p.1700-1707.

24. Burnstein S.H. The removal of testosterone-binding globulin from plasma by affinity chromatography.-Steroids, 1969, v.14, Ho.1, p.263-268.

25. Rosner W., Smith R.H. Testosterone-estradiol binding globulin of human plasma.-Biochim. Biophys, Acta, 1974, v.351, No.1,p.92-98.

26. Mickelson K.E., Teller D.C., Petra P.H. Characterization of the sex steroid binding protein in human pregnancy serum. Improvements in the purification procedure.-Biochemistry, 1978, v.17,1. Ho.8, p.1409-1414.

27. Petra P.H. The serum sex steroid-binding protein. Purification, characterization and immunological properties of the human and rabbit proteins.-J. Steroid. Biochem., 1979, v.11, Ho.1A,p.245-252.

28. Petra H., Levis J. Modification in the purification sex steroid-binding protein of human serum by affinity chromatography.-Anal. Biochem., 1980, v.105, Ho.1, p.165-169.

29. Igbal M.I.,Johnson M.W. Purification and characterization ofhuman sex hormone binding globulin.-J. Steroid. Biochem., 1979» v.10, Wo.5, p.535-540.

30. Mercier-Bodard C., Renoir J.M., Baulieu E.E. Puther characterization and imunological studies of human sex steroid binding plasma protein.-J. Steroid. Biochem., 1979, v.11, No.1A, p.253-259.

31. Suzuki Y., Itagaki E., Mori H«, Hosoya T. Isolation of testosterone-binding globulin from bovine serum by affinity chromatography and its molecular characterization.-J. Biochem., 1977, v.81, N0.6, p.1721-1731.

32. Suzuki Y., Okumura Y., Sinohora H. Purification and characterization of testosterones binding globulin of canine serum.-J. Biochem., 1979, v.85, No.5, p.1195-1203.

33. Bohn H, Isolation, characterization and quantitative imunological determination of steroid binding J3-globulin.-Blut, 1974, v.29, No.1, p.17-31.

34. Weetphal U. Steroid-Protein Interactions.-Berlin: Springer, 1971, 567p.

35. Mahany Т., Khirabadi B.S., Gersten D.M., Kurian P., Ledloy R.S., Ramwell P.W. Studies on the affinity chromatography of serum albumins from human and animal plasmas.-Сотр. Biochem. and Physiol., 1981, v.68, No.2, p.312-323.

36. Burton R.M., Westphal U. Steroid hormone-binding proteinsin blood plasma.-Metab. Clin. Exp., 1972, v.21, No.3, p.253-256.

37. Klotz I.M., Urquhart J.M. The binding of organic ions by-proteins: effect of temperature.-J. Amer. Chem. Sos., 1949, v.71, No.3, p.847-851.

38. Basset M., Defaye G., Chambaz E.M. Study of steroid-protein interactions by electron spin resonance spectroscopy. Binding of a spin-labelled dihydrotestosterone to bovine serum albumin.-J. Clin. Endocrinol. Metab., 1970, v.30, No.2, p.166-173.

39. Lebeau M.-C., Baulieu E.E, Binding of steroid conjugates to human corticosteroid binding globulin.-J. Clin. Endocrinol. Metab., 1970, v.30, No.2, p. 166-173.

40. Demey-Ponsart E., Foidart J.M., Hendrickx J.C., Sodoyez J.C. Effect of serum dilution on binding of Cortisol to thermolabile and thermostable вегит proteins.-J. Steroid Biochem., 1977,v.8, No.10, p.1091-Ю95.

41. Fletcher J.E. Influence of free fatty acid concentration on drug binding to plasma albumin.-Ann. N. Y. Acad. Sci, 1973, v.226, No.1, p.247-258.

42. Levendahl B.H., Perlmutter R. Testosterone binding to bovine serum albumin: effect of pH.-Arch. Biochem. and Biophys., 1956, v.61, No.1, p.456-460.

43. Schmid K. Preparation and properties of an acid glycoprotein prepared from human plasma.-J. Amer. Chem. Sos., 1950, v.72,1.o.3, p.2816-2825.

44. Westphal U. Binding of steroids to proteins.-J. Amer. Oil Chemist's Sos., 1964, v.41, No.1, p.71-90.

45. Ganguly M., Garnighan R., Westphal U. Steroid Protein Interactions. XIV. Interaction between human o(f-acid glycoprotein and progesterone.-Biochemistry, 1967, v.9, p.2803-2814.

46. Kerkay J., Westphal U. Steroid Protein Interactions. XIX. Complex formation between oC,-acid glycoprotein and steroid hormones .-Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.170, No.2, p.324-333.

47. Ganguly M., Westphal U. Steroid Protein Interactions. XX. Effect of chemical modification on progesterone-binding affinity of cC/-acid glycoprotein.-Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.170, No.2, p.309-323.

48. Kerkay J., Westphal U. Steroid Protein Interactions. XXI. Metal ion inhibition of association between progesterone anddi-acid glycoprotein.-Arch. Biochem. Biophys., 1968, v.129, No.2, p.480-489.

49. Westphal U., Stroupe S.D., Cheng S.L., Harding G.B. Mechanismof steroid binding to serum proteins.-J. Toxicol. Environment. Health, 1978, v.4, Wo.2, p.229-247.

50. Clark A.F. and Bird C.E. Binding of 5c<.-androstane-3oC ,17yg -diol to human plasma proteins .-J. Endocr.,1973, v.57, Ho.2,p.289-298.

51. Mowszwicz I., Kahn D., Dray P. Influence of testosterone binding to serum proteins on aromatization by enzymes of human placental microsomes.-J. Clin. Endocr., 1970, v.31, Ho.4, p.584-586.

52. Lasnitzki J., Franklin Н.Й. The influence of serum on uptake, conversion and action of testosterone in rat prostate glands in organ culture.-J. Endocr., 1972, v.54, Ho.2,p. 333-342.

53. Rosenfield R.L. Plasma testosterone binding globulin and indexes of the concentration of unbound plasma androgens in normaland hirsute subjects.-J. Clin. Endocr. Metab., 1971, v.32, No.6, p. 717-728.

54. Vermeulen A., Stoica Т., Verdonck L. The apparent free testosterone concentration, an index of androgenity.-J. Clin. Endocr. Metab., 1971, v.33, No.5, p.759-767.

55. Vanderbeeken Y. The evaluation of the role of androgens in hirsutism and the use of a new antiandrogen "cyroterone" acetate for therapy.-J. Clin. Bndocr. Metab., 1974, v#39, No.1,p.81-95»

56. Rosner W. , Hochberg R, Corticosteroid-binding globulin in the rat: Isolation and studies of its influence on Cortisol action in vivo.-Endocrinol., 1972, v.91, No,3, p.626-632.

57. Rosner W. Recent studies on the binding of Cortisol in se-rum.-.T. Steroid. Biochem., 1972, v.3, No.3, p.531-542.

58. Strel1chyonok O.A., Avvakumov G.V. Evidence for the presense of specific binding sites for transcortin in human liver plasma membranes.-Biochim. Biophys. Acta, 1983, v.755, No.3, p.514-517.

59. Weisiger R., Gollan J., Ockner R. R*cet>tor for albumin of the liver cell surface may mediate uptake of fatty acids and other albumin-bound substances.-Nature, 1981, v*211, No.4486, p.1048-1П51,

60. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д., Лебедь О.И., Стефанов А.В., Бол-деокул А.Е. Сродство к сывороточному альбумину как показатель биологической активности ксенобиотиков.-ДАН СССР, 1983, т.268, J62, с.488-491.

61. Ахрем А.А., Аввакумов Г.В., Кукушкина И.И., Свиридов О.В., Стрельченок О.А., Сурвило Л.И., Чащин B.JI. Выделение транскорти-на из сыворотки ретроплацентарной крови методом аффинной хроматографии.-Изв. АН БССР Сер. хим. н., 1977, J6 6, C.III-II5.

62. Gaillard P., Han К.-К. and Dautrevaux М. Caracterisation et proprietes physico-chimiques de la transcortine humaine.-Biochi-mie, 1975, v.57, Ho.5, p.559-568.

63. Trapp G.A., Seal U.S., Doe R.P. Ligand column for the purification of steroid-binding proteins.-Steroids, 1971, v.18,1. По.4, p.431-433.

64. Пятый Всесоюзный симпозиум по химии и физике белков и пептидов (Баку, 28-31 окт. 1980 г.): Тез. докл. Рига, Б. и., 1980, с.22.

65. Стрельченок О.А., Сурвило 1.И., Свиридов О.В., Ахрем А.А. Совместная адсорбция транскортина и сексстероидсвязывающего белка человека на кортизол-сефарозе.-Изв. АН БССР. Сер. хим. н., 1983, Ж, с.70-76.

66. Weber K., Osborn M. Reliability of molecular weight by dode-cyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.-J. Biol. Chera., 1969, v.244, No.16, p.4406-4412.

67. Vernon P., Kalb Jr., Bernlohr R. A new spectrophotometric assay for protein in cell extracts.-Anal. Biochem., 1977, v.82, Ho.2, p.362-371 .

68. Ellman G.L. Tissue sulfhudryl groups.-Arch. Biochem. Bio-phys., 1959, v. 82, Ho.1, p.70-77.

69. Hirs G.H. Oxidation of cystine and cysteine during acid hydrolysis of proteins.-In: Meth. in Enzymol., Hew York: Academic Press, 1967, v.11, p.59-65.

70. Edelhoch H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins.-Biochemistry, 1967, v.6, Ho.7, p.1948-1954.

71. Woods K., Wang K. Separation of dansylamino acids by poly-amide layer chromatography.-Biochim. Biophys. Acta, 1967, v.133, Ho.2, p.369-370.

72. Hayashi R. Carboxypeptidase Y in sequence determination of peptides.-In: Meth. in Enzymol., Hew York: Academic Press, 1977, v.47, p.84-93.

73. ЮЗ. Стрельченок O.A., Сурвило JI.И., Дапелик Г.З., Свиридов О.В. Очистка и физико-химические свойства сексстероидсвязывающего глобулина плазмы крови человека.-Биохимия, 1983, т.48, J& 5, с.75$-762.

74. Liimpaphayon К., Lee С., Jacobson H.I., King Т.М. Estrogenгreceptor in human endometrium during the menstrual cycle and early pregnancy.-Amer. J. Obstetr. Gynecol., 1971, v.111, Ho.8, p.Ю64-Ю68.

75. Tulchinsky D. Chopra I.J. Competitive ligand-binding assay for measurement of sex hormone binding globulin (SHBG).-J. Clin. Endocr., 1965, v.26, Ho.1, p.71-78.

76. Стрельченок O.A., Жук Н.И., Свиридов О.В., Ахрем А.А. Молекулярные аспекты стероид-белковых взаимодействий. -Изв. Ж БССР Сер. хим. н., 1982, Ш 6, с.90-96.

77. Ashwell G., Morell A.G., Horowitz M.I., Pigraan W. The hepatic receptor for asialoglycoproteins.-In: "The Glycoconjugates", New York: Academic Press, 1978, v.11, p.231-234.

78. Nishida S., Matsumura S., Horino M., Oyama H., Okazaki K. Radioimmunoassay for steroid hormones. 1. Radioimmunoassay for plasma Cortisol.-Kawasaki Med. J., 1976, v.2, No.2, p.81-89.

79. Sandberg L., Porath J. Prepation of adsorbents for bio-specific affinity chromatography.-J. Chromatogr., 1974» v.90, No.1, p.87-98.

80. Smith L.B., Jubis W. A source of errors in equilibrium dialysis .-Steroids . , 1980, v.36, No.4, p.393-404.

81. Blondeau J.P., Rocker P., Rodel P. Competitive inhibition of specific steroid-protein binding: practical use of relative competition ratios for the deviation of equilibrium inhibition constants.-Steroids, 1978, v.32, No.5, p.563-575.

82. Akhrem A.A., Avvakumov G.V., Sviridov O.V., Strel chyonok O.A. Analysis of methyl glycosides as their trimethylsilyl ethers: on column re-N-acetylation and improved gas-liquid chromatographic separation.-J. Chromatogr., 1978, v.166, No.1,p.123-131 .

83. Bigelow C. On the average hydrophobicity of proteins and the relation between it and protein structure.-J. Theoret. Biol., v•16, No.2, p.187-211.

84. Schachman H.K. Ultracentrifugation, diffusion and visco-metry. In: Meth. in Enzymol., Hew York: Academic Press, 1957, v.4, p.32-103.

85. Gibbons L. Physico-chemical methods for the determination of the purity, molecular size and shape of glycoproteins. In: Glycoproteins, Hew York: Academic Press, 1972, v.4, p.31-140.

86. Michell R.H., Hawthorne J.H. The site of diphosphoinositi-de synthesis in rat liver.-Biochem Biophys. Res. Gommun., 1965, v.21, Ho.4, p.333-337.

87. Greenwood P.O., Hunter W.M., Glover J.S. The preparation 121of I-labelled human growth hormone of high specific radioactivity .-Biochem. J., 1963, v.89, Ho.1, p.114-123.

88. Стрельченок O.A., Аввакумов Г.В., Сурвило Л.И., Ахрем А.А. 0 роли специфического связывания стероидных гормонов глобулинами плазмы крови человека.-ДАН COOP, 1983, т.270, Ш2У с.478-480.

89. Bolton А.Е., Hunter W.M. Labeling of proteins to high specific radioactivities by conjugation to an iodine-125-containing acylating agent.-Biochem. J., 1973, v.133, Ho.3, p.529-538.

90. Sica V., Parikh J., Hola E., Puca J.A., Cuatrecassas P. Affinity chromatography and the purification of estrogen receptors.-J. Biol. Chem., 1973, v.298, Ho.8, p.6543-6558.

91. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable.-Analyt. Biochem., 1977, v.83, Ho.2, p.346-356.