Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Щукин, Владимир Николаевич

• Щукин, Владимир Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щукин, Владимир Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурно-функциональные особенности метанотрофов 9 1.1. Пути первичного метаболизма метанотрофов. Роль меди в окислении метана.

1. 2. Системы поглощения меди у метанотрофов. Метанобактин. 18 Глаьа 2. Структурно-функциональные особенности метанотрофов соленых и щелочных водоемов

2.1. Гало(алкало)фильные метанотрофы

2.2. Основные стратегии адаптации метанотрофов к высоким значениям солености и рН

Глава 3. Общая характеристика бактериальных Б-слоев

3.1. Выделение и химический состав Б-слоев

3.2. Функции 8-слоев

3.3. Способность Б-слоев к самосборке и практическое применение

3.4. Цитохром с пероксидазы бактерий 40 ЗЛ Поверхностные белки метанотрофов 42 3.6. Б-слои метанотрофов

Глава 4. Материалы и методы исследования

4.1. Объекты исследования и культивирование бактерий

4.2. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. а1саИрЫ1ит

4.3. Трипсинолиз белка в геле и экстракция пептидов

4.4. Экстрагирование поверхностных белков

4.5. Получение поликлональных антител

4.6. Разделение белков Б-слоя Мт. акаИркИит К)Ъ в градиенте сахарозы

4.7. Электрофорез в ДСН-ПААГ

4.8. Иммуноблоттинг 52 4.У. Выделение геномной ДНК

4.10. Выделение плазмидной ДНК

4.11. Выделение РНК

4.12. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

4.13. Векторетная ПЦР

4.14. Получение компетентных клеток и их трансформация

4.15. Клонирование и экспрессия гена 'согВ'

4.16. Очистка фрагментов ДНК

4.17. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК

4.18. Выделение рекомбинантных белков с помощью металлхелатной хроматографии

4.19. Определение концентрации белка

4.20. Получение инсерционных мутантов по генам 1согА' и 1согВ'

4.21. Микроскопические исследования

4.22. Определение включения 14СН4 суспензиями клеток

4.23. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

4.24. Определение активности ферментов

4.25. Определение пероксидазной активности в геле

4.26. Определиние состава жирных кислот

4.27. Определение содержания сахарозы и эктоина в клетках Мт. аІсаІірШІит

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Особенности ультраструктуры клеток галоалкалофильных метанотрофов

5.1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. аісаііркіїит

5.2.2. Идентификация 27-кДа белка

5.2.3. Идентификация 80-кДа белка

5.3. Изучение функции белка 'СогВ'

5.4. Изучение экспрессии генов 'согА ' и 'согВ'

5.5. Топология белка 'СогА'

5.6. Топология белка 'СогВ'

5.7. Получение и анализ инсерционных мутантов по генам 'согА ' и 'согВ'

5.7.1. Фенотипическая характеристика 'СогА'- мутанта Мт. аІсаІірЬіІит

5.7.2. Фенотипическая характеристика 'СогВ'- мутанта Мт. аІсаІірЬіІит

5.7.3. Уровни осмопротекторов и жирнокислотный состав мутантов

5.8. Идентификация 59-кДа белка

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z»

Актуальность проблемы. Клеточная оболочка бактерий является важным фактором их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. У аэробных метанотрофов, использующих метан в качестве источника углерода и энергии, клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану (Гальченко, 2001; Троценко, Хмеленина, 2008). Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов несколько отличается по химическому составу от таковой других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием предельно восстановленного газообразного субстрата - метана. Так, в наружной мембране термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath обнаружены специфические белки, в том числе мультигемовые цитохромы с типа, что указывает на окислительно-восстановительные процессы, происходящие на клеточной поверхности (Karlsen et al., 2011). Дополнительной особенностью ряда метанотрофов является наличие на внешней поверхности клеточной стенки упорядоченных гликопротеиновых S-слоев. У метанотрофов рода Methylomicrobium, включая галоалкалофилов Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. buryatense (5В, 5G, 6G, 7G), а также негалофильного нейтрофила Mm. album BG8, S-слои представлены монослоем чашевидных структур, уложенных в гексагональной (рб) симметрии (Jeffries, Wilkinson, 1987; Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). У Methylococcus capsulatus (штаммы Texas и 874) S-слои характеризуются тетрагональной (/>4) симметрией расположения белковых субъединиц (Тюрин с соавт., 1985; Сузина, Фихте, 1986). Однако функции этих структур у метанотрофов остаются не выясненными. Выяснение роли S-слоев у различных микроорганизмов связано в первую очередь с расшифровкой соответствующих генетических детерминант их белковых компонентов и выяснении связи S-слоев с другими поверхностными белками микроорганизма (Северина, 1995; Sara, Sleyu-, 2000).

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - идентификация и первичная характеристика доминирующих поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить основные поверхностные белки у Mm. alcaliphilum 20Z и определить нуклеотидные последовательности кодирующих их генов.

2. Изучить возможную связь основных поверхностных белков с S-слоями или другими структурами клеточной оболочки.

3. Выделить и охарактеризовать инсерционные мутанты Mm. alcaliphilum 20Z по поверхностным белкам, изучить основные свойства полученных мутантов.

Научная новизна- У Mm. alcaliphilum 20Z в составе ассоциированных с клеточной поверхностью белков обнаружены белки с молекулярными массами 27 и 80 кДа, проявлявшие высокую гомологию (>50% идентичности) с поверхностными белками 'СогА' и 'CorB' Methylomicrobium album BG8. Впервые выявлена локализация белка 'CorА' в основании чашевидных структур S-слоев и периплазматическая локализация 80-кДа белка, отнесенного к новому классу дигемовых цитохром с пероксидаз. Впервые получены инсерционные мутанты по генам 1согА' и 1согВ'. Показано участие 'СогА' в прикреплении S-слоев к клеточной поверхности метанотрофа. Мутант по гену 1согВ' рос на метане с высокой скоростью и имел более высокие активности ферментов окисления С i-соединений по сравнению с родительским штаммом. Показана коэкспрессия белков 'СогА' и 'СогВ' при низком содержании меди в ростовой среде. Кроме 'СогА' и 'СогВ' при биотинилировании целых клеток метились большая субъединица МДГ и белок, с м.м. 59 кДа, указывая на экспонирование на наружной поверхности клеточной стенки по крайней мере фрагментов этих белков. Полученные приоритетные данные по идентификации и характеристике поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z создают предпосылки дальнейших исследований их роли у галоалкалофильных метанотрофов.

Научно-практическое значение. Исследование поверхностных белков и кодирующих их генов у метанотрофов представляет интерес для продукции целевых белков посредством гетерологичной экспрессии. Это перспективно ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых минеральных средах. Кроме того, изучение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Разработанный метод получения мутантов Mm. alcaliphilum 20Z перспективен • в качестве эффективного инструмента при изучении функциональных генов/ферментов у метанотрофов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2007-2011гг), на I школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), на XIV международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на V и VII 7 молодёжной шкоде-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2011).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.

Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Дуде В.И., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Серебряковой М.Е., к.б.н. Зиганшину P.A., к.б.н. Решетникову A.C., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц., д.б.н. Осипову Г.А. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 ссылок, из них 18 на русском и 157 на английском языках, содержит 4 таблицы и 47 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Щукин, Владимир Николаевич

выводы

1. Из клеточных оболочек галотолерантного метанотрофа Methylomicrohium alcaliphilum 20Z впервые выделены поверхностные белки с молекулярными массами 27, 59, 67 и 80 кДа, определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Установлено, что белок с м.м. 67 кДа является большой субъединицей метанолдегидрогеназы. Поверхностный белок с м.м. 59-кДа предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны I типа.

2. Иммуноцитохимическими и электронно-микроскопическими методами доказана локализация белка 'СогА' с м.м. 27 кДа в основании чашевидных структур S-слоёв. Показано, что 80-кДа белок локализован в периплазме и идентифицирован как бактериальная дигемовая цитохром с пероксидаза нового семейства 'СогВ', впервые обнаруженная у Мс. capsulatus Bath.

3. Впервые получен мутант с инактивированным геном icorA', не способный расти на метане и лишенный S-слоёв при росте на метаноле. Мутация в гене 'согВ', кодирующем цитохром с пероксидазу, сопровождалась повышенной скоростью роста клеток на метане и высокими активностями ферментов окисления Ci-соединений.

4. Обнаружена котранскрипция генов, кодирующих 'СогА' и 'СогВ', в виде одной бицистронной мРНК в условиях низкого содержания меди в среде культивирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функции S-слоев, характерных для многих бактерий, до сих пор не выяснены (Sara, Sleytr, 2000). Для галотолерантных алкалофильных метанотрофов можно лишь предполагать роль S-слоев в качестве дополнительного ригидного каркаса клеточной стенки, предотвращающего лизис клеток в условиях изменяющегося осмотического давления содовых озер, подверженных пересыханию и флуктуациям солености. При этом отсутствие S-слоев у нейтрофильных галофильных изолятов, отнесенных к родам Methylobacter и Methylohalobius, не позволяет рассматривать S-слои как универсальный механизм, способствующий выживанию при высокой солености. Кроме того, S-слои в виде 'рюмок', напоминающих чашевидные структуры у галотолерантных представителей рода Methylomicrobium, описаны у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8 (Brantner et al., 2000). Более того, S-слои тетрагональной (р4) симметрии описаны у ряда штаммов негалофильного термотолерантного метанотрофа Me. capsulatus (Texas и 874) (Тюрин с соавт., 1985; Фихте, Сузина, 1986). В то же время, в литературе отсутствуют сведения о наличии S-слоев у физиолого-биохимически 'родственной' группы аэробных бактерий - метилотрофов, использующих в качестве источников углерода и энергии окисленные или замещенные производные метана, но не растущих на метане. Необходимой предпосылкой успешного выяснения функций S-слоев у микроорганизмов является идентификация основных поверхностных белков и кодирующих их генов. В данной работе идентификацию и выделение поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z проводили с использованием дансилирования и биотинилирования. Благодаря этим подходам удалось определить и наработать в препаративных количествах белки, экспонированные на наружной поверхности клеточной стенки, в числе которых доминируют белки S-слоев. В итоге были обнаружены четыре мажорных ассоциированных с клеточной поверхностью белка: 27, 59, 67 и 80 кДа.

Нами установлено, что поверхностный 27-кДа белок идентичный белку 'СогА', ране.; обнаруженному у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8, кодируется у Mm. alcaliphilum 20Z геном MEALZv42831. Методами иммунно-цитобиохимии с использованием антител к очищенному белку впервые продемонстрировано, что 'СогА' локализован в основании чашевидных структур S-слоев и ответственен за связывание S-слоев с наружной мембраной метанотрофа. С помощью полученного инсерционного мутанта доказана необходимость белка 'СогА' для роста клеток на метане, что, наряду с экспрессией этого белка при понижении содержания меди в среде, указывает на его важную роль в процессе окисления СН4 с участием медь

98 зависимой ММО. Проведенный нами Blast анализ выявил уникальность белка 'СогА' для метанотрофов, образующих S-слои, что косвенно подтверждает гипотезу о возможной функции 'СогА' в качестве элемента специфической транспортной системы ионов меди, например, в случае экранирования S-слоями доставки и транспортировки этого катиона посредством других переносчиков (например, сидерофором метанобактином).

80-кДа белок (ОРС MEALZv42832), обладающий перекись-разлагающей активностью, идентифицирован нами как дигемовая цитохром с пероксидаза нового класса. Наибольшую гомологию этот белок проявлял с поверхностным белком 'CorB' Mm. album BG8(Karlsen et al., 2010). Нами доказана периплазматическая локализация дигемовой цитохром с пероксидазы у Mm. alcaliphilum 20Z. Пространственная близость 'СогА' и 'СогВ' на клеточной поверхности, наряду с коэкспрессией данного тандема белков, подразумевает их совместное участие в гомеостазе ионов меди у Mm. alcaliphilum 20Z. Не исключено, что цитохром с пероксидаза окисляет ключевую аминокислоту белка 'СогА' (триптофан), от модификации которой зависит связывание ионов меди, как в случае гомолога этого белка (МорЕ) из Мс. capsulatus Bath (Karisen et al., 2011). Данное предположение основано на присутствии в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативных аминокислот - аналогов, формирующих сайты связывания меди (гистидин-132, гистидин-203 и триптофан-130) у Мс. capsulatus Bath.

Кроме того, постулировано, что в формировании S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z участвует 59-кДа белок, доминирующий в спектре поверхностных белков, хотя для okoi чательного утверждения требуются дополнительные исследования. В геноме Mm. alcaliphilum 20Z идентифицирован ген данного белка, который предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа, гомологичный представителям семейства TolC. Белки этого семейства охватывают почти все аспекты адаптации бактерий к различным стрессам и неблагоприятным условиям. В частности, о возможном участии TolC в формировании S-слоев косвенно свидетельствует присутствие соответствующего гомолога у Mm. album BG8 (ZP08486741.1).

Определение у метанотрофа первичной аминокислотной последовательности интегральных поверхностных белков, а также белковые компоненты S-слоев, идентификация соответствующих генов и выяснение условий их экспрессии позволит в дальнейшем расширить представление о белковом комплексе наружной клеточной мембраны - сурфацеоме (Karisen et al., 2011). Дальнейшие исследования белков сурфацеома метанотрофов представляют несомненный интерес для конструирования новых систем гетерологичной экспрессии целевых пептидов, экспонируемых поверхности рекомбинантных бактерий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щукин, Владимир Николаевич, 2012 год

1. Гайер Г. Электронная гистохимия. (1974) Москва. «Мир».

2. Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. Москва. ГЕОС. 500 с.

3. Дебабов В.Г. (2004) S-слои бактерий и архей как объект бионанотехнологий. Молекулярная биология. Т. 38. № 4. С. 578-591.

4. Ешинимаев Б.Ц., Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (2002) Физиолого-биохимические и цитологические особенности галоалкало-толерантного метанотрофа при росте на метаноле. Микробиология. Т. 71. № 5. С. 690-700.

5. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Баранова С.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1998) Новый умеренно галофильный метанотроф рода Methylobacter. Микробиология. Т. 67. № 4. С. 532-539.

6. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. (1999) Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. Микробиология. Т. 5. С. 689-697.

7. Решетников A.C., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (2004) Обнаружение генов биосинтеза эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий. Доклады РАН. Т. 396. №6. С. 831-834.

8. Северина JI.O. (1995) Бактериальные S-слои. Микробиология. Т. 64. № 6. С. 725-733.

9. Скулачев В.П. (1985) Натриевый цикл новый тип бактериальной энергетики. Биохимия. Т. 50. № 2. С. 179-183.

10. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. (1986) Ультраструктурная организация метанотрофных бактерий. Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 85 с.

11. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. (2008) Эстремофильные метанотрофы. Ред. В.Ф. Гальченко.Пущино. ОНТИ ПНЦ РАН. 206 с.

12. Тюрин B.C., Горская JI.A., Кафтанова A.C., Логинова Т.М., Михайлов A.M. (1985) Особенности тонкого строения Methylococcus capsulatus при различных условиях культивирования. Микробиология. Т. 21. № 6. С. 770-775.

13. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников A.C., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (2006) Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем. Труды Института микробиологии. Москва. Наука. Т. 13. С. 147-171. Ред. В.Ф. Гальченко.

14. Хмеленина В.Н., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. (1997) Физиолого-биохимические особенности галоалкалотолерантного метанотрофа. Микробиология. Т. 66. № 4. С. 447-453.

15. Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. (2000) Синтез органических осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами. Микробиология. Т. 69. № 4. С. 465-470.

16. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1996) Метанотрофные бактерии солёных водоёмов Украины и Тувы. Микробиология. Т. 65. № 5. С. 696-703.

17. Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (2006) Особенности метаболизма облигатных метанотрофов. Труды Института микробиологии. Москва. Наука. Т. 13. С. 24-44. Ред. В.Ф. Гальченко.

18. Хмеленина В.Н., Щукин В.Н., Решетников А.С., Мустахимов И.И., Сузина Н.Е., Ешинимаев Б.Ц., Троценко Ю.А. (2010) Структурно-функциональные особенности метанотрофов гиперсоленых и щелочных водоемов. Микробиология. Т. 79. № 4. С. 498-508.

19. АН Н., and Murrell J.С. (2009) Development and validation of promoter-probe vectors for the study of methane monooxygenase gene expression in Methylococcus capsulatus (Bath). Microbiology. V. 155. P. 761-771.

20. Anthony C. (1991) Assimilation of carbon by methylotrophs. Biotechnology. V. 18. P. 79109.

21. Anthony C., and Zatman L.J. (1964) The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. Biochem. J. V. 92. P. 614-621.

22. Atack J.M., and Kelly D.J. (2007) Structure, mechanism and physiological roles of bacterial cytochrome с peroxidases. Adv. Microb. Physiol. V. 52. P. 73-106.

23. Baani M., and Liesack W. (2008) Two isozymes of particulate methane monooxygenase with different methane oxidation kinetics are found in Methylocystis sp. strain SC2. Prot. Natl. Acad. Sci. USA. V. 105. P. 10203-10208.

24. Balasubramanian R., and Rosenzweig A.C. (2008) Copper methanobactin: a molecule whose time has come. Curr. Opin. Chem. Biol. V. 12. № 2. P. 245-249.

25. Baumeister W., and Lembcke G. (1992) Structural features of archaebacterial cell envelopes. J. Bioenerg. Biomembr. V. 24. P. 567-575.

26. Bergmann D.J, Zahn J.A., and DiSpirito A.A. (1999) High molecular- mass multi-c-heme cytochromes from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 181. P. 991-997.

27. Bergmeer H.U., Bergmeer J., and Grabl M. (1983) Methods of enzymatic analysis. 3rd edition. Verlag. Chemie GmbH. V. 2. P. 203-211.

28. Berson O., and Lidstrom M. (1997) Cloning and characterization of cor A, a gene encoding a copper-repressible polypeptide in the type I methanotroph, Methylomicrobium albus BG8. FEMS Microbiol. Lett. V. 148. P. 169-174.

29. Beveridge T.J., Pouwels P., Sara M., Kotiranta A., and Launatmaa K. (1997) Functions of S-layers. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 99-119.

30. Blakesley R.W., and Boezi J.A. (1977) A new staining technique for proteins in polyacrylamide gels using coomassie brilliant blue G250. Anal. Biochem. V. 82. № 2. P. 580-582.

31. Bodrossy L., Murrell J.C., Dalton H., Kalman M., Puskas L.G., and Kovacs K.L. (1995) Heat-tolerant methanotrophic bacteria from the hot-water effluent of a natural-gas field. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. P. 3549-3555.

32. Brantner C.A., Buchholz L.A., Remsen C.C., and Collins M.L. (2000) Isolation of intracytoplasmic membrane from the methanotrophic bacterium Methylomicrobium album BG8. Curr. Microbiol. V. 40. № 2. P. 132-134.

33. Callegari L., Riboli B., Sanders W., Coconelli P, Kok J., Venema G., and Morelli L. (1998) The S-layer gene of Lactobacillus helveticus CNRZ 892: cloning, sequencing and heterologous expression. Microbiology. V. 144. P. 719-726.

34. Chami M., Bayan N., and Peyret J.L. (1997) The S-layer protein of Corynebacterium glutamicum is anchored to the cell wall by its C-terminal hydrophobic domain. Mol. Microbiol. V. 23. P. 483-492.

35. Chauvaux S., Matuschek M., and Beguin P. (1999) Distinct affinity of binding sites for Slayer homologous domains in Clostridium thermocellum and Bacillus anthracis. J. Bacteriol. V. 181. P. 2455-2458.

36. Dalton H. (2005) The Leeuwenhoek Lecture 2000 the natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. V. 360. P. 1207-1222.

37. Dedysh S.N., Knief C., and Dunfield P.F. (2005) Methylocella species are facultatively methanotrophic. J. Bacteriol. V. 187. P. 4665-4670.

38. DiSpirito A.A., Zahn J.A., Graham D.W., Kim H.J., Larive C.K., Derrick T.S., Cox C.D., and Taylor A. (1998) Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V. 180. № 14. P. 3606-3613.

39. Dworkin J., and Blaser M.J. (1997) Molecular mechanisms of Campylobacter fetus surface layer protein expression. Mol. Microbiol. V. 26. P. 433-440.

40. Eichler J. (2001) Post-translational modification of the S-layer glycoprotein occurs following translocation across the plasma membrane of the haloarchaeon Haloferax volcanii. Eur. J. Biochem. V. 268. P. 4366-4374.

41. El Ghazouani A., Basle A., Firbank S.J., Knapp C.W., Gray J., Graham D.W., and Dennison C. (2011) Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorg. Chem. V. 50. № 4. P. 1378-1391.

42. Engelhardt H., and Peters J. (1998) Structure research on surface layers: a focus on stability, surface layer homology domains, and surface layer-cell wall interaction. J. Struct. Biol. V. 124. P. 276-302.

43. Erman J.E., and Vitello L.B. (2002) Yeast cytochrome c peroxidase: mechanistic studies via protein engineering. Biochim. Biophys. Acta Protein Struct. Mol. Enzymol. V. 1597. P.193-220.

44. Fernandez-Herrero L.A., Olabarria G., and Berengner J. (1997) Surface proteins and a novel transcription factor regulate the expression of the S-layer gene in Thermus thermophylus HB8. Mol. Microbiol. V. 24. P. 61-72.

45. Fitch M.W., Graham D.W., Arnold R.G., Agarwal S.K., Phelps P, Speitel G.E., and Georgiou G. (1993) Phenotypic characterization of copper-resistant mutants of Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V. 59. № 9. P. 2771-2776.

46. Fjellbirkeland A., Kleivdal H., Joergensen C., Thestrup H., and Jensen H.B. (1997) Outer membrane proteins of Methylococcus capsulatus (Bath). Arch. Microbiol. V. 168. P. 128133.

47. Fouet A., Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M., and Gounon P. (1997) Molecular characterization of the Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the major cell-associated antigen. Mol. Microbiol. V. 23. № 6. P. 1147-1155.

48. Fulop V., Ridout C.J., Greenwood C., and Hajdu J. (1995) Crystal structure of the di-haem cytochrome c peroxidase from Pseudomonas aeruginosa. Structure. V. 3. P. 1225-1233.

49. Graham D.W., Kim H.J., Galeva N., Larive C.K., and Alterman M. (2005) Purification and physical-chemical properties of methanobactin: a chalkophore from Methylosinus trichosporium OB3b. Biochemistry. V. 44. № 13. P. 5140-5148.

50. Graham D.W., and Kim H.J. (2011) Production, isolation, purification, and functional characterization of methanobactins. Methods Enzymol. V. 495. P. 227-245.

51. Gruber K., and Sleytr U.B. (1991) Influence of an S-layer on surface properties of Bacillus stearothermophilus. Arch. Microbiol. V. 156. P. 181.

52. Handel E. (1968) Direct microdetermination of sucrose. Analytical biochemistry. V. 22. P. 280-283.

53. Helland R., Fjellbirkeland A., Karlsen O.A., Ve T., Lillehaug J., and Jensen H.B. (2008) An oxidized tryptophan facilitates copper binding in Methylococcus capsulatus-secreted protein MopE. J. Biol. Chem. V. 283. № 20. P. 13897-904.

54. Holmes A.J., Costello A., Lidstrom M.E., and Murrell J.C. (1995) Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol. Lett. V. 132. P. 203-208.

55. Howorka S., Sara M., Wang Y., Kueni B, Sleytr U.B., Lubitz W., and Bayley H. (2000) Surface-accessible residues in the monomeric and assembled forms of a bacterial surface layer protein. J. Biol. Chem. V. 275. P. 37876-37886.

56. Hynonen U., Westerlund-Wikstrom B., and Palva A. (2002) Identification by flagellum display of an epithelial cell and fibronectin-binding function in the SlpA surface protein of Lactobacillus brevis. J. Bacteriol. V. 184. P. 3360-3367.

57. Jarrell K.F., Jones G. M., Kandiba L., Nair D.B., and Eichler J. (2010) S-layer glycoproteins and flagellins: reporters of archaeal posttranslational modifications. Archaea. P. 948-956.

58. Jeffries P., and Wilkinson J.F. (1978) Electron microscopy of the cell wall complex of Methylomonas albus. Arch. Microbiol. V. 119. № 2. P. 227-229.

59. Johnson P.A., and Quayle J.R. (1964) Microbial growth on Ci-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 93. P.281-290.

60. Karlsen O.A., Larsen O., and Jensen H.B. (2010) Identification of a bacterial di-heme cytochrome c peroxidase from Methylomicrobium album BG8. Microbiology. V. 10. P. 37119-37128.

61. Karlsen O.A., Larsen O., and Jensen H.B. (2011) The copper responding surfaceome of Methylococccus capsulatus Bath. FEMS Microbiol. Lett. V. 323. № 2. P. 97-104.

62. Karlsen O.A., Lillehaug J.R., and Jensen H.B. (2008) The presence of multiple c-type cytochromes at the surface of the methanotrophic bacterium Methylococcus capsulatus (Bath) is regulated by copper. Mol. Microbiol. V. 70(1). P. 15-26.

63. Kay W.W., Phipps B.M., Ishiguro E.E., Olafson R.W., and Trust T.J. (1984) Surface layer virulence A-proteins from Aeromonas salmonicida strains. Can. J. Biochem. Cell Biol. V. 62. №11. P. 1064-1071.

64. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., and Gottschalk G. (1999) Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch Microbiol. V. 172. P. 321-329.

65. Knapp C.W., Fowle D.A., Kulczycki E., Roberts J.A., and Graham D.W. (2007) Methane monooxygenase gene expression mediated by methanobactin in the presence of mineral copper sources. PNAS. V. 104. № 29. P. 12040-12045.

66. Koval S.F. (1997) The effect of S-layers and cell surface hydrophobicity on prey selection by bacterivorous protozoa. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 138-142.

67. Kuen B., Koch A., Asenbauer E., Sara M., and Lubitz W. (1997) Molecular characterization of the second S-layer gene sbsB of Bacillus stearothermophilus PV72 expressed by oxidative stress. J. Bacteriol. V. 179. P. 1664-1670.

68. Kuhlmann A.U., and Bremer E. (2002) Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. Appl.Environ.Microbiol. V.68. №2. P. 772-783.

69. Kwon M., Chong S., Han S., and Kim K. (2003) Oxidative stresses elevate the expression of cytochrome c peroxidase in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. V. 1623. P. 1-5.

70. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V. 227. P. 680-685.

71. Lamb D.C., Jackson C.J., Warrilow A.G., Manning N.J., Kelly D.E., and Kelly S.L. (2007) Lanosterol biosynthesis in the prokaryote Methylococcus capsulatus: insight into the evolution of sterol biosynthesis. Mol. Biol. Evol. V. 24. №8. P. 1714-1721.

72. Leibovitz E., Lemaire M., and Miras I. (1997) Occurence and function of a common domain in S-layer and other exocellular proteins. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P.127-133.

73. Lemaire M., Miras I., Gounon P., and Béguin P. (1998) Identification of a region responsible for binding to the cell wall within the S-layer protein of Clostridium thermocellum. Microbiology. V. 144. P. 211-217.

74. Lidstrom M.E. (1988) Isolation and characterization of marine methanotrophs. Antonie Van Leeuwenhoek. V. 54. № 3. P. 189-199.

75. Lorea G., Torino M.J., Font de Valdez G., and Ljungh A. (2002) Lactobacillus express cell surface proteins which mediate binding of immobilized collagen and fibronectin. FEMS Microbiol. Letters. V. 206. P. 31-37.

76. Lortal S., Rouault A., Cesselin B., and Sleytr U.B. (1992) Paracrystalline surface layers of dairy propionibacteria. Appl Environ Microbiol. V. 59. № 8. P. 2369-2374.

77. Lupas A., Engelhardt H., and Peters J. (1994) Domain structure of the Acetogenium kivui surface layer revealed by electron crystallography and seguence analysis. J. Bacteriol. V. 176. P. 1224-1233.

78. Marmur J.A. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. V. 3. P. 208-214.

79. McDonald I.R., and Murell J.C. (1997) The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. № 8. P. 3218-3224.

80. Merkx M., and Lippard S.J. (2002) Why OrfY Characterization of mmoD, a long overlooked component of the soluble methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Biol. Chem. V. 277. P. 5858-5865.

81. Messner P., and Christian R. (1990) Characterization of the surface layer glycoprotein of Clostridium symbiosum HB25. J. Bacteriol. V. 172. P. 2576-2583.

82. Messner P., and Sleytr U.B. (1992) Crystalline bacterial cell surface layers. Adv. Microbiol. Physiol. V. 3. P. 213-275.

83. Messner P., Steiner K., Zarschler K., and Schaffer C. (2008) S-layer nanoglycobiology of bacteria. Carbohydr. Res. V. 343. № 12. P. 1934-51.

84. Minard K.I., and McAlister-Henn L. (2001) Antioxidant function of cytosolic sources of NADPH in yeast. Free Radic. Biol. Med. V. 31. P. 832-843.

85. Muller D.J., Baumeister W., and Engel A. (1999) Controlled unzipping of a bacterial surface layer with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 1317013174.

86. Moll D., Huber C., and Schlegel B. (2001) S-layer streptavidin fusion proteins as template for nanopatterned molecular arrays. Proc. Natl. Acad. USA. V. 99. P. 1464614651.

87. Morton J.D., Hayes K.F., and Semrau J.D. (2000) Effect of copper speciation on whole-cell soluble methane monooxygenase activity in Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. P. 1730-1733.

88. Murrell J.C., and Radajewski S. (2000) Cultivation-independent techniques for studying methanotroph ecology. Res. Microbiol. V. 151. P. 807-814.

89. Murrell J.C., Gilbert B., and McDonald I.R. (2000) Molecular biology and regulation of methane monooxygenase. Arch. Microbiol. V. 173. P. 325-332.

90. Myronova N., Kitmitto A., Collins R.F., Miyaji A., and Dalton H. (2006) Three-dimensional structure determination of a protein supercomplex that oxidizes methane to formaldehyde in Methylococcus capsulatus (Bath). Biochemistry. V. 45. P. 11905-11914.

91. Navarre W.W., and Schneewind O. (1999) Surface protein of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell envelope. Microbiol. Mol. Biol. Rev. V. 63. P. 174-182.

92. Neubauer A., Pum D., and Sleytr U.B. (1996) Fibre-optic sensor using enzyme membrane with 2D crystalline structure. Biosensors Bioelectronics. V. 113. P. 317-325.

93. Niegowski D., and Eshaghi S. (2007) The Cor A family: structure and function revisited. Cell. Mol. Life Sci. V. 64. P. 2564-2574.

94. Nomellini J.F., Kupsu S., Sleytr U.B., and Smit J. (1997) Factors Controlling In Vitro Recrystallization of the Caulobacter crescentus paracrystalline S-Layer. J. Bacteriol. V. 179. P. 6349-6354.

95. Olabarria G., Carrascosa J.L., and Berenguer J. (1996) A conserved motif in S-layer proteins is involved in peptidoglycan binding in Thermus thermophilus. J. Bacteriol. V. 178. P.4765-4772.

96. Palva A. (1997) Molecular biology of the Lactobacillus brevis S-layer gene (slpA). FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 83-88.

97. Paul G., and Wieland F. (1987) Sequence of the halobacterial glycosaminoglycan. J. Biol. Chem. V. 262. P. 9587-9593.

98. Paul G., Lompeich F., and Wieland F. (1986) Asparaginyl-N-acetylgalactosamine. Linkage unit of halobacterial glycosaminoglycan. J. Biol. Chem. V. 261. P. 1020-1024.

99. Peters J. (1996) A hyperthermostable protease of the subtilisin family bound to the surface layer of the archaeon Staphylothermus marinus. Curr. Microbiol. V. 6. P. 739-749.

100. Plekhanov A.Y. (1996) Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel. Anal. Biochem. V. 239. P. 110-111.

101. Prior S.D., and Dalton H. (1985) The effect of copper ions on membrane content and methane monooxygenase activity in methanol-grown cells of Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. V. 131. P. 155-163.

102. Pum D., and Sleytr U.B. (1999) The application of bacterial S-layers in molecular nanotechnology. Trends Biotechnol. V. 17. P. 8-12.

103. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., and Trotsenko Y.A. (2010) Ectoine biosynthesis genes identification in moderate halophilic alphaproteobacteria Methylarcula marina. Mikrobiologia. V. 79. № 6. P. 859-860.

104. Rothfuss H., Lara J.C., Schmid A.K. and Lindstrom M.E. (2006) Involvement of the Slayer proteins Hpi and SlpA in the maintenance of cell envelope integrity in Deinococcus radiodurans R1. Microbiology. V. 152. P. 2779-2787.

105. Sambrook J., and Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 3rd edn Cold Spring Harbor Laboratory. New-York.

106. Sara M. (2001) Conserved anchoring mechanisms between crystalline cell surface S-layer proteins and secondary cell wall polymers in Gram-positive bacteria.Trends Microbiol. V. 9. P. 47-49.

107. Sara M., and Sleytr U.B. (2000) S-Layer proteins. J. Bacteriol. Y.182. P. 859-868.

108. Sara M., Pum D., and Sleytr U.B. (1992) Permeability and charge-dependent adsorption properties of the S-layer lattice from Bacillus coagulans E38-66. J. Bacteriol. V. 174. № 11. P.3487-3493.

109. Schacterle G. R., and Pollack R.L. (1973) A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biologic material. Anal Biochem. V. 51. № 2. P. 654-655.

110. Schneitz C., Nuotioo L., and Lounatmaa K. (1992) Adhesion of Lactobacillus acidophylus to avian intestinal ephitelia cell mediated by the crystalline bacterial cell surface layer (Slayer). Appl. Bacteriol. V. 74. P. 290-299.

111. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J., Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R., Murrell J.C., and Lidstrom M.E. (1995) Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. J. Bacteriol. V. 177. №. 11. P. 3071-3079.

112. Semrau J.D., DiSpirito A.A., and Yoon S. (2010) Methanotrophs and copper. FEMS Microbiol. Rev. V. 34. P. 496-531.

113. Sieburgh J.M. Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M., and Laux D. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixed layer of the deep ocean Methylomonas pelagica sp. nov. Curr. Microbiol. V. 14. P. 285-293.

114. Silver S. (1969) Active transport of magnesium in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 62. P. 764-771.

115. Sleytr U.B., and Beveridge T.J. (1999) Bacterial S-layers. Trends. Microbiol. V. 7. P. 253260.

116. Sleytr U.B., and Sara M. (1997) Bacterial and archaeal S-layer proteins: structure-function relationships and their biotechnological applications. Trends Biotechnol. V. 15. P. 20-26.

117. Sleytr U.B., and Schuster B. (2000) S-layer-supported lipid membranes. J. Biotechnol. V. 74. № 3. P. 233-254.

118. Smid B.J., and Messner P. (1996) Toward selective elicitation Of Tnl-controlled vaccination responses:vaccine application of bacterial surface layer proteins.

119. Biotechnology. V. 44. P. 225-231.

120. Smith T.J., Slade S.E., Buron N.P., Murrell J.C., and Dalton H. (2002) Improved system for protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V. 68. P. 5268-5273.

121. Sokolov A.P., and Trotsenko Y.A. (1995) Methane consumption in (hyper) saline habitats of Crimea (Ukraine). FEMS Microbiol. Lett. V. 18. № 4. P. 299-304.

122. Sorokin D.Y., Jones B.E., and Kuenen J.G. (2000) A novel obligately methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment. Extremophiles. V. 4. P.145-155.

123. Stafford G.P, Scanlan J., McDonald I.R, and Murrell J.C. (2003) RpoN, mmoR and mmoG, genes involved in regulating the expression of soluble methane monooxygenase in Methylosinus trichosporium OB3b. Microbiology. V. 149. P. 1771-1784.

124. Stein L.Y., Sayavedra-Soto L.A., Hommes N.G., and Arp D.J. (2000) Differential regulation of amoA and amoB gene copies in Nitrosomonas europaea. FEMS Microbiol. Lett. V. 192. №2. P. 163-168.

125. Stewart F.J., Newton I.G., and Cavanaugh C.M. (2005) Chemosynthetic endosymbioses: adaptations to oxic-anoxic interfaces. Trends Microbiol. V. 13. P. 440-448.

126. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., and Lidstrom M.E. (1999) Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus (Bath). Microbiology. P. 145. P. 1235-1244.

127. Storz G., and Imlay J.A. (1999) Oxidative stress. Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 188-194.

128. Takeguchi M., Miyakawa. K., and Okura I. (1998) Purification and properties of particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Mol. Catal. Chem. V. 132. P. 145-153.

129. Takeguchi M., Miyakawa. K., and Okura I. (1999) The role of copper in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Mol. Catal. Chem. V. 137. P. 161-168.

130. Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol, and Evol. V. 24. P. 15961599.

131. Thiemann B., and Imhoff I.F. (1991) The effect of salt on the lipid composition of Ectothiorhodospira. Arch. Microbiol. V. 156. № 5. P. 376-384.

132. Trinder P. (1976) Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann. Clin. Biochem. V. 6. P. 24-27.

133. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., and Higgins D.G. (1997) The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. V. 24. P. 4876^1882.

134. Thorne K.J., Oliver R.C., Maclntyre D.E., and Gordon J.L. (1977) Endotoxin-induced platelet aggregation and secretion. Changes in plasma membrane proteins. J. Cell Sci. V. 28. P. 225-236.

135. Trotsenko Y.A., and Murrell J.C. (2008) Metabolic aspects of obligate aerobic methanotrophy. Adv. App. Microbiol. V. 63. P. 183-229.

136. Van der Palen C.J., Slotboom D.J., Jongejan L., Reijnders W.N., Harms N., Duine J.A., and van Spanning R.J. (1995) Mutational analysis of mau genes involved in methylamine metabolism in Paracoccus denitrificans. Eur. J. Biochem. V. 230. P. 860-871.

137. Genome sequence of the haloalkaliphilic methanotrophic bacterium Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. J. Bacteriol. V. 194. № 2. P. 551-552.

138. Wang Y., Graichen M.E., Liu A., Pearson A.R., Wilmot C.M., and Davidson V.L. (2003) MauG, a novel di-heme protein required for tryptophan tryptophylquinone biogenesis. Biochemistry. V. 42. P. 7318-7325.

139. Wang Y., Li X., Jones L.H., Pearson A.R., Wilmot C.M., and Davidson V.L. (2005) MauG-dependent in vitro biosynthesis of tryptophan tryptophylquinone in methylamine dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. V. 127. P. 8258-8259.

140. Walker J.M. (1994) The dansyl method for identifying N-terminal amino acids. Methods Mol. Biol. V. 32. P. 321-328.

141. Walker S.G., Smith S.H., and Smit H.J. (1992) Isolation and comparison of the paracrystalline surface layer proteins of freshwater caulobacters. J. Bacteriol. V. 174. P.

142. Wösten M.M. (1998) Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiol. Rev. V. 22. P. 127-150.

143. Xin J-Y., Cui J-R., Hu X-X, Li S-B., Xia C-G., Zhu L-M., and Wang Y-Q. (2002) Particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium is a copper-containing enzyme. Biochem. Biophys. Res. Communit. V. 295. P. 182-186.

144. Yanisch-Perron C., Vieira J., and Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene. V. 33.

145. Yimga T.M., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., and Liesack W. (2003) Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl. Environ. Microbiol. V. 69. P. 593-602.

146. Zahn J.A., Bergman D.J., Kunz J.M., and DiSpirito A.A. (2001) Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 183. P. 832-6840.

147. Zgurskaya H.I., Krishnamoorthy G., Ntreh A., and Lu S. (2011) Mechanism and function of the outer membrane channel Tol C in multidrug resistance an1783-1792.1. P. 103-119.enterobacteria. Microbiology. V. 2. P. 189-192.