ВЫДЕЛЕНИЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Харченко Наталья Васильевна

• Харченко Наталья Васильевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Харченко Наталья Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. История использования кисломолочных продуктов

2.1.1. Продукты молочнокислого брожения

2.2. Влияние пробиотиков на организм человека

2.2.1. Восстановление нормальной микробиоты

2.2.2. Лечение инфекционных процессов, вызванных Helicobacter pylori

2.2.3. Пробиотики - регуляторы иммунной системы

2.2.4. Пробиотики и регуляция холестерина

2.2.5. Антимикробные вещества, синтезируемые пробиотиками

2.2.6. Требования, предъявляемые к пробиотическим препаратам

2.2.7. Классификация пробиотических препаратов

2.2.8. Перспективы совершенствования пробиотических препаратов

2.3. Бифидобактерии

2.3.1. Морфология и экология бифидобактерий

2.3.2. История создания таксономии бифидобактерий и её современный вид

2.3.3. Физиология бифидобактерий

2.3.3.1. Температурные интервалы роста

2.3.3.2. Отношение к кислороду

2.3.3.3. Углеводный метаболизм бифидобактерий

2.3.3.4. Устойчивость к действию желчи

2.3.4. Способы хранения микроорганизмов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Культуры бактерий, использованные в данном исследовании

3.2. Питательные среды

3.3. Приготовление растворов и красителей

3.4. Выделение чистых культур бифидобактерий

3.5. Молекулярные методы идентификации бифидобактерий

3.5.1. Выделение ДНК

3.5.2. Родоспецифическая полимеразная цепная реакция

3.5.3. Электрофорез ДНК

3.5.4. Секвенирование фрагментов генов

3.6. Хранение бифидобактерий

3.6.1. Лиофилизация бактериальных клеток

3.6.1.1. Предварительная подготовка культур перед лиофилизацией

3.6.1.2. Способы хранения культур после лиофилизации

3.6.2. Использование в качестве защиты пептидных факторов и культуральной жидкости Luteococcus casei

3.6.2.1. Выделение реактивирующего фактора (РФ)

3.6.2.2. Определение выживаемости бифидобактерий после лиофилизации и последующего хранения в отсутствии и в присутствии РФ

3.7. Анализ устойчивости бифидобактерий к желудочному стрессу

3.8. Анализ устойчивости бифидобактерий к кишечному стрессу

3.9. Определение устойчивости бифидобактерий к кислороду

3.10. Определение продуктов метаболизма бифидобактерий при помощи

газовой хроматографии

3.11. Влияние бифидобактерий на условно патогенные штаммы

3.12. Определение устойчивости бифидобактерий к тетрациклину

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ

4.1. Идентификация бифидобактерий по морфологическим признакам .. 68 4.1.1. Генетическая идентификация бифидобактерий

4.2. Разработка способа длительного хранения и изучение выживаемости

бактерний рода Bifidobacterium

4.2.1. Лиофилизация бифидобактерий

4.2.2. Влияние на выживаемость бифидобактерий реактивирующего фактора (РФ)

4.3. Сохранность пробиотических свойств после длительного хранения

4.3.1. Определение устойчивости бифидобактерий к желудочному стрессу

4.3.2. Определение устойчивости бифидобактерии к кишечному стрессу

4.3.3. Определение устойчивости бифидобактерий к действию кислорода

4.4. Определение продуктов метаболизма бифидобактерий

4.5. Влияние бифидобактерий на рост условно-патогенных штаммов

4.6. Определение устойчивости бифидобактерий к тетрациклину

5. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

бад биологически активные добавки

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

КМ МГУ коллекция микроорганизмов МГУ

КЖ культуральная жидкость (супернатант)

КОЕ колониеобразующие единицы

ЛЖК летучие жирные кислоты

МИК минимальная подавляющая концентрация антбиотика

ОКИ острая кишечная инфекция

ОМГС обезжиренное молоко с глюкозой и сахарозой

РФ реактивирующий фактор (пептид)

ТФУ трифторуксусная кислота

ФР физиологический раствор

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

1. ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы рода Bifidobacterium широко распрастранены в природе и являются основнымт представителями микробиоты человека и животных. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека представляет собой комплексную экосистему, представленную более чем 500 бактериальными видами. Совокупность всех микробиоценозов человека или животных рассматривают как экстракорпоральный орган, количество клеток в котором в 10-100 раз больше общего числа клеток всех тканей и органов хозяина (Шендеров, 2001). Поддержание нормального биоценоза человеческого организма, в частности и функциональной активности микробиоты в различных отделах пищеварительного тракта, всецело зависит от нормального физиологического состояния организма (Воробьев, 1997; Минушкин, 2010). Клиницисты считают крайне важной необходимостью восстановления при дисбиотических состояниях собственной микробиоты кишечника, в первую очередь бифидобактерий и лактобактерий (Ардатская, 2003; Ардатская, 2006). Для коррекции и восстановления численности и качественного состава кишечной микробиоты, особое место на протяжении довольно длительного времени занимают пробиотики - живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию его микроэкологического статуса (Ардатская, 2006). Большое количество пробиотиков содержат в своем составе бифидобактерии. Данные микроорганизмы являются самыми многочисленными представителями полезной микробиоты. Вырабатывая молочную и уксусную кислоту, они препятствуют размножению патогенных микроорганизмов, стимулируют

перистатику кишечника. Колонизация микроорганизмов начинается с момента рождения и зависит от способа рождения, а также от вида питания. При нарушении микробиоценоза пробиотики применяют перорально и как правило в лиофилизированном виде, либо в составе молочных и ряда других продуктов. Однако выживаемость пробиотических микроорганизмов в ЖКТ экспериментальных животных составляет 0.01% от их исходной численности при пероральном поступлении (Давлов, 2013).

Широко известны и описаны в большом количестве пробиотические свойства бифидобактерий (Kailasapathy, 2000; Lui et al., 2016; Singhi et al., 2016), но важно пополнять библиотеку новыми штаммами, которые обладали бы этими свойствами, а также имели стабильный рост при длительном хранении. Широко известен полиморфизм бифидобактерий. Не так часто можно наблюдать клетки, которые демонстрируют образование классической вилочковидной «бифидо» - формы. Они часто похожи на прямые палочки, коккобациллы, образуют скопления и даже цепочки клеток. Часто ученые сталкиваются с трудностью их культивирования в лабораторных условиях и выделения их в чистую культуру. При идентификации любого штамма на первом этапе описываются физиолого-биохимические характеристики. К сожалению, у бифидобактерий нет специфических признаков, которые с высокой вероятностью могут выделить из ряда культур. Поэтому необходимы методы анализа, которые могли бы позволить с высокой точностью определить бифидобактерии. По литературным данным различные исследования предлагают новые альтернативные генетические мишени для идентификации бифидобактерий (Ventura et al., 2004; Пиксасова, 2009). Однако не всегда данных методов хватает в полной мере. Для точности определения бифидобактерий необходим анализ 16S pPHK.

После определения бифидобактерий появляется следующий трудный вопрос. Каким образом достичь максимального хранения культур? По литературным данным используются различные методы хранения, такие как высокие температуры замораживания (Грачева и др., 2011), хранение в

лиофилизированном состоянии с различными криопротекторами (Tindall, 2007), использование стабилизированной активированной воды в метастабильном состоянии (Дворников, 2005). Совокупность различных комбинаций методов хранения позволяем получить высокую выживаемость при длительном хранении. Таким образом, разработка, с одной стороны, простого, а с другой - надежного, недорогого метода хранения штаммов является одним из приоритетных направлений прикладной микробиологии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ВЫДЕЛЕНИЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ.»

Цель работы

Выделить новые перспективные штаммы бифидобактерий, обладающие высокой жизнеспособностью и сохраняющие важные пробиотические свойства при долговременном хранении, для дальнейшего конструирования пробиотических препаратов и использования их в пищевой промышленности.

Задачи

1) Выделить из природных источников устойчиво растущие культуры бифидобактерии и определить методами молекулярно-генетического типирования их видовую принадлежность.

2) Адаптировать методы хранения МКБ для бифидобактерий по подбору эффективных концентраций криопротекторов и показателям температурных режимов лиофилизации.

3) Оценить динамику сохранения устойчивости выделенных штаммов бифидобактерий к желудочному, кишечному и окислительному стрессам при их долговременном (6-12 мес.) хранении.

4) Определить антимикробную активность и антибиотикорезистентность выделенных штаммов бифидобактерий.

5) На основании совокупности полученных результатов провести отбор наиболее перспективных штаммов бифидобактерий как основы для пробиотических препаратов и добавок к пищевым продуктам.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. История использования кисломолочных продуктов

С давних времен у людей пользуются популярностью кисломолочные напитки, которые получают путем сквашивания молока различными видами молочнокислых бактерий. Народы Греции, Рима, Индии, Ближнего Востока и Закавказья уже в далекой древности употребляли кисломолочные напитки, которые получали на основе коровьего, овечьего или ослиного молока. Только значительно позже были научно обоснованы диетические и лечебные свойства этих продуктов. Отечественный физиологог и микробиолог Илья Ильич Мечников впервые провел исследования по возможности востановления кишечной микробиоты с помощью молочнокислых бактерий. У кисломолочных продуктов усвояемость выше, чем у молока, так как они воздействуют на секреторную деятельность желудка и кишечника, в результате чего железы пищеварительного тракта интенсивнее выделяют ферменты, ускоряющие переваривание пищи. Диетические свойства кисломолочных продуктов объясняют воздействием на организм человека микроорганизмов и веществ, получаемых при сквашивании молока (молочной кислоты, спирта, углекислого газа, бактериоцинов и витаминов).

Все кисломолочные продукты делят на две группы: получаемые в результате молочнокислого брожения (простокваша и др.), и получаемые в результате смешанного (молочнокислого и спиртового) брожения (кефир, кумыс и др.). В некоторых продуктах спиртовое брожение проявляется слабо, в них накапливаются лишь следы спирта (ацидофилин).

2.1.1. Продукты молочнокислого брожения

Содержание в кисломолочных напитках молочной кислоты и образующих ее молочнокислых бактерий дало основание И.И.Мечникову впервые в мире создать научную теорию о целесообразности применения в пищу таких напитков. Занимаясь проблемой долголетия, И.И.Мечников

пришел к убеждению, что с преждевременной старостью можно и нужно бороться. Ученый обратил внимание на то, что многие жители Болгарии отличаются большой продолжительностью жизни (McFarland, 2015). По его мнению, это долголетие обусловлено потреблением кисломолочного напитка «кисело млеко» - болгарской простокваши. В зависимости от культур молочнокислых бактерий различают простоквашу обыкновенную, мечниковскую, южную, украинскую (ряженка), ацидофильную и варенец. Обыкновенную простоквашу готовят на чистых культурах молочнокислых стрептококков. Она имеет нежный сгусток с освежающим, приятным, слабокислым вкусом. Мечниковская простокваша отличается от обыкновенной более плотным сгустком и кисловатым вкусом. Это объясняется тем, что ее готовят из чистых культур болгарской палочки и молочнокислых стрептококков. Южная простокваша имеет консистенцию сметаны, слегка вязкую, вкус кисловатый, щиплющий, освежающий. При приготовлении, кроме молочнокислых стрептококков и палочек, используют дрожжи (Степаненко, 2002).

2.2. Влияние пробиотиков на организм человека

Желудочно-кишечный тракт человека включает в себя свыше 1014 клеток микроорганизмов. В составе ЖКТ более 1000 бактериальных видов. Основное разнообразие бактерий находится в толстом кишечнике. У новорожденных первые дни ЖКТ стерильный, и его колонизация происходит на 3-4 сутки (Faseb, 2015). Видовое соотношение колонизации кишечника у новорожденных зависит от способа рождения - естественное или в результате кесарева сечения, типа питания - кормление грудью или замена грудного вскармливания, географическое положение - развивающаяся или развитая страна (Fanaro et al., 2003). Кишечная палочка и стрептококки первыми заселяют кишечник младенца. По завершению формирования микробного состава доминирующей популяцией оказываются бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium и бактероидов. Сопутствующая популяция

представлена кишечной палочкой, эубактериями, фузобактериями, энтерококками. В остаточную популяцию входят дрожжеподобные грибы, бациллы, клостридии, протеи и др. Бифидобактерии составляют 95% от общей популяции микроорганизмов в кишечнике у новорожденных при вскармливаливании грудным молоком (Favier et al., 2002; Кешишян, 2013). Численность Bifidobacterium в кишечнике значительно уменьшается с возрастом человека. В преклонном возрасте количество бифидобактерий уменьшается до 3-6% от фекальной биоты (Satokari et al., 2003). Наличие Bifidobacterium в ЖКТ связывают с рядом преимуществ для здоровья, некоторые из которых будут обсуждены более подробно ниже. Оценивая значимость бифидобактерий и ряда других микроорганизмов, учеными были созданы пробиотические препараты.

Согласно опредедению ВОЗ, пробиотик - это живые микроорганизмы, примененные в адекватных количествах, оказывающие оздоровительный эффект на организм человека. Термин «пробиотик» впервые был предложен Вергио, который в своей монографии «Anti- und Probiotika» проводил сравнение различных соединений, обладающих как антимикробным, так и полезным для микробиоты кишечника действием (Шендеров и др., 2005; Маевская, 2010). Лилли и Стилвелл в 1965 году применяли этот термин для обозначения микробных метаболитов, выделяемых одними микроорганизмами, способных оказывать положительный эффект на рост других (Gupta et al., 2015). Чтобы подчеркнуть микробную природу пробиотиков, в 1989-м году этот термин был переопределён, как «живые микробные пищевые добавки, которые положительно влияют на организм животного-хозяина, благодаря улучшению его кишечного баланса». Примерно такое же определение было предложено Хаавенаром и Хьюисом в 1992-м году: «Пробиотики - это живые моно- или смешанные культуры бактерий, употребление которых оказывает положительное влияние на организм хозяина (человека и животных), благодаря улучшению качества естественной флоры» (Ozen et al., 2015).

2.2.1. Восстановление нормальной микробиоты

Полезное действие пробиотиков - это результат некоторого комплекса механизмов воздействия бактерий на организм хозяина, которые отличаются в зависимости от штамма и области воздействия (рис.1). Эти механизмы включают (РгакаБИ е1 а1., 2011):

1) поддержание баланса микробиоты кишечника за счёт синтеза антимикробных веществ;

2) борьбу с патогенными микроорганизмами и токсинами за место прикрепления к стенкам кишечника, а также за питательные вещества;

3) стимуляцию слизеобразования, стабилизацию кишечного барьера, улучшение кишечного транспорта, метаболизма;

4) иммуномодуляцию за счёт повышения врождённого иммунитета и предотвращения спровоцированных патогенами воспалительных процессов;

5) регуляцию иммунного ответа.

Рис.1. Механизмы, с помощью которых пробиотики способствуют улучшению здоровья организма-хозяина (Prakash et al., 2011).

Нарушение нормальной микробиоты сопровождается развитием гнилостных и болезнетворных микроорганизмов, которые, в свою очередь, выделяют ядовитые для организма человека продукты при разложении пищи. В результате развивается диарея. Инфекционная диарея - это серьезная мировая проблема, иногда приводящая к летальному исходу. По данным ВОЗ количество смертей от инфекционной диареи в год достигает нескольких миллионов случаев. В то время как преобладающее большинство смертей приходится на случаи заболевания детей развивающихся стран, тем не менее, по оценкам эпидемиологов 30% популяции даже развитых стран страдают от диарей, вызванных пищевыми отравлениями. Препараты B.bifidum в комплексе со Streptococcus thermophiles, B.breve в комбинации с Lactobacillus casei предназначены для борьбы с данной проблемой. В результате применения пробиотиков возникает конкуренция между микроорганизмами препарата и кишечного тракта за важнейшие питательные вещества и места прикрепления на клетках кишечника. На остальную микробиоту пробиотики воздействуют благодаря выделению короткоцепочечных жирных кислот и бактериоцинов.

2.2.2. Лечение инфекционных процессов, вызванных Helicobacter pylori

Грамотрицательные бактерии Helicobacter pylori являются возбудителем гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. Учеными были проведены эксперименты in vitro на животных моделях, в которых показано, что молочнокислые бактерии могут ингибировать рост этих микроорганизмов, снижать активность уреазы, необходимой данному виду бактерий как средство защиты от кислотности окружающей среды (Яковенко с соавт., 2006). По мнению многих исследователей, лечение подобных инфекционных процессов возможно с помощью заместительной микробной терапии пробиотическими препаратами (Чернега и др., 2000; Хавкин и др., 2005; Кляритская и др., 2006). В этом направлении получено немало положительных результатов, показывающих действенность

лактобактерий и бифидобактерий. Среди бактериоцинов пробиотиков сильный эффект в отношении H. pylori проявляли лактицин А164 и лактицин ВН5. Эффект этих бактериоцинов оказался сильнее по сравнению с низиномА, педиоцином РО2 и лейкоцином К (Ермоленко, 2009).

2.2.3. Пробиотики - регуляторы иммунной системы

Одним из важнейших свойств пробиотиков является их способность влиять на иммунную систему человека. Оно хорошо изучено. Регуляция иммунитета - это ключевое средство, с помощью которого пробиотики действуют на весь организм хозяина. Это свойство имеет большое значение при инфекционных и раковых заболеваниях, вакцинации, аллергиях, аутоиммунных и воспалительных процессах, влиянии на дендритные клетки (Drakes et al., 2004; Jonkers et al., 2012; You et al., 2014). Исследования на животных показали, что эффект пробиотиков зависит от выбранного штамма, дозы, продолжительности приёма и иммунного статуса хозяина.

Работа кишечного иммунитета включает в себя систему сигналов с множеством взаимодействий между комменсалами, чужеродными антигенами и эукариотическими клетками (рис.2). Последние представлены эпителиальными клетками, фагоцитами (моноциты, макрофаги и нейтрофилы), дендритными и другими клетками, которые принадлежат к неспецифическому барьеру, а также слизеобразующими клетками, такими как бокаловидные клетки и клетки Панета, которые выделяют антимикробные пептиды и синтезируют дефензины (Rook et al., 2005). Приобретённый иммунитет включает антитела и клеточно-опосредованный ответ. Он характеризуется своей специфичностью и памятью. Эпителиальные клетки слизистой кишечника очень важны в координировании защитных механизмов. Они отвечают на внешние сигналы, такие как продукты бактериального метаболизма и компоненты их клеточных стенок и ДНК. Происходит это благодаря выработке хемокинов и цитокинов - наибольшей по числу и разнообразию группой медиаторов иммунного ответа, которые

регулируют инициацию, сохранение и разрешающую способность врождённого и приобретённого иммунных ответов (Shi et al., 2007).

подключичная вена

грудной проток

периферические лимфоузлы

Рис.2. Функциональная анатомия запуска иммунного ответа под воздействием кишечных антигенов (http://jem.rupress.org/cgi/content-nw/full/203/3/497/FIG2).

Показано, что пробиотики могут модулировать активность всех вышеперечисленных клеток иммунной системы. Они взаимодействуют с эпителиальными и иммунными клетками кишечника, причём,

предпочтительно с теми, которые относятся к врождённому иммунитету, укрепляя, тем самым, этот барьер (Забодалова, 2006). Микроорганизмы, включая комменсалов и пробиотики, запускают эпителиальный ответ (выделение хемокинов), который привлекает клетки врождённого иммунитета к эпителию и слизистой оболочке кишечника.

Для запуска иммунных сигналов пробиотические микроорганизмы должны начать взаимодействовать с эпителиальными и иммунными клетками, ассоциированными с кишечником. Иммунологической чувствительностью к пробиотикам обладают специфические клетки, расположенные над Пейеровыми бляшками, и клетки, выстилающие стенки кишечника. Расположенные под эпителиальными дендритные клетки также способны производить отбор антигенов прямо из содержимого кишечника, составляя важное звено между содержимым просвета кишечника и иммунной системой (Soccol et al., 2014).

Бактерии и белковые антигены широко представлены в кишечнике. Антигенные пептиды попадают в кровоток через притоки воротной вены печени или захватываются дендритными клетками в субэпителиальной области Пейеровых бляшек, затем, по отходящим лимфатическим сосудам, переносятся в кишечный лимфатический узел. Бактериальные клетки также могут захватываться дендритными клетками. Они стимулируют выработку IgA в Пейеровых бляшках (Kawai et al., 2011).

2.2.4. Пробиотики и регуляция холестерина

Показано, что ожирение возникает в результате сбоя регуляции организмом потребления и хранения энергии. Установлено, что у тучных людей филогенетически изменен состав микробиоты. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из главных причин смертности среди людей в разных странах мира. Повышение количества липидов в крови является основной причиной этих заболеваний (Забодалова, 2006).

Современные исследования показывают, что применение диет с молочнокислыми продуктами или продуктами, обогащенными пробиотическими микроорганизмами, обладает способностью к снижению уровня холестерина (Петухов, 2004)

Бифидобактерии создают слабокислую среду, что способствует снижению роста E.coli, клостридий, условно-патогенной, а также патогенной микробиоты. Ацидификация содержимого толстой кишки ведет к нейтрализации активности бактериальной 7-а-дегидроксилазы, что обусловливает снижение литогенных свойств желчи. Бифидобактерии секретируют деконъюгазы, которые превращают таурин- и глицинсодержащие амиды желчных кислот в труднорастворимые осадки, связывающие толстокишечный холестерин и обеспечивающие экскрецию его с каловыми массами. Холестерин не всасывается в кровь, что способствует снижению гиперхолестеринемии (Ooi, 2010).

У пациентов, употребляющих кисломолочные продукты, наблюдалось значительное снижение уровня холестерина (Ooi, 2010). Бактерии-пробиотики могут расщеплять неусваиваемые углеводы и образовывать короткоцепочечные жирные кислоты в кишечнике. В результате ингибируется синтез холестерина в печени и/или перераспределение холестерина из плазмы в печень. Таким образом, снижается общий уровень жиров в крови. Отдельные пробиотические штаммы могут расщеплять желчные кислоты и препятствовать всасыванию холестерина из кишечника (FAO, 2001; Lin et al., 2004; Roberfroid, 2007).

Можно выделить следующее пути воздействия пробиотических микроорганизмов на снижение уровня холестерина: (Головин и др., 2014).

- холестерин включается в метаболизм бактерий в ходе их роста и развития;

- путем деконъюгации желчных кислот с помощью гидролазы желчных кислот происходит образование деконъюгатироанных желчных жирных кислот и как следствие:

а) вывод из организма деконъюгированных желчных солей и использование холестерина на восполнение утраченных желчных кислот;

б) потеря способности солюбилизировать холестерин и другие липиды пищи, снижение усвоения пищевого холестерина организмом;

в) копреципитация деконъюгированных желчных кислот с холестерином, экскреция их из организма;

- продукты брожения молочнокислых бактерий ингибируют ферменты синтеза холестерина в организме человека;

- перевод холестерина в нерастворимую форму копростанола под действием холестерин-редуктазы кишечной микробиоты, что приводит к экскреции холестерина из организма;

- пробиотики составляют конкуренцию за место прикрепления к клеточным стенкам.

В результате проявляются следующие эффекты: препятствие проникновению холестерина и продуктов его превращения в кровеносное русло, стимуляция его переработки в желчные кислоты, вывод из организма и замедление процесса его синтеза.

2.2.5. Антимикробные вещества, синтезируемые пробиотиками

Некоторые пробиотики обладают способностью синтезировать ряд антимикробных веществ. Это короткоцепочесные жирные кислоты (молочная, уксусная и пропионовая), угнетающие рост микроорганизмов, за счет понижения рН среды. Это неорганическое соединение - перекись водорода. Самыми высокоорганизованными антимикробными веществами, синтезируемыми бифидобактериями, являются бактериоцины и бактериоциноподобные вещества. Бактериоцины устойчивы к высоким температурам, сохраняют активность в широком диапазоне рН. Данные вещества не имеют цвета и запаха. Бактериоцин способен образовывать поры в мембранах при низких концентрациях. Данные соединения подвержены диструкции со стороны протеолетических ферментов. Бактериоцины

рассматривают перспективной альтернативой антибиотиков (Cotter et al., 2013). Бактериоцины обладают активностью к близкородственным штаммам продуцента (Cleveland et al., 2001; Kemperman et al., 2003; Kemperman, Jonker et al., 2003; De Vuyst et al., 2007). Существуют бактериоцины со спектром действия на гнилостные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Основными широко используемыми в прикладных исследованиях в настоящее время бактерицинами являются: низин, бифидоцин Б, бифилонг, бифидин, плантарицин, лактоцин, диацетин и др. (Похиленко, 2011).

Бактериоцины разделены на три основные категории: (Ермоленко,

2009)

1) Лантибиотики. Это небольшие пептиды (<5 кДа), в их составе присутствуют редкие серосодержащие аминокислоты, такие как лантионин и Р-метиллантионин. Они синтезируются на рибосомах и подвергаются посттрансляционной модификации.

2) Не содержащие лантионин термоустойчивые пептиды. Данный вид синтезируется на рибосомах, а далее происходит минимальная посттрансляционная модификация. В данной группе выделяют три подвида: одинаковые пептиды, двупептидные бактериоцины, тиол-активированные пептиды.

3) Термоустойчивые белки.

Существуют бактериоцины с липидными и углеводными компонентами.

2.2.6. Требования, предъявляемые к пробиотическим препаратам

Современные пробиотики должены соответствовать следующим критериям (Бельмер, 2004; Хавкин, 2006):

1) содержать микроорганизмы, пробиотический эффект которых доказан в рандомизированных контролируемых исследованиях;

2) обладать стабильной клинической эффективностью;

3) быть непатогенным и нетоксичным, не вызывать побочных эффектов при длительном применении;

4) оказывать положительное влияние на организм хозяина (например, увеличивать резистентность к инфекциям);

5) обладать колонизационным потенциалом, т. е. сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного эффекта (быть устойчивым к низкой кислотности, органическим и желчным кислотам, антимикробным токсинам и ферментам, продуцируемым патогенной микрофлорой);

6) быть стабильным и жизнеспособными при длительном сроке хранения.

Принципиальные требования предъявляются к штаммам бактерий, на основе которых создаются пробиотики (Бельмер, 2004; Хавкин, 2006). Они должны:

1) быть выделены у здоровых людей и идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам;

2) иметь генетический паспорт;

3) обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

4) не должны угнетать нормальный микробиоценоз;

5) быть безопасными для людей, включая иммунологическую безопасность;

6) производственные штаммы должны быть стабильными по биологической активности и удовлетворять технологическим требованиям.

2.2.7. Классификация пробиотических препаратов

В основу существующих классификаций положено либо количество микроорганизмов, входящих в препарат, либо их родовая принадлежность, либо наличие дополнительных компонентов в составе препарата. В соответствии с этим, пробиотики разделяются на монокомпонентные (монопробиотики), монокомпонентные сорбированные, поликомпонентные

(полипробиотики), комбинированные (синбиотики); бифидосодержащие, лактосодержащие (включающие лактобациллы), колисодержащие (содержащие кишечную палочку) и состоящие из споровых бактерий и сахаромицетов (табл.1). Признана также классификация, в которой препараты, нормализующие кишечную микробиоту, разделяют на четыре поколения (Щербаков с соавт., 1999). К I поколению относят монокомпонентные препараты: «Колибактерин», «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин». Они содержат 1 штамм бактерий. Препараты II поколения («Бактисубтил», «Биоспорин» и «Споробактерин») основаны на неспецифических для человека микроорганизмах и являются самоэлиминирующимися антагонистами. Их могут применять для лечения тяжелых форм дисбактериоза, но обязательно в сочетании с бифидо- и лактосодержащими пробиотиками, необходимыми для нормализации микробиоценоза кишечника. Препараты III поколения включают поликомпонентные пробиотики, содержащие несколько симбиотических штаммов бактерий одного вида («Ацилакт», «Аципол») или разных видов («Линекс», «Бифиформ»), с взаимоусиливающим действием. От препаратов I поколения они отличаются более сбалансированным составом и являются новой вехой в лечении дисбактериозов. Особенно преимущества препаратов III поколения проявляются у больных с суб- и декомпенсированным дисбактериозом кишечника. К IV поколению относятся препараты иммобилизованных на сорбенте бифидосодержащих пробиотиков («Бифидумбактерин форте», «Пробифор»). Сорбированные бифидобактерии эффективно колонизируют слизистую оболочку кишечника, оказывая более выраженное протективное действие, чем несорбированные аналоги (Феклисова, 2015).

Таблица 1.

Характеристика пробиотических препаратов и их состав

Группа Название Штамм Миним. возраст Показания

Монокомпонент ные, I поколение «Бифидумбакте рин» B.bifidum 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза 1 стадии, ОКИ

«Биобактон» L.acidophilus 0

«Лактобакте рин» Lplantarum 8ЯЛ3 0

«Колибакте рин» E.coli М-17 6 месяцев При затяжном колите

Монокомпонент ные сорбированные, IV поколения «Бифидумакте рин форте» B.Ыfidum сорбированный на активирован ном угле 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза 1-3 стадии, ОКИ

Поликомпонент ные, III поколение «Ацилакт» L.acidophilus 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза 1-3 стадии, ОКИ

«Бифиформ» B.longum E.faecium лактулоза 0

«Бификол» B.bifldum E.coli М-17 6 месяцев При колитах у взрослых, детям по строгим показаниям

«Линекс» L.acldophllus E.faeclum B.lnfantls 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза 1-2 стадии, ОКИ

Комбинирован ные, II поколение «Аципол» 4 штамма L.acldophllus + полисахарид кефирного грибка 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза 1-3 стадии, ОКИ

«Бифилиз» B.blfldum + лизоцим 0 Для профилактики и лечения

дисбактериоза 1-3 стадии, для иммунной коррекции

«Биофлор» E.coli М-17 экстракт овощей, прополис 3 года Для профилактики и лечения дисбактериоза, ОКИ. Преимущественно у взрослых

Прбиотики из бацилл и непатогенных грибов «Биоспорин» B.subtiШs, B.licheniformis 1 год Элиминационн ый курс при дисбактериозе 2-3 стадии, ОКИ

«Бактисубтил» Бациллы №5832 3 года

«Энтерол» Sacharomyces boulardii взрослым

Метаболические «Хилак форте» Метаболиты кишечной микробиоты 0 Для профилактики и лечения дисбактериоза, ОКИ.

Наиболее популярными являются биологически активные добавки

(БАД): «Наринэ» и «Примадофилюс». Среди БАД существуют формулы для различных возрастных групп, в том числе специальные детские пробиотики (табл.2. Справочник: лекарственные средства; Энциклопедия лекарств, 2004; Лыкова, 2005; Справочник лекарств, гомеопатии, БАД, 2009).

Таблица 2.

Пробиотические БАД, зарегистрированные и используемые в России

(Лыкова, 2005)

Название Состав С какого возраста принимается

БАД Российского производства

«Аципол» в капсулах L.acidophilus и полисахарид кефирных грибков 0

«Бифидумбактерин» B.bifidum с лактозой и без С 6 месяцев

«Биобанктон» L.acidophilus 0

«Биовестин» B.adolescentis MC 42, B.bifidum, Lacobacillus plantarum 8RA3 С года

«LB-комплекс» L.plantarum 8RA3, L.fermentum 39, B.bifidum 791 0

«Ламинолакт» Enterococcus faecium, соевый белок, фруктовый порошок, морская капуста, растительные добавки направленного действия: черника, морковь, эхинацея, подорожник, мед и др. -

«Нарине» L.acidophilus ЕР 317/402 0

«Нормо флорины/Эуфло Рины» В и L (жидкие) бифидобактерии или лактобактерии и продукты их метаболизма 0

«Полибактерин» B. bifidum, B. breve, B.longum, B.adolescentis, L.plantarum, L.fermentum, L.acidophilus С 3 лет

БАД зарубежного производства

«Ацидо Бак» комплекс молочнокислых и бифидобактерий и морковный порошок С 12 лет

«Ацидофилис Бифидум Плюс», «Ацидофиллус лактобациллин», «Ацидо филис», «Ацидофилус» и др L.acidophilus, B.bifidum, B.infantis, аскорбиновая кислота, ацетилцистеин в основном, взрос лым, некоторые - с 4 или с 12 лет

«Бифидофилус Флора B.longum, L.acidophilus С 12 лет

Форс»

«Вайтадофилюс» L.acidophilus, яблочный порошок, яблочные хлопья С 3 лет

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Харченко Наталья Васильевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1) Амерханова А.М. Роль пробиотических микроорганизмов в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины и возможности повышения эффективности препаратов на их основе. / Новые лекарственные средства. 2007. №4. С. 4-7.

2) Амерханова А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-симбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности. / Диссертации на соискание степени доктора биологических наук. Москва: ФБУН МНИИЭМ им.Габричевского. 2009. 280 с.

3) Ардатская М.Д. Пре- и пробиотики в коррекции микроэкологических нарушений кишечника. / Фарматека. 2011. № 12. С. 62-69.

4) Ардатская М.Д. Минушкин О.Н. Пробиотики в лечении функциональных заболеваний кишечника. / Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2012. № 3. С. 106-113.

5) Балабушевич Н.Г., Сухоруков Г.Б., Ларионова Н.И. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и меламин формальдегида. / Вестник МГУ. Сер.2. 2002. Т. 43. С. 370-376.

6) Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Получение и характеристика полиэлектролитных микрочастиц с белком. / Биохимия. 2004. Т. 69. №7. С. 930-936.

7) Бельмер С.В., Щиголева Н.Е., Хавкин А.И. Пробиотическая коррекция антибиотик-ассоциированного дисбактериоза кишечника у детей клинические наблюдения. / Клиническая микробиология антимикробной химиотерапии. 2010. Т.12. № 4. С 347-352.

8) Богданович Т.М., Страчунский Л.С. Мупироцин: Уникальный антибиотик для местного применения. / КМАХ. 1999. Т.1. № 1. С. 57-65.

9) Бондаренко В.М. По поводу нового подхода к классификации фармакопейных лекарственных пробиотических препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального

питания. / Фарматека. 2007. №2. С. 62-64.

10) Бухарин О.В., Семенов А. В., Черкасов С.В. Характеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии. / Клиническая микробиология антимикробной химиотерапии. 2010. Т. 12. № 4. С. 347-352.

11) Воробьев А.А. Использование больших доз пробиотика Бифидумбактерина форте в лечении ОРВИ у детей. / Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. №5. С. 43-46.

12) Высеканцев И.П., Бабишен О.М., Марценюк В.Ф. Биологические свойства криоконсервантных препаратов, иммобилизированных на энтеросорбенте. / Проблемы криобиологии. 2012. Т. 22. №3. С. 278.

13) Грачев Н.М., Бондаренко В.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дисбактериоза кишечника. / Инфекционные болезни. 2004. №2. С. 53-58.

14) Головин М.А., Ганина В.И., Машенцева Н.Г. Холестерин-редуцирующие пробиотические бактерии в молочной продукции. / Молочная промышленность. 2014. №5. С. 46-47.

15) Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовский И.А. Выживаемость микроорганизмов в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. / Кишечная микрофлора. 2013. № 2. С. 4-8.

16) Дворников В.М. Технология сохранения жидких концентратов бифидобактерий и лактобацилл на основе стабилизированной активированной низкоминерализованной воды в метастабильном состоянии. / Ижевск: «Мир - РТ». 2005. № 37. С. 5.

17) Демаков В.А., Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю. Иммобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты. / Биотехнология. 2008. №2. С. 30-45.

18) Домотенко Л.В., Шепелин А.П. Бифидум-среда для выделения и культивирования бифидумбактерий. / Инфекция и иммунитет. 2014. Т.4. №3. С. 279-283.

19) Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками. / Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11. 2009. №1. С. 157-167.

20) Забодалова Л.А. Функциональные пищевые продукты - путь к здоровью. / Переработка молока: технология, оборудование, продукция. 2006. №11. С. 8-11.

21) Кадетов В.В., Терентьев А.Н., Высеканцев И.П., Анисинов Б.И., Морозов Л.Н., Милютин А.В. Методические аспекты биологической безопасности при консервировании биологического материала для микробиологических исследований. / Клиническая лабораторная диагностика. 1999. №8. С. 22-24.

22) Кешишян Е., Бердникова Е. Особенности формирования микрофлоры кишечника у детей первого года жизни. Новый пробиотик Линекс детский: показания к применению. / Практика педиатра. 2013. С. 51-54.

23) Кляритская И.Л., Кривой В.В. Влияние пробиотиков на эффективность антихеликобактерной терапии при H.pylori-ассоциированной пептической язве и хроническом гастрите. / Современная гастроэнтерология. 2007. №1. С. 60-62.

24) Коваленко Г.А. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. / Биотехнология. 2006. №1. С. 76-83.

25) Мазанкова Л.Н., Шевелева С.А., Лыкова Е.А. Пробиотики на современном этапе - клинические подходы и области применения. Пособие для врачей. М.: Вопросы современной педиатрии. 2005. 40 с.

26) Мамедова Л.Н. Клинико-патогеническое обострение оптимизации диагностики и лечения воспалительных заболеваний кишечника. / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Ростов-на-дону: РГМУ. 2013. 27 с.

27) Мечников И.И.Этюды Оптимизма. / М.: Наука. 1988. 328 с.

28) Минушкин О.Н., Елизаветина Г.А., Ардатская М.Д. Нарушение баланса микрофлоры и ее коррекция. / Эффективная фармакотерапия. 2013. №41. С. 4-8.

29) Молокеев А.В. Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме и способ его получения. / Пат. №2317089 РФ. 2007.

30) Нетрусов А.И., Егоров М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. Учебное пособие для вузов. / М.: Академия. 2005. С. 610.

31) Петухов В.А. Нарушения функций печени и дисбиоз при липидном дистресс-синдроме Савельева: современный взгляд на проблему. / 2004. Т. 6. №6.

32) Пиксасова О.В. Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М.: МГУ имени М.В.Ломоносова. 2009. 23 с.

33) Справочник: лекарственные средства, медикаменты в интернет аптеке. Электронный источник: http: //www.yarapteka.ru/modules. php?name=spr.

34) Справочник лекарств, гомеопатии, БАД. Электронный источник: http://www.allergist.ru.

35) Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. / Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы. 1991. С. 81-159.

36) Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. / М.: ООО Все для Вас - Подмосковье. 1999. 415 с.

37) Феклисова Л.В., Ющук Н.Д. Результаты многоцентровых клинико-лабораторных исследований назначения сорбированного поликомпонентного препарата-пробиотика детям и взрослым при инфекционной патологии. / Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2015. №1. С. 66-76.

38) Хавкин А. И., Жихарева Н. С., Рачкова Н. С. Современные принципы терапии язвенной болезни. / Лечащий Врач. №4. 2005. С. 24-27.

39) Харченко Н. В., Чердынцева Т. А., Нетрусов А.И. Новые подходы для выделения штаммов бифидобактерий, их молекулярная диагностика и оценка пробиотического потенциала. / Микробиология. 2015. Т. 84 №3. С. 1-8.

40) Хорошилова Н.В. Терапевтическая эффективность пробиотиков. / Новая аптека. Аптечный ассортимент. 2009. №6. С. 100-102.

41) Чернега Н. В.Терапевтическая эффективность нового пробиотика «Бифи-форм» при хронических заболеваниях желудка и 12-перстной кишки у детей. / Перинатология и педиатрия. №4. 2000. С. 64-66.

42) Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология: некоторые итоги и перспективы исследований. / Вестник РАМН. 2005. №12. С. 13-17.

43) Шендеров Б.А., Минушкин О.Н., Елизаветина Г.А., Ардатская М,Д. Нарушение баланса микрофлоры и ее коррекция. / Эффективная фармакокинетика. 2013. № 41. С. 4-8.

44) Энциклопедия лекарств: Регистр лекарственных средств России (11-е издание). / М.: РЛС. С. 139.

45) Яковенко Э.П., Аникина Е.В., Яковекно А.В., Агафонова Н.А., Ковтун А.В., Кограманова А.В., Иванов А.Н. Инновационные мгноговидовые мультиштаммовые пробиотики в клинической практике. / Лечащий врач. 2014. №5. С. 77-81.

46) Anderson K., Johansson A., Sheehan T., Mott B., Corby-Harris V. Draft genome sequences of two Bifidobacterium sp. from the honey bee (Apis mellifera). / Gut Pathogen. 2013. V. 5. Р. 1-3.

47) Barrett E., Ross R., Fitzgerald G., Stanton C. Rapid screening method for analysing the conjugated linoleic acid production capabilities of bacterial cultures. / Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. Р. 2333-2337.

48) Begley M., Hill C., Gahan C. Bile salt hydrolase activity in probiotics. / Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. Р. 1729-1738.

49) Biavati B., Vescovo M., Torriani V. Bifidobacteris: histoty, ecology, physiology and applications. / Ann Microbiol. 2000. V. 50. Р. 117-131.

50) Biavati B., Mattarelli P., Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. The Family Bifidobacteriaceae. / The Prokaryotes. 2006. V. 3. P. 322-382.

55) Day J. Cryopreservation of microalgae and cyanobacteria. / Methods Mol Biol. 2007. V. 368. P. 141-151.

56) Cleveland J, Montville T, Nes I. Chikindas ML. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. / Int. J. Food Microbiol. 2001. V. 71. P. 20.

57) Champagne C., Garder N., Roy D. Bile salt hydrolase activity in probiotics. / Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 72. P. 1729-1738.

58) Chambaud I. Survival to gastric and intestinal stress. / Centre Daniel Carasso. Danone research. 2007.

59) Chen Y. Immobilized Isochrysis galbana (Haptophyta) for longterm storage and applications for feed and water quality control in clam (Meretrix lusoria) cultures. / J. Appl. Phycol. 2003. V. 15. P. 439-444.

60) Cotter P., Ross R., Hill C. Bacteriocins - a viable alternative to antibiotics. / Nat. Rev. Microbiol. 2013. V. 11. P. 95-105.

61) Cotter P., Hill C., Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH. / Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 429-453.

62) Dehnert J. Untersuchungen über die Gram positive Stuhlflora. / Brustmilchkinder. Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infectionskr. 1957. S. 66-79.

63) De Vuyst L, Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. / J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 13. P. 194-199.

64) Downes J., Mantzourani M., Beighton D., Hooper S., Wilson M.J., Nicholson A., Wade W.G. Scardovia wiggsiae sp. nov., isolated from the human oral cavity and clinical material. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61 P. 25-29.

65) Drakes M., Blanchard T., Czinn S. Bacterial probiotic modulation of dendritic cells. / Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 3299-3309.

66) Egan M., O'Connell Motherrway M., Ventura M. Metabolism of sialic acid by Bifidobacteria breve UCC2003. / App. Microbiol. 2014. V. 80. P. 4414-4426.

67) Favier C., Vaughan E., de Vos W., Akkermans D. Molecular monitoring of succession of bacterial communites in human neonates. / App. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. Р. 219-226.

68) Health and nutrititional propertie of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. / Probiotics in food. 2001.

Электронный источник: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0512e/a0512e00.pdf.

69) Fanaso S., Chierici R., Guerrini P., Viqi V. Intestinal microflora in early infancy: composition and development. / Acta Paediatr Suppl. 2003. V. 94. P. 48-55.

70) Faseb J. The role of the gut microbiota in metabolic health. / J. Faseb. 2015. V. 14. Р. 673-784.

71) Greenwood J., Pickett M. Transfer of Haemophilus vaginalis Gardner and Dukes to a new genus, Gardnerella: G. vaginalis (Gardner and Dukes) comb. nov. / Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. Р. 170-178.

72) Gueimonde M., Garrigues C., van Sinderen D., de los Reyes-Gavilán C.G., Margolles A. Bile-Inducible Efflux Transporter from Bifidobacterium longum NCC2705, Conferring Bile Resistance. / Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75(10). Р. 3153-3160.

73) Gupta V., Garg R. Probiotics. / Indian J. Med Microbiol. 2015. V. 27. P. 202-209.

74) Holland D. Generic index of the commoner forms of bacteria. / J. Bacteriol. 1920. V. 5. Р. 191-299.

75) Huys G., Vancanneyt M., D'haene K., Falsen E., Wauters G., Vandamme P., Alloscardovia omnicolens gen. nov., sp. nov., from human clinical samples. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. Р. 1442-1446.

76) Jian W., Dong X. Transfer of Bifidobacterium inopinatum and Bifidobacterium denticolens to Scardovia inopinata gen. nov., comb. nov., and Parascardovia denticolens gen. nov., comb. nov., respectively. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. Р. 809-812.

77) Kemperman R, Kuipers A, Karsens H, Nauta A, Kuipers O, Kok J. Identification and characterization of two novel clostridial bacteriocins, circularin A and closticin. / Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1589-1597.

78) Khaskheli G., Zuo F., Yu R., Chen S. Everexpression of small heat shoch protein enhances heat- and salt-stress tolerance of Bifidobacterium longum NCC2705. / Curr. Microbiol. 2015. V. 71. P. 8-15.

79) Kheadr E., Dabour N., Le Lay C., Lacroix C., Fliss I. Antibiotic susceptibikity profile of bifidobacteria as affected by oxgall, acid, and hydrogen peroxide sress. / Antimicrob agent chemother. 2007. V. 51. P. 169-174.

80) Kim G., Brochet M., Lee B., Cloning and characterization of a bile salt hydrolase (bsh) from Bifidobacterium adolescentis. / Biotechnol. Lett. 2005. V. 27. P. 817-822.

81) Klijn A., Mercenier A., Arigoni F., 2005. Lessons from the genomes of bifidobacteria. / FEMS Microbiol. V. 29. P. 491-509.

82) Leahy S., Higgins D., Fitzgerald G., van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria. / J.Appl Microbiol. 2005. V. 98. P. 1303-1315.

83) Lu L., Mu J., Sloan S., Miner P., Gardner J. Exploring the physiologic role of human gastroesophageal reflux by analyzing teme-series data from 24-h gastric and esophageal pH recordings. / Phys. Reports. 2014. V. 2. V. 7. P. 12051.

84) Len A., Harty D., Jacques N., Proteome analysis of Streptococcus mutans metabolic phenotype during acid tolerance. / Microbiology. 2004. V. 150. P. 1353-1366.

85) Lin Y-G, Meijer G., Vermeer M., Trautwein E. Soy protein enhances the cholesterol-lowering effect of plant sterol esters in cholesterol-fed hamsters. / J. Nutr. 2004. V. 134. P. 143-148.

86) Marsalek B., Rojickova-Padrtova R. Long-term maintenance of alga strains for use in biomassays and biotechnology. / Arch. Hydrobiol. Suppl. Algol. Stud. 1988. V. 124. P. 121-136.

87) Masco L., Van Hoord K., De Brandt E., Swings J., Huys G. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products. / J. Antimicrob. Chemother. 2006. V. 58. P. 85-94.

88) Matsumoto M., Ohishi H., Benno Y. H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance. / Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 93. P. 109-113.

89) McFarland L. From ask to yogurt: the history, development, and current use of probiotics. / Clin Infect Dis. 2015. V. 15. P. 85-90.

90) Maus J., Ingham S., Employment of stressful conditions during culture production to enhance subsequent cold- and acid-tolerance of bifidobacteria. / J. Appl. Microbiol. 2003. V. 95. P. 146-154.

91) Milani C., Duranti S., Lugli G., Bottacini F. Comparative genomics of Bifidobacterium animalis subsp. lactis reveals a strict monophyletic bifidobacterial taxon. / Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79. P. 4304-4315.

92) Moubareck C., Gavini F., Vaugien L., Butel M., Doucet-Populaire F. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. / J. Antimicrob. Chemother. 2005. V. 55. P. 38-44.

93) Mitsuoka T. Comparative studies on bifidobacteria isolated from the alimentary tract of man and animals. / Zentral Bacteriol. Parasitenkd. Infectionskr. 1969. P. 52-64.

94) Meile L., Rohr L., Geissmann T., Herensperger M., Teuber M. Characterization of the D-xylulose-5-phosphate/D-fructose-6-phosphate-phosphoketolase gene (xfp) from Bifidobacterium lactis. / J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2929-2936.

95) Nebra Y., Blanch A.R. A New Selective Medium for Bifidobacterium. / Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5173-5176.

96) Noriega L., Gueimonde M., Sánchez B., Margolles A., de los Reyes-Gavilán C. Effect of the adaptation to high bile salt concentrations on glycosidic activity, survival at low pH and cross-resistance to bile salts in Bifidobacterium. / Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 94. P. 79-86.

97) Oberg Ts., Ward R.E., Broadbent JR. 2013. Genetic and physiological responses of Bifidobacterium animalis subsp. lactis to hydrogen peroxide stress. / J. Bacteriol. 2013. V. 195. P. 3743-3751.

98) O'May G., Reynolds N., Smith A., Kennedy A., Macfarlane G. Effect of pH and antibiotics on microbial overgrowth in the stomachs and duodena of patients undergoing percutaneous endoscopic gastrostomy feeding. / J. Clin. Microbiol., 2005. V. 43. P. 3059-3065.

99) Ooi L., Liong M. Cholesterol - lowering effects of probiorics and prebiotics: a revion of in vivo and in vivo findings. / Int. J. Mol.Sci. 2010. V. 11. P. 2499-2522.

100) Okamoto M., Benno Y., Leung K.P., Maeda N. Bifidobacterium tsurumiense sp. nov., from hamster dental plaque. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 144-148.

101) Orla-Jensen S. Classification des bactéries lactiques. / Lait. 1924. P. 468-474.

102) Ozen M., Dinleyici E. The history of probiotics: the untold story. / Benef. Microbes. 2015. V. 6. P. 159-165.

103) Prasanna P, Grandison A., Charalampopoulos D. Bifidobacteria in milk products: An overview of phisiological abd biochemical properties, exopolysaccharide producrion, selection criteria of milk products and healht benefits. / Food Res. Int. 2014. V. 55. P. 247-262.

104) Prakash S., Tomaro-Duchesneau C., Saha S., Cantor A. The gut microbiota and human health with an emphasis on the of microencapsulated bacterial cells. / J. Biomed Biotechnol. 2011. V. 10. P. 981214.

105) Poupard J., Husain I., Norris R. Biology of the bifidobacteria / Bacteriol. Rev. 1973. V. 37. P. 136-165.

106) Poncet J., Benort V. Cryopreservation of the unicellular marine alga, Nannochloropsis oculata. / Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. I. 23. P. 2017-2022.

107) Rook G., Blunet L. Microbes, immunoregulation, and the gut. / Gut. 2007. V. 54. P. 317-320.

108) Reuter G., Vergleichende Untersuchunge über die Bifidus-Flora im Säuglings- und Erwachsenenstuhl. / Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infectionskr. Hyg. Abt. 1963. V. 191. P. 486-507.

109) Ruas-Madiedo P., Hernández-Barranco A., Margolles A., de los Reyes-Gavilán C. A Bile salt-resistant derivative of Bifidobacterium animalis has an altered fermentation pattern when grown on glucose and maltose. / Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 6564-6570.

110) Pinto M., Franz C., Schilinger U., Holzapfel W. Lactobacillus spp. with in vitro probiotic properties from human faeces and traditional fermented products. / Int. J. of Food Microbiology. 2006. V. 109. P. 205-214.

111) Saarela M., Rantala M., Hallamaa K., Nohynek L., Virkajärvi I., Mättö J. Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria. / J. Appl. Microbiol. 2004. V. 96. P. 1205-1214.

112) Begley M., Hill C., Gahan C.G. Bile salt hydrolase activity in probiotics. / Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 1729-1738.

113) Satokari R., Vauqhan E., Saarela M., Matto J., de Vos W. Molecular approaches for the detection and identification of bifidobacteria and lactobacilli in the human gastrointestinal tract. / Syst. Appl. Microbiol. 2003. V. 26. P. 572-84.

114) Sánchez B., Champomier-Verges M.-C., Collado M. del C., Anglade P., Baraige F., Sanz Y., de los Reyes-Gavilán C.G., Margolles A., Zagorec M. Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum. / Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 6450-6459.

115) Scardovi V., Trovatelli L.D. New species of bifidobacteria from apis mellifica L. and apis indica F. a contribution to the taxonomy and biochemistry of the genus Bifidobacterium. / Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene. Abteilung II. 1969. V. 123. P. 64-88.

116) Shi L., Qiu D., Zhao G., Corthesy B., Lees-Miller S., Reeves W., Kao P. Dynamic binding of Ku80, Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells. / Nucleic Acid Res. 2007. V. 35. P. 2302-2310.

117) Simpson P.J., Ross R.P., Fitzgerald G.F., Stanton C. Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov. and Aeriscardovia aeriphila gen. nov., sp. nov., isolated from a porcine caecum. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 401-406.

118) Sue E., Zhao L., Ren F., Liu S., Zhang M. Complete genome sequence of Bifidobacterium animalis sibsp. lactis A6, a probiotic strain with high acid resistance ability. / J. Biotechnol. 2015. V. 200. P. 8-9.

119) Talwalkal A., Kailasapathy K. The role of oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp. / Curr. Issues Intest. Micribiol. 2004. V. 5. P. 1-8.

120) Tharmaraj N. Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and propionibacteria. / J. Dairy Sci.

2003. V. 86. P. 2288-2296.

121) Tiourina O., Sukhorukov G. Multilayer alginate/protamine microsized capsules: encapsulation of alpha-chymotrypsin and controlled release study. / Int. J. Pharm. 2002. V. 242. P. 155-161.

122) Tiourina O., Antipov, A., Sukhorukov G., Larionova N. Entrapment of chymotrypsin into hollow polyelectrolyte microcapsules. / Macromol. Biosci. 2001. V. 1. P. 209-214.

123) Uelivon A., Mozetti V., Lacroix C., Kheadr E., Fliss I., Meile L. Classification of a moderately oxygen-tolerant isolate frome babyfaeces as Bifidobacterium thermophilum. / BMC Microbiol. 2007. V. 7. P. 171-180.

124) Uzunova-Doneva T. Anabiosis and conservation of microorganisms. / J. of Culture Collection. 2005. V. 4. P. 17-28.

125) Ventura M., Canchaya C., van Sinderen D., Fitzgerald G.F. Bifidobacterium lactis DSM 10140: identification of the atp (atpBEF HAGDC) operon and analysis of its genetic structure, characteristics, and phylogeny. / Appl. Environ. Microbiol.

2004. V. 70. P. 3110-3121.

126) Ventura, M., Canchaya C., Tauch A., Chandra G., Fitzgerald G.F., Chater K.F., and van Sinderen D. Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary

history of an ancient phylum. / Microbiol. Molecular Biol. Rev. 2007. V. 71. P. 495-548.

127) Wang B., Xu H., Wei H., Zeng Z., Xu F. Oral administration of Bifidobacterium bifidum for modylating microflora, acid and bile resistance, and phylosiological indices in mice. / Can J. Microbiol. 2015. V. 61. P. 155-63.

128) Winslow C.E.A., Broadhurst J., Buchanan R.E., Krumweide C., Rogers L.A., Smith G.H. The families and genera of the bacteria: reliminary report of the committee of the society of american bacteriologists on characterization and classification of bacterial types. / J. Bacteriol. 1917. V. 2. P. 505-566.

129) Zarate S., Lopez-Leiva M.H. Oligosaccharide formation during enzymatic lactose hydrolysis: a literature review. / J. Food Prot. 1990. V. 53. P. 262-268.

130) Zhihong S., Wenyi Z., Chenyi G., Xiabwei Y., Yarong W. Comparative genomic analysis of 45 type strains of the genus Bifidobacterium: A snapshot of its genetic diversity and evolution. / PLoS ONE. 2015. V. 10. P. 576-593.

131) Yazawa K., Imani K., Tamuza Z. Oligosaccharides and polysaccharides specifically utilizable by bifidobacteria. / Chem. Pharm. Bull. 1978. V. 26. P. 3306-3311.

132) You J., Dong H., Mann E., Knight S., Yagoob P. Probiotic modulation of dendritic cell is influenced by ageing. / Immunobiology. 2014. V. 219. P. 138-148.

133) Jonkers D., Penders J., Masclee A., Pierik M. Probiotics in the management of inflammatory bowel disease: a systematic review of intervention studies in adult patients. / Drugs.2012. V. 72. P. 803-823.

134) Jian W., Dong X. Transfer of Bifidobacterium inopinatum and Bifidobacterium denticolens to Scardovia inopinata gen. nov., comb. nov., and Parascardovia denticolens gen. nov., comb. nov., respectively. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 809-812.