Влияние WNT лигандов на формирование фенотипа клеточных линий меланомы человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Куликова, Ксения Валерьевна

• Куликова, Ксения Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куликова, Ксения Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ВКЛАД \¥ОТ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В

ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ МЕЛАНОМЫ

1.1 Лиганды ХУяЛ и их внеклеточные партнеры по взаимодействию

1.2 Пути передачи сигнала, активируемые белками семейства

1.2.1 Канонический \yrit сигнальный путь

1.2.2 Неканонические \Угй сигнальные пути

1.3 Значение сигнального пути для поддержания гомеостаза кожи

1.4 Роль сигнального пути в формировании и прогрессии меланомы

1.4.1 Роль канонического \Vrit сигнального пути при развитии меланомы

1.4.2 Вклад неканонического \yrit сигнального пути в метастазирование меланомы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Ферменты и реактивы

2.2 Плазмидные векторы и клонирование

2.2.1 Создание экспрессионной конструкции, кодирующей лиганд 11\¥п15а

2.2.2 Создание ОТАТ-репортерной системы

2.3 ДНК электрофорез в агарозном геле и ПААГ

2.4 Трансформация клеток Е. соЫ

2.5 Культивирование клеточных линий

2.6 Выделение тотальной РНК и ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией

2.7 Транзиторная трансфекция культуры опухолевых клеток

2.8 Получение клеточных пулов, стабильно продуцирующих рекомбинантные белки

2.9 Вестерн-блот (иммуноблот) анализ

2.10 Выделение мембрано-связанного пула Р-катенина

2.11 Иммуноцитохимический анализ

2.12 Люциферазный тест

2.13 Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток

2.14 Тест на восстановление повреждений монослоя

2.15 Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Клетки меланоцитарного невуса и клетки линий меланомы человека экспрессируют гены базовых молекулярных компонентов, необходимых для миграции

3.2 Клеточные линии меланомы человека различаются по паттерну экспрессии генов молекулярных компонентов, ассоциированных с подвижностью

3.3 В клеточных линиях меланомы человека отсутствие выраженной ядерной локализации р-катенина не отражает статус активности канонического \Viit сигнального пути

3.4 Вариабельность паттерна экспрессии генов транскрипционных факторов ТСР/ЬЕБ семейства в клеточных линиях меланомы человека

3.5 Для клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия гена неканонического лиганда \Vnt5a

3.6 Получение экспрессионных конструкций, кодирующих лиганды Wnt

3.7 Экспрессия гена канонического лиганда приводит к накоплению Р-катенина и к активации ТСР/ЬЕР-зависимого промотора в модельной клеточной линии меланомы человека Ме1Р

3.8 В клеточной линии Ме1Р неканонические лиганды ингибируют активацию канонического \Vrit сигнального пути, стимулированную \Vnt3a, но не 1лС

3.9 Как неканонические, так и канонический лиганды вызывают усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р

3.10 Неканонический лиганд \Vntl 1 стимулирует пролиферацию клеток Ме1Р

3.11 Усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р под действием \Vnt3a не связано с активацией канонического \Viit сигнального пути

3.12 В клеточной линии Ме1Р лиганды \Vnt3a, \Vnt5a и \¥п1;11 активируют сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние WNT лигандов на формирование фенотипа клеточных линий меланомы человека»

Диагностика меланомы на ранних стадиях сильно затруднена значительным внешним сходством меланоцитарных невусов и новообразованных меланом. Пациенты зачастую не обращают внимания на незначительные изменения цвета, размера или контура родинок, сопровождающие их злокачественную трансформацию. Помимо внешнего сходства клетки невуса и меланомы имеют и общее происхождение. Меланома не всегда возникает в ходе перерождения меланоцитарного невуса, она, как и последний, может образоваться напрямую из видоизмененных меланоцитов, являющихся производными клеток нервного гребня (neural crest cell, NCC). Несмотря на столь очевидное сходство меланомы и невуса, эти два новообразования имеют и принципиальные различия. Так, невус - это повреждение, имеющее доброкачественную природу. Каждый человек несет на поверхности кожи несколько меланоцитарных невусов. При рождении невусы наблюдают лишь у 1-6 % детей [1], в то время как у оставшихся они появляются во время взросления. Если с невусами люди живут всю жизнь, не слишком замечая их присутствие, то с меланомой дело обстоит иначе. Меланома представляет собой довольно агрессивное злокачественное новообразование. Составляя всего 3-5 % всех кожных новообразований, она является причиной смерти 80 % пациентов с онкологическими заболеваниями кожи [2]. Тем не менее, течение заболевания сильно различается среди пациентов, страдающих этим недугом. Некоторые угасают за считанные месяцы, а другие живут годами. Таким образом, возникает вопрос, что именно отличает невус от меланомы и почему течение заболевания сильно различается среди пациентов. Исследование молекулярно-биологических аспектов, характеризующих клеточные процессы в невусах и меланомах, способно приблизить человечество к пониманию особенностей их течения и помочь в борьбе с онкологическими заболеваниями.

Высокая смертность больных меланомой определяется в первую очередь высоким метастатическим потенциалом опухолевых клеток данного вида. В основе метастазирования, с свою очередь, лежит способность к активной миграции, благодаря которой клетки опухоли распространяются по всему организму и дают начало новым очагам поражения. При метастазировании меланомы активируются те же генетические программы, которые контролируют процессы эмбриогенеза. Клеточная подвижность связана с экспрессией таких генов, как Slug, Twistl, Sipl, Snail. Все они являются маркерами высоко подвижных клеток нервного гребня (NCC), а также задействованы в индукции процесса под названием эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП).

ЭМП подразумевает изменение морфологии эпителиальных клеток в сторону 6 мезенхимальных, сопровождающееся деламинированием, разрушением межклеточных контактов и активацией синтеза металлопротеиназ [3]. Snail и Slug принадлежат к одному семейству транскрипционных факторов [4]. Подавление экспрессии их генов совпадает с ингибированием миграции клеток нервного гребня [5]. Twistl и Sipl также задействованы в увеличении клеточной подвижности. Ингибирование продукции Twistl приводит к снижению подвижности и метастатической активности клеток рака молочной железы [6] и гепатоцеллюлярного рака [7]. Sipl задействован в регуляции гена виментина, экспрессия которого характерна для подвижных клеток [8].

Помимо экспрессии генов маркеров ЭМП, клетки нервного гребня и меланомы роднит и высокая значимость сигнальных каскадов, активируемых белками семейства Wnt, для регуляции внутриклеточных процессов. Wnt сигнальные пути контролируют процессы, связанные с формированием и дифференцировкой клеток нервного гребня. Они же участвуют в возникновении и развитии меланомы. Wnt сигнальный каскад включает в себя довольно сложную сеть внутриклеточных взаимодействий. Его лиганды способны запускать несколько различных цепей передачи сигнала: каноническую и две неканонические. В соответствии с современными представлениями, каноническая ветвь Wnt сигнального пути задействована в основном в контроле пролиферации и дифференцировки, осуществляя действие на уровне регуляции транскрипции. Неканонические Wnt сигнальные пути, напротив, преимущественно влияют на организацию цитоскелета и клеточную подвижность. На настоящий момент предполагают, что в меланомах канонический и неканонические Wnt сигнальные каскады могут выполнять роль антагонистов, по-разному влияя на развитие меланомы. Неканонические Wnt сигнальные пути способствуют метастазированию опухолей. В то время как канонический участвует в супрессии развития меланомы путем стимулирования клеточной дифференцировки.

В связи с вышеизложенным цель настоящего исследования состояла в выявлении роли различных белков семейства Wnt в формировании опухолевого фенотипа клеточных линий меланомы человека.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить уровень экспрессии генов маркеров эпителиально-мезенхимального перехода: Slug, Twistl и Sipl в клеточных линиях меланомы человека.

2. Исследовать взаимосвязь между активностью канонического \VrLt сигнального пути и локализацией р-катенина в имеющемся наборе клеточных линий меланомы человека.

3. Изучить вклад канонических и неканонических лигандов в формирование фенотипа клеточной линии меланомы человека Ме1Р.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Куликова, Ксения Валерьевна

5. ВЫВОДЫ

1. Для всех исследованных клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия генов маркеров эпителиально мезенхимального перехода: Slug, Twist 1, Sipl, виментина, что свидетельствует об активированном статусе программы эпителиально-мезенхимального перехода в изученных линиях.

2. Впервые показано, что накопление р-катенина в ядрах клеток линий меланомы человека не может служить достаточным условием для активации канонического Wnt сигнального пути.

3. Как канонический Wnt3a, так и не канонический Wnt5a лиганды усиливают подвижность клеток линии меланомы человека MelP.

4. Неканонический лиганд Wntll усиливает пролиферацию культуры клеточной линии меланомы человека MelP, в то время как канонический лиганд Wnt3a оказывает противоположное действие.

5. В клеточной линии меланомы человека MelP канонический лиганд Wnt3a способен активировать сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на кажущиеся различия между меланоцитарным невусом и меланомой, эти кожные образования во многом сходны. Помимо внешнего вида и происхождения, их объединяет также наличие базовых компонентов генетической программы подвижности, заимствованной у клеток нервного гребня. Как невус, так и меланома экспрессируют гены маркеров N00, характерных также для ЭМП. Наличие базового набора транскрипционных факторов, обеспечивающих миграцию и ЭМП, в клетках как меланомы, так и невуса указывает на потенциальную способность клеток обоих новообразований к активному движению. Тем не менее, к метастазированию, в основе которого лежит клеточная миграция, способна только меланома, но не невус. Более того, фенотип самой меланомы может сильно варьировать среди различных пациентов, начиная от неинвазивного или слабоинвазивного до высоко агрессивного быстро развивающегося заболевания. Таким образом, одного наличия базовых компонентов генетической программы, обеспечивающей миграцию клеток, не достаточно для формирования высоко подвижного фенотипа опухоли. Успешная реализация программы подвижности зависит от ряда факторов, в числе которых активность внутриклеточных сигнальных каскадов, влияющих на продукцию разнообразных молекулярных компонентов, способствующих миграции.

Среди сигнальных путей, чья регуляция может различаться в кожных новообразованиях, выделяется А^М сигнальный путь. Он задействован как в процессе эмбрионального развития, так и в онкогенезе. Лиганды семейства способны активировать несколько сигнальных каскадов: канонический, или (3-катениновый, и неканонические \Уп1/Са2+-зависимый и ^¥п1;/РСР. Согласно литературным данным канонический и неканонический Wnt/Ca2+-зaвиcимый сигнальные пути в меланоме являются функциональными антагонистами. Активация канонической ветви \Уп1 сигнального пути является хорошим прогностическим признаком для пациентов, страдающих этим недугом. В то время как стимуляция неканонического Wnt сигнального пути под действием, например, \Vnt5a, напротив, сопряжена с усилением метастазирования опухолей. При этом стоит отметить, что выводы о негативном влиянии активности канонической ветви \Viit сигнального каскада на развитие меланомы делались преимущественно на основании того, что накопление основного эффектора данного пути Р-катенина в ядре опухолевых клеток положительно коррелирует с продолжительностью жизни пациентов. В рамках данной работы было впервые показано, что выраженная ядерная локализация Р-катенина не является

98 достаточным условием для активации канонического сигнального пути в клеточных линиях меланомы человека. Подобное наблюдение дает возможность по-новому взглянуть на роль канонического Wnt сигнального пути в формировании фенотипа опухоли. Для меланомы характерна тенденция к потере внутриядерной локализации р-катенина по мере прогрессии опухоли. При этом аналогичной тенденции по изменению статуса активности канонического \\fnt сигнального пути при прогрессии меланомы в рамках данного исследования выявлено не было. Таким образом, несмотря на то, что по крайней мере в некоторых системах внутриядерную локализацию Р-катенина можно рассматривать как фактор, препятствующий развитию опухоли, зависимость между локализацией р-катенина и степенью прогрессии меланомы определяется не столько активностью канонического Wnt сигнального пути, сколько наличием альтернативных молекулярных факторов, также способных влиять на внутриклеточную локализацию Р-катенина.

В рамках данной работы было исследовано не только значение конкретного сигнального пути для прогрессии меланомы, но и характер влияния лигандов семейства \\fnt на формирование фенотипа опухоли. Пытаясь выяснить, каким образом лиганды участвуют в этом процессе, были исследованы эффекты, оказываемые лигандами ^УМЗа, и ^УпЙ 1 на поведение модельной клеточной линии меланомы человека

Ме1Р. Согласно классическим представлениям в меланоме каждый из этих лигандов активирует свой сигнальный каскад: \Vnt3a - канонический, \Vnt5a - Са зависимый неканонический, а Wntl 1 - путь клеточной поляризации. Канонический \Уп1 сигнальный путь, как правило, регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток, а неканонические оказывают влияние на организацию цитоскелета и клеточную подвижность. В связи с этим ожидалось, что \Vnt3a будет влиять на пролиферацию, а \Vnt5a и \Vntl 1 на миграцию исследованной клеточной линии (рисунок 29, А). Тем не менее, в ходе работы выяснилось, что в линии Ме1Р \Vnt3a способен активировать миграцию, а Wntl 1 пролиферацию опухолевых клеток. Более того, эффект на миграцию от канонического \Vnt3a имитировал действие, оказываемое неканоническим \¥п15а, что опровергает предположение о функциональном антагонизме данных лигандов в меланоме. \Уп13а-опосредованная миграция не зависит от активации канонического сигнального пути, поскольку добавление 1лС1 не влияет на подвижность клеток. Помимо миграции \Vnt3a также оказывает влияние на пролиферацию опухолевых клеток, снижая скорость их роста (рисунок 29, Б). Несмотря на кажущееся противоречие эффектов, оказываемых \Vnt3a, как активизация подвижности, так и ингибированне пролиферации способны положительно повлиять на метастазированне опухоли. м/пгёа)

Л/тба)

Рисунок 29. Схематичное представление влияния \Vrit лигандов на процессы пролиферации и миграции клеток меланомы человека. (А) Схема, основанная на литературных данных. (Б) Схема, составленная на основании экспериментальных данных, полученных на Ме1Р. \Vnt3a, \Vnt5a, Wntll - лиганды семейства \Vrit; Стрелками (—«■) показано активирующее влияние \Уп1 лигапда па клеточный процесс; Стрелками (—)) показано ингибируюшее влияние Wnl лиганда на клеточный процесс.

Как уже отмечалось, считается, что в меланомс каждый из исследованных лигандов активирует свой сигнальный каскад. Более того, неканонические лиганды \Vnt5a и \Vntl 1 путем конкуренции за связывание с соответствующим рецептором способны ипгибировать ХУтЗа-опосрсдоваппую активацию канонического \Viit сигнального пути (рисунок 30, А). wnt3a) (wnt5a) (wntll)

Wnt/p-catenin

Б (Wnt3a) (WntSaj (Wntll)

Wnt/p-catenin

Рисунок 30. Схематичное представление влияния Wnt лигандов на активацию Wnl сигнальных путей в клетках меланомы человека. (А) Схема, основанная на литературных данных. (Б) Схема, составленная на основании экспериментальных данных, полученных на MclP. Обозначения соответствуют обозначениям на рисунке 29.

Матсришш, полученные в данной работе, позволили существенным образом расширить существующие представления. В исследованной системе MelP все Wnt лиганды, вне зависимости от того, считаются они каноническими или неканоническим, активируют сигнальный каскад, связанный с увеличением уровня цитоплазматического Са2+ (рисунок 30, Б). При этом, Wnt3a также активирует канонический Р-катениновый сигнальный путь. Учитывая, что согласно литературным данным, канонический Wnt сигнальный путь вовлечен преимущественно в регуляцию пролиферации и дифференцировки, а неканонический в основном контролирует подвижность клеток, а также тот факт, что WntЗa-oпocpeдoвaпнaя миграция клеток MclP является р-катснип независимой, можно предположить, что в клеточной линии мсланомы человека MelP Wnt3a вызывает снижение скорости увеличения числа клеток через активацию канонического Wnt сигнального каскада и усиливает миграцию через активацию Wnt/Ca2'-сигнального каскада.

Основываясь на описанных вьппе наблюдениях можно заключить, что в клеточной линии мсланомы человека MclP как Wnt5a, Wntll, так и Wnt3a способны повлиять па поведение опухолевых клеток. При этом характер действия лигандов семейства Wnt на мсланому различается. Лиганды Wnt могут участвовать в развитии

101 меланомы как минимум двумя способами: за счет активации миграции опухолевых клеток и за счет усиления клеточной пролиферации. При этом лиганд который считался регулятором процессов по реорганизации цитоскелета и изменению клеточной подвижности, в модельной линии меланомы человека Ме1Р активирует преимущественно пролиферацию. Лиганд \Vnt3a, который, напротив, традиционно считался модулятором пролиферации и дифференцировки, в линии Ме1Р способствует усилению клеточной подвижности. Согласно литературным данным, \Vnt3a в меланоме активирует канонический \Уп1 сигнальный путь. При этом активация р-катенинового сигнального пути, способствуя дифференцировке клеток, служит фактором, благоприятно влияющим на продолжительность жизни пациентов, страдающих этим заболеванием. Полученные данные указывают на то, что \Vnt3a в клетках меланомы способен повлиять не только на пролиферацию и р-катениновый сигнальный путь, но и на клеточную подвижность и неканонический \Уп1;/Са - сигнальный путь. Таким образом, в случае метастазирующей меланомы ^¥п13а может оказаться функциональным аналогом лиганда Wnt5a, который считается индуктором метастазирования. Учитывая также тот факт, что в исследованных клеточных линиях меланомы человека статус активности канонического сигнального пути сильно варьировал и не отражал стадии развития заболевания, можно предположить, что на поздних стадиях развития метастазирующей меланомы данный сигнальный путь утрачивает свое значение и перестает оказывать сильное влияние на фенотип опухоли.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куликова, Ксения Валерьевна, 2012 год

1. Marghoob А.А. 2002. Congenital melanocytic nevi. Evaluation and management. Dermatol Clin 20(4), 607-616.

2. Tsao H., Atkins M.B., Sober A.J. 2004. Management of cutaneous melanoma. N Engl J Med 351(10), 998-1012.

3. Lee J.M., Dedhar S., Kalluri R., Thompson E.W. 2006. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol 172(7), 973-981.

4. Nieto M.A. 2002. The snail superfamily of zinc-finger transcription factors. Nat Rev Mol Cell Biol 3(3), 155-166.

5. Carl T.F., Dufton C., Hanken J., Klymkowsky M.W. 1999. Inhibition of neural crest migration in Xenopus using antisense slug RNA. Dev Biol 213(1), 101-115.

6. Yang J., Mani S.A., Donaher J.L., Ramaswamy S., Itzykson R.A., Come C., Savagner P., Gitelman I., Richardson A., Weinberg R.A. 2004. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell 117(7), 927-939.

7. Bindels S., Mestdagt M., Vandewalle C., Jacobs N., Volders L., Noel A., van Roy F., Berx G., Foidart J.M., Gilles C. 2006. Regulation of vimentin by SIP1 in human epithelial breast tumor cells. Oncogene 25(36), 4975-4985.

8. Miller J.R. 2002. The Wnts. Genome Biol 3(1), 1-15.

9. Smolich B.D., McMahon J.A., McMahon A.P., Papkoff J. 1993. Wnt family proteins are secreted and associated with the cell surface. Mol Biol Cell 4(12), 1267-1275.

10. Willert K., Brown J.D., Danenberg E., Duncan A.W., Weissman I.L., Reya Т., Yates J.R., 3rd, Nusse R. 2003. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature 423(6938), 448-452.

11. The Wnt homepage: http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/.

12. Slusarski D.C., Corces V.G., Moon R.T. 1997. Interaction of Wnt and a Frizzled homologue triggers G-protein-linked phosphatidylinositol signalling. Nature 390(6658), 410-413.

13. Angers S., Moon R.T. 2009. Proximal events in Wnt signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 10(7), 468-477.

14. Xu Y.K., Nusse R. 1998. The Frizzled CRD domain is conserved in diverse proteins including several receptor tyrosine kinases. Curr Biol 8(12), R405-406.

15. Weeraratna A.T. 2005. A Wnt-er wonderland-the complexity of Wnt signaling in melanoma. Cancer Metastasis Rev 24(2), 237-250.

16. Niehrs C., Shen J. 2010. Regulation of Lrp6 phosphorylation. Cell Mol Life Sci 67(15), 2551-2562.

17. Tamai K., Semenov M., Kato Y., Spokony R., Liu C., Katsuyama Y., Hess F., Saint-Jeannet J.P., He X. 2000. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature 407(6803), 530-535.

18. Pinson K.I., Brennan J., Monkley S., Avery B.J., Skarnes W.C. 2000. An LDL-receptor-related protein mediates Wnt signalling in mice. Nature 407(6803), 535-538.

19. Itasaki N., Jones C.M., Mercurio S., Rowe A., Domingos P.M., Smith J.C., Krumlauf R. 2003. Wise, a context-dependent activator and inhibitor of Wnt signalling. Development 130(18), 4295-4305.

20. Glinka A., Wu W., Delius H., Monaghan A.P., Blumenstock C., Niehrs C. 1998. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 391(6665), 357-362.22.