Влияние рекомбинантной двухкассетной плазмидной конструкции, несущей гены vegf165а и bmp2, на процессы остеогенеза in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Журавлева Маргарита Николаевна

• Журавлева Маргарита Николаевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Журавлева Маргарита Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные представления об эмбриональном и репаративном остеогистогенезе

1.2 Понятие индуцированного остеогистогенеза

1.3 Генная индукция регенерации костной ткани. Выбор целевых генов29

1.3.1 Костные морфогенетические белки

1.3.2 Клиническое применение и доклинические исследования BMP2

1.3.3 Сосудистый эндотелиальный фактор роста

1.3.4 Доклинические исследования и клиническое применение VEGF для стимуляции остеорегенерации

1.3.5 Комбинированное применение VEGF и BMP2

1.4 Выбор вектора для создания генно-терапевтического препарата

1.4.1 Использование двухкассетных плазмидных векторов

1.4.2 Особенности переноса плДНК в клетки-мишени in vitro и in vivo

1.4.3 Проблема целевой доставки плазмидной ДНК

1.5 Концепция матриксов, совмещенных с ДНК, и проблема выбора материала-носителя

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методы работы с плазмидными генетическими конструкциями

2.1.1. Создание плазмидных генетических конструкций

2.1.2 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами

2.1.4 Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом секвенирования

2.1.5 Трансформация E.coli разработанными генетическими конструкциями

2.1.6 Выделение плазмидной ДНК из E. Coli

2.1.7 Электрофоретический анализ плДНК

2.2 Методы работы с культурами эукариотических клеток

2.2.1 Выделение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из костного мозга человека

2.2.2 Выделение мультипотентных стромальных клеток из костного мозга крысы

2.2.3 Выделение остеобластов черепа крыс

2.2.4 Проточная цитофлуориметрия

2.3 Методы трансфекции эукариотических клеток

2.3.1 Трансфекция клеток HEK293FT, ММСК-КМ человека, крысы, остеобластов крысы

2.4 Методы определения синтеза белков BMP2 и VEGF165A

2.4.1 Флуоресцентная иммуноцитохимия

2.4.2 Иммуноблоттинг

2.4.3 Иммуноферментный анализ

2.5 Методы оценки остеогенной дифференцировки ММСК и остеобластов

2.5.1 Остеогенная дифференцировка ММСК и остеобластов крысы

2.5.2. Выявление кальциевых депозитов реакцией von Kossa

2.5.3 Выявление кальциевых депозитов окрашиванием ализариновым красным

2.5.4 Определение активности щелочной фосфатазы

2.6 Формирование клетками капилляроподобных структур на внеклеточном матриксе Matrigel

2.7 Создание остеопластического материала, совмещенного с ДНК

2.7.1 Совмещение остеопластических материалов с плазмидной ДНК pBudKan-coVEGF165А-coBMP2 и определение емкости материалов для плазмидной ДНК

2.7.2 Определение метаболической активности клеток при воздействии смывов с остеопластических материалов и остеопластических материалов, совмещенных с pBudKan-coVEGF165A-coBMP2 (MTS-тест)

2.8 Эксперименты in vivo

2.8.1 Гетеротопическая (внутримышечная) имплантация остеопластических материалов

2.8.2 Оценка влияния остеопластических материалов, совмещенных с ДНК, на процессы регенерации костной ткани

2.8.3 Оценка эффективности трансфекции клеток реципиентного ложа методом ПЦР-РВ

2.8.4 Подготовка образцов тканей для гистохимического и иммуногистохимического исследования

2.9 Гистохимическое исследование

2.10 Иммуногистохимическое исследование

2.9.1 Морфометрическая оценка результатов гистохимического и иммуногистохимического исследования

2.10 Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Создание генетических конструкций

3.2 Получение и анализ первичных культур эукариотических клеток

3.3 Анализ синтеза рекомбинантных белков VEGF165A и BMP2 клетками HEK 293 FT, ММСК костного мозга крысы, человека, остеобластами крысы, трансфицированными плДНК pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2

3.5 Анализ остеогенной дифференцировки ММСК костного мозга и остеобластов крысы под влиянием среды, кондиционированной клетками HEK293FT, трансфицированными pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2

3.5.1 Выявление минеральных отложений in vitro

3.5.2 Определение активности щелочной фосфатазы

3.7 Создание остеопластических материалов, совмещенных с ДНК

3.7.1 Определение плДНК-связывающей способности остеопластических материалов

3.7.2 Определение цитотоксичности остеопластических материалов и матриксов, совмещенных с pBudKan-coVEGF165A-coBMP2 (MTS-тест)

3.7.3 Оценка экспрессии кодон-оптимизированных генов vegf165a и bmp2 в

3.8 Гетеротопическая (внутримышечная) имплантация остеопластических

3.9 Оценка влияния остеопластических материалов, совмещенных с ДНК, на процессы регенерации костной ткани (ортотопическая имплантация)

107

клетках гетеро- и ортотопического ложа

108

материалов

111

113

ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

129

148

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

150

152

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние рекомбинантной двухкассетной плазмидной конструкции, несущей гены vegf165а и bmp2, на процессы остеогенеза in vitro и in vivo»

Актуальность проблемы

В физиологических условиях костная ткань обладает хорошим регенеративным потенциалом и самообновляется на 4-10% ежегодно (Кишкун А. А., 2008). Костный дефект, то есть отсутствие костной ткани на протяжении (более 1 см для человека), может возникать в результате травмы (первичный костный дефект), а также вследствие патологического процесса или оперативного вмешательства (вторичный костный дефект). Восстановление его целостности зависит от множества факторов, таких как характер травмы, качество репозиции и иммобилизации отломков, степень повреждения окружающих тканей, состояние сосудов и нервов, обеспечивающих местную трофику (Rosen, 2018). Замедленная консолидация осложняет до 10 % переломов костей (Morshed, 2014) и до 28% переломов в случае наличия сопутствующих хронических заболеваний (сахарный диабет, генерализованный атеросклероз, алкоголизм и др.) (Perlman et al., 1999). При нарушении процесса восстановления костной ткани возникает вторичный костный дефект, который может существовать длительно (годами). Длительно существующие костные дефекты развиваются так же в 1%-6,5% случаев различных форм остеохондропатий (Ахтямов И.Ф., 2014). Остеонекроз, возникающий в результате местных или системных трофических нарушений или высокоэнергетических переломов, является еще одним фактором, снижающим вероятность успешного восстановления органотипической ткани в костном дефекте (Murphey et al., 2014). Наиболее распространен остеонекроз головки бедренной кости. Так, в США регистрируется до 20 000 случаев в год (Kamal et al., 2013).

Наибольшую проблему для восстановления целостности костной ткани представляют собой протяженные дефекты длинных трубчатых костей, которые возникают при механическом воздействии с большой кинетической

энергией (ДТП, падение с высоты, огнестрельные и минно-взрывные ранения), при удалении костных опухолей (Предеин Ю.А., 2016). Частота огнестрельных переломов в структуре боевой хирургической травмы достигает 20%, более чем в 30% случаев протяженность дефекта составляет более 5 см (Ефименко Н.А., 2003). Ситуацию осложняет то, что высокоэнергетические травмы сопровождаются остеопорозоподобной трансформацией костного матрикса, аморфизацией кристаллов ГА (гидроксиапатита) в зоне так называемого молекулярного сотрясения, остеонекрозом костных отломков, нарушением местной трофики за счет повреждения нервных и сосудистых стволов и обширных некрозов мягких тканей, а также общим тяжелым состоянием пациента, что существенно влияет на регенерацию и приживление трансплантатов. Огнестрельные переломы часто приводят к укорочению конечности, формированию ложного сустава и ампутации (Денисов А.В., 2010).

Как известно, широкое распространение в лечении протяженных костных дефектов получила костная пластика (Кузанов А.И., 2005). Наилучшими свойствами остеоинтеграции, по мнению хирургов, обладают кровоснабжаемые аутотрансплантаты, однако этот способ не всегда может быть применен при необходимости замещения обширного костного фрагмента вследствие травматичности взятия ткани из донорского участка и ограниченной длины питающей ножки (Кузанов А.И., 2005). Аваскулярные аутотрансплантаты обладают длительными сроками остеоинтеграции, часто секвестрируются в процессе их резорбции, возникают переломы. Кроме того, требуется взятие материала из донорского участка. Кадаверные децеллюляризированные аллотрансплантаты лишены проблемы поиска донорского участка, однако замещение их костной тканью происходит только путем резорбции с последующей перестройкой за счет прорастания сосудов и миграции клеток из окружающих тканей. Скорость этих процессов низкая, поэтому целесообразно использование трансплантатов небольшого размера.

Использование ксеногенных тканей ограничено их высокой реактогенностью в ряде случаев (Sun et al., 2015).

Методом несвободной костной пластики по Г.А. Илизарову могут быть замещены дефекты длинных трубчатых костей величиной до 20 см и более (Борзунов Д.Ю., 2000). Однако, при длительном нахождении аппарата на конечности часто развивается воспаление мягких тканей в местах прохождения спиц, вплоть до остеомиелита, флегмоны и даже сепсиса (Емец А.Н., 2015). Вследствие длительного ограничения функции конечности развивается тугоподвижность в смежных с дефектом суставах (Sasabe et al., 2017).

Черепно-мозговые травмы так же могут сопровождаться возникновением обширных дефектов костей черепа, которые самостоятельно не восстанавливают свою целостность. В этой области с успехом применяется пластика дефекта полимерными и металлическими пластинами, которая, однако, не может быть применена у детей в связи с их продолжающимся ростом. В данной группе пациентов наилучшие результаты показала пластика аутокостью, однако, донорские участки ограничены, и забор материала требует проведения дополнительной операции (Тихомиров С. Е., 2012).

Даже в оптимальных условиях сроки консолидации переломов весьма продолжительные, и требуется длительная иммобилизация поврежденной конечности. В случае замедленной консолидации или ее отсутствия, формирования ложного сустава, больших дефектов костной ткани и трофических нарушений стандартное лечение часто оказывается малоэффективным. В результате пациент на длительное время трудоспособность, возможно наступление стойкой инвалидности, что наносит как экономический, так и социальный ущерб (Kanakaris et al., 2007). По данным Федеральной службы государственной статистики 24000 человек в 2017 г. стали инвалидами в результате последствий травм. В связи с вышеобозначенным актуальна разработка методов улучшения и ускорения процессов регенерации костной ткани.

Перспективным подходом в остеопластике является использование остеопластических материалов натурального и искусственного происхождения. Такие материалы не только заполняют собой костный дефект, но так же в них могут быть смоделированы необходимые форма, остеокондуктивные и механические свойства, которые были характерны для утраченного костного фрагмента (Иванов С. Ю., 2013; Панкратов А.С., 2018). Основным ограничивающим фактором их применения является размер костного дефекта. Это связано с тем, что в центральных областях имплантата наблюдается низкая васкуляризация, что значительно замедляет его ремоделирование и замещение собственной костной тканью (Kang et al., 2014).

С целью индукции репаративных процессов в клеточном микроокружении области повреждения было предложено внесение в неё факторов роста (Казакова В.С., 2015). Согласно литературным данным наиболее эффективны в качестве индукторов регенерации костной ткани и лучше всего исследованы два белка - BMP2 (bone morphogenetic protein 2, костный морфогенетический белок) и VEGF165 (vascular endothelial growth factor 165, фактор роста эндотелия сосудов 165) (Rivera et al., 2013; Beamer et al., 2010; Chan et al., 2015). BMP2, являясь дифференцировочным фактором, вызывающим дифференцировку клеток-предшественниц в хондрогенном и остеогенном направлениях, участвует как в энхондральном (при образовании трубчатых костей), так и в интрамембранозном (при формировании плоских костей, например, черепа) процессах формирования кости (Sheikh et al., 2015; Чеканов А.В., 2012). VEGF стимулирует ангиогенез, оказывает пролиферативный и антиапоптотический эффект, является хемоаттрактантом для эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Рост сосудов, за который отвечает VEGF, является инициирующим фактором остеогенеза при энхондральном остеогенезе (Neufeld et al., 1999).

Биомедицинские продукты и изделия медицинского назначения, включающие препараты на основе рекомбинантного белка BMP2 разрешены для клинического применения в ряде стран. Так, костнопластический

материал INFUSE, представляющий собой металлоконструкцию и абсорбирующую коллагеновую губку в комбинации с рекомбинантным белком BMP2, используется для переднего поясничного спондилодеза при спондилолистезе (Epstein, 2011). На основе плазмидной ДНК (плДНК), кодирующей VEGF165, так же существует зарегистрированный геннотерапевтический препарат - Неовакулген, предназначенный для лечения ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза (Иткес А.В., 2007), увеличивающий плотность капиллярной сети в ишемизированных тканях, тем самым улучшая кровоснабжение пораженных конечностей и снижая число ампутаций (Червяков Ю.В., 2016).

Репаративная регенерация костной ткани является длительным процессом, а действие вводимых белковых факторов in situ недолговечно вследствие их деградации в месте повреждения протеолитическими ферментами (Demidova-Rice et al, 2012), поэтому возник вопрос об экспрессии этих белков непосредственно клетками костного дефекта и окружающих его тканей. В связи с тесной взаимосвязью процессов ангиогенеза и остеогенеза в ходе репарации костной ткани, целесообразным является применению генной терапии с использованием bmp2 и vegf165a совместно в составе единого геннотерапевтического средства. Безопасным методом осуществления генного трансфера является применение плДНК, которая не иммуногенна и не интегрируется в геном клетки-хозяина (Nayerossadat et al., 2012). Таким образом, разработка и применение генетической конструкции на основе плДНК, ко-экспрессирующей гены bmp2 и vegf165a представляется актуальной.

Объединение подходов по имплантации остеопластических материалов и введению геннотерапевтических препаратов на основе плДНК, ко-экспрессирующей кДНК генов bmp2 и vegf165a с получением так называемых матриксов, совмещенных с ДНК (МСД), обладающих как остеокондуктивным, так и остеоиндуктивным эффектом, позволит не только восполнить значительное количество костной ткани веществом с заданной

микроархитектурой и механическими свойствами, но и дополнительно стимулировать остеогенез за счет привлечения и дифференцировки остеобластов и васкуляризации имплантата. Ранее в работах Р.В. Деева, И.Я. Бозо продемонстрирована эффективность применения МСД, содержащей плДНК кодирующую изолированно кДНК (кодирующую ДНК) vegf165, для восстановления целостности кости в области критического дефекта черепа (Бозо И.Я., 2017). Применение МСД, дополнительно несущих кДНК гена BMP2, при дефектах длинных трубчатых костей является логическим продолжением работ, начатых И.Я. Бозо. Большая эффективность ДНК-конструкций, несущих кДНК нескольких терапевтических генов по сравнению с моногенными конструкциями была продемонстирована в работах А.А. Ризванова, И.И. Салафутдинова на примере плДНК, несущей гены vegf и fgf2, применяемой для индукции ангиогенеза и нейрорегенерации (Ризванов А.А., 2014).

Таким образом, совместное воздействие белковых факторов VEGF165 и BMP2, синтезируемых клетками при трансфекции плазмидной конструкцией, несущей гены этих белковых факторов, на процессы остео- и ангиогенеза in vitro и репаративного остеогистогенеза in vivo представляет фундаментальный и практический интерес. Недостаток способов эффективной доставки плазмидной ДНК в клетки-мишени in vivo является основной причиной, ограничивающей применение генетических конструкций в генной терапии и биомедицине для стимуляции регенерации. В этой связи возможность использования МСД, выполняющих одновременно остеокондуктивную и остеоиндуктивную функцию, в качестве нового терапевтического инструмента, представляет несомненный практический интерес.

Цель работы: оценка индукции репаративного остеогенеза при применении кодон-оптимизированной плазмидной генетической конструкции, несущей кДНК генов vegf165a и bmp2 в составе матриксов, совмещенных с ДНК.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспрессионные плазмидные конструкции, кодирующие комбинации кДНК генов vegf165A и bmp2, а именно pBud-Kan-VEGF165A-BMP2, pBud-Kan-VEGF 165A-eGFP, pBud-Kan-eGFP-BMP2, для индукции остеогенеза.

2. Провести анализ процессов остеогенеза и ангиогенеза in vitro под влиянием рекомбинантных белков, синтезируемых под воздействием предложенных плазмидных конструкций.

3. Получить остеопластические матриксы, совмещенные с плазмидной конструкцией pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2 и оценить их цитотоксический эффект на культуры остеопрогениторных клеток in vitro.

4. Оценить процессы репаративного гистогенеза in vivo в модели гетеротопической имплантации матриксов, совмещенных с ДНК, в межмышечные пространства бедра крысы.

5. Оценить процессы репаративного остеогенеза in vivo в модели ортотопической имплантации матриксов, совмещенных с ДНК, в область дефекта бедренной кости крысы.

Научная новизна

В результате работы впервые создана плазмидная конструкция pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2, ко-экспрессирующая одновременно и независимо гены vegf165a и bmp2, оказывающие проангиогенное и проостеогенное действие. Полученная генетическая конструкция содержит кодон-оптимизированные последовательности кДНК генов vegf165a и bmp2, что способствует более активной экспрессии этих факторов в клетках. Впервые получены МСД на основе разработанной генетической конструкции pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2 и коммерчески доступных синтетических и натуральных остеопластических материалов, исследована ДНК-связывающая способность этих материалов. Показано, что модификация материалов плДНК не оказывает токсического эффекта на клетки потенциального реципиентного

ложа. Впервые остеопластические материалы, совмещенные с генетической конструкцией pBud-Kan-coVEGF165-coBMP2, были трансплантированы животным в гетеротопическое (внутримышечно) и ортотопическое (в область дефекта бедренной кости) положение и продемонстрирована их безопасность и эффективность в отношении индукции регенерационного остеогенеза длинных трубчатых костей. Имплантация МСД способствует более быстрому формированию костного регенерата по сравнению с обычными материалами. МСД способствует усилению васкуляризации и длительному поддержанию усиленной васкуляризации в области имплантации.

Научно-практическая значимость работы

Настоящая работа расширяет знания о воздействии плДНК, несущей кДНК генов vegf165 и bmp2 на процессы ангио- и остеогенеза in vitro и in vivo. В ходе выполнения работы различными методами было показано, что применение генетических конструкций, одновременно кодирующих синтез как VEGF165, так и BMP2, имеет преимущество перед генетическими конструкциями, кодирующими лишь один терапевтический ген в отношении стимуляции остеогенеза в культурах клеток ММСК и остеобластов.

Полученные результаты расширяют представления о возможностях терапевтического применения генетических конструкций, кодирующих одновременно синтез белков VEGF165 и BMP2. Известный синергичный эффект белков VEGF165 и BMP2, являющихся продуктами pBud-Kan-coVEGF165-coBMP2, в отношении стимуляции остеогенеза может быть использован при патологических процессах, сопровождающихся остеогенной недостаточностью. Включение в генетическую конструкцию гена vegf165 способствует повышенной васкуляризации тканей в области введения pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2, что открывает перспективу использования данной конструкции при повреждениях костной ткани, сопровождающихся нарушением местной трофики.

Используемые в работе методические подходы позволяют вводить pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2 в область повреждения кости в составе МСД, что обеспечивает как остеокондуктивный, так и остеоиндуктивный эффект, что имеет важное клиническое значение для восстановления целостности костного дефекта. Способность ДНК выдерживать высушивание позволяет использовать такие МСД в качестве готовой лекарственной формы, удобной в клиническом применении.

В полученной в результате работы плазмидной конструкции pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2 последовательность гена устойчивости к зеоцину и его про/эукариотический промотор заменены на последовательность гена устойчивости к канамицину и его прокариотический промотор, благодаря чему полученная конструкция не поддерживает синтез белка антибиотикорезистентности в эукариотических клетках реципиента. За счет данных модификаций плазмидная конструкция pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2 обладает характеристиками, соответствующими рекомендациям FDA для клинического применения.

В целом результаты настоящей работы, полученные в области исследования биологической активности pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2, будут способствовать развитию генной терапии и применению МСД при травмах и заболеваниях костной ткани.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантные белки VEGF165 и BMP2, синтезируемые клетками после их трансфекции двухкассетной генетической конструкцией pBud-Kan-coVEGF165-coBMP2, совместно оказывают более выраженное индуцирующее действие в отношении процессов остеогенной дифференцировки в культурах клеток in vitro, по сравнению с воздействием отдельных рекомбинантных белков VEGF165 или BMP2.

2. Остеопластические материалы на основе коллагена и гидроксиапатита совмещенные с плДНК pBud-Kan-coVEGF165-coBMP2, при

их имплантации в область костного дефекта способствуют привлечению и дифференцировке остеобластов за счет ВМР2 и ангиогенезу за счет УЕОБ165Л, что способствует более быстрому формированию костной ткани в составе регенерата, лучшей васкуляризации и более длительному ее поддержанию в области имплантации по сравнению с действием ординарных остеопластических материалов.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих всероссийских и международных симпозиумах, конгрессах и конференциях: Международная конференция «Трансляционная медицина 2016», Казань, 13-16 октября 2016; Международная биологическая школа-конференция БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 21-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Москва, 17-21 апреля 2017; Актуальные вопросы фундаментальной, экспериментальной и клинической морфологии: Всероссийская конференция молодых специалистов, Рязань, 6 октября 2017; III Национальный конгресс по регенеративной медицине, Москва, 15-18 ноября 2017; VII Всероссийский симпозиум с международным участием Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии, Астрахань, 27-28 апреля 2017; Пироговский форум с международным участием «Хирургия повреждений, критические состояния. Спаси и сохрани», 25-26 мая 2017; XXV конгресс ESGCT в сотрудничестве с Немецким обществом генной терапии, Берлин, 17-20 октября 2017; Всероссийская научно-практическая конференция «Современные методы диагностики и лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательного аппарата», Казань, 22-23 ноября 2018.

Место выполнения работы и личный вклад соискателя

Экспериментальные данные получены автором на базе Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Автор принимал участие в определении цели

исследовательской работы, планировал и проводил эксперименты in vitro и in vivo в соответствии с поставленными задачами работы, лично разрабатывал и проводил операции на модельных животных. Световые и флуоресцентные фотографии микропрепаратов сделаны автором. Полученные результаты автор лично описывал и обсуждал, проводил сравнительный анализ результатов с данными научной литературы. На основе полученных результатов автором опубликован ряд статей по теме диссертационной работы, материалы доложены на научных конференциях.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 1 5 печатных работ, в том числе 6 статей в научных журналах, из них 3 в рекомендованных ВАК, а также 5 в изданиях, индексируемых в базе данных Scopus, 9 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах.

Структура и объем работы

Материалы диссертационный работы изложены на 179 страницах машинописного текста. Работа содержит 40 рисунков и 8 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 223 источников, среди которых 35 отечественных и 188 зарубежных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления об эмбриональном и репаративном

остеогистогенезе

Как известно, источником развития костной ткани является мезенхима эмбриона. В развитии костной ткани участвуют два дифферона: остеогенный (стволовые остеогенные клетки, мультипотентные стромальные клетки, остеобласты, остеоциты) и гематогенный (конечный этап - остеокласты) (Keith, 1927; Гололобов В.Г., 2010). Эмбриональный гистогенез костной ткани происходит двумя путями: непосредственно из мезенхимы- прямой остеогистогенез (эндесмальный), либо из мезенхимы на месте ранее развившейся хрящевой модели кости - непрямой остеогистогенез (энхондральный) (Данилов Р.К., 2011).

Эндесмальный остеогистогенез характерен для развития грубоволокнистой костной ткани во время образования плоских костей (например, некоторых костей черепа) и проходит несколько последовательных стадий.

1. Стадия скелетогенного островка. На месте развития будущей кости происходит очаговое размножение мезенхимных клеток, в результате образуется скелетогенный островок и происходит его васкуляризация. В дифференцировке клеток мезенхимы в остеобласты участвуют два основных пути: путь BMP и путь Wnt. BMP2, BMP4 и BMP7 из эпидермиса головы связываются с BMPR-II (рецептор BMP 2 типа) в мезенхимных клетках нервного гребня, который активирует BMPR-I (рецептор BMP 1 типа) (Wang et al., 2014). BMPR-I фосфорилирует цитоплазматический Smad, который связывается с co-Smad и перемещается в ядро, где служит транскрипционным фактором, активирующим экспрессию Runx2. Runx2 активирует гены остеокальцина, остеопонтина, коллагена 1 типа, костного сиалопротеина и других специфичных для кости белков внеклеточного матрикса, что способствует дифференцировке клеток мезенхимы в остеобласты. Wnt

связывается с трансмембранным рецептором Frizzled и ко-рецептором LRP5/6, что приводит к внутриклеточному накоплению в-катенина, который проникает в ядро клетки, где взаимодействует с фактором транскрипции TCF/LEF, активирующим транскрипцию генов остеогенеза, в том числе Runx2 (Gilbert, 2000; Lin et al., 2011). Остеобласты периферической части островка синтезируют межклеточное вещество внутрь островка и способны к делению, в то время как остеобласты внутренних частей островка перестают делиться. За счет этого осуществляется периферический рост скелетогенного островка.

2. Остеоидная стадия. Остеобласты приобретают отростчатую форму и дифференцируются в остеоциты, продуцирующие межклеточное вещество с коллагеновыми волокнами и мукопротеидами (оссеомукоид). Недостаток VEGF-A на данной стадии приводит к сниженной продукции коллагена клетками как in vivo, так и in vitro (Hu et al., 2016).

3. Стадия минерализации. Остеобласты периферического слоя выделяют щелочную фосфатазу (ЩФ), которая расщепляет глицерофосфаты крови с высвобождением фосфорной кислоты, реагирующей с солями кальция с образованием сначала аморфных отложений Са3(РО4)2, из которого в дальнейшем в матриксных везикулах образуются кристаллы ГА Са10(РО4)6(ОН)2. Уровень экспрессии ЩФ, а, следовательно, и менерализации на этом этапе контролируется BMP2 через Wnt-путь (Rawadi et al., 2003). Под воздействием протеаз и мембранных фосфолипаз матриксные везикулы разрываются и сформированные кристаллы гидроксиапатита выходят в межклеточной пространство, где они связываются с волокнами коллагена посредством остеонектина, образуя костные балки (Омельяненко Н.П, 2009). Так образуется первичная губчатая кость, в которой толщина и ориентация трабекул зависят от величины и направления вектора нагрузки (ретикулофиброзная или грубоволокнистая костная ткань) (Barrère et al., 2006).

4. Образование пластинчатой костной ткани. Происходит формирование костной ткани, состоящей из нескольких непрерывных слоев пластинок.

Ретикулофиброзная костная ткань перестраивается с участием остеокластов и за счет врастания сосудов, вокруг которых за счет дифференцировки прилегающей мезенхимы образуются костные пластинки в форме цилиндров - первичные остеоны (Омельяненко Н.П., 2009). В процессе перестройки костной ткани VEGF связывает VEGFR1 в остеокластах и регулирует их дифференцировку и активацию, снижение VEGF ингибирует резорбцию костной ткани (Hu et al., 2016).

Энхондральный остеогистогенез характерен для развития длинных трубчатых костей. При этом из склеротома сомитов формируется скелетобластема, имеющая гетерогенный клеточный состав, включающий клетки эктодермы и эктомезенхимы. Непрямой остеогистогенез так же проходит ряд стадий (Данилов Р.К., 2011).

1. Стадия образования хрящевой модели кости. На месте будущих костей мезодермальные клетки конденсируются в компактные узлы за счет связывания N-кадгерином и N-CAM. Клетки секретируют транскрипционные факторы Paxl и Scleraxis, которые активируют гены, характерные для хрящевой ткани, в результате чего клетки мезенхимы дифференцируются в хондроциты (Gilbert, 2000). BMP2 индуцирует хондрогенез посредством активации экспрессии Sox9 (Zhou et al., 2016). Образуется зачаток, имеющий форму будущей кости и состоящий из эмбрионального гиалинового хряща, покрытого надхрящницей.

2. Стадия образования костной манжетки. В области диафиза клетки надхрящницы за счет врастания сосудов и увеличивающейся механической нагрузки дифференцируются в остеобласты, которые образуют вокруг хряща перихондральную ретикулофиброзную костную ткань. BMP2 из остеобластов аутокринном путем стимулирует дифференцировку остеобластов и секрецию ими VEGF-A, который повышает в них экспрессию BMP2. VEGF-A в сочетании с ангиопоэтином-1 стимулирует формирование сосудов, окруженных ММСК. BMP2 остеобластов паракринным путем воздействует на

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Журавлева Маргарита Николаевна, 2020 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ахтямов, И.Ф. Современные методы визуализации в диагностике остеонекроза головки бедренной кости / И.Ф. Ахтямов, Р.Х. Закиров, В.В. Лобашов // Вестник современной клинической медицины - 2014. Т.2. - С. 29.

2. Белоусов, Е.Ю. Опыт использования ангиогенной терапии в лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей / Белоусов Е.Ю., Сорока В.В., Нохрин С.П., Рязанов А.Н. // Трудный пациент - 2014. - Т.10 -С.40-43.

3. Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего [текст]: пат. 2519326 Рос. Федерация: МПК 7 C12Q1/68, C12N5/0789, A61K48/00, A61K47/48, A61K31/713 / Исаев А.А., Киселев С.Л., Деев Р.В., Бозо И.Я., Филоненко Е.С.; заявитель и патентообладатель: ООО «НекстГен»; завл: 29.12.2011; опубл.14.04.2014, Бюл. № 16.

4. Бозо, И.Я. Разработка и применение ген-активированного остеопластического материала для замещения костных дефектов: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. ФГБНУ Институт экспериментальной медицины, Москва, 2017.

5. Борзунов, Д.Ю. Удлинение отломков кости по Г.А. Илизарову. Эволюция способа (Обзор литературы) / Д.Ю. Борзунов // Гений ортопедии -2000. - 4. - 91-97.

6. Бухарова, Т.Б. Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека, трансфицированных геном костного морфогенетического белка BMP-2 / Т.Б. Бухарова, А.В. Волков, А.С. Воронин, К.А. Филимонов, С.С. Чаплыгин и др. // Клиническая и экспериментальная морфология - 2013. - №1. С. 45-51.

7. Волова, Л.Т. Биологическая система оценки качества биоимплантатов с помощью клеточных технологий / Л.Т. Волова // Успехи современного естествознания - 2008. - №5. - С. 86-87.

8. Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed): пат. 2297848 Рос. Федерация: МПК7 А61К 48/00, С12К 15/85, А61Р 9/14 / Иткес А.В., Киселев С.Л.; патентообладатель: Иткес А.В. - № 2005113934/15; заявл. 11.05.2005; опубл. 27.04.2007, Бюл. № 12.

9. Гололобов, В.Г. Костная ткань - Повреждение - Регенерация. Закономерные процессы посттравматического остеогистогенеза / В.Г. Гололобов // Вопросы морфологии XXI века - 2010. - В. 2. С. 90-95.

10. Гололобов, В.Г. Морфо-функциональная организация, реактивность и регенерация костной ткани / В.Г. Гололобов, А.К. Дулаев, Р.В. Деев и др. -Санкт-Петербург: ВМедА. - 2006.

11. Гололобов, В.Г. Органы опорно-двигательной системы. Гистогенез и регенерация / В. Г. Гололобов, И. А. Одинцова; под ред. Р. К. Данилова. -Санкт-Петербург: Военно-мед. акад. им. С. М. Кирова, 2010. - 28 с.

12. Данилов, Р.К. Руководство по гистологии / Р.К. Данилов. - Санкт-Петербург: СпецЛит, 2011. - С. 260-262.

13. Деев, Р.В. Ранние стадии регенерационного гистогенеза в периостальной части «костной мозоли» у человека / Р.В.Деев, И.Л. Плакса, М.О. Мавликеев, И.Я. Бозо, М.С. Абызова // Морфология - 2018. - Т.153, №2. - С.63-69

14. Денисов, А. В. Ультраструктурные изменения костной ткани при огнестрельных ранениях и пути их коррекции (экспериментально-клиническое исследование): диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ, Санкт-Петербург, 2010.

15. Емец, А.Н. К вопросу об осложнениях чрескостного остеосинтеза / А.Н. Емец, А.П. Сахарюк, Э.В. Ахобекова, Е.В. Кондрашин, Д.А. Оразлиев // Материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные принципы и технологии остеосинтеза костей конечностей, таза и позвоночника», Санкт-Петербург, 2015.

16. Ефименко, А. Ю. Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани / А. Ю. Ефименко, Е. Е. Старостина, Н. И. Калинина, Е. В.Парфенова // Гены и клетки - 2011. - №3.

17. Ефименко, Н.А. Характеристика боевой травмы и лечебные мероприятия при огнестрельных переломах длинных костей конечностей / Н.А. Ефименко, В.М. Шаповалов, А.К. Дудаев // Воен.-мед. журн. - 2003. - Т. 324, № 5. - С. 4-12.

18. Иванов, С. Ю. Синтетические материалы, используемые в стоматологии для замещения дефектов костной ткани / С. Ю. Иванов, Р. Ф. Мухаметшин, А. А. Мураев, А. П. Бонарцев, В. М. Рябова // Современные проблемы науки и образования - 2013. - № 1.

19. Казакова, В.С. Перспективы использования факторов роста в восстановлении костной ткани. Обзор литературы / В.С. Казакова, О.О. Новиков, Е.Т. Жилякова // Научный результат. Серия «Медицина и фармация» - 2015. - №3 (5).

20. Кишкун, А. А. Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции: руководство для врачей / А. А. Кишкун. -Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 973 с.

21. Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида [Текст]: пат. 2558294 Рос. Федерация: МПК7 C12N 15/00 / Ризванов А.А., Богов А.А., Масгутов Р.Ф., Богов А.А., Салафутдинов И.И., Исаев А.А., Деев Р.В., Бозо И.Я., Плакса И.Л.; патентообладатель ООО «НекстГен». - № 2014137218/10; заявл. 16.09.2014; опубл. 27.07.2015, Бюл. № 21.

22. Кодон-оптимизированные последовательности и фармацевтическая композиция [Текст]: пат. 2557385 Рос. Федерация: МПК7 C12N 15/00 / Ризванов А.А., Бозо И.Я., Исаев А.А., Соловьева В.В., Салафутдинов И.И., Деев Р.В.; патентообладатель ООО «НекстГен». - № 2014124845/10; заявл. 18.06.2014; опубл. 20.07.2015, Бюл. № 20.

23. Кузанов, А.И. Реваскуляризация костной ткани васкуляризированными надкостнично-кортикальными аутотрансплантатами: диссертация на

соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Российский научный центр хирургии Российской академии медицинских наук, Москва, 2005.

24. Макаревич, П.И. Терапевтический ангиогенез с применением факторов роста: современное состояние и перспективы развития / П.И. Макаревич, К.А. Рубина, Д.Т. Дыйканов, В.А. Ткачук, Е.В. Парфенова // Кардиология - 2015. -Т. 55, № 9. - С. 59-71.

25. Нагиева, С.Э. Перспективы трансплантации костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти (Обзор литературы) / С.Э. Нагиева, Ф.Э. Исмаилова, Э.Р. Нагиев // Научное обозрение. Медицинские науки - 2016. -№ 4. - С. 69-77.

26. Омельяненко, Н.П. Молекулярно-биологические и биохимические законмерности онтогенеза соединительно-тканных структур / Н.П. Омельяненко, Л.И. Слуцкий // Соединительная ткань (гистофизиология и биохимия). - М.: Известия, 2009. - Т. 2. - С.468.

27. Оноприенко, Г.А. Современные концепции процессов физиологического и репаративного остеогенеза / Г.А. Оноприенко, В.П. Волошин // Альманах клинической медицины - 2017. - №2.

28. Панкратов, А.С. Проблемы биоинтеграции микро- и нанокристаллического гидроксиапатита и подходы к их решению / А.С. Панкратов, И.С. Фадеева, В.В. Минайчев, П.О. Кирсанова, А.С. Сенотов, Ю.Б. Юрасова, В.С. Акатов // Гены и Клетки - 2018. Т. 3. - С. 46-51.

29. Предеин, Ю.А. Костные и клеточные имплантаты для замещения дефектов кости / Ю.А. Предеин, В.В. Рерих // Современные проблемы науки и образования - 2016. - № 6.

30. Солоницына, Л.А. Анализ основных положений федерального закона №180-ФЗ "О биомедицинских клеточных продуктах" / Л.А. Солоницына, С.В. Сазонов, С.Л. Леонтьев // Клеточные технологии - практическому здравоохранению 2016. Сборник научных работ V Межрегиональной научно-практической конференции - 2016. - С. 74-80.

31. Тихомиров, С. Е. Пластика дефектов свода черепа и твердой мозговой оболочки новым полимерным материалом Реперен / С. Е. Тихомиров, С. Н. Цыбусов, Л. Я. Кравец, А. П. Фраерман, А. А. Балмасов // Соврем. технол. мед. - 2010. - №2.

32. Тюмина, О.В. Культивирование мультипотентных мзенхимально-стромальных клеток для клинического применения. Проблемы / О.В. Тюмина, С.Е. Волчков, П.А. Овчинников, А.И. Горина // Программа и научные труды Научной конференции молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА - 2016. - С. 145.

33. Фриденштейн, А.Я. Гистогенетический анализ внескелетного остеогенеза: диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук, Москва, 1960.

34. Чеканов, А.В. Количественный эффект повышения остеоиндуктивности материала за счет включения в него рекомбинантного морфогенетического белка кости rhBMP- 2 / А.В. Чеканов, И.С. Фадеева, В.С. Акатов, М.Е. Соловьева, Н.В. Вежнина, М.В. Лекишвили // Клеточная трансплатология и тканевая инженерия - 2012. - Т. 2. - С.75-81.

35. Червяков, Ю.В. Пятилетние результаты лечения больных хронической ишемией нижних конечностей с использованием генной терапии / Ю.В. Червяков И.Н. Староверов, О.Н. Власенко, И.Я. Бозо, А.А. Исаев, Р.В. Деев // Ангиология и сосудистая хирургия - 2016. Т.22, №4.

36. Adams, S. L. Integration of signaling pathways regulating chondrocyte differentiation during endochondral bone formation / S. L. Adams, A. J. Cohen, and L. Lassova // J Cell Physiol. - 2007. - V. 213, №3. - P.635-41.

37. Albrektsson, T. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration / T. Albrektsson, and C. Johansson // Eur Spine J. - 2001. - V.10 - P.96-101.

38. Al-Dosari, M. S. Nonviral Gene Delivery: Principle, Limitations, and Recent Progress / M. S. Al-Dosari and X. Gao // The AAPS Journal - 2009. -V. 11, №4. -P. 671.

39. Al-Munajjed, A. A., Gleeson, J. P. and O'Brien, F.J. Development of a collagen calcium-phosphate scaffold as a novel bone graft substitute / Al-Munajjed, A. A., Gleeson, J. P., and O'Brien, F.J. // Stud Health Technol Inform. - 2008. -P.11-20.

40. Ampuja, M. Transcription factors-Intricate players of the bone morphogenetic protein signaling pathway / M. Ampuja, and A. Kallioniemi // Genes Chromosomes Cancer - 2018. - V.57, №1. - P. - 3-11.

41. Anindyajati, A. Plasmid Copy Number Determination by Quantitative Polymerase Chain Reaction / A. Anindyajati, A.A. Artarini, C. Riani, D.S Retnoningrum // Scientia Pharmaceutica - 2016. -V.84, №1. - P. 89-101.

42. Azzoni, A.R. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression / A.R. Azzoni, S.C. Ribeiro, G.A. Monteiro, and D.M. Prazeres // J Gene Med -2007. - V. 9. - P.392-402.

43. Bai, X. Adenovirus-Mediated VEGF Gene Therapy to Improve Bone Healing: A Comparison of in vivo and ex vivo Approaches / X. Bai, X. Zhang // Journal of Hard Tissue Biology. - 2013. - P.89-94

44. Balmayor, E.R. Gene Therapy for Bone Engineering / E.R. Balmayor and van Griensven // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology - 2015. - V.3. - P.9

45. Barradas, A.M., Osteoinductive biomaterials: current knowledge of properties, experimental models and biological mechanisms / A.M. Barradas, H. Yuan, van C.A. Blitterswijk, and P. Habibovic // Eur Cell Mater. - 2011. - V.15, №21. - P.407-29.

46. Barrere, F. Bone regeneration: molecular and cellular interactions with calcium phosphate ceramics. / F.Barrere, C.A. van Blitterswijk, K. de Groot // International Journal of Nanomedicine - 2006. - V.1, №3. - P.317-332.

47. Bastos, R. Nuclear pore complex proteins / R. Bastos, N. Pante and B. Burke // Int Rev Cytol. - 1995. - V.162B. - P257-302.

48. Beamer, B. Vascular endothelial growth factor: an essential component of angiogenesis and fracture healing / B. Beamer, C. Hettrich and J. Lane // HSS J. -2010. - V.6, №1. - P. 85-94

49. Birmingham, E. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells is regulated by osteocyte and osteoblast cells in a simplified bone niche / E. Birmingham, G.L. Niebur, P.E. McHugh, G. Shaw, F.P. Barry // Eur Cell Mater -2012. -V.12, №23. - P.13-27.

50. Bonadio, J. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration / J. Bonadio, E. Smiley, P. Patil and S. Goldstein // Nat Med - 1999. - V.5, №7. - P.753-759.

51. Boraiah, S. Complications of recombinant human BMP-2 for treating complex tibial plateau fractures: a preliminary report / S. Boraiah, O. Paul, D. Hawkes, M. Wickham, D.G Lorich // Clin Orthop Relat Res. - 2009. - V 467, №12.

- P.3257-3262.

52. Bose, S. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in biotechnology / S. Bose, M. Roy, A. Bandyopadhyay // Trends Biotechnol. - 2012.

- V.30, №10. - P.546-54.

53. Brandi, M.L. Vascular biology and the skeleton / M.L. Brandi, P.J. Collin-Osdoby // Bone Miner. Res. - 2006. - №21 - P. 183-192.

54. Bunnell, B.A. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation / B.A. Bunnell, M. Flaat, C. Gagliardi, B. Patel, C. Ripoll // Methods

- 2008. - №45. - P.115-20.

55. Byrne, A. M. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF) / A.M. Byrne, D.J. Bouchier-Hayes, J.H. Harmey // J Cell Mol Med.- 2005. -V.9, №4.- P. 777-794.

56. Carlevaro, M. F. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in cartilage neovascularization and chondrocyte differentiation: auto-paracrine role during endochondral bone formation / M. F. Carlevaro, S. Cermelli, R.Cancedda, Descalzi Cancedda F // J Cell Sci. - 2000 - V 113 - Pt 1 - P. 59-69.

57. Carreira, A. C. Bone Morphogenetic Proteins: structure, biological function and therapeutic applications / A. C. Carreira, G. G. Alves, W. F. Zambuzzi, M. C. Sogayar, J.M. Granjeiro // Arch Biochem Biophys. - 2014. - P. 64-73.

58. Castren, E. Osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells in two -dimensional and three-dimensional cultures without animal serum / E. Castren, T. Sillat, S. Oja // Stem Cell Research & Therapy - 2015. - P. 167.

59. Chaabo, F. Nutritional correlates and dynamics of diabetes in the Nile rat (Arvicanthis niloticus): A novel model for diet-induced type 2 diabetes and the metabolic syndrome / F. Chaabo, A. Pronczuk, E. Maslova // Nutrition & metabolism - 2010. - №7(1). - P. 29.

60. Chai, Y. C. Probing the osteoinductive effect of calcium phosphate by using an in vitro biomimetic model / Y.C. Chai, S.J. Roberts, J. Schrooten, F.P. Luyten // Tissue Eng Part A - 2011. - P.1083-1097.

61. Chan, C. K. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell / C. K. Chan, E. Y. Seo, J. Y. Chen, D. Lo, A. McArdle // Cell -2015. - V.160, №12. - P. 285 -298

62. Clark, D. Effects of Aging on Fracture Healing / D. Clark, M. Nakamura, T. Miclau, R. Marcucio // Curr Osteoporos Rep. - 2017. - V.15, №6. - P.601-608.

63. Curtin C.M. Combinatorial gene therapy accelerates bone regeneration: non-viral dual delivery of VEGF and BMP2 in a collagen-nanohydroxyapatite scaffold / C.M. Curtin, E.G. Tierney, K. McSorley, S.A. Cryan, G.P. Duffy, F.J. O'Brien // Adv Healthc Mater. - 2015 -V.4, №2. - P.223-227

64. D'Mello, S. Bone Regeneration Using Gene-Activated Matrices / S. D'Mello, K. Atluri, S.M. Geary // AAPS J - 2017. - P. 19- 43.

65. Deckers, M. M. Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors during osteoblast differentiation / M. M. Deckers, M.Karperien, C. van der Bent, T. Yamashita, S. E. Papapoulos, C. W. Lowik // Endocrinology - 2000 -V.141, №5. - P.1667-1674.

66. Demidova-Rice, T. N. Acute and Impaired Wound Healing: Pathophysiology and Current Methods for Drug Delivery, Part 2: Role of Growth Factors in Normal and Pathological Wound Healing: Therapeutic Potential and Methods of Delivery / T. N. Demidova-Rice, M. R.Hamblin, I. M. Herman // Advances in skin & wound care. -2012 - V 25 - №8 -P. 349-370.

67. Ding, Z. Molecular pathogenesis of fracture nonunion / Z. Ding, Y. Lin, Y. Gan, T. Tang, // Journal of Orthopaedic Translation. - 2018. - P.45-56.

68. Disis, M.L. Effect of dose on immune response in patients vaccinated with an her-2/neu intracellular domain protein-based vaccine / M.L. Disis, K. Schiffman, K. Guthrie, L.G. Salazar, K.L. Knutson, V. Goodell, C. dela Rosa, M.A. Cheever // J Clin Oncol. - 2004. - V.22, №10. - P.1916-25.

69. Dominici M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. / Dominici, M., K. Le Blanc, Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. // Cytotherapy - 2006. - Vol. 8(4): - P. 315317.

70. Dutta, S.R. Ceramic and non-ceramic hydroxyapatite as a bone graft material: a brief review / S.R.Dutta, D. Passi, P. Singh, A. Bhuibhar // J Med Sci. - 2015. -V.184, №1. - P.101-106.

71. El Bialy, I. Formulation, Delivery and Stability of Bone Morphogenetic Proteins for Effective Bone Regeneration / I. El Bialy, W. Jiskoot, M. Reza Nejadnik // Pharm Res. - 2017. - V.34, №6. - P.1152-1170.

72. Elangovan, S. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor / S. Elangovan, S.R. D'Mello, L. Hong, R.D. Ross, C. Allamargot, D.V. Dawson // Biomaterials - 2014. - V.35, №2. - P.737-747.

73. Endo, M. Bone regeneration by modified gene-activated matrix: effectiveness in segmental tibial defects in rats / M. Endo, S. Kuroda, H. Kondo, Y. Maruoka, K. Ohya, S. Kasugai // Tissue Eng. - 2006. - P.489-497.

74. Epstein, N.E. Pros, cons, and costs of INFUSE in spinal surgery / N.E. Epstein // Surgical Neurology International - 2011. - V.2. - P.10.

75. Evans C. Gene therapy for the regeneration of bone / C. Evans // Injury -2011. - V.42, №6. - P.599-604.

76. Fabre, J.W. Hydrodynamic gene delivery to the pig liver via an isolated segment of the inferior vena cava / J.W. Fabre, A. Grehan., M. Whitehorne, G.J. Sawyer, X. Dong // Gene Ther. - 2008. - V.15, № 6. - P.452-462.

77. Fei, Q.M. Changes with age and the effect of recombinant human BMP-2 on proteoglycan and collagen gene expression in rabbit anulus fibrosus cells / Q.M. Fei, X.X. Jiang, T.Y. Chen, J. Li, H. Murakami, K.J. Tsai, W. C. Hutton // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) - 2006. - V.38, №11. - P.773-779.

78. Feichtinger, G.A. Sonoporation increases therapeutic efficacy of inducible and constitutive BMP2/7 in vivo gene delivery / G.A. Feichtinger, A.T. Hofmann, P. Slezak, S. Schuetzenberger, M.Kaipel, E. Schwartz // Hum Gene Ther Methods -2014. - V.25, №1. - P.57-71.

79. Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure / P. L. Felgner, T. R. Gadek // Proc Natl Acad Sci U S A Journal - 1987. -V. 84, № 21. - P.7413-7417.

80. Ferreira, E. Sustained and promoter dependent bone morphogenetic protein expression by rat mesenchymal stem cells after BMP-2 transgene electrotransfer. / E. Ferreira, E. Potier, P. Vaudin, K. Oudina, M. Bensidhoum // Eur Cell Mater. -2012. - V.24. - P.18-28.

81. Frost, H.M. The biology of fracture healing. An overview for clinicans, part II. / H.M. Frost // Clin Orthop Rel Res. - 1989. V.248. - P.294-309.

82. Garrison, P. Spatial regulation of bone morphogenetic proteins (BMPs) in postnatal articular and growth plate cartilage / P. Garrison, S. Yue, J. Hanson, J. Baron, J.C. Lui // PLoS One - 2017. - V.12, №5. - P. e017675.

83. Ghiasi, M.S. Bone fracture healing in mechanobiological modeling: A review of principles and methods / M.S. Ghiasi, J. Chen, A. Vaziri, E.K. Rodriguez, A. Nazarian // Bone Rep. - 2017. - V.6. - P. 87-100.

84. Gilbert, S.F. Osteogenesis: The Development of Bones / S.F. Gilbert // Developmental Biology. 6th edition. - Sunderland (MA): Sinauer Associates, 2000.

85. Gill, D.R. Progress and prospects: the design and production of plasmid vectors / D.R. Gill, I.A. Pringle, S.C. Hyde // Gene Ther. - 2009. - V.16, №2/ - P. 165-171.

86. Gill, D.R. Progress and prospects: the design and production of plasmid vectors / D.R. Gill, I.A. Pringle, S.C.Hyde // Gene Ther. - 2009. - V.16, №2. -P.165-71.

87. Graham, F. L. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA / F. L. Graham & A. J. van der Eb // Virology - 1973. - V.52, №2. - P. 456-467.

88. Granjeiro, J.M. Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use / J.M. Granjeiro // Braz J Med Biol Res. - 2005. - V.38, №10. - P.1463-1473.

89. Guan, J. Bone morphogenetic protein 2 gene transduction enhances the osteogenic potential of human urine-derived stem cells / J. Guan, J. Zhang, Z. Zhu, // Stem Cell Research & Therapy - 2015. - V.6, №1. - P.5.

90. Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research. Hum Gene Ther. - 2001. - V.10, №12 (3). - P. 303-14.

91. Gupta, A.K. Hydroxyapatite crystals as a bone graft substitute in benign lytic lesions of bone / A.K. Gupta, P. Kumar, K. Keshav, A. Singh // Indian Journal of Orthopaedics - 2015. - V.49, №6. - P.649-655.

92. Hoellig, M. Mesenchymal stem cells from reaming material possess high osteogenic potential and react sensitively to bone morphogenetic protein 7 / M. Hoellig, F. Westhauser, K. Kornienko, K. Xiao, G. Schmidmaier, A. Moghaddam // J Appl Biomater Funct Mater. - 2017. - V.15, №1. - P.e54-e62.

93. Hu, K. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair / K. Hu, B.R.Olsen // J Clin Invest. - 2016. - V.126, №2. - P. 509-26.

94. Hu, K. The roles of vascular endothelial growth factor in bone repair and regeneration / K. Hu, and B.R. Olsen // Bone - 2016. - V.91. - P.30-38.

95. Johnston, K. Coexpression of proteins in bacteria using T7-based expression plasmids: expression of heteromeric cell-cycle and transcriptional regulatory complexes / K. Johnston, A. Clements, R.N.Venkataramani, R.C. Trievel, R. Marmorstein //Protein Expr Purif. - 2000. - V.20, №3. - P.435-43.

96. Joseph, V. Heterotopic bone formation with the use of rhBMP2 in posterior minimal access interbody fusion: a CT analysis / V. Joseph and Y.R. Rampersaud // Spine - 2007. - V.32, №25. - P.2885-2890.

97. Ju, Y. P. 3D printing technology to control BMP-2 and VEGF delivery spatially and temporally to promote large-volume bone regeneration / Y. P. Ju, S. Jin-Hyung, C. Song-Ah, J. Jang, M. Kim, S.H. Lee and Dong-Woo Cho // J. Mater. Chem. B. - 2015. - V.3. - P. 5415-5425; V.42. - P.599-604.

98. Kagiwada, H. Human mesenchymal stem cells as a stable source of VEGF-producing cells / H. Kagiwada, T. Yashiki, A. Ohshima, M. Tadokoro, N. Nagaya and H. Ohgushi // J Tissue Eng Regen Med. - 2008. - V.2, № 4. - P.184-189.

99. Kakudo, N. Immunolocalization of vascular endothelial growth factor on intramuscular ectopic osteoinduction by bone morphogenetic protein-2 / N. Kakudo, K. Kusumoto, Y.B. Wang, Y. Iguchi, Y. Ogawa // Life Sci. - 2006. - V.79, №19. -P.1847-1855.

100. Kanakaris, N. The health economics of the treatment of long-bone non-unions / N. Kanakaris and P. Giannoudis // Injury - 2007. - V.38 - P. 77-84.

101. Kang, Y. Engineering Vascularized Bone Grafts by Integrating a Biomimetic Periosteum and p-TCP Scaffold / Y. Kang, L. Ren, Y. Yang // ACS Applied Materials & Interfaces - 2014. V.6, №12. - P. 9622-9633.

102. Kawai, M. Ectopic bone formation by human bone morphogenetic protein-2 gene transfer to skeletal muscle using transcutaneous electroporation / M. Kawai, K. Bessho, S. Kaihara, J. Sonobe, K. Oda, T. Iizuka, H. Maruyama // Hum Gene Ther. - 2003. -V.1, №14. - Р. 1547-56.

103. Keith, A. Concerning the Origin and Nature of Osteoblasts / A. Keith // Proc R Soc Med. - 1927. - V.21,№2. -P.301-8.

104. Khan, M.A. Gene delivery using calcium phosphate nanoparticles: Optimization of the transfection process and the effects of citrate and poly(l-lysine) as additives / M.A. Khan, V.M. Wu, S. Ghosh, V.Uskokovic // Journal of colloid and interface science - 2016. - V.471. - P.48-58.

105. Khan, W.S. An Osteoconductive, Osteoinductive, and Osteogenic Tissue-Engineered Product for Trauma and Orthopaedic Surgery: How Far Are We? / W.S. Khan, F. Rayan, B.S. Dhinsa, D. Marsh // Stem Cells International - 2012. - V.2012. - P. 236231.

106. Kilborn, S.H. Review of growth plate closure compared with age at sexual maturity and lifespan in laboratory animals / S.H. Kilborn, G. Trudel, H. Uhthoff // Contemp Top Lab Anim Sci. - 2002. V.41, №5. - P.21-6.

107. Kim, H.J. Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells / H.J.Kim, J.F. Greenleaf, R.R. Kinnick, J.T.Bronk, M.E. Bolander // Hum Gene Ther. - 1996. V.10, №7(11). - P. 1339-46.

108. Kim, K-J. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes / K-J. Kim, H-E. Kim, K-H. Lee et al. // Protein Science: A Publication of the Protein Society - 2004. V.13, №6. - P. 1698-1703.

109. Kim, S.E. Co-delivery of platelet-derived growth factor (PDGF-BB) and bone morphogenic protein (BMP-2) coated onto heparinized titanium for improving osteoblast function and osteointegration / S.E. Kim, Y.P. Yun, J.Y. Lee, J.S. Shim, K.Park, J.B.Huh // J Tissue Eng Regen Med. - 2015. - V.9, №12. - P. E219-28.

110. Kishimoto, K.N. Ectopic bone formation by electroporatic transfer of bone morphogenetic protein-4 gene / K.N. Kishimoto, Y. Watanabe, H.Nakamura, S.Kokubun // Bone - 2002. V.31, №2. - P.340-7.

111. Krebs, M.D. Calcium phosphate-DNA nanoparticle gene delivery from alginate hydrogels induces in vivo osteogenesis / M.D. Krebs, E. Salter, E.Chen, K.A.Sutter, E. Alsberg // J Biomed Mater Res A - 2010. - V. 92, №3. - P. 1131-8.

112. Kwapisz, A. Correlations between BMP-4 gene expression, heterotopic ossification and function after uncemented total hip replacement / A. Kwapisz, P.

Kozlowski, J. Szemraj, M. Synder, M. Sibinski // Ortop Traumatol Rehabil. - 2013.

- V.15, №2. P.117-24.

113. Langenfeld, E.M. Bone morphogenetic protein-2 stimulates angiogenesis in developing tumors / E.M. Langenfeld, J. Langenfeld // Mol Cancer Res. - 2004. -V. 2, № 3. - P. 141-149.

114. Lechardeur, D. Nucleocytoplasmic Transport of Plasmid DNA: A Perilous Journey from the Cytoplasm to the Nucleus / D. Lechardeur & G. Lukacs // Human gene therapy - 2006. - V.17. - P. 882-9.

115. Lee, M. Comparative Analysis of Non-viral Transfection Methods in Mouse Embryonic Fibroblast Cells / M. Lee, K. Chea, R. Pyda, M. Chua, I. Dominguez // Journal of Biomolecular Techniques: JBT - 2017. - V.28, №2. - P. 67-74.

116. Li, J. BMP-2 plasmid DNA-loaded chitosan films - A new strategy for bone engineering / J. Li, J. Lin, W.Yu, X. Song, Q. Hu et al. // J Craniomaxillofac Surg.

- 2017. V. 45, №12. - P. 2084-2091.

117. Li, R. Effect of cell-based VEGF gene therapy on healing of a segmental bone defect / R. Li, D.J. Stewart, H.P. von Schroeder, E.S. Mackinnon, E.H. Schemitsch // J Orthop Res. - 2009. - V. 27, №1.- P. 8-14.

118. Lin, G.L. Integration of BMP, Wnt, and Notch signaling pathways in osteoblast differentiation / G.L. Lin, K.D. Hankenson // Journal of cellular biochemistry - 2011. - V.112, №12. - P 3491-3501.

119. Lipps, G. Plasmids: Current Research and Future Trends / G. Lipps // Caister Academic Press. - 2008.

120. Liu, D. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery / D. Liu // Gene Ther. - 2004. V.11, №8. P. 675-82.

121. Liu, F. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA / F. Liu, Y. Song, D. Liu // Gene Ther. - 1999. - V. 6, №7. - P. 1258-66.

122. Liu, J.Z. Co-expression of human bone morphogenetic protein-2 and osteoprotegerin in myoblast C2C12 / J.Z. Liu, Y.Y.Hu, Z.L.Ji. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. - 2003. - V.17, №1. - P. 1-4.

123. Liu, M.A. Human clinical trials of plasmid DNA vaccines / M.A. Liu, J.B. Ulmer // Adv Genet. - 2005. - V.55. - P. 25-40.

124. Liu, M.A. Human clinical trials of plasmid DNA vaccines / M.A. Liu, J.B. Ulmer // Adv Genet. - 2005. V.55. - P. 25-40.

125. Liu, T. Calcium phosphate nanoparticles as a novel nonviral vector for efficient transfection of DNA in cancer gene therapy / T. Liu, A. Tang, G. Zhang, Y. Chen, J. Zhang, S.Peng, Z.Cai // Cancer Biother Radiopharm. - 2005. - V. 20, №2. - P. 141-9.

126. Lodish, H. DNA Cloning with Plasmid Vectors, Section 7.1 / H. Lodish, A. Berk, S.L. Zipursky et al. // Molecular Cell Biology, 4th edition. - New York: W. H. Freeman, 2000.

127. Low, L. DNA vaccination with electroporation induces increased antibody responses in patients with prostate cancer / L. Low, A. Mander, K. McCann, D. Dearnaley, T. Tjelle, I. Mathiesen, F. Stevenson, C.H. Ottensmeier // Hum Gene Ther. - 2009. V.20, №11. - P. 1269-78.

128. Lu, C. Effect of age on vascularization during fracture repair / C. Lu, E. Hansen, A. Sapozhnikova, D. Hu, T. Miclau, R.S. Marcucio // Journal of orthopaedic research: official publication of the Orthopaedic Research Society - 2008. V. 26, №10. - P.1384-1389.

129. Lykissas, M. Use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in spine surgery / M. Lykissas, I. Gkiatas // World Journal of Orthopedics - 2017. V. 8, №7, P.531-535.

130. Madeira, C. Nonviral Gene Delivery to Mesenchymal Stem Cells Using Cationic Liposomes for Gene and Cell Therapy / C. Madeira, R. D. Mendes, S. Ribeiro et al. // Journal of Biomedicine and Biotechnology - 2010. V. 2010. -Article ID 735349. - 12 p.

131. Mali, S. Delivery systems for gene therapy / S. Mali, // Indian Journal of Human Genetics - 2013. V.19, №1.- P.3-8.

132. Marsell, R. The biology of fracture healing / R. Marsell, T.A. Einhorn // Injury - 2011. V. 42, №6. P.551-5.

133. Masgutov, R. Use of gene-activated demineralized bone allograft in the therapy of ulnar pseudarthrosis. Case report / R. Masgutov, M. Zhuravleva, G. Masgutova, A. Rizvanov, M. Chekunov et al. // BioNanoScience - 2017. - V.7, №1.

- P. 194-198.

134. Matsubara, H. Vascular tissues are a primary source of BMP2 expression during bone formation induced by distraction osteogenesis / H. Matsubara, D.E. Hogan, E.F.Morgan, D.P. Mortlock, T.A. Einhorn, L.C.Gerstenfeld // Bone - 2012.

- V.51, №1. - P. 168-80.

135. Mayer, H. Vascular endothelial growth factor (VEGF-A) expression in human mesenchymal stem cells: autocrine and paracrine role on osteoblastic and endothelial differentiation / H. Mayer, H. Bertram, W. Lindenmaier, T. Korff, H. Weber, H.Weich // J Cell Biochem. - 2005. - V. 95, №4. - P.827-39.

136. McKay, W. F. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft) / W.F. McKay, S.M. Peckham, J.M.Badura // Int Orthop. - 2007. -V.31, №6. P.729-734.

137. McMahon, M.S. Bone morphogenic protein 3 signaling in the regulation of osteogenesis / M.S. McMahon // Orthopedics - 2012. - V. 35, №11. - P.920.

138. Medina-Kauwe L.K. Intracellular trafficking of nonviral vectors / L.K. Medina-Kauwe, J. XieHamm-Alvarez // Gene Ther. - 2005. - V.12, №24. - P.1734-51.

139. Meinel, L. Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials: comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2 / L. Meinel, S. Hofmann, O. Betz, R. Fajardo, H.P. Merkle, R. Langer, C.H. Evans, G. Vunjak-Novakovic, D.L. Kaplan // Biomaterials - 2006. - V.27, №28. - P.4993-5002.

140. Mir, O. Avascular necrosis of the femoral head: A rare class-effect of anti-VEGF agents / O. Mir, R.Coriat, T.Gregory, S. Ropert, B. Billemont, F. Goldwasser // Investigational new drugs. - 2010. - V.29. - P. 716-8.

141. Miron, R.J. Osteoinduction: a review of old concepts with new standards / R.J. Miron, Y.F. Zhang // J Dent Res. - 2012. - V.91, №8. - P.736-44.

142. Morshed, S. Current Options for Determining Fracture Union / S. Morshed // Adv Med. - 2014. - V.2014. - P.708574.

143. Moya-Angeler, J. Current concepts on osteonecrosis of the femoral head / J. Moya-Angeler, A.L. Gianakos, J.C. Villa, A. Ni, J.M. Lane // World J Orthop. -2015. V.6, №8. - P.590-601.

144. Mulliken, J.B. Induced osteogenesis--the biological principle and clinical applications / J.B. Mulliken, L.B. Kaban, J. Glowacki // J Surg Res. - 1984. - V. 37, №6. - P.487-96.

145. Mulliken, J.B. Induced osteogenesis--the biological principle and clinical applications / J.B. Mulliken, L.B. Kaban, J. Glowacki // J Surg Res. - 1984. V. 37, №6. - P. 487-96.

146. Murphey, M.D. From the radiologic pathology archives imaging of osteonecrosis: radiologic-pathologic correlation / M.D. Murphey, K.L. Foreman, M.K. Klassen-Fischer, M.G.Fox, E.M.Chung, M.J. Kransdorf // Radiographics -2014. - V.34, №4. - P.1003-28.

147. Nagata, T. Codon optimization effect on translational efficiency of DNA vaccine in mammalian cells: analysis of plasmid DNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms / T. Nagata, M. Uchijima, A. Yoshida, M. Kawashima, Y. Koide // Biochem Biophys Res Commun. - 1999. - V.2, № 261(2).

- P.445-51. Bauer R. Optimization of codon usage is required for effective genetic immunization against Art v 1, the major allergen of mugwort pollen / R. Bauer, M. Himly, A. Dedic, F. Ferreira, J. Thalhamer, A. Hartl // Allergy. - 2003. - V.58. - P. 1003-1010.

148. Nakai, T. Mechanical stress up-regulates RANKL expression via the VEGF autocrine pathway in osteoblastic MC3T3-E1 cells / T. Nakai, Y. Yoshimura, Y. Deyama, K. Suzuki, J. Iida, T. Nakai, Y. Yoshimura, Y.Deyama, K. Suzuki, J. Iida // Molecular Medicine Reports. - 2009. - V.2. - P.229-234.

149. Nayerossadat, N. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery / N. Nayerossadat, T. Maedeh, P.A. Ali // Advanced Biomedical Research - 2012. V.1.

- P.27.

150. Neufeld, G. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors / G. Neufeld, T. Cohen, S. Gengrinovitch, Z. Poltorak // FASEB J. - 1999. - V.13, №1.

- P.9-22.

151. Ogilvie, C.M. Vascular Endothelial Growth Factor Improves Bone Repair in a Murine Nonunion Model / C.M. Ogilvie, C. Lu, R. Marcucio et al. // The Iowa Orthopaedic Journal - 2012. - V.32. - P.90-94.

152. Oryan, A. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? / A. Oryan, A. Kamali, A. Moshiri, M. Baghaban Eslaminejad // Cells Tissues Organs - 2017. - V.204, №2. - P.59-83.

153. Park, J.Y. 3D printing technology to control BMP-2 and VEGF delivery spatially and temporally to promote large-volume bone regeneration / J.Y. Park, JH. Shim, S-A. Choi, J. Jang, M. Kim, S. H. Lee, D-W. Cho // J. Mater. Chem. B, -2015. V. 3. - P. 5415-5425.

154. Park, S.H. BMP2-modified injectable hydrogel for osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells / S.H. Park, J.S. Kwon, B.S. Lee et al. // Scientific Reports - 2017. - V.7. - P.6603.

155. Peng, H. Noggin improves bone healing elicited by muscle stem cells expressing inducible BMP4 / H. Peng, A. Usas., D. Hannallah, A. Olshanski, G.M. Cooper, J. Huard // Mol Ther. - 2005. - V.12, №2. - P.239-46.

156. Perkins, J.R. Transient protein-protein interactions: structural, functional, and network properties / J.R. Perkins, I. Diboun, B.H. Dessailly, J.G.Lees, C. Orengo // Structure - 2010. - V.13, №18(10). - P.1233-43.

157. Qin, J.Y. Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter / J.Y. Qin, L.Zhang, K.L. Clift et al. // PLoS ONE

- 2010. - V.5, №5. - P.e10611.

158. Rao, S.M. Bone morphogenetic proteins: periodontal regeneration / S.M. Rao, G. M.Ugale, S. B.Warad // N Am J Med Sci. - 2013. -V.5. - P. 161-168.

159. Rawadi, G. BMP-2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop / G. Rawadi, B. Vayssiere, F. Dunn, R. Baron, S. Roman-Roman // J Bone Miner Res. - 2003. - V.18, №10. - P.1842-53.

160. Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals / Recillas-Targa F. // Mol Biotechnol. - 2006. V.34, №3. P. 337-354.

161. Reddi, A.H. (1981) Cell biology and biochemistry of endochondral bone development. Coll Relat Res 1: 209-226

162. Regard, J.B. Activation of Hedgehog signaling by loss of GNAS causes heterotopic ossification / J.B. Regard, D. Malhotra, J. Gvozdenovic-Jeremic, M. Josey, M. Chen, L.S.Weinstein, J. Lu et al. // Nat Med. - 2013. - V.19, №11. -P.1505-12.

163. Rice, J. DNA vaccines: precision tools for activating effective immunity against cancer / J. Rice, C.H.Ottensmeier, F.K.Stevenson // Nat Rev Cancer - 2008. - V.8, №2. - P.108-20.

164. Rivera, J.C. Beyond osteogenesis: an in vitro comparison of the potentials of six bone morphogenetic proteins / J.C. Rivera, C.A. Strohbach, J. C. Wenke, C.R. Rathbone // Frontiers in Pharmacology - 2013. - V. 4. - P. 125.

165. Rodríguez-Évora, M. Osteogenic effect of local, long versus short term BMP-2 delivery from a novel SPU-PLGA-ßTCP concentric system in a critical size defect in rats / M. Rodríguez-Évora, A. Delgado, R. Reyes, A. Hernández-Daranas, I. Soriano, J. San Román, C. Evora // Eur J Pharm Sci. - 2013. - V.16, №49(5). -P.873-84.

166. Rosen, C. J. Bone innervation in dynamic / C. J. Rosen, R. Bouillon, J. E. Compston, V. Rosen, D. P. Bauer. // Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. 9th ed. - Ames, Iowa: Wiley-Blackwell, 2018. - P. 1029.

167. Rosenberg, A.M. The binding of DNA to native type II collagen / A.M. Rosenberg, D.W. Hunt, R.E.Petty // J Rheumatol. - 1983. - V.10, №6. - P.925-9.

168. Roy, I. Calcium phosphate nanoparticles as novel non-viral vectors for targeted gene delivery / I. Roy, S. Mitra, A. Maitra, S. Mozumdar // Int J Pharm. -2003. - V.2, №250(1). - P.25-33.

169. Rucker, P. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems / P. Rucker, F.M.Torti, S.V.Torti // Protein Eng. - 1997.

- V. 10, №8. - P.967-73.

170. Saran, U. Role of angiogenesis in bone repair / U. Saran, S. Gemini Piperni, S. Chatterjee // Arch Biochem Biophys. - 2014. - V.1, №561. - P.109-17.

171. Sasabe, R. Effects of joint immobilization on changes in myofibroblasts and collagen in the rat knee contracture model / R. Sasabe, J. Sakamoto, K. Goto,Y. Honda, H. Kataoka, J. Nakano et al. // J Orthop Res. - 2017. - V.35, №9. - P.1998-2006.

172. Schlenk, F. Recent developments and perspectives on gene therapy using synthetic vectors / F. Schlenk, S. Grund, D. Fischer // Ther Deliv. - 2013. V.4, №1.

- P. 95-113.

173. Seamon, J. Adenoviral Delivery of the VEGF and BMP-6 Genes to Rat Mesenchymal Stem Cells Potentiates Osteogenesis / J. Seamon, X. Wang, F. Cui // Bone Marrow Research. - 2013; - № 737580.

174. Seib, F.P. Endogenous bone morphogenetic proteins in human bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells / F.P. Seib, M. Franke, D. Jing, C. Werner, M. Bornhäuser // Eur J Cell Biol. - 2009. - V. 88, №5. - P.257-71.

175. Shao, J. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing / J. Shao, W. Zhang, T. Yang // Biological Research - 2015. - V.48. -P.62.

176. Sharma, S. Adenoviral Mediated Expression of BMP2 by Bone Marrow Stromal Cells Cultured in 3D Copolymer Scaffolds Enhances Bone Formation / S. Sharma, D. Sapkota, Y.Xue et al. // PLoS ONE - 2016. - P.11, №1. - P.e0147507.

177. Sheikh, Z. Bone Regeneration Using Bone Morphogenetic Proteins and Various Biomaterial Carriers / Z. Sheikh, M.A. Javaid, N.Hamdan, R. Hashmi, I. Rehman // Materials - 2015. - V.8, №4. P.1778-1816.

178. Sheridan, C. Gene therapy finds its niche / C. Sheridan // Nat Biotechnol. -2011. - V.29, №2. - P. 121-128.

179. Sheyn D. Ultrasound-based nonviral gene delivery induces bone formation in vivo / D. Sheyn, N. Kimelman-Bleich, G. Pelled, Y. Zilberman, D.Gazit, Z. Gazit // Gene Ther. - 2008. - V.15, №4. - P. 257-66.

180. Shi, L. Heterotopic ossification related to the use of recombinant human BMP-2 in osteonecrosis of femoral head / L. Shi, W. Sun, F. Gao, L. Cheng, Z. Li // Medicine - 2017. - V.96, №27. - P.e7413.

181. Shu, B. BMP2, but not BMP4, is crucial for chondrocyte proliferation and maturation during endochondral bone development / B. Shu, M. Zhang, R. Xie et al. // J Cell Sci. - 2011. - V.124, №20. - P.3428-40.

182. Simon, M.C. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function / M.C. Simon, B. Keith // Nature reviews Molecular cell biology

- 2008. - V.9, №4, - P. 285-296.

183. Spector, J.A. Osteoblast expression of vascular endothelial growth factor is modulated by the extracellular microenvironment / J.A. Spector, B.J. Mehrara, J.A. Greenwald, P.B. Saadeh, D.S. Steinbrech, et al. // Am J Physiol Cell Physiol. - 2001.

- V. 280, №1. - P.C72-80.

184. Steinbrech, D.S. VEGF expression in an osteoblast-like cell line is regulated by a hypoxia response mechanism / D.S. Steinbrech, B.J. Mehrara, P.B. Saadeh, J.A. Greenwald, J.A. Spector, G.K. Gittes, M.T. Longaker // Am J Physiol Cell Physiol.

- 2000. - V. 278, №4. - P.C853-60.

185. Suk-Jun, L. Enhancement of bone regeneration by gene delivery of BMP2/Runx2 bicistronic vector into adipose-derived stromal cells / L. Suk-Jun, S-W. Kang, H-J. Do, I. Han, D. A.Shin, J-H. Kim, S-H. Lee // Biomaterials - 2010. -V.31, № 21. - P.5652-5659.

186. Sun, J. A crucial role of IL-17 in bone resorption during rejection of fresh bone xenotransplantation in rats / J. Sun, X. Wang, C. Fu, D. Wang, Z. Bi // Cell Biochem Biophys. - 2015. - V.71, №2. - P.1043-9.

187. Sun, J. Role of bone morphogenetic protein-2 in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells / J. Sun, J. Li, C. Li, Y. Yu // Molecular Medicine Reports

- 2015. - V.12, №3. - P.4230-4237.

188. Suzuki, O. Octacalcium phosphate (OCP)-based bone substitute materials / O. Suzuki // Japanese Dental Science Review - 2013. - V.49, №2. - P. 58-71.

189. Sykaras, N. Bone morphogenetic proteins (BMPs): how do they function and what can they offer the clinician? / N. Sykaras, L.A. Opperman // J Oral Sci. -2003.

- V.45, №2. - Р. 57-73.

190. Szymonowicz, M. Cytotoxicity Evaluation of High-Temperature Annealed Nanohydroxyapatite in Contact with Fibroblast Cells / M. Szymonowicz, M. Korczynski, M. Dobrzynski, K. Zawisza, M. Mikulewicz, E. Karuga-Kuzniewska, B. Zywickab, Z. Rybak, R.J. Wiglusz // Materials (Basel) - 2017. - V. 27, №10(6).

- P. E590.

191. Tagawa, S.T. Phase I study of intranodal delivery of a plasmid DNA vaccine for patients with Stage IV melanoma / S.T. Tagawa, P. Lee, J.Snively, W. Boswell, S. Ounpraseuth, S. Lee et al. // Cancer - 2003. - V.1, № 98(1). - P.144-54.

192. Tai, W. Functional peptides for siRNA delivery / W. Tai, X. Gao // Adv Drug Deliv Rev. - 2016. - V.110-111. - P.157-168.

193. Tan, T.Y. Monoallelic BMP2 Variants Predicted to Result in Haploinsufficiency Cause Craniofacial, Skeletal, and Cardiac Features Overlapping Those of 20p12 Deletions / T.Y.Tan, C. Gonzaga-Jauregui, E.J. Bhoj, K.A. Strauss, K. Brigatti, // Am J Hum Genet. - 2017. - V.101 - №6 - P. 985-994.

194. Teschendorf, C. Comparison of the EF-1 alpha and the CMV promoter for engineering stable tumor cell lines using recombinant adeno-associated virus / C. Teschendorf, K.H. Warrington, D.W. Siemann, N.Muzyczka // Anticancer Res. -2002. - V.22, №6A. - P.3325-30.

195. Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy / C. E. Thomas, A. Ehrhardt, M. A. Kay //Nature Reviews Genetics. -2003.

- V.4, №5. - Р. 346-358.

196. Titomirov, A.V. In vivo electroporation and stable transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA / A.V. Titomirov, S.Sukharev, E. Kistanova // Biochim Biophys Acta - 1991. - V.1088, №1. - V.131-4.

197. Tolmachov, O. Designing plasmid vectors / O. Tolmachov // Methods Mol Biol. - 2009. - V.542. P.117-29.

198. Tsunoda, S. Sonoporation using microbubble BR14 promotes pDNA/siRNA transduction to murine heart / S. Tsunoda, O. Mazda, Y. Oda, Y. Iida, S. Akabame et al. // Biochem Biophys Res Commun. - 2005. - V.14, № 336(1). - P. 118-27.

199. Urist, M.R. Bone: formation by autoinduction / M.R. Urist // Science - 1965. V. 150. - P. 893-899.

200. van den Beucken, J.J.J.P. Multilayered DNA coatings: In vitro bioactivity studies and effects on osteoblast-like cell behavior / J.J.J.P. van den Beucken, X.F. Walboomers, S.C.G. Leeuwenburgh, M.R.J. Vos, N.A.J.M. Sommerdijk, R.J.M. Nolte and J.A. Jansen // Acta Biomaterialia - 2007. - V. 3, № 4. - P.587-596.

201. Viguet-Carrin, S. The role of collagen in bone strength / S. Viguet-Carrin, P. Garnero, P.D. Delmas // Osteoporos Int. - 2006. V.17, №3. P.319-36.

202. Wagner-Ecker, M. The collagen component of biological bone graft substitutes promotes ectopic bone formation by human mesenchymal stem cells / M. Wagner-Ecker, P. Voltz, M. Egermann, W. Richter // Acta Biomater. - 2013. - V.9, №7. - P.7298-307.

203. Wang, D. Bone regeneration in critical-sized bone defect enhanced by introducing osteoinductivity to biphasic calcium phosphate granules / D. Wang, A.Tabassum, G.Wu, L. Deng, D. Wismeijer, Y. Liu // Clin Oral Implants Res. -2017. - V. 28, №3. - P.251-260.

204. Wang, R.N. Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in development and human diseases / R.N. Wang, J.Green, Z.Wang, Y.Deng, M. Qiao, M.Peabody, et al. // Genes Dis. - 2014. - V.1, №1. - P.87-105.

205. Wang, W. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells / W. Wang, Y.L. Jia , Y.C. Li, C.Q. Jing, X.Guo, X.F. Shang, C.P. Zhao, T.Y. Wang // Sci Rep. - 2017. - V.5, №7(1). -P.10416.

206. Wang, X. The EF-1a promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells / X. Wang, Z. Xu, Z. Tian et al. // Journal of Cellular and Molecular Medicine - 2017. V.21, №11. P.3044-3054.

207. Wegman F. Gene delivery of bone morphogenetic protein-2 plasmid DNA promotes bone formation in a large animal model / F. Wegman, R.E.Geuze, Y.J. van der Helm, F. Cumhur Oner, W.J. Dhert, J. Alblas // J Tissue Eng Regen Med. - 2014. V.8, №10. P.763-70.

208. Welzel, T. Transfection of cells with custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA / T. Welzel, I. Radtke, W. Meyer-Zaika, R. Heumannb, M. Epple // J. Mater. Chem. - 2004. - V.14. - P.2213-2217.

209. Williams, P.D. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease / P.D. Williams, P.A. Kingston // Cardiovascular Research. - 2011. - V.91, №4. - P. 565-576.

210. Wu, Y. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis / Y. Wu, L. Chen, P.G.Scott, E.E. Tredget // Stem Cells. - 2007. V. 25, №10. - P.2648-59.

211. Yang, Q. VEGF enhancement of osteoclast survival and bone resorption involves VEGF receptor-2 signaling and beta3-integrin / Q. Yang, K.P. McHugh, S. Patntirapong, X. Gu, L. Wunderlich, P.V. Hauschka // Matrix Biol. - 2008. - V. 27, №7. - P.589-99.

212. Yang, W. Bmp2 in osteoblasts of periosteum and trabecular bone links bone formation to vascularization and mesenchymal stem cells / W. Yang, D. Guo, M.A. Harris // J Cell Sci. - 2013. V.126, №18. - P.4085-98.

213. Yang, Y-Q. The role of vascular endothelial growth factor in ossification / Y-Q. Yang, Y-Y.Tan, R.Wong, A.Wenden, L-K.Zhang, A.B.M. Rabie // International Journal of Oral Science - 2012. - V.4, №2. - P.64-68.

214. Ye, L. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials / L.Ye, S-K. Chen, L. Li, L. Qin, X-L. Wang, Y-X. Lai // Journal of Orthopaedic Translation. - 2015. - V.3, №3. - P.95-104.

215. Yuan, H. Bone formation induced by calcium phosphate ceramics in soft tissue of dogs: A comparative study between Alpha-TCP and Beta-TCP / H. Yuan, J.D. de Bruijn, Y. Li, Z. Feng, K. Yang, K. de Groot, X. Zhang // J Mater Sci Mater Med. - 2001a. - V.12. - P.7-13.

216. Yuan, H. Bone induction by porous glass ceramic made from bioglass (45s5) / H. Yuan, J.D. de Bruijn, X. Zhang, C.A. van Blitterswijk, K. de Groot // J Biomed Mater Res. - 2001b. - V.58. - P.270-276.

217. Yuan, H. Osteoinductive ceramics as a synthetic alternative to autologous bone grafting / H. Yuan, H. Fernandes, P. Habibovic, J. de Boer, A.M. Barradas et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2010. - V.107. - P.13614-13619.

218. Zhang, G. Long-term expression of human alpha1-antitrypsin gene in mouse liver achieved by intravenous administration of plasmid DNA using a hydrodynamics-based procedure / G. Zhang, Y.K. Song, D.Liu // Gene Ther. - 2000. V.7, №15. - P.1344-9.

219. Zhang, R. Wnt/p-catenin signaling activates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts / R. Zhang, B.O. Oyajobi, S.E. Harris et al. // Bone 2013. - V.52, №1. - P./145-156.

220. Zhao, M. The zinc finger transcription factor Gli2 mediates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts in response to hedgehog signaling / M. Zhao, M. Qiao, S.E. Harris, D. Chen, B.O. Oyajobi, G.R.Mundy // Mol Cell Biol. - 2006. - V.26. P. 6197-6208.

221. Zhou, N. BMP2 induces chondrogenic differentiation, osteogenic differentiation and endochondral ossification in stem cells / N. Zhou, Q. Li, X. Lin, N. Hu, J.Y. Liao et al. // Cell Tissue Res. - 2016. - V.366, №1. - P.101-11.

222. Zhou, W. Gene Therapy and Gene Delivery Systems / W. Zhou, D. V. Schaffer // Springer, 2005.

223. Zhou, Z.C. VEGF, eNOS, and ABCB1 genetic polymorphisms may increase the risk of osteonecrosis of the femoral head / Z.C. Zhou, S.Z. Gu, J. Wu, Q.W.Liang // Genet Mol Res. - 2015. V. 29, №14(4). - P.13688-98.