Ген-активированные матриксы, импрегнированные полиплексами с геном BMP2, для регенерации костной ткани тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Недорубова Ирина Алексеевна

• Недорубова Ирина Алексеевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Недорубова Ирина Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цель исследования

Задачи, решаемые в ходе исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая и практическая значимость исследования

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация работы

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Репаративная регенерация костной ткани

1.2 Костные морфогенетические белки для регенерации костной ткани

1.3 Доставка генетических конструкций в клетки

1.3.1 Вирусные системы доставки генов

1.3.2 Невирусные системы доставки генов

1.4 Доставка генетических конструкций в зону регенерации

1.4.1 Природные биоматериалы

1.4.2 Синтетические биоматериалы

1.4.3 Ген-активированные матриксы, содержащие плазмидные конструкции с геном BMP2, для регенерации костной ткани

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Получение плазмидной ДНК

2.1.1 Трансформация E.coli плазмидной ДНК

2.1.2 Получение биомассы E.coli и выделение плазмидной ДНК

2.1.3 Рестрикция и анализ фрагментов ДНК в агарозном геле

2.1 Клеточные культуры

2.2.1 Получение и культивирование клеточных культур

2.2.2 Трансфекция клеток

2.2.3 Оценка эффективности трансфекции клеток

2.2.4 Оценка жизнеспособности ММСК ЖТ по результатам МТТ-теста

2.2.5 Оценка остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ

2.2.6 Сокультивирование трансфицированных и необработанных ММСК ЖТ

2.3 Исследования матриксов in vitro

2.3.1 Матриксы

2.3.2 Оценка цитотоксичности матриксов

2.3.3 Исследование адгезии клеток на поверхности матриксов методом сканирующей электронной микроскопии

2.3.4 Оценка кинетики высвобождения полиплексов из матриксов

2.3.5 Оценка трансфицирующей способности полиплексов в составе матриксов in vitro

2.3.6 Оценка остеоиндуктивных свойств матриксов, импрегнированных полиплексами TF/pBMP2, in vitro

2.4. Исследования матриксов in vivo

2.4.1 Модель внутримышечной имплантации

2.4.2 Модель критического дефекта теменных костей крыс

2.4.3 Микрокомпьютерная томография

2.4.4 Гистологическое исследование

2.4.5 Морфометрия

2.5 Статистическая обработка

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Определение оптимальных условий трансфекции клеточных культур ММСК ЖТ

3.1.1 Сравнение трансфицирующих агентов TurboFect, PEI и Lipofectamine 2000 для доставки плазмиды pEGFP-C1 в ММСК ЖТ

3.1.2 Определение соотношения TurboFect и плазмиды pEGFP-C1 для трансфекции ММСК ЖТ

3.1.3 Определение оптимальных условий трансфекции ММСК ЖТ полиплексами TF/pEGFP

3.1.4 Трансфекция суспензионных культур ММСК ЖТ полиплексами TF/pEGFP

3.2 Исследование особенностей остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после инкубации с полиплексами с геном BMP2

3.2.1 Сравнительная оценка индукции остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ различными полиплексами с геном BMP2

3.2.2 Индукция остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ при сокультивировании с ММСК ЖТ, трансфицированными полиплексами с геном BMP2

3.3 Исследование матриксов in vitro

3.3.1 Оценка цитотоксичности матриксов на основе PLA-гранул, хитозанового гидрогеля с разной степенью деацетилирования хитозана и PRP при инкубации с ММСК ЖТ

3.3.2 Выбор условий импрегнации полиплексов в PLA-гранулы

3.3.3 Оценка кинетики высвобождения полиплексов из матриксов PLA, PLA/Chit и PLA/PRP

3.3.4 Оценка цитотоксичности матриксов PLA, PLA/Chit и PLA/PRP, импрегнированных полиплексами TF/pBMP2

3.3.5 Исследование эффективности трансфекции ММСК ЖТ полиплексами в составе матриксов PLA, PLA/Chit и PLA/PRP

3.3.6 Исследование остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после инкубации с матриксами на основе PLA, PLA/Chit и PLA/PRP, импрегнированных полиплексами TF/pBMP2

3.4 Исследование матриксов in vivo

3.4.1 Оценка биосовместимости матриксов на основе PLA, PLA/Chit и PLA/PRP in vivo

3.4.2 Оценка остеоиндуктивного действия TF/pBMP2-матриксов in vivo на модели критического дефекта теменных костей крыс

3.5 Протокол получения ген-активированных матриксов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

119

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России

Список публикаций в других изданиях

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГКИТ - гигантские клетки инородных тел

ДМЕМ - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)

ДМСО - диметилсульфоксид

ИФА - иммуноферментный анализ

Микро-КТ - Микрокомпьютерная томография

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

MTT - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

AAV - adeno-associated virus (аденоассоциированный вирус)

ACTp - actin в (бета-актин)

ALPL - alkaline phosphatase (щелочная фосфатаза)

BMP - bone morphogenetic protein (костный морфогенетический белок)

BGLAP - bone gamma-carboxyglutamate protein (ген остеокальцина)

CAG - CMV early enhancer/chicken в actin promoter (промотор в-актина цыпленка в

сочетании с ранним энхансером CMV)

CMV - cytomegalovirus promoter (промотор цитомегаловируса человека)

Col - collagen (коллаген)

DAPI - 4,6-diamidino-2-phenylindole

EFla - human elongation factor-1 alpha promoter (промотор фактора элонгации 1a человека)

EGFP - enhanced green fluorescent protein (усиленный зеленый флуоресцентный белок)

FGF - fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов)

GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (глицеральдегид фосфат дегидрогеназа)

GC - foreign-body giant cell (гигантские клетки инородных тел)

HEK293 - Human Embryonic Kidney 293 (клетки почки эмбриона человека)

Lipo2000 - Lipofectamine

Ora - osteocalcin (остеокальцин)

Opn - osteopontin (остеопонтин)

PEI - polyethylenimine

PLA - Polylactic Acid (полимолочная кислота)

PLGA - poly(lactic-co-glycolic acid) (сополимер молочной-гликолевой кислот) Runx2 - Runt-related transcription factor 2 (транскрипционный фактор 2) SPP1 - secreted phosphoprotein 1 (ген остеопонтина) SV40 - simian virus 40 promoter (ранний промотор вируса обезьяны 40) TF - TurboFect

UBC - human ubiquitin C promoter (промотор убиквитина C человека) WBC - white blood cells (лейкоциты)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Восстановление структуры и функций поврежденной костной ткани является актуальной задачей в таких областях медицины, как ортопедия, стоматология и челюстно-лицевая хирургия. На данный момент для лечения дефектов костей применяют костные трансплантаты, полученные от пациента или донора, и синтетические остеопластические материалы. Однако существующие терапевтические подходы имеют ряд ограничений. Аутотрансплантаты, хотя и обладают остеокондуктивными свойствами и способствуют эффективной остеоиндукции благодаря естественным факторам роста, для взятия аутотрансплантанта необходимо проведение дополнительных хирургических процедур, что сопряжено с риском возникновения местных осложнений, таких как хроническая боль и гиперчувствительность в месте оперативного вмешательства. Аллогенные трансплантаты исключают проблему болевого синдрома на месте взятия материала для восполнения костного дефекта, могут быть получены в неограниченном количестве и в нужной конфигурации. Однако, они также имеют ряд недостатков, связанных с риском отторжения трансплантата и передачи заболеваний и инфекции. Для снижения риска иммунного ответа на аллотрансплантацию, донорскую костную ткань подвергают специальной обработке, которая изменяет структуру трансплантата, что влияет на его механические свойства и способность стимулировать заживление кости [Archunan и др., 2021]. Используемые синтетические остеопластические материалы, как правило, не позволяют восстановить в полной мере структуру и функциональные свойства тканей в зоне дефекта. Поэтому для решения вопроса эффективной регенерации костной ткани наиболее перспективным является разработка новых биодеградируемых имплантатов, способных не только поддерживать формирование новой костной ткани, но и индуцировать неоостеогенез.

Одним из наиболее эффективных индукторов остеогенеза, активирующим экспрессию маркеров остеобластов, является костный морфогенетический белок 2 (bone morphogenetic protein 2, BMP-2). По результатам клинических и экспериментальных исследований было показано, что материалы с BMP-2 являются более эффективными по сравнению с традиционными неактивированными костно-пластическими материалами [Кузнецова и др., 2019]. Однако, доставка факторов роста для стимулирования регенеративных процессов все еще имеет существенные недостатки [Lee и др., 2019b; Witte De и др., 2018]. Из-за короткого периода полураспада и ферментативной деградации фактора роста в месте имплантации необходимо добавление высокой концентрации остеоиндуктора для достижения терапевтического эффекта, что может вызывать серьезные осложнения.

Другим подходом, направленным на усиление и стимуляцию процессов регенерации костной ткани, является генная терапия [Shapiro и др., 2018]. Такой способ, основанный на доставке нуклеиновых кислот, обеспечивает экспрессию целевых генов в резидентных клетках, которые в свою очередь начинают синтезировать белки, индуцируя дифференцировку остеопрогениторных клеток. Таким образом, генная терапия является более перспективным подходом, направленным на достижение терапевтических концентраций остеогенных индукторов в зоне костного дефекта, лишенным недостатков применения высоких доз рекомбинантных белков.

Существует два основных метода введения генетических конструкций в клетки-мишени: вирусные и невирусные. Наиболее безопасны невирусные способы доставки плазмидных ДНК с целевыми генами. Они лишены недостатков вирусных векторов: сводят к минимуму риск развития инсерционного мутагенеза, менее иммуногенны и позволяют встраивать большой спектр генов, что делает их более перспективными для клинических применений [Balmayor и др., 2015]. Однако существенным недостатком невирусных векторов является необходимость использования дополнительных методов доставки генов в клетки. Поэтому для

решения этой проблемы ведется разработка систем с высокой трансфицирующей способностью, обеспечивающих достаточную жизнеспособность клеток.

Для обеспечения адресной доставки целевых генов в зону костного повреждения и их пролонгированного высвобождения генетические конструкции импрегнируют в биорезорбируемые биосовместимые материалы, получая ген-активированные матриксы [Деев и др., 2015]. В настоящее время ведется активный поиск оптимальных матриц-носителей, которые смогут как инициировать, так и поддерживать регенерацию ткани. Синтетические полимеры, такие как полимолочная кислота (poly(lactic acid); PLA) и поли(Ь-лактид-со-)гликолид (poly(lactic-co-glycolic acid; PLGA), благодаря своей биосовместимости и возможности модификации, являются подходящими кандидатами для формирования остеопластических материалов [Stylios и др., 2007]. С 1970-х годов PLA одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration; FDA) для использования в медицине и пищевой промышленности [Ata и др., 2015]. Из PLA могут быть изготовлены высокопористые гранулы, обеспечивающие прорастание сосудов, миграцию остеогенных клеток-предшественников и инкапсуляцию веществ [Feng и др., 2018]. Недостатком PLA является плохая смачиваемость и хрупкость. Смешивание PLA-гранул с гидрогелями позволит повысить гидрофильность полимера и получить прочный упругий материал. Такие матриксы будут обладать оптимальными биологическими и физико-механическими свойствами и представлять большой интерес для регенеративной медицины.

Для получения гидрогелей перспективно использование хитозана или фибрина на основе обогащенной тромбоцитами плазмы (platelet rich plasma; PRP). Важными особенностями хитозана являются его бактерицидные, фунгицидные свойства [Roller и др., 1999] и противоопухолевое действие [Azuma и др., 2015]. Кроме того, хитозан, являясь поликатионной молекулой, может выступать в качестве агента для доставки генов в клетки [Li и др., 2017], что делает его подходящим кандидатом для создания ген-активированных матриксов. Гидрогели, полученные на основе PRP пациента, позволяют изготавливать аутогенные

материалы для регенерации тканей, обладающие высокой биосовместимостью. Волокна фибрина участвуют в поддержании остеокондукции, а активация тромбоцитов способствует высвобождению ростовых факторов и стимуляции ангиогенеза, митотической и метаболической активности клеток, вовлеченных в регенерацию [Alsousou и др., 2009; Xu и др., 2020; Zhang и др., 2013].

Таким образом, разработка новых биосовместимых остеопластических матриксов в сочетании с генной терапией является актуальной задачей. Такой подход открывает новые возможности для эффективного восстановления костной ткани и улучшения качества жизни пациентов, страдающих от заболеваний и травм костей.

Степень разработанности темы

Предыдущие исследования показали эффективность использования матриксов, активированных рекомбинантными BMPs. Так, например, в США для заполнения костных дефектов был одобрен остеопластический материал с белком BMP-2 - Infuse bone graft (Medtronic Spinal and Biologies, США) [Кузнецова и др., 2019]. Однако, из-за быстрой скорости биодеградации BMP-2, требуется применение белка в супрафизиологической концентрации, что может вызывать серьезные осложнения. Преодолеть эти недостатки можно за счет использования ген-активированных матриксов, несущих ген BMP2. В связи с чем в научных и медицинских кругах ведутся активные исследования, направленные на создание новых эффективных ген-активированных остеопластических материалов, содержащих вирусные векторы [Bukharova и др., 2023; Gabal и др., 2021] и плазмидные конструкции [Gantenbein и др., 2020; Qadir и др., 2019; Меглей и др., 2022], несущие гены разных белков остеоиндукторов. Ведутся разработки оптимальных матриц-носителей [Wu и др., 2021; Zhu и др., 2021] для локальной доставки генетических конструкций в зону костного повреждения, а также способы их изготовления [Alonzo и др., 2021; Khvorostina и др., 2023]. Однако, несмотря на многочисленные работы, в настоящее время не существует зарегистрированных

остеопластических материалов, содержащих гены белков остеоиндукторов, которые были одобрены для широкого медицинского применения с целью восполнения дефицита костной ткани. Поэтому требуется разработка новых подходов генной терапии, которые позволят преодолеть существующие ограничения традиционных методов лечения и повысить эффективность восстановления костных дефектов.

Цель исследования

Разработка и исследование остеогенных свойств ген-активированных матриксов на основе полилактидных гранул, импрегнированных полиплексами с геном BMP2.

Задачи, решаемые в ходе исследования

1. Оптимизировать условия трансфекции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) полиплексами с плазмидными конструкциями, обеспечивающими высокий уровень экспрессии целевого гена BMP2.

2. Исследовать особенности остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после трансфекции клеток полиплексами с плазмидами, несущими ген BMP2.

3. Изучить биосовместимость компонентов матриксов: полилактидных гранул, гидрогелей на основе хитозана/PRP in vitro при инкубации с ММСК ЖТ и in vivo при внутримышечной имплантации крысам.

4. Разработать протокол получения ген-активированных матриксов, содержащих полилактидные гранулы, импрегнированные полиплексами с геном BMP2, и гидрогели на основе хитозана/PRP.

5. Исследовать способность полиплексов с геном BMP2 в составе матриксов трансфицировать ММСК ЖТ и индуцировать остеогенную дифференцировку клеток in vitro.

6. Исследовать влияние разработанных ген-активированных матриксов на репаративную регенерацию костной ткани в модели критического дефекта теменных костей крыс.

Научная новизна исследования

Впервые получены ген-активированные матриксы на основе хитозанового или фибринового гидрогеля и полилактидных гранул, с включенными полиплексами, содержащими ген BMP2.

Впервые показана биосовместимость и остеоиндуктивные свойства разработанных ген-активированных матриксов на основе полилактидных гранул, импрегнированных полиплексами с геном BMP2, и гидрогелей хитозана или PRP in vitro при инкубации с ММСК ЖТ и in vivo при внутримышечной имплантации и имплантации в область критического дефекта теменных костей крыс.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Разработан протокол получения эффективных ген-активированных остеопластических матриксов на основе полилактидных гранул, импрегнированных полиплексами с геном BMP2 и хитозанового или фибринового гидрогеля. Матриксы, полученные по разработанному протоколу, могут быть рекомендованы для проведения доклинических и клинических исследований с целью дальнейшего применения в регенеративной медицине костной ткани.

В ходе выполнения работы получены новые данные, позволяющие углубить представление о молекулярно-генетических механизмах трансфекции клеточных культур полиплексами с плазмидными ДНК, обосновать выбор генетических конструкций и методы их включения в полимерные матриксы для доставки в область костного дефекта с целью инициации репаративного остеогенеза.

Результаты, полученные в ходе выполнения работы, позволят расширить области применения ген-активированных матриксов, и существенно ускорить восстановление пациентов с обширными дефектами костной ткани.

Кроме того, результаты исследования, полученные в данной работе, могут быть использованы для разработки новых подходов генной терапии, направленной на лечение пациентов с заболеваниями, характеризующимися дефицитом костной ткани.

Методология и методы диссертационного исследования

В работе были использованы плазмидные конструкции с геном BMP2 (pcDNA3-BMP2 и pTagRFP-N-BMP2) или с геном зеленого флуоресцентного белка EGFP (pEGFP-C1). Плазмиды выделяли из трансформированных клеток Escherichia coli (E.coli). Сохранность первичной структуры плазмид оценивали при помощи рестрикции с анализом продуктов реакции в агарозном геле. Для эффективной доставки плазмидных конструкций в клетки были подобраны оптимальные протоколы трансфекции методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. In vitro на клеточных культурах ММСК ЖТ была оценена цитосовместимость различных композиций матриксов на основе полимеров с помощью методов МТТ-теста, флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); остеогенная дифференцировка ММСК ЖТ была исследована по экспрессии ключевых остеогенных маркеров с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноцитохимического окрашивания (ИЦХ) и определения уровня минерализации внеклеточного матрикса (по окрашиванию ализариновым красным). In vivo на крысах линии Wistar оценивали биосовместимость полученных матриксов при внутримышечной имплантации; остеоиндуктивные свойства матриксов оценивали на модели ортотопического остеогенеза при имплантации в зону критического дефекта теменных костей крыс. Образцы некропсий, полученные в результате экспериментов in vivo, были

подвергнуты гистологическому исследованию. Эффективность репаративного остеогенеза также была оценена методом микрокомпьютерной томографии (микро-КТ). Для оценки достоверности различия исследуемых групп использовали статистические методы анализа.

Положения, выносимые на защиту

1. Оптимальные условия трансфекции культур ММСК ЖТ полиплексами с плазмидой pEGFP-C1 достигаются при инкубации адгезированных ММСК ЖТ с полиплексами, содержащими 4 мкл/мл TF и 2 мкг/мл рДНК в течение 1 ч.

2. Трансфекция ММСК ЖТ полиплексами с плазмидами, несущими ген BMP2, приводит к индукции остеогенной дифференцировки клеток in vitro. При этом реализуется паракринный механизм действия секретируемого белка на клетки.

3. Матриксы на основе PLA-гранул и гидрогелей хитозана или PRP не оказывают цитотоксического действия in vitro и не вызывают воспалительной реакции in vivo.

4. Разработан протокол получения цитосовместимых ген-активированных матриксов на основе полиплексов рДНК/TF, PLA-гранул и гидрогелей. Включение полиплексов рДНК/TF в высокопористые PLA-гранулы обеспечивает пролонгированное высвобождение плазмидных конструкций из матриксов в течение 21 суток, обеспечивая доставку целевого гена BMP2 в ММСК ЖТ.

5. Разработанные ген-активированные матриксы с геном BMP2 обеспечивают остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ in vitro и приводят к формированию новой костной ткани при имплантации в зону критического дефекта теменных костей крыс. При этом ген-активированные матриксы на основе PLA-гранул с фибриновым гидрогелем способствуют более эффективной регенерации костной ткани по сравнению с другими матриксами.

Степень достоверности результатов

Достоверность полученных результатов подтверждается достаточным количеством биологических и технических повторов и сроков наблюдения в исследованиях in vitro и in vivo. Результаты проведенных исследований были получены с использованием современных молекулярно-генетических, цитологических, гистологических, цитохимических, спектральных и оптических методов и корректной статистической обработкой данных. Сформулированные в работе выводы соответствуют поставленным цели и задачам исследования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ген-активированные матриксы, импрегнированные полиплексами с геном BMP2, для регенерации костной ткани»

Апробация работы

Результаты проведенных исследований были доложены на Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2020; Всероссийской научной конференции с международным участием «Регенеративная биология и медицина», Москва, 2021; 45th FEBS Congress, Molecules of Life: Toward New Horizons, Slovenia, 2021; Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2022; V национальном конгрессе по регенеративной медицине, Москва, 2022.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» (ФГБНУ «МГНЦ»).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа соответствует формуле специальности 1.5.7. Генетика (биологические науки) - «Горизонтальный перенос генов», «Реализация генетической информации (транскрипция, трансляция). Механизмы регуляции экспрессии генов», «Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки

клеток», «Генетика соматических клеток», «Генотерапия» - работа включает в себя обсуждение принципов генетической терапии, особенностей переноса целевых генов в соматические клетки и реализацию генетической информации, используются молекулярно-генетические методы исследования.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором выполнен анализ литературных данных по теме диссертации, определена актуальность проблемы и сформулированы цель и задачи исследования. Автор непосредственно участвовал в выборе адекватных методов и моделей исследования, планировании и проведении всех этапов экспериментов как in vitro, так и in vivo. Автором была проведена обработка полученных результатов и подготовка материалов для представления на научных конференциях и публикации в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Публикации

Материалы диссертационной работы представлены в 19 печатных работах, в том числе в 12 статьях (все в Web of Science и/или Scopus), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени кандидата биологических наук, и в одном патенте на изобретение - №2779540 от 09.09.2022 «Термоотверждаемый и остеоиндуктивный костнопластический материал на основе композиции хитозанового гидрогеля и частиц из полилактида или хитозана с импрегнированным костным морфогенетическим белком-2 (ВМР-2)». В опубликованных научных работах полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 30 рисунков. Работа имеет следующую структуру: список сокращений и условных обозначений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список научных трудов по теме диссертации, список цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 240 наименований, из них 12 отечественных и 228 зарубежных источника.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Репаративная регенерация костной ткани

За последние годы в мире резко возросло число пациентов с заболеваниями костей, и ожидается, что эта тенденция будет только увеличиваться в ближайшем будущем [Alonzo и др., 2021]. Ежегодно происходит примерно 160 - 190 миллионов переломов костей, и более 400 миллионов пациентов страдают от острых или долгосрочных последствий таких травм [Wu и др., 2021]. Хотя костная ткань обладает высоким потенциалом к регенерации, большие дефекты, полученные вследствие серьезных переломов и травм, хирургических резекций опухолей кости и вызванные другими причинами, не всегда способны полностью восстановиться за счет эндогенных ресурсов [Wilkinson и др., 2021].

Костная ткань представляет собой разновидность плотной соединительной ткани, характеризующуюся минерализованным внеклеточным матриксом, и содержит остеопрогениторные клетки, остеобласты, остеоциты и остеокласты. Костный матрикс состоит из органических и неорганических компонентов. Неорганическая часть, составляющая около 60% массы костной ткани, в основном представлена фосфатом кальция и карбонатом кальция, образующих гидроксиапатит. Неминерализованный органический матрикс, известный как остеоид, главным образом содержит коллагеновые волокна 1 -го типа, а также включает различные липиды, белки. Коллагеновые волокна обеспечивают прочность кости на растяжение, а кристаллы гидроксиапатита - на сжатие [Safadi и др., 2009].

Остеопрогениторные клетки в основном представляют собой стволовые клетки мезенхимального происхождения, способные дифференцироваться в остеобласты. Остеобласты являются метаболически активными костеобразующими клетками, которые синтезируют и секретируют вещества костного матрикса, такие как коллаген I типа, протеогликаны, неколлагеновые белки и некоторые факторы роста, и участвуют в последующей минерализации

остеоида посредством высвобождения матриксных везикул, содержащих фосфатазы, кальций и неорганический фосфат [Ansari и др., 2021]. В сформировавшейся кости они встречаются только в глубоких слоях надкостницы и в местах регенерации костной ткани после ее травмы. Остеобласты дифференцируются в остеоциты, которые представляют собой зрелые неделящиеся клетки, отвечающие за поддержание структурной целостности минерализованного матрикса и участвующие в регуляции обмена Ca2+. Дифференцировка остеобластов регулируется многочисленными секретируемыми факторами роста, такими как трансформирующий фактор роста-Р (transforming growth factor-P, TGFP), костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins, BMPs), факторы роста фибробластов (fibroblast growth factors, FGFs) и другие [Rodan и др., 1998]. На долю остеоцитов приходится 90-95% всех костных клеток. Остеоциты располагаются в полостях основного вещества кости, которые называются костными лакунами. Они участвуют в передаче сигналов клетками и поддержании жизнеспособности костного матрикса. Отростки остеоцитов сообщаются друг с другом и с остеобластами через сеть канальцев [Safadi и др., 2009]. Остеокласты, в свою очередь, представляют собой крупные многоядерные клетки, образующиеся из моноцитов. Они богаты митохондриями и лизосомами, ферменты которых расщепляют коллаген и протеогликаны остеоида. Остеокласты отвечают за резорбцию кости, поэтому необходимы для ее восстановления, ремоделирования и роста.

Репаративная регенерация костной ткани представляет собой многофазный процесс, разделенный на четыре основных этапа: образование гематомы; миграция и митоз мезенхимальных клеток; образование хряща и замещение хряща костью; и ремоделирование костной ткани [Al-Aql и др., 2008]. Сразу после повреждения кости и местной сосудистой сети в месте дефекта образуется гематома, представляющая собой скопление различных компонентов крови. Она выполняет ключевые функции в остановке кровотечения и обеспечении остеокондукции для начала регенерации. Эта первая фаза заживления перелома, называемая деструктивной фазой, длится около трех дней и характеризуется воспалением и

местной гипоксией. Затем следует конструктивная фаза регенерации, характеризующаяся образованием новой сосудистой сети, которая позволяет рекрутировать мезенхимальные стволовые клетки, дифференцирующиеся в хондроциты и остеобласты, и остеокласты [Shrivats и др., 2014]. Грануляционная ткань конденсируется в костную мозоль, представляющую собой хрящевой каркас, который действует как фиксирующая и стабилизирующая структура. Затем хондроциты подвергаются запрограммированной гибели клеток (апоптозу), а остеобласты формируют костный матрикс, замещая костную мозоль. В месте перелома в течение месяцев или лет кость ремоделируется до физиологического состояния при непосредственном участие остеокластов и остеобластов [Baroli, 2009].

1.2 Костные морфогенетические белки для регенерации костной ткани

Современные достижения в понимании структуры кости и механизмов остеогенеза открыли новые возможности для регуляции процессов регенерации костной ткани.

Исследования, направленные на применение генной терапии для решения проблемы заживления костных дефектов начались в середине 90-х годов, когда были идентифицированы и получены мощные остеоиндукторы [Niyibizi и др., 1998; Scaduto и др., 1999]. Наибольшее внимание было сосредоточено на остеогенных свойствах некоторых факторов роста, в частности костных морфогенетических белках (BMPs). BMPs являются частью суперсемейства TGFp, которые синтезируются остеобластами, хондроцитами, а также их предшественниками [Wozney и др., 1998]. BMPs синтезируются в клетках в виде неактивных предшественников, состоящих из ^концевого гидрофобного сигнального пептида, который направляет белок по секреторному пути, пропептида, обеспечивающего правильный фолдинг белка, и С-концевого зрелого домена [Громов и др., 2020]. После димеризации и протеолитического гидролиза образуется зрелая форма белка в виде гомодимеров или гетеродимеров,

секретируемых в межклеточное пространство [Han и др., 2021]. Известно примерно 25 различных BMPs [Schmidt-Bleek и др., 2016]. BMPs действуют на специфические BMP-рецепторы клеточной мембраны и осуществляют паракринную регуляцию процессов пролиферации, апоптоза, дифференцировки и миграции различных типов клеток [Carreira и др., 2014]. BMP-2 является наиболее изученным и эффективным остеоиндуктором, хотя также имеются доказательства участия и других типов BMP в регенерации костной ткани. Мутации в гене, кодирующем BMP-2, способствуют повышению хрупкости костей, нарушениям энхондрального остеогенеза и минерализации костного матрикса [Chen и др., 2012]. Нокаут гена BMP2 у эмбрионов приводит к летальному исходу [Zhang и др., 1996]. BMP-2 играет ключевую роль в дифференцировке ММСК в остеобласты за счет увеличения экспрессии Runt фактора транскрипции 2 (Runt-related transcription factor 2, Runx2) [Galitsyna и др., 2020; Lee и др., 2000; Song и др., 2011]. Runx2 в свою очередь регулирует экспрессию генов белков остеогенной дифференцировки, таких как остеокальцин (osteocalcin, OCN, BGLAP), щелочная фосфатаза (Alkaline phosphatase, ALPL), остеопонтин (osteopontin, OPN, SPP1) коллаген 1 типа (COLI) и другие [Кожевникова и др., 2008].

В различных исследованиях была продемонстрирована эффективность использования рекомбинантных BMPs для регенерации костной ткани в различных ортотопических моделях остеогенеза. Остеопластический материал Infuse bone graft (Medtronic Spinal and Biologics, США), представляющий собой рекомбинантный BMP-2 человека (rhBMP-2), импрегнированный в коллагеновую губку, был одобрен FDA в качестве альтернативы костным трансплантатам для межтелового спондилодеза, восстановлении при переломах большеберцовой кости, а также для синус-лифтинга и аугментации альвеолярного гребня [Govender и др., 2002; Schmidt-Bleek и др., 2016; Недорубова и др., 2020].

Однако существенным недостатком применения BMPs является их короткий период полураспада и быстрая деградация, в результате чего для достижения терапевтического эффекта требуется использование остеоиндуктора в избыточном количестве [Seo и др., 2023]. Применение супрафизиологических доз BMP-2 может

вызывать серьезные осложнения, такие как воспалительные [Boyne и др., 2005; Cicciü и др., 2014] и иммунные реакции, избыточное разрастание костной ткани [Axelrad и др., 2008] или, напротив, усиление костной резорбции [McClellan и др., 2006]. Несмотря на некоторые исследования, которые не выявили связи между применением rhBMP-2 и возникновением опухолевых новообразований [Cooper и др., 2013; Kelly и др., 2014], есть данные, указывающие на возможность увеличения риска развития онкологической трансформации при использовании высоких доз rhBMP-2 в процедуре артродеза позвоночника [Carragee и др., 2013]. А также показано, что избыточное количество BMP-2 может способствовать развитию уже существующих опухолей [Skovrlj и др., 2015; Woo и др., 2012], поэтому FDA запретили использование rhBMP у пациентов с онкологическими диагнозами в анамнезе. В связи с непредсказуемыми побочными эффектами и высокой стоимостью рекомбинантных белков, перспективы белковой терапии сильно ограничены [Недорубова и др., 2020].

В качестве альтернативного способа обеспечения терапевтических концентраций остеогенных белковых факторов, все больший интерес вызывает генная терапия, направленная на локальную доставку генетических конструкций с геном BMP2 в зону регенерации. Такой подход обеспечит продолжительную секрецию белка в физиологических концентрациях, моделируя действие BMP-2 в процессе заживления раны, что позволит избежать побочных эффектов, связанных с использованием высоких доз rhBMP-2.

1.3 Доставка генетических конструкций в клетки

Эффективность и безопасность генной терапии в значительной мере определяется выбором векторов для доставки генов в целевые клетки, которые подразделяются на вирусные и невирусные. Выбор систем для переноса генов в клетки зависит от многих факторов, включая типы модифицируемых клеток, размер гена, который необходимо доставить, и конкретного применения.

1.3.1 Вирусные системы доставки генов

Использование вирусных векторов является многообещающим подходом в генной терапии. Более 2000 клинических испытаний вирусной генной терапии уже завершено на данный момент, что свидетельствует об относительной безопасности и эффективности данного подхода [Ginn и др., 2018]. Для разработки ген-активированных остеопластических материалов с вирусами в основном используют такие векторы, как аденовирусные, аденоассоциированные, лентивирусные и ретровирусные.

Аденовирусные векторы

Аденовирусы (Ad) относятся к семейству лишенных липидной оболочки вирусов, содержащих двухцепочечную ДНК. Аденовирусы человека разделены на 51 серотип на основе различий в антигенных свойствах капсидных белков [Russell и др., 2009, Roberts и др., 2006]. Среди различных серотипов аденовируса Ad5 является наиболее часто используемым для доставки генов. Ad был первым ДНК-вирусом, используемым в генной терапии, благодаря его генетической стабильности простоте использования и производства [Breyer и др., 2006; Seymour и др., 2011], а в настоящее время более чем в 20% всех исследований используют именно аденовирусные векторы. К преимуществам Ad относят их способность трансдуцировать широкий круг клеточных типов и тканей, поскольку рецепторы для аденовирусов имеются почти у всех клеток. Ad способны доставлять гены размером до 20 т.п.о. как в реплицирующиеся, так и покоящиеся клетки и обеспечивать высокий уровень экспрессии вводимого гена. Кроме того, Ad обычно не интегрируются в геном хозяина, а существуют в виде эписомы, что снижает риск генотоксичности и возникновения онкогенных мутаций [Vorburger и др., 2002]. В ранних in vivo исследованиях на модели дистракционного остеогенеза нижней челюсти крыс [Ashinoff и др., 2004] и модели сегментарных дефектов бедренных костей кроликов [Baltzer и др., 2000] и крыс [Betz и др., 2006] была показана эффективность локальной инъекции аденовирусных векторов, содержащих ген BMP2, для регенерации костной ткани. Основной проблемой терапии на основе

аденовирусов является высокая иммуногенность капсида вируса, которая приводит к активации как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, что ведет к уничтожению трансдуцированных клеток и снижению эффективности повторного введение вектора одному и тому же пациенту [Vannucci и др., 2013]. Поэтому большинство исследователей используют аденовирусные векторы для ex vivo генной терапии костной ткани [Liu и др., 2017; Park и др., 2017; Park и др., 2018]. Кроме того, было показано, что ex vivo аденовирусная генная терапия с геном BMP2 показала себя более эффективным подходом для восполнения костных дефектов в сравнении с in vivo доставкой генных конструкций с. Для решения проблемы иммуногенности аденовирусов также ведутся исследования, направленные на изоляцию аденовирусных векторов внутри скаффолдов, непроницаемых для иммунных клеток [Gabal и др., 2021; Qian и др., 2016] или используют подходы локального снижения иммунной реакции за счет применения противовоспалительных препаратов.

Аденоассоциированные вирусные векторы

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой, непатогенный вирус, содержащий одноцепочечную ДНК и окруженный капсидом. Для репликации в клетках AAV нуждается в дополнительных генах, которые обеспечиваются хэлперными вирусами, такими как аденовирусы или вирус простого герпеса [Ning и др., 2023]. AAV способны трансдуцировать различные типы делящихся и неделящихся клеток. Хотя есть сообщения о низкой эффективности трансдукции ММСК человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани [Bougioukli и др., 2021], и высокой вариации эффективности трансдукции от донора к донору [Yao и др., 2023]. Аденоассоциированные вирусы считаются более безопасными по сравнению с аденовирусами. Низкий иммуногенный потенциал AAV уменьшает риск отторжения вируса и повышает эффективность доставки генетической информации. Аденоассоциированные векторы могут встраиваться в геном клетки, что с одной стороны может обеспечивать длительную экспрессию гена в течение многих лет, что делает их привлекательными для длительной терапии, но с другой стороны встраивание

происходит случайным образом, что теоретически может привести к инсерционному мутагенезу. Основным существенным недостатком AAV векторов является их небольшая пакующая емкость, составляющая приблизительно 4 т.п.н. [Dong и др., 2008], что серьезно ограничивает спектр терапевтических генов, которые могут быть доставлены с помощью данного вектора. AAV становятся все более популярными векторами для генной терапии. Ген-активированные матриксы на основе AAV векторов с геном BMP2 были использованы для регенерации дефекта свода черепа мышей [Yazici и др., 2011] и для восстановления переломов бедренной кости у мышей [Arav Ben и др., 2012]. В настоящее время FDA уже одобрило препарат на основе AAV для лечения спинальной мышечной атрофии [Li и др., 2020].

Ретровирусные векторы

Ретровирусы относятся к семейству РНК-вирусов, имеющих помимо капсиды внешнюю липидную оболочку. Ретровирусные векторы обеспечивают высокий уровень экспрессии переносимых генов и могут доставлять до 8 т.п.о., однако, способные заражать только делящиеся клетки, в которых они репродуцируются. После инфицирования клетки-мишени вирус встраивается в клеточный геном, причем случайным образом, поэтому существует риск возникновения инсерционного мутагенеза и канцерогенеза. Весомыми недостатками ретровирусных векторов для генной терапии костной ткани является их неспособность инфицировать неделящиеся клетки, а также их генетическая нестабильность, проявляющаяся делециями или точковыми мутациями [Maier и др., 2010]. В генной терапии костной ткани преимущественно используется подтип ретровирусных векторов - лентивирусы.

Лентивирусные векторы

После проникновения лентивируса в клетку обратная транскриптаза на матрице РНК осуществляет синтез двухцепочечной ДНК, которая затем переносится в ядро, а ферменты лентивирусной интегразы обеспечивают встраивание трансгена в ДНК хозяина. Одним из главных отличий лентивирусов от других ретровирусов является их способность инфицировать неделящиеся

клетки, что делает их более универсальными и позволяет использовать для доставки генов в широкий спектр типов клеток. Однако, как и у ретровирусов, у лентивирусов есть свои недостатки. Их использование может вызвать иммунный ответ. Кроме того, интеграция лентивирусов в геном хозяина происходит случайным образом, что может привести к нежелательным мутациям и изменению функций клетки, поэтому в генной терапии лентивирусные векторы используют в основном для трансдукции клеток ex vivo. В ряде работ было показано, что после имплантации ММСК, трансдуцированных лентивирусными векторами с геном BMP2, наблюдалось гетеротопическое образование костной ткани [Bougioukli и др., 2019a] и заживление критического дефекта бедренной кости у крыс [Alluri и др., 2019; Bougioukli и др., 2019b] и мышей [Alaee и др., 2014].

Таким образом, несмотря на то, что ведется большое число исследований по применению вирусных векторов для генной терапии, такой подход имеет ряд существенных недостатков, таких как способность вирусов вызывать иммунные и/или токсические реакции [Bessis и др., 2004], опасность канцерогенеза [Baum и др., 2006], ограниченная пакующая емкость векторов [Thomas и др., 2003] и тропизм [Waehler и др., 2007], которые ограничивают их применение в клинической практике. В настоящее время в генной терапии используются репликационно-дефицитные вирусные конструкции, но невозможно полностью исключить вероятность того, что в результате рекомбинации не произойдет образования патогенного, способного к репликации вируса de novo. Поэтому фокус исследований все больше смещается на разработку более безопасных невирусных систем доставки генов.

1.3.2 Невирусные системы доставки генов

Невирусные методы генной терапии основаны на введении в клетки плазмидных ДНК. Плазмидный вектор предствавляет собой двуцепочечную кольцевую молекулу ДНК, которая состоит из нескольких ключевых элементов: ориджин репликации, обеспечивабщий репликацию плазмиды в клетке; ген

устойчивости к антибиотикам, позволяющий отобрать клетки, содержащие плазмиду; промотор, который инициирует транскрипцию встроенного гена; трансгены, которые необходимо клонировать или экспрессировать; а также дополнительные элементы, такие как селекционные маркеры для эукариотических клеток, энхансеры и регуляторные элементы [Tolmachov и др., 2009].

Промотор в плазмидах играет ключевую роль, определяющую эффективность экспрессии целевого гена. Выбор промотора зависит от типа клетки-хозяина, требуемого уровеня экспрессии и цели эксперимента. В большинстве случаев конструируемые плазмиды с геном BMP2 содержат промотор цитомегаловируса (CMV), который способен обеспечить высокий уровень экспрессии гена [Loozen и др., 2019; Wang и др., 2017; Wu и др., 2012; Yang и др., 2008]. Хотя также есть работы, в которых плазмидные конструкции содержат и другие промоторы, такие как промотор фактора элонгации 1а человека (EF1a) [Paidikondala и др., 2019; Raftery и др., 2018], промотор убиквитина C человека (UBC) [Keeney и др., 2016], промотор ß-актина цыпленка в сочетании с ранним энхансером CMV (CAG) [Kawai и др., 2017; Raftery и др., 2018] и ранний промотор вируса обезьяны 40 (SV40) [Lee и др., 2017]. В ходе сравнительного исследования эффективности трансфекции ММСК плазмидами, содержащими промотор CMV или EF1a было обнаружено, что плазмида с CMV промотором обеспечивает более высокий уровень экспрессии трансгена по сравнению с промотором EF1a, что подтверждается увеличением количества клеток, синтезирующих EGFP [Kozisek и др., 2021]. Эффективность функционирования промоторов также существенно зависит от типа трансфицируемых клеток. Так, например, промотор CMV обеспечивал высокий уровень экспрессии целевого гена в клеточных линиях эмбриональных почек человека (HEK 293), фибросаркомы человека (HT 1080) и опухолевых клетках молочной железы (CMMT), но низкую эффективность в клеточных культурах ММСК крысы и фибробластах человека (MRC5) [Qin и др., 2010].

Для увеличения эффективности экспрессии целевого гена часто используют так называемые Advanced-векторы, которые прошли оптимизацию кодонов и

содержат сильно укороченную интронную вставку [НасоЫап и др., 2016; Кийаррап и др., 2018; Raftery и др., 2018]. Кодоновая оптимизация направлена на применение триплетов, предпочтительно используемых данным организмом. Кодоны могут влиять на регуляцию биосинтеза белка, ускоряя трансляцию, а добавление коротких искусственных интронов повышает скорость транскрипции, позволяет стабилизировать молекулы мРНК и способствует их экспорту в цитозоль [Недорубова И. А. и др., 2020]. Показано, что трансфекция различных клеточных культур Advanced-векторами приводила к значительному увеличению синтеза белка ВМР-2 по сравнению с немодифицированными плазмидами [НасоЫап и др., 2016; Raftery и др., 2018]. Однако данные эффективности промоторов EF1a и СМУ в Advanced-векторах противоречат друг другу в разных исследованиях. Это может быть связано с особенностями используемых клеточных культур или условиями проведения трансфекции [НасоЫап и др., 2016; Raftery и др., 2018].

Плазмиды не обладают способностью проникать через плазматическую мембрану клеток, как вирусы, поэтому для трансфекции используются физические или химические методы доставки. Данные методы могут приводить к нарушению целостности клеточной мембраны или накоплению токсических компонентов, что может вызвать гибель клеток. Поэтому современные исследования направлены на повышение эффективности невирусной доставки генов, сохраняя при этом жизнеспособность клеток.

1.3.2.1 Физические методы трансфекции

С помощью физических методов оказывается локальное воздействие на клеточную мембрану, что приводит к проникновению в клетки экзогенных молекул нуклеиновых кислот. На сегодняшний день в генной терапии костной ткани наиболее часто используют такие физические методы, как электропорация [Kawai и др., 2017; Wu и др., 2012] и сонопорация [Гискй^ег и др., 2014] (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Физические методы трансфекции

Электропорация

Электропорация - это метод, при котором высокоинтенсивные, короткие электрические импульсы создают временные поры в клеточной мембране, через которые плазмиды могут проникать внутрь клетки. Это простой, быстрый и дешевый метод доставки генетических конструкций в клетки [Das и др., 2015]. Электропорация была использована для трансфекции ММСК плазмидой с геном BMP2, что обеспечивало продукцию белка BMP-2 в течение 14 суток in vitro, а внутримышечная имплантация трансфицированных клеток мышам приводила к формированию костной ткани [Asian и др., 2006]. Кроме того, электропорация также была использована для переноса плазмид, содержащих ген BMP2 in vivo. Было показано, что доставки гена BMP2, в том числе в сочетании с другими генами, с помощью электропорации приводила к увеличению скорости заживления дефекта альвеолярной кости у крыс [Kawai и др., 2017; Kawai и др., 2018] и способствовала образованию большого объема новой костной ткани в модели дистракционного остеогенеза нижней челюсти кролика [Wu и др., 2012]. Использование электропорации для доставки гена BMP9 способствовало заживлению дефекта лучевой кости мыши [Kimelman-Bleich и др., 2011]. Однако,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Недорубова Ирина Алексеевна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильев А. В. и др. Характеристика неоостеогенеза на модели критического дефекта теменных костей крыс с помощью традиционной и трёхмерной морфометрии // Гены Клетки. 2014. Т. 9. № 4. С. 121-127.

2. Громов А. В. и др. Рекомбинантный фактор роста костной ткани BMP-2 человека, получаемый синтезом в клетках Escherichia coli. Часть 1: от очистки белка до экспериментальных моделей исследования эффективности // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020. Т. 38. №. 1. С. 24-33.

3. Деев Р. В. и др. Ординарные и активированные остеопластические материалы Р.В. // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. 2015. № 1. С. 5169.

4. Зарницын В. Г. и др. Физические методы переноса нуклеиновых кислот в ткани и клетки // Биологические мембраны. 2004. Т. 21. № 5. С. 370-388.

5. Кожевникова М.Н. и др. Молекулярно-генетические основы регуляции остеогенной дифференцировки мезенхимных стромальных клеток // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2008. Т. 3. С. 261-271.

6. Кузнецова В. С. и др. Безопасность и эффективность применения морфогенетических белков кости 2 и 7 в стоматологии // Стоматология. 2019. Т. 98. № 1. С. 64-69.

7. Логовская Л. В. и др. Индукция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2013. Т. 1. С. 28-33.

8. Мартынова А. Д. и др. Улучшение доставки комплексов плазмидной ДНК с поликатионом в клетки человека в присутствии блоксополимеров этилен- и пропиленоксида // 2012. С. 101-104.

9. Меглей А. Ю. и др. Оценка свойств остеогенных ген-активированных матриксов на основе гидрогелей, импрегнированных полиплексами с геном BMP2 // Гены и Клетки. 2022. Т. 17. № 4. С. 133-141.

10. Михеев А. А. и др. Катионные Липосомы Как Средства Доставки Нуклеиновых Кислот // Тонкие Химические Технологии. 2020. Т. 15. № 1. С. 7-27.

11. Недорубова И. А. и др. Невирусная доставка гена BMP2 для регенерации костной ткани // Гены Клетки. 2020. Т. 15. № 4. С. 33-39.

12. Недорубова И. А. и др. Эффективность генактивированных остеопластических матриксов, импрегнированных полиплексами с геном BMP2 // Биотехнология. 2022. Т. 38. № 5. С. 53-59.

13. Ahmadi F. и др. Chitosan based hydrogels: characteristics and pharmaceutical applications // Res. Pharm. Sci. 2015. Т. 10. № 1. С. 1.

14. Al-Aql Z. S. и др. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis //Journal of dental research. 2008. Т. 87. № 2. С. 107-118.

15. Alaee F. и др. Suicide gene approach using a dual-expression lentiviral vector to enhance the safety of ex vivo gene therapy for bone repair // Gene Ther. 2014. Т. 21. № 2. С. 139-147.

16. Alberto Gonzalez-Villarreal C. и др. Bone marrow mesenchymal stem cells: improving transgene expression level, transfection efficiency and cell viability // J BUON. 2018. Т. 23. №. 6. С. 1893-903.

17. Alexandrov V. и др. Transfection potential of the serum-free McCoy-Plovdiv cell line // Comptes Rendus L'Academie Bulg. des Sci. 2015. Т. 68. № 8. С. 1055-1060.

18. Alluri R. и др. Regional gene therapy with 3D printed scaffolds to heal critical sized bone defects in a rat model // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 2019. Т. 107. № 10. С. 2174-2182.

19. Almajidi Y. Q. и др. Chitosan-based nanofibrous scaffolds for biomedical and pharmaceutical applications: A comprehensive review // Int. J. Biol. Macromol. 2024. Т. 264. С. 130683.

20. Alonzo M. и др. Bone tissue engineering techniques, advances, and scaffolds for treatment of bone defects // Curr. Opin. Biomed. Eng. 2021. Т. 17. С. 100248.

21. Alsousou J. h gp. The biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery: A review of the literature // J. Bone Jt. Surg. - Ser. B. 2009. T. 91. № 8. C. 987-996.

22. Anderson J. M. h gp. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres // Adv. Drug Deliv. Rev. 1997. T. 28. № 1. C. 5-24.

23. Anitua E. h gp. Platelet rich plasma in oral and maxillofacial surgery from the perspective of composition // Platelets. 2021. T. 32. № 2. C. 174-182.

24. Ansari S. h gp. Matrix vesicles: role in bone mineralization and potential use as therapeutics // Pharmaceuticals. 2021. T. 14. № 4. C. 289.

25. Arav A. Ben h gp. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2012. T. 6. № 10. C. e43-e50.

26. Archunan M. W., Petronis S. Bone Grafts in Trauma and Orthopaedics // Cureus. 2021. T. 13. № 9. C. 1-5.

27. Ashinoff R. L. h gp. Bone morphogenic protein-2 gene therapy for mandibular distraction osteogenesis // Ann. Plast. Surg. 2004. T. 52. № 6. C. 585-591.

28. Aslan H. h gp. Nucleofection-Based Ex Vivo Nonviral Gene Delivery to Human Stem Cells as a Platform for Tissue Regeneration // Tissue Eng. 2006. T. 12. № 4.

29. Ata R. h gp. Recent applications of polylactic acid in pharmaceutical and medical industries //J. Chem. Pharm. Res. 2015. T. 7. №. 12. - C. 51-63.

30. Axelrad T. W. h gp. Heterotopic ossification after the use of commercially available recombinant human bone morphogenetic proteins in four patients // J. Bone Jt. Surg. - Ser. B. 2008. T. 90. № 12. C. 1617-1622.

31. Azuma K. h gp. Anticancer and anti-inflammatory properties of chitin and chitosan oligosaccharides // J. Funct. Biomater. 2015, Vol. 6, Pages 33-49. 2015. T. 6. № 1. C. 3349.

32. Bacevich B. M. h gp. Advances with platelet-rich plasma for bone healing // Biol. Targets Ther. 2024. T. 18. C. 29-59.

33. Baino F., Ferraris M. Learning from nature: using bioinspired approaches and natural materials to make porous bioceramics // Int. J. Appl. Ceram. Technol. 2017. T. 14. № 4. C. 507-520.

34. Baino F. h gp. Bioceramics and scaffolds: a winning combination for tissue engineering // Front. Bioeng. Biotechnol. 2015. T. 3. C. 202

35. Baino F., Verné E. Production and characterization of glass-ceramic materials for potential use in dental applications: thermal and mechanical properties, microstructure, and in vitro bioactivity // Appl. Sci. 2017, Vol. 7, Page 1330. 2017. T. 7. № 12. C. 1330.

36. Balmayor E. R. h gp. Chemically modified RNA induces osteogenesis of stem cells and human tissue explants as well as accelerates bone healing in rats // Biomaterials. 2016. T. 87. C. 131-146.

37. Balmayor E. R. h gp. Gene therapy for bone engineering // Front. Bioeng. Biotechnol. 2015. T. 3. № FEB. C. 1-7.

38. Baltzer A. W. A. h gp. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene // Gene Ther. 2000. T. 7. № 9. C. 734-739.

39. Baroli B. From natural bone grafts to tissue engineering therapeutics: Brainstorming on pharmaceutical formulative requirements and challenges // J. Pharm. Sci. 2009. T. 98. № 4. C. 1317-1375.

40. Basirnejad h gp. The distinct role of small heat shock protein 20 on HCV NS3 expression in HEK-293T Cell Line // Avicenna J. Med. Biotechnol. 2018. T. 10. № 3. C. 152.

41. Baum C. h gp. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors // https://home.liebertpub.com/hum. 2006. T. 17. № 3. C. 253-263.

42. Bessis N. h gp. Immune responses to gene therapy vectors: influence on vector function and effector mechanisms // Gene Ther. 2004 111. 2004. T. 11. № 1. C. S10-S17.

43. Betz O. B. h gp. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects // J. Bone Jt. Surg. 2006. T. 88. № 2. C. 355-365.

44. Bez M. h gp. In situ bone tissue engineering via ultrasound-mediated gene delivery to endogenous progenitor cells in mini-pigs // Sci. Transl. Med. 2017. T. 9. № 390.

45. Bougioukli S. h gp. Lentiviral gene therapy for bone repair using human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells // Hum. Gene Ther. 2019a. T. 30. № 7. C. 906-917.

46. Bougioukli S. h gp. Ex vivo gene therapy using human bone marrow cells overexpressing BMP-2: "Next-day" gene therapy versus standard "two-step" approach // Bone. 2019b. T. 128. C. 115032.

47. Bougioukli S. h gp. Limited potential of AAV-mediated gene therapy in transducing human mesenchymal stem cells for bone repair applications // Gene Ther. 2021. T. 28. № 12. C. 729-739.

48. Boyne P. J. h gp. De novo bone induction by recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in maxillary sinus floor augmentation // J. Oral Maxillofac. Surg. 2005. T. 63. № 12. C. 1693-1707.

49. Breyer B. h gp. Adenoviral vector-mediated gene transfer for human gene therapy // Curr. Gene Ther. 2006. T. 1. № 2. C. 149-162.

50. Bukharova T. B. h gp. Tissue engineering construction from 3D porous ceramic carriers and multipotent stromal cells for the repair of bone tissue defects // Bull. Exp. Biol. Med. 2009. T. 147. № 1. C. 147-155.

51. Bukharova T. B. h gp. Adenovirus-based gene therapy for bone regeneration: a comparative analysis of in vivo and ex vivo BMP2 gene delivery // Cells. 2023. T. 12. № 13. C. 1762.

52. Carragee E. J. h gp. Cancer risk after use of recombinant bone morphogenetic protein-2 for spinal arthrodesis // J. Bone Jt. Surg. 2013. T. 95. № 17. C. 1537-1545.

53. Carreira A. C. h gp. Bone Morphogenetic Proteins: Structure, biological function and therapeutic applications // Arch. Biochem. Biophys. 2014. T. 561. C. 64-73.

54. Carvalho T. G. de h gp. A simple protocol for transfecting human mesenchymal stem cells // Biotechnol. Lett. 2018. T. 40. № 3. C. 617-622.

55. Chen G. h gp. TGF-P and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation // Int. J. Biol. Sci. 2012. T. 8. № 2. C. 272-288.

56. Chen W. h gp. Functionalizing titanium surface with PAMAM dendrimer and human // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2018. T. 106. № 3. C. 706-717.

57. Cicciu M. h gp. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promote and stabilize hard and soft tissue healing for large mandibular new bone reconstruction defects // J. Craniofac. Surg. 2014. T. 25. № 3. C. 860-862.

58. Collins M. N., Birkinshaw C. Hyaluronic acid based scaffolds for tissue engineering—A review // Carbohydr. Polym. 2013. T. 92. № 2. C. 1262-1279.

59. Conner S. D., Schmid S. L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. 2003. T. 422. № 6927. C. 37-44.

60. Cooper G. S., Kou T. D. Risk of cancer after lumbar fusion surgery with recombinant human bone morphogenic protein-2 (rh-BMP-2) // Spine (Phila. Pa. 1976). 2013. T. 38. № 21. C. 1862-1868.

61. Coughlin M. J. h gp. Coralline hydroxyapatite bone graft substitute in hindfoot surgery //Foot & ankle international. 2006. T. 27. №. 1. C. 19-22.

62. Curtin C. M. h gp. Innovative collagen nano-hydroxyapatite scaffolds offer a highly efficient non-viral gene delivery platform for stem cell-mediated bone formation // Adv. Mater. 2012. T. 24. № 6. C. 749-754.

63. D'Mello S. h gp. Bone regeneration using gene-activated matrices // AAPS J. 2017. T. 19. № 1. C. 43-53.

64. Dang Q. h gp. Characterization and biocompatibility of injectable microspheres-loaded hydrogel for methotrexate delivery // Carbohydr. Polym. 2016. T. 136. C. 516526.

65. Das A. K. h gp. Physical methods of gene transfer: Kinetics of gene delivery into cells: A Review // Agric. Rev. 2015. T. 36. № 1. C. 61.

66. Day R. M. Bioactive glass stimulates the secretion of angiogenic growth factors and angiogenesis in vitro // Tissue Eng. 2005. T. 11. № 5-6. C. 768-777.

67. Dong J. Y., Fan P. D., Frizzell R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus // Human gene therapy. 2008. T. 7. № 17. C. 21012112.

68. Douglas K. L., Piccirillo C. A., Tabrizian M. Effects of alginate inclusion on the vector properties of chitosan-based nanoparticles // J. Control. Release. 2006. T. 115. № 3. C. 354-361.

69. Elouahabi A., Ruysschaert J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes // Mol. Ther. 2005. T. 11. № 3. C. 336-347.

70. Elsawy M. A. h gp. Hydrolytic degradation of polylactic acid (PLA) and its composites // Renew. Sustain. Energy Rev. 2017. T. 79. C. 1346-1352.

71. Endo M. h gp. Bone regeneration by modified gene-activated matrix: Effectiveness in segmental tibial defects in rats // Tissue Eng. 2006. T. 12. № 3. C. 489-497.

72. Everts P. A. h gp. Platelet Rich Plasma in orthopedic surgical medicine. // Platelets. 2021. T. 32. № 2. C. 163-174.

73. Feichtinger G. A. h gp. Sonoporation increases therapeutic efficacy of inducible and constitutive BMP2/7 in vivo gene delivery // Hum. Gene Ther. Methods. 2014. T. 25. № 1. C. 57-71.

74. Feng P. h gp. A Multimaterial scaffold with tunable properties: toward bone tissue repair // Adv. Sci. 2018. T. 5. № 6. C. 1700817.

75. Fernandes G. h gp. Combination of controlled release platelet-rich plasma alginate beads and bone morphogenetic protein-2 genetically modified mesenchymal stem cells for bone regeneration // J. Periodontol. 2016. T. 87. № 4. C. 470-480.

76. Ferreira A. M. h gp. Collagen for bone tissue regeneration // Acta Biomater. 2012. T. 8. № 9. C. 3191-3200.

77. Gabal Y., Ramsey J. D. Surface modification of adenovirus vector to improve immunogenicity and tropism // Methods Mol. Biol. 2021. T. 2183. C. 357-366.

78. Galitsyna E. V. h gp. Collagen-based hydrogel functionalized with rhBMP-2 // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2020. T. 548. № 6.

79. Gantenbein B. h gp. Non-viral gene delivery methods for bone and joints // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2020. T. 8. C. 598466.

80. Gheisari Y. h gp. Multipotent mesenchymal stromal cells: Optimization and comparison of five cationic polymer-based gene delivery methods // Cytotherapy. 2008. T. 10. № 8. C. 815-823.

81. Ginn S. L. h gp. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: An update // J. Gene Med. 2018. T. 20. № 5.

82. Gonzalez-Fernandez T. h gp. Mesenchymal stem cell fate following non-viral gene transfection strongly depends on the choice of delivery vector // Acta Biomater. 2017. T. 55. C. 226-238.

83. Govender S. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures // J. BONE Jt. Surg. 2002. T. 84. № 12. C. 2123-2134.

84. Graceffa V. Development of a fibrin-mediated gene delivery system for the treatment of cystinosis via design of experiment // Sci. Reports 2022 121. 2022. T. 12. № 1. C. 1-12.

85. Granito R. N., Custodio M. R., Renno A. C. M. Natural marine sponges for bone tissue engineering: The state of art and future perspectives // J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 2017. T. 105. № 6. C. 1717-1727.

86. Gremare A. h gp. Characterization of printed PLA scaffolds for bone tissue engineering // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2018. T. 106. № 4. C. 887-894.

87. Grigoriev T. E. h gp. Effect of molecular characteristics and morphology on mechanical performance and biocompatibility of PLA-based spongious scaffolds // Bionanoscience. 2018. T. 8. № 4. C. 977-983.

88. Haas J., Park E. C., Seed B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein // Curr. Biol. 1996. T. 6. № 3. C. 315-324.

89. Habraken W. h gp. Calcium phosphates in biomedical applications: materials for the future? // Mater. Today. 2016. T. 19. № 2. C. 69-87.

90. Hacobian A. R. A. h gp. Improved osteogenic vector for non-viral gene therapy // Eur. Cells Mater. 2016. T. 31. № 0. C. 191-204.

91. Halim N. S. S. A. h gp. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell // Int. J. Mol. Sci. 2014. T. 15. № 9. C. 15044-15060.

92. Hamilton V. h gp. Characterization of chitosan films and effects on fibroblast cell attachment and proliferation // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2006. T. 17. № 12. C. 13731381.

93. Han O., Pak B., Jin S. W. The role of BMP signaling in endothelial heterogeneity // Front. Cell Dev. Biol. 2021. T. 9. № June. C. 1-8.

94. Hsu S. H. h gp. Chitosan as scaffold materials: Effects of molecular weight and degree of deacetylation // J. Polym. Res. 2004. T. 11. № 2. C. 141-147.

95. Hu Y. h gp. Co-transfection with BMP2 and FGF2 via chitosan nanoparticles potentiates osteogenesis in human adipose-derived stromal cells in vitro // J. Int. Med. Res. 2021. T. 49. № 3.

96. Huang M. h gp. Uptake and Cytotoxicity of Chitosan Molecules and Nanoparticles: Effects of Molecular Weight and Degree of Deacetylation // Pharm. Res. 2004. T. 21. № 2. C. 344-353.

97. Joenoes H. h gp. Construction of recombinant plasmid pcDNA3.1/BMP-2 and its involvement in differentiation of human dental pulp-derived cells into an odontoblastic lineage // Makara J. Heal. Res. 2010. T. 13. № 1. C. 5-8.

98. Kaige Lu D. Z. BMP-2 gene modified canine bMSCs promote ectopic bone formation mediated by a nonviral PEI derivative // Ann Biomed Eng. 2011. T. 39. № 6. C. 1829-1839.

99. Kaipel M. h gp. Evaluation of fibrin-based gene-activated matrices for BMP2/7 plasmid codelivery in a rat nonunion model // Int. Orthop. 2014. T. 38. № 12. C. 26072613.

100. Kalfas I. H. Principles of bone healing. // Neurosurg. Focus. 2001. T. 10. № 4. C. 1-4.

101. Kane R. J., Roeder R. K. Effects of hydroxyapatite reinforcement on the architecture and mechanical properties of freeze-dried collagen scaffolds // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2012. T. 7. C. 41-49.

102. Kargozar S. h gp. Synthesis, physico-chemical and biological characterization of strontium and cobalt substituted bioactive glasses for bone tissue engineering // J. Non. Cryst. Solids. 2016. T. 449. C. 133-140.

103. Kawai M. h gp. Non-Surgical Model for Alveolar Bone Regeneration by Bone Morphogenetic Protein-2/7 Gene Therapy // J. Periodontol. 2017. C. 1-18.

104. Kawai M. h gp. Analysis of mineral apposition rates during alveolar bone regeneration over three weeks following transfer of BMP-2/7 gene via in vivo electroporation // Eur. J. Histochem. 2018. T. 62. № 3. C. 217-221.

105. Keeney M. и др. Scaffold-mediated BMP-2 minicircle DNA delivery accelerated bone repair in a mouse critical-size calvarial defect model // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 2016. Т. 104. № 8. С. 2099-2107.

106. Keerthi Atluri и др. Nanoplex-mediated co-delivery of fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein genes promotes osteogenesis in human adipocyte-derived mesenchymal stem cells // Mol Pharm. 2015. Т. 12. № 8. С. 3032-3042.

107. Kelly M. P. и др. Cancer risk from bone morphogenetic protein exposure in spinal arthrodesis // J. Bone Jt. Surg. - Am. Vol. 2014. Т. 96. № 17. С. 1417-1422.

108. Khattar V. и др. Structural determinants and genetic modifications enhance BMP2 stability and extracellular secretion // FASEB BioAdvances. 2019. Т. 1. № 3. С. 180190.

109. Khorsand B. и др. Regeneration of bone using nanoplex delivery of FGF-2 and BMP-2 genes in diaphyseal long bone radial defects in a diabetic rabbit model // J. Control. Release. 2017. Т. 248. С. 53-59.

110. Khvorostina M. и др. Osteogenesis enhancement with 3D printed gene-activated sodium alginate scaffolds // 2023. С. 1-13.

111. Kiang T. и др. The effect of the degree of chitosan deacetylation on the efficiency of gene transfection // Biomaterials. 2004. Т. 25. № 22. С. 5293-5301.

112. Kimelman-Bleich N. и др. Targeted gene-and-host progenitor cell therapy for nonunion bone fracture repair // Mol. Ther. 2011. Т. 19. № 1. С. 53-59.

113. Kolk A. и др. A novel nonviral gene delivery tool of BMP-2 for the reconstitution of critical-size bone defects in rats // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 2016. Т. 104. № 10. С. 2441-2455.

114. Kolk A. и др. Comparative analysis of bone regeneration behavior using recombinant human BMP-2 versus plasmid DNA of BMP-2 // J. Biomed. Mater. Res. -Part A. 2019. Т. 107. № 1. С. 163-173.

115. Kozisek T. и др. Comparison of promoter, DNA vector, and cationic carrier for efficient transfection of hMSCs from multiple donors and tissue sources // Mol. Ther. Nucleic Acids. 2021. Т. 26. С. 81-93.

116. Kroczek A. h gp. Effects of osteoinduction on bone regeneration in distraction: Results of a pilot study // J. Cranio-Maxillofacial Surg. 2010. T. 38. № 5. C. 334-344.

117. Kunath K. h gp. Low-molecular-weight polyethylenimine as a non-viral vector for DNA delivery: Comparison of physicochemical properties, transfection efficiency and in vivo distribution with high-molecular-weight polyethylenimine // J. Control. Release. 2003. T. 89. № 1. C. 113-125.

118. Kuttappan S. h gp. BMP2 expressing genetically engineered mesenchymal stem cells on composite fibrous scaffolds for enhanced bone regeneration in segmental defects // Mater. Sci. Eng. C. 2018. T. 85. № August 2017. C. 239-248.

119. Laird N. Z. h gp. Gene- and RNAi-activated scaffolds for bone tissue engineering: Current progress and future directions // Adv. Drug Deliv. Rev. 2021. T. 174. C. 613627.

120. Lee B. K. h gp. PLA micro- and nano-particles // Adv. Drug Deliv. Rev. 2016. T. 107. C. 176-191.

121. Lee J. E. h gp. Enhanced transfection of human mesenchymal stem cells using a hyaluronic acid/calcium phosphate hybrid gene delivery system // Polymers (Basel). 2019a. T. 11. № 5.

122. Lee K.-S. h gp. Runx2 is a common target of transforming growth factor p1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12 // Mol. Cell. Biol. 2000. T. 20. № 23. C. 8783-8792.

123. Lee Y. H. h gp. Enzyme-crosslinked gene-activated matrix for the induction of mesenchymal stem cells in osteochondral tissue regeneration // Acta Biomater. 2017. T. 63. № 7. C. 210-226.

124. Lee Y. H. h gp. Application of alginate microbeads as a carrier of bone morphogenetic protein-2 for bone regeneration // J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 2019b. T. 107. № 2. C. 286-294.

125. Li C. h gp. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy // Nat. Rev. Genet. 2020 214. 2020. T. 21. № 4. C. 255-272.

126. Li H. и др. Accelerated bony defect healing based on chitosan thermosensitive hydrogel scaffolds embedded with chitosan nanoparticles for the delivery of BMP2 plasmid DNA // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2017. Т. 105. № 1. С. 265-273.

127. Li X. и др. Effect of polylactic acid membrane on guided bone regeneration in anterior maxillary implantation // Med. Sci. Monit. 2023. Т. 29. С. e938566-1.

128. Liu Z. и др. The combination of nano-calcium sulfate/platelet rich plasma gel scaffold with BMP2 gene-modified mesenchymal stem cells promotes bone regeneration in rat critical-sized calvarial defects // Stem Cell Res. Ther. 2017. Т. 8. № 1. С. 1-9.

129. Loozen L. D. и др. BMP-2 gene delivery in cell-loaded and cell-free constructs for bone regeneration // PLoS One. 2019. Т. 14. № 7. С. 1-16.

130. Luca L. и др. Injectable rhBMP-2-loaded chitosan hydrogel composite: Osteoinduction at ectopic site and in segmental long bone defect // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2011. Т. 96A. № 1. С. 66-74.

131. Lv H. и др. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery // J. Control. Release. 2006. Т. 114. № 1. С. 100-109.

132. Maier P. и др. Retroviral vectors for gene therapy //Future microbiology. 2010. Т. 5. № 10. С. 1507-1523.

133. Manassero M. и др. Coral scaffolds in bone tissue engineering and bone regeneration // Cnidaria, past, Present Futur. World Medusa her Sisters. 2016. С. 691714.

134. Masuki H. и др. Growth factor and pro-inflammatory cytokine contents in platelet-rich plasma (PRP), plasma rich in growth factors (PRGF), advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), and concentrated growth factors (CGF) // Int. J. Implant Dent. 2016. Т. 2. № 1.

135. McClellan J. W. и др. Vertebral bone resorption after transforaminal lumbar interbody fusion with bone morphogenetic protein (rhBMP-2) // J. Spinal Disord. Tech. 2006. Т. 19. № 7. С. 483-486.

136. Midoux P. и др. Polymer-Based Gene Delivery: A Current Review on the Uptake and Intracellular Trafficking of Polyplexes // Curr. Gene Ther. 2008. Т. 8. № 5. С. 335352.

137. Mishra A. h gp. Buffered platelet-rich plasma enhances mesenchymal stem cell proliferation and chondrogenic differentiation // Tissue Eng. Part C. Methods. 2009. T. 15. № 3. C. 431-435.

138. Moisley K. M. h gp. Optimising proliferation and migration of mesenchymal stem cells using platelet products: A rational approach to bone regeneration // J. Orthop. Res. 2019. T. 37. № 6. C. 1329-1338.

139. Morozov A. G. h gp. In Vitro Study of Degradation Behavior, Cytotoxicity, and Cell Adhesion of the Atactic Polylactic Acid for Biomedical Purposes // J. Polym. Environ. 2020. T. 28. № 10. C. 2652-2660.

140. Morshed M. h gp. Non-viral delivery systems of DNA into stem cells: Promising and multifarious actions for regenerative medicine // J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2020. T. 60. C. 101861.

141. Nandi S. K. h gp. In vitro and in vivo evaluation of the marine sponge skeleton as a bone mimicking biomaterial // Integr. Biol. (Camb). 2015. T. 7. № 2. C. 250-262.

142. Nedorubova I. A. h gp. Development of osteoplastic material impregnated with plasmid encoding bone morphogenetic protein-2 // Biotekhnologiya. 2020. T. 36. № 4. C. 59-64.

143. Nedorubova I. A. h gp. Comparative study of BMP-2 gene delivery to Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells with Turbofect and Polyethylenimine // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2021a. T. 677. № 4. C. 042024.

144. Nedorubova I. A. h gp. Development of osteoplastic material impregnated with plasmid encoding bone morphogenetic protein-2 // Appl. Biochem. Microbiol. 2021b. T. 57. № 7. C. 818-822.

145. Nedorubova I. A. h gp. Comparative Efficiency of Gene-Activated Matrices Based on Chitosan Hydrogel and PRP Impregnated with BMP2 Polyplexes for Bone Regeneration // Int. J. Mol. Sci. 2022. T. 23. № 23.

146. Ning K. h gp. Adeno-Associated Virus Monoinfection Induces a DNA Damage Response and DNA Repair That Contributes to Viral DNA Replication // MBio. 2023. T. 14. № 1.

147. Niyibizi C. h gp. Potential role for gene therapy in the enhancement of fracture healing // Clin. Orthop. Relat. Res. 1998. T. 355. № SUPPL. C. 148-153.

148. Noori A. h gp. A review of fibrin and fibrin composites for bone tissue engineering // Int. J. Nanomedicine. 2017. T. 12. C. 4937-4961.

149. Olton D. h gp. Nanostructured calcium phosphates (NanoCaPs) for non-viral gene delivery: Influence of the synthesis parameters on transfection efficiency // Biomaterials. 2007. T. 28. № 6. C. 1267-1279.

150. Osada K. Development of functional polyplex micelles for systemic gene therapy // Polym. J. 2014. T. 46. № 8. C. 469-475.

151. Paidikondala M., Kadekar S., Varghese O. P. Innovative strategy for 3D transfection of primary human stem cells with BMP-2 expressing plasmid DNA: A clinically translatable strategy for ex vivo gene therapy // Int. J. Mol. Sci. 2019. T. 20. № 1.

152. Pandita D. h gp. Gene delivery into mesenchymal stem cells: A biomimetic approach using rgd nanoclusters based on poly(amidoamine) dendrimers // Biomacromolecules. 2011. T. 12. № 2. C. 472-481.

153. Papadopoulos A. h gp. Injectable and photopolymerizable tissue-engineered auricular cartilage using poly(ethylene glycol) dimethacrylate copolymer hydrogels // Tissue Eng. Part A. 2011. T. 17. № 1-2. C. 161.

154. Park J. h gp. Bone regeneration in critical size defects by cell-mediated BMP-2 gene transfer: A comparison of adenoviral vectors and liposomes // Gene Ther. 2003. T. 10. № 13. C. 1089-1098.

155. Park J. h gp. The effect on bone regeneration of a liposomal vector to deliver BMP-2 gene to bone grafts in peri-implant bone defects // Biomaterials. 2007. T. 28. № 17. C. 2772-2782.

156. Park S. h gp. Improved Bone Regeneration with Multiporous PLGA Scaffold and BMP-2-Transduced Human Adipose-Derived Stem Cells by Cell-Permeable Peptide // Implant Dent. 2017. T. 26. № 1. C. 4-11.

157. Park S. Y. h gp. Enhanced Bone Regeneration by Diabetic Cell-Based Adenoviral BMP-2 Gene Therapy in Diabetic Animals // Tissue Eng. - Part A. 2018. T. 24. № 1112. C. 930-942.

158. Pawar S. N., Edgar K. J. Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications // Biomaterials. 2012. T. 33. № 11. C. 3279-3305.

159. Pellá M. C. G. h gp. Chitosan-based hydrogels: From preparation to biomedical applications // Carbohydr. Polym. 2018. T. 196. C. 233-245.

160. Qadir A. h gp. Non-viral delivery system and targeted bone disease therapy // Int. J. Mol. Sci. 2019. T. 20. № 3. C. 1-21.

161. Qian D. h gp. Construction of doxycycline-mediated BMP-2 transgene combining with APA microcapsules for bone repair // Artif. Cells, Nanomedicine Biotechnol. 2016. T. 44. № 1. C. 270-276.

162. Qiao C. h gp. Using poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres to encapsulate plasmid of bone morphogenetic protein 2/polyethylenimine nanoparticles to promote bone formation in vitro and in vivo // Int. J. Nanomedicine. 2013. T. 8. C. 2985-2995.

163. Qin J. Y. h gp. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter // PLoS One. 2010. T. 5. № 5. C. 3-6.

164. Raftery R. M. h gp. Development of a gene-activated scaffold platform for tissue engineering applications using chitosan-pDNA nanoparticles on collagen-based scaffolds // J. Control. Release. 2015. T. 210. C. 84-94.

165. Raftery R. M. h gp. Delivery of the improved BMP-2-Advanced plasmid DNA within a gene-activated scaffold accelerates mesenchymal stem cell osteogenesis and critical size defect repair // J. Control. Release. 2018. T. 283. № 2017. C. 20-31.

166. Raftery R., O'Brien F. J., Cryan S. A. Chitosan for Gene Delivery and Orthopedic Tissue Engineering Applications // Molecules. 2013. T. 18. № 5. C. 5611.

167. Rahimi P. h gp. Comparison of transfection efficiency of polymer-based and lipid-based transfection reagents. // Bratisl. Lek. Listy. 2018. T. 119. № 11. C. 701-705.

168. Roberts D. M. h gp. Hexon-chimaeric adenovirus serotype 5 vectors circumvent pre-existing anti-vector immunity // Nat. 2006 4417090. 2006. T. 441. № 7090. C. 239243.

169. Rodan G. A. Control of bone formation and resorption: biological and clinical perspective. // J. Cell. Biochem. Suppl. 1998. T. 30-31. № SUPPL. 30/31. C. 55-61.

170. Rodríguez-Vázquez M. h gp. Chitosan and its potential use as a scaffold for tissue engineering in regenerative medicine // Biomed Res. Int. 2015. T. 2015.

171. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food Microbiol. 1999. T. 47. № 1-2. C. 67-77.

172. Roubelakis M. G. h gp. Platelet-Rich Plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process // Stem Cell Rev. Reports. 2014. T. 10. № 3. C. 417-428.

173. Ruponen M. h gp. Interactions of polymeric and liposomal gene delivery systems with extracellular glycosaminoglycans: Physicochemical and transfection studies // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1999. T. 1415. № 2. C. 331-341.

174. Russell W. C. Adenoviruses: Update on structure and function // J. Gen. Virol. 2009. T. 90. № 1. C. 1-20.

175. Safadi F. F. h gp. Bone structure, development and bone biology // Bone Pathol. 2009. C. 1-50.

176. Santos J. L. h gp. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells using PAMAM dendrimers as gene delivery vectors // J. Control. Release. 2009. T. 134. № 2. C. 141-148.

177. Scaduto A. A., Lieberman J. R. Gene therapy for osteoinduction // Orthop. Clin. North Am. 1999. T. 30. № 4. C. 625-633.

178. Scheller E. L., Krebsbach P. H. Gene therapy: Design and prospects for craniofacial regeneration // J. Dent. Res. 2009. T. 88. № 7. C. 585-596.

179. Schmidt-Bleek K. h gp. BMPs in bone regeneration: Less is more effective, a paradigm-shift // Cytokine Growth Factor Rev. 2016. T. 27. C. 141-148.

180. Seda Tigli R., Karake?ili A., Gümü§derelioglu M. In vitro characterization of chitosan scaffolds: Influence of composition and deacetylation degree // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2007. T. 18. № 9. C. 1665-1674.

181. Seo J. I. h gp. Effects of rhBMP-2 with various carriers on maxillofacial bone regeneration through computed tomography evaluation // Maxillofac. Plast. Reconstr. Surg. 2023. T. 45. № 1. C. 1-8.

182. Seymour L. W., Fisher K. D. Adenovirus: Teaching an Old Dog New Tricks // https://home.liebertpub.com/hum. 2011. T. 22. № 9. C. 1041-1042.

183. Shapiro G. h gp. Recent Advances and Future of Gene Therapy for Bone Regeneration // Curr. Osteoporos. Rep. 2018. T. 16. № 4. C. 504-511.

184. Shea L. D. h gp. DNA delivery from polymer matrices for tissue engineering // Nat. Biotechnol. 1999 176. 1999. T. 17. № 6. C. 551-554.

185. Sheyn D. h gp. Ultrasound-based nonviral gene delivery induces bone formation in vivo // Gene Ther. 2008 154. 2007. T. 15. № 4. C. 257-266.

186. Shih Y. V h gp. Calcium phosphate-bearing matrices induce osteogenic differentiation of stem cells through adenosine signaling // 2013.

187. Shrivats A. R. h gp. Bone Regeneration // Princ. Tissue Eng. Fourth Ed. 2014. C. 1201-1221.

188. Silva D. da h gp. Biocompatibility, biodegradation and excretion of polylactic acid (PLA) in medical implants and theranostic systems // Chem. Eng. J. 2018. T. 340. C. 914.

189. Skovrlj B. h gp. Association Between BMP-2 and Carcinogenicity // Spine (Phila. Pa. 1976). 2015. T. 40. № 23. C. 1862-1871.

190. Slivac I. h gp. Non-viral nucleic acid delivery methods // Expert Opin. Biol. Ther. 2017. T. 17. № 1. C. 105-118.

191. Song I. h gp. Effects of BMP-2 and vitamin D3 on the osteogenic differentiation of adipose stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. T. 408. № 1. C. 126131.

192. Sorushanova A. h gp. The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development // Adv. Mater. 2019. T. 31. № 1. C. 1801651.

193. Stylios G., Wan T., Giannoudis P. Present status and future potential of enhancing bone healing using nanotechnology // Injury. 2007. T. 38. № 1. C. S63-S74.

194. Sukul M. h gp. In vitro biological response of human osteoblasts in 3D chitosan sponges with controlled degree of deacetylation and molecular weight // Carbohydr. Polym. 2021. T. 254. C. 117434.

195. Sun X., Zhang N. Cationic Polymer Optimization for Efficient Gene Delivery // Mini-Reviews Med. Chem. 2010. T. 10. № 2. C. 108-125.

196. Tamm C. h gp. Fast and Efficient Transfection of Mouse Embryonic Stem Cells Using Non-Viral Reagents // Stem Cell Rev. Reports. 2016. T. 12. № 5. C. 584-591.

197. Tan E. h gp. HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors // Front. Bioeng. Biotechnol. 2021. T. 9. C. 796991.

198. Tang Y. h gp. Combination of bone tissue engineering and BMP-2 gene transfection promotes bone healing in osteoporotic rats // Cell Biol. Int. 2008. T. 32. № 9. C. 1150-1157.

199. Thomas C. E., Ehrhardt A., Kay M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy // Nat. Rev. Genet. 2003 45. 2003. T. 4. № 5. C. 346-358.

200. Thomas T. J., Tajmir-Riahi H. A., Pillai C. K. S. Biodegradable polymers for gene delivery // Molecules. 2019. T. 24. № 20.

201. Tolmachov O. Designing plasmid vectors // Methods Mol. Biol. 2009. T. 542. C. 117-129.

202. Tsuchiya S. h gp. Transfer of the bone morphogenetic protein 4 gene into rat periodontal ligament by in vivo electroporation // Arch. Oral Biol. 2017. T. 74. C. 123132.

203. Tyler B. h gp. Polylactic acid (PLA) controlled delivery carriers for biomedical applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2016. T. 107. C. 163-175.

204. Vannucci L. h gp. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology // New Microbiol. 2013. T. 36. C. 1-22.

205. Vasilyev A. V. h gp. Comparison of Impregnated Bone Morphogenetic Protein-2 Release Kinetics from Biopolymer Scaffolds // Inorg. Mater. Appl. Res. 2019. T. 10. № 5. C. 1093-1100.

206. Vasilyev A. V. h gp. Influence of the degree of deacetylation of chitosan and bmp-2 concentration on biocompatibility and osteogenic properties of bmp-2/pla granule-loaded chitosan/p-glycerophosphate hydrogels // Molecules. 2021a. T. 26. № 2.

207. Vasilyev A. V. h gp. Osteoinductive Moldable and Curable Bone Substitutes Based // Polymers (Basel). 2021b. T. 13. № 22. C. 3974.

208. Vorburger S. A., Hunt K. K. Adenoviral Gene Therapy // Oncologist. 2002. T. 7. № 1. C. 46-59.

209. Vural A. C. h gp. Cranial bone regeneration via BMP-2 encoding mesenchymal stem cells // Artif. Cells, Nanomedicine Biotechnol. 2017. T. 45. № 3. C. 544-550.

210. Waehler R. h gp. Engineering targeted viral vectors for gene therapy // Nat. Rev. Genet. 2007 88. 2007. T. 8. № 8. C. 573-587.

211. Wang W. h gp. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients // J. Cell. Mol. Med. 2011. T. 15. № 9. C. 19891998.

212. Wang Y. h gp. Modification of human umbilical cord blood stem cells using polyethylenimine combined with modified TAT peptide to enhance BMP-2 Production // Biomed Res. Int. 2017. T. 2017.

213. Washington M. A. h gp. The impact of monomer sequence and stereochemistry on the swelling and erosion of biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) matrices // Biomaterials. 2017. T. 117. C. 66-76.

214. Wegman F. h gp. Osteogenic differentiation as a result of BMP-2 plasmid DNA based gene therapy in vitro and in vivo // Eur. Cells Mater. 2011. T. 21. C. 230-242.

215. Wilkinson P. h gp. Systematic review of the preclinical technology readiness of orthopedic gene therapy and outlook for clinical translation // Front. Bioeng. Biotechnol. 2021. T. 9. № March. C. 1-24.

216. Witte T. M. De h gp. Bone tissue engineering via growth factor delivery: from scaffolds to complex matrices // Regen. Biomater. 2018. T. 5. № 4. C. 197-211.

217. Woo E. J. Recombinant human bone morphogenetic protein-2: adverse events reported to the Manufacturer and User Facility Device Experience database // Spine J. 2012. T. 12. № 10. C. 894-899.

218. Wozney J. M., Rosen V. Bone Morphogenetic Protein and Bone Morphogenetic // Clin. Orthop. Relat. Res. 1998. № 346. С. 26-37.

219. Wu A. M. и др. Global, regional, and national burden of bone fractures in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis from the Global Burden of Disease Study 2019 // Lancet Heal. Longev. 2021. Т. 2. № 9. С. e580-e592.

220. Wu D. T. и др. Polymeric scaffolds for dental, oral, and craniofacial regenerative medicine // Molecules. 2021. Т. 26. №. 22. С. 7043.

221. Wu G. P. и др. Effect of electroporation-mediated transfecting recombinant plasmid pIRES-hBMP2-hVEGF165 on mandibular distraction osteogenesis // Ann. Plast. Surg. 2012. Т. 69. № 3. С. 316-325.

222. Xu J. и др. Platelet-rich plasma and regenerative dentistry // Aust. Dent. J. 2020. Т. 65. № 2. С. 131-142.

223. Xue J. и др. One-step fabrication of bone morphogenetic protein-2 gene-activated porous Poly-L-Lactide scaffold for bone induction // Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. 2017. Т. 7. № December. С. 50-59.

224. Yang S., May S. Release of cationic polymer-DNA complexes from the endosome: A theoretical investigation of the proton sponge hypothesis // J. Chem. Phys. 2008. Т. 129. № 18.

225. Yang W. и др. Applications and prospects of non-viral vectors in bone regeneration // Curr. Gene Ther. 2018. Т. 18. С. 21-28.

226. Yang X. и др. Non-viral bone morphogenetic protein 2 transfection of rat dental pulp stem cells using calcium phosphate nanoparticles as carriers // Tissue Eng. - Part A. 2008. Т. 14. № 1. С. 71-81.

227. Yang X. и др. Chitosan/collagen scaffold containing bone morphogenetic protein-7 DNA supports dental pulp stem cell differentiation in vitro and in vivo // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 2020. Т. 108. № 12. С. 2519-2526.

228. Yao S., Rong W., Yuan Y. Optimization of adeno-associated virus (AAV) gene delivery into human bone marrow stem cells (hBMSCs) // Stem Cell Investig. 2023. Т. 10. № 0. С. 3-3.

229. Yazici C. h gp. Self-complementary AAV2.5-BMP2-coated femoral allografts mediated superior bone healing versus live autografts in mice with equivalent biomechanics to unfractured femur // Mol. Ther. 2011. T. 19. № 8. C. 1416-1425.

230. Yu Z. h gp. Application of fibrin-based hydrogels for nerve protection and regeneration after spinal cord injury // J. Biol. Eng. 2020. T. 14. № 1. C. 1-15.

231. Yue J. h gp. BMP2 gene delivery to bone mesenchymal stem cell by chitosan-g-PEI nonviral vector // Nanoscale Res. Lett. 2015. T. 10. № 1.

232. Zaragosi L.-E. h gp. Nucleofection is a valuable transfection method for transient and stable transgene expression in adipose tissue-derived stem cells // Stem Cells. 2007. T. 25. № 3. C. 790-797.

233. Zhang H., Bradley A. Mice deficient for BMP2 are nonviable and have defects in amnion/chorion and cardiac development // Development. 1996. T. 122. № 10. C. 29772986.

234. Zhang J. h gp. The Effects of Platelet-Rich and Platelet-Poor Plasma on Biological Characteristics of BM-MSCs in Vitro // Anal. Cell. Pathol. 2020. T. 2020.

235. Zhang N. h gp. Research progress in the mechanism of effect of PRP in bone deficiency healing // Sci. World J. 2013. T. 2013.

236. Zhang W. h gp. BMP-2 gene-fibronectin-apatite composite layer enhances bone formation // J. Biomed. Sci. 2011. T. 18. № 1. C. 1-11.

237. Zhang W. h gp. An Improved, Chemically Modified RNA Encoding BMP-2 Enhances Osteogenesis in Vitro and in Vivo. , 2019. 131-144 c.

238. Zhu Y. h gp. Biomaterial properties modulating bone regeneration // Macromolecular Bioscience. 2021. T. 21. №. 4. C. 2000365.

239. Zhuravleva M. N. h gp. Recombinant Plasmid DNA Construct Encoding Combination of vegf165 and bmp2 cDNAs Stimulates Osteogenesis and Angiogenesis In Vitro // Bionanoscience. 2017. T. 7. № 2. C. 288-293.

240. Zimina A. h gp. Biocompatibility and Physico-Chemical Properties of Highly Porous PLA/HA Scaffolds for Bone Reconstruction // Polym. 2020, Vol. 12, Page 2938. 2020. T. 12. № 12. C. 2938.