Влияние охлаждения на структуру и осмотические свойства эритроцитов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.22, кандидат биологических наук Бабийчук, Любовь Александровна

• Бабийчук, Любовь Александровна
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бабийчук, Любовь Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структурная организация мембран эритроцитов

2. Холодовой шок эритроцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. Материалы и методы исследования

4. Изменение объема и формы эритроцитов в гипертонических средах как начальный этап модификации барьерных свойств мембраны

5. Влияние температуры на поведение эритроцитов при изменении осмотических условий среды.

6. Влияние состава и рН среды на чувствительность к охлаждению клеток,подвергнутых инкубации при +37 и 0°С.

7. Влияние температуры инкубации (0 и +37°С) на устойчивость эритроцитов к замораживанию в присутствии не проникающего крио-протектора (ПЭ0-1500)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние охлаждения на структуру и осмотические свойства эритроцитов человека»

Замораживание и последующий отогрев биологических объектов вызывают повреждения как на тканевом и органном, так и на клеточном уровнях организации [2,15,18,23,25]. В настоящее время в криобиологических исследованиях значительное внимание уделяется изучению механизмов холодового повреждения мембранных структур клетки [2,109,162]. Важной особенностью механизма повреждения мембран при охлаждении является развитие процессов, модифицирующих их структуру, уже при положительных температурах [2,41. Указанные процессы включают конформационные изменения мембранных белков L31 и фазовые переходы липидов [236]. Подобные изменения не являются безразличными для сохранения жизнеспособности клеток: нарушение структуры и проницаемости мембраны под их влиянием при быстром охлаждении от +37 до 0°С вызывают лизис некоторых клеток [23,2151, в том числе эритроцитов [162,2501. Разнообразие физико-химических факторов, потенцирующих повреждение эритроцитов при охлаждении в области положительных температур (высокие концентрации непроникающих солей и неэлектролитов [250] , бактериальные токсины [2151, лизофосфатиды [2401 и другие [I43J) не позволяет в настоящее время предложить единый механизм, объясняющий поведение клеток в указанных условиях. Однако, то, что холодовое повреждение эритроцитов усиливается в гиперосмотических условиях, делает необходимым анализ поведения клеток в растворах непроникающих через мембрану криопротекторов (полиэтиленоксиды,гидрокси -этилкрахмал,поливинилпирролидон [19]). Можно предположить, что трудности их применения в криобиологической практике обусловлены развитием температурозависимых изменений, аналогичных процессам, наблюдаемым при охлаждении в гипертонических солевых средах при положительных температурах [109]. Поэтому, выявление основных закономерностей нарушения структуры и функции клеток при положительных температурах позволит разработать наиболее оптимальные условия обработки клеток криопротекторами и обосновать принципы направленного контроля процессов модифицирующих состояние клет -ки при ее охлаждении из области физиологических температур.

Другой важной проблемой является выявление процессов, модифицирующих структуру мембраны при помещении клетки в гипертони -ческие среды. Б этих условиях реакция клетки может быть весьма сложной и проявляться как в изменениях ее макроскопических параметров (формы и объема), так и в изменениях молекулярной структуры мембраны.

Изменения объема и формы клетки вызывают модификацию структуры мембраны уже в начальной фазе гипертонической обработки,поэтому изменения, вызванные охлаждением,будут "накладываться" на уже модифицированную структуру, а результирующий процесс будет зависеть от исходного состояния клетки. В этой связи следует отметить, что начальная реакция клетки на изменение осмотических условий среды проявляется в изменении ее формы, т.е.в развитии локальных деформаций мембраны. Последнее способно привести к локальным изменениям структуры мембраны [161, что делает необходимой постановку вопроса о том, как проявляют себя начальные нарушения структуры, и какова их роль в повреждении клетки при последующем охлаждении.

Решение этого вопроса сопряжено с рядом трудностей.Во-первых, традиционные подходы к анализу механизмов холодового пов -реждения клетки в большинстве своем не учитывают важной особенности организации структуры мембраны - продольной и поперечной асимметрии в распределении ее компонентов [87]. Это означает, что "дифференциальная" холодовая чувствительность различных участков мембраны заложена в ее исходной структуре.

Во-вторых, большинство клеток имеет сложно организованный

- 5 белковый цитоскелет, стабилизирующий структуру мембраны и контролирующий динамическое поведение ее компонентов [115]. В целом, повреждение структуры мембраны может проявляться как нарушение ее барьерных свойств, что способно привести к коллоидно-осмоти -ческому набуханию и лизису клеток [2431.

Начальная реакция эритроцитов на изменение осмотических условий среды, связанная с изменением объема и формы, включает изменения белкового цитоскелета, что отразится как на структурной устойчивости мембраны, так и на состоянии участков прикрепления к ней цитоскелета. Эти изменения могут привести к формированию дефектов структуры и нарушению барьерных свойств мембраны. Последующее охлаждение может вызвать углубление уже существующих нарушений структуры и лизис клеток.

Таким образом, выявление температурозависимых изменений структуры мембраны в гиперосмотических условиях предполагает анализ изменений макроскопических параметров клетки (формы и объе -ма) и изменений молекулярной структуры и проницаемости мембраны.

Исходя из этого, целью данной работы явилось исследование изменений формы, объема, структуры и проницаемости эритроцитов, вызванных действием повышенной тоничности среды при +37 и 0°С, а также после охлаждения от +37 до 0°С и замораживания до -196°С в присутствии Х5$-ного ПЭО-1500.

Для достижения указанной цели требовалось решение следую -щих задач:

- исследовать направленность и характер изменений объема и формы эритроцитов при 0 и +37°С в зависимости от тоничности среды;

- на основе анализа изменения пассивной проницаемости мембраны для ионов К1" изучить устойчивость барьерных свойств мембраны при изменении тоничности и температуры среды;

- б

- с помощью флуоресцентных зондов (пиренДНСДСП-12 и ОСП--14) изучить направленность и характер изменений структурного состояния липидов и белков мембраны эритроцитов при О и +37°С в средах различной тоничности, а также обратимость указанных изменений;

- исследовать структурную устойчивость эритроцитов к циклическому сдвигу температуры 0—-+37—*0°С в зависимости от тонич -ности, состава и рН среды и направленности сдвига осмотических условий;

- исследовать влияние температуры, при которой производится обработка эритроцитов криопротектором ПЭО-1500,на их устойчивость к замораживанию до -19б°С и последующему отогреву.

В работе установлено,что температура,при которой эритроциты помещаются в гипертонические условия,оказывает существенное влияние на макроскопические параметры эритроцитов (объем и форму). Впервые показано,что при 0°С изменения формы эритроцитов,вызванные повышением тоничности среды,носят качественно иной характер, чем при +37°С. При низкой температуре не формируются некоторые переходные формы клеток (кренированный диск) и большая часть клеток не выходит из фазы кренирования. Получены данные о том, что постгипертонический лизис эритроцитов.наблюдаемый при возврате клеток из гипертонических условий в среды с физиологической то -ничностью,а также лизис клеток при охлаждении от +37 до 0°С в присутствии 0,6-1,2 М h(oU коррелируют с начальным уровнем дефектности структуры,оцениваемой по освобождению ионов К4*.

Новым является установление факта о взаимосвязи между количеством появляющихся на этапе инкубации в гипертонических условиях чувствительных к охлаждению эритроцитов в форме гладкого плоского диска, и величиной гемолиза при последующем охлаждении. Получены данные об устойчивости макроскопических параметров эритроцитов, проницаемости и структуры мембраны при циклическом сдвиге температуры в присутствии гипертонических концентраций соли.С помощью флуоресцентных зондов установлено, что основная роль в эффектах, развивающихся в условиях гипертонии, принадле -жит пространственной реорганизации белковых компонентов мембраны.

В работе получены новые данные о влиянии температуры на поведение эритроцитов в средах с высокой тоничностью (от 1,8 до 3,0 М //act ). Показана важная роль в этих процессах рН и температуры среды. Впервые показана эффективность дозированного вве -дения в среду криопротектора при низких температурах как факго -ра.,резко повышающего устойчивость эритроцитов к замораживанию и изменению осмотических условий среды.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что на основе анализа результатов работы высказано предположение о едином механизме, лежащем в основе повреждения клеток при холодовом шоке и постгипертоническом лизисе, связанном с начальным формированием дефектов структуры мембраны. Развиты представления о роли изменений структуры белкового скелета клеток, сопровождающих изменение объема и формы клеток в качестве фактора, модифицирующего их устойчивость к изменению температуры. Указано на значение медленнообратимых изменений белков эритроцитов в процессах, вовлеченных в изменение холодовой чувствитель -ности клеток при гипертонической инкубации и охлаждении.

Анализ поведения эритроцитов в средах, содержащих непроникающий криопротектор (ПЭ0-1500), позволил предложить эффективный метод предобработки клеток перед криоконсервацией.

Разработанный на основании результатов исследований метод холодовой предобработки эритроцитов перед криоконсервацией успешно применяется на Харьковской областной станции переливания крови. Принципы разработанного метода внедрены и используются для предобработки других клеток во ВНИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных (г.Пушкин).

На защиту выносятся положения:

1. Устойчивость эритроцитов человека, к охлаждению в интервале температур +37 - 0°С в гипертонических условиях юреды зависит от объема и формы клеток, а также от исходного уровня дефектности структуры мембраны, оцениваемого по освобождению ионов К4".

2. Сохранность эритроцитов при замораживании до -19б°С в присутствии непроникающего кри о протектора. ПЭ0-Х500 существенно повышаются при снижении температуры, при которой клетки обрабатываются кри о протектором до 0 -г +4°С, когда резко ограничивается роль факторов, влияющих на форму клеток и барьерные свойства мембраны.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на IX и XI конференциях молодых ученых Института проблем криобиологии и криомеди-цины АН УССР (Харьков,1982,1984); ХУ-ом Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск,1982); 1У-ом Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев,1983); П-ой Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков,1984); П-ой Всесоюзной конференции по анабиозу (Рига.,1984).

По результатам исследований опубликовано 9 научных работ.

- 9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

Биологическим мембранам принадлежит основная роль в регуляции структуры и функции клеток. Основным структурным элементом эритроцитов млекопитающих является плазматическая мембрана,отделяющая цитоплазму от внешней среды, поэтому мембранные препараты, полученные из этих клеток, являются однородными и не загрязнены другими мембранами. В то же время структура эритроцитарной мембраны отражает общие принципы организации биологических мембран.

Основными компонентами мембран эритроцитов, как и других биологических мембран,являются белки,липиды и углеводы.Углеводы химически связаны либо с белками,либо с липидами и образуют соответственно гликопротеины и гликолипиды [7,24].

В состав мембраны эритроцитов входит около 20 белков и гли-копротеинов,а. также различные типы липидов и гликолипидов [1701 , [1951. Большинство белков и гликопротеинов являются интегральными и солюбилизируются в присутствии детергентов.органических растворителей и при изменении рН [65,125,230]. Эти белки погружены в бислой и стабилизируются в нем гидрофобными взаимодействиями [2251. Степень погружения белков в гидрофобное ядро мембраны может быть различной в зависимости от их амфифильных свойств.Интегральные белки пронизывают мембрану,причем гидрофильные сегменты белков экспонируются в водную фазу, a. сами белки довольно прочно связаны с липидами.Вязкость липидного матрикса весьма слабо ограничивает диффузию интегральных белков в плоскости мембраны.

Периферические мембранные компоненты (примерно 25$ всех мембранных белков) расположены на поверхности мембраны и связаны с ней слабыми нековалентными взаимодействиями. Эти белки могут быть легко элиминированы из мембраны буфером с низкой ионной силой [21,95,182].

С помощью диск-электрофореза в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель из мембран эритроцитов выделено два интегральных гликопротеина.Один из них с молекулярной массой 90100 КД (компонент 3) [218] .второй - сиалогли ко протеин с молеку -лярной массой.30^-50 КД - гликофорин [226] .Гидрофильные участки компонента 3 и гликофорина локализованы на наружной поверхности мембраны [188,219,226] и являются специфическими рецепторами для различных вирусов,лектинов и антител.Гликофорин состоит из одной полипептидной цепи.содержащей около 60$ углеводов,в основном в форме олигосахаридов [156,226] и представляет собой тримодальную молекулу с гидрофильно-гидрофобно-гидрофильной структурой.Полипептидная цепь гликофорина пронизывает липидный бислой мембраны таким образом,что Д/-концевой гликопептидный участок расположен снаружи клетки,а С-концевой гидрофобный участок - в гидрофобной липидной зоне мембраны на ее внутренней поверхности [138,170].

Другие гликопротеины - белки полосы 3 содержат около 5-8$ углеводов,в основном маннозу.галактозу и Н -ацетилглюкозамин.Показано, что белок полосы 3 выполняет такие функции,как транспорт анионов [71,194].транспорт воды [2173, обладая при этом холин -эстеразной и АТ^-азной активностью [219].Очищенный основной белок полосы 3 состоит из одной полипептидной цепи и пронизывает липидный бислой мембраны,причем его /\/-концевой участок находится на внутренней стороне мембраны.В составе мембраны белок полосы 3 формирует димеры,и.возможно - тетрамеры [185]. Ha. внутреннем домене белка полосы 3 расположен участок связывания глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы (полоса 6),и сам белок образует проч -ные связи с мембраной в присутствии молекул АТФ [185].Ферментный белок,связанный с мембраной электростатическими связями.является тетрамером с молекулярной массой 150 КД и участвует в цикле

- II гликолиза эритроцитов. Белок полосы 3 и гликофорин формируют мембрано-интеркалированные частицы,хорошо видимые при криоскалы-вании [239] и их количество в эритроцитарной мембране (5*10^) соответствует числу молекул этих интегральных белков [219].

Цитоплазматическая (внутренняя) поверхность мембран эритроцитов покрыта филаментным ретикулумом из белков,поддерживающим целостность мембраны по механизму нековалентной стабилизации.Субмембранный ретикулум довольно устойчив и при солюбилизации бел -ков тритоном Х-100 сохраняет свои свойства [70,119,1461. В его состав,прежде всего, входит водорастворимый белок с высоким молекулярным весом - спектрин, который при гель-электрофорезе формирует две дискретные полосы [581. Другим компонентом,входящим в субмембранный ретикулум,является белок полосы 4.1,а также эритро-цитарная форма активна (полоса 5) [34,1051.

Молекула спектрина представляет собой димер из двух неидентичных субъединиц,обозначаемых об (250 КД) и j*> (225 КД).' Обе субъединицы представляют собой удлиненные палочковидные структуры, каждая приблизительно 1000 I в длину [176].Последние эксперименты свидетельствуют,что данные структуры образуют множественные нековалентные ассоциации между соседними сегментами,что обеспечивает их контакт друг с другом [169].Высокоочшценные молекулы спектрина способны формировать крупные макромолекулярные агрегаты без участия других посредников [169,1841.При этом димеры спектрина превращаются в тетрамерные формы [134] с определенной ориентировкой головы и хвоста [212].образуя,таким образом.тетрамерные единицы удвоенной длины.Установлено.что индивидуальные спек-триновые димеры организуются в тетрамерные формы с помощью нековал ентных взаимодействий между сегментом домена с молекулярной массой 80 КД сС-субъединицы и доменом 28 КД р -субъединицы [1841.

В настоящее время существует две гипотезы о структурно

- 12 функциональной организации субъединиц спекгрина в мембране.Первая предполагает,что функционально активной в мембране является тетрамерная форма спекгрина [2331 •,согласно второй - олигомерная [ 169]. Поскольку спектрин ассоциирован с внутренней поверхностью мембраны,его локальная концентрация,достигающая 10"%, достаточна для образования олигомеров. Образование олигомеров спекгрина доказано в экспериментах иг rUUo [184] .

Вторым функционально значимым белком субмембранного ретику-лума, эритроцитов является актин (полоса 5), который представляет собой компактные глобулы с молекулярной массой 43 КД ((3"-актин) [ 34]. Актин способен связывать нуклеотиды,преимущественно АД§ и содержит элементы,индуцирующие полимеризацию & -актина.При образовании филаментных комплексов актина могут полимеризоваться 1218 молекул, называемых протофиламентами (fr-актин) [107]. Пос -кольку тетрамеры спектрина бивалентны в местах связывания актина, они могут перекрестно сшивать филаменты актина, в растворе.Полагают,что короткие филаменты актина перекрестно сжитые спекгри-ном,являются важным структурным элементом цитоскелета [92].

Добавление в реагирующую смесь белка. 4.1 увеличивает взаимодействие между спектрином и актином в растворе [63].Белок полосы 4.1 может также модулировать спектрин-зависимое прикрепление актина к мембране и формировать белковый комплекс,связанный с мембраной через спектрин [63].

Данные электронной микроскопии свидетельствуют,что белок полосы 4.1 и актин связываются с терминальными участками димера. спектрина [ 64] .Хотя структура, образуемого комплекса полностью не выяснена,,белок полосы 4.1 в указанном комплексе является связывающим звеном между спектрином и актином.Способность белка полосы . 4.1 влиять на. связывание спектрина с актином,с образованием ре -шетчатой структуры свидетельствует ,что этот белок участвует в

- 13 поддержании формы эритроцитарной мембраны [192] и вносит существенный вклад в стабильность цитоскелета клетки [210] .'Это доказывается тем,что цитоскелет эритроцитарной мембраны после истоще -ния по белку полосы 4.1 менее стабилен,чем цитоскелет нормальных клеток [146] .

Экспериментально доказано присутствие в мембране эритроци -тов другого специфичного белка с высоким сродством к спектрину, который был идентифицирован как электрофоретический компонент 2.1 -"анкирин" с молекулярной массой 210 КД [2311 .Этот белок связывается со спектрином вблизи проксимального конца димера,т.е.: у середины тетрамера,,на, противоположном конце от участка связыва -ния актина и белка полосы 4.1 [232] . Недавние исследования [121] показали,что данный белок связывается с мембраной через белок полосы 3. Олигомер анкирин-белок полосы 3 содержит также полипетид полосы 4.2 с молекулярной массой 72 КДассоциированный с белком полосы 3.Наиболее прочное звено в мембранном цитоскелете - это связь между белком 2.1 и цитоплазматической частью белка полосы 3 о

Ka"2*I0 mot' ).Второе ассоциирующее звено характеризуется Ка* "10^mol ,и включает связь спектрина с белком полосы 2.1; 4.1, и актином (в присутствии белка 4.1). При олигомеризации спектрина преобладают более слабые связи - KaBI0^ mot [184] .Полагают,что весь белок 2Л связывается с белком полосы 3 вблизи мембраны [121].

Локализация цитоплазматического белка 2.1 вблизи поверхности мембраны,возможно,является одним из начальных этапов самосборки мембранного скелета эритроцитов,который реализуется при достаточной концентрации спектрина в местах связывания.Подобный процесс сборки олигомеров спектрина может индуцироваться также за счет связывания с белком полосы 4.1 и актином (так как сродство спектрина к этим белкам достаточно велико [12X1). Тот факт, что спектрин может прикрепляться к мембране через белковый кофактор,

- .14 связанный с белком полосы 3 указывает,что мембранный скелет может оказывать стабилизирующий эффект на молекулы липидного бис-лоя непосредственно через белок полосы 2.1, либо через ионные связи включающие Са^+ [178,245].

Субмембранный ретикулум способен ограничивать латеральную подвижность трансмембранных белков [104] .поскольку белки,входя -щие в его состав,образ уют под мембраной сеть,регулирующую движение интегральных белков [205]Для некоторых белков спекгрин и другие белки субмембранного ретикулума являются "якорями".удерживающими их в определенных локусах мембраны и контролирующими их топологическую организацию.

При удалении спекгрина и актина из мембран эритроцитов,последняя разрушается и трансформируется в сферические везикулы [ 115],т.е.субмембранный ретикулум играет существенную роль в сохранении формы и размера эритроцитов.Стабилизирующий эффект субмембранного ретикулума способствует тому,что при деформации клетки она может восстанавливать форму мембраны после снятия стресса.Увеличение степени взаимодействия интегральных белков со спектрином ограничивает изменение формы клетки [205].

Таким образом,периферическая белковая сеть формирует устойчивую и элластичную основу.регулирующую деформации мембраны, и оказывает стабилизирующее действие на динамичный липидный бислой.

По данным [234] липиды в мембранах эритроцитов составляют 40$ ее сухого веса.По молекулярному соотношению примерно половина фракции липидов состоит из неэтерифицированного холестерина (40$),а другая половина из фосфолипидов (50$) и гликолипидов (10$) [234]. Основными фосфолипидами мембран эритроцитов являются сфингомиелин (СМ),фосфатидилхолин (ФХ),фосфатидилэтаноламин (ФЭА) и фосфатидилсерин (£С),которые составляют примерно 95$ от общего содержания фосфолипидов [ 234].Последние три (ФХ.ФЗА и ФС)

- 15 являются диацилглицерофосфолипидами 1.1951. Сфингомислин принадлежит к классу сфинголипидов и включает углеводородную цепь,содержащую двойную углеродную связь,две ОН-группы и А/Н^-группу^тарифицированную длинноцепочечной жирной кислотой по амидной связи, т.е.формируется церамид [1951.Гликолипиды,подобно сфингомиелину, включают церамидную единицу,хотя их полярная группировка, состоит из различных комплексных полисахаридов,которые могут включать более 20 остатков Сахаров [1951.

Липиды эритроцитов различаются не только по наличию сфинго-зинового или глицеринового скелета,но и по полярным группировкам [ 195].Каждый индивидуальный класс фосфолипидов представляет собой группу соединений,имеющих одинаковую полярную группу,но различные жирные кислоты,отличающиеся по длине цепи и числу двойных связей [691 .Та,к,фосфатидилхолин мембран эритроцитов состоит более чем из 20 молекулярных видов,типичный представитель которых формирует молекулу с насыщенной жирной кислотой во втором положении глицеринового скелета.

По данным, полученным при анализе распределения химических меток,фосфолипазного гидролиза и с помощью липид-обменивающих белков, установлено [197,235],что фосфолипиды в мембране эритроцитов распределены асимметрично по обе стороны мембраны.Холин - содержащие фосфолипиды (сфингомиелин и фосфатидилхолин) распределены преимущественно на наружной поверхности мембраны,а фосфатидилэта-ноламин и фосфатидилсерин на внутренней.В мембране эритроцитов человека 76$ ФХ и 82$ СМ находятся в наружном монослое,в то время как 80$ ФЭА и весь §С локализованы во внутреннем монослое. Все гликолипиды находятся во внешнем монослое [252]. До сих пор, однако,не выяснен характер распределения холестерина по обе стороны мембраны.Большинство данных свидетельствует о его преимущественной локализации в наружном монослое мембраны [891.

- 16

Липидный бислой эритроцитов проявляет высокую степень стазт бильности.Исследования с помощью ^АР-ЯМР показали, что даже после обработки мембран фосфолипазами,о ставшиеся липиды находятся в бислойной конфигурации [2351. До сих пор неясно.связана ли подобная стабильность с присутствием некоторых белков,или с относи -тельно высокой концентрацией холестерина в мембране, или с тем и другим вместе.Подобная стабильность играет важную роль в обеспечении физиологических свойств эритроцитов в кровяном русле и сохранении их способности к деформационным нагрузкам при прохождении через узкие капилляры [1951.

Предполагают [1721, что асимметричное расположение фосфоли-пидов в мембране эритроцитов связано со способностью ФЭА и §С взаимодействовать с частью молекул спектрина,расположенного на внутренней поверхности мембраны. Нарушение структурной организации спектрина может привести к уменьшению прочности взаимодействия между фосфолипидами и спектрином,что, в свою очередь,увеличивает скорость трансмембранных перестроек липидов типа "флип-флоп" и изменяет характер асимметрии в распределении различных фосфоли-пидов в мембране [118]. Однако.физиологическое значение липидной асимметрии до сих пор окончательно не выяснено.Установлено, в частности, что липосомы, приготовленные из фосфолипидной смеси, состав которой сходен с составом внутреннего монослоя мембраны, резко снижают время свертывания плазмы [195] -что наблюдается в присутствии незамкнутых эритроцитарных теней или вывернутых везикул.Зто может означать, что липиды цитоплазматической поверх -ности мембраны, и в первую очередь фосфатидилсерии,обладают про-коагулянтной активностью.

Фосфолипиды принимают участие в регуляции функционирования ион-транспортирующих систем мембран.Активность таких катион-транспортирующих АТФ-аз эритроцитов человека, как /Va1*-К^-АТФ-аза.

- 17 и полностью зависят от глицерофосфолипидов внутреннего монослоя [196] .Активность д^-^-АТФ-азы специфично обеспечивается фосфатидилсерином.а азы-смесью фосфолипидов внутреннего монослоя.В соответствии с их функцией оба фермента являются трансмембранными (или интегральными) и, следовательно , находятся в тесном контакте с обеими половинами бислоя. Тот факт, что только фосфолипиды внутренней поверхности поддерживают активность этих ферментов, свидетельствует, что их активные центры локализованы на внутренней стороне мембраны.

Асимметричное распределение липидов играет существенную роль в регуляции текучести бислоя и, в частности.обусловливает дискретный характер его фазового состояния [224].Исследования с применением различных спин-меченных фосфолипидов [224] показали наличие в интактной эритроцитарной мембране более ригидного внешнего и более текучего внутреннего монослоев.Было также показано, что гетерогенность текучести мембраны находится под влиянием ли-пид-белковых взаимодействий в мембране [139 ,248].Текучесть липид-ных везикул.сформированных из липидов эритроцитов человека, выше, чем у интактных эритроцитов или их теней,т,е.мембранные белки модулируют текучесть мембраны [248].В биологических мембранах ли-пиды и белки ассоциированы.главным образом,слабыми нековалентны-ми взаимодействиями.В результате возникают области пограничных (прибелковых) липидов.отличающиеся от основного бислоя как по составу компонентов,так и по их подвижности [1481.Предполагается, что пронизывающие мембрану белки окружены липидными кластерами, •структура которых зависит от архитектуры белка [149] .В этих слоях фосфатидные ацильные цепи.расположенные вокруг белков.образуют слой так называемых иммобилизованных липидов.которые тесно связаны с поверхностью белка.

Локальное изменение липидного состава одного из монослоев мембраны эритроцитов приводит,как правило,к изменению положения белков у поверхности раздела и к изменению их физических свойств [ 44 1.В этих случаях в мембране могут формироваться специфические связи в системе спектрин-актин-липид, которые приводят к изменению ее вязкоэластических свойств [441.

Экспериментальные данные,полученные с применением спин-метки (12-нитроксилстеарат) показали,что различия в текучести мембран между интактными эритроцитами и тенями могут быть обусловлены гемоглобином [2481, который взаимодействует с мембраной пос -редством электростатических сил. Согласно современным данным [ 204] гемоглобин с мембраной эритроцита имеет два типа участков связывания, один с высоким сродством,а другой - с низким.Участками мембраны с высоким сродством к гемоглобину являются,преимущественно, отрицательно заряженные головки фосфатидил с ери на, который локализован на внутренней поверхности бислоя.Эти участки связывания .возможно .частично экранируются спектрином 12041. По данным [94] молекулы гемоглобина,взаимодействующие с поверхностью мембраны, могут модифицировать динамическую структуру мембраны.

В настоящее время установлено, что различные липиды распределены в плоскости мембраны не случайно,а формируют отдельные, различающиеся по составу зоны. Такая планарная гетерогенность фосфолипидов в эритроцитарной мембране доказывается множеством структурных переходов, происходящих в липидной фазе мембраны при изменении температуры или под воздействием анестетиков [27]. С применением метода анализа поляризации флуоресценции установлено,что фосфолипиды мембран эритроцитов способны осуществлять быструю латеральную диффузию [96Д401.Коэффициент латеральной диффузии флуоресцентного зонда в составе липидного бислоя теней эритроцитов при 25°С, определяемый методом фотообесцвечивания равен 7,5'10~^см^/с, а соответствующая величина,полученная из ана

- 19 лиза. флуоресценции эксимеров пирена -7*10~®см^/с [1401. Способность молекул к латеральной подвижности в плоскости бислоя проявляется в формировании липидных микродоменов.различающихся по своей структуре,состояние которых зависит от присутствия или отсутствия дивалентных ионов,особенно Са^+ [172,207].Установлено.что примерно одна треть фосфатидилсерина кластеризована вокруг мембранных б ел ков, a, остальная его часть ассоциирована в небольшие кластеры на внутренней поверхности липидного бислоя.Такие же кластеры обнаружены и в случае фосфатидилэтаноламина [1721. Поскольку §ЭА и ФС являются кислыми фосфолипидами, они способны связывать биокатионы (К^.А/а4", СаФосфатидилсерин имеет сильное сродство к связыванию Са^+ [172], и может поддерживать нативную конформацию спектрина, посредством ионных мостиков, образованных Се?+ [1721.

Важную роль в мембране эритроцитов играет холестерин,который образует как обедненные холестерином пограничные слои фосфолипи-дов.примыкающие к белкам, так и зоны, обогащенные холестерином в удаленных от белков участках мембраны [78Д31].Каковы причины неравномерного распределения холестерина в мембране,еще не совсем ясно, однако считают, что распределение холестерина коррелирует с числом протоно-донорных и протоно-акцепгорных групп в молекуле фосфолипида [781. Подобный характер распределения хо -лестерина в мембране рассматривается как физиологически важный, так как при этом "выравнивается" вязкость различных участков мембраны, т.е.формируются стабильные жидко-кристаллические зоны [ 78 1. При низких концентрациях холестерин взаимодействует прежде всего с диненасыщенными липидами, а при высоких - способен включаться в участки с насыщенными липидами, способствуя их разжижению.

При анализе обмена липидов между везикулами из фосфатидилсерина и меченного холестерина и эритроцитами.установлено, что в эритроцитах крысы холестерин содержится в двух пулах,причем полупериод достижения равновесия между ними равен 2,3 часа [981. Возможно,что эти два пула характеризуют фракции слабо и сильно связанного с мембраной холестерина.При истощении эритроцитов человека по холестерину проницаемость мембран для К4" и Н а+ практически не изменяется,пока не удаляется более 30$ холестерина,при более глубоком истощении барьерные свойства резко нарушаются [80], III].

Повышение концентрации холестерина,входящего в состав на -тивных и искусственных мембран [78], ограничивает подвижность ацильных радикалов жирных кислот, способствует упорядочению структуры мембраны и снижает ее проницаемость для ионов и макромолекул [78]. Структурная неоднородность мембраны эритроцитов в определенной степени связана с высоким содержанием в ней холестерина, что проявляется в формировании холестерин-лецитиновых доменов, отличающихся по своим свойствам от чистой липидной фазы [97]. Введение холестерина в липидный бислой мембраны эритроцита за -метно изменяет площадь клеточной поверхности [128]. Считают, что это связано со специфическим конденсирующим эффектом холестерина на фосфолипиды и его способностью снижать мобильность ацильных цепей вблизи глицеринового остова, a. также со способностью ограничивать термотропные фазовые переходы [148].

Таким образом, мембрана эритроцитов имеет весьма сложную структурную организацию, которая играет существенную роль в обеспечении функции эритроцитов. Наличие в эритроцитарной мембране жесткой белковой решетки, образованной периферическими белками, способными связываться с интегральными белками, асимметричное расположение и определенный состав липидов в бислос, относитель

- 21 но высокое содержание холестерина, обусловливают сложный механизм ответа клеток на экстремальные воздействия и, в частности, появление феномена гипертонического холодового шока эритроцитов.

- 22

Заключение диссертации по теме «Криобиология», Бабийчук, Любовь Александровна

ВЫВОДЫ

1. Температура инкубации оказывает существенное влияние на характер и направленность изменений формы эритроцитов в гипертонических растворах НоСЛ (0,15-1,2 М).При концентрации //аС1 выше 0,6 М формируются чувствительные к охлаждению уплощенные клетки с гладкой поверхностью,число которых возрастает при +37°С. При 0°С резко возрастает относительная пропорция эхиноцитов и клеток со складчатой поверхностью устойчивых к охлаждению.

2. Величина гемолиза эритроцитов при охлаждении (+37—=- 0°С) в гипертонических условиях (0,6-1,2 М tiatt} и переносе их в изо-осмотические среды коррелирует с исходным уровнем дефектности мембраны .оцениваемой по уровню освобождения из клеток ионов К4". Освобождение ионов К* из эритроцитов в гипертонических условиях зависит от температуры инкубации и в интервале 0 * +37°С возрастает при ее повышении.

3. Предварительная гипертоническая инкубация (0,6-1,2 М Л'яСО эритроцитов при 0°С приводит к повышению их устойчивости к последующему охлаждению от +37 до 0°С,где в обычных условиях наблюдается гипертонический холодовой гемолиз эритроцитов.Устойчивость клеток коррелирует с низким уровнем в популяции плоских гладких клеток и снижается в процессе продолжительной инкубации (60-90 мин) при +37°С.

Анализ изменений структуры мембран с помощью флуоресцентных зондов свидетельствует.что изменение температуры и осмоляр -ности среды оказывает преимущественное влияние на характер взаимодействия белков и липидов в мембране,проявляющееся в изменении пространственной структуры белок-липидных комплексов.

5. Повышение тоничности среды выше 1,8 М НаСЬ приводит к повреждению мембраны при постоянной температуре.Однако,в этих условиях наблюдается обращение эффекта, температуры и более сильный

- 172 -гемолиз развивается при 0°С.

6. Изменение состава среды оказывает более существенное влияние на эритроциты,находящиеся в гипертонических условиях при 0°С,чем при +37°С.Зависимость величины гемолиза при охлаждении (+37—»Ю°С) в средах содержащих неэлектролит (0,86 М сахароза), от концентрации и состава электролитов становится более выраженной после преинкубации при 0°С.В средах,содержащих электролиты, температура оказывает сильное влияние на зависимость величины гемолиза от рН среды.

7. Устойчивость эритроцитов к замораживанию до -196°С в присутствии ПЭО-1500 и переносу в изоосмотические среды возрастает,если температуру обработки клеток криопротекторами перед замораживанием снизить до +4-тО°С и криопротекторы вводить дози-рованно в течение 40-60 мин. Указанная процедура позволяет сох -ранить в деконсервированных клетках высокий уровень АТ§ и 2,3-ДФГ.

- 173

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных результатов дает возможность предложить несколько механизмов .лежащих в основе различий холодовой чувствительности эритроцитов.подвергнутых гипертонической инкубации при О и 37°С.Наиболее приемлемый из них предполагает наличие единой основы наблюдаемых явлений,заключающейся в начальном формирова -нии дефектов в структуре мембраны .Температура, контролирует ука. -занный процесс,ограничивая его вблизи 0°С.Помимо этого,температура оказывает влияние на характер реорганизации белкового скелета клеток и на. обратимость этого процесса. Изложенное выше можно принять в качестве гипотезы,позволяющей объяснить особенности поведения эритроцитов при изменении осмотических и температурных условий среды как в интервале температур 0 * +37°С,та,к и при замораживании и отогреве.

С учетом важной роли начального состояния клеток можно говорить о едином механизме,лежащем в основе таких явлений,как гипертонический холодовой шок эритроцитов и постгипертонический гемолиз.В обоих случаях необходимым условием развития повреждения является появление дефектов структуры на предварительном этапе инкубации в гиперосмотических условиях.

Значение последующих этапов,связанных со сдвигом температуры и осмотических параметров среды,заключается в активации про -цессов.вызывающих увеличение размера и стабилизацию дефектов структуры .Таким образом,соответственно характеру изменений условий среды как для криогемолиза.так и для постгипертонического гемолиза существуют общие закономерности,позволяющие объяснить поведение эритроцитов при изменении температуры или тоничности среды.

В интервале температур 0 * +37°С можно выделить две температурные зоны 0 + +15°С и +15 * +37°С,в каждой из которых реакция

- 166 эритроцитов на повышение тоничности среды различна.В температурной зоне 0 * +15°С инкубация клеток в условиях гипертонии проявляется в иной,чем при +37°С направленности изменений макроскопических параметров клетки (формы и объема), что отражает темпера-турозависимые изменения состояния белков цитоскелета,которые являются медленно обратимыми .В то же время область температур +I5-* * +37°С является "критической",для которой характерно резкое возрастание вероятности нуклеации дефектов.В экспериментах наблюдается корреляция между макроскопическими изменениями и уровнем развития дефектов структуры (оцениваемой по возрастанию пассивной утечки ионов К4") на этапе инкубации и гемолизом клеток на этапе охлаждения.

В основе процесса инициации (нуклеации) дефектов,по-видимому,лежат осмотические факторы,так как имеется критическая область тоничности среды (0,6-0,8 М /1/аС&),выше которой наблюдается нарушение структуры.Снижение температуры потенцирует действие осмотических факторов .Действительно,в присутствии 1,2 М /vfoCfc- постгипертонический лизис не наблюдается при осмотическом сдвиге +37—+ +37 ,а также при одновременном осмотическом и температурном сдвиге 0—»+37°С.0днако,он резко возрастает при сдвиге +37 0°С.При осмотическом сдвиге 0-~0°С постгипертонический лизис выражен относительно слабо.

На основе предложенной гипотезы отсутствие гемолиза в первом случае можно объяснить резким снижением стабильности (времени жизни) мембранных дефектов при +37°С на фоне более высокого,чем при 0°С,уровня формирования дефектов.Это может быть обусловлено высокой текучестью бислоя при этой температуре и "сплавлением" дефектов структуры.Во втором случае низкая стабильность дефектов при +37°С сочетается с низким уровнем формирования дефектов на начальном этапе инкубации при 0°С,что при медленной обратимости измене

- 167 ний,развивающихся при 0°С,резко снижает вероятность постгипертонического лизиса при +37°С.Б третьем случае развитие гемолиза обусловлено увеличением размера дефектов на этапе охлаждения и их стабилизацией на этапе низкотемпературной инкубации.В четвертом случае.несмотря на возрастание под влиянием низкой температуры стабильности дефектов,лизис ограничен резким снижением уровня инициации дефектов.

Процесс нуклеации дефектов.по-видимому,носит неспецифический характер,и может быть обусловлен действием физико-химических,химических, биохимических и фармакологических факторов.В изотонических условиях криогемолиз эритроцитов наблюдается в присутствии бактериальных токсинов [215], продуктов окисления [1751 ,лизофос-фатидов [241], ко рот ко цепочных фосфолипидов [2231 .'Это означает, что важным прогностическим фактором при охлаждении клеточных суспензий является взаимосвязь между концентрацией модифицирующего агента и температурой,при которой агент воздействует на структуру перед охлаждением клеток,т.е.от сочетания условий,способных повлиять на. исходную дефектность структуры .Бол ее низкая температура., с одной стороны .накладывает ограничения на процесс формирования дефектов,а,с другой - потенцирует стабилизацию дефектов при их "критическом" росте.Это предполагает наличие оптимальной и "критической" концентрации агентов,выше которой во всех случаях будет наблюдаться формирование дефектов и повреждение.

Остается неясным вопрос о природе факторов.контролирующих процессы.лежащие в основе нуклеации дефектов,а также процессы, вызывающие увеличение их размера и стабилизацию.Взаимосвязь между изменениями макроскопических параметров клетки (объема и формы) и дефектностью структуры указывает.что данные процессы контролиру -ются белками.Модулирующее влияние периферических белков цитоске-лета. на состояние интегральных белков [171] свидетельствует,что

- 168 начальная фаза изменений зависит от характера и направленности реорганизации периферической белковой решетки,способной изменять свой объем по механизму электростатической экранировки зарядов. Этот процесс ассоциирован с первичным этапом изменений (начальная гипертоническая инкубация), и, по-видимому.определяется температу-розависимым изменением соотношения между различными олигомерными формами спектрина.

Характер изменений на втором этапе (сдвиг температуры или переход от гиперосмотических к изоосмотическим условиям),по-види-мому,контролируется такими процессами,как фазовое разделение липидов,а также зависит от уровня механического стресса на мембране при восстановлении объема и выхода клеток из фазы кренирова. -ния.Высокое содержание холестерина в мембране эритроцита (33 моль %) предотвращает фазовые переходы основной массы липидов и они развиваются в микроокружении интегральных белков,где холестерин отсутствует [4].Это может означать,что повреждение локализуется в участках мембраны,включающих интегральные белки,а терминальная фаза, повреждения ассоциирована с коллоидно-осмотическим набуха -нием и лизисом клеток.

С учетом того,что прикрепление компонентов цитоскелета к мембране является точечным,а основной компонент цитоскелета-спек-трин связывается с мембраной через белок полосы 2.1 .взаимодействующий с интегральным белком полосы 3 tI2ll,можно предположить, что именно эти компоненты мембраны играют основную роль в меха -низме формирования дефектов структуры.

В свою очередь, увеличение размера и стабилизация дефектов могут быть связаны с неодинаковыми характеристиками объемной релаксации белковой решетки и липидного бислоя и разделением липидных фаз при низкой температуре.

Обработка, эритроцитов ПЭО-1500 при температурах ниже +15°С приводит к снижению гемолиза после отогрева и резкому возрастанию осмотической устойчивости клеток при переносе в изотонические среды.Это свидетельствует,что уровень повреждений эритроцитов в цикле изменения осмотических и температурных условий среды,сопровождающих замораживание-отогрев и перенос в изотонические среды, определяется темиже закономерностями,которые выявляются при крио-гемолизе и постгипертоническом гемолизе эритроцитов,и,в первую очередь,начальным уровнем дефектности структуры перед сдвигом температуры и осмотических условий среды.При быстрых скоростях замораживания и отогрева вклад последнего фактора может быть менее выражен.

При замораживании эффект проникающих криопротекторов может быть обусловлен простым коллигативным действием,связанным со снижением эффективной концентрации солей при каждой из температур, т.е.со сдвигом 11 критического" значения осмолярности в область температур,где повышение вязкости мембраны и снижение подвижности ее компонентов накладывает диффузионные ограничения на процессы, связанные с формированием дефектов.

Известно,что в большинстве случаев непроникающие криопротек-торы эффективны только после замораживания от температурной области О v +4°С [19], причем после продолжительной инкубации.Это указывает на возможное вовлечение в этот процесс обнаруженного нами явления гипертонической низкотемпературной стабилизации клеток.Высокая вязкость растворов непроникающих криопротекторов может являться фактором,обусловливающим необходимость длительной инкубации при 0 * +4°С,что связано с влиянием на подвижность поверхностных компонентов при структурной "адаптации" мембраны. В то же время на этапах замораживания и отогрева этот фактор может играть положительную роль,накладывая ограничения на развитие процессов .связанных с увеличением размера и стабилизацией дефектов структуры.

Таким образом.проведенные исследования показывают существование общих закономерностей в наблюдаемых изменениях температурной и осмотической устойчивости эритроцитов.Хотя остается неясным какие молекулярные процессы обусловливают появление .рост и стабилизацию дефектов,можно предположить,что возрастание пассивной проницаемости для ионов К* отражает лишь промежуточные этапы эволюции дефектов,а повреждение во всех случаях обусловлено достижением ими "критического" размера.Изменения конформации и характера ассоциации белков решетки могут ограничивать аккомодацию белкового скелета к модифицированному температурой'липидному бислою, что может стать причиной увеличения размера и стабилизации дефектов, коллоидно-осмотического набухания и лизиса клеток.

- 171

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бабийчук, Любовь Александровна, 1985 год

1. Бейли Н. Статистические методы в биологии.-М. ,Мир,1963.-171 с.

2. Белоус A.M.,Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.-Киев,Наукова. думка,1982.-255 с.

3. Белоус A.M. ,Бондаренко В.А.1 Механизмы криоповреждений: Молекул ярно-клеточная концепция.-В сб.:Вторая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии.Тезисы докладов,т.I, Харьков,1984, с.9.

4. Белоус A.M. ,Бондаренко В.А.,Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы криоповреждения биомембран.-В кн.^Физико-химические механизмы криоповреждений биологических структур.М.(Итоги науки и техники / ВИНИТИ.Биофизика,1978,т.9) с.80-114.

5. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны.-М.Наука,1975.-183 с.

6. Бондаренко Т.П. Роль липидов в повреждении мембран митохондрий и эритроцитов при охлаждении:Автореф.дисс. канд.биол. наук.-Харьков,1981. -23 с.

7. Бондаренко Т.П.,Бондаренко В.А.,Белоус A.M. Температурные изменения структуры эритроцитов: значение фазовых переходов липидов и формы клеток.-Материалы П Всесоюз.симпозиума "Липиды биологических мембран", Ташкент,1980, с.24-25.- 174

8. Владимиров Ю.А.,Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды з исследовании биологических мембран.-М.,Наука,1980. -320 с.

9. Добрецов Г.Е. Исследование пространственной структуры мембран и липопротеидов флуоресцентными зондами.-Укр.биохим.журн., 1984, т.5б,№ 2, с. 211-222.

10. Добрецов Г.Е.Дубур Г.Я.Дубуре Р.Р.,Спирин М.М.Деме А.К. Флуоресцентные зонды производные пиридина для исследования конструкции биологических мембран.-Журн.прикладной спектро -скопииД983,т.39Д° б,с.377.

11. Добрецов Г.Е.Чекрыгин О.В. Анализ синглет-синглетного переноса энергии в мембранах. П.Перенос с точечного белка на флуоресцентный зонд .расположенный на. двух поверхностях липид-ного бислоя.-Биофизика,1981,т.26, №2, с.376.

12. Куницын В.Г.,Остравская Т.А.Феденков В.И. Некоторые меха -низмы структурных изменений эритроцитарных мембран при действии сдвига рН.-Цитология,1979,т.21,№ 2, с.207-210.

13. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии.-ЛНаука, 1972. 262 с.

14. Маркин B.C. Организация мембран в плоскости слоя и форма клеток.Статистический подход.-Биофизика.Д980,т.25,№ 5,с.941-952.

15. Мвшкова Н.П.,Алексахина. Н.В. Определение фосфоклицериновой кислоты.-Успехи биол.химии,1954,вып.2,с.285-288.

16. Пушкарь Н.С.,Белоус A.M. Введение в криобиологию.-Киев,Нау-кова. думка, 1975. -343 с.

17. Пушкарь Н.С.,Шраго М.И.,Белоус A.M.,Калугин Ю.В. Криопротек-торы.Киев, Наукова думка,1978. -204 с.

18. Рождественская М.А. Определение гемоглобина в плазме консервированной крови.-В кн.:Актуальные вопросы переливания крови. Л.,1955, вып.5, с.55-57.- 175

19. Свиридов Б.Е.,Левин С.В. .Янушка А.Л.,Сабаляускас И.О.,Комиссар Й.Ю.,Мошеева Ф.И. Слабосвязанные белки и ультраструкгура, мембран теней эритроцитов.-Цитология,1976,т.18,№ 2,с.178-182.

20. Семенченко А.Ю.Бондаренко В.А.,Белоус A.M. Влияние дифиль-ных соединений на диффузию белков в растворе.-В сб.'.Криобиология и криомедицина.-Киев ,На,укова думка,1984,вып.14,с.37-39.

21. Смит 0. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. -М. ,Изд-в о Иностр.лит-ра,1963. -503 с.

22. Финеан Дж.,Коллин Р.,Мичеля Р. Мембраны и их функции в клетке.М.,Мир, 1977. -200 с.

23. Хочачка П.,Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации.М., Мир, 1977. 379 с.

24. Чекрыгин О.В.Добрецов Г.Е. Анализ синглет-синглетного переноса энергии в мембранах.1У.Измерение площади,занимаемой белками на поверхности мембраны.-Биофизика,1981 ,т.26,№ 2, с.Ъ16.

25. Черницкий Е.А. .Воробей А.Б. Структура и функции эритроцитар-ных мембран.-Минск, Наука и техника, 1981. -213 с.

26. Черницкий Е .А. .Слобожанина Е. И., Козлова Н.М.Додан В.Б. рН Агрегация спектрина в эритроцитарных мембранах.-Изв.АН БССР, Сер.биол.и.1977, вып.6, с.32-36.

27. Шраго М.И. О криозащитном действии полимеров окиси этилена на эритроциты человека при глубоком охлаждении (к проблеме консервирования крови): Автореф.дисс. . докт.биол.наук, -Л.,1971. 33 с.

28. Aldwinckle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A.D., et al. Effectsof poly(ethyleneglycol) on liposomes and erythrocytes. Permeability changes and membrane fusion. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 689, N3, p.548-561.

29. Aloni В., Eitan A., Livne A. The erythrocyte membrane site for the effect of temperature on osmotic fragility. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.465, N1, p.46-54.

30. Araki Т., Rollofsen В., Den Kamp J.a.P.Op, Van Deenen L.L.M. Temperature-dependent veaiculation of human erythrocytes caused by hypertonic salt: a phenomenon involving lipid segregation. Cryobiology, 1932, v. 19, 114, p.353-361.

31. Arnold K., Pratsch L., Gawrisch K. Effect of poly(ethylene-glycol) on phospholipid hydration and polarity of the external phase. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v.728, N1, p.121-129.

32. Atkinson M.A.L., Morrow J.S., Marchesi Y.T. The polymeric state of actin in the human erythrocyte cytoskeleton. J. Cell. Biol., 1982, v.18, N4, p.493-506.

33. Baker R.V., Hope D.V. The effect of gradual changes in temperature on the release of hormones from nerve endings isolated from bovine neural lobes. J. ileurochem., 1976, v.27, 1T1,p.197-202.

34. Barenholz Y., Thompson Т.Е. Sphyngomyelius in bilayers and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.604, N2, p.129-159.

35. Beck J.S. Echinocyte formation: a test case for mechanisms of cell shape changes. J. Theor. Biol., 1976, v.71, N4, p. 515-525.

36. Bennett V., Branton D. Selective association of spectrinwith the cytoplasmic surface of human erythrocyte plasma mem32branes. Quantitative determination with purified P spectrin. - J. Biol. Chem., 1977, v.252, N8, p.2753-2763.

37. Bernhardt I., Glaser R. Investigations on the control of ion transport in human erythrocytes. II. Influence of transmembrane, exterior surface potential and intracellular pH on the 22Na efflux. Acta Biol. Med. Ger., 1982, v.41, N6, p.541-549.- 177

38. Beaaia M. La forme et la deformabilite dea erythrocytes nor-maux et dana certaina anemiea hemolytiquea congenitalea. -Nouv. rev. franc, hematol., 1977, v.18, N1, p.75-94.

39. Beutler E. Red cell metaboliam. A manual of biochemical me-thoda. Hew York, Grune and Stratton, 1975. - 100p.

40. Bitol M., Leterrier P. Spin-label atudy of erythrocyte membrane submitted to a bending atreaa. Biorheology, 1982,v. 19, 114, p.495-507.

41. Bjerrum P.J. Hemoglobin-depleted human erythrocyte gho3ta: characterization of morphology and tranaport functiona. J. Membrane Biol., 1979, v.48, N1, p.43-67.

42. Blank M., Britten J.S. Membrane proteina and membrane rheo-logy. Biorheology, 1975, v.12, N5, p.271-274.

43. Blank M., Soo L., Abbott R.E. The ionic permeability of ad-aorbed membrane protein monolayers. J. Electrochem. Soc., 1979, v.126, N9, p.1471-1474.

44. Blaurock A.E., Gamble R.C. Small phosphatidylcholine viaic-lea appear to be faceted below the thermal phaae transition.-J. Membrane Biol., 1979, v.50, N2, p.187.

45. Bola И.О., Gip J.M.K., Wolff B.R. Trout red blood cells trea- 178 ted with proteases fuse when placed on glass slides. Bioscience Rep., 1984, v.4, N1, p.65-71.

46. Eoni L.T., Stewart T.P., Alderfer J.L., Hui S.W. Lipid-poly-ethylene glycol interactions: I. Induction of fusion between liposomes. J. Membrane Biol., 1981, v.62, N1-2, p.65-71.

47. Brahm J. Temperature-dependent changes of chloride transport kinetics in human red cells. J. Gen. Physiol., 1977, v.70, N3, p.283-306.

48. Brahm J. Water transport through the red cell membrane. -Period. Biol., 1983, v.85, N2, p.109-116.

49. Branton D. Membrane cytoskeletal interactions in the human erythrocytes. In: Cold Spring. Harbor. Symp., 1981, v. 46, part 1, p.1-6.

50. Brumen M., Glaser R., Svetina S. Osmotic states of the red blood cell. Bioelectrochem. Bioenerg., 1979, v.6, N2,p.227-243.

51. Calvert R., Bennett P., Gratzer W. Properties and structural role of the subunits of human spectrin. Eur. J. Biochem., 1980, v.107, N2, p.355-361.

52. Cauham P.B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell.-J. Theor. Biol., 1970, v. 26, N1, p.61-81.

53. Cass A., Dalmark M. Equilibrium dialysis of ions in nystatin-treated red cells. Nat. New Biol., 1973, v.244, N1, p.47-49.- 179

54. Cassoly R., Daveloose D., Wolf C., Leterrier P. Etude de la spectrine par marquage do spin. C.r. Acad, sci., 1978, v.D286, N12, p.1009-1012.

55. Caasoly R., Davelooae D., Leterrier P. Spin labeling of human apectrin. Effects of temperature, divalent cations and re-aaaociation with erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.601, Ю, p.478-489.

56. Cohen C.M., Foley S.P. Spectrin-dependent and independent as-aociation of P-actin with the erythrocyte membrane. J. Cell Biol., 1980, v.86, N2, p.694-698.

57. Cohen C.M., Tyler J.M., Branton D. Spectrin-actin association studied by electron microscopy of shadowed preparations. -Cell, 1980, v.21, N3, p.875-883.

58. Coleman R., Holdsworth G. Effects of detergents on erythrocyte membranes: different patterns of solubilization of the membrane proteins by dihydroxy and trihydroxy bile salts. -Biochem. Soc. Trans., 1975, v.4, N5, p.747-748.

59. Coulon T., Outlired R. The temperature dependence of erythrocyte water diffusion permeability. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 11, 113, p.408-419.

60. Cotterrell D., Whittman R. The influence of the chloride gradient across red cell membranes on sodium and potassium movements. J. Physiol., 1971, v.214, N3, p.509-536.

61. Crandall E.D., Gritz A.M., Osher A.S., et al. Influence ofpH on elastic deformability of the human erythrocyte membrane. Amer. J. Physiol., 1978, v.235, 115, p.269-273.

62. Cullis R.R., Decruijff В., Hope M.J., et al. Structural properties of lipids and their functional roles in biological membranes. In:Membrane fluidity in biology, 1983, v.1, edited by Aloia R.C. Academic Press (Hew York), p. 39-83.- 180

63. Cuppoletti J., Mayheio E., Zobel C.R., Yung C.Y. Erythroso-mes-large proteoliposomes derived from crosa-linked human erythrocyte cyto3keletons and exogenous lipid. Proc. Hat. Acad. Sci.US-Biol. Sci., 1981, v.78, N5, p.2786-2790.

64. Dalmark M. Chloride and water distribution in human red cells. J. Physiol., 1975, v.250, N1, p.65-84.

65. Dalmark M., Wieth J.O. Temperature dependence of chloride, bromide, iodide, thiocyanate and salicylate transport in human red cells. J. Physiol., 1972, v.224, N3, p.583-610.

66. Darin-Bennett A., White I.G. Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on succeptibility of cold shock. Oryobioloccy, 1977, v. 14, ^4, p.466-470.

67. David E. Golan, Ы. Robert Alecio, Veatoh W.R., Rando R.R. Lateral mobility of phospholipid and cholesterol in the human erythrocyte membrane: effects of protein-lipid interaotions.-Riochemistry, 1984, v.23, 112, p.332-34°.

68. Davidson S.J., Song S.W. A thermally induced alteration in 1узозоте membranes: salt permeability at 0°and 37°C. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.375, 1T2, p.274-285.

69. D'Avila II.M. A spin label study of erythrocyte membranes during simulation of freezing. J. Membrane Biol., 1981, v.60, IT2, p.155-163.

70. Dembo M., Glushko V., Aberlin M.E., Sonenberg M. A method for measuring membrane microviscosity using pyrene excimer formation. Application to human erythrocyte ghosts. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.522, N2, p.201-212.

71. Demel R.A., Kruyff B. de. The function of sterols in membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.457, N2, p.109-132.

72. Deuling H.J., Helfrich V/. Red blood cell shapes as explained on the basis of curvature elasticity. Biophys. J., 1976,- 181 -v.16, Ц8, p.861-868.

73. Deuticke В., Ruaka С. Changes of nonelectrolyte permeability in cholesterol-loaded, erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.433, M, p.638-653.

74. Dijck P.W.M. van, Zoelen E.J.J, van, Seldenrijk R., et al. Calorimetric behaviour of individual phospholipid classes from human and bovine erythrocyte membranes. Chem. Phys, Lipids, 1976, v.17, N2-3, p.336-343.

75. Donlon J.A., Rothstein A. The cation permeability of erythrocytes in lov/ ionic strength media of various tonicities. -J. Membrane Biol., 1969, v.1, N1, p.37-51.

76. Donner M., Andre J.-C., Bonchy M. Kinetics of partly diffusion-controlled reactions. VII. Pyrene excimer formation in erythrocyte membranes. Biochim. Bipphys. Acta, 1980, v.97, N3, p.1183-1192.

77. Drost-Hansen W. Structure and functional aspects of inter-facial (vicinal) water as related to membrane and cellular systems. Colloq. int. CNRS, 1976, H246, p.177-186.

78. Dubbelman T.M.A.R., De Bruijne A.W., Ghristianse K., Van Ste-veninck S. Hypertonic cryochemolysis of human red blood cells. J. Membrane Biol., 1979, N3-4, p.225-241.

79. Elg3aeter A., Shotton D.M., Branton D. Intermembrane par -ticle aggregation in erythrocyte ghosts. II. The influence of spectrin aggregation. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.42, N1, p.101-122.

80. Emmelot P., Van Hoeven R.P. Phospholipid unsaturation and plasma membrane organization. Chem. Phys. Lipids, 1975, v.14, N3, p.236-246.

81. Evans E.A., Kukan B. Free energy potential for aggregation of erythrocytes and phosphotidylcholine /phosphatidylserine- 182 vesicles in dextran (36,500 mW), solutions arrd in plasma. -Biophys. J., 1983, v.44, N2, p.255-261.

82. Flamm M., Schachter D. Acanthocytosis and cholesterol er-richment decrease lipid fluidity of only the outer human erythrocyte membrane leaflet. Nature, 1982, v.298, IT5871, p.292-294.

83. Forsdyke D.R., Ford P.M. Rouleauz formation аз a measure of the plaama separating ability of plasma. J. Theor. Biol., 1983, v.103, N3, p.467-473.

84. Forsyth P.A., Mareelja Б., Mitchell D.J., Iliuhane B.W. Pha-ae transitions in charged lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.469, N3, p.335-344.

85. Fowler Y.M., Luna E.J., Harguaves W.K., et al. Spectrin promotes the association of F-action with the cytoplasmic surface of the human erythrocyte membrane. J. Cell. Biol., 1981, v.88, N2, p.388-395.

86. Funder J., Wieth J.O. Chloride erythrocytes in human erythrocytes and ghosts: a quantitative comparison. J. Physiol., 1976, v.262, N4, p.679-696.

87. Fung Y.C.B., Tong P. Theory of the sphering of red blood cells. Biophys. J., 1968, v.8, 112, p. 175-193.

88. Gaines K.C. Connections between cytoplasmic proteins and the erythrocyte membrane. Trends Biochem. Sci., 1981, v.6, 1T1, p.13-16.

89. Galla-H.-J., Luisetti J. Lateral and transversal diffusion and phase transitions in erythrocyte membranes. An excimer fluorescence study. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.596, N1, p.108-118.

90. Gershfeld IJ.L. Equilibrium studies of lecithin-cholesterol interactions. I. Stoichiometry of lecithin-cholesterol com- 183 plexes in bulk systems. Biophys. J., 1978, v.22, N3, p.469-489.

91. Girand P., Claret M. Л study of cholesterol transfers between erythrocytes and lipid vesicles: possible involvement of interparticular collisions. FEBS Lett., 1979, v.103, ,p.186-192.

92. Glaser R. Factors influencing the form of human erythrocytes.-Biophys. Membrane Transp, Sch. Proc. Part 2, Y/roclaw, 1976,p.147-184.

93. Glaser R. The shape of red blood cells as a function of membrane potential and temperature. J. Membrane Biol., 1979, v.51, Ю, p.217-228.

94. Glaser R., Brumen M., Svetina S. Stationare loneuzustaude menschliecher Brythrozyten. Biol. Zentralblatt., 1980, B.99, H4, S.429-442.

95. Glaser R., Leitmannova A. Transformation of human red cell shape with regard to fluid-mosaic structure of the membrane.-Stud. Biophys., 1975, v.48, I'D, p.219-229.

96. Goekoop J.G., Spies P., Bierman-van Steeg C., Vriclink R., et al. pH-dependent behaviour of erythrocyte membrane elevations. Cell. Biol. Int. Repth., 1978, v.2, IT2, p.139-145.

97. Goodman S.R., Branton D. Spectrin bending and the control of membrane protein mobility. J. Supramol. Struct., 1978, v.8, Ы4, p.455-465.

98. Goodman S.R., Yu J., Whitfield C.P., et al. Erythrocyte membrane skeletal protein bands 4.1 a and b are sequence-related phosphoproteins. J. Biol. Chem., 1982, v.257, N8,p.4564-4582.

99. Gottlieb M.H., Eanes E.D. On phase transitions in erythrocyte membranes and extracted membrane lipids. Biochim. Bio- 184 phys. Acta, 1974, v.373, N3, p.519-522.

100. Gratzer W.B. The red cell membrane and its cytoskeleton. -Biochem. J., 1981, v.198, N1, p.1-8.

101. Green L.A.G., Hui H.L., Green P.A., et al. The role of choline phoapholipida in hypertonic cryohemolyaia. Cryobiolo-gy, 1983, v.20, N1, p.25-30.

102. Green P.A., Jung C.Y. Gold-induced hemolysis in a hypertonic milieu. J. Membrane Biol., 1977, v.33, H3-4, p.249-262.

103. Green P. A., Jung C.Y., Cuppoletti J., 0wen3 IT. Hypertonic cryochemolysia and the cytoakeletal syatem. Biochim. Bio-phys. Acta, 1981, v. 648, N3, p.225-230.

104. Grunze M., Porat В., Deuticke B. Dual effect of membrane cholesterol on aimple and mediated tranaport proceaaea in human erythrocytes. Biochim. Biophya. Acta, 1980, v.600, N3, p.860-869.

105. Guun R.B. A titratable carrier model for both mono- and divalent anion tranaport in human red blood cells. In: Oxygen affinity of hemoglobin and red cell acid baae atatua. Ed. by M. Rorth and P. Aatrup. Muukagaard, Copenhagen, 1972, p.823-827.

106. Gunn R.B. A titratable carrier model for monovalent and divalent inorganic aniona in red blood cells. In: Erythrocytes, thrombocytes, leukocytes. E.Gerlach, K.Williams editors. Georg Thieme Yerlag, Stuttgart, 1973, p.77-79.

107. Gunn R.B., Dalmark M., Tosteson D.G., Wieth J.O. Characteristics of chloride transport in human red blood cells. -J. Gen. Physiol., 1973, v.61, N2, p.185-206.

108. Haest C.W.M. Interactions between membrane sceleton proteins and the intrinsic membrane domains. Biochim. Biophys.- 185

109. Acta, 1982, v.48, H4, p.331-352.

110. Haest C.W.M., De Gier J., Van E.G.A., et al. The effect of lipid phase transitions on the architecture of bacterial membranes. -Biochim. Biophys. Acta, 1974, v.356, N1, p.17-26.

111. Haest C.Y/.M., Heller K., Schwi3ter K., et al. Concomitant changes of membrane leak permeability and phospholipid dynamics in erythrocytes subjected to chemical and physical membrane perturbation. Biomed. Biochim. Acta, 1983, v.42, N11-12, p.127-130.

112. Haest C.W.M., Plasa G., Kamp D., Deuticke B. Spectrin asa stabilizer of the phospholipid assymetry in the human erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v.509, N1, p.21-32.

113. Hainfeld J.P., Steek T.L. The sub-membrane reticulum ofthe human erythrocyte: a scanning electron microscope study.-J. Supramol. Struct., 1977, v.6, N3, p.301-313.

114. Hammerstedt R.H., Amann R.P., Rucinsky Т., et al. Use of spin labels and electron spin resonance spectroscopy to characterise membranes of bovine sperm: effect of butylated hydroxytoluene and cold shock-biol. reproduct., 1976, v.14, N4, p.381-397.

115. Hargreaves W.R., Gield K.W., Verkleij A., Branton D. Reas-sociation of ankyrin with band 3 in erythrocyte membranes and in lipid vesicles. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N24, p.11965-11973.

116. Herrmenn A., Arnold K., Pratsch L., Lassmann G. Influence of polyethylene glycol on the structure of the erythrocyte membrane: an ESR study. Biomed. Biochim. Acta, 1983, v.42, N9, p.1151-1157.

117. Herrmann A., Pratsch L., Arnold K,, Lassmann G. Effect of poly(ethylene glycol) on the polarity of aqueous solutions and on the structure of vesicle membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v.733, N1, p.87-95.

118. Hertz R., Barenholz Y. Permeability and integrity properties of lecithin-sphingomyelin liposomes. Chem. Phys. Lipids, 1975, v. 15, IT2, p.138-156.

119. Holzwarth G., Yu J., Steck T.L. Heterogenety in the conformation of different protein fractions from the human erythrocyte membrane. J. Supramol.Struct., 1976, v.4, N2, p.161-168.

120. Hong J.S., Poisner A.M. Effect of low temperature on the release of vasopressin from isolated bovine neurohyphyris. -Endocrinology, 1974, v.94, N1, p.234-240.

121. Hope M.J., Cullis P.R. The bilayer stability of inner monolayer lipids from the human erythrocyte. FEBS Lett., 1979, v.107, N2, p.323-326.

122. Hui S.W., Stewart С.Ы., Carpenter M.P., Stewart T.P. Effects of cholesterol on lipid organization in human erythrocyte membrane. J. Cell. Biol., 1980, v.85, N2, p.283-291.

123. Inoue K. Permeability properties of liposomes, prepared from dipalmitoyl lecithin, dimyristoyllecithin, egg lecithin, rat liver lecithin and beef sphingomyelin. Biochim. Biophys. Acta, 1974, v.339, N3, p.390-402.

124. Jacobs M.H., Parpart A.K. Osmotic properties of the erythrocyte. II. The influence of pH, temperature and oxygen tension on hemolysis in hypotonic solutions. Biol. Bull, 1931, v.60, N1, p.95-119.

125. Jain M.K. Honrandom lateral organization in bilayers and biomembranes. In: Membrane fluidity in biology, 1983, v.1,- 187 edited by Aloia R.C., Academic press (New York), p.1-39.

126. Jan K.M. Role of hydrogen bonding in red cell aggregation.-J.Cell Physiol., 1979, 1П , p.49-55.

127. Jay A.W., Rowlands S. The stages of osmotic hemolysis. -J. Physiol., 1975, v.252, N3, p.817-832.

128. Ji Т.Н., Kiehm D.J., Middaugh G.R. Presence of spectrin tetramer on the erythrocyte membrane. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N7, p.2990-2993.

129. Johnson R.M. The kinetics of resealing of washed erythrocyte ghosts. J. Membrane Biol., 1975, v.22, N3-4, p.231-253.

130. Johnson R.M., Robinson J. Morphological changes in assymet-ric erythrocyte membranes induced by electrolytes. Bio-chem. Biophys. Res. Communs., 1976, v.70, 113, p.925-931.

131. Johnson R.M., Taylor G., Meyer D.E. Shape and volume changes in erythrocyte ghosts and spectrin-actin netv/orks. J. Cell. Biol., 1980, v.85, N2, p.371-376.

132. Kahane I., Gitler C. Red cell membrane glycophorin labeling from within the lipid bilayers. Science, 1978, v.201, N4353, p.351-352.

133. Kamada Т., Setowama S., Chuman Y., Otsuji S. Metabolic dependence of the fluidity of intact erythrocyte membrane. -Biochem, Biophys. Res. Commun., 1983, v.116, N2, p.541-547.

134. Kapitsa H.-G., Saekmann E. Local measurement of lateral motion in erythrocyte membranes by photobleaching technique.-Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.595, N1, p.56-65.

135. Kirk R.G., Andrews S.B., Lee P. The correlation of composition and morphology during the high to low potassium transition. J. Membrane Biol., 1983, v.76, N3, p.281-289.

136. Kirpatrick P.H., Sandberg H.E. Effect of anionic surfoe-tants, non-ionic surfoetants and neutral salts on the con- 188 formation of spin-labelled erythrocyte membrane proteins. -Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.298, H2, p.209-218.

137. Kitagawa Т., Tanaka Y., Inoue K., IJojima S. Effect of temperature and bovine serum albumin on lysis of erythrocyte induced by dilaroyl glycerophospholine and dilecanoylglyce-rophosphacholine. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.467, N2, p.137-145.

138. La Celle P.L. Effect of sphering on erythrocyte deformabi-lity. Biorheology, 1972, v.9, IJ1, p.51-59.

139. La Celle P.L., Rothstein A. The passive permeability of the red blood cell to cations. J. Gen. Physiol., 1966, v.50, N1, p.171-188.

140. Lange J., Hadesman K.A., Steck T.Z. Role of the reticulim in the stability and shape of the isolated human erythrocyte membrane. J. Cell. Biol., 1982, v.92, ЫЗ, p.714-722.

141. Lange Y., Gough A., Steck T.L. Role of the bilayer in the shape of the isolated erythrocyte membrane. J. Membrane Biol., 1982, v.69, N2, p.113-124.

142. Lee A.G. Lipid phase transitions and phase diagrams. I.Lipid phase transitions. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.472, N2, p.237-281.

143. Lee A.G. An overlapping site model for the lipid annual of membrane proteins. PEBS Lett., 1983, v.151, N2, p.297-303.

144. Leibo S.P. Freezing damage of bovine erythrocytes: simulation using glycerol concentration changes at subzero temperatures. Cryobiology, 1976, v. 13, If6, p.587-598.

145. Lepke S., Passow H. The permeability of the human red blood cell to sulfate ions. J. Membrane Biol., 1971, v.6, N2,p.158-182.

146. Lerche D., Glaser R. Investigation of artificial aggregati- 189 on of washed human erythrocytes caused by decreased pH reduced ionic strength. Acta biol. med. Ger., 1970, v.39, N8-9, p.913-918.

147. Levi G., Coletti А., Росе U., Raiteri M. Decrease of uptake and exchange of neurotransmitter amino acids after depletion of their synaptosomal pools. Brain Res,, 1976, v.103, N1, p.103-116.

148. Leiber M.R., Steck T.L. A description of the holes in human erythrocyte membrane ghosts. J, Biol. Chem., 1982, v.257, N19, p.11651-11659.

149. Leiber M.R., Steck T.L. Dynamics of the holes in human erythrocyte membrane ghogts. J. Biol. Chem., 1982, v. 257,1. 19, p. 11660-11679.

150. Liljas L., Lundahl P., Hjerten S. The majoir sialoglycopro-tein of the human erythrocyte membrane. Release with a non-ionic detergent and purification. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.426, N3, p.526-534.

151. Lin P.S. Electron microscopic study of hemolysis: a proposal of formation of weak-structural region in the erythrocyte membrane. Cell.Biol. Int. Repth., 1981, v.5, N2, p.159-169.

152. Linden C.D., Wright K.L., McConnel H.M., Pox C.P. Lateral phase separations in membrane lipids and the mechanism of sugar transport in Escherichia coli. Proc. ITatl. Acad. Sci. USA, 1973, v.70, N6, p.2271-2275.

153. Liu S.C., Palek J. Spectrin tetramerdimer equilibrium and the stability of erythrocyte membrane skeletons. Nature, 1980, v. 285, N5766, p.586-588.

154. Liu S.C., Windisch P., Kim S., Palek J. Oligomeric states of spectrin in normal erythrocyte membranes : biochemical and electron microscopic studies. Cell, 1984, v.37, N2, p.587

155. Livne A., Raz A. Erythrocyte fragility and potassium efflux as affected by temperature and homolyzing rate. FEBS Lett., 1971,v.16, N2, p.99-101.

156. Lovelock J.E. Physical instability and thermal shock in red cells. Nature, 1954, v.173, N4406, p.659-661.

157. Lovelock J.E. The denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing. Proc. Roy. Soc.,Ser. B, 1957, v.147, N4, p.427-433.

158. Luer C.A., Wong K.P. The effects of pH and temperature on the circular dichroism of human erythrocyte membranes. -Biophys. Chem., 1978, v.9, N1, p.15-22.

159. Luthra M.G., Friedman I.M., Sears D.A. Effects of the pH and temperature on the interaction of an impermeant probe with surface proteins of the human red blood cell. J. Biol. Chem., 1978, v.253, N16, p.5647-5653.

160. Macleod R.A., Caleott P.H. Cold 3hock and freezing damageto microbes. In: Surv. vegetative microbes. 26th Symp. Soc. Microbiol. Univ. Cambridge, 1976. Cambridge, 1976, p.81-109.

161. Maggio В., Ahkong A.P., Lucy A. Polyethylene glycol surface potential and cell fusion. Biochem. J., 1976, v.158, N3, p.647-650.

162. Mann T. The biochemistry of semen and of the male reproductive tract. Methuen, London, 1964, p.356-363.

163. Marchesi V.T. Review: the red cell membrane skeleton: recent progress. Blood, 1983, v. 61, IT1, p.1-12.

164. Marchesi V.T., Furthmayr H., Tomita M. The red cell membrane. Annu. Rev. Biochem. v.45, Palo Alto, Calif., 1976,p.667-698.

165. Marikovsky Y., Khodadad J.K,, Weinstein R.S. Influence of- 191 red. cell ahape on surface charge topography. Exp. Cell. Res., 1978, v.116, N1, p.191-197.

166. Marinetti G.V., Crain R.C. Topology of amino-phospholipids in the red cell membrane. J. Supramol. Struct., 1978, v.8, N2, p.1-23.

167. Маззоп W.T., Abrahamson E.W. Phase transitions in vertebrate and invertebrate photoreceptor membranes. J. Membrane Biol., 1974, v.15, H4, p.383-392.

168. McGregor R.D., Tobias C.A. Molecular seiving of red cell membranes during gradual osmotic hemolysis. J. Membrane Biol., 1972, v.10, N4, p.345-356.

169. Meduski J.W., Hochstein P. Hot-cold hemolysis: the role of positively charged membrane phospholipids. Experienta, 1972, v.28, N5, p.565-566.

170. Mikkelsen A., Stokke B.T., Elgsaeter A. An electro-optic study of human erythrocyte spectrin dimers. The presence of calcium ions does not alter spectrin flexibility. Biochim. Biophys. Acta, 1984, v.45, N5, p.95-103.

171. Minetti M., Ceecarini M. Protein-dependent lipid lateral phase reparation as a mechanism of human erythrocyte ghost resealing. J. Cell. Biochem., 1982, v. 19, 111, p.59-77.

172. Mombera C., Van Dijck P.W.M., Van Deenen L.L.M., et al. The interaction of spectrin-actin and synthetic phospholipids. -Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.470, ГТ2, p. 152-160.

173. Morariu V.V., Pop V.I., Popeacu 0., Benga G. Effects of temperature and pH on the water exchange through erythrocyte membranea: nuclear magnetic resonance studies. J. Membrane Biol., 1981, v.62, N1-2, p.1-7.

174. Morris G.J. Lipid loas and haemolyaia by thermal shock* lack of correlation. Cryobiology, 1975, v.12, N3, p.192-201.

175. Morris G.J., Farrant J. Effect of cooling rate on thermal shock hemolysis. Gryobiology, 1973, v.10, N2, p.119-125.

176. Morrison M. , Mueller T.J., Edwards И.Н. Protein architecture of the erythrocyte membrane. Progr. Clin. Biol. Res., 1981, v.51, p.16-34.

177. Morrow J.S., Ilaigh W.B., Marchesi V.T. Spectrin oligomers: a structure feature of the erythrocyte cytoskeleton. J. Supramol. Str. Cell Bochem., 1981, v.17, N3, p.275-289.

178. Morrow J.S., Marchesi V.T. Self-assembly of spectrin oligomers in vitro: a basis for a dynamic cytoskeleton. J. Cell Biol., 1981, v.88, N2, p.463-468.

179. Mucara I.G., Cantley L.C. The structure and function of band 3. In: Cell membranes: methods and reviews, v.1, Edited by Elson E., Frazier V/., Glazer L. Plenum Publishing Corp. (New York), 1983. - 197 p.

180. Murphy S. Erythrocyte osmotic fragility and cell water influence of pH and temperature. J. Lab. Clin. Med., 1969, v.71, N4, p.319-331.

181. Nicolson G.L., Painter R.G. Anionic sites of human erythrocyte тетЬгапез; II. Transmembrane effects of aktin-spectrin on the topography of bound positively charged colloidal particles. J. Cell. Biol., 1973, v.59, N4, p.395-406.

182. Nigg E.A., Cherry R.J. Anchorage of a band 3 population at the erythrocyte cytoplasmic membrane surface: protein rotational diffusion measurements. Proc. Wat. Acad. Sci. USA, Biol. Sci., 1980, v.77, N8, p.4702-4706.

183. Uishio Т., Hirota S., Yamashita J., Kobayashi K., et al. Erythrocyte changes in aqueous polyethylene glycol solutions containing sodium chloride. J. Pharm. Sci., 1982, v.71, N9, p.977-980.

184. Oku IT., Nojima S., Inoue K. Selective release of non-electrolytes from liposomes upon perturbation of bilayers by temperature change of polyene antibiotics. Biochim. Bio-phys. Acta, 1980, v.595, N2, p.277-291.

185. Pinto da Silva P. Translational mobility of the membrane intercalated particles of human erythrocyte ghosts, pH dependent, reversible aggregation. J. Cell. Biol., 1972, v.53, 118, p.777-787.

186. Ralston G.B. Physical-chemical studies of spectrin. J. Supramol. Struct., 1978, v.8, из, p.361-373.

187. Ralston G.B. The structure of spectrin and the shape of the red blood cell. Trends. Biochem. Sci., 1978, v.3, N9, p.195-198.

188. Ramjeesingh M., Grinstein S., Rothstein A. Intrinsic segments of band 3 that are associated with anion transport across red blood cell membranes. J. Membrane Biol., 1980,v.51, N2, p.95-103.

189. Roelofsen В., Meer G., Kamp J.A.P. The lipids of red cell membranes: compositional, structural and functional aspects.-Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1981, v.41, N156, p.111-116.

190. Roelofsen В., Schatzman H.J. The lipid requirement of the2+ 2+

191. Ca + Mg ) ATPase in the human erythrocyte membrane, as studied by various highly purified phospholipaaes. - Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.464, N1, p.17-26.

192. Rousselet A., Guthmann C., Matricon J., et al. Study of the transverse diffusion of spin labelled phospholipids in biological membranes. I. Human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.426, N3, p.357-371.

193. Saez R., Alonso A., Villena A., Goui P.M.O. Detergent-like properties of polyethyleneglycols in relation to model mem- 194 branes. FEBS Lett., 1982, v.137, N2, p.323-326.

194. Samsel R.W., Perelson A.S. Kinetics of roulean formation. II. Reversible reactions. -Biophys. J., 1984, v.45, N4, p.805-825.

195. Schachter D., Cogan U., Abbott R.E, Asymmetry of lipid dynamics in human erythrocyte membranes studied with permeant fluorophores. Biochemistry (USA), 1982, v.21, N9, p.2146-2151.

196. Schmid-Schoubein H. Microreology of erythrocytes, blood, viscosity and the flow in the microcirculation. In: International review of physiology. Cardiovascular physiology. II. A.C. Guyton (Ed.), Park Press, 1976, v.9, p.1-62.

197. Seeman P., Sanks Т., Argent W., Kwant W.O. The effect of membrane-strain rate and of temperature on erythrocyte fragility and eritical hemolytic volume. Biochim. Biophys. Acta, 1969, v.183, N3, p.476-489.

198. Shaklai N., Yguerabide J., Ranney H.M. Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore. Biochemistry, 1977, v.16, N25, p.5585-5592.

199. Sheetz M.P. Membrane skeletal dynamics: role in modulation of red cell deformability, mobility of transmembrane proteina and shape. Semin. Hematol., 1983, v,20, N3, p.175-189.

200. Sheelz M.P., Casaly J. Phosphate metabolite regulation of spectrin interactions. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1981, v.41, N156, p.117-122.

201. Shiga T., Maeda N. Influence of membrane fluidity on erythrocyte functions. Biorheology, 1981, v.17, N5, p.485-500.

202. Shiga Т., Suda Т., Maeda N. Spin label studies on the human erythrocyte membrane. Two sites and two phases for fatty acid spin labels. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.466, N2, p.231-244.

203. Shinitzky M., Inbar M. Microviscosity parameters and protein mobility in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.433, N1, p.133-149.

204. Shohet S.B. Possible roles for the membrane cytoskeleton in regulation red cell stability and deformability. -Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1981, v.41, N156, p.123-130.

205. Shohet S.B., Card R.T., Clark M., et al. The erythrocyte cytoskeleton and its apparent role in cellular functions. -Progr. Clin. Biol. Res., 1981, v.51, p.35-58.

206. Shotton D.M., Burke B.E., Branton D.I. The molecular structure of human erythrocyte spectrin. Biophysical and electron microscopic studies. J. Mol. Biol., 1979, v.131, N2,p.303-329.

207. Shramm M., Eiseukradt В., Barlcai E. Cold-induced leakage of amilaae from zymogen granule and sealing of its membrane by specific lipids. Biochim. Biophys. Acta, 1967, v.135, N1, p.44-52.

208. Skalak R., Zarda P.R., Jan K.-M,, Chien S. Mechanics ofroulean formation. Biophys. J., 1981, v.35, N3, p.771-783.

209. Smyth C.J., Mollby R., Wadstrom T. Phenomenon of hot-cold hemolysis: chelator-induced lysis of sphingomycelinase-tre-ated erythrocytes. Infect, and Immun., 1975, v.12, N5,p.1104-1111.

210. Snabre P., Mills P., Quemada D. Experimental and theoretical determination of red blood cell. Adhesiveness induced by dextran. Stud. Biophys., 1982, v.90, p.237-238.

211. Solomon A.K., Chason В., Dix J.A., et al. Biomembranes and cell function. Annals of the New York Academy of Sciences, v.414. Ed. :by Kummerow P.A., Benga G., Holmes R.P. New York Academy of Sciences, 1983, p.97-125.

212. Sudhot T.C. Core structure, internal osmotic pressure and irreversible structural changes of chromaffin granules during osmometer behaviour. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v.684, N1, p.27-40.

213. Takahashi Т., Williams R.J. Thermal shock hemolysis in human red cells. 1. The effects of temperature, time and osmotic stress. Cryobiology, 1983, v.20, N6, p.507-520.

214. Tamura A., Fujii T. Roles of charged groups on the surface of membrane lipid bilayer of human erythrocytes in induction of shape change. J. Biochem., 1981, v.90, N3, p.629-635.

215. Tanaka Y., Mashino K., Inoue K., Nojima S. Mechanism of human erythrocyte hemolysis induced by short-chain phosphati- 197 dylcholines and lysophosphatidylcholine. J. Biochem. Tokyo, 1983, v.94, Ю, p.833-841.

216. Tanaka K.-I., Ohniahi S.I. Heterogeneity in the fluidity of intact erythrocyte membrane and ita homogenization upon hemolysis. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.426, N2, p,213-231.

217. Tanford G. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science, 1978, v.202, N4345, p.1012-1018.

218. Tanner M.J.A. Erythrocyte glycoproteins. Gurr. Topics Membranes and Тгапзр. Vol. 11. New York, 1978, p.279-325.

219. Taupin Gh., Dvolaitzky M., Sauterey G. Osmotic pressure induced pores in phospholipid vesicles. Biochemistry, 1975, v.14, N21, p.4771-4776.

220. Terwilliger T.G., Solomon A.K. Osmotic water permeability of human red cells. J. Cell Physiol., 1981, v.11, N5,p.549-570.

221. Trommler A., Wolf H. Quantitative estimation of adhesion force of human erythrocytes on glass surfaces. Stud. Biophys., 1979, v.73, N3, p.233-235.

222. Tyler J.M., Branton D. Molecular interactions govering red cell membrane structure. Progr. Glin. Biol. Res., 1980, v.56, p.79-94.

223. Tyler J.M., Reinhardt B.N., Branton D. Aasociations of erythrocyte membrane proteins. Binding of purified bands 2.1 and 4.1 to spectrin. J. Biol. Ghem., 1980, v.255, N14,p.7034-7039.

224. Ungewickell E., Gratzer W. Self-association of human spectrin. A thermodynamic and kinetic study. Eur. J. Biochem., 1978, v.88, N2, p.379-385.

225. Van Deenen L.L.M., De Gier J. Lipids of the red cell membrane. In: The red blood cell, Surgenor B, Ed. N.Y., San Prancisko and London, Academic Ргезз, 1974, p.147-211.

226. Verma S.P., Wallach D.P.H. Erythrocyte membranes undergo cooperative, pH-sensitive state transitions in the physiological temperature range: evidence from Raman spectroscopy.-Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1976, v.73, N 10, p.3558-3561.

227. Wallach D.P.H., Verma S.P., Pooksou J. Application of laser Raman and infrared spectroscopy to the analysis of membrane structure. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.559, N2-3,p.153-208.

228. Weinstein R.S. Electron microscopy of surfaces of red cell membranes. In: Red cell membrane: structure and function. G.A. Jamieson, T.J.Greenwalf eds., Philadelphia, 1969, p.36.

229. Weltzien H.U., Kalkoff H.G. Quantitative studies on 1узо1е-cithin metiated hemolysis. Benzylated lysolecithin as a probe to study effects of temperature and red cell species on the hemolytic reaction. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.455, H1, p.56-65.

230. Weltzien H.U. Cytolytic and membrane-perturbing properties of lysophosphatidylcholine. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.559, N2-3, p.259-287.

231. Wilbrandt W. Osmotische natur sogennante nicht-osmotishe hamolyse. Pflugers Arch. Gesamte Physiol., 1941, v.245, N1, p.22-52.

232. Willbrandt W., Shatzmann H.J. Changes in passive cation permeability of erythrocytes in low electrolyte media. -In: Regulation of inorganic ion content of cells. London, 1960, p.34-52.

233. Williams R.G., Shaw S.K. The relationship between cell injury and osmotic volume reduction. II. Red cell lysis correlates with cell volume rather than intracellular salt concentration. Cryobiology, 1980, v.17, N6, p.530-540.

234. Williamson P., Bateman J., Kozarsky K. et al. Involvement of spectrin in the maintenance of phase-state asymmetry in the erythrocyte membrane. Cell, 1982, v.30, p.725-733.

235. Woolgar A.E. Hemolysis of human red blood cells by freezing and thawing in solutions containing sucrose £ relationship with posthypertonic hemolysis and solute movements. . Cryobiology, 1974, v.11, N1, p.44-51.

236. Woolgar A.E., Morris G.T. Some combined effects of hypertonic solutions and changes in temperature on posthypertonic hemolysis of human rea blood cells. Cryobiology, 1973, v.10, N1, p.82-86.

237. Yamaguchi Т., Kuroki S., Tanaka M., Kimoto E. Effects of temperature and cholesterol on human erythrocyte membranes.

238. J. Biochem., 1982, v.92, ИЗ, p.673-678.

239. Yung C.Y., Carlson L.LI., Balzer C.J. Characteristics of the permeability barrier of human erythrocytes chosts to n nonelectrolytes. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.298, И1, p.101-107.

240. Yung C.Y., Green P.A. Hypertonic cryohemolysis: ionophore and pH effects. J, Membrane Biol., 1978, v.39, N2-3,p.273-284.

241. Zade-Oppen A.M.M. Posthypertonic hemolysis in sodium chloride systems. Acta Physiol. Scand., 1968, v.73, N4, p.341-364.

242. Zwaal R.F.A. Membrane and lipid involvement in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v.515, N2, p.163-206.