ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI - ПРОДУЦЕНТА L-ЛИЗИН-α-ОКСИДАЗЫ НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Каримова Елена Владимировна

• Каримова Елена Владимировна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Каримова Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Особо опасные для Российской Федерации фитопатогенные микроорганизмы и современные методы их диагностики

1.2. Использование грибов рода Trichoderma для создания

биопрепаратов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Измерение концентрации бактериальных клеток на спектрофотометре NanoDrop

2.3. Состав питательных сред для культивирования бактерий

2.4. Подбор оптимальных условий культивирования А. сЫгиШ

2.5. Искусственное заражение растительного материала бактерией А. сЫгиШ

2.6. Применение серологических методов для выявления и идентификации А. сЫгиШ

2.6.1. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ)

2.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.7. Применение молекулярных методов для выявления и идентификации А. сЫгиШ

2.7.1. Оптимизация методов выделения ДНК из чистой культуры бактерий и зараженного растительного материала

2.7.2. Выявление и идентификация возбудителя А. сЫгиШ методом ПЦР

2.7.3. Идентификация А. сЫгиШ методом секвенирование гена ^ рРНК

2.8. Изучение влияния метаболитов гриба Trichoderma harzianum Rifai F-180 на фитопатогенные бактерии

2.9. Определение зон возможного распространения

фитопатогенных бактерий на территории Российской Федерации

ГЛАВА III. Выбор особо опасных фитопатогенных бактерий в качестве объектов исследования, определение зон их возможного распространения. 56 ГЛАВА IV. Исследования с фитопатогенной бактерией

E. amylovora

4.1. Изучение роста E. amylovora на средах разного состава

4.2. Изучение влияния культуральной жидкости гриба Tr.harzianum Rifai F-180 на E. amylovora

4.3. Изучение влияния гомогенного фермента L-лизин-а-

оксидазы гриба Tr. harzianum Rifai штамм F-180 на E. amylovora

ГЛАВА V. Исследования с фитопатогенной бактерией

A. citrulli

5.1. Подбор питательной среды и оптимальных условий культивирования A. citrulli

5.2. Усовершенстование серологических методов выявления и идентификации A. citrulli

5.2.1. Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для выявления A. citrulli

5.2.2. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления A. citrulli

5.3. Применение молекулярных методов для выявления и идентификации A. citrulli

5.3.1. Идентификация полученной бактерии A. citrulli

5.3.2. Оптимизация методов выделения ДНК из чистой культуры A. citrulli и зараженного растительного материала

5.3.3. Подбор специфичных праймеров, определение их чувствительности, специфичности и оптимизация условий ПЦР для

выявления и идентификации А. сЫгиШ

5.4. Изучение влияния метаболитов гриба Тг. harzianum Rifai Б-180

на А. сЫгиШ

5.4.1. Изучение влияния культуральной жидкости Тг. harzianum Rifai Б-180 на А. сЫгиШ

5.4.2. Изучение влияния гомогенного фермента L-лизин-a-

оксидазы Тг. harzianum Rifаi Б-180 в отношении А.сЫгиШ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Список условных сокращений, используемых в диссертации:

1. ВТО - всемирная торговая организация;

2. ГИС - географическая информационная система;

3. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

4. ЕОКЗР - Европейская и Средиземноморская организация по карантину и защите растений;

5. ЕАЭС - Евразийский экономический союз;

6. ИФА - иммуноферментный анализ;

7. КВО - карантинный вредный организм;

8. КЖ - культуральная жидкость;

9. КОЕ - колониеобразущая единица;

10. ЛО - Ь-лизин-а-оксидаза;

11. по - пары оснований;

12. ПЦР - полимеразная цепная реакция;

13. РНИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции;

14. рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота.

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI - ПРОДУЦЕНТА L-ЛИЗИН-α-ОКСИДАЗЫ НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ»

Актуальность проблемы.

Поиск средств для подавления фитопатогенных бактерий продолжает оставаться актуальной проблемой не только для микробиологии, сельского хозяйства, но и для экологии. Весьма перспективным в этом направлении является использование не химических, а биологических средств защиты, в частности продуктов жизнедеятельности микробного происхождения.

Грибы рода Trichoderma являются одним из наиболее изучаемых в последнее время родов грибов. Это единственный род, каждый вид которого представлен в Генетическом Банке хотя бы одним геном, а многие виды представлены последовательностью двух или более генов [4, 37].

Способность некоторых видов рода Trichoderma подавлять фитопатогенные организмы, а также стимулировать рост и развитие растений объясняет широкое и длительное использование этих грибов в сельском хозяйстве в биологической защите растений [24, 64, 74, 76, 81, 87, 152, 176, 194].

Повышенный интерес к грибам рода Trichoderma обусловлен также изучением его ферментных систем. На кафедре биохимии им. академика Березова Т.Т. Медицинского Института Российского университета дружбы народов было установлено, что штамм Trichoderma harzianum Rifai Б-180 является продуцентом фермента Ь-лизин-а-оксидазы (ЛО) [46]. Было показано, что данный фермент обладает противоопухолевой и антивирусной активностью [2, 7, 8, 19, 37, 39, 41]. Впервые было доказано ингибирование Ь-лизин-а-оксидазой вирусов некротической пятнистости бальзамина (ШБУ) и кольцевой пятнисости томата (ТЯБУ) [47, 48].

В последние годы на территории Российской Федерации отмечается увеличение случаев обнаружения заболеваний бактериальной природы среди других групп фитопатогенных микроорганизмов. Многие возбудители карантинных болезней чаще всего могут быть завезены из-за рубежа при

импорте семенного и посадочного материала. В связи с этим необходимостью являются разработка и совершенствование методов выявления и идентификации возбудителей, а также поиск возможных эффективных мер контроля, защиты и борьбы с возбудителями бактериозов. Работа с некоторыми особо опасными фитопатогенными бактериями в нашей стране никогда не проводилась, поэтому в настоящее время особенно актуальным является необходимость разработки собственных тест-систем, а также мер по предупреждению появления данных бактериозов на территории РФ, определение зон возможного риска распространения этих заболеваний.

Влияние фермента Ь-лизин-а-оксидазы и других метаболитов гриба Тг. Иашапыш Rifai Б-180 в отношении ряда особо опасных возбудителей бактериальных болезней растений до настоящего времени не было изучено. Углубление исследований штамма-продуцента, изучение его новых биологических свойств является необходимым и важным, так как представляет не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные экспериментальные данные будут способствовать выяснению тонких молекулярных механизмов действия фермента.

Работа является частью исследований, проводимых с Тг. Иашапыш Rifai на кафедре биохимии им. академика Т.Т. Березова МИ Российского университета дружбы народов, выполняемых в рамках Государственных контрактов НИР/НИОК «Молекулярные основы патологических процессов и система их внутриклеточной регуляции; структура и биологическая активность ферментов с антиопухолевой и антивирусной активностью» (тема №030522-1-274-1).

Цель работы: определить зоны возможного распространения особо опасных фитопатогенных бактерий на территории Российской Федерации, изучить методы их идентификации и влияние метаболитов Trichoderшa Иашапыш Rifai Б-180 на данные бактерии.

Задачи исследования:

- провести анализ литературных данных и осуществить выбор особо опасных для Российской Федерации фитопатогенных бактерий;

- установить зоны возможного распространения выбранных бактерий на территории Российской Федерации с помощью метода Географических информационных систем (ГИС);

- изучить рост данных фитопатогенных микроорганизмов на средах разного состава, подобрать оптимальные условия их культивирования для проведения дальнейших исследований;

- усовершенствовать серологические методы выявления и идентификации (РНИФ и ИФА) выбранных бактерий;

- выбрать оптимальный метод выделения ДНК бактерий, а также усовершенствовать методики ПЦР для выявления и идентификации;

- исследовать влияние метаболитов гриба ^. harzianum Rifai Б-180 на особо опасные для РФ фитопатогенные бактерии;

Научная новизна

Впервые с помощью современного метода ГИС были определены зоны возможного распространения фитопатогенов А. а^иШ и Е. amylovora на территории Российской Федерации.

Подобраны оптимальные условия культивирования бактерии А. сНгШИ;

Впервые в Российской Федерации показана возможность выявления и идентификации бактерии А. а^иШ методами РНИФ и ИФА.

Определена и успешно апробирована специфичная пара новых праймеров АС-1 Б/Я, которая может быть использована при проведении фитосанитарной экспертизы для выявления и идентификации возбудителя А. сШиШ.

Впервые установлено наличие ингибирующих свойств культуральной жидкости (КЖ) ^. harzianum Rifai Б-180 при активности Ь-лизин-а-оксидазы (ЛО) 0,054 Е/мл в отношении особо опасных фитопатогенных бактерий

Е. amylovora и А. а^иШ.

Практическая значимость работы:

- впервые определены территории РФ, подверженные опасности акклиматизации фитопатогенов A. citrulli и E. amylovora и установлены зоны их возможного распространения.

- подобраны оптимальные условия культивирования A. citrulli;

- усовершенствованы серологические методы выявления и идентификации A. citrulli: РНИФ и ИФА. Подобран оптимальный титр кроличьей сыворотки для постановки РНИФ. Сэндвич-метод ИФА (DAS ELISA) позволяет выявлять в исследуемом материале бактерию A. citrulli в количестве 104 КОЕ/мл.

- установлен оптимальный метод экстракции ДНК A. citrulli из чистых культур и зараженного растительного материала - при использовании набора «DNeasyKit» (Qiagen, США). Выделенные образцы ДНК были использованы при проведении классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени»;

- определена и апробирована специфичная пара праймеров AC-1 F/R, которая может быть использована для выявления и идентификации бактерии A. citrulli;

- впервые доказано наличие ингибирующих свойств КЖ Tr. harzianum Rifai F-180 с активностью ЛО 0,054 Е/мл в отношении E. amylovora и A. citrulli.

Практическая значимость данной работы подтверждена: патентами на изобретения - Патент РФ № 2493247 Смирнова И.П., Каримова Е.В., Шнейдер Ю.А. Ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (Erwinia amylovora) от 20.09.2013 г.;

- Патент РФ № 2535983 Смирнова И.П., Каримова Е.В. Продуцент ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур (Acidovorax citrulli) от 20.12.2014г.;

- разработкой методических рекомендаций по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур

Acidovorax citrulli (ЗИааё е1 а1.). УДК 57 (094), № госрегистрации 115081710028. Инв. № 67-2015 МР ВНИИКР, Москва 2015;

- подана заявка на патент: Каримова Е.В., Шнейдер Ю.А., Смирнова И.П. Регистрационный № 2012105552//Набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli и способ выявления возбудителя Acidovorax citrulli от 18.02.2016.

Основные положения, выносимые на защиту:

- проведен анализ литературных данных с целью выбора особо опасных для Российской Федерации фитопатогенных бактерий: E. amylovora и А. сЫтиШ. Установлены зоны их возможного распространения с помощью ГИС;

- подобраны оптимальная питательная среда и условия культивирования

А. сЫтиШ;

- адаптированы методы РНИФ, ИФА и ПЦР для выявления и идентификации фитопатогенной бактерии А. сЫтиШ;

- впервые определена и успешно апробирована специфичная пара новых праймеров АС-1 F/R, которая может быть использована для выявления и идентификации возбудителя А. сНтШ методом ПЦР;

- впервые установлено ингибирующее влияние продуктов метаболизма гриба ^. harzianum Rifai Б-180 на фитопатогенные бактерии E. amylovora и А. сЫтиШ при активности ЛО 0,054 Е/мл и гомогенного фермента ЛО с активностью 5,0 и 10,0 Е/мг.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVI, XVII, XVIII Научно-практических конференциях по медицинской микологии (Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2013, 2014, 2015); Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» (Москва, 2012); Третьем всероссийском съезде по защите растений (С.-Петербург, 2013); Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии биологических средств защиты растений в производстве органической сельскохозяйственной продукции»

(Краснодар, 2014) и Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные исследования молодых ученых в биологии, защите растений и смежных отраслях» (Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Из них 8 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций, остальные тезисы докладов на международных конференциях. Получено два патента: № 2493247 от 20.09.2013 г., № 2535983 от 20.12.2014 г. Подана заявка на патент: регистрационный № 2012105552 от 18.02.2016 г. Разработаны методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и приложения. Работа изложена на 1 46 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 27 рисунков, 5 приложениий. Библиографический список используемой литературы включает 196 источников, из которых 135 зарубежных.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Смирновой И.П. за всестороннюю помощь при выполнении диссертации, д.м.н., профессору Волиной Е.Г. за ценные советы на заключительном этапе работы, а также сотрудникам ФГБУ «ВНИИКР» за консультации и помощь в проведении исследований зав. лабораторией, к.б.н. Шнейдеру Ю.А., ст.н.с. Шнейдер Е.Ю., ст.н.с. Дреновой Н.В., м.н.с. Лозовой Е.Н., начальнику отдела, к.б.н. Камаеву И.О. за помощь в статистической обработке результатов.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особо опасные для Российской Федерации фитопатогенные микроорганизмы и современные методы их диагностики.

В последние годы на территории Российской Федерации среди групп фитопатогенных микроорганизмов отмечается увеличение случаев обнаружения заболеваний бактериальной природы. Из фитопатогенных бактерий, имеющих высокий фитосанитарный риск и вредоносность, наиболее опасными следует считать карантинные бактерии.

Согласно законодательству Российской Федерации, карантинный вредный организм - это организм (вредитель, возбудитель болезни, сорное растение), отсутствующий или ограниченно распространенный на территории Российской Федерации, способный нанести значительный вред растениям или продукции растительного происхождения [54].

В настоящее время в Перечень вредителей, возбудителей болезней растений, сорняков, имеющих карантинное значение для Российской Федерации, входят 175 микроорганизмов, из них одиннадцать возбудителей бактериальных болезней растений [32].

Опасность карантинных фитопатогенных микроорганизмов -возбудителей бактериальных болезней в случае их акклиматизации при благоприятных условиях может быть очень высокой, что нанесет серьезный ущерб урожаю и его качеству в посевах и посадках сельскохозяйственных, лесных и декоративных культур.

О потенциальной опасности, вредоносности и возможности распространения возбудителей карантинных бактериозов, можно судить по экономическим потерям в странах распространения возбудителя болезни. Например, отсутствующие на территории РФ фитопатогенные бактерии Xanthomonas oryzae ру. oryzae и Xanthomonas oryzae ру. oryzicola являются наиболее серьезными болезнями культуры риса в Юго-Восточной Азии, особенно для широко распространенного возделывания низкорослых высокоурожайных сортов. В странах тропической Азии ущерб от бактерии

Xanthoшonas oryzae ру. oryzae достигает в зависимости от сорта риса от 60 до 81% урожая, в странах умеренного климата - до 30% [189]. Вредоносность фитопатогенной бактерии Xanthoшonas oryzae ру. oryzicola ниже, однако в очень влажные сезоны при использовании высоких норм азота в Индии потери достигали 5-30% урожая [156].

По данным Pataky, J. К. (2004) вредоносность другого карантинного фитопатогенного микроорганизма - бактерии Pantoea stewartii в годы эпифитотий может достигать 100% на восприимчивых сортах сахарной кукурузы, на более устойчивых сортах - от 30 до 80% [150].

Фитопатогенная бактерия Xylophilыs aшpelinыs имеет большое экономическое значение в странах своего распространения и массового промышленного производства винограда, таких как, ЮАР, Италия, Испания, Франция [144].

Потери урожая от карантинной бактерии Ralstonia solanacearыш в отдельные годы могут достигать от 30 до 80% [5]. Выявление рас 1 и 3 Ralstonia solanacearыш периодически отмечается в партиях продовольственного картофеля, завозимого на территорию Российской Федерации из Египта и Китая. Очаги возбудителя, зарегистрированные в 2000 - 2001 гг. в Магаданской области, Хабаровском, Приморском краях и Ленинградской области в настоящее время ликвидированы. В 2011 г. в РФ очаг Ralstonia solanacearыш был документирован службой карантина растений на хранящихся клубнях семенного картофеля в Московской области [5].

В последние годы наблюдается значительный рост импорта посевного и посадочного материала в Российскую Федерацию, а также обмен растительными материалами в научных целях. В связи с этим возрастает вероятность завоза карантинных фитопатогенных микроорганизмов на территорию РФ, поэтому особое значение приобретает изучение возбудителей карантинных бактериальных болезней растений, исключение

возможности их проникновения и распространения на территории нашей страны и совершенствование мер борьбы с ними.

При сохранении объемов передвижения растительной продукции через границы РФ можно предположить, что все возбудители бактериальных болезней, для которых климатические условия территории нашей страны являются благоприятными, рано или поздно, возможно, будут завезены.

В связи с вступлением Российской Федерации в Евразийский экономический союз (ЕАЭС) и взаимодействием со странами Всемирной Торговой Организации (ВТО) был подготовлен Проект Единого перечня карантинных объектов, в который было предложено добавить наиболее опасные вредные организмы, способные нанести существенный вред сельскому хозяйству Российской Федерации.

Среди возбудителей бактериозов, включенных в перечень карантинных объектов, одним из наиболее опасных является возбудитель бактериального ожога плодовых культур Erwinia amylovora.

Данный фитопатогенный микроорганизм находится в списке карантинных для территории Российской Федерации вредных организмов, однако в последние годы специалистами фитосанитарной службы бактериоз был обнаружен в пятнадцати регионах Российской Федерации, где он наносит значительный ущерб производителем сельскохозяйственной продукции, личным подсобным хозяйствам, рекреационным зонам и др. [22]. В связи с этим в последнее время исследователями уделяется повышенное внимание возбудителю бактериального ожога плодовых культур E. amylovora.

Впервые вспышка E. amylovora была отмечена в конце XVIII века на востоке США, в штате Нью-Йорк [175]. За полтора столетия фитопатоген распространился по всей Северной Америке [83]. Данный бактериоз был обнаружен в пяти частях света, на четырех континентах. В настоящее время 54 страны официально подтвердили наличие возбудителя бактериального ожога плодовых культур E. amylovora. Страны Южной Америки отрицают

присутствие данного фитопатогенного микроорганизма на своей территории [99]. Австралия - единственная страна (континент), чьей карантинной службе удалось ликвидировать карантинную бактерию E. amylovora на своей территории [97, 99].

Фитопатогенный микроорганизм E. amylovora в настоящее время является одним из наиболее опасных бактериальных возбудителей болезней плодовых культур во всем мире [73, 124, 134, 145, 151, 153, 177, 178], Возбудитель ожога плодовых деревьев - бактерия Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. представляет собой подвижные, мелкие палочки размером 0,60,9 х 1,2-1,6 мкм, не образующие спор, располагаются одиночно, парами и короткими цепочками, подвижные, с 5-8 перитрихально расположенными жгутиками, имеют капсулу, грамотрицательные, факультативные анаэробы.

о о

Оптимальная температура роста 26-28 С, минимальная - 6-8 С, погибают

о

при 43-50 С [14, 56, 93, 99, 160, 175].

E. amylovora поражает более 180 видов плодовых и декоративных культур растений семейства розоцветных Rosaceae подсемейства Pomoideae. Кизильник (Cotoneaster Medik) — самая восприимчивая к бактериальному ожогу культура, среди плодовых деревьев больше всего страдает от заболевания груша (Pyrus L). Возбудитель болезни также поражает боярышник (Crataegus L.), айву (Cydonia Mill.), хеномелес (Chaenomeles Lindl), яблоню (Malus P. Mill.), рябину (Sorbus L.), иргу (Amelanchier Medik), мушмулу (Mespilus L.), пираканту (Pyracantha M.Roem.), странвезию (Stranvaesia L.), дикую грушу (Pyrus communis L.), розу (Rosa L.) [97, 99]. В последнее время отмечены случаи обнаружения бактерии E. amylovora на нехарактерных для нее растениях-хозяевах, в частности на сливе (Prunus domestica) [179] и абрикосе (Prunus armeniaca) [180]. Все перечисленные выше растения-хозяева бактерии E. amylovora имеют широкое распространение на территории РФ.

Для Российской Федерации E. amylovora является карантинным объектом. В результате мониторинга, проводимого с целью уточнения

карантинного состояния территории России на наличие ожога плодовых деревьев, специалистами ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») впервые были выявлены очаги возбудителя болезни в 2003 году - в Калининградской области, в 2007 году - в Воронежской, Тамбовской областях и Карачаево-Черкесии, в 2008 году - в Самарской, Саратовской, Белгородской областях, в 2009 году - в Кабардино-Балкарии, в 2010 году - в Волгоградской области и Ставропольском крае, в 2011 году - в Липецкой области [1, 16, 22, 56, 93], в 2015 году - в Смоленской и Брянской областях.

E. amylovora обладает очень высокой скоростью распространения. Перенос фитопатогенной бактерии в новые регионы осуществляется посадочным и прививочным материалом, насекомыми-опылителями, естественным путем и др [93, 97, 99].

Опасность этого заболевания заключается в быстрой (в течение 3 месяцев) гибели зараженных растений. Вызывая быструю гибель зараженных растений, фитопатоген E. amylovora не только причиняет ущерб урожаю текущего года, но и резко снижает продуктивность деревьев в последующем [14, 16, 22, 56].

Бактерии проникают через цветки или повреждения на растениях. Заболевание начинается с соцветий, а затем переходит на побеги и ветки. Почки не раскрываются, листья и цветки чернеют, засыхают, но не опадают. Молодые ветки и листья начинают чернеть с кончиков, затем скручиваются, образуя симптом, названный «shepherd's crook» (пастуший посох), затем инфекция быстро распространяется вниз по дереву, которое производит впечатление обожженного огнем [14, 56, 99]. Кора размягчается, наблюдается выделение экссудата в виде капель жидкости молочно-белого цвета. Бактерия поражает и плоды, чаще незрелые; они чернеют, но так же, как и листья, не опадают, а остаются на дереве [14, 56].

Проникновение бактерии E. amylovora в Российскую Федерацию произошло двумя путями: с зараженным импортным посадочным материалом и естественным путем.

Таблица 1

Некоторые страны-экспортеры посадочного материала плодовых культур в Россию (2008 - 2013 гг.) и распространение в них E. amylovora

Страна Распространение E. amylovora Год появления возбудителя

Бельгия Присутствует, ограничено распространен 1970 [90]

Венгрия Присутствует, ограничено распространен 1996 [180]

Италия Присутствует, ограничено распространен 1992 (о.Сицилия) 1994 (материковая часть) [97]

Нидерланды Присутствует, широко распространен 1966 [97]

Польша Присутствует, ограничено распространен 1966 [172]

Сербия Присутствует, ограничено распространен 1989 [121]

Украина Присутствует, ограничено распространен 2010 [99]

Франция Присутствует, ограничено распространен 1972 [97]

Современные методы выявления и идентификации E. amylovora связаны с применением микробиологических, серологических и молекулярно-генетических методов.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) является серологическим методом диагностики, основанным на реакции антиген-антитело, где антитела помечены флюоресцентным красителем, и последующей визуализацией данного комплекса под люминесцентным микроскопом. Этот метод выявления и идентификации позволяет визуализировать распределение диагностируемого микроорганизма в исследуемом образце [93, 94, 133].

Другим серологическим методом выявления и идентификации возбудителя E. amylovora является иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА - метод выявления антигенов при помощи антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с отрицательным и положительным контролями [17, 89, 108, 109, 131, 132].

Серологические тесты, такие как ИФА, достаточно трудоемки и не всегда обладают высокой чувствительностью и специфичностью [17, 89, 131, 133]. Поликлональные антитела могут давать перекрестные реакции с другими видами энтеробактерий, присутствующих на растении-хозяине. Моноклональные антитела слишком консервативны, чтобы различать все штаммы возбудителя E. amylovora [93, 131, 133].

Для культурально-морфологической идентификации бактерии E. amylovora разработано несколько видов полуселективных сред. На агаровой среде с аспарагином и сульфатом меди ММ2Си Е. ату1оуога образует слизистые желтые колонии, которые являются типичными для возбудителя [79, 93, 106, 160], в то же время на других питательных средах, например, УОС, возбудитель образует белые колонии [79, 160]. На левановой среде колонии возбудителя Е. ату1оуога видны также через 24 ч. Они сероватые, округлые, куполообразные, гладкие и мукоидные после 48 ч инкубации. Встречаются также леван-негативные колонии возбудителя бактериального ожога [79, 93, 160].

Одним из наиболее распространенных молекулярно-генетических методов диагностики возбудителя E. amylovora в настоящее время является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [23, 75, 107, 126, 140, 151, 154, 158].

Метод ПЦР для выявления и идентификации бактерии имеет ряд преимуществ по сравнению с другими. Прежде всего, это высокая чувствительность, которая обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность выявлять единичные копии ДНК. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах, в чем и заключается универсальность данного метода. Проведение анализа возможно в минимальном (несколько микролитров) объеме пробы. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении труднокультивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды, а также микроорганизмов в латентной форме [23, 33, 107, 126, 154, 158]. При проведении фитосанитарной экспертизы для выявления бактерии E. amylovora с помощью ПЦР появляется возможность быстрого получения результатов. Все это выгодно отличает данный метод диагностики от других.

В настоящее время разработано достаточное количество протоколов и праймеров и для идентификации Е. amylovora методом классической ПЦР. Большинство из них могут быть использованы для видовой идентификации возбудителя [75, 99, 122, 125, 126, 128, 158]. Llop P. и Bonaterra A. с соавторами в 2000 г. разработали гнездовой-ПЦР (nested-PCR) для выявления бактерии E. amylovora. Разработанная система отличалась высокой чувствительностью и достоверностью в предварительных экспериментах с искусственно зараженным растительным материалом [140].

Сотрудниками лаборатории бактериологии ФГБУ «ВНИИКР» разработаны и успешно применяются в фитосанитарной экспертизе для выявления и идентификации Е. amylovora флуоресцентный ПЦР-анализ (FLASH) и био-ПЦР-анализ, с предварительным высевом суспензии образца на плотные питательные и/или селективные среды.

Широкое применение для идентификации чистых бактериальных культур получил метод, базирующийся на применении MALDI-TOF-масс-

спектрометра, интегрированного с обширной базой данных микроорганизмов [80]. Ранее этот метод применялся в клинической диагностике, позже он был успешно адаптирован для идентификации фитопатогенных видов Erwinia, особенно E. amylovora [159].

Несмотря на значительные усилия по борьбе с E. amylovora во всем мире, бактерия по-прежнему вызывает большие потери урожая и гибель плодовых культур. Вредоносность фитопатогена весьма велика вследствие очень быстрого его распространения. В сильно зараженных садах возбудитель заболевания может поражать от 20 до 50%, в отдельных случаях до 90% деревьев, часть из которых полностью погибает [1, 14, 56, 93, 134].

Фитопатогенная бактерия E. amylovora вызывает серьезные потери в местах, где температура и условия влажности благоприятны для ее развития. Экономический ущерб выражается не только в потерях урожая и гибели плодовых деревьев, но и в затратах на восстановление садов. Так например, в ФРГ впервые бактерия была выявлена в 1971 г., в результате чего было выкорчевано 18 тыс. деревьев при общей стоимости затрат 350 тыс. марок. В 1972 г. та же сумма была затрачена вторично [56, 93, 177, 178]. Убытки производителей яблок и груш в Вашингтоне и Северном Орегоне в 1998 г. составили 68 млн. долларов, в Мичигане в 2000 г. - 42 млн. долларов [174]. В связи с этим интерес многих ученых всего мира привлекает поиск и изучение новых стратегий борьбы с данным возбудителем, и последующие возможности сокращения убытков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каримова Елена Владимировна, 2016 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

а. 1 Александров И.Н. Бактериальный ожог плодовых культур в Российской Федерации. Историческая справка. / Александров И.Н. //Защита и Карантин растений, 2009, № 12, С. 26 - 30.

2. Алексеев С.Б. Особенности действия противоопухолевого фермента Ь-лизин-а-оксидазы TгicИodeгшa Бр. / Алексеев С.Б., Смирнова И.П. // Антибиотики и химиотерапия, 2007. - Т. 52 - вып. 11-12 - С. 25-29.

3. Алексеев С.Б. Новый иммуномодулятор из триходермы / Алексеев С.Б., Смирнова И.П., Берёзов Т.Т. // Вопросы медицинской химии, М., 1997 - т. 43 - вып. 2 - С. 112-115.

4. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода TгicИodeгшa. / Алимова Ф.К. // Казань, КГУ, 2006. - 268 с.

5. Ахатов А.К. Болезни и вредители овощных культур и картофеля / Ахатов А.К., Ганнибал Ф.Б., Мешков Ю.И. и др. // М., Товарищество научных изданий КМК, 2013. С. 463.

б. Бадалян И.Э. Применение Ь-лизин-а-оксидазы в проточном ферментном анализаторе «АРФА» / Бадалян И.Э., Симонян А.Л., Берёзов Т.Т. и др. // ЦНИИ Атоминформ, Ереван, 1989, Препринт ЕФИ-1202 (79) С.89.

7. Берёзов Т.Т. Ингибитор вируса иммунодефицита человека / Берёзов Т.Т., Смирнова И.П., Алексеев С.Б. и др. // Патент РФ № 2022011, 1994.

8. Берёзов Т.Т. Ингибитор вируса герпеса простого I типа. / Берёзов Т.Т., Смирнова И.П., Алексеев С.Б. и др. // Патент РФ № 2022012, 1994.

9. Берёзов Т.Т. Способ определения активности Ь-лизин-а-оксидазы. / Берёзов Т.Т., Смирнова И.П., Сяткин С.П. // Авторское св-во № 1047957 СССР, 1983. - 3 с.

10. Берёзов Т.Т. Фермент, обладающий антипролиферативной и антиметастатической активностью / Берёзов Т.Т., Хадуев С.Х., Трещалина Е.М. и др. // Авторское св-во № 1660387. - СССР. - 1991.

11. Браун Л. А. История географических карт. / Браун Л. А //— Москва: Центрполиграф, 2006. — 479 с.

12. Васильев В.П. Сравнительная оценка способов выделения ДНК для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью ПЦР"/ Васильев В.П., Алексеев В.В., Антонов В.А., Замараев В.С., Пивень Н.Н.//. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008, №1, С. 55 - 60.

13. Громова Н.Ю. Технология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие./ Громова Н.Ю., Косивцов Ю.Ю., Сульман Э.М. // Тверь:ТГТУ, 2006. 84 с.

14. Данкверт С.А. Вредные организмы, имеющие карантинное фитосанитарное значение для Российской Федерации: справочник. // Данкверт С.А., Маслов М.И., Магомедов У.Ш., Мордкович Я.Б. Воронеж: Научная книга, 2009, 449 с.

15. Диджапетрене Я. Воздействие L-лизин-а-оксидазы на карциному кожи мышей, индуцированную метилхолантреном / Диджапетрене Я., Алексеев С.Б., Смирнова И.П. и др. // Ж. Антибиотики и химиотерапия, 2001

- т. 46 - вып. № 4 , С. 13-15.

16. Дренова Н.В. Бактериальный ожог плодовых деревьев на Северном Кавказе и в Предкавказье. / Дренова Н.В., Шнейдер Е.Ю., Квашнина Н.А. и др. // Материалы международной научно-практической конференции «Инновационно-технологическое обеспечение устойчивого развития садоводства, виноградарства и виноделия», Махачкала, 2013, С. 178

- 185.

17. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М. - Учебное пособие 2007, 288 с.

18. Емцев В.Т. Микробиология: учебник для вузов. / Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. // 5-е изд., перераб. и доп. — М. : Дрофа, 2005. - 445 с.

19. Жукова О.С. Влияние L-лизин-а-оксидазы гриба Trichoderma sp. на кинетику клеточного цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта. / Жукова О.С, Хадуев С.Х., Добрынин Я. В. и др. // Экспер. онкол., 1985. - Т. 7

- вып. 6 - С. 42-44.

20. Журкин И. Г. Геоинформационные системы. /Журкин И. Г., Шайтура С. В. // — Москва: Кудиц-пресс, 2009. — 272 с.

21. Капралов Е. Геоинформатика. / Капралов Е., Кошкарев А., Тикунов В., Лурье И., Семин В., Серапинас Б., Сидоренко В., Симонов А.// В 2 книгах. — Москва: Academia, 2010.

22. Каримова Е.В. Прогнозирование распространения возбудителя бактериального ожога плодовых культур. / Каримова Е.В., Шнейдер Е.Ю., Смирнова И.П. // Защита и Карантин растений, 2013, № 9, С. 40 - 43.

23. Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. / Кверчи М., Джереми М., Ван ден Эде Г. // Практическое руководство. Люксембург: Бюро официальных изданий ЕС, 2007. 252 с.

24. Коломбет Л.В. Грибы рода Trichoderma - продуценты биопрепаратов для растениеводства / Коломбет Л.В. // Успехи медицинской микологии. М., 2007. Т1. С.323 - 371.

25. Коломбет Л.В. Экспресс-оценка антигрибного, рострегулирующего и фитотоксического действия протравителей семян / Коломбет Л.В., Соколов М.С. // Агрохимия, 2006. - № 8 - С. 52-56.

26. Кучмина Е.Ю. Влияние Trihoderma harziamim на токсические и мутагенные свойства почвы / Кучмина Е.Ю., Алимова Ф.К., Киямова С.Н., Иванченко О.Б. // Тез докл. Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в X1X-XXI веках». Санкт-Петербург.

- 2001. - С. 30-31.

27. Лукашева Е.В. Обзор. Ь-лизин-а-оксидаза: физико-химические и биологические свойства. / Лукашева Е.В., Берёзов Т.Т. // Биохимия, 2002. - Т. 67 - № 10 - С. 1394-1403.

28. Лукашева Е.В. Биологические свойства Ь-лизин-а-оксидазы и ее конъюгатов./ Лукашева Е.В., Берёзов Т.Т., Седакова Л.А. и др. // Биомедицинская химия, 2004. - № 4 - С. 376-383.

29. Покровский В.С. Перспективы разработки новых ферментных противоопухолевых препаратов/ Покровский В.С., Трещалина Е.М., Лукашева Е.В. и др. // Вопросы онкологии. - 2011. - Т. 57. - № 2.- С. 155-164.

30. Поляк М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии. / Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. // Санкт-Петербург, 2002. 80с.

31. Потапова О.Л. Применение ортофенилендиамина в определении активности L - лизин - а- оксидазы и концентрации L - лизина. / Потапова О.Л., Турчинский В.В., Березов Т.Т. // Вопр. мед. химии. 1992, № 5, с. 28-30.

32. Приказ от 26 декабря 2007 г. N 673 по Министерству сельского хозяйства РФ «Об утверждении перечня карантинных объектов».

33. Ребриков Д.В ПЦР в реальном времени. /Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семёнов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. // М., 2013, 223 с.

34. Рой А.А. Влияние бактерий рода ВасШш на возбудителя бактериального рака томатов. / Рой А.А., Пасичник Л.А., Церковняк Л.С. и др.// Микробиология. 2012, Т. 74, № 5. С. 74 - 80.

35. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода триходерма и их использование в практике. / Сейкетов Г.Ш. Алма-Ата: Наука, 1982, 248 с.

36. Смирнова И.П. Продуценты оксидаз Ь-аминокислот и возможные области их применения. / Смирнова И.П. // Биотехнология, 1991. - № 3 - С. 3-7.

37. Смирнова И.П. Биотехнология фермента Ь-лизин-а-оксидазы из триходермы. / Смирнова И.П., Березов Т.Т. // М.: 2014. - 190 с.

38. Смирнова И.П. Окислительное дезаминирование некоторых аминокислот продуктами метаболизма триходермы. / Смирнова И.П., Алексеев С.Б. // Биотехнология, 1998. - № 2 - С. 1-5.

39. Смирнова И.П. Влияние L-лизин-а-оксидазы на развитие герпетической генитальной инфекции у морских свинок. / Смирнова И.П., Алексеев С.Б. // Бюллетень эксперим. биологии и медицины, 1999. - т. 128 -№ 12 - С. 654-656.

40. Смирнова И.П. Биосинтез противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы Trichoderma sp. / Смирнова И.П., Алексеев С.Б. // Антибиотики и химиотерапия, 2009. - т. 54 - № 5-6 - С. 8-11.

41. Смирнова И.П. Триходерма - продуцент ингибитора вируса иммунодефицита человека. / Смирнова И.П., Алексеев С.Б. Мошков Д.А. // Вопросы медицинской химии, 2000. № 4. - С. 384-387.

42. Смирнова И.П. Изучение субстратной специфичности оксидаз L-аминокислот некоторых штаммов рода Trichoderma sp. / Смирнова И.П., Берёзов Т.Т. // Микробиология. - 1989. - Т. 58.- № 1 - С.49-53.

43. Смирнова И.П. Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм L-лизин-а-оксидазы. / Смирнова И.П., Селищева А.А. Алексеев С.Б. Подборонов В.М. // Антибиотики и химиотерапия, 2003. - т. 48 - вып. 1 - С. 9-12.

44. Смирнова И.П. Антибактериальная и антимикробная активность L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Ridai. / Смирнова И.П. Гуськова Т.А., Пушкина Т.В., Подборонов В.М. // Сибирь-Восток, 2003. - вып. 1 (61) -С. 10-12.

45. Смирнова И.П. Ингибитор вируса клещевого энцефалита. / Смирнова И.П., Ларичев В.Ф. // Патент РФ № 2473689 от 27.01.2013 г.

46. Смирнова И.П. L-лизин-а-оксидазная активность некоторых видов Trichoderma. / Смирнова И.П., Хадуев С.Х. // Ж. Микробиология. -1984.-№ 1.- С.163-164.

47. Смирнова И.П., Штамм Trichoderma harzianum Rifai - продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus) (патент РФ № 2475528)/ Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. // Публикация патента: Бюл. № 5. 20.02.2013.

48. Смирнова И.П. Продуцент ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина (патент РФ № 2481392). / Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. // Публикация патента: Бюл. № 13. 10.05. 2013.

49. Соколов М.С. Агротехногенные факторы минимизации вредоносности фузариоза колоса пшеницы / Соколов М.С., Коломбет Л.В. // Агрохимия, 2007. - № 12 - С. 63-80.

50. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Приложение к журналу «Защита и карантин растений» №4. Москва. 2013. 636 с.

51. Станчева Й. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Т.4. Болезни технических культур. / Станчева Й.// Pensoft, 2003, 186 c.

52. Сычев П.А. Антагонистические свойства Trichoderma viride Fr. по отношению к некоторым патогенам Cucumis sativum L. / Сычев П.А., Шапошник Ю.А. // Микол. и фитопатол., 1982. - Т. 16 - Вып. 2 - С. 151-159.

53. Тюльпанова В.А. Биотехнология новых форм грибных фунгицидов для защиты растений / Тюльпанова В.А., Громовых Т.И., Малиновский А.Л. и др. // Сибирский экологический журнал. 1997. №5. С.495 - 500.

54. Федеральный закон от 21.07.2014 №206-ФЗ (ред. от 13.07.2015) "О карантине растений".

55. Хадуев С.Х.Цитостатический эффект L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai и Trichoderma viride Fr. / Хадуев С.Х., Жукова О.С., Добрынин Я.В. и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1987.- № 4 - С. 458-460.

56. Шнейдер Е.Ю. Анализ фитосанитарного риска возбудителя бактериального ожога плодовых Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. для территории Российской Федерации. / Шнейдер Е.Ю. // ФГУ ВНИИКР, 2009.

57. Шнейдер Е.Ю., Каримова Е.В. Отчет о научно-исследовательской работе. Разработка методических рекомендаций по выявлению и идентификации карантинных вредных организмов по теме: Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Shaad et al.). Удк 57 (094), № госрегистрации 115081710028. Инв. № 67-2015 МР ВНИИКР. Москва 2015.

58. Штерншис М.В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России. / Штерншис М.В. // Вестник Томского Государственного университета. Биология. 2012. №2. С. 92 - 100.

59. Штерншис М.В. Энтомопатогены - основа биопрепаратов для контроля численности насекомых. / Штерншис М.В. // Новосибирск : НГАУ, 2010. 160 с.

60. Штерншис М.В. Биологическая защита растений / Штерншис М.

B., Джалилов Ф. С.-У., Андреева И. В., Томилова О.Г. — М.: КолосС, 2004, 264 с.

61. Шкаликов В.А. Иммунитет растений. / Шкаликов В.А., Дьяков Ю.Т., Смирнов А.Н. и др. — М.: КолосС, 2005.—190с.

62. Abdel-Fattah G.M. Trichoderma harzianum: a biocontrol agent against Bipolaris oryzae // Abdel-Fattah G.M., Shabana Y.M., Ismail A.E., Younes M.R.. / Mycopathologia. August 2007, Volume 164, Issue 2, pp 81-89

63. Acimovic G.Control of fire blight (Erwinia amylovora) on apple trees with trunk-injected plant resistance inducers and antibiotics and assessment of induction of pathogenesis-related protein genes / Acimovic G., Zeng Q., Mcghee

C. et al. // Plant Science. 2015 Vol. 6(16):1-10.

64. Ait-Lahsen H. An antifungal Exo-u-l,3glucanase (AGN13.1) from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum / Ait-Lahsen H., Soler A., Rey M., J.,

De La Cruz, E. Monte, A. Llobell // Appl. Environ. Microbiol.,- 2001.- Vol. 67. -P. 5833-5869.

65. Al-Ameiri N. S. Efficiency of Jordanian Trichoderma harzianum (Rifai) isolates against Meloidogyne javanica (Treub) on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) / Al-Ameiri N. S. // Jordan Journal of Agricultural Sciences, 2009. - Vol. 5. - № 4.

66. Altintas S. Application of Trichoderma harzianum increases yield in cucumber (Cucumis sativus) grown in an unheated glasshouse. / Altintas S., Bal U. // J. Appl. Hortic., - 2005 Vol. 7 - pp. 25-28.

67. Alves A.O. Colonization dynamics of Acidovorax citrulli in melon. / Alves A.O., Xavier A.S., Viana I.O. et al.// Tropical Plant Pathology, 2010, 35, 368-372.

68. Antal Z. Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species / Antal Z., Manczinger L., Szakacs G. R.P. // Mycol. Res. - 2000. - Vol. 104. - P. 545-549.

69. Assouline I. The watermelon fruit blotch disease and other diseases caused by Acidovorax avenae subsp. citrulli. / Assouline I.// Phytoparasitica. 1996, 24: 136-137.

70. Bahar O. Bacterial fruit blotch: A threat to the cucurbit industry./ Bahar O., Burdman S. // Israel Journal of Plant Sciences. 2010. 58, P. 19-31.

71. Bahar O. New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli. / Bahar O., Efrat M., Hadar N. et al.// Plant Pathol. 2008. 57, P. 754-763.

72. Bahar O., Bacterial fruit blotch of melon: screens for disease tolerance and role of seed transmission in pathogenicity. / Bahar O., Kritzman G., Burdman S. // Eur. J. Plant Pathol. 2009. 123: P. 71-83.

73. Balaz J. The status of Erwinia amylovora in the Former Yugoslav Republics over the past two decades. / Balaz J., Grahovac M., Radunovic D. et al. // Pestic. Phytomed. (Belgrade), 2013. 28(1), P. 9-22.

74. Bal U. A positive side effect from Trichoderma harzianum, the biological control agent: increased yield in vegetable crops. / Bal U., Altintas S. // J. Environ. Prot. Ecol.- 2006a. - Vol. 7 (2). - P. 383-387.

75. Barbé S. Conventional and real-time PCR to detect Erwinia piriflorinigrans allow its distinction from the fire blight pathogen Erwinia amylovora./ Barbé S., Bertolini E., Roselló M., Llop P., López M.M. // Applied and Environmental Microbiology. 2014 Volume 80, number 8. P. 2390 - 2398.

76. Benítez T. Biofungicides: Trichoderma as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi. In: Pandalai S.G. (ed.) / Benítez T., Delgado-Jarana J., Rincón A.M. et al. // Recent research developments in microbiology, vol. 2. Research Signpost, Trivandrum, 1998. pp. 129-150.

77. Benítez T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. / Benítez T., Rincón A.M., Limón MC, Codón AC. // Int. Microbiol., 2004 - Vol. 7 - pp. 249-260.

78. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture. / Berg G. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2009. - Vol. 84. - P. 11-18.

79. Bereswill S. Molecular characterization of natural Erwinia amylovora strains deficient in levan synthesis. / Bereswill S., Jock S., Aldridge P. //Physiol. Mol. Plant Pathol. 1997, 51: 215-225.

80. Bizzini, A. MALDI-TOF MS, a revolution in clinical microbial identification. / Bizzini, A., Greub, G. // Clin Microbiol Infect 2010 16, 16141619.

81. Bolar J.P. Expression of endochitinase from Trichoderma harzianum in transgenic apple increases resistance to apple scab and reduced vigor / J.P. Bolar J.L. Norelli K.-W. Wong C.K. Hayes, G.E. Harman, H.S. Aldwinckle // Phytopathology, 2000. - Vol. 90 - pp. 72-77.

82. Brotman Y. Role of swollenin, an expansin-like protein from Trichoderma, in plant root colonization. / Brotman Y., Briff E., Viterbo A., Chet I. // Plant Physiol., 2008. - Vol. 147, pp. 779-789.

83. Bonn W.G. Distribution and economic importance of fire blight. In: Fire Blight. The Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora / Bonn W.G. and Van der Zwet T. // CABI Publishing, Wallingford, United Kingdom - 2000. P. 37-55.

84. Burdman S. Molecular, physiological, and hostrange characterization of Acidovorax avenae subsp. citrulli isolates from watermelon and melon in Israel. / Burdman S., Kots N., Kritzman G., Kopelowitz J. // 2005 Plant Dis. 89: 13391347.

85. Burdman S. Acidovorax citrulli: generating basic and applied knowledge to tackle a global threat to the cucurbit industry. / Burdman S., Walcott R. // Molecular Plant Pathology. 2012. 13(8), P. 805-815.

86. Cai XueQing. Pathogen identification of bacterial fruit blotch of watermelon in Fujian. / Cai XueQing, Huang YueYing, Yang JianZhen et al. // Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2005. 34 (4), 434-437.

87. Carvalho Daniel Diego Costa. Biocontrol of seed pathogens and growth promotion of common bean seedlings by Trichoderma harzianum. / Carvalho Daniel Diego Costa; Sueli Correa Marques de Mello; Murillo Lobo Júnior; Alaerson Maia Geraldine. // Pesquisa Agropecuária Brasileira. 2011 vol.46 no.8.

88. Choi J-H. Acidovorax soli sp. nov., isolated from landfill soil./ Choi JH., Kim M-S., Roh S.W. & Bae J-W.// International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2010. 60, 2715-2718.

89. Clark, M.F. Characteristics of the Microplate Method of ELISA for the detection of Plant viruses. /Clark, M.F. Adams, A.N. // Journal of General Virology. 04/1977; 34(3):475-83.

90. Deckers T. Three years of experience in chemical control of fire blight in pear orchards in Belgium. / Deckers T., Porreye W., Maertens P. //Acta horticulturae. 1990 №273. P. 367 - 376.

91. De Lima R. Fruit blotch: important bacterial disease of melon in Brazil. / De Lima R, Ramos M, Barbosa da Silveira E //Anais da Academia Pernambucana de Ciencia Agronómica, Recife, 2004 vol. 1, 79-88.

92. Deshpande S.K. Production of cellulase and xylanase by Trichoderma reesei. / Deshpande S.K., Bhotmange M.G., Chakrabarti T., Shastri PN. // Indian Journal of Chemical Technology. - September 2008. - Vol. 15. - P. 449-456.

93. Drenova N.V. Distribution, characteristics and diagnostic methods for fire blight (Erwinia amylovora) in the Russian Federation. / Drenova N.V., Kharchenko A.A., Kuznetsova A.A. et al //Conference: XIII th International Workshop on Fire Blight, At Zurich, Switzerland. Acta Horticultura, 2013, 1056: 65-70.

94. Dreo, T. Novel approaches in detection of the causative agent of fire blight, Erwinia amylovora, in laboratories and in orchards. / Dreo, T., Braun-Kiewnick, A., Lehmann, A. et al. In Zbornik predavanj in referatov 10. slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin z mednarodno udelezbo, Podcetrtek, Slovenia, 2011. 67-71.

95. Dutta B. Acidovorax citrulli seed inoculum load affects seedling transmission and spread of bacterial fruit blotch of watermelon under greenhouse conditions. / Dutta B., Scherm H. & Gitaitis R. // Plant Disease (accepted for publication, posted online on 7.12.2011, DOI: 10.1094/PDIS-04-11-0292).

96. Elad Y. Biological control of Rhizoctonia solani in strawberry fields by Trichoderma harzianum. / Elad Y., Chet I., Henis Y., // Plant Soil, 2006. - Vol. 60 - pp. 245-254.

97. EPPO (2011) EPPO Plant Quarantine Data Retrieval System PQR.

98. EPPO (2011a) Acidovorax citrulli - Bacterial fruit blotch of cucurbits. EPPO Alert list.

99. EPPO (2013), PM 7/20 (2)*Erwinia amylovora, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin Volume 43, Issue 1, 21 -45.

100. Euzeby J. Validation List no 127. List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published./ Euzeby J. // International Journal for Systematic and Evolutionary Microbiology (2009) 59, 923-925.

101. Feng J.J. Advances in detection of Acidovorax citrulli. / Feng J.J., Li J.Q., Walcott R.R. et al.//Seed Sci. & Technol., (2013) 41, 1-15.

102. Feng, J.J. Multilocus sequence typing reveals two evolutionary lineages of Acidovorax avenae subsp. citrulli. / Feng, J.J., Schuenzel, E.L., Li, J.Q. and Schaad, N.W. // Phytopathology, (2009) 99, 913-920.

103. Fessehaie, A. Simultaneous detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli and Didymella bryoniae using multiplex real-time PCR. / Fessehaie, A., Walcott, R. and Keinath, A. // Phytopathology, (2005) 95, S29.

104. Fessehaie A. Role of honey bees in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae ssp. citrulli. /Fessehaie A., Hopkins D., Gitaitis R. et al // Phytopathol. (2005) 95: P. 29-S29.

105. Gasoni L. Impact of Trichoderma harzianum biocontrol agent on functional diversity of soil microbial community in tobacco monoculture in Argentina. / Gasoni L., Khan N., Yokoyama K. et al. // World Journal of Agricultural Sciences. 2008. 4. P. 527-532.

106. Geider, K. Molecular detection of fire blight and differentiation of Erwinia amylovora strains. / Geider, K. // Phytopathol Pol (2005) 35, 57-68.

107. Gottsberger R. A. Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting chromosomal DNA of Erwinia amylovora. / Gottsberger R. A. // Letters in Applied Microbiology. (2010) 51(3):285-292.

108. Gorris M.T. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for Erwinia amylovora and their use in different serological techniques. / Gorris M.T., Cambra E., López M.M. et al. // Acta Horticulturae (1996) no. 411, P. 47-51.

109. Gorris M.T. A sensitive and specific detection of Erwinia amylovora based on the ELISA-DASI enrichment method with monoclonal antibodies. / Gorris M.T., Cambra M., Llop P. et al. // Acta Horticulturae (1996) no. 411, 41-45.

110. Ha, Y. Simultaneous detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli and Didymella bryoniae in cucurbit seedlots using magnetic capture hybridization and real-time polymerase chain reaction. / Ha, Y., Fessehaie, A., Ling, K.S. et al. // Phytopathology, (2009) 99, 666-678.

111. Hall T. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. / Hall T. // Nucl. acids symp. (1999) Ser. 41, 95-98.

112. Harman, G.E. Myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. / Harman, G.E. // Plant Disease, v.84, p.377-393, 2000.

113. Harman, G.E. Trichoderma species - opportunistic, avirulent plant symbionts. / Harman, G.E.; Howell, C.R.; Viterbo, A. et al. //Nature Reviews Microbiology, v.2, p.43-56, 2004.

114. Himananto O. Novel and highly specific monoclonal antibody to Acidovorax citrulli and development of ELISA-based detection in cucurbit leaves and seed. / Himananto O., Thummabenjapone P., Luxananil P., et al. // Plant Disease (2011) 95, 1172-1178.

115. Holeva M.C. Acidovorax avenae subsp. citrulli newly reported to cause bacterial fruit blotch of watermelon in Greece. / Holeva M.C., Karafla C.D., Glynos P.E. & Alivizatos A.S. // New Disease Reports [http://ndrs.org.uk] (2009) Volume 20, 13.

116. Hopkins D.L. Wet seed treatments for the control of bacterial fruit blotch of watermelon./ Hopkins D.L., Cucuzza J.D. & Watterson J.C. // Plant Disease (1996) 80, 529-532.

117. Hopkins D. Wet seed treatment with peroxyacetic acid for the control of bacterial fruit blotch and other seedborne diseases of watermelon / Hopkins D., Thompson C. M., Hilgren J., Lovic B. // Plant Disease. (2003) 87(12): 1495-1499.

118. Howell C.R. The role of antibiosis in biocontrol Trichoderma and Gliocladium. / Howell C.R. //. Enzymes, biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd. 1998. Vol. 2. Pp. 173-184.

119. Howell C.R. Induction of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani by seed treatment with Trichoderma virens / C.R. Howell, L.E Hanson, R.D. Stipanovic, L.S. Puckhaber // Phytopathology, 2000. -Vol. 90 - pp. 248-151.

120. Howell C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. / Howell C.R. // Plant Disease, 2003 - Vol. 87 - pp. 4-10.

121. Ivanovic, M. Exploring diversity of Erwinia amylovora population in Serbia by conventional and automated techniques and detection of new PFGE patterns. / Ivanovic, M., Obradovic, A., Gasic, K. et al. // European Journal of Plant Pathology, (2012) 133(3), 545-557. doi:10.1007/s10658-011-9926-8.

122. Jock S. Following spread of fire blight in Western, Central and Southern Europe by molecular differentiation of Erwinia amylovora strains with PFGE analysis. / Jock S, Donat V, López MM, et al. // Envir. Microbiol. (2002).4: 106-114.

123. Johnson K. Quorum sensing affects virulence and seed-to-seedling transmission of Acidovorax avenae subsp. citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch. / Johnson K. // Phytopathology (2010) 100, S148.

124. Johnson K. B. Implications of pathogenesis by Erwinia amylovora on rosaceous stigmas to biological control of fire blight. / Johnson K. B., Sawyer T. L., Stockwell V. O., Temple T N. // Phytopathology 03/2009; 99(2): 128-38.

125. Jones A. II Gram negative bacteria. B. Erwinia and Pantoea. / Jones A, Geider K. // Guide for identification of plant pathogenic Bacteria, 2ndedition, Schaad NW, Jones JB, Chum W, APS Press, St Paul, USA. (2001).

126. Kabadjova-Hristova P. Multiplex PCR assay for identification of Erwinia amylovora -the causative agent of fire blight. / Kabadjova-Hristova P.,

Atanasova I., Dousset X., Moncheva P. // Biotechnology & Biotechnological Equipment 04/2014; 20(3), P. 21-25.

127. Kajiwara Hideyuki Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli using PCR and MALDI-TOF MS. / Kajiwara Hideyuki, Sato Masatoshi, Suzuki Akiko. // Journal of Electrophoresis 01/2012; 56(1):13-17.

128. Kim WS Molecular detection and differentiation of Erwinia pyrifoliae and host range analysis of the Asian pear pathogen. / Kim WS, Jock S, Rhim S-L, Geider K // Plant Dis. (2001). 85: P. 1183-1188.

129. Koike, S.T. Vegetable Diseases. / Koike, S.T., Gladders, R. & Paulus A.O. // Academic Press, USA (2007).

130. Kubota, M. A method to evaluate percentage of cucurbit seeds infested with Acidovorax avenae subsp. citrulli, pathogen of bacterial fruit blotch. / Kubota, M., Hagiwara, N. & Shirakawa, T. // Journal of General Plant Pathology (2011) 77, 112-115.

131. Kokoskova B. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and identification of plant pathogenic bacteria (in particular for Erwinia amylovora and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus). / Kokoskova B., Janse J. D., // Plant Pathology. Methods in Molecular Biology. (2009). Volume 508, pp 75-87.

132. Kokoskova B. Reliability of diagnostic techniques for Erwinia amylovora, the causative agent of fire blight disease. / Kokoskova B., Mraz I., // Folia Microbiologica 02/2005; 50(3):217-221.

133. Kokoskova B. Comparison of specificity and sensitivity of immunochemical and molecular techniques for reliable detection of Erwinia amylovora. / Kokoskova B., Mraz I., Hyblova J., // Folia Microbiol. (2007). 52 (2), 175-182

134. Kvashnina N. Monitoring of outbreaks of the fire blight in south of Russia. / Kvashnina N. // Plant protection and quarantine. (2010) 6:40-41.

135. Kusakabe H. -A new antitumor enzyme L-lysine-a-oxidase from Trichoderma viride./ Kusakabe H., Kodama K., Kununaka A., et al. // J. Bio. chem. -1980. - Vol.255. - № 3. P.976-981.

136. Kusakabe H. Effect of L-lysine a-oxidase on growth of mouse leukemia cells. / Kusakabe H., Kodama K., Kununaka A., et al.// Agric. Biol. Chem. - 1988a. 44, 387-392.

137. Kusakabe C. Extracellular production of L-lysine-a-oxidase in wheat bran culture of a strain of Trichoderma viride. / Kusakabe H., Kodama K., Kununaka A., et al. // Agric. Biol. Chem. - 1979. - Vol.43. - № 12. - P. 2531-2533.

138. Lessl J.T. Colonization of female watermelon blossoms by Acidovorax avenae ssp. citrulli and the relationship between blossom inoculum dosage and seed infestation. / Lessl J.T., Fessehaie A., Walcott R.R. // J. Phytopathol. (2007) 155: 114-121.

139. Lewis W. Watermelon bacterial fruit blotch. / Lewis W., Baker T P., Corwin B // MU Guide. Published by mu extension, university of MissouriColumbia (2002).

140. Llop P. Developmentof a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. / Llop P., Bonaterra A., Peñalver J., Lopez M.M. // Appl. Environ. Microbiol.2000. 66: 2071-2078.

141. Limón M.C. Increased antifungal and chitinase specific activities of Trichoderma harzianum CECT 2413 by addition of a cellulose binding-domain / M.C Limon, M.R, Chacon, R. Mejias, J.Delgado-Jarana, A.M. Rincon, AC. Codon, T. Benitez// Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - № 64. - P. 675-685.

142. Matsuura T. Detection and isolation of Acidovorax avenae subsp. citrulli from watermelon seeds using membrane filtration immunostaining. / Matsuura T., Shirakawa T., Sato M. et al. // Japanese Journal of Phytopathology (2008) 74, 1153-11156.

143. McManus P. Antibiotic use in plant agriculture. / McManus P, Stockwell V, Sundin G, Jones A. // Annual Review of Phytopathology; (2002). 40. P. 443-465.

144. Manceau C. Bacterial extraction from grapevine and detection of Xylophilus ampelinus by a PCR and Microwell plate detection system. /Manceau C., Grall S., Brin C., Guillaumes J. // (2005). Bulletin OEPP, 35(1). P. 55-60.

145. Milcevicová R Erwinia amylovora induced defense mechanisms of two apple species that differ in susceptibility to fire blight. / Milcevicová R, Gosch C, Halbwirth H, et al. // Plant Science , (2010) 179, P. 60-67

146. Mirik, M. Occurrence of bacterial fruit blotch of watermelon caused by Acidovorax avenae subsp. citrulli in the eastern Mediterranean region of Turkey. / Mirik, M., Aysan, Y., Sahin, Y. // Plant Dis. (2006) 90, P. 829.

147. Mohamed A. Bacterial antagonists of fungal pathogens also control root-knot nematodes by induced systemic resistance of tomato plants. / Mohamed A., Heuer H., Hallmann J. // (accepted for publication, posted online on 28.02.2014, PLoS ONE 02/2014; 9(2):e90402).

148. Nascimetno A.R.P. Alternative hosts of Acidvorax avenae subsp. citrulli. / Nascimetno A.R.P., Mariano R.L.R. & Silva E.I. // Horticultura Brasileira (2004) 33 (3), 511-515.

149. Palkovics L. First report of bacterial fruit blotch of watermelon caused by Acidovorax avenae subsp. citrulli in Hungary. / Palkovics L, Petroczy M, Kertesz B, et al. // Plant Disease (2008) 92(5), P. 834-835.

150. Pataky, J. K. Stewart's wilt of corn. / Pataky, J. K. // The Plant Health Instructor. (2004). DOI: 10.1094/PHI-I-2004-0113-01. www.apsnet.org

151. Pirc, M. Improved fireblight diagnostics using quantitative real-time PCR detection of Erwinia amylovora chromosomal DNA. / Pirc, M., Ravnikar, M., Tomlinson, J., Dreo, T. // Plant Pathology (2009). 58(5), 872-881.

152. Pomella, A.W.V. Controle biológico com Trichoderma em grandes culturas - uma visao empresarial. / Pomella, A.W.V.; Ribeiro, R.T.S. // In: BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B. (Ed.). Biocontrole de doen?as de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, (2009). p.239-244.

153. Ponce de León Door Adrian, Chacón Alejandro Romo, Muñiz Carlos Acosta. (2013) Detection of streptomycin resistance in Erwinia amylovora strains

isolated from apple orchards in Chihuahua, Mexico. / Ponce de León Door Adrian, Chacón Alejandro Romo, Muñiz Carlos Acosta. // European Journal of Plant Pathology (2013) 10, P. 137.

154. Powney R. The specificity of PCR-based protocols for detection of Erwinia amylovora. / Powney R, Beer S , Plummer K, Luck J, Rodoni B // Australasian Plant Pathology (2011). 40(1):87-97.

155. Puttharugsa C. Development of surface plasmon resonance imaging for detection of Acidovorax avenae subsp citrulli (Aac) using specific monoclonal antibody. / Puttharugsa C., Wangkam T., Huangkamhang N., et al. // Biosensors and Bioelectronics (2011) 26, 2341-2346.

156. Rajarajeswari N. V. L. Assessments of farm yield and district production loss from bacterial leaf blight epidemics in rice. / Rajarajeswari N. V. L., Muralidharan K. // Crop Protection; (2006) 25(3). P. 244-252.

157. Rey M. Improved antifungal activity of a mutant of Trichoderma harzianum CECT 2413 which produces more extracellular proteins. /Rey M., Delgado-Jarana J., Benítez T. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 May; 55 (5): 604-8.

158. Salm H., Real-time PCR for detection and quantification of Erwinia amylovora, the causal agent of fireblight. / Salm H., Geider K.// Plant Pathology, 2004. 53, 602 - 610.

159. Sauer, S. Classification and identification of bacteria by mass spectrometry and computational analysis. / Sauer, S., Freiwald, A., Maier, et al. // PLoS ONE (2008) 3: e2843. doi: DOI: 10.1371/journal.pone.0002843.

160. Schaad N.W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. / N.W. Schaad, J. B. Jones, W. Chun // APS Press. 2001. P. 373.

161. Schaad N.W. List of new names and new combinations previously effectively but not validly, published. / Schaad N.W., Postnikova E., Sechler A., et al. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2009) 59, 923-925.

162. Schaad N.W. Reclassification of subspecies of Acidovorax avenae as A. avenae (Manns, 1905) emend., A. cattleyae (Pavarino, 1911) comb, nov., A. citrulli (Schaad et al., 1978) comb, nov., and proposal of A. oryzae sp. nov. / Schaad N.W., Postnikova E., Sechler A., et al. // Systematic and Applied Microbiology (2008) 31, 434-446.

163. Schaad N.W Pseudomonas pseudoalcalignes subsp. citrulli subsp. nov. / Schaad N.W., Sowell G.Jr, Goth R.W., et al. // International Journal of Systematic Bacteriology (1978) 28 (1), 117-125.

164. Sharma K Morphological, Biochemical and Molecular characterization of Trichoderma harzanium isolates for their efficacy as biocontrol agent. / Sharma K., Mishra A.K. and Misra R. S. // Journal of Phytopathology. (2009) 157(1): 51-56.

165. Sharon E. Improved attachment and parasitism of Trichoderma on Meloidogyne javanica in vitro. / Sharon E., I. Chet and Y. Spiegel // European Journal of Plant Pathology(2009). 123, 291-299.

166. Sharon E., Parasitism of Trichoderma on Meloidogyne javanica and role of the gelatinous matrix. / Sharon E., I. Chet, A. Viterbo, et al. // European Journal of Plant Pathology (2007). 118, 247-258.

167. Sharon E., Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum. / Sharon E., M. Bar-Eyal, I. Chet, et al. // Phytopathology (2001). 91, 687-693

168. Shi C. Biocontrol of Fusarium graminearum Growth and Deoxynivalenol Production in Wheat Kernels with Bacterial Antagonists. / Shi C., Yan P., Li J., et al. // International Journal of Environmental Research and Public Health (Impact Factor: 2). 01/2014; 11(1):1094-1105.

169. Shirakawa T. Occurrence of watermelon bacterial fruit blotch in Japan. / Shirakawa T., Kikuchi S, Kato T. et al// Japanese Journal of Phytopathology, (2000) 66, 223-231.

170. Shirakawa T. Population dynamics of Acidovorax avenae subsp. citrulli on infested seeds and on subsequent seedlings of watermelon. / Shirakawa

T., Komiya Y., Abiko K. // Japanese Journal of Phytopathology (2003) 69, 102106.

171. Smirnova I.P. L-aminoacid oxydases in Trichoderma. / Smirnova I.P., Sale M. // V Intern. Congr. of plant pathology, Aug. 20-27, Kyoto, 1989. p. 498.

172. Sobiczewski P. Terminal shoot susceptibility of new Polish apple cultigens to fire blight. / Sobiczewski P., surawicz E., Berczynski S., Lewandowski M. // Folia Horticulturae. (2004) 16/2, P. 149-157.

173. Song, W.Y. Use of PCR for rapid identification of Acidovorax avenae and A. avenae subsp. citrulli. / Song, W.Y., Sechler, A.J., Hatziloukas, E., Kim, H.M. and Schaad, N.W. // In: Pseudomonas syringae and Related Pathogens (Iacobellis, N.S., Collmer, A., Hutcheson, S.W., Mansfield, J.W., Morris, C.E., Murillo, J., Schaad, N.W., Stead, D.E., Surico, G. and Ullrich, M.S., eds), (2003) pp. 531-543. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

174. Stockwell V.O. Use of antibiotics in plant agriculture./ Stockwell V.O., Duffy B. // Revue scientifique et technique . (2013). 31(1), P. 199-210.

175. Thomson S.V., Epidemiology of fire blight. In: Vanneste JL (ed) Fire blight: the disease and its causative agent, Erwinia amylovora. / Thomson S.V. // CABI Publishing, Wallingford, (2000) pp 9-36

176. Thiruchchelvan N. Effect of Insecticides on Bio-Agent Trichoderma harzianum Rifai. UnderIn vitroCondition. / Thiruchchelvan N., Mikunthan G., Thirukkumaran G.and Pakeerathan K. // American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., (2013) 13 (10): 1357-1360.

177. Vanneste Joël L. Fire Blight: the disease and its causative agent, Erwinia amylovora. / Vanneste Joël L. // CABI Publishing. Wallingford. UK. (2000). P. 375.

178. Vanneste J.L. Isolation of Erwinia amylovora from blighted plums (Prunus domestica) and potato roses (Rosa rugosa). / Vanneste J.L., Lex S., Vermeulen M., Berger F. // Acta Hort (2002). 590. P. 89-94.

179. Vegh A. First Report of Erwinia amylovora Causing Fire Blight on Plum (Prunus domestica) in Hungary. / Vegh A., Nemethy Zs., Hajagos L., and Palkovics L. // Plant Disease. (2012) Vol. 96, № 5. P. 759

180. Vegh A. First Occurence of Fire Blight on Apricot (Prunus armeniaca) in Hungary/ Vegh A, Palkovics L. //Not Bot Horti Agrobo, 2013 № 41(2):440-443

181. Vinale F. A noel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants. / Vinale F., Sivasithamparam K., Ghisalberti E.L., et al. // Physiol. Mol. Plant Pathol., 2008a. - Vol. 72 - pp. 80-86.

182. Vinale, F. Trichoderma-plant-pathogen interactions. / Vinale, F.; Sivasithamparam, K.; Ghisalberti, E.L.; et al.// Soil Biology and Biochemistry, v.40, p.1-10, 2008.

183. Walcott R. R. Role of blossom in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp. citrulli. / Walcott R. R., Gitaitis R. D., and Castro A. C. // Phytopathology(2003) 93:528-534.

184. Walcott R.R. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon seed using immuno-magnetic separation and the polymerase chain reaction. / Walcott R.R., Gitaitis R.D. // Plant Dis. (2000) 84: 470-474.

185. Walcott R.R. Investigating intraspecific variation of Acidovorax avenae subsp. citrulli using DNA fingerprinting and whole cell fatty acid analysis. / Walcott R.R., Langston D.B.Jr., Sanders F.H.Jr., Gitaitis R.D. // Phytopathology (2000) 90: p. 191-196.

186. Walcott, R.R. Differences in pathogenicity between two genetically distinct groups of Acidovorax avenae subsp. citrulli on cucurbit hosts. / Walcott, R.R., Fessehaie, A. and Castro, A.C. // J. Phytopathol. (2004) 152, 277-285.

187. Wall, G.C. A new bacterial disease on watermelon in the Mariana Islands. / Wall, G.C., Santos, V.M. // Phytopathology, (1988) 78, 1605.

188. Webb R.E. A seed-borne bacterium isolated from watermelon. / Webb R.E., Goth R.W. // Plant Disease Reporters, (1965) 818-821.

189. Wen Lu Molecular detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, and Burkholderia glumae in infected rice seeds and leaves. / Wen Lu, Luqi Pan, Haijun Zhao, et al. // The Crop Journal, doi: 10.1016/j.cj.2014.06.005.

190. Willems A. Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov. comb, nov., Acodovorax avenae subsp. citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae and Acidovorax konjaci. / Willems A., Goor M., Thielemans S., et al. // International Journal of Systematic Bacteriology (1992) 42, 107-119.

191. Wilson P.S. Dynamics of soilborne Rhizoctonia solani in the presence of Trichoderma harzianum: effects on stem canker, black scurf and progeny tubers of potato. / Wilson P.S., Ketola E. O., Ahvenniemi P. M., et al // Plant Pathology, (2008) 57, 152-161.

192. Yang C.A. A novel L-amino acid oxidase from Trichoderma harzianum ETS 323 associated with antagonism of Rhizoctonia solani. / Yang C.A., Cheng C.H., Lo C.T., et al. // J Agric Food Chem. (2011) May 11;59(9):4519-4526.

193. Yanli T. Reliable and Sensitive Detection of Acidovorax citrulli in Cucurbit Seed Using a Padlock-Probe-Based Assay. / Yanli T, Yuqiang Z, Walcott R.R., et al. // Plant Disease 06/2013; 97(7): P. 961-966.

194. Yedidia I. Effect of Trichoderma harzianum on microelement concentrations and increased growth of cucumber plants. / Yedidia I., Srivastva A.K., Kapulnik Y. Chet I. // Plant Soil, 2001. - Vol. 235 - pp. 235-242.

195. Zhao T. An improved assay for detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon and melon seed. / Zhao T., Feng J., Sechler A et al. // Seed Sci. & Technol., (2009) 37, 337-349.

196. Zhao T. Pathogen Identification of Hami mellon bacterial fruit blotch. / Zhao T., Sun F.Z., Wang B.W., Hui W.G. // Acta Phytopathologica Sinica (2001). 31(4), 357-364.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Состав буферов, используемых при постановке РНИФ

Фосфатно-солевой буфер (PBS)

Na2HPÜ4 х 12 Н2О (AppliChem) 2,9 г

KH2PO4 х 2 Н2О (AppliChem) 0,2 г

NaCl (AppliChem) 8,0 г

KCl (AppliChem) 0,2 г

Вода дистиллированная 1,0 л Конечное значение рН 7,2. Стерилизовать автоклавированием в течение 30 мин при температуре 121°С и давлении 1 атм. Фосфатно-солевой буфер с твином (PBS Tween)

Na2HPÜ4 х 12 Н2О (AppliChem) 2,9 г

KH2PO4 х 2 Н2О (AppliChem) 0,2 г

NaCl (AppliChem) 8,0 г

KCl (AppliChem) 0,2 г

0,1 %Tween 20 0,5%

Вода дистиллированная 1,0 л Фосфатно-глицериновый буфер

Na2HPÜ4 х 12 Н2О (AppliChem) 3,2 г

NaH2PÜ4 х 2 Н2О (AppliChem) 0,15 г

Глицерин (AppliChem) 50,0 мл

Вода дистиллированная 100,0 мл Конечное значение рН 7,6.

Приложение 2

Состав буферов, используемых при постановке ИФА (DAS ELISA)

Покрывающий буфер

Na2C03 1,59 г.

NaHCOs 2,93 г.

NaN 0,2 г .

Вода дистиллированная 1 л. Конечное значение рН 9,6. Экстрагирующий буфер

Na2HPO4 х 12 Н2О (AppliChem) 2,9 г

KH2PO4 х 2 Н2О (AppliChem) 0,2 г

NaCl (AppliChem) 8,0 г

KCl (AppliChem) 0,2 г

Tween 20 0,5 %

Поливинилпирролидон 2%

Бычий сывороточный альбумин 0,2%

Вода дистиллированная 1,0 л Субстратный буфер

Диэтаноламин 97 мл.

Азид натрия 0,2 г.

Вода дистиллированная 1,0 л Конечное значение рН 9,6.

Приложение 3

Страны распространения наиболее опасных возбудителей бактериальных болезней растений Acidovorax сНгыШ: Канада, США, Бразилия, Коста-Рика, Венгрия, Греция, Турция, Китай, Индия, Тайвань, Таиланд, Северные Марианские острова, Гуам, Япония, Республика Южная Корея, Австралия, ЮАР.

Ешша ашу1оуога: США, Канада, Бермудские о-ва, Мексика, Гватемала, Новая Зеландия, Великобритания, Нидерланды, Польша, Дания, Бельгия, Босния и Герцеговина, Болгария, Франция, Германия, Швейцария, Люксембург, Хорватии, Кипр, Турция, Швеция, Норвегия, Ирландия, Греция, Чехия, Словакия, Эстония, Финляндия, Латвия, Литва, Македония, Молдавия, Черногория, Румыния, Сербия, Италия, Албания, Армения, Азербайджан, Беларусь, Украина, Казахстан, Киргизстан, Республика Корея, Сирия, Иордания, Иран, Израиль, Ливан, Алжир, Египет, Марокко, Тунис.

Приложение 4

Сравнение показателей динамики роста бактерии А. еИтыШ после 30 и 36ч культивирования в зависимости от жидкой питательной среды при температуре +37 оС и разного значения концентрации бактерии (КОЕ/мл).

А)

В)

Д)

Е)

А) 102, Б) 103, В) 104, Г) 105, Д) 106, Е) 107

Приложение 5 Методические рекомендации и патенты

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФНТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ

Федеральное государственное бюджетное учреждение «ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ» (ФГБУ «ВНИИКР»)

УДК 57 (094)

№ госрегистрации 115081710028 Инв. № 67-2015 МР ВНИИКР

ОТЧЕТ

О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

Разработка методических рекомендаций по выявлению и идентификации карантинных вредных организмов

по теме:

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЯТНИСТОСТИ ТЫКВЕННЫХ КУЛЬТУР