Разработка методов выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) на основании изучения его биологии и генетики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.07, кандидат наук Словарева Ольга Юрьевна

• Словарева Ольга Юрьевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Словарева Ольга Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие сведения об объекте исследования

1.2 История изучения

1.3 Географическое распространение

1.4 Фитосанитарный статус

1.5 Информация о поражаемых растениях

1.6 Способы переноса и распространения

1.7 Симптомы бактериоза

1.8 Вредоносность и экономическое значение

1.9 Генетика А. сНтиШ

1.10 Методы диагностики

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Бактериальные изоляты и растительные экстракты

2.2 Общие принципы работы в лаборатории и техника безопасности

2.3 Приготовление растворов, буферов и питательных сред

2.4 Тесты ПЦР

2.5 Проведение электрофореза

2.6 Чистка ампликонов и измерение их концентрации

2.7 Проведение секвенирования

2.8 Оптимизация культурально-морфологического теста

2.9 Оптимизация процедуры подготовки образца для анализа

2.10 Изучение эффективности методов выделения ДНК

2.11 Оптимизация условий проведения ПЦР-тестов

2.12 Оценка применимости ПЦР-тестов

2.13 Участие в Международных МСИ

2.14 Разработка селективной питательной среды для изоляции А. сЫгиШ

2.15 Разработка метода обогащения образца

2.16 Разработка ПЦР-теста в режиме «реального времени»

2.17 Практическое применение диагностических методов

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Оптимизация культурально-морфологического теста

3.2 Оптимизация процедуры подготовки образца для анализа

3.3 Изучение эффективности методов выделения ДНК

3.4 Оптимизация условий проведения ПЦР-тестов

3.5 Оценка применимости ПЦР-тестов

3.6 Участие в Международных МСИ

3.7 Разработка селективной питательной среды для изоляции А. еИтыШ

3.8 Разработка метода обогащения образца

3.9 Разработка ПЦР-теста в режиме «реального времени»

3.10 Определение оптимального размера лабораторной пробы семян

3.11 Разработка новой диагностической схемы

3.12 Практическое применение диагностических методов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рекомендации производству

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) на основании изучения его биологии и генетики»

ВВЕДЕНИЕ

В современных условиях резко изменяющегося климата становятся наиболее актуальными вопросы, связанные с поддержанием основных жизненных потребностей человека, одной из которых является продовольствие. Согласно Резолюции, принятой Генеральной Ассамблеей Организации Объединенных Наций 25 сентября 2015 г., одной из основных целей в области устойчивого развития на период до 2030 г. является ликвидация голода и обеспечение продовольственной безопасности (Резолюция..., [сайт] URL: https://www.un.org/ga/search/view_doc.asp?symbol=A/RES/70/1&Lang=R.). На осуществление поставленной цели направлена деятельность такой отрасли экономики, как сельское хозяйство (Фрумкин, 2016; Буздалов, 2017). Государство осуществляет комплекс мер по поддержанию экономической деятельности аграрного сектора, так как развитое сельское хозяйство представляет собой один из главных факторов безопасности страны в долгосрочном периоде (Лачуга и др., 2019). Важной составляющей такого комплекса является совершенствование технического регулирования и осуществление фитосанитарного надзора в области обеспечения безопасности сельскохозяйственной продукции (Указ президента Российской Федерации № 20., [сайт] URL: http://kremlin.ru/acts/news/62627).

Развитие и распространение болезней и вредителей - это труднопредсказуемый процесс, на который оказывает влияние целый ряд факторов; наиболее значимыми из них являются условия климата (Игнатов, 2014; Павлюшин, 2018), а также перемещение продукции в ходе торговых отношений (Martin et al., 2016; Slovareva, 2020). Возможный экономический ущерб оценивают исходя из риска интродукции и акклиматизации, а также вредоносности вредителя или возбудителя болезни. Кроме того, важное значение имеет наличие, степень распространенности и экономическая значимость поражаемых организмов (Шнейдер, Каримова, 2013).

В последние годы все больше отмечается повышение агрессивности фитопатогенных бактерий в отношении растений-хозяев (Игнатов и др., 2009; Игнатов, 2014; Горобей, Осипова, 2017; Горшков, 2017; Cai et al., 2018; Zarco-Tejada et al., 2018; Masum et al., 2019). Acidovorax citrulli (Schaad et al.) - это фитопатогенная бактерия, являющаяся возбудителем бактериальной пятнистости тыквенных культур. Первые сообщения о фитопатогене появились в 1965 г., когда R.E. Webb и R.W. Goth описали возбудителя, выделенного из рассады арбузов (Шнейдер, Каримова, 2013). Вскоре после обнаружения бактерия проникла из США на территории стран Азии, Европы и Океании. Причину распространения связывают с международной торговлей семенами (Schaad et al., 1978; Fessehaie, Walcott, 2005; Bahar, Burdman, 2010; Каримова, Смирнова, 2013; Словарева, Корнев, 2018; Yang et al., 2019). При отсутствии обязательной проверки фитосанитарного состояния продукции тыквенных культур фитопатоген, вероятно, распространился на новые территории особенно быстро и беспрепятственно (Словарева и др., 2020).

Бактерия патогенна в отношении всех видов растений семейства Cucurbitaceae (Каримова, Смирнова, 2013; Каримова, Лозовая, 2015). Тыквенные культуры являются хозяйственно значимыми и возделываются по всему миру - по данным ФАОСТАТ, тыквенные культуры возделывались в 2017-2018 гг. в 165 странах мира на площадях 8218142 га и 8315994 га соответственно. В РФ в 20172018 гг. под посевами арбузов было занято 133636 и 133748 га площадей, под посевами огурцов - 44190 и 42830 га, под посевами тыкв, кабачков и патиссонов -54960 и 56002 га соответственно (ФАОСТАТ: [сайт] URL: http: //www. fao. org/fao stat/ru).

По данным Единой межведомственной информационно-статистической системы (ЕМИСС: [сайт] URL: https://www.fedstat.ru/) и Федеральной службы государственной статистики (Федеральная служба государственной статистики: [сайт] URL: https://rosstat.gov.ru/), бахчевые культуры возделывались на территории России в 2017-2019 гг. в Центральном, Южном, Северо-Кавказском, Приволжском, Сибирском, Уральском и Дальневосточном федеральных округах.

Всего под бахчевыми продовольственными культурами было задействовано в 2017 г. 152,05 тыс. га, в 2018 г. - 140,31 тыс. га и в 2019 г. - 127,86 тыс. га.

Согласно Доктрине продовольственной безопасности РФ, одним из индикаторов оценки показателей продовольственной безопасности является самообеспечение государства продукцией овощных и бахчевых культур в размере 90% от общего потребления данной продукции населением. Таким образом, производство продукции тыквенных культур является одним из основных направлений реализации политики РФ в области обеспечения населения продуктами питания.

В настоящее время A. citrulli причиняет ущерб урожаям тыквенных культур на территориях своего распространения (Islam et al., 2019), а для ряда стран является объектом внешнего карантина (EPPO. Acidovorax citrulli Categorization: [сайт] URL: https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC/categorization).

Симптомы бактериоза проявляются на листьях и стеблях растений в виде хлорозов, которые впоследствии становятся некрозами (Wechter et al., 2011). На плодах патоген вызывает появление пятен, которые с развитием болезни превращаются в обширные мокнущие язвы. При этом бактерия активно размножается во всех тканях плода, что делает его непригодным для использования в пищу (Bahar, Burdman, 2010). В комфортных для бактерии условиях может погибнуть до 100% урожая (Islam et al., 2019). Возбудитель поражает растения в любой фазе развития - от всходов до плодов (Bahar, Burdman, 2010). На сегодняшний день информация об эффективных способах борьбы с возбудителем отсутствует (Hopkins, 1996; Hopkins et al., 2003, Fessehaie, Walcott, 2005; Adhikari et al., 2017). Как и на многие другие бактерии, на A. citrulli оказывают подавляющее действие соединения на основе меди, вводя бактерию в состояние стресса, при котором она утрачивает вирулентность, оставаясь жизнеспособной. Тем не менее, исследования показали, что наличие благоприятных условий, таких как хелатирование, субстрат растения-хозяина и др. быстро приводит к восстановлению вирулентности. Кроме того, требуемые

концентрации соединений меди являются токсичными как для растений, так и для потребителей продукции растений после обработок (Kan et al., 2019).

Также не существует полностью устойчивых к A. citrulli сортов какого-либо вида растений семейства Cucurbitaceae (Sowell, Schaad, 1979; Goth, Webb, 1981; Hopkins, 1990; Hopkins et al., 1993; Hopkins, Thompson, 2002; Schaad et al., 2003, Bahar et al., Bacterial fruit blotch..., 2009; Johnson et al., 2011, Wechter et al., 2011; Carvalho et al., 2013; De Melo et al., 2014).

Развитие болезни может протекать бессимптомно до наступления благоприятных условий, таких как жаркая и влажная погода (Fessehaie, Walcott, 2005). В случае, если больное растение успело сформировать семена, бактерия может сохраняться в них длительное время (Bahar, Burdman, 2010). Установлено, что образование зараженных семян возможно даже при отсутствии симптомов на плодах - бактерия попадает в семена при опылении. Симптомы на семенах не проявляются, что и создает высокий риск распространения фитопатогена на большие расстояния (Walcott et al., 2003; Fessehaie, Walcott, 2005).

В то же время, семена тыквенных культур активно перемещаются между странами в ходе торговых отношений. По данным Всемирного информационного ресурса для профессиональных семеноводов (Global Information Services for Seed Professionals: [сайт] URL: https://www.seedquest.com/), насчитывается около 80-ти крупных компаний, деятельность которых связана с производством и торговлей семенами тыквенных культур. Анализ импорта семян за 2017-2019 гг. по кодам ТН ВЭД 1209918000 и 1207700000 (Таможенная статистика ВЭД России: [сайт] URL: https://statimex.ru/statistic) показал, что существенная часть семян прочих овощных культур (включая тыквенные) поступает в РФ из Франции, Польши, Италии, США и Китая (1,93 тыс.тонн от общего объема импорта 2,65 тыс.тонн), а семян дыни - из Италии, Китая, Франции, Турции, Нидерландов и Перу (1,2 тонны от общего объема импорта 1,3 тонны). По данным Федеральной государственной информационной системы Аргус-Фито (Федеральная государственная информационная система Аргус-Фито: [сайт] URL: https://argusfito.fitorf.ru/), в 2017, 2018 и 2019 гг. семена тыквенных культур

поступали в РФ из 38 стран в количестве 7015,5, 8820,8 и 10361,8 тонн соответственно. Основными странами происхождения перемещаемых семян тыквенных культур за 2017-2019 гг. стали Китай, Белоруссия, Тайвань, США и Венгрия. Таким образом, в РФ поступают семена тыквенных культур преимущественно из стран распространения A. citrulli - США, Китай, Тайвань, Венгрия, Франция и др.

A. citrulli представляет собой потенциальную угрозу для производства продукции тыквенных культур на территории РФ (Каримова и др., 2017; Каримова и др., 2019). В настоящий момент фитопатоген отсутствует на территории РФ, но климатические условия основных регионов возделывания его главных растений-хозяев, дынь и арбузов (Черноземье, Среднее и Нижнее Поволжье, Северный Кавказ, Приморье, Республика Крым), схожи с условиями тех стран, в которых распространен патоген (Шнейдер, Каримова, 2013; Каримова и др., 2017). Кроме того, последние годы характеризуются существенными изменениями климата (Левитин, Изменение климата..., 2012; Левитин, Защита растений..., 2012). Температура поверхности Земли увеличивается до 1,5 °C в год на протяжении ста лет, а начиная с 2015 г. потепление климата происходит особенно быстрыми темпами (Medhaug et al., 2017). Считается, что на климатические условия территории РФ, в силу географического расположения, глобальное потепление окажет наибольшее влияние (Sun et al., 2019). Такие изменения могут оказать стимулирующее воздействие на акклиматизацию и распространения теплолюбивых микроорганизмов (Игнатов, 2014), в том числе возбудителей бактериозов (Glinushkin et al., 2016). Также следует отметить, что условия выращивания растений семейства Cucurbitaceae в закрытом грунте являются оптимальными для акклиматизации A. citrulli независимо от региона, так как создаваемый в закрытом грунте теплый и влажный микроклимат особенно благоприятен для развития фитопатогена (Walcott et al., 2003; Шнейдер, Каримова, 2013; Словарева, Корнев, 2017).

A. citrulli пристально изучается учеными по всему миру. Только в базе NCBI за последние 5 лет опубликовано более 100 рукописей, посвященных

фитопатогену. Тем не менее, знаний о патогенезе A. citrulli все еще недостаточно (Bahar et al., Type IV pili..., 2009; Ren et al., 2013; Luo et al., 2015; Каримова и др., 2019).

В процессе изучения бактерии установлено, что A. citrulli характеризуется внутривидовым генетическим разнообразием (Bahar, Burdman, 2010; Song et al.,

2015). Walcott et al., изучая различные штаммы A. citrulli в 2000 г., обнаружили высокую степень генетической изменчивости между ними. Несмотря на это, ученые показали, что штаммы могут быть сгруппированы в два кластера, называемые I и II группой. Группа I состояла из штаммов, полученных из различных видов тыквенных культур, кроме арбуза. Группа II была сформирована изолятами, выделенными из растений и плодов арбуза (Walcott et al., 2000). Исследования, проведенные в различные периоды другими учеными, подтверждают эти предположения (Walcott et al., 2004 г.; Burdman et al., 2005 г.; Feng et al., 2009 г.; Zivanovic, Walcott, 2017 г.). Тем не менее, в 2016 г. из растений арбуза с одних и тех же посадок были выделены изоляты A. citrulli, которые по генетическим характеристикам четко разделялись на две группы (Choi et al.,

2016). Данное исследование опровергает достоверность теории группирования изолятов относительно растений-хозяев. Другие исследования показали, что штаммы A. citrulli могут быть разделены по их генетическим характеристикам не на две, а на 6 или 7 групп, причем основным фактором, влияющим на генетическое разнообразие, следует считать географическое происхождение штаммов (Melo et al., 2014).

Исследования, направленные на установление внутривидовых генетических различий между штаммами, показали, что генетически отличающиеся друг от друга штаммы A. citrulli могут показывать как схожие результаты применения культурально-морфологических, физиологических, серологических, молекулярно-генетических методов и тестов на патогенность, так и проявлять отличия в результатах применения этих методов (Bahar, Burdman, 2010).

Ввиду того, что A. citrulli может наносить существенный вред производству тыквенных культур, проникновение и распространение данного фитопатогена

контролируется странами ЕОКЗР. При этом, несмотря на предпринимаемые меры контроля, найдены свежие отчеты о выявлении данной бактерии в европейских странах (Cunty et al., 2018., Popovic, Ivanovic, 2015). Подобный результат мог быть вызван отсутствием эффективного диагностического протокола на фоне высокой внутривидовой генетической изменчивости A. citrulli и недостоверности применяемых методов выявления и идентификации фитопатогенной бактерии. Сведения о том, что бактерия проникла на ранее свободные территории, вызывают опасения и повышают актуальность проведения обследований посадок тыквенных культур в благоприятных для развития бактериоза климатических зонах РФ. Одной из таких зон является территория Республики Крым (Шнейдер, Каримова, 2013).

Актуальность темы. В силу вышеуказанных причин, не теряет свою актуальность потребность в разработке комплекса мер по контролю распространения возбудителей болезней растений (Kruse et al., 2019; Указ..., [сайт] URL: http://kremlin.ru/acts/news/62627) и, в частности, A. citrulli. Центральным звеном такого комплекса является своевременная лабораторная диагностика (Walcott et al., 2006; Boykin et al., 2019; Словарева, Старикова, 2020). Лучшее понимание молекулярных основ патогенеза возбудителя, а также знания о генном механизме, необходимом A. citrulli для проявления вирулентности, имеет большое значение для разработки эффективных стратегий борьбы с бактериозом (Yan et al., 2013; Luo et al., 2015; Song et al., 2018).

Степень разработанности темы. На начало исследования испытательными лабораториями стран ЕАЭС применялись два нормативных документа (НД): PM 7/127 (1) и МР 67-2015 ВНИИКР. Согласно вышеуказанным НД, диагностика заболевания проводится в несколько этапов (формирование лабораторной пробы, подготовка аналитической пробы, выявление и идентификация), каждый из которых содержит ряд определенных сложностей.

Проблемы исследования вредного организма возникают уже на этапе отбора лабораторного образца, так как его объём не соответствует существующей норме отбора образцов. Согласно НД, образец семенного материала должен

состоять из не менее чем двух подвыборок по 5000 семян каждая (10 000 семян). Предоставление такого количества семян не всегда возможно, убыточно для производителя семян, а кроме того, чем больше объём семян для исследования, тем сложнее процесс формирования аналитической пробы и менее достоверны результаты анализа (81оуагеуа е! а1., 2019).

Кроме того, в случае проверки фитосанитарного состояния вегетирующих растений или плодов, ни один из НД не предусматривает диагностики в бессимптомных образцах, что не позволяет проводить исследование таких образцов. Возникает риск пропустить фитопатоген в случае содержания его в образце в латентной форме. Процесс подготовки аналитических проб существенно отличается между двумя НД, при этом влияние метода подготовки проб на чувствительность и эффективность последующих тестов не определена.

Методы выявления и идентификации, приведенные в РМ 7/127 (1), существенно отличаются от методов, предлагаемых к использованию в МР 672015 ВНИИКР. При этом отчет об оценке применимости методов отсутствует. Кроме того, приведенные в НД методы нуждаются в актуализации.

Вышеизложенные соображения обуславливают актуальность данного исследования, цель которого - разработка методов выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax сЫгиШ (ЗеИааё е! а1.) на основании изучения его биологии и генетики.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

— Апробация, оценка применимости и совершенствование существующих диагностических тестов для А. сЫгиШ;

— Разработка селективной питательной среды для изоляции культуры А. сНгиШ;

— Разработка метода обогащения образца;

— Разработка нового ПЦР-теста для выявления и идентификации А. сЫгиШ и оценка его применимости.

Научная новизна. Разработана селективная питательная среда для изоляции культуры А. сНгиШ из экстракта, что позволяет существенно упростить проведение культурально-морфологического диагностического теста.

Впервые разработан метод обогащения образца, что позволяет успешно проводить выявление и идентификацию А. еНгыШ даже при низком содержании фитопатогена в образце, а также существенно сокращает время, необходимое для проведения диагностики.

На основе оригинальных исследований разработан тест ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) для идентификации А. еИтиШ, оценка аналитической специфичности которого показала лучшие результаты по сравнению с имеющимися тестами ПЦР-РВ.

Разработана новая схема выявления и идентификации А. еИтиШ, что позволяет проводить диагностику фитопатогена максимально эффективно, достоверно, быстро и с минимальными затратами.

Впервые в Российской Федерации проведено обследование посадок арбуза на выявление А. еИтиШ на территории Республики Крым, в результате которого целевой организм не обнаружен.

Впервые при исследовании образцов семян тыквенных культур обнаружен генетический материал А. еИтиШ в импортной подкарантинной продукции.

Теоретическая и практическая значимость. Оптимизирован метод культивирования и изоляции А. еИтиШ. Оценена эффективность различных методов подготовки образца для анализа, что позволило выбрать наиболее оптимальный из них для проведения лабораторных исследований. Апробирован ряд коммерческих наборов для выделения ДНК, что позволило определить актуальный ассортимент наиболее эффективных и доступных из них. Оптимизирован состав реакционной смеси для проведения классических ПЦР и ПЦР-РВ. Проведена оценка применимости существующих ПЦР-тестов. Принято участие в Международных межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ), что позволило получить новые штаммы целевой бактерии для их изучения, освоить новые диагностические методы, оценить применимость действующего

НД по выявлению и идентификации А. сНгиШ, а также установить связь с зарубежным научным сообществом.

Разработана селективная питательная среда для изоляции культуры А. сНгиШ из экстракта тыквенных культур.

Впервые разработан метод обогащения образца, который позволяет сократить время, необходимое для проведения исследования в случае подозрения на содержание фитопатогена в образце, с 3-4 недель до 3-4 дней. Разработан тест на основе ПЦР-РВ для идентификации А. сНгиШ, оценка применимости которого показала лучшие результаты по сравнению с имеющимися ПЦР-тестами.

Расширена область применения методики выявления и идентификации А. сНгиШ для проведения диагностики фитопатогена в небольших партиях семян, бессимптомном растительном материале, экстрактах, бактериальных культурах и препаратах ДНК.

Разработана новая схема диагностики А. сНгиШ.

Применение оптимизированных диагностических методов при исследовании образцов арбуза, отобранных в ходе обследования посадок на территории Республики Крым, позволило установить отсутствие А. сНгиШ в образцах.

Применение новых методов выявления и идентификации А. сНгиШ впервые в РФ позволило обнаружить генетический материал фитопатогена в образцах импортной подкарантинной продукции семян тыквенных культур.

Методы и методология исследований. Используемые в настоящей работе культурально-морфологические, биологические и молекулярно-генетические методы являются как объектом самого исследования, так и средством получения экспериментальных данных. Количественная обработка данных ПЦР проводилась путем цифровой регистрации. При использовании общепринятых методик, ГОСТов, современных культурально-морфологических, биологических и молекулярно-генетических методов анализа, различных методов интерпретации

результатов и статистического анализа получены результаты фактически 4-х летних комплексных экспериментальных исследований.

Положения, выносимые на защиту диссертационной работы:

1. Селективная питательная среда для изоляции культуры A. citrulli из экстракта даже при низкой концентрации бактерии в образце.

2. Метод обогащения образца для простого и быстрого получения результата диагностики A. citrulli в случае подозрения на содержание фитопатогена в образце.

3. Новый, более специфичный тест на основе ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli.

4. Новая схема диагностики A. citrulli.

Степень достоверности. Исследования выполнены по известным методикам. Все выводы и рекомендации производству подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных результатов.

Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены на 6 международных научных конференциях: Международная научная конференция «Эпидемии болезней растений: мониторинг, прогноз, контроль», ФГБНУ ВНИИФ, пгт. Большие Вязёмы, Московская область, 13-17 ноября 2017; Всероссийская конференция с международным участием «Современные подходы и методы в защите растений», УРФУ им. Б.Н. Ельцина, г. Екатеринбург, 12-14 ноября 2018; 2nd International Conference Modern Synthetic Methodologies for Creating Drugs and Functional Materials (M0SM2018), UrFu, Ekateringurg, November 12-14, 2018; Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвящённая 150-летию А.В. Леонтовича МНКМУиС-2019, РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва, 4-6 июня 2019; Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы карантина и защиты растений», ФГБУ «ВНИИКР», рп. Быково, 8-9 октября 2019, Вторая международная научно-практическая конференция «Аграрная экономика

в условиях глобализации и интеграции», Российская академия наук, г. Москва, 24-25 октября 2019.

Публикации. Основные результаты проведённых в рамках настоящей диссертационной работы исследований опубликованы в 9 научных изданиях, 2 из которых входят в текущий перечень рецензируемых ВАК РФ журналов и реферативные базы Web of Science и Scopus, 2 входят в перечень журналов, включенных в реферативные базы Web of Science и Scopus.

Личный вклад автора. Работа является результатом оригинальных исследований. Диссертантом лично проведена основная часть экспериментальных работ, представленных в диссертации, аналитическая обработка полученных данных, обзор литературных источников, подготовка и написание публикаций, обобщение результатов. Разработка программы исследований и выбор необходимых методов исследований выполнены при участии научного руководителя.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах. Состоит из введения, основной части, содержащей 26 рисунков, 38 таблиц, заключения, списка литературы (включает 158 наименований, в том числе 109 -на иностранном языке), принятых сокращений и 3 приложений.

Характеристика результатов, полученных в соавторстве и благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, к.б.н. К.П. Корневу за формирование научного мышления и вклад в данное исследование; к.б.н. Л.С. Большаковой за руководство подготовкой данной работы; д.б.н. А.А. Соловьеву за помощь и поддержку; к.б.н. Г.Н. Бондаренко, д.б.н. А.В. Смиряеву и д.б.н. А.Н. Игнатову за помощь и ценные советы при выполнении данной работы; преподавательскому составу РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, коллективу ФГБУ «ВНИИКР» и своим друзьям за помощь и поддержку.

Место выполнения экспериментальной работы.

Работа выполнена в лаборатории бактериологии Испытательного лабораторного центра Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР»), 140150, Московская область, Раменский район, рп. Быково, ул.

Пограничная, д. 32, а также на кафедре генетики, селекции и семеноводства ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 127550, г. Москва, Лиственничная аллея, д. 3.

Отдельные эксперименты были проведены:

— в лаборатории биоинформатики Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России);

— в испытательной лаборатории филиала в Республике Крым Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР»), 295053, Республика Крым, г. Симферополь, ул. Оленчука, д. 52.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общие сведения об объекте исследования

Объектом исследования является возбудитель бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.).

Компьютерный код ЕОКЗР: PSDMAC (EPPO. Acidovorax citrulli: [сайт] URL: https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC).

Систематическое положение: согласно приведенной в п. 1.2 реклассификации объекта исследования, в работе используется следующая таксономия:

Царство: Bacteria Тип: Proteobacteria Класс: Betaproteobacteria Порядок: Burkholderiales Семейство: Comamonadaceae Род: Acidovorax Вид: Acidovorax citrulli Номенклатура

Официальное название: Acidovorax avenae subsp. citrulli (Schaad et al. 1978) Willems et al. 1992.

Научное название: Acidovorax citrulli (Schaad et al.)

Синонимы: Pseudomonas avenae subsp. citrulli (Schaad et al. 1978) Hu et al. 1991, Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp. citrulli (Schaad et al. 1978).

Официальное русское название: возбудитель бактериальной пятнистости тыквенных культур.

Общепринятое название на английском языке: bacterial fruit blotch of cucurbits.

Типовой материал. Типовым штаммом A. citrulli является АТСС 29625 Американской коллекции типовых культур (NCBI: [сайт] URL:

blast.ncbi.nlm.nih.gov). Данный материал также хранится в Национальной коллекции фитопатогенных бактерий (Йорк, Великобритания) NCPPB под номером 3679.

Морфология. Бактерия представляет собой грамотрицательные, строго аэробные палочки, размер которых составляет 0,5*1,7 мкм, подвижные, имеющие один жгутик (Bahar, Burdman, 2010; Feng et al., 2013) (рис. 1).

£

Рисунок 1 - Просвечивающая электронная микрофотография клеток штамма М6 Acidovorax сИтиШ. Стрелками показаны жгутики. Шкала бар = 1 мкм

(Фото: ВаИаг, Вигётап, 2010).

На большинстве твердых сред бактерия образует круглые, прозрачные и гладкие колонии (Willems et al., 1992). При культивировании A. citrulli на среде Кинг Б вырастают гладкие, округлые, кремовые, блестящие, не флуоресцирующие колонии, которые могут достигать диаметра около 5,0 мм. На среде NSA колонии А. citrulli значительно мельче, чем на среде Кинг Б (Словарева, Корнев, 2017). Как правило, на NSA колонии беловато-серого цвета, выпуклые, с четкими краями, диаметр от 0,05 до 1,5 мм (рис. 2).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Словарева Ольга Юрьевна, 2021 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арефьев, В.А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов / В.А. Арефьев, Л.А. Лисовенко // Науч. ред. Л.И. Патрушев; Москва: Изд-во ВНИРО. - 1995. - 407 с.

2. Белкин, Д.Л. Метод секвенирования в видовой идентификации карантинных вредных организмов / Д.Л. Белкин, Г.Н. Бондаренко, А.Б. Яремко, Д.А. Уварова // Карантин растений. Наука и практика. - 2019. - № 2 (28). - С. 3134.

3. Буздалов, И.Н. Сельское хозяйство / И.Н. Буздалов // Большая российская энциклопедия (электронная версия 2017). [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://bigenc.ru/economics/text/3546840 (дата обращения: 05.03.2020).

4. Горобей, И.М. Проблема бактериозов растений и подходы к ее решению / И.М. Горобей, Г.М. Осипова // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2017. - № 47 (4). - С. 94-102.

5. Горшков, В.Ю. Бактериозы растений: молекулярные основы формирования растительно-микробных патосистем / В.Ю. Горшков // Казань: Изд-во Сергея Бузукина. - 2017. - 296 С.

6. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследования). - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.

7. Единая межведомственная информационно-статистическая система. [Электронный ресурс] / ЕМИСС. - Режим доступа: https: //www.fedstat.ru.

8. Игнатов, А.Н. Новые возбудители бактериозов и прогноз их распространения в России / А.Н. Игнатов, Н.В. Пунина, Е.В. Матвеева, К.П. Корнев, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко // Защита и карантин растений. - 2009. -№ 4. - С. 38-40.

9. Игнатов, А.Н. Распространение возбудителей опасных бактериозов растений в Российской Федерации / А.Н. Игнатов // Защита картофеля. - 2014. -№ 2. - С. 53-57.

10. Каримова, Е.В. Возбудитель бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax еИтыШ / Е.В. Каримова, И.П. Смирнова // Карантин растений. Наука и практика. - 2013. - № 1 (3). - С. 14-18.

11. Каримова, Е.В. Прогнозирование зон возможной вредоносности бактериальной пятнистости тыквенных культур / Е.В. Каримова, Е.Н. Лозовая // Защита и карантин растений. - 2015. - № 4. - С. 39-41.

12. Каримова, Е.В. Современный метод прогнозирования распространения болезней растений (на примере Б^Ма ашу1оуога и Acidovorax сЫгиШ) / Е.В. Каримова, Е.Н. Лозовая, Ю.А. Шнейдер // Карантин растений. Наука и практика. - 2017. - № 3 (21). - С. 13-16.

13. Каримова, Е.В. Фитопатогенные бактерии Б^Ма amylovora и Acidovorax сЫгиШ и анализ их фитосанитарного риска / Е.В. Каримова, Ю.А. Шнейдер, И.П. Смирнова, Е.Н. Пакина, Т.С. Астраханова // Проблемы развития АПК региона. - 2019. - № 4 (40). - С. 71-77.

14. Левитин, М.М. Защита растений от болезней при глобальном потеплении / М.М. Левитин // Защита и карантин растений. - 2012. - № 8. - С. 1617.

15. Левитин, М.М. Изменение климата и прогноз развития болезней растений / М.М. Левитин // Микология и фитопатология. - 2012. - Т. 46. - № 1. -С. 14-19.

16. Лачуга, Ю.Ф. Важнейшие положения концепции стратегического развития семеноводства и размножения растений в РФ / Ю.Ф. Лачуга, Ю.В. Плугатарь, Н.М. Макрушин, А.М. Малько, В.М. Косолапов, В.И. Долженко, В.И. Драгавцев, И.М. Куликов, В.М. Лукомец, В.Ф. Пивоваров, В.Д. Надыкта, Н.И. Сидельников, С.И. Воронов, В.И. Леунов, А.В. Солдатенко, А.И. Алтухов, Л.А. Беспалова, В.Т. Синеговская, А.П. Царев, С.В. Гончаров, Т.А. Полякова, Е.М. Макрушина, Т.В. Долженко, Т.С. Науменко, О.В. Андросова, Р.Ю. Шабанов, О.А. Клиценко, А.В. Михилев, Д.И. Паспеков // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. - 2019. - № 132. - С. 9-16.

17. Лавренчук, Л.С. Микробиология : Практикум / Л.С. Лавренчук, А.А. Ермошин // под ред. Е.В. Березиной. Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та. - 2019. -107 с.

18. Мазурин, Е.С. Контроль достоверности результатов фитосанитарной экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики / Е.С. Мазурин, М.Б. Копина, Н.А. Шероколава // Вестник РУДН. - 2012. - № 3. - С. 3138.

19. Машковский, М. Словарь справочник лекарственных препаратов / М. Машковский, С. Южаков // М.: Рипол Классик. - 2005. - 640 с.

20. Мельников, Н.Н. Пестициды. Химия, технология и применение / Н.Н. Мельников // М.: Химия. - 1987. - 712 с.

21. МР 67-2015 ВНИИКР (вторая редакция). Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax сШиШ (Schaad et а1.). - 2018.

22. МР 67-2015 ВНИИКР. Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax а^иШ (Shaad et а1.). - 2015.

23. МР 67-2015 ВНИИКР (третья редакция). Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax а^иШ (Schaad et a1.). - 2020.

24. Павлюшин, В.А. Фитосанитарная безопасность агроэкосистем / В.А. Павлюшин // Вторая Всероссийская научная конференция с международным участием «Применение средств дистанционного зондирования земли в сельском хозяйстве», 26-28 сентября 2018, Санкт-Петербург. - 2018. - С. 45-51.

25. Резолюция, принятая Генеральной Ассамблеей 25 сентября 2015 года. Семидесятая сессия. Пункты 15 и 116 повестки дня (А/70^.1). Организация Объединенных Наций [Электронный ресурс] / Режим доступа: https: //www.ua org/ga/search/view_doc.asp?symbo1=A/RES/70/1 &Lang=R (дата обращения: 05.03.2020).

26. Словарева, О.Ю. Изоляция культуры Acidovorax citrulli из семян тыквенных культур / О.Ю. Словарева, К.П. Корнев // Карантин растений. Наука и практика. - 2019. - № 3 (29). - С. 9-16.

27. Словарева, О.Ю. Использование методов биоинформатики в создании нового ПЦР-теста для диагностики возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli / О.Ю. Словарева, Е.В. Старикова // Сборник тезисов докладов 20-й Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева, 27-29 октября 2020, Москва. - 2020. - С. 29-30.

28. Словарева, О.Ю. Оптимизация методов обнаружения и идентификации Acidovorax citrulli (Schaad et al.), возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур» / О.Ю. Словарева, К.П. Корнев // Материалы конференции: «Эпидемии болезней растений: мониторинг, прогноз, контроль», 13-17 ноября 2017, Большие Вязёмы, Московская область. - 2017. - С. 294-301.

29. Словарева, О.Ю. Оценка аналитической специфичности молекулярно-генетических методов идентификации Acidovorax citrulli. / О.Ю. Словарева, К.П. Корнев // Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. - 2020. - № 51. - С. 25-45.

30. Словарева, О.Ю. Старикова Е.В. Новый ПЦР-тест в режиме «реального времени» для Acidovorax citrulli, основанный на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS / О.Ю. Словарева, Е.В. Старикова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2021. - № 39(2). - С. 46-50.

31. Словарева, О.Ю. Разработка селективной питательной среды для изоляции культуры Acidovorax citrulli (Schaad et al.) / О.Ю. Словарева, К.П. Корнев // Сборник тезисов докладов IV Всероссийского съезда по защите растений, 9-11 сентября 2019, Санкт-Петербург. - 2019. - C. 210.

32. Словарева, О.Ю. Рекомендуемый порядок проведения диагностики Acidovorax citrulli в семенах / О.Ю. Словарева, К.П. Корнев // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные подходы и методы в защите растений», 12-14 ноября 2018, Екатеринбург (электронная версия). - 2018. - С. 86-88.

33. Словарь медицинских препаратов [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://med.niv.ru/doc/dictionary/medications/articles/5785/penicillin-g-natrievaya-sol-.htm.

34. Смиряев, А.В. Генетика популяций и количественных признаков / А.В. Смиряев, А.В. Кильчевский. - М.: КолосС, 2007. - 272 с.

35. Таможенная статистика ВЭД России. [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://statimex.ru/statistic.

36. Теддер, Дж. Промышленная органическая химия / Дж. Теддер, А. Нехватал, А. Джубб // Перевод с англ. Г.Я. Легина. Под ред. О.В. Корсунского. -М.: Мир. - 1977. - 704 с.

37. Указ президента Российской Федерации № 20 «Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» от 21 января 2020 года. [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://kremlin.ru/acts/news/62627. (дата обращения: 05.03.2020).

38. ФАОСТАТ. [Электронный ресурс] / FAO. - Режим доступа: http: //www. fao. org/fao stat/ru/#data/QC.

39. Федеральная государственная информационная система Аргус-Фито. [Электронный ресурс] / Режим доступа: https://argusfito.fitorf.ru/.

40. Федеральная служба государственной статистики. [Электронный ресурс] / Режим доступа: https://rosstat.gov.ru.

41. Фирсов, Н.Н. Микробиология: словарь терминов / Н.Н. Фирсов // М.: Дрофа. - 2006. - 256 с.

42. Фрумкин, Б.Е. Аграрная политика / Б.Е. Фрумкин // Большая российская энциклопедия (электронная версия 2016). [Электронный ресурс] / Режим доступа: https://bigenc.ru/economics/text/4128270 (дата обращения: 05.03.2020).

43. Шнейдер, Е.Ю. Анализ фитосанитарного риска возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Shaad et al.) для территории Российской Федерации / Е.Ю. Шнейдер, Е.В. Каримова // под ред. Т.В. Артемьевой; п. Быково: ФГБУ «ВНИИКР». - 2013. - 110 c.

44. Шнейдер, Е.Ю. Разработка новых и оптимизация существующих методов диагностики возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Shaad et al.) / Е.Ю. Шнейдер, Е.В. Каримова, Е.С. Мазурин // под ред. Т.В. Артемьевой; п. Быково: ФГБУ «ВНИИКР». - 2015. - 67 c.

45. Abedon, S.T. Bacteriophage plaques: theory and analysis / S.T. Abedon, J. Yin // Methods Mol Biol. - 2009. - Vol. 501. - Pp. 161-74.

46. Adhikari, M. Biological control of bacterial fruit blotch of watermelon pathogen (Acidovorax citrulli) with rhizosphere associated bacteria / M. Adhikari, D.R. Yadav, S.W. Kim, Y.H. Um, H.S. Kim, S.C. Lee, J.Y. Song, H.G. Kim, Y.S. Lee // Plant Pathol. J. - 2017. - Vol. 33. - P. 170.

47. Altman, F.P. Tetrazolium salts and formazans / F.P. Altman // Prog Histochem Cytochem. - 1976. - Vol. 9. - № 3. - Pp. 1-56.

48. Bahar, O. Bacterial fruit blotch of melon: screens for disease tolerance and role of seed transmission in pathogenicity / O. Bahar, G. Kritzman, S. Burdman // Eur. J. Plant Pathol. - 2009. - Vol. 123. - Pp 71-83.

49. Bahar, O. Bacterial fruit blotch: a threat to the cucurbit industry / O. Bahar, S. Burdman // Isr. J. Plant Sci. - 2010. - Vol. 58. - Pp. 19-31.

50. Bahar, O. New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli / O. Bahar, M. Efrat, E. Hadar, B. Dutta, R. Walcott, S. Burdman // Plant Pathol. - 2008. - Vol. 57. - Pp. 754-763.

51. Bahar, O. Type IV pili are required for virulence, twitching motility, and biofilm formation of Acidovorax avenae subsp. citrulli / O. Bahar, T. Goffer, S. Burdman // MPMI. - 2009. - Vol. 22. - № 8. - Pp. 909-920.

52. Black, M.C. First report of bacterial fruit blotch of watermelon in Texas / M.C. Black, T. Isakeit, L.W. Barnes // Plant Dis. - 1994. - Vol. 78. - P. 831.

53. Boykin, L.M. Tree lab: Portable genomics for early detection of plant viruses and pests in Sub-Saharan Africa / L.M. Boykin, P. Sseruwagi, T. Alicai, E. Ateka, I.U. Mohammed, J.L. Stanton, C. Kayuki, D. Mark, T. Fute, J. Erasto, H. Bachwenkizi, B. Muga, N. Mumo, J. Mwangi, P. Abidrabo, G. Okao-Okuja, G. Omuut, J. Akol, H.B. Apio, F. Osingada, M.A. Kehoe, D. Eccles, A. Savill, S. Lamb, T. Kinene, C.B. Rawle,

A. Muralidhar, K. Mayall, F. Tairo, J. Ndunguru // Genes. - 2019. - Vol. 10 (9). - № 632. - Pp. 1-13.

54. Burdman, S. Acidovorax citrulli: Generating basic and applied knowledge to tackle a global threat to the cucurbit industry / S. Burdman, R. Walcott // Mol. Plant Pathol. - 2012. Vol. 13. - Pp. 805-815.

55. Burdman, S. Molecular, physiological, and host-range characterization of Acidovorax avenae subsp. citrulli isolates from watermelon and melon in Israel / S. Burdman, N. Kots, G. Kritzman, J. Kopelowitz // Plant Dis. - 2005. - Vol. 89. - Pp. 1339-1347.

56. Cai, L. Magnesium oxide nanoparticles: Effective agricultural antibacterial agent against Ralstonia solanacearum / L. Cai, J. Chen, Z. Liu, H. Wang, H. Yang, W. Ding // Frontiers in Microbiology. - 2018. - Vol. 9. - № 790. - Pp 1-19.

57. Carvalho, F.C. Selection of watermelon genotypes for resistance to bacterial fruit blotch / F.C. Carvalho, L.A. Santos, R.C. Dias, R.L. Mariano, E.B. Souza // Euphytica. - 2013. - Vol. 190. - Pp. 169-180.

58. Cho, M.S. Rapid and specific detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli using SYBR green-based real-time PCR amplification of the YD-repeat protein gene / M.S. Cho, D.H. Park, T.-Y. Ahn, D.S. Park // J. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - Vol. 25. - Pp. 1401-1409.

59. Choi, O. Two genetically distinct groups of Acidovorax citrulli are present in watermelon-growing fields in Korea / O. Choi, S.K. Cho, B. Kang, J. Cho, J. Park, Y. Lee, J. Kim // J. Agric. Life Sci. - 2016. - Vol. 50. - Pp. 53-59.

60. Copeland, A. Complete sequence of Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1 / A. Copeland, S. Lucas, A. Lapidus, K. Barry, J. Detter, T. Glavina del Rio, E. Dalin, H. Tice, S. Pitluck, H. Kiss // US DOE Joint Genome Institute: Walnut Creek, CA, USA. - 2006.

61. Crall, J.M. Bacterial fruit rot of watermelon in Florida / J.M. Crall, N.C. Schenck // Plant Dis. - 1969. - Vol. 53. - Pp. 74-75.

62. Cunty, A. First report of Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch, on melon (Cucumis melo) in Guadeloupe (France) / A. Cunty, C. Audusseau, S. Paillard, V. Olivier // Plant Disease. - 2018. - Vol. 103. - № 5. - P. 1017

63. Davidson, A.L. Structure, function, and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems / A.L. Davidson, E. Dassa, C. Orelle, J. Chen // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2008. - Vol. 72. - Pp. 317-364.

64. De Buck, E. The importance of the twin-arginine translocation pathway for bacterial virulence / E. De Buck, E. Lammertyn, J. Anne // Trends Microbiol. - 2008. -Vol. 16. - Pp. 442-453.

65. De Melo, E.A. Efficacy of yeast in the biocontrol of bacterial fruit blotch in melon plants / E.A. De Melo, R.M. Rosa de Lima, D. Laranjeira, L.A. dos Santos, L. de Omena Gusmao, E.B. de Souza // Trop. Plant Pathol. - 2015. - Vol. 40. - Pp. 56-64.

66. Deng, W.L. First report of Acidovorax avenae subsp. citrulli as the causal agent of bacterial leaf blight of betelvine in Taiwan / W.L. Deng, T.C. Huang, Y.C. Tsai // Plant Dis. - 2010. - Vol. 94 (8). - P. 1065.

67. Dutta, B. Acidovorax citrulli seed inoculum load affects seedling transmission and spread of bacterial fruit blotch of watermelon under greenhouse conditions / B. Dutta, H. Scherm, R.D. Gitaitis, R.R. Walcott // Plant Dis. - 2012. - Vol. 96. - № 5. -Pp. 705-711.

68. Eckshtain-Levi, N. Insights from the genome sequence of Acidovorax citrulli M6, a group I strain of the causal agent of bacterial fruit blotch of cucurbits / N. Eckshtain-Levi, D. Shkedy, M. Gershovits, G.M. Da Silva, D. Tamir-Ariel, R. Walcott, T. Pupko, S. Burdman // Front. Microbiol. - 2016. - Vol. 7. - № 430. - Pp. 1-12.

69. EPPO. Acidovorax citrulli [Electronic resource]. Available at https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC.

70. EPPO. Acidovorax citrulli Categorization [Electronic resource]. Available at https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC/categorization.

71. EPPO. Acidovorax citrulli Distribution [Electronic resource]. Available at https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC/distribution.

72. Evans, T.A. First report of watermelon fruit blotch in Delaware / T.A. Evans, R.P. Mulrooney // Plant Dis. - 1991. - Vol. 75. - P. 1074.

73. Feng, J. Evalution of seed treatments for the eradication of Acidovorax avenae subsp. citrulli from melon and watermelon seeds / J. Feng, J. Li, P. Randhawa, M. Bonde, N.W. Schaad // Canadian Journal of Plant Pathology. - 2009. - Vol. 31. -Pp. 180-185.

74. Feng, J.J. Advances in detection of Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch of cucurbits / J.J. Feng, J.Q. Li, R.R. Walcott, G.M. Zhang, L.X. Luo, L. Kang, Y. Zheng, N.W. Schaad // Seed Sci. Technol. - 2013. - Vol. 41. - Pp. 115.

75. Fessehaie, A. Biological control to protect watermelon blossoms and seed from infection by Acidovorax avenae subsp. citrulli / A. Fessehaie, R. R. Walcott // Biological Control. - 2005. - Vol. 95. - № 4. - Pp. 413-419.

76. Giovanardi, D. Factors influencing the detection of Acidovorax citrulli in naturally contaminated cucurbitaceous seeds by PCR-based assays / D. Giovanardi, S.A. Sutton, E. Stefani, R.R. Walcott // Seed Sci. Technol. - 2018. - Vol. 46. - Pp. 93106.

77. Glinushkin, A.P. Bacterial diseases of wheat in the Southern Ural: manifestations, biological characteristics and monitoring features / A.P. Glinushkin, O.O. Beloshapkina, A.A. Solovykh, G. V. Sudarenkov, J. Molnar // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. - 2016. - Vol. 51 (1). - Pp. 57-67.

78. Global Information Services for Seed Professionals [Electronic resource]. Available at https://www.seedquest.com.

79. Goth, R.W. Resistance of commercial watermelon (Citrullus lanatus) to Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli / R.W. Goth, R.E. Web // Plant Dis. -1981. - Vol. 65. - Pp. 671-672.

80. Grubben, G.J.H. Plant resources for tropical Africa. Vegetables / G.J.H. Grubben, O.A. Denton // N.L. Wageningen, N.L. Leiden // Backhuys Publishers. -2004. - 668 Pp.

81. Gurlebeck, D. Type III effector proteins from the plant pathogen Xanthomonas and their role in the interaction with the host plant / D. Gurlebeck, F. Thieme, U. Bonas // J Plant Physiol. - 2006. - Vol. 163 (3). - Pp. 233-255.

82. Gurlebeck, D. Visualization of novel virulence activities of the Xanthomonas type III effectors AvrBsl, AvrBs3 and AvrBs4 / D. Gurlebeck, S. Jahn, N. Gurlebeck, R. Szczesny, B. Szurek, S. Hahn, G. Hause, U. Bonas // Mol. Plant Pathol. - 2009. -Vol. 10 (2). - Pp. 172-188.

83. Hopkins, D.L. Differences in cultivar resistance to bacterial fruit blotch of watermelon / D.L. Hopkins // Phytopathology. - 1990. - Vol. 80. - P. 435.

84. Hopkins, D.L. Evaluation of Citrullus sp. germplasm for resistance to Acidovorax avenae subsp. citrulli / D.L. Hopkins, C.M. Thompson // Plant Dis. - 2002. - Vol. 86. - Pp. 61-64.

85. Hopkins, D.L. Wet seed treatment with peroxyacetic acid for the control of bacterial fruit blotch and other seedborne diseases of watermelon / D.L. Hopkins, C.M. Thompson, J. Hilgren, B. Lovic // Plant Dis. - 2003. - Vol. 87. - Pp. 1495-1499.

86. Hopkins, D.L. Wet seed treatments for the control of bacterial fruit blotch of watermelon / D.L. Hopkins, J.D. Cucuzza, J.C. Watterson // Plant Dis. - 1996. - Vol. 80. - Pp. 529-532.

87. Hu F.-P. Numerical analysis and determinative tests for nonfluorescent plant-pathogenic Pseudomonas spp. and genomic analysis and reclassification of species related to Pseudomonas avenae Manns 1909 / F.-P. Hu, J.M. Young, C.M. Triggs // International Journal of Systematic Bacteriology. - 1991. - Vol. 41. - № 4. - Pp. 516525.

88. Isakeit, T. First report of infection of honeydew with Acidovorax avenae subsp. citrulli / T. Isakeit, M.C. Black, L.W. Barnes, J.B. Jones // Plant Dis. - 1997. -Vol. 81. - P. 694.

89. Isakeit, T. Natural infection of citronmelon with Acidovorax avenae subsp. citrulli / T. Isakeit, M.C. Black, J.B. Jones // Plant Dis. - 1998. - Vol. 82. - Pp. 351351.

90. Islam, M.R. Development of molecular markers for detection of Acidovorax citrulli strains causing bacterial fruit blotch disease in melon / M.R. Islam, M.R. Hossain, H.T. Kim, D.M.I. Jesse, M. Abuyusuf, H.J. Jong, J.I. Park, I.S. Nou // Int. J. Mol. Sci. - 2019. - Vol. 20 (11). - № 2715. - Pp. 1-16.

91. Johnson, K. L. Efficacy of a nonpathogenic Acidovorax citrulli strain as a biocontrol seed treatment for bacterial fruit blotch of cucurbits / K. L. Johnson, G. V. Minsavage, T. Le, J. B. Jones, R. R. Walcott // Plant Dis. - 2011. - Vol. 95. - Pp. 697704.

92. Kan, Y. Induction and resuscitation of the viable but non-culturable (VBNC) state in Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch of cucurbitaceous crops / Y. Kan, N. Jiang, X. Xu, Q. Lyu, V. Gopalakrishnan, R. Walcott, S. Burdman, J. Li, L. Luo // Front. Microbiol. - 2019. - Vol. 10. - № 1081. - Pp. 1-13.

93. King, E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E.O. King, M.K. Ward, D.E. Raney // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. - 1954. - Vol. 44. - Pp. 301-307.

94. Kruse, A. Lessons from one fastidious bacterium to another: What can we learn about Liberibacter species from Xylella fastidiosa / A. Kruse, L.A. Fleites, M. Heck // Insects. - 2019. - Vol. 10 (9). - № 300. - Pp. 1-23.

95. Kuo, S.-Y. Production of fluorescent antibody-labeling proteins in plants using a viral vector and the application in the detection of Acidovorax citrulli and Bamboo mosaic virus / S.-Y. Kuo, Y.-C. Lin, Y.-C. Lai, J.-T. Liao, Y.-H. Hsu, H.-C. Huang // PLoS ONE. - 2018. - Vol. 13 (2). - № 0192455. - Pp. 1-22.

96. Latin, R.X. Bacterial fruit blotch of watermelon in Indiana / R.X. Latin, K.K. Rane // Plant Dis. - 1990. - Vol. 74. - P. 331.

97. Latin, R.X. Bacterial fruit blotch of watermelon: the hypothetical exam question becomes reality / R.X. Latin, D.L. Hopkins // Plant Dis. - 1995. - Vol. 79. -Pp. 761-765.

98. Lee, H. Non-destructive evaluation of bacteria-infected watermelon seeds using visible/near-infrared hyperspectral imaging / H. Lee, M.S. Kim, Y.R. Song, C.S.

Oh, H.S. Lim, W.H. Lee, J.S. Kang, B.K. Cho // Journal of the Science of Food and Agriculture. - 2017. - Vol. 97 (4). - Pp. 1084-1092.

99. Luo, J. Identification of pathogenicity-related genes in biofilm-defective Acidovorax citrulli by transposon Tn5 mutagenesis / J. Luo, W. Qiu, L. Chen, S.I. Anjum, M. Yu, C. Shan, M. Ilyas, B. Li, Y. Wang, G. Sun // Int. J. Mol. Sci. - 2015. -Vol. 16. - Pp. 28050-28062.

100. Martin, H. First report of Acidovorax avenae subsp. citrulli as a pathogen of Gramma in Australia / H. Martin, C. Horlock // Plant Dis. - 2002. - Vol. 86. - P. 1406.

101. Martin, H. First report of Acidovorax avenae subsp. citrulli as a pathogen of cucumber / H. Martin, R. O'Brien, D. Abbott // Plant Dis. - 1999. - Vol. 83. - P. 965.

102. Martin, R.R. Quarantine regulations and the impact of modern detection methods / R.R. Martin, F. Constable, I.E. Tzanetakis // Annu. Rev. Phytopathol. - 2016.

- Vol. 54. - Pp. 189-205.

103. Masum, M.M.I. Biogenic synthesis of silver nanoparticles using phyllanthus emblica fruit extract and its inhibitory action against the pathogen Acidovorax oryzae strain RS-2 of rice bacterial brown stripe / M.M.I. Masum, M.M. Siddiqa, K.A. Ali, Y. Zhang, Y. Abdallah, E. Ibrahim, W. Qiu, C. Yan, B. Li // Frontiers in Microbiology. -2019. - Vol. 10. - № 820. - Pp. 1-18.

104. Medhaug, I. Reconciling controversies about the 'global warming hiatus' / I. Medhaug, M. Stolpe, E. Fischer // Nature. - 2017. - Vol. 545. - Pp. 41-47.

105. Melo, L.A. Comparing Acidovorax citrulli strains from melon and watermelon: Phenotypic characteristics, pathogenicity and genetic diversity / L.A. Melo, N.D. Tebaldi, A. Mehta, A.S.A. Marques // Trop. Plant Pathol. - 2014. - Vol. 39.

- Pp. 154-162.

106. Mudgett, M.B. New insights to the function of phytopathogenic bacterial type III effectors in plants / M.B. Mudgett // Annu Rev Plant Biol. - 2005. - Vol. 56. -Pp. 509-531.

107. NCBI. Basic Local Alignment Search Tool [Electronic resource]. Available at https://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

108. Nebert, D.W. Aryl hydrocarbon receptor (AHR): "pioneer member" of the basic-helix/loop/helix per-Arnt-sim (bHLH/PAS) family of "sensors" of foreign and endogenous signals / D.W. Nebert // Prog Lipid Res. - 2017. - Vol. 67. - Pp. 38-57.

109. Park, H.-J. Complete genome sequence of Acidovorax citrulli strain KACC17005, a causal agent for bacterial fruit blotch on watermelon / H.-J. Park, H.J. Seong, W.J. Sul, C.-S. Oh, S.-W. Han // J. Microbiol. - 2017. - Vol. 53. - Pp. 340-341.

110. PM 7/127 (1) Acidovorax citrulli // EPPO Bulletin. - 2016. - № 46 (3). - Pp. 444-462.

111. PM 7/76 (5) Use of EPPO diagnostic standards // EPPO Bulletin. - 2018. -№ 48 (3). - Pp. 373-377.

112. PM 7/98 (3) Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity // EPPO Bulletin. - 2018. - № 48 (3). - Pp. 387-404.

113. Popovic T. Occurrence of Acidovorax citrulli causing bacterial fruit blotch of watermelon in Serbia / T. Popovic, Z. Ivanovic // Plant Disease. - 2015. - Vol. 99 (6). -P. 886.

114. Rahimi-Midani, A. First isolation and molecular characterization of bacteriophages infecting Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch / A. Rahimi-Midani, Y.S. Lee, S.-W. Kang, M.-K. Kim, T.-J. Choi // Plant Pathol. -2018. - Vol. 34 (1). - Pp. 59-64.

115. Ren, Z.G. Screening of the pathogenicity mutants of Acidovorax avenae subsp. citrulli and cloning of the hrcR gene // Z.G. Ren, L. Hou, Z.G. Song, L.Q. Zhang // Acta Phytopathol. Sin. - 2009. - Vol. 39. - Pp. 501-506.

116. Ren, Z.G., Multiplication of Acidovorax citrulli in planta during infection of melon seedlings requires the ability to synthesize leucine / Z.G. Ren, W.J. Jiang, X.Y. Ni, M. Lin, W. Zhang, G.Z. Tian // Plant Pathol. - 2014. - Vol. 63. - Pp. 784-791.

117. Schaad, N.W. Emergence of Acidovorax avenae subsp. citrulli as a crop threatening disease of watermelon and melon / N.W. Schaad, E. Postnikova, P.S. Randhawa // Pseudomonas syringae and related pathogens. - N.S. Iacobellis, A. Collmer, S.W. Hutcheson, J.W. Mansfield, C.E. Morris, J. Murillo, N.W. Schaad, D.E.

Stead, G. Surico, M.S. Ullrich (editors). - Kluwer Academic Publishers. - 2003. - 573581.

118. Schaad, N.W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, third edition / N.W. Schaad // N.W. Schaad, J.B. Jones, W. Chun (editors). -St. Paul, USA: American Phytopathological Society Press. - 2001. - 373 P.

119. Schaad, N.W. PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies of Acidovorax / N.W. Schaad, W.Y. Song, E. Hatziloukas // US Patent. -2000. - 6,146,834.

120. Schaad, N.W. Pseudomonas pseudoalcalignes subsp. citrulli / N.W. Schaad, G.Jr. Sowell, R.W Goth, R.R. Colwell, R.E. Webb // International Journal of Systematic Bacteriology. - 1978. - Vol. 28 (1). - Pp. 117-125.

121. Schaad, N.W. Reclassification of subspecies of Acidovorax avenae as A. avenae (Manns 1905) emend., A. cattleyae (Pavarino, 1911) comb. nov., A. citrulli (Schaad et al., 1978) comb. nov., and proposal of A. oryzae sp. nov. / N.W. Schaad, E. Postnikova, A. Sechler, L.E. Claflin, A.K. Vidaver, J.B. Jones, I. Agarkova, A. Ignatov, E. Dickstein, B.A. Ramundo // Syst. Appl. Microbiol. - 2008. - Vol. 31. - Pp. 434-446.

122. Shavit, R. The vap B-vap C operon of Acidovorax citrulli functions as a bona-fide toxin-antitoxin module / R. Shavit, M. Lebendiker, Z. Pasternak, S. Burdman, Y. Helman // Front. Microbiol. - 2016. - Vol. 6. - № 1499. - Pp. 1-12.

123. Shirakawa, T. Population dynamics of Acidovorax avenae subsp. citrulli on infested seeds and on subsequent seedlings of watermelon // T. Shirakawa, Y. Komiya, K. Abiko // Japanese Journal of Phytopathology. - 2003. - Vol. 69. - Pp. 102-106.

124. Shneider, Y.A. Method for selection of new primers for identification of the especially dangerous bacterium Acidovorax citrulli / Y.A. Shneider, E.V. Karimova, I.P. Smirnova // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2018. - Pp. 1-4.

125. Silva, G.M. Strains of the group I lineage of Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch of cucurbitaceous crops, are predominant in Brazil / G.M. Silva, R.M. Souza, L. Yan, R.S. Júnior, F.H. Medeiros, R.R. Walcott // Phytopathology. - 2016. - Vol. 106. - Pp. 1486-1494.

126. Slovareva, O.Y. Detection and identification of pathogens of bacterial diseases of wheat and barley in the Russian Federation / O.Y. Slovareva // MIR J. -2020. - Vol. 7 (1). - Pp. 13-23.

127. Slovareva, O.Y. Obtaining a fast and reliable diagnostic result of Acidovorax citrulli with the sample enrichment method / O.Y. Slovareva, K.P. Kornev, G.N. Bondarenko // In: Bogoviz A.V. (eds) The Challenge of Sustainability in Agricultural Systems. Lecture Notes in Networks and Systems. - Springer, Cham. - 2021. - Vol. 206. - Pp. 743-751.

128. Slovareva, O.Y. Recommended procedure for detection and identification Acidovorax citrulli in seeds / O.Y. Slovareva, K.P. Kornev, G.N. Matyashova, A.A. Stakheev, S.I. Prikhodko // AIP Conference Proceedings. - 2019. - Vol. 2063. - № 030020. - Pp. 1-5.

129. Somodi, G.C. Occurrence of a bacterial watermelon fruit blotch in Florida / G.C. Somodi, J.B. Jones, D.L. Hopkins, R.E. Stall, T.A. Kucharek, N.C. Hodge, J.C. Watterson // Plant Dis. - 1991. - Vol. 75. - Pp. 1053-1056.

130. Song, J.Y. Analysis of intraspecific genetic diversity in Acidovorax citrulli causing bacterial fruit blotch on cucurbits in Korea / J.Y. Song, M.M. Oo, S.Y. Park, M.W. Seo, S.-C. Lee, N.B. Jeon, M.H. Nam, Y.S. Lee, H.G. Kim, S.-K. Oh // Korean J. Agric. Sci. - 2018. - Vol. 45. - Pp. 575-582.

131. Song, J.Y. Genetic characteristics of Acidovorax citrulli population causing bacterial fruit blotch against cucurbits in Korea / J.Y. Song, S.Y. Park, M.W. Seo, M.H. Nam, H.S. Lim, S.-C. Lee, Y.S. Lee, H.G. Kim // Plant Dis. - 2015. - Vol. 21. - Pp. 82-88.

132. Sowell, G. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli on watermelon-seed transmission and resistance of plant introductions / G. Sowell, N.W. Schaad // Plant Dis. - 1979. - Vol. 63. - Pp. 437-441.

133. Sun, Q. Global heat stress on health, wildfires, and agricultural crops under different levels of climate warming / Q. Sun, C. Miao, M. Hanel, A.G.L. Borthwick, Q. Duan, D. Ji, H. Li // Environment International. - 2019. - Vol. 128. - Pp. 125-136.

134. Tanaka, K.J. Selective substrate uptake: The role of ATP-binding cassette (ABC) importers in pathogenesis / K.J. Tanaka, S. Song, K. Mason, H.W. Pinkett // Biochim. Biophys. Acta (BBA) Biomembr. - 2018. - Vol. 1860. - Pp. 868-877.

135. Walcott, R. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon seed using immunomagnetic separation and the polymerase chain reaction / R. Walcott, R. Gitaitis // Plant Dis. - 2000. - Vol. 84. - Pp. 470-474.

136. Walcott, R. Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp. citrulli / R. Walcott, R. Gitaitis, A. Castro // Phytopathology. - 2003. -Vol. 93. - Pp. 528-534.

137. Walcott, R.R. Chapter 26: Detection of Acidovorax citrulli in cucurbit seeds / R.R. Walcott, J. Feng, R.D. Gitaitis // Detection of plant-pathogenic bacteria in seed and other planting material, second edition; M. Fatmi, R.R. Walcott, N.W. Schaad (editors). - 2016. - Pp. 179-187.

138. Walcott, R.R. Investigating intraspecific variation of Acidovorax avenae subsp. citrulli using DNA fingerprinting and whole cell fatty acid analysis / R.R. Walcott, D.B.Jr. Langston, F.H.Jr. Sanders, R.D. Gitaitis // Phytopathology. - 2000. -Vol. 90. - Pp. 191-196.

139. Walcott, R.R., Differences in pathogenicity between two genetically distinct groups of Acidovorax avenae subsp. citrulli on cucurbit hosts / R.R. Walcott, A. Fessehaie, A.C. Castro // Phytopathology. - 2004. - Vol. 152. - Pp. 277-285.

140. Walcott, R.R., Progress towards a commercial PCR-based assay for Acidovorax avenae subsp. citrulli / R.R. Walcott, A.C. Castro, A. Fessehaie, K. Ling // Seed Sci. Technol. - 2006. - Vol. 34. - Pp. 101-116.

141. Wall, G.C. A new bacterial disease on watermelon in the Mariana Islands / G.C. Wall, V.M. Santos // Phytopathology. - 1988. - Vol. 78. - № 1605. - Pp. 1-9.

142. Wang, T. Genome sequence of a copper-resistant strain of Acidovorax citrulli causing bacterial fruit blotch of melons / T. Wang, Y. Yang, T. Zhao // Genome Announc. - 2015. - Vol. 3. - Pp. 310-315.

143. Wang, T. Genome sequence of Acidovorax citrulli group 1 strain pslb65 causing bacterial fruit blotch of melons / T. Wang, B. Sun, Y. Yang, T. Zhao // Genome Announc. - 2015. - Vol. 3. - Pp. 315-327.

144. Wang, T. Quorum-sensing contributes to virulence, twitching motility, seed attachment and biofilm formation in the wild type strain Aac-5 of Acidovorax citrulli // T. Wang, W. Guan, Q. Huang, Y. Yang, W. Yan, B. Sun, T. Zhao // Microbial Pathogenesis. - 2006. - Vol. 100. - Pp. 133-140.

145. Webb, R.E. A seed-borne bacterium isolated from watermelon / R.E. Webb, R.W. Goth // Plant Dis. Report. - 1965. - Vol. 49. - Pp. 818-821.

146. Wechter, W.P. Identification of resistance to Acidovorax avenae subsp. citrulli among melon (Cucumis spp.) plant introductions / W.P. Wechter, A. Levi, K.-S. Ling, C. Kousik, C.C. Block // HortScience. - 2011. - Vol. 46. - Pp. 207-212.

147. Willems, A. Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov., comb. nov., Acidovorax avenae subsp. citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae, and Acidovorax konjaci / A. Willems, M. Goor, S. Thielemans, M. Gillis, K. Kersters, J. De Ley // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1992. - Vol. 42. - Pp. 107-119.

148. Xinyue, B. Development of a multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of Cucumber green mottle mosaic virus and Acidovorax citrulli in watermelon / B. Xinyue, L. Xiaodong, Y. Haibo, A. Mengnan, L. Rui, X. Zihao, W. Yuanhua // PeerJ. - 2019. - Vol. 7, № 7539. - Pp. 1-17.

149. Yan, L. Further evidence of cucurbit host specificity among Acidovorax citrulli groups based on a detached melon fruit pathogenicity assay / L. Yan, B. Hu, G. Chen, M. Zhao, R.R. Walcott // Phytopathology. - 2017. - Vol. 107. - Pp. 1305-1311.

150. Yan, L. Rapid and sensitive detection of Acidovorax citrulli in cucurbit seeds by visual loop-mediated isothermal amplification assay / L. Yan, Y. Zhao, J. Zhou, S. Chen, S. Bai, Y. Tian, W. Gong, B. Hu // Phytopathol. - 2019. - Vol. 167. -Pp. 10-18.

151. Yan, S. Genetic diversity analysis of Acidovorax citrulli in China / S. Yan, Y. Yang, T. Wang, T. Zhao, N.W. Schaad // Eur. J. Plant Pathol. - 2013. - Vol. 136. -Pp. 171-181.

152. Yan, W. Biological function analysis of hrcN gene of Acidovorax citrulli / W.R. Yan, T.L. Wang, Y.W. Yang, L.Y. Dai, T.C. Zhao // Acta Phytopathol. Sin. -2015. - Vol. 45. - Pp. 33-40.

153. Yang, R. Complete assembly of the genome of an Acidovorax citrulli strain reveals a naturally occurring plasmid in this species / R. Yang, D.S. Garcia, F. Pérez Montaño, G.M. da Silva, M. Zhao, I. Jiménez Guerrero, T. Rosenberg, G. Chen, I. Plaschkes, S. Morin, R. Walcott, S. Burdman // Front. Microbiol. - 2019. - Vol. 10. -№ 1400. - Pp. 1-17.

154. Zarco-Tejada, P.J. Previsual symptoms of Xylella fastidiosa infection revealed in spectral plant-trait alterations / P.J. Zarco-Tejada, C. Camino, P.S.A. Beck, R. Calderon, A. Hornero, R. Hernández-Clemente, T. Kattenborn, M. Montes-Borrego, L. Susca, M. Morelli, V. Gonzalez-Dugo, P.R.J. North, B.B. Landa, D. Boscia, M. Saponari, J.A. Navas-Cortes // Nature Plants. - 2018. - Vol. 4 (7). - Pp. 432-439.

155. Zhang, J. Rapid on-site detection of Acidovorax citrulli by cross-priming amplification / J. Zhang, Q. Tian, S.-F. Zhu, W.-J. Zhao, F.-Q. Liu // Mol. Cell. Probes. - 2012. - Vol. 26. - Pp. 175-176.

156. Zhang, X. Involvement of hrpX and hrpG in the virulence of Acidovorax citrulli strain Aac5, causal agent of bacterial fruit blotch in cucurbits / X. Zhang, M. Zhao, J. Yan, L. Yang, Y. Yang, W. Guan, R. Walcott, T. Zhao // Front. Microbiol. -2018. - Vol. 9. - № 507. - Pp. 1-12.

157. Zhong, J. Rapid discrimination between Groups I and II of Acidovorax citrulli using a primer pair specific to a pil L gene / J. Zhong, Z.-Y. Lin, Y.-M. Ma, B.D. Gao, H.-Q. Liu, T.-C. Zhao, N.W. Schaad // Phytopathol. - 2016. - Vol. 164. - Pp. 558-562.

158. Zivanovic, M. Further characterization of genetically distinct groups of Acidovorax citrulli strains / M. Zivanovic, R.R. Walcott // Phytopathology. - 2017. -Vol. 107 (1). - Pp. 29-35.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А - Тесты на основе ПЦР для выявления и идентификации

различных участков генома Acidovorax citrulli

Зонды, праймеры и их сочетания, а также последовательности нуклеотидов, 5Л-3Л Примечание (участок генома, размер ПЦР-продукта, источник и другое)

SEQ ID no. 3 (Aacf2): GGA AGA ATT CGG TGC TAC CC SEQ ID no. 4 (Aacr2): TCG TCA TTA CTG AAT TTC AAC A 16S-23S рДНК, 450 п.о., Schaad et al., 2000. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и чистой культуре

Acit F Contig 21: ACC GAA CAG AGA GTA ATT CTC AAA GAC Acit R Contig 21: GAG CGT GAT GGC CAA TGC Acit Contig 21 probe: FAM-CAT CGC TTG AGC AGC AA-MGB NFQ Контиг 21 АТФазы, Монсанто. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и чистой культуре

Acit F Contig 22: GAA AGT GGT TGT TCT GGT GAT CAA Acit R2 Contig 22: TTC GGA GGA CTC GGG ATT T Acit probe Contig 22: VIC-ATG GTC TGC GAG CCA G-MGB NFQ Контиг 22 некодируемого региона, Monsanto, Keygene. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и чистой культуре

Acit 1-F IS1002: GAG TCT CAC GAG GTT GTT Acit 1-RIS1002: GAC CCT ACG AAA GCT CAG Acit 1-probe IS1002: FAM-TGC AGC CCT TCA TTG ACG G-BHQ1 Элемент IS 1002 геномной последовательности штамма AAC00-1 (доступно в Генбанке под номером NC_008752), Woudt et al., 2009. Обнаружение и идентификация в экстракте семенного материала

AACF3 (SEQ ID 5): CCT CCA CCA ACC AAT ACG CT AACR2 (SEQ ID no. 4): TCG TCA TTA CTG AAT TTC AAC A AACP2: FAM-CGG TAG GGC GAA GAA ACC AAC ACC-BHQ1 16S-23S ITS, 246 п.о., Schaad et al., 2000; Feng et al., 2006; Zhao et al., 2009

AC-1 F: ATG GTG TGT TCT TCG GGA CC AC-1 R: ATC GGC GAT CTC TTC GTG TC Лейцин-богатый ингибитор повторных рибонуклеаз, 140 п.о., Shneider et al., 2018

AcM13 F: TCG CGG GCC GTG ATG TTC CG AcM13 R: TGG ACT TCG GGT GGG CCT TCA Участок с (+) 269247 по 269971 гликозилгидролазы, 724 п.о., Islam et al., 2019. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах дыни

AcM3S0 F: GCA TCC GGT GTG CTG CTG GA AcM3S0 R: GAG ATG TCA GAG TCG CAC GGT Участок с (+) 1911322 по 1912175 АТФ-связывающего белка, 853 п.о., Islam et al., 2019. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах дыни

AcM797 F: AAG GCG GAC ATG GGT TGG CT AcM797 R: CTG CGC CTG CGC CCA CAC CA Участок с (+) 271733 по 272671 транслокации сигнального пути твин-аргинин, 938 п.о., Islam et al., 2019. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах дыни

Ac33 F: F: TCG ATA AGG CCA CCA AGT TC Ac33 R: GAC TGG GGT AAC GTG GGG CT Участок с (-) 3879509 по 3880383 гипотетического белка фосфатазы, 874 п.о., Islam et al., 2019 Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах тыквенных культур

Ac1410 F: TAG CGC AGC CCC ACC CAG TG Ac1410 R: CAA GGG CGA CAA GAT GAT GT Участок с (+) 3120584 по 3121283 сахар-связывающего белка, 699 п.о., Islam et al., 2019. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах тыквенных культур

G2AcFwd: CGA TAG GGT TGG GTT CAA G G12AcRev: ACG TAC TGC CGA TTT TTG C TTSS штамма Aave_2166, 291 п.о., Zivanovic & Walcott, 2017. Идентификация штаммов группы II, чистые культуры

G12AcFwd: CCG AAG AGA TAA CAC TGC ATC G12AcRev: ACG TAC TGC CGA TTT TTG C TTSS штамма Aave 2166, 254 п.о. Идентификация штаммов групп I и II, чистые культуры

WFB 1: GAC CAG CCA CAC TGG GAC WFB 2: CTG CCG TAC TCC AGC GAT

Участок с 293 по 669 16S рРНК штамма AAC 94-85, 360 п.о., Walcott and Gitaitis, 2000

PL1: GTC CGA GCG TAC GTT GAG PL2: ACG GCA CCT GAC CCG TTG

Ген рИЬ штамма ААС00-1, 332 п.о., гИо^ й а1., 2016. Идентификация штаммов группы II, чистые культуры

AC158F: CTT GGT GCT CCA TGC TCG A AC158R: GGC TTG GTT GCG AAT TCA CT

Ген УЭ повторяющегося белка, 158 п.о., СИо й а1., 2015. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах тыквенных культур_

SEQ ID 4: GTC ATT ACT GAA TTT CAA CA SEQ ID 5: CCT CCA CCA ACC AAT ACG CT

168-238 рРНК, 246 п.о., 8сИааа й а1., 1999. Обнаружение и идентификация в симптоматическом растительном материале и плодах тыквенных культур

pilA-mut-F: GCG AAT TCG ATT ACA CCA AGA AAG CCA A

pilA-mut-R: GCG AAT TCA TTG CTA GCA GCA GTC ATG G

Внутренний фрагмент pilA, type IV Pili, 303 п.о., Bahar et al., 2009. Использовали для создания мутанта W1-A

pilA-comp-F: GCC GAA TTC CCC ATA GTG ATT AGG CAC CA

pilA-comp-R: GCC GGA TCC GCC GCT GAA CGC CGC CAT CC

Фрагмент рПА, 1134 п.о. ВаИаг et а1., 2009. Использовали для создания мутанта, комплементарного мутанту W1-A

pilT-mut-F: GCC GAA TTC TCG CGG CCA TGG TGA ACC ACC TCA ACG A

pilT-mut-R: GCC GGA TCC AGC ATG GCG CGC ACC ATT TCC TTT TCC T

Фрагмент pilT, 367 п.о., Bahar et al., 2009. Использовали для создания pilT-мутантов

pilT-comp-F: GCC GGA TCC TGT GTT GGG GGA TGG GTG AAC GG

pilT-comp-R: GCC TCT AGA TCC GGC CGC TGC TGC GAC AGG

Фрагмент рПТ, 1509 п.о., ВаИаг ег а1., 2009. Использовали для создания мутанта,

комплементарного мутанту рПТ

Iup-F: AAG CTT ACC AGT TCC GCC ACG GTC TGT CCA C

Idn-R: AAG CTT CAT TGG TGA TGA AGC ACT TG

Гены aacI и aacR штамма дикого типа Aac-5, 1897 п.о., Wang et al., 2015

Rup-F: GAA TTC AGA CGC TCT ACG GCA CGA TA Rdn-R:

AAGCTTACCAGTTCCGCCACGGTCTGTCCAC

Ген aacR, 1918 п.о., Wang et al., 2015

GmF: GGA TCC CGA CGC ACA CCG TGG AAA GmR: GTC GAC GCG GCG GTG ACA ATT T

Гены aacI и aacR, 855 п.о., Wang et al., 2015

aacI-F: AAG CTT TTG GGA GGT CGG TAC TGA G aacI-R: GTC GAC GCA GGA TTT TTC TGG CGA CCG TGG C

Ген aacI, 1207 п.о., Wang et al., 2015

aacR-F: AAG CTT GTA GGA AGG GCG GGG GGC aacR-R: GTC GAC GCG GGA TTG GCA TTG GGG G

Ген aacR, 1351 п.о., Wang et al., 2015

BX-L1: CAG CTG GGA GCG ATC TTC AT BX-S-R2: GCG TCA GGA GGG TGA GTA GCA

Фрагменты BOX, 279 п.о., Bahar et al., 2008

F3: TTG ATT CAC CGC CGA ACG

B3 : TTA CAG ACG ATA AAT GAC CCG G

Ген hrpG-hrpX, Oya et al., 2008

FIP: TAC GGC TGT CAC AGT CGT AGC TGA CTC GCA TGA TTT CCC CA

BIP: TTG CAC CTC ATT GCA AAT GCC CCG TCT GGA ATG AAC TAA GCT

Спейсерный регион (AY898625), Oya et al., 2008

HB2F2: CCT CCA GCT GCC CGT ATC HB2R2: CGG ACA CCC GGT ACA TCA GC

Ген hrpB2, 290 п.о., Tian et al., 2010

BOXAACF: GCG TAT GAG TCC CGA AGA AAT BOXAACR2: GCA TGC CTT GTA TTC AGC TAT AACPROBE: FAM-CCG AAA TCC GTA TTG GAC GGA TCG AA-BHQ1

ACCAPRWb: BIO-TEG-GGC GAA TTG CAC GGT CGG CCC CAG CCC TAC GGG GTT ATG GTG TAT GTC GCT ATG AAC TTG ATC

Фрагменты BOX, 480 п.о., Ha et al., 2009

HuiF: GTT GGA AGA ATT CGG TGC TAC C HuiR: ATT CGT CAT TAC TGA ATT TCA ACA AG HuiP: FAM-ACG CTC TGC GGT AGG GCG AAG AAA CC-TAMRA

Внутренний спейсерный регион, 448 п.о., Hui et al., 2007

hrpG-1F: CTA TGA CAT GAT TAC GAA TTC GAG CGT TTC GCC GGA CAT hrpG-1R: CAG GGT CTC AAC TGC CCA GGC GAC TCG CAT GAT TTC CCC A Участок, расположенный выше гена hrpG, 1185 п.о., Zhang et al., 2018

hrpG-2F: TGG GGA AAT CAT GCG AGT CGC CTG GGC AGT TGA GAC CCT G hrpG-2R: CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC GCG ACC TGG AAG AAC TGG AGC Участок, расположенный ниже гена hrpG, 1146 п.о., Zhang et al., 2018

hrpX-1F: CTA TGA CAT GAT TAC GAA TTC GCG ACA ACA TCC TGA CCT CC hrpX-1R: ACA GCT TGA AGG CAT TCG CCC GTT GGG AGG AGA GAG AAA G Участок, расположенный выше гена hrpX, 1514 п.о., Zhang et al., 2018

hrpX-2F: CTT TCT CTC TCC TCC CAA CGG GCG AAT GCC TTC AAG CTG T hrpX-2R: CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC TGG CCG TCA TCG ACA ACC T Участок, расположенный ниже гена hrpX, 1480 п.о., Zhang et al., 2018

RT-hrpG-F: GGG AGG CAT TCA AGC CAT CT RT-hrpG-F: AAC AGC AGC CAG GCG AGT T hrpG мРНК, 417 п.о., Zhang et al., 2018

RT-hrpX-F: GTC GCA CCC TGC TGC TGA TAG RT-hrpX-F: AGG CGT GGT CCG ACA GTT CTT hrpXмРНК, 411 п.о., Zhang et al., 2018

RT-2166-F: AGA ACT GCT GGA AGT GGA GA RT-2166-R: CAG GGC GAG ATT CAA AGA мРНК штаммаAac5_2166, 570 п.о., Zhang et al., 2018

RT-rpoB-F: GCG ACA GCG TGC TCA AAG TG RT-rpoB-R: GCC TTC GTT GGT GCG TTT CT Референсный ген, 104 п.о., Zhang et al., 2018

1132-2166F: CGC TCT AGA ACT AGT GGA TCC ATG AAG AAT TTC ATG CGA TC 1132-2166R: GGG CCC CCC CTC GAG GTC GAC TTC GAT AGC TTT TCT GAT TTT TC Эффектроный ген Aac5 2166, 1080 п.о., Zhang et al., 2018

Fragment 1 F: TGG AAA ACG GTC TCA AGA AG Fragment 1 R: GCG CTT CAC TAT CAC CAT CT Гипотетический белок Aave 0500 & Aave 0501, Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 2 F: TCG GAA AGT TCT TTT GAT CG Fragment 2_R: GAG GAA ACA TCC GAA CAA TG Главный координатор суперсемейного транспортера Aave_0700 & гипотетический белок Aave 0701, Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 3 F: CTC ATG CTG CGG ATA GAG AT Fragment 3_R: TCT CCC CAA TGT AGA GCT TG Фаговый белок HK97 Aave 1619, гипотетический белок Aave 1620 & Aave 1621,Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 4 F: GAA GAA GAA CCT TGC ACA GC Fragment 4 R: CAC GTA GTC GCG ATA ACT CC Гипотетический белок Aave 1760 Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 5 F: CTG ACG CTC ATC GAC ATC AC Fragment 5 R: GTT GAT CGC AAA TCC GTT G Гипотетический белок Aave 2369, Aave 2370 & Aave 2371, Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 6 F: CCG TTT TTG TTC TTG TCT TGA Fragment 6 R: CTA CGT CGA ATC GCA CAA C Гипотетический белок Aave 2759, Aave 2760 & Aave 2761, Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 7 F: AAG CTG CAG AAG TTC GTC AC Fragment 7 R: TCA TCG TTG CTT TCT GAA CA Фаговый белок Aave 2900, Eckshtain-Levi et al., 2014

Fragment 8 F: AGG AAA ACG TGA TCA AGC AG Fragment 8 R: TTT TCC TAC AAT GCG GAC AT Гипотетический белок Aave 4100, Eckshtain-Levi et al., 2014

Aave 2199 F: TAC ATG TAC CCG CAG AAC CA Aave 2199 R: GAA GTC CAC GTT CGG GTA GA gltA, ген домашнего хозяйства цитрат-синтазы Aave 2199, Eckshtain-Levi et al., 2014

WFB1F: GGG GCA CGC CAA CAT CCT WFB2R: CGC GCC GAC CGA GAC CTG TRAP-дикарбоксилатный транспортер, 232 п.о., Seminis, Inc.

RST49F: GAT GGC CGT GCC CTT CTT CAT CCT CG RST51R: CAT GGC CAC GGC GAT GAG GAT GC TRAP-дикарбоксилатный транспортер, 390 п.о., Minsavage et al., 1995

Приложение Б - Используемые штаммы из коллекции ВНИИКР

Название бактерии Субстрат № штамма

Arthrobacter castelli Solanum lycopersicum 0073

Arthrobacter sp. Citrullus lanatus 0341

Arthrobacter sp. Cucurbita pepo subsp. Ovifera 0342

Bacillus sp. Citrullus lanatus 0320

Burkholderia sp. Musa 0287

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Brassica oleracea 0049

Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis Solanum lycopersicum 0239

Enterobacter amnigenus Crataegus oxyacantha 0047

Erwinia billingiae Malus domestica 0044

Erwinia piriflorinigrans Pyrus communis 0109

Erwinia tasmaniensis Prunus persica 0078

Microbacterium phyllosphaerae Cucurbita pepo subsp. Ovifera 0340

Microbacterium sp. Zea mays 0300

Ochrobactrum anthropi Pyrus communis 0048

Ochrobactrum sp. Pyrus communis 0043

Pantoea sp. Glycine max 0409

Pantoea stewartii subsp. Stewartii Zea mays var. Rugose 0120

Pseudomonas nitritireducens Glycine max 0370

Pseudomonas putida Trifolium pratense 0033

Pseudomonas syringae pv. Prunus avium 0222

syrmgae

Rahnella aquantilis Rosa 0181

Ralstonia pseudosolanacearum Solanum tuberosum 0030

Sphingomonas paucimobilis Cucurbita pepo subsp. Ovifera 0339

Xanthomonas arboricola pv. Prunus domestica 0149

pruni

Xanthomonas campestris pv. Brassica oleracea 0226

campestris

Xanthomonas hortorum Pelargonium 0170

Xylella fastidiosa Olea europaea 0306

Xylophilus ampelinus Vitis vinifera 0050

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Solanum lycopersicum 0240

Clavibacter michiganensis subsp. Solanum tuberosum 0028, 0137, 0138, 0139, 0140,

Sepedonicus 0235, 0254, 0285, 0311, 0412

Curtobacterium flaccumfaciens Brassica oleracea 0045

pv. Flacumfaciens

Curtobacterium sp. Hordeum 0356

Triticum 0362

Dickeya sp. Solanum tuberosum 0322

Erwinia amylovora Malus domestica 0051, 0077, 0096, 0115, 0118,

0180, 0182, 0194, 0195, 0191,

0241, 0151, 0289, 0157, 0161,

0304, 0318

Pyrus communis 007б, 0068, 0103, 0114, 0150, 0319, 0253, 0095, 0158, 0163, 0178, 0186, 0193, 0224, 0244, 0208, 0255, 0288

Crataegus oxyacantha 0105, 0110, 0112, 0117, 0128, 0165, 0168, 0315

Cydonia oblonga 0126, 0156, 0164, 0167, 0305

Pyracantha 0173

Cotoneaster 0176, 0307

Chaenomeles japonica 0200

Erwinia piriflorinigrans Pyrus communis 0113

Microbacterium sp. Glycine max 0413

Ochrobactrum lupine Fabaceae 0350

Paenibacillus sp. Hordeum 0357

Pantoea agglomerans Zea mays 0298

Hordeum 0358

Pantoea ananatis Phaseolus 0398

Pantoea dispersa Glycine max 0409

Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays 0201, 0204, 0206, 0286, 0297

Pectobacterium atrosepticum Solanum tuberosum 0321

Phyllobacterium sp. Solanum tuberosum 0364

Pseudomonas azotoformans Hordeum 0359

Pseudomonas corrugata Solanum lycopersicum 0402

Pseudomonas graminis Vicia cracca 0392

Pseudomonas hibiscicola Triticum 0363

Pseudomonas syringae Triticum 0361

Pseudomonas syringae pv. Syringae Prunus persica 0223

Ralstonia solanacearum Solanum tuberosum 0001, 0014, 0021, 0104, 0133, 0136, 0171, 0174, 0209, 0211, 0296, 0302, 0303, 0313, 0312

Stenotrophomonas sp. Triticum 0360

Pisum sativum 0368

Stenotrophomonas maltophilia Glycine max 0371

Xanthomonas campestris pv. campestris Brassica oleracea 0232

Xanthomonas fragariae Fragaria 0345, 0346, 0347

Xanthomonas hyacinthi Hyacinthus orientalis 0375

Xilophilus ampelinus Vitis vinifera 0125, 0221

Примечание: штаммы, выделенные голубым цветом, использовали для оценки аналитической специфичности методов Acit 1 F/R, Acit 1-probe, «Acidovorax citrulli-РВ» «Синтол», Acidovorax citrulli-Rt «АгроДиагностика», AC158F/AC158R, SEQ ID 3/4, PL1/PL2 и G12AcFwd/G12AcRev. Все штаммы - для оценки аналитической специфичности метода ПЦР-РВ PAS F/R, PAS-P

Приложение В - Детекция продуктов ПЦР AC158F/AC158R с ДНК из семян

тыквенных культур и бактериальными изолятами