Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Минькова, Наталья Олеговна

• Минькова, Наталья Олеговна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Минькова, Наталья Олеговна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение

Глава I. Низкомолекулярные регуляторные пептиды у животных

различных филогенетических групп (обзор литературы)

1.1. Филогенез регуляторных пептидов

1.2. Регуляторные пептиды животных и некоторых других таксономических групп

1.3. Регуляторные пептиды насекомых

1.3.1. Миотропные пептиды насекомых

1.3.2. Семейство РРМР- амидов

1.3.3. Кардиоактивные пептиды

1.3.4. АКН/РРСН семейство

1.3.5. Меланоцитостимулирующие гормоны у насекомых

1.3.6. Опиоидные пептиды насекомых

1.3.7. Диуретические пептиды

1.3 8. Аллатотропины и аллатостатины

1.3.9. Феромонтропные пептиды

1.4. Энкефалины и их синтетические аналоги - как регуляторы

роста и возможные фармакологические агенты

1.4.1. Открытие, структура и функциональная роль

опиоидных пептидов

1.4.2. Тканевая локализация и содержание энкефалинов

1.4.3. Распад и биосинтез энкефалинов

1.4.4. Рецепторы энкефалинов

1.4.5. Синтетические аналоги энкефалинов

I 4.6. Физиологический эффект даларгина

1.4.7. Фармакологическая активность даларгина

Глава II. Материалы и методы

11.1. Биологический материал

11.2. Введение радиоактивных предшественников и пептидов

в гемолимфу насекомых

И З. Получение препаратов меченых нуклеиновых кислот

11.4. Определение содержания нуклеиновых кислот по методу

Шмидта - Таннгаузера

11.5. Получение препаратов меченых белков и определение содержания белка

11.6. Определение ДНК-полимеразной активности

11.6.1. Приготовление активированной ДНК

11.6.2. Получение экстрактов, содержащих ДНК-полимеразу

11.6.3. Определение общей ДНК-полимеразной активности

II.7 Выделение субклеточных фракций из гомогенатов личинок

восковой моли

11.8. Определение радиоактивности коконов восковой моли

11.9. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава III. Регуляция лей-энкефалином и даларгином обмена

нуклеиновых кислот

II!.1. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога

даларгина на содержание нуклеиновых кислот у насекомых

111.2. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на биосинтез ДНК у насекомых

111.3. Влияние пептидов на ДНК-полимеразную активность

у восковой моли

111.4. Влияние лей-энкефалина и его аналога даларгина на биосинтез РНК

Глава IV. Регуляция лей-энкефалином и даларгином обмена

белков у личинок восковой моли

Глава V. Субклеточная локализация 3Н-даларгина у восковой моли

Заключение

Выводы

Приложение. Биологические наблюдения за развитием восковой

моли после инъекции даларгина личинкам VII возраста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых»

ВВЕДЕНИЕ.

В настоящее время большое внимание уделяется сопоставлению нейроэндокринных систем насекомых и позвоночных. Доказано, что сложность эндокринной регуляции у насекомых одного порядка с таковой у беспозвоночных. Это подтверждается хотя бы тем, что около 50 различных антисывороток, полученных к пептидному материалу позвоночных, дают положительную иммунную реакцию при испытании на клетках беспозвоночных (De Loof et al., 1987). Присутствие у насекомых пептидов, сходных с пептидами позвоночных, подтверждается данными, полученными с помощью иммуноцитохимического и радиоиммунологического методов, а также по результатам биопроб (Thorpe, Duve, 1984). Хотя содержание опиоидных пептидов и плотность опиатных рецепторов у насекомых в сотни раз ниже, чем у позвоночных, их рецепторная пептидная система столь же сложна, как у последних.

Сравнительные исследования показывают, что основные принципы организации работы эндокринной системы сложились уже перед дивергенцией первичноротых и вторичноротых. Они также оказались достаточно стабильными в ходе дальнейшей эволюции животных.

Сейчас число выделенных и идентифицированных природных регуляторных пептидов приближается к сотне, а число синтезированных аналогов измеряется тысячами. Однако, внедрение регуляторных пептидов и их аналогов в практику идет далеко не столь быстро, как этого можно было ожидать. Лишь несколько десятков аналогов регуляторных пептидов проходят клинические испытания. Ежегодно в мире выявляются и идентифицируются новые и новые природные пептиды, кроме того, у ранее открытых регуляторных пептидов выявляются принципиально новые биологически активные потенции, позволяющие расширить и пересмотреть перспективные оценки их практического использования.

Наряду с выявлением функциональной роли эндогенных пептидов, изучается действие на организм их синтетических аналогов. Одним из таких

аналогов регуляторных пептидов является даларгин - синтетический аналог лей-энкефалина. синтезированный в ВКНЦ АМН России. Он обладает рядом перспективных интересных фармакологических свойств. Учитывая применение даларгина в медицине в качестве фармакологического препарата (Чазов и др., 1984) и в рыбоводстве как биорегулятора роста рыб (Седова, 1991), изучение биохимических аспектов различных путей метаболизма, затрагиваемых даларгином, представляют несомненный научный и практический интерес.

Использование модельных систем для выявления основных закономерностей влияния пептидов . на обменные процессы имеет длительную историю, в течение которой число биологических объектов в основном было ограничено несколькими видами млекопитающих. Сейчас внимание сфокусировано на низших формах ввиду их относительной простоты, большей доступности и пригодности для осуществления определенных экспериментальных процедур. Но, прежде всего, важность информации, полученной при использовании таких моделей, была установлена путем демонстрации замечательного структурного и функционального параллелизма между высшими и низшими животными. Эти аналогии прослеживаются от молекулярного до организменного уровня организации. Более того, функциональная значимость экспериментов с более низкоорганизованными животными, включая одноклеточных, позволяет использовать их для моделирования в биомедицинских исследованиях; широкие сравнительные работы в таком контексте уже принесли информацию об эволюционной истории основных биологических понятий и ведут к открытию принципов, которые трудно выявить, изучая лишь млекопитающих.

Нейроэндокринный аппарат осуществляет интегративный контроль над функциями тела. Этот регуляторный механизм столь же важен для насекомых, как и для млекопитающих, включая человека, и его функционирование у первых, вероятно, не менее сложно, чем у вторых. Поэтому параллелизм, существующий в механизме действия регуляторных пептидов у млекопитающих и у насекомых, дает основание считать последних перспективной экспериментальной моделью.

Учитывая сказанное, а также огромную экономическую важность насекомых и особенности их развития, характеризующиеся достаточно быстрой сменой морфологических форм, этот биологический объект незаменим для проведения нейроэндокринных исследований в плане сравнительной биохимии.

Исходя из вышеизложенного, мы поставили перед собой задачу исследовать, во-первых, интенсивность включения меченого предшественника 3Н-дТТФ в ДНК и изменение содержания ДНК под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у восковой моли и мучного хрущака. Во-вторых, изучить воздействие лей-энкефалина и даларгина на содержание и интенсивность синтеза РНК с тем, чтобы на основании полученных данных оценить функциональную роль низкомолекулярных регуляторных пептидов в регуляции некоторых сторон обмена нуклеиновых кислот у различных насекомых. В-третьих, исследовать изменение активности ДНК-полимеразного комплекса ферментов при введении лей-энкефалина и даларгина в организм восковой моли с тем, чтобы высказать мнение о возможном механизме воздействия пептидных регуляторов на геном насекомых. В-четвертых, выяснить влияние лей-энкефалина и даларгина на содержание белков и интенсивность их синтеза у восковой моли, сопоставить степень воздействия эндогенного пептида и его синтетического аналога на процесс шелкообразования на заключительном этапе личиночного развития у этого насекомого. В-пятых, установить субклеточную локализацию 3Н-даларгина введенного личинкам восковой моли, что может служить основанием для рассмотрения вероятных путей действия низкомолекулярных регуляторных пептидов на метаболизм насекомых.

ГЛАВА I. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ У

животных различных филогенетических групп (обзор литературы).

1.1 Филогенез регуляторных пептидов.

Обобщение результатов исследования низкомолекулярных регуляторных пептидов у одноклеточных организмов и животных различных таксономических групп осуществлено в ряде обзоров (Ашмарин, 1986, 1988, Карамян, Соллертинская, 1964, 1987, Le Roith d., Roith J., 1984, Holman et al., 1990, O'Shea M., Adams M., 1986, Penzlin,1989, Hassel, 1993). Согласно этим авторам, большое число нейропептидов или близких им пептидов обнаружено не только у высших организмов, но и у организмов, не обладающих нервной системой, и даже у одноклеточных.

Размеры малых пептидов или триггерных участков средних и больших нейропептидов - 4-11 аминокислотных остатков, находятся в замечательном соответствии с размерами "узнающих" последовательностей в полипептидах антител или рецепторов (Ружицин, 1991). Контактные участки этих белковых молекул состоят из 5-6 доменов, содержащих отдельные пента- и декапептидные фрагменты. Ранее был установлен и минимальный размер антигенной детерминанты - 4-7 остатков. Пептиды-регуляторы представляются как бы подвижным "узнающим" фрагментом белковых молекул.

Как и у высших животных, регуляторные пептиды беспозвоночных образуются путем протеолитической фрагментации высокомолекулярных предшественников. При этом сначала отщепляются сигнальные пептиды, способствующие выведению гормонов из железистых клеток, а потом -пептидные фрагменты прогормонов (Wang, 1988; Rayne, O Shea, 1996). Часть регуляторных пептидов (для нейропептидов такие случаи не описаны) образуются у высших организмов не из специализированных больших пептидов - предшественников, а из белков, выполняющих другие функции, как, например, тафцин из иммуноглобулина. Вероятно, это отражает начальные этапы филогенеза регуляторных пептидов. В свою очередь, это

дает основание полагать, что регуляторные пептиды (и нейропептиды) являются наиболее древними регуляторами обменных процессов (Ашмарин, 1987,1988; Карамян, 1956; Муратов и др., 1988; Шейман и др., 1985).

Формирование в процессе эволюции все новых и новых нейропептидов может быть значительно более быстрым и гибким процессом, нежели образование новых мономолекулярных медиаторов. У лишенных нервной системы организмов обнаружены многообразные регуляторные пептиды, близкие к таковым высших организмов, поэтому достаточно обоснованной является гипотеза об особой эволюционной древности пептидных медиаторов и о преимуществах их быстрой эволюции. Установленным фактом является и обилие нейромодуляторных и нейромедиаторных пептидов, обнаруживаемых у беспозвоночных с примитивной нервной системой (Камкин, 1984; Муратов и др., 1988; Шейман и др., 1985).

Наличие у многоклеточных организмов такого пути быстрой эволюции системы пептидной регуляции открывает возможности широкого использования на всех ступенях филогенеза эволюционно древних регуляторных пептидов, которые благодаря изменениям в топографии рецепторов и мест синтеза самих регуляторных пептидов, обретают принципиально новые сферы действия. Если изложенные выше соображения правильны, то значительная часть регуляторных пептидов высших животных должна быть идентична или очень близка к регуляторным пептидам, обнаруживаемым у низших многоклеточных систем, причем в относительно филогенетически молодых системах организмов. Многие авторы уже осуществили такие сопоставления, показав близость ряда регуляторных пептидов нервной системы и пищеварительных органов практически на всех ступенях филогенеза (Holman et al., 1990). Важно далее проследить участие регуляторных пептидов не вообще в функциях нервной и других относительно филогенетически молодых систем, а оценить их вовлеченность в наиболее сложные новейшие функции мозга, такие как обучение, память и другие, а также в новейшие функции иммунной системы -модуляцию специфического иммунитета (Такси, Ласкар, 1986; Ашмарин, 1987, 1989).

Опубликовано немало сообщений о выявлении регуляторных пептидов у наиболее просто организованных многоклеточных и одноклеточных. Заметим, однако, что, как правило, объектом таких поисков являются регуляторные пептиды, идентичные или подобные тем, которые обнаружены ранее у высших позвоночных, Высокочувствительные радиоиммунные методы, отработанные в процессе изучения регуляторных пептидов позвоночных, используются для обнаружения и идентификации пептидов низших организмов.

Согласно И. П. Ашмарину (1988) неправомерен вывод о том, что все регуляторные пептиды высших позвоночных представлены в числе регуляторных пептидов низших существ в виде идентичных или очень близких соединений. К тому же немало регуляторных пептидов, эволюция которых, будучи прослежена в пределах позвоночных, демонстрирует возникновение новых пептидов-регуляторов. Следовательно, тезис о широком участии пептидов в регуляции филогенетически новых функций у высших позвоночных, будучи сам по себе правилен, не дает права на предположение о том, что эволюционно древними являются все "высшие" регуляторные пептиды. Более того, учитывая преобладание иммунохимических и функциональных подходов к сравнению регуляторных пептидов низших и высших животных, следует избегать утверждений о полной их идентичности до полного раскрытия первичных структур тех и других.

1.2. Регуляторные пептиды животных и некоторых других таксономических групп.

В таблице 1 представлен список практически всех обнаруженных к настоящему времени регуляторных пептидов у различных групп бактерий, одноклеточных, грибов и животных, составленный нами исходя из литературных данных (Ашмарин, 1986, 1987, 1988, 1989, Муратов и др., 1988, Такси, Ласкар, 1986, !_е Ро№, 1Чо№, 1984, е1 а!., 1985, Но1тап е! а!., 1990, РепгПп, 1990, Ыавэе!, 1993). Следует отметить, что список приведенных пептидов ограничивается только теми, для которых установлено иммуноподобие к соответствующим пептидам высших

животных. Крупные таксоны, приведенные в таблице, выбраны с соответствии с филогенетическим древом (Висктапп, 1984).

Таблица 1

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ БАКТЕРИЙ, ГРИБОВ, ОДНОКЛЕТОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ИММУНОРЕАКТИВНЫЕ ПЕПТИДАМ

ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ, (по Ашмарину 1986, 1987, 1988, 1989, Муратову и др., 1988, Такси, Ласкар, 1986, !_е РоЛИ, РоКИ, 1984, 1ЧоШ1 е* а!,, 1985, Но!тап е* а!., 1990, РегаИп,

1990. Nassei, 1993)

Таксон Название Название пептида, к которому

организма обнаружена иммунореактивность

Прокариоты Е. co!i инсулин кальцитонин соматостатин

Одноклеточные Protozoa холецистокинин

эукариоты аргинин8-вазотоцин

Tetrachymena инсулин адренокортикотропный гормон

Грибы Fungia кальцитонин

Тип Aurelia aurita инсулин

Кишечнополостные

Hydra arrenyata инсулин

Metridium инсулин

Тип Моллюски Buccinium инсулин

Helix pomatia инсулин

Lymnaea stagnalis соматостатин

Mya arenflia инсулин

Ostrea инсулин

Тип Моллюски Pecten maximus инсулин

Phs»sp. соматостатин

Тип Членистоногие Acheta вазопрессин

Класс Насекомые Aeschna вещество Р

Apis инсулин

Blaberus вазопрессин

Bombyx инсулин р-эндорфин панкреатический полипептид лей-энкефалин

Calliphora инсулин р-эндорфин мет-энкефалин панкреатический полипептид

Clitumnis вазопрессин вазотоцин

Продолжение таблицы 1

ОгоэорИйа мет-энкефалин лей-энкефалин

Ег^аУэ инсулин лей-энкефалин мет-энкефалин соматостатин секретин р-эндорфин

1_ерйпо1агза инсулин соматостатин кальцитонин кортиколиберин а-эндорфин р-зндорфин адренокортикотропный гормон мотилин панкреатический полипетид гастрин вазопрессин вазотоцин окситоцин

ЬеисорИаеа вещество Р адренокортикотропный гормон мет-энкефалин лей-энкефалин

[.оа^а а-эндорфин р-эндорфин соматостатин вещество Р адренокортикотропный гормон панкреатический полипептид вазопрессин гонадолиберин соматолиберин лей-энкефалин

Manduca инсулин соматостатин кальцитонин а-эндорфин р-эндорфин лей-энкефалин вещество Р панкреатический полипептид глюкагон адренокортикотропный гормон гастрин

Продолжение таблицы 1.

Репр1апе1а соматостатин вещество Р адренокортикотропный гормон панкреатический полипептид вазопрессин гонадолиберин кортиколиберин окситоцин глюкагон лей-энкефалин мет-энкефалин

Ро^еэ вазопрессин

БагсорИада а-эндорфин р-эндорфин адренокортикотропный гормон гонадолиберин соматолиберин лей-энкефалин мет-энкефалин

Гиг, Оболочники Сюпа МеэУпаПз мотилин инсулин соматостатин кальцитонин Р-эндорфин гастрин бомбезин панкреатический полипептид холецистокинин

Тип Хордовые Класс ВгапсЫоз1:ота 1апсео1а1ит инсулин

Головохордовые

Примечание: В таблице представлены пептиды, имеющие в своем составе до 60 аминокислотных остатков.

Из приведенных данных следует, что у низших животных обнаружено 22 иммуноподобных регуляторных пептида. Исходя из приведенных данных, можно сделать обобщение: инсулиноподобный пептид обнаружен у животных всех таксономических групп, представленных в таблице, соматостатин представлен у четырех таксонов, отсутствует у одноклеточных и головохордовых, а также не выделен у кишечнополостных. Таксон оболочников представлен в таблице одним видом, но у него обнаружено и выделено 8 иммуноподобных регуляторных пептидов.

Рис.1. Распространение обнаруженных регуляторных пептидов среди изученных таксонов.

Из 22 перечисленных в таблице иммунотестированных регуляторных пептидов все выявлены у насекомых, пять их них представлены у 6 и более родов различных отрядов, К этим наиболее часто встречающимся пептидам относятся: инсулиноподобный пептид (6 родов), вещество Р (6 родов), панкреатический полипептид (7 родов), вазопрессин (8 родов), лей- и мет-знкефалины (7 родов). Среди прокариот наибольшее количество регуляторных пептидов обнаружено у кишечной палочки Е. сой, по-видимому, в связи с её выдающейся изученностью. Наглядное изображение распределения регуляторных пептидов, иммуноподобных регуляторным пептидам высших позвоночных у изученных таксонов представлено на рис. 1. Однако, следует уточнить, что отсутствие ряда пептидов у низших животных, не означает их отсутствие в организме животных с более высоким уровнем организации. Это объясняется трудностями обнаружения этих пептидов у низших животных и сложностью радиоиммунологических методов.

1.3 Регуляторные пептиды насекомых.

Нейропептиды являются древнейшей формой регуляции биологических обменных процессов. Филогенетически древние регуляторные пептиды низших животных широко представлены в системе регуляторных пептидов высших животных, в том числе среди регуляторов высших функций головного мозга и специфического иммунитета.

В настоящее время можно считать доказанным, что сложность эндокринной регуляции у насекомых одного порядка с таковой у позвоночных. Это подтверждает хотя бы тот факт, что около 50 антисывороток, полученных к пептидному материалу позвоночных дают положительную иммунореактивность при испытаниях на клетках членистоногих (Ое 1_оо1!1987). Сравнительные исследования в этой области показывают, что основные принципы организации работы эндокринной системы уже были хорошо сложившимися перед дивергенцией первичноротых и вторичноротых. Они также оказались достаточно стабильными в ходе дальнейшей эволюции (Ое изо!, 1988),

Совершенно очевидно, что функции пептидов в организме насекомых и млекопитающих имеют сходный характер, но не идентичны. Исследование функций пептидов у насекомых имеет не только большое теоретическое значение в плане сравнительной биохимии, но оно принципиально важно для развития некоторых практических направлений энтомологии, в частности использования нейропептидов в качестве потенциальных инсектицидов.

1.3.1.Миотропные пептиды насекомых.

Первый пептид, обладающий миотропной активностью, найденный у насекомых был назван проктолином. Он был открыт Брауном и Старратом (1975) у американского таракана Periplaneta americana. Была установлена его аминокислотная последовательность АРГ-ТИР-ЛЕЙ-ПРО-ТРИ и показано, что проктолин действует как нейротрансмиттер на мышцы нижнего отдела кишечника. В течение следующих двадцати лет изучалось его влияние на множестве физиологических систем. В настоящее время накоплен большой литературный материал по распределению, действию и функциям проктолина (O'Shea, Adams, 1986, Holman et al.,1986, Penzlin, 1989). Обнаружена проктолиноподобная иммунореактивность в мозге мышей, крыс и человека (Penzlin, 1989), а также чувствительность к проктолину кишки млекопитающих. Выяснено, что он может воздействовать на различные поведенческие реакции у крыс. В литературе есть сообщения о том, что активность выброса глутамата спинными мотонейронами крысы может быть усилена проктолином и другими медиаторами типа серотонина или вещества Р. Установлено, что среди различных нейропептидов проктолин является наиболее мощным ингибитором аминоэнкефалиназ, участвующих в деградации энкефалинов в синапсах плазматических мембран (Penzlin,1989). В совокупности эти результаты предполагают присутствие и функционирование проктолина или проктолиноподобных пептидов не только у беспозвоночных животных.

Проктолин является наиболее изученным пептидом беспозвоночных. Он обнаружен, по крайней мере, у шести отрядов насекомых. Долгое время полагали, что проктолин является "кишечным пептидом", но при испытании

синтетического аналога проктолина оказалось, что он может вызывать сокращение скелетных мышц насекомых и индуцировать миогенный ритм сокращения - расслабления. Предполагается, что причиной вызванного проктолином мышечного сокращения является изменение концентрации ионов Са2+. Показано возбуждающее действие проктолина на сердце насекомых: в концентрации 10"7М он вызывает деполяризацию мембраны (Hertel et al.,1988), что говорит о доказательстве эффекта прямого действия проктолина. Кроме того, доказано, что действие проктолина в центральной нервной системе насекомых ассоциируется с небольшой популяцией мотонейронов (менее 5% от общего числа), где проктолин является одним из пептидов, участвующих в нервно-мышечной передаче (Witten, 0'Shea,1985). У тараканов и саранчи, в качестве объектов, обнаружена субпопуляция проктолинэргических мотонейронов, где проктолин действует, как котрансмиттер, усиливая нервно-мышечную передачу и дозозависимое сокращение мышц (Banner et al., 1987,Orchard et al., 1989). Действие проктолина может иметь два эффекта: прямой, когда происходит медленное и постоянное увеличение напряжения мышц без деполяризации мембраны, и косвенный, при котором модуляторный эффект проявляется в продлении фазы релаксации сокращения, вызванного под действием мотонейронов при участии глутамата, как трансмиттера. В последнем случае проктолин модулирует действие глутамата. Механизм действия проктолина может быть различным. Проблема участия цАМФ и фосфорилазы в проктолинактивируемых клетках мышц интерпретирована крайне противоречиво. Данные, полученные при исследовании иннервации прилежащих желез у самцов Gryllus bimaculatus, свидетельствуют о том, что нейроны нерва последнего брюшного ганглия могут продуцировать проктолиноподобную субстанцию и транспортировать ее по своим аксонам к мускулатуре прилежащих желез, где она служит комедиатором в нервно-мышечном соединении (Yasuyama et al.,1992). Установлено, что выделение проктолина под действием нервной стимуляции зависит от концентрации ионов Са2+, что еще раз подчеркивает значение проктолина как

естественного регулятора работы висцеральных мышц насекомых (Orchard, Lange,1987).

В настоящее время проведен ряд исследований по сравнению функций проктолина и его аналогов. Обнаружено, что, как и проктолин, его аналоги участвуют в контроле мышечных сокращений и регулируют частоту сердечных сокращений у некоторых насекомых. Сравнительные исследования их биологической активности показали, что наибольшей миотропной активностью, превышающей таковую проктолина в 5 раз, обладает пептид, содержащий вместо триптофана L-диоксифенилаланин. Изучено действие проктолина и его аналогов на автономные физиологические функции у насекомых. Установлено, что под действием проктолина у куколок Tenebrio molitor шестикратно усиливалось давление гемолимфы в гемоцеле, причем (1_<Ьра2)-проктолин оказался активнее проктолина (Slama et а!., 1993).

В последнее время ведутся исследования по обнаружению, выделению и характеристике биохимических свойств ряда других миотропных пептидов насекомых.

Из экстрактов голов таракана Leucophaea maderae выделен ряд октапептидов, стимулирующих сокращение задней кишки таракана, относящихся к семейству цефаломиотропинов, названных лейкокининами. Следует отметить, что для этой группы пептидов пока не найдены структурные аналоги среди представителей позвоночных (Замятнин, 1996). Определены аминокислотные последовательности этих пептидов (табл.2) (Holman et al.,1990).

В структуре лейкокининов прослеживается идентичность последовательности аминокислотных остатков в 4, 6-8 позициях, что свидетельствует о наличии квазиконсервативной области, которая практически неотличима у разных биологических видов. Наличие у всех пептидов глицина на С - конце определяется эффективностью связывания с рецептором (Замятнин, 1996). Большая часть лейкокининовых рецепторов сосредоточена в передней кишке и яйцеводах, где чувствительность к лейкокининам в 1000 раз выше, чем в задней. Лейкокинины не активируют

висцеральную мускулатуру, но избирательно действуют на те мышцы задней кишки, где присутствуют несинаптические рецепторы. Действию лейкокининов сопутствует выделение внутриклеточного Са2+ (Davies et al.,1995). Показано, что субнаномолярные количества (ЗхЮ"10М) этих пептидов вызывали увеличение частоты и амплитуды мышечных сокращений (Cook, Wagner, 1991 ).

Таблица 2

АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЛЕЙКОКИНИНОВ

(Holman et al., 1990).

Пептид Структура

Лейкокинин I асп-про-ала-фен-асн-сер-три-гли-!чн2

Лейкокинин II АСП-ПРО-ГЛИ-ФЕН-СЕР-СЕР-ТРИ-ГЛИ-1ЧН2

Лейкокинин III АСП-ГЛН-гли-ФЕН-АСН-СЕР-ТРИ-ГЛИ-ын2

Лейкокинин IV АСП-АЛА-СЕР-ФЕН-ГИС-СЕР-ТРИ-ГЛИ-мн2

Лейкокинин V гли-сер-гли-фен-сер-сер-три-гли-мн2

Лейкокинин VI Рглу-СЕР-СЕР-ФЕН-ГИС-СЕР-ТРИ-ГЛИ-1\1Н2

Лейкокинин VII АСП-ПРО-АЛА-ФЕН-СЕР-СЕР-ТРИ-ГЛИ-МН2

Лейкокинин VIII гл И-АЛА-асп-фе Н-ТИ Р-С е Р-ТРИ-ГЛ И-N Н2

Из голов таракана Leucophaea maderae выделен нейропептид, стимулирующий активность мускулатуры задней кишки насекомого. Установлена его аминокислотная последовательность этого лейкопирокинина: рГЛУ-ТРИ-СЕР-ФЕН-ТРИ-АРГ-ЛЕЙ-МН2 (Holman et al.,1986). Из ретроцеребрального комплекса американского таракана выделены два миотропных пептида, С-концевая последовательность которых сходна с лейкопирокинином. Установлена их аминокислотная последовательность и физиологическая роль, как нейрогормонов, стимулирующих мышечные сокращения (Predel et al., 1997).

Из мозга и комплекса кардиальных тел саранчи Locusta migratoria выделены 4 миотропных пептида, сходные по первичной структуре и названные локустатахикининами. Было найдено около 800 локустатахикинин- подобных иммунореактивных нейронов, отростки которых иннервируют большинство из синаптических нейропилей мозга и зрительных долей, также как фронтального и гипоцеребрального ганглия. Широкое распространение этих нейронов в мозге саранчи указывает на важную роль

локустатахикининов в передаче сигнала и его регуляции (Nassei, 1993). Радиоиммунными методами в центральной нервной системе и эндокринных клетках личинок и имаго Calüphora vomitoria обнаружены тахикинин-подобные пептиды, сходные с локустатахикининами, причем концентрация этих пептидов в нервной системе постоянна, тогда как в эндокринных клетках их содержание все время изменяется (Kim et al., 1997). Все тахикинины функционируют через связывание со специфическими рецепторами трех типов (Аванов, 1991). Следует отметить сходство пептидов тахикининового семейства с веществом Р, как по структуре С-терминальных аминокислотных последовательностей ФЕН-Х-ГЛИ-ЛЕЙ-MET-NH2 (где X - гидрофобное или ароматическое составляющее), так и по функциональной роли (Penzlin et al.. 1989). Предполагается, что это семейство нейропептидов - результат эволюции вещества Р, которое обнаружено как у примитивных организмов, так и у человека.

Из экстрактов комплекса corpora cardiaca / corpora ailata Locusta migratoria выделен и очищен пептид, вызывающий увеличение амплитуды, частоты и тонуса сокращений яйцевода, а также стимулирующий сокращение задней кишки саранчи. Этот пептид был назван локустамиотропином (Lom-MT). Определена его первичная структура ГЛУ-АЛА-ВАЛ-ПРО-АЛА-АЛА-ГЛН-ФЕН-СЕР-ПРО-АРГ-ЛЕЙ-МНг и отмечено, что С- концевая последовательность сходна с таковой лейкопирокинина Leucophaea maderae (Schoofs et al., 1990). Из придаточных желез самцов Locusta migratoria выделено и идентифицировано два миотропных пептида, получивших по современной классификации название Lom- МТ I, состоящий из 13 аминокислотных остатков, и Lom-MT II, состоящий из 15 аминокислотных остатков (De Loof et al., 1992). При сравнении миотропной активности пептидов пирокининового семейства установлено, что наибольшей активностью обладает лейкопирокинин (Nassei, 1993). Миотропные пептиды были выделены из гусениц Manduca sexta, установлена их первичная структура (Yi et al., 1995).

Установлено, что помимо стимуляции миогенных сокращений миотропные пептиды у насекомых, они могут контролировать такие физиологические функции, как диурез и секреция пищеварительных

ферментов (Tips et al., 1990). Показано, что миотропный пептидэргический материал могут содержать не только ЦНС, но и другие органы.

Впервые сульфакинины были выделены из голов Leucophaea maderae и показано их миотропное действие на препарат задней кишки этого насекомого (Nachman et al., 1986). Позже два сульфакинина были выделены из Sarcophga bullata (De Loof et al., 1992). Сходные пептиды были изолированы и из других насекомых, их аминокислотные последовательности представлены в таблице 3. Лейкосульфакинины обнаруживают структурные и биологические черты, сходные с таковыми сульфатированных пептидов позвоночных - холецистокинином, гастрином (De Loof et al., 1992, Замятнин, 1996).

Таблица 3

АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СУЛЬФАКИНИНОВ _НАСЕКОМЫХ (по Thrope et al., 1995)._

Вид Аминокислотная последовательность пептидов

diptera

Calliphora vomitoria фен-асп-асп-тир"-гли-гис-мет-арг-фен-кн2

Calliphora vomitoria гли-гjш-глу-глу-гjш-фeh-acп-acп-tиp**-гjш-i^^c-

Drosophila melenogaster ФЕН-АСП-АСП-ТИР"-ГЛИ-ГИС-МЕТ-АРГ-ФЕН-\'Н:

Drosophila melenogaster гш-гш-асп-асп-глн-фен-асп-асп-тир"-гли-шс-мет-арг-фен-мн2

Neobellieria búllala фен-асп-асп-тир"-гли-гис-мет-арг-фен-мн2

Neobellieria bullata x* -х-глу-глу-глн- фен-асп-асп-тир"'"-гли-шс-мет-арг-фен-мн2

BLATTODEA

Leucopheae maderae глу-гш-фен-а€п-асп-тир>*-гли-гис-мет-арг-фен-мн2

Leucopheae maderae рГт/-СЕР-АСП-АСП-ТИР"-ГЛИ-гис-МЕТ-АРГ-ФЕП-КН2

Periplaneta americana глу-глн"фен-асп-асп-тир*"'-гли-гис^4ет-арг-фен-мн2

Periplaneta americana рГЛУ-СЕР-АСП-АСП-ТИР^-ГЛИ-ГИС-МЕТ-АРГ-ФЕН-Шг

ORTHOPTERA

Locusta migratoria рГЛУ-ЛЕЙ-АЛА-СЕР-АСП-АСП-ТИР**-ГШ-гаС-МЕТ-АРГ-ФЕН-МН2

Примечание: X*- эти аминокислоты не идентифицированы.

**-тирозин в 6 положении сульфатирован.

Лейкосульфакинины насекомых и сульфатированные пептиды позвоночных имеют один и тот же блок аминокислот на С - конце, что дает основание связывать с этой группой их сходную миотропную активность. Сходны и пороговые концентрации их миотропного действия. Помимо этого, они участвуют в регуляции нервной, эндокринной и иммунной систем, то есть обладают полифункциональностью действия. Это свидетельствует о наличии у насекомых нейропептидов, подобных гормонам позвоночных. Предполагается, что эволюция миотропных пептидов началась не с позвоночных, а на гораздо более ранних этапах развития животного мира (Nachman etal., 1986).

С помощью меченых лигандов в мозге весенней падальной мухи Phormia terraenovae обнаружен нейропептид галанин, состоящий из 29 аминокислотных остатков, который ранее был идентифицирован у многих млекопитающих. Этот пептид - нейрогормон; он регулирует сокращение гладкой мускулатуры, контролирует пищевое поведение (Johard et а!., 1992).

Из экстрактов голов таракана и саранчи выделен нейропептид, ингибирующий спонтанные сокращения в изолированной задней кишке насекомого, а также сокращения висцеральных и скелетных мышц. Определена его первичная структура рГЛУ-АСП-ВАЛ-АСП-ГИС-ВАЛ-ФЕН-ЛЕЙ-АРГ-ФЕН-МН2. Лейкомиосупрессин является первым ингибиторным нейропептидом, выделенным и идентифицированным у насекомых (Holman et al., 1986b, De Loof et al., 1992). Определена его структура на молекулярном уровне с помощью анализа кДНК и геномной ДНК в мозге Diploptera punctata. Показано, что синтез лейкомиосупрессина осуществляется как в нервной системе, так и в многочисленных эндокринных клетках насекомого (Bendena et al., 1997). В клетках ЦНС мух - жигалок методами иммунохимии выявлена локализация пептидов, сходных с лейкомиосупрессином. Они обнаружены в головном мозге, субпищеводном, грудных и брюшных ганглиях. Функциональная роль этих пептидов так же сходна с лейкомиосупрессином (Meola et al., 1991). Из голов колорадского жука выделено 6 миотропных пептидов, у которых установлена аминокислотная последовательность. Обсуждается их принадлежность к семействам миотропных пептидов (De Loof et al., 1992). Из медоносной

пчелы Apis mellifera выделен новый биоактивный пептид, обладающий миотропной активностью и названный аписином (Takahashi et al., 1993).

Таким образом, миотропные пептиды синтезируются в различных отделах нейросекреторной системы насекомых и обладают широким спектром регуляторной активности. Представители этих семейств участвуют в гормональном контроле сократительной и выделительной активности, контролируют поведенческие реакции и половую деятельность насекомых. Установлено, что эти пептиды могут выполнять функции комодуляторов и ко-трансмиттеров, вступая во взаимодействие с нейромодуляторами и нейротрасмиттерами (Nassel, 1996).

РМКР-подобные пептиды составляют большое семейство нейропептидов, обладающие Отличительной их особенностью последовательность на С - конце сходная или идентичная Р1ШР-амиду.

РМРР-амид (ФЕН-МЕТ-АРГ-ФЕН-ЫНз) - наиболее изученный пептид Хотя РМРР-амид был впервые выделен из моллюска, к нему обнаружена у многих представителей царства животных. РМ(ЧР- амид- подобные пептиды были изолированы у целого ряда

В частности, из экстрактов нервной ткани падальной мухи Calliphora vomitoria выделено 13 нейропептидов, состоящих из 7-12 остатков и содержащих на С - конце FMRF-амидный мотив, и один крупный пептид, имеющий С - концевую последовательность МЕТ-ИЛЕ-АРГ-ФЕН. Идентифицирован ген, кодирующий эти последовательности (Duve et al., 1992). Показано, что нонапептиды обладают способностью индуцировать

Из голов комара Aedes aegypti выделены пептиды, сходные с FMRF-обнаружена в нейросекреторных клетках, нейронах и

эндокринных клетках средней кишки самок комара. Доказана миотропная активность этих пептидов (Matsumoto et al., 1988).

Из грудных ганглиев саранчи Schistocerca gregaria выделен нейропептид, родственный FMRF-амиду. Установлена его первичная структура ПРО-АСП-ВАЛ-АСП-ГИС-ВАЛ-ФЕН-ЛЕЙ-АРГ-ФЕН-МНг. Он почти идентичен лейкомиосупрессину, выделенному из Leucophaea maderae (Robb et al.,1989). Радиоиммунологическими методами исследовали распределение нейропептидов, сходных с FMRF-амидом. Установлено, что в различных нервных тканях присутствуют разные типы этих пептидов, что свидетельствует о дифференциальной экспрессии нейропептидов в отделах нервной системы (Robb, Evans, 1990).

Иммунореактивность к пептидам FMRF-амидного семейства установлена в нейронах мозга, зрительных долях, среднем протоцеребруме, дейтоцеребруме и подглоточном ганглии тутового шелкопряда Bombyx mori (Iwana et al., 1992).

Из сегментарных ганглиев Manduca sexta выделены три пептида, сходные с FMRF-амидом. Установлена их первичная структура. Биологическое действие этих пептидов проявляется в сокращении мышечной стенки тонкой кишки, что согласуется с идеей о том, что эти пептиды играют роль физиологических регуляторов в пищеварительном тракте. Обнаружено, что их количество не изменяется в течение всего онтогенеза (Kingan et al., 1995).

Исследована экспрессия амидированного олигопептидного гормона (СЕР-АСН-АСП-ФЕН-МЕТ-АРГ-ФЕН-МНг) у дрозофилы, принадлежащего к семейству FMRF-амидов. Этот гормон является результатом посттрансляционной модификации продукта гена, который кодирует FMRF-амидный предшественник. Всего у дрозофил известно 5 производных этого гена. Показано, что исследуемый вариант присутствует в центральной нервной системе дрозофил в процессе всего онтогенеза (Nichols et al., 1995). Кроме того, некоторые изменения в экспрессии гена нейропептидного FMRF-амида выявлены в процессе метаморфоза, что указывает на значение этого семейства в его контроле (Schneider et al., 1993).

В ряде работ показано, что пептиды FMRF-амидного семейства могут действовать не только опосредовано как нейрогормоны, выделяясь в гемолимфу, но и как нейромодуляторы, стимулируя выделение последних (Schiebe, Walther, 1988). Это функция сходна с таковой октопамина и проктолина, но опосредована независимой от этих двух нейромедиаторов рецепторной системой (Evans et al.,1986).

1.3.3.Кардиоактивные пептиды.

Кардиоактивный гормон, увеличивающий интенсивность сердечных сокращений, первоначально был изолирован из перикардиальных органов краба, затем он был идентифицирован у насекомых.

В нервной системе саранчи Locusta migratoria был обнаружен кардиоактивный пептид (КАП) следующей структуры ПРО-ФЕН-ЦИС-АСН-АЛА-ФЕН-ПЛИ-ЦИС-МН2, полностью идентичный гормону краба (Stangier, Keller, 1989). Интересно, что в брюшных вентральных нервных цепочках имаго табачного бражника М. sexta были идентифицированы два пептида, аминокислотная последовательность которых аналогична КАП (Tublitz, Truman, 1985). Из экстрактов голов мучного хрущака Tenebrio molitor и совки - походного червя Spodoptera eridania выделен кардиоактивный пептид со структурой сходной с кардиоактивным гормоном ракообразных (Furuy et al.,1993). Получены данные о том, что эти пептиды оказывают воздействие на миокард насекомых путем изменения уровня инозитол-1,4,5,-трифосфата, который является вторичным посредником в регуляции деятельности сердечной мышцы (Tublitz, 1988).

1.3.4. AKH/RPCH семейство гормонов насекомых.

Семейство пептидов, включающее адипокинетический гормон (АКГ) насекомых, гормон ракообразных, концентрирующий красных пигмент, гипертрегалоземический гормон и родственные им гормоны встречаются у большой группы насекомых. Впервые адипокинетический гормон был изолирован из кардиальных тел саранчи Locusta migratoria Стоуном и сотрудниками в 1976 году. Вслед за этим установлена его первичная

структура, которая оказалась идентичной гормону ракообразных, концентрирующему красный пигмент (Nassel, 1993). В настоящее время известна структура приблизительно 20 пептидов этого семейства, выделенных из разных насекомых, которые активируют гликогенфосфорилазу жирового тела и участвуют в метаболизме и транспорте липидов и углеводов, а также регулируют синтез белков и активность мышечных сокращений (Penzlin, 1989). Все эти пептиды являются окта- нона- или декапептидами с блокированными N- (пироглютамат)- и С-(амидная группа)-концами.

Из кардиальных тел саранчи Locusta migratoria выделено три адипокинетических гормона, два их которых (АКГ 111 и АКГ II) являются октапептидами, а один {АКГ I) - декапептид. Наибольшей способностью к мобилизации липидов обладает АКГ I, тогда как АКГ II сильнее мобилизует углеводы, активируя гликогенфосфорилазу. АКГ III менее активен в обоих отношениях, но при высоких дозах проявляет активность сходную с АКГ I. Необходимым условием для активации фосфорилазы этими гормонами является присутствие внеклеточного Са2+. Циклический АМФ является вторичным посредником в передаче сигнала. Центральное место в механизме передачи сигнала от этих гормонов занимает фосфоинозидный цикл (Van Marrewijk et al., 1992).

Адипокинетические гормоны, сходные с АКГ саранчи выделены и идентифицированы у имаго Manduca sexta (Lienger et al., 1986), Drosophila melanogaster (Schaffer et al., 1990), Romalea micriptera и Schictoserca gregaria (Holman et al., 1990). Структура всех выделенных пептидов подтверждена синтезом их аналогов.

Из кардиальных тел тараканов Periplaneta americana (Siegert et al., 1986) и Nauphoeta cineria (Gade, 1987), жуков Tenebrio molitor и Zophabas rugipes (Gade, Rosinski, 1990), мясной мухи Phormia terraenovae (Gade et al., 1990) выделены и идентифицированы гипертрегалоземические пептиды, которые в соответствии со структурой были отнесены к семейству адипокинетических гормонов. Эти пептиды регулируют углеводный обмен насекомых. Физиологическое действие гипергликемических гормонов

проявляется в повышении уровня трегалозы в гемолимфе насекомых, что сходно с действием глюкагона позвоночных.

1.3.5. Меланоцитостимулирующие гормоны у насекомых.

В центральной нервной системе насекомых обнаружен пептид, сходный по структуре и функциям с меланоцитостимулирующим гормоном позвоночных. Дальнейшие иммуноцитохимические исследования позволили установить наличие меланотропиноподобных пептидов в мозге, брюшной нервной цепочке и нейросекреторных органах личинок и имаго Locusta migratoria и в мозге взрослых мух Sarcophaga bullata (Schoofs et al., 1987,1988). Считают, что у насекомых есть специфические антигены еще не выясненного функционального значения, от распределения которых в центральной нервной системе зависит выделение меланотропинов в ответ на воздействие стимулов внешней среды. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что низкомолекулярные пептиды, в частности меланотропины, имеют высокую эволюционную сохранность, восходя от очень древнего предшественника как для насекомых, так и для позвоночных. Предполагается, что как и у высших животных, у насекомых меланотропины образуются из молекул - предшественников, подобных проопиомеланокортину. Об этом свидетельствует положительная иммунореактивность на антисыворотки., действующие против предшественников проопиомеланокортина (Schoofs et al.,1987).

Из мозга и переднегрудного отдела куколок Inachis lo был выделен пептид, контролирующий пигментацию. Он назван фактором, ослабляющим меланизацию (Buckmann, Maisch, 1987). Показано, что этот фактор одновременно увеличивал содержание каротиноидов в кутикуле. Результаты исследований межвидового распространения этого пептидного фактора у чешуекрылых показали, что пептиды, подобные фактору, уменьшающему меланизацию, встречаются в разных семействах чешуекрылых, независимо от наличия кокона, у таких представителей как Aglias urticae, Pieris brasssicae, Galleria mellonelia, и могут иметь различную функцию (Buckmann, Koch, 1989).

Механизм действия меланотропиноподобных пептидов на меланоциты насекомых рассматривается с точки зрения влияния этих пептидов на переход гранул, содержащих меланин, из состояния золя в состояние геля. Это сопровождается перераспределением пигмента в клетках и их потемнением. Процесс выделения меланотропиноподобных пептидов контролируется воздействием экологических факторов на рецепторы и центральную нервную систему.

1.3.6. Опиоидные пептиды насекомых.

До настоящего времени у насекомых не выделены опиоидные пептиды, однако лей- и мет-энкефалины были изолированы из моллюска Mytilus и краба Carcinus maenas (Nassel, 1993).

Радиоиммунными и иммуноцитохимическими методами показано наличие энкефалиноподобного материала в различных тканях и нервной системе у некоторых видов насекомых. В мозге, кардиальных и прилежащих телах Manduca sexta найдены нейросекреторные клетки, содержащие лей-энкефалин-подобные пептиды (Homberg et al.,1991). Нервные клетки, содержащие энкефалиноподобный материал, были обнаружены в надглоточном ганглии мозга американского таракана (Milton et al.,1991); помимо этого, в многочисленных эндокринных клетках Periplaneta americana выявлены пептиды, проявляющие иммунореактивность, сходную с таковой у млекопитающих в отношении ß-эндорфина, лей- и мет-энкефалина (Schols et al., 1987). Пептиды, иммунологически сходные с мет-энкефалином, найдены в сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах и молодых овариальных фолликулах Locusta migratoria и Sarcophaga bullata. В нервной системе обоих видов выявлена иммунореактивность к ß-эндорфину, лей- и мет-энкефалинам. Предполагается, что энкефалин-подобные пептиды могут регулировать процессы размножения (Schoofs et al.,1988). В центральной нервной системе Calliphora vomitoria выявлено наличие энкефалиноподобного материала. Обнаружены нейронные пути, свидетельствующие о том, что лей- и мет-энкефалин - подобные пептиды мозга мух функционируют как нейротрансмиттеры и нейромодуляторы.

Небольшое количество иммунореактивного материала обнаружено в нейропиле. Считается, что этот материал в противоположность материалу мозга, действует как нейрогормон и его физиологическое действие проявляется после выделения в гемолимфу (Duve et al., 1988). Таким образом, энкефалиноподобные пептиды обладают нейромодулирующей и периферической нейрогормональной активностью.

Установлено, что деградация энкефалинов в организме насекомых происходит под действием нейтральной эндопептидазы, аминопептидазы и карбоксипептидазы (Masler, Kovaleva, 1997).

С помощью меченых лигандов доказано наличие опиоидных рецепторов у Scotia segetum (Karabensch et al.,1985), Locucta migratoria (Tamarelle et al., 1989), Periplaneta americana (Weiss et al.,1987), Leucophaea maderae (Ford et al.,1986). В частности, большое количество высокочувствительных опиоидных дельта - рецепторов было обнаружено в гемоцитах Leucophaea maderae. Обсуждается роль опиоидных рецепторов в формировании иммунного ответа у насекомых, подобно тому, как это происходит у млекопитающих (Stefano et al.,1992). Это указывает на связь между нейроэндокринной и иммунной системами у насекомых.

Предполагается, что опиоидная система может участвовать в регуляции питания (Kavaliers et al.,1987) и поведенческих реакций у насекомых аналогично тому, как это происходит у позвоночных (Weiss et al., 1987), равно как контролировать двигательную активность и участвовать в формировании иммунного ответа (Nagabhushaman et al., 1995).

В последнее время изучается действие опиоидных пептидов и их аналогов на различные функции организма. Исследовано влияние ряда аналогов энкефалинов (0-АПА2-ЛЕЙ5-энкефалинамид и D-AJ1A2-MET5-энкефалинамид) на двигательную активность (Ford et al., 1986). Инъецированные вблизи головных ганглиев таракана Leucopheae maderae эти аналоги энкефалинов вызывают ослабление или усиление двигательной активности в разных концентрациях. Оба эти эффекта блокируются введением налоксона - опиатного антагониста, снимающего также угнетающее действие морфина. Это свидетельствует о сложном и

многоступенчатом механизме действия опиоидов на организм беспозвоночных животных.

1.3.7. Диуретические пептиды.

Диуретические и антидиуретические пептиды контролируют водный и ионный баланс организма, а также выведение из него продуктов жизнедеятельности. Эти факторы гомеостаза ответственны за поддержание стабильной внутренней среды под влиянием постоянно изменяющихся внешних условий. Установлено, что у насекомых водный баланс регулируется смесью нескольких гормонов, действие которых на мальпигиевы сосуды и заднюю кишку проявляется после их выделения в гемолимфу (Coast et al.,1993). Доказано, что диурез у насекомых после питания вызывается одновременным выделением диуретических гормонов и серотонина, которые действуют синергически (Maddrell et al.,1993).

В тканях саранчи Locusta migratoria и некоторых других насекомых иммунологическими методами обнаружен пептид, подобный аргинин-вазопрессину, функционально подобный диуретическому гормону позвоночных, причем его уровень коррелирует с обезвоживанием организма (Schooley et al., 1987). Позднее этот диуретический гормон был выделен из подглоточного и грудных ганглиев, охарактеризована его структура, показано, что он представляет собой антипараллельный димер:

ЦИС-ЛЕЙ-ИЛЕ-ТРЕ-АСП-ЦИС-ПРО-АРГ-ГЛИ-НН2 Параллельный димер не обладает биологической активностью также, как и мономер.

Показано, что действие диуретического гормона осуществляется с участием цАМФ, который является его вторичным посредником (Ргоих et а1.,1988). Установлено, что после питания в гемолимфе насекомого находится до 60% от выделяемого диуретического гормона, следовательно, он контролирует выделение мочи после кормления (Audsley et а!., 1997).

Ц! " С-ПРО-АРГ-ГЛИ-NH

<2

Из комплекса кардиальные/прилежащие тела и отдельно из медиальных нейросекреторных клеток имаго Manduca sexta были выделены два диуретических пептида, состоящие из 41 (Mas-DP I) и 30 (MAS-DP II) аминокислотных остатков, принадлежащие к семейству кортикотропин-рилизинг- подобных пептидов (Ma, Blackburn ,1992).

Исследованы распределение и относительная активность диуретического и антидиуретического пептидов у домашнего сверчка Acheta domestícus (Coast, Wheeter, 1990). Показано, что антидиуретический пептид ингибирует выделение жидкости мальпигиевыми сосудами и его действие проявляется после выделения в гемолимфу.

Из голов комара Aedes aegypti выделены натриуретические и экскреторные пептиды, отличающиеся по действию на изолированные мальпигиевы сосуды (Hayes et al.,1988). Установлено, что эти пептиды действуют как нейрогормоны и их физиологическое действие проявляется после выделения в гемолимфу, причем уровень гормонов четко коррелирует с уровнем экскретируемой жидкости (Clark, Bradley, 1997).

Сравнение действия диуретических гормонов (аргинин- вазопрессин -подобного и кортикотропин- рилизинг -подобного) показывает, что последний вызывает более сильную стимуляцию секреции и выработку цАМФ (Coast et al.,1993).

I.3.8. Аллатотропины и аллатостатины.

У насекомых активность нейросекреторных клеток, отвечающих за выделение ювенильных гормонов (ЮГ), контролируется нейрогормонами пептидной природы - аллатотропинами и аллатостатинами.

В мозге, кардиальных телах и подглоточном ганглии саранчи Locusta migratoria обнаружен аллатотропин, вызывающий увеличение скорости высвобождения ювенильного гормона HI (Gadot et al., 1987). Определена его первичная структура ГЛИ-ФЕН-ЛИЗ-АСП-ВАЛ-ГЛУ-МЕТ-МЕТ-ТРЕ-АЛА-АРГ-ГЛИ-ФЕН-МН2. Иммуноцитохимическими методами аллатотропин идентифицирован у Manduca sexta, личинок Galleria mellonella (Nassel, 1993), взрослых особей Tenebrio molitor, Schistocerca nitans, Periplaneta americana,

Heliotis virescens (Holman et al.,1990). Показано, что у имаго М. sexta аллатотропин является и кардиоактивным пептидом (Veenstra et ai., 1994). Биохимическими методами установлено, что аллатотропин синтезируется в нейросекреторных клетках мозга и транспортируется в кардиальные тела, где он и накапливается. Показано, что аллатотропин синтезируется в неактивной форме препрогормона, а его активная форма обнаруживается в кардиальных телах (Bogus, Scheller, 1994). Предполагается, что активность аллатотропина может быть обнаружена на всех стадиях развития Lepidoptera.

Из мозга и прилежащих тел живородящего таракана Diploptera punctata выделены 5 аллатостатинов, нейропептидов, тормозящих выделение ювенильных гормонов. Эти нейропептиды содержат от 8 до 18 аминокислотных остатков и сходны по структуре С-концевой последовательности ТИР-Х-ФЕН-ГЛИ-ЛИЗ-1\1Н2 (Stay, 1992). Установлено, что содержание аллатостатинов у эмбрионов и в гемолимфе имаго колеблется как в эмбриогенезе, так и во время последующего развития, включая репродуктивный цикл насекомого (Yu et a!.,1992, Holbrook et al.,1996). Исследована деградация аллатостатинов в гемолимфе живородящего таракана и показано, что сначала эндопептидазами с С-конца отщепляется гексапептид, который затем под действием аминопептидазы превращается в пентапептид, названный амастатином, который на некоторое время ингибирует действие эндо- и экзопептидаз. В гемолимфе таракана обнаружены все продукты деградации аллатостатина, являющиеся биологически активными пептидами, но их роль до конца не выяснена (Garside etal., 1997).

Из прилежащих тел саранчи S. gregaria выделено 9 пептидов, обладающих свойствами аллатостатинов (их назвали шитостатинами). Установлено, что они ингибируют синтез ЮГ не только у S. gregaria, но и у Locusta migratoria, а также оказывают воздействие на выделение адренокортикотропного гормона из кардиальных тел (De Loof et al.,1996).

Из тканевых экстрактов Calliphora vomitoria выделено 5 аллатостатин-подобных пептидов, четыре имеют типичное для аллатостатинов С-окончание и названы лей- каллатостатинами, пятый имеет на С-конце

метионин вместо лейцина и назван мет- каллатостатином (Duve et al.,1993). Сходные с лей-каллатостатином пептиды были обнаружены в тканевых экстрактах личинок V возраста Cydia pomonella. Иммунореактивными методами идентифицированы нейроны и нейросекреторные клетки мозга и периферической нервной системы продуцирующие эти пептиды. Показано, что в концентрации Ю"10-Ю"16 M эти пептиды обладают миоингибиторной активностью (Duve et al., 1997).

Новый пептид из семейства аллатостатинов был изолирован из мозга и прилежащих тел Manduca sexta и назван лепидостатином и функционирует, как нейрогормон (Davis et al., 1997).

Следует отметить, что все аллатотропины и аллатостатины являются нейросекреторными пептидами и для ряда из них идентифицированы гены (Guan, 1996).

Предполагается, что аллатостатины помимо ингибирования синтеза ювенильных гормонов, выполняют у насекомых многообразные функции: миомодуляторную или миотропную контроля деятельности висцеральных мышц, регуляции деятельности выделительной системы.

1.3.9.Феромонтропные пептиды.

Ключевую роль в регуляции биосинтеза половых феромонов играют нейрогормоны пептидной природы, вырабатываемые в подглоточном ганглии. Феромонтропные пептиды идентифицированы у Heliotis zea, Bombyx mori, Pseudoletia separata, Locusta migratoria. Иммуногистохимически показано, что нейрогормон вырабатывается в трех группах нейросекреторных клеток, соответствующих максиллярному, мандибуллярному и лабиальному нейромерам подглоточного ганглия. У некоторых чешуекрылых в регуляции выработки указанного нейрогормона принимает участие ювенильный гормон (Raina, 1993).

Выделенный из комплексов мозг / подглоточный ганглий самок Heliotis zea нейропептид, активирующий биосинтез феромона (НАБФ), имеет структуру H-LSDDMPATPADQEMYRQDPEQIDSRTKYFSPRL-NH2.

Иммунореактивность к данному пептиду обнаружено у самок Heliotis

virexeus, Lymantria dispar, Ostrinia nubilalis, Blattella germanica, Musca domestica, Apis meIIitera. Это свидетельствует о широком распространении молекул со сходной гормональной активностью (Raina et al ,1987,1989).

Из голов тутового шелкопряда выделены 2 различных нейропептида, активирующих биосинтез феромона, имеющие сходную С- концевую последовательность, определяющую биологическую активность (Kuniyoshi et al..1992). Определена их первичная структура и идентифицированы кодирующие их гены (Xu et al.,1996). Обнаружено большое сходство этих нейропептидов с таковым Heliotis zea.

Из экстрактов голов Pseudoletia separata выделен новый феромонтропный пептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков, причем С- концевая пентапептидная группа сходна с феромонтропными пептидами других насекомых. Биотестирование этого пептида показало, что он проявляет также гормональную активность, выражающуюся в меланизации и покраснении покровов. Таким образом, он регулирует морфологические цветовые изменения, связанные с фазовым метаморфозом бабочек (Matsumoto et al.,1992).

У перелетной саранчи Locusta migratoria в экстрактах кардиальных и прилежащих тел и комплексах мозг и подглоточный ганглий обнаружен пептид, активность которого, сходна с таковой нейропептида, активирующего биосинтез полового феромона (Streng, 1992).

У плодовой мушки Drosophila melanogaster молекулярно - генетическими методами идентифицирован пептид, состоящий из 26 аминокислотных остатков и обладающий феромонтропной активностью и ген, кодирующий эту последовательность. Этот пептид также стимулирует откладывание яиц у самок (Wolfner, 1997).

Следовательно, помимо регуляции полового поведения, феромонтропные пептиды могут контролировать репродуктивные функции насекомых.

В целом, приведенные выше материалы убеждают в том, что биоразнообразие регуляторных пептидов у насекомых изучается

исключительно широко, В последнее время у насекомых идентифицированы многочисленные новые регуляторные пептиды, установлена их роль в регуляции процессов жизнедеятельности, которая осуществляется за счет их специфичности и полифункциональности. Все сказанное позволяет допустить существование у насекомых непрерывной совокупности (континуума) регуляторных пептидов в соответствии с обобщением, высказанном при оценке успехов пептидной химии И.П. Ашмариным и М.Ф. Обуховой (1986).

1.4. Энкефалины и их синтетические аналоги - как регуляторы роста и возможные фармакологические агенты.

1.4.1.Открытие, структура и функциональная роль опиоидных пептидов.

В 1975 году независимо друг от друга, почти одновременно в разных странах три группы исследователей, возглавляемые С. Ли, Л. Терениусом и Дж. Хьюджесом получили эндогенные опиоидные полипептиды. Химический анализ, выделенных из экстрактов мозга кроликов, морских свинок, крыс и свиней соединений показал, что они являются пентапептидами, различающимися между собой лишь природой С-концевой аминокислоты (цитировано по Бахареву, 1985).

1 2 3 4 5 лей-энкефалин : Н-ТИР-ГЛИ-ГЛИ-ФЕН-ЛЕЙ-ОН

1 2 3 4 5 мет-энкефалин : Н-ТИР-ГЛИ-ГЛИ-ФЕН-МЕТ-ОН

Немного позже, Р. Симантов и С. Снайдер (81тап1оу, Бпаус^ег, 1976) выделили оба пентапептида из мозга теленка.

В настоящее время опиоидные нейропептиды являются наиболее многочисленным (свыше 30 пептидов), структурно и функционально и многообразным семейством пептидов. Они содержат в качестве активного центра лей- и мет-энкефалиновые последовательности - УСвРЬ. УввРМ (табл. 4).

Таблица 4

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ОСНОВНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОПИОИДНЫХ _ПЕПТИДОВ (Ашмарин, Каразеева, 1996)._

Название пептида Структура

мет-энкефалин УввРМ

лей-энкефалин УСвРЬ

Э-эндорфин Ув6РМТ8ЕК8(ЗТР!_\/Т1КНА11КЫАУККСЕ

у-эндорфин УббРмтэЕкзотртг

а-эндорфин УООРМТЗЕКБОТРЬУТ

а-неоэндорфин УввРЬИКУРК

динорфин А и его дериваты У66Р1_РШР1РК1_К\ЛЮШ усср1яткрк1_к увврьи*!

мет-энкефалин-РХЗЬ-амид УССРМР^а

мет-энкефалин-РР-амид УввРМКРа

Большинство из них обладает более или менее выраженным обезболивающим действием, реализуемым через рецепторы. Однако не менее важными представляются их влияние на функциональную активность мозга: снижение или усиление эмоционального поведения, индукция "чувства удовлетворения, вознаграждения", то есть функция внутренних факторов подкрепления. Некоторые опиоидные пептиды, в частности энкефалины, являются мощными активаторами разновидности МК-лимфоцитов. убивающих раковые клетки. Следовательно, опиоиды могут служить химическими посредниками между иммунной и нервной системами, регулируя иммунитет (Ашмарин, Каразеева, 1996).

Литературные данные свидетельствует о том, что функции энкефалинов в организме человека и животных крайне разнообразны. Установлено, что энкефалины тормозят выделение различных нейротрансмиттеров, выступая в роли котрансмиттеров и комодуляторов, регулируют выделение пролактина. Энкефалины в организме выступают не только как нейромедиаторы, но и как нейромодуляторы. Накоплены данные, свидетельствующие о существовании энкефалинэргической нервной передачи (Янг, Хонг, 1981).

Показано, что низкомолекулярные пептиды - энкефалины обладают широким спектром регуляторного влияния на метаболизм в целом. Они

принимают участие в регуляции ряда эндокринных функций и влияют на процессы регенерации (Тимошин и др., 1987). По данным О Б. Ильинского и соавторов энкефалины оказывают стимулирующий эффект на рост нервной ткани в культуре (Иупэку е\ а!., 1987). Тот факт, что энкефалины влияют на пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников, а также влияют на процессы деления клеток эпителия языка и роговицы крыс (Тимошин, Жданова, 1987), активируя синтез ДНК, позволяет считать, что опиоидные пептиды являются важным звеном регуляции клеточного деления. Накоплено много фактов, указывающих на роль эндогенных опиоидоподобных пептидов в регуляции пищеварительных функций (Полонский, 1987).

1.4.2. Тканевая локализация и содержание энкефалинов.

Соотношение содержания мет-энкефалинов и лей-энкефалинов в природных источниках различно. Исследования, проведенные с помощью радиоиммуногических тестов, показали, что энкефалины содержатся практически во всех отделах мозга и пределы их концентраций широко варьируют. Помимо этого, энкефалины обнаружены нервных сплетения, а также в эндокринных клетках желудочно-кишечного тракта (Костерлиц, Хьюс, 1981).

Содержание мет-энкефалина в полосатом теле очень высоко - 84 пг/мг белка, а в бледном шаре концентрация энкефалина составляет 76 нг/мг белка. Содержание мет- энкефалина оказывается умеренно высоким в аккумбентном ядре (10 нг/мг белка), в области гипоталамуса и в преоптической области. Мозжечок и гипокамп характеризуются самыми низкими концентрациями энкефалина. Обнаружено также, что в мозге, содержится в 5-10 раз больше мет-энкефалина, чем лей-энкефалина (Янг и др., 1981).

Высокое содержание энкефалинов полосатом теле указывает на их участие в регуляции болевого порога, а наличие их в аккумбентном ядре и миндалевидном ядре свидетельствует об участии энкефалинов в регуляции

эмоционального поведения. И. наконец, присутствие в гипоталамусе явно предполагает нейроэндокринную роль энкефалинов (Янг и др., 1981).

С помощью биотестов обнаружено 55нг/г мет-энкефалина в подвздошной кишке морской свинки. Содержание его в различных участках тонкого кишечника морских свинок разнообразно. Так, в привратнике - 75нг/г, в нижней части тонкой кишки - 77нг/г, а в верхней части тонкой кишки - 67нг/г. Получены данные о присутствии энкефалиноподобной иммунореактивности в кишечнике человека (Мик, Бохан, 1981).

1.4.3. Распад и биосинтез энкефалинов.

В сложном комплексе процессов, происходящих при функционировании нервной системы, существенная роль принадлежит нейропептидам и пептидогидролазам, ответственным за образование и деградацию нейропептидов. Динамика содержания нейропептидов в тканях и органах полностью определяется активностью пептидогидролаз.

Так, например, с использованием 3Н-лей-энкефалина было установлено, что основная роль в распаде энкефалина в клетках мозга быка принадлежит растворимой и мембраносвязанной аминопептидазе. Помимо этого в деградации энкефалинов могут принимать участие дипептидиламинопептидаза, эндопептидаза, и карбоксипептидаза. Исходя из полученных экспериментальных данных был проведен ориентировочный расчет скорости обновления пула энкефалинов мозга, который показал, что под действием аминопептидаз пул этих нейропептидов обновляется в течение нескольких секунд. По обеспечиваемой ими скорости распада обе аминопептидазы могут быть отнесены к ключевым ферментам деградации энкефалинов (Колесанова, 1987). Следует отметить, что процесс распада энкефалинов находится в динамическом равновесии с энкефалиногенезом.

Отличительной чертой всех нейропептидов, в том числе и опиоидных, является то, что это - секретируемые продукты. В процессе биосинтеза нейропептиды накапливаются в секреторных гранулах и при соответствующих физиологических условиях (уникальных для каждого нейропептида или группы нейропептидов) происходит выброс их из клетки.

Особенностью биосинтеза нейропептидов является то, что подобно ч другим секретируемым белкам, они сначала возникают в виде предшественников. Препронейропептиды содержат сигнальную последовательность, которая локализована, как правило, на N -конце полипептидной цепи. Благодаря ей, препронейропептиды транслоцируются в полость цистерн эндоплазматического ретикулума, где подвергаются посттрансляционным модификациям, благодаря чему в секреторных гранулах накапливаются зрелые нейропептиды, которые при соответствующих физиологических условиях выбрасываются во внеклеточное пространство. Протеиназы, обеспечивающие выщепление нейропептидов, не являются высокоспецифичными. В значительной мере точное выщепление обусловлено наличием в аминокислотной последовательности пептидов - предшественников парных остатков, которые в первую очередь атакуются протеиназами, близкими по характеру действия к катепсину В и трипсину (Ашмарин, Каразеева, 1996).

Основным инициирующим звеном энкефалиногенеза следует считать систему внутриклеточного протеолиза, в первую очередь кислых катепсинов. Простейшим механизмом активирующего действия катепсинов в энкефалиногенезе является перевод энкефалинобразующих кабоксипептидаз из мембраносвязанных форм в свободное состояние, в результате чего происходит усиление процессов энкефалинообразования (Петровский, 1991).

Синтез ряда опиоидных пептидов, содержащих в качестве минимальной активной последовательности мет-энкефалин, обеспечивается по крайней мере двумя пептидами - предшественниками проопиомеланокортином (локализованным главным образом, но не исключительно в гипофизе) и препроэнкефалином А (локализованном преимущественно, но опять таки не исключительно, в надпочечниках). Сходным образом лей-энкефалинсодержащие пептиды выщепляются из мозгового пептида- предшественника продинорфина (препроэнкефалина В) и вышеупомянутого препроэнкефалина А, совмещающего в себе последовательности нейропептидов с лей-энкефалиновыми и мет-энкефалиновыми активными центрами. Аминокислотные

последовательности энкефалинов фланкированы парами основных аминокислот, которые играют ключевую роль в освобождении пептидов из высокомолекулярной проформы.

Определенные успехи достигнуты в изучении ферментов осуществляющих процессинг про-энкефалинов. М. Бенук с соавторами (Веписк е! а!., 1981) установили, что образование мет-энкефалина из его предшественников может осуществлять ангиотензин - конвертирующий фермент и дипептидилкарбоксипептидаза, выделенные из митохондриальных мембран почек и мозга кролика.

В ряде случаев образование опиоидных пептидов и процессы их распада переплетаются друг с другом. Но следует отметить, что протеолитический распад нейропептидов является часто не простым актом уничтожения регулятора, а реакцией образования нового биоактивного соединения (Ашмарин, Каразеева, 1996).

1.4.4. Рецепторы энкефалинов.

Установлено, что спектр биологических эффектов опиоидов реализуется через взаимодействие со специфическими рецепторами, локализованными в центральной и периферической нервной системе и в ряде висцеральных органов. Выявлена крайняя неравномерность распределения рецепторов энкефалинов: больше всего их оказалось в лимбической системе мозга (т.е. в структурах ответственных за поведение, эмоции, память),значительно меньше - в спинном мозге, различных отделах кишечника, семявыносящем протоке, тканях глаза, мигательной перепонке, селезенке, плаценте, легких, миокарде, сосудистом сплетении. Они найдены в мембране лимфоцитов человека (Бахарев, 1985). Определение рецепторов в периферической нервной системе и изолированных органах основываются на способности налоксона (антагониста опиатов) блокировать эффект опиатов и опиоидных пептидов. Опиатные рецепторы локализованы на мембранах соответствующих клеток-мишеней. Взаимодействие энкефалинов с рецепторами играет одну из ключевых ролей в возникновении противоболевых эффектов. Ответ клетки и суммарный ответ

организма на введение того или иного биологически активного вещества зависит от концентрации рецепторов на мембранах, от концентрации самого вещества и от сродства вещества-регулятора к данным рецепторам (Булаев, 1982).

В организме существует несколько типов рецепторов, специфически связывающих опиаты и опиоидные пептиды. В настоящее время выделяют четыре типа таких рецепторов: мю(р.), дельта (5), кап па (к) и сигма(ст). Принято считать, что наиболее активно связываются с опиатами и опиоидными пептидами и-рецепторы (Бахарев, 1985); лей-знкефалины имеют наименьшее сродство к ц-рецепторам (Булаев, 1982). ц-рецепторы опосредуют противоболевые эффекты, ощущение возбуждения, прилива сил, удовольствия, 5-рецепторы участвуют в регуляции эмоционального поведения и воздействия опиатов на функции внутренних органов, в частности на дыхание. Активация каппа-рецепторов приводит к чувству успокоения, а активация сигма-рецепторов вызывает галлюцинации, чувство тоски, агрессию (Бахарев, 1985). Мет-энкефалин наиболее интенсивно связывается с 8- и к- рецепторами (Дубинин, Захарова, 1995). Наибольшим сродством к дельта- рецепторам обладает Д-ала2-лей-энкефалин.

Для изучения взаимодействия лиганда с рецепторами используют метод, в основе которого лежит взаимодействие биологически активного вещества (лиганда) с рецептором, причем последний представляет собой встроенный в мембрану гликопротеин.. Примером практического использования лиганд - рецепторного метода служит изучение связывания с опиоидными рецепторами синтетического аналога лей-энкефалина гексапептида-даларгина. Показано, что он в высокой степени взаимодействует с дельта- рецепторами, несколько хуже с а-рецепторами и не связывается с каппа и сигма- рецепторами (Шитин, 1987). Помимо этого, даларгин может связываться с даларгин- связывающими белками клеток, мишеней, структура которых сходна со структурой опиоидных рецепторов (Изыкенова, Таранова, 1992).

Существование различных субпопуляций рецепторов и различное сродство к ним энкефалинов определяет характер физиологического действия этих пептидов (Коростылев, 1988).

1.4.5. Синтетические аналоги энкефалинов.

При проведении некоторых биологических тестов знкефалины демонстрируют относительно слабую активность.

В связи с этим энкефалины химически модифицируют для получения аналогов со свойствами, аналогичными или превосходящими таковые морфина. Как показали исследования, биологическая активность аналога зависит от характера и места его химической модификации.

Так, присутствие в аналоге энкефалина Ы-концевой основной группы оказывается существенно важным, но ее точное положение в пептиде не фиксировано. Пептид, удлиненный остатком аргинина в 6-м положении, сохраняет свою биологическую активность. Активность энкефалина увеличивается при замене одного из атомов водорода аминогруппы тирозина на метильную группу. Тирозин чувствителен к модификации, однако глицин-2 может быть заменен Д-аминокислотами, что приводит к. заметному увеличению морфиноподобной активности. Глицин-3 с успехом может быть заменен азаглицином. Фенольное кольцо фенилаланина имеет существенное значение, но в этом случае Ы-метилирование увеличивает активность пептида. Метионин допускает модификацию в широких пределах. Концевая карбоксильная группа оказывается несущественной для осуществления биологической активности: после её этерификации, амидирования и даже восстановления до спирта активность пептида сохраняется (Гайгер,1981).

Интерес к синтезированным аналогам энкефалина объясняется и тем, что они обладают нужными фармакологическими свойствами, относительно простым строением и доступностью синтеза. При создании синтетических аналогов энкефалинов стараются решить три основные задачи: 1) пептид должен быть стабилен в биологических средах; 2) он должен взаимодействовать с опиатными рецепторами; 3) препарат должен

проникать к своим клеткам-мишеням при заданном способе введения в организм {Бахарев, 1985).

В настоящее время созданы первые отечественные системы бактериального синтеза энкефалинов, которые были представлены лабораторией синтеза ВКНЦ АМН РФ.

Изучение взаимодействия алкилированного аналога лей-энкефалина ^2-ТИР-ГЛИ-ГЛИ-ФЕН-ЛЕЙ, где - алкильные радикалы) с опиоидными рецепторами показало, что степень связывания зависит от структуры радикала.

Азидным методом был получен (О-гис^-лей-энкефалин. Биологическая

активность синтезированного соединения, тестированного на препарате подвздошной кишки морской свинки, обнаружила невысокую активность связывания с ст-рецепторами, по сравнению с исходными лей-энкефалином (Зизити, М|Иоп, 1987).

Даларгин - один из первых синтетических аналогов лей-энкефалина, применяющихся в клинической практике.

1 2 3 4 5 6

Даларгин : Н-ТИР-О-АЛА-ГЛИ-ФЕН-ЛЕЙ-АРГ-ОН

Даларгин отличается от лей-энкефалина тем, что является не пенталептидом, а гексапептидом, а глицин во втором положении заменен на О-аланин, который защищает пептид от атаки карбоксипептидаз и улучшает его проникающую способность, а также способствует увеличению продолжительности существования пептида. В шестом положении добавляется аминокислота аргинин,

Даларгин синтезирован методом твердофазного синтеза в лаборатории химии пептидов под руководством лауреата Государственной премии М.И. Титова, на базе Всесоюзного кардиологического центра АМН России. Даларгин - синтетический суперактивный аналог лей-энкефалина, представляет собой белый мелкокристаллический порошок, легко растворимый в воде; в стерильных водных растворах стоек несколько лет. Даларгин - один из первых аналогов опиоидных пептидов, на основе которого создан лекарственный препарат.

В первую очередь, одной из важных характеристик любого аналога является время его жизни в организме. Исследование этой характеристики необходимо для выявления перспектив применения даларгина в качестве фармакологического препарата.

С помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) изучено расщепление даларгина в сыворотке крови человека (Исакова и др., 1987). Этот метод позволяет регистрировать одновременно сигналы исходного пептида, а также продуктов его распада. Количество образующегося фрагмента по отношению к исходному пептиду можно оценить, сравнивая амплитуды сигналов соответственно фрагмента и исходного пептида. Перед началом измерений в сыворотку крови человека добавили даларгин таким образом, чтобы концентрация пептида в образце составила 1 нг/мл. Через определенные промежутки времени измерялась амплитуда сигналов, она постоянно уменьшалась. Через 84 минуты завершился распад даларгина.

Авторы показали, что расщепление даларгина идет с С-концевой части молекулы и предположили следующую схему распада даларгина:

ТИР-О-АЛА-ГЛИ-ФЕН-ЛЕИ-АРГ

дипептидилкарбоксипептидаза

ТИР-О-АЛА-ГЛИ-ФЕН+ЛЕИ-АРГ

4

ЛЕИ+АРГ

арбоксипептидаза

ТИР-О-АЛА-ГЛИ- ФЕН-ЛЕИ+АРГ

Таким образом, видно, что даларгин расщепляется на стабильные тетрапептиды и пентапептиды. Такой распад подразумевает наличие двух основных деградирующих систем: карбоксипептидазы и дипептидилкарбоксипептидазы. Эти две системы расщепляют гексапептид до тетрапептида и пентапептида, но далее деградация прекращается. По всей видимости, какие-то конформационные характеристики как пентапептида так и тетрапептида препятствуют воздействию ферментов. Оба продукта деградации активно связываются с опиатными рецепторами.

Из всего изложенного выше можно сделать вывод, что время жизни даларгина в организме сравнительно невелико (84 минуты) и продукты,

получающиеся в результате его распада, являются биологически активными веществами. Все это позволяет использовать препарат как в фармакологии, так и при изучении молекулярных механизмов его воздействия на организм биологических объектов, в том числе и насекомых.

1.4.6. Физиологический эффект даларгина.

Спектр физиологического влияния даларгина достаточно широк. Даларгин, введенный периферически в больших дозах, может проникать целиком или в виде биологически активных фрагментов через гематоэнцефалический барьер и непосредственно взаимодействовать с центральными опиоидными рецепторами мозга или, как это показано для других опиоидов, индуцировать выброс эндогенных опиоидных веществ (Ярыгин, 1987).

Одно из главных направлений современного этапа развития нейрохимических механизмов обучения и памяти состоит в выяснении роли нейропептидов в этих механизмах. Есть сведения о том, что нейропептиды улучшают обучение и память у животных, где исходные показатели низки, но почти не влияют на хорошо обучающихся и запоминающих животных. Так, введение даларгина не влияет на процессы обучения и памяти у крыс в 2-х месячном возрасте и улучшает эти процессы в несколько раз у 7-8 месячных животных (Диш, Пузырева, 1987). Это подтверждает представление о том, что выраженность эффектов нейропептидов и их синтетических аналогов тем выше, чем дальше от нормы соответствующая функция, что еще раз доказывает регуляторный характер их действия.

Классические представления о регуляции секреции пищеварительных желез постулируют пусковые и корригирирующие влияния на них нервно-гуморальных механизмов. Коррекция секреции обеспечивает её адаптированность к виду принятой пищи. Пептидэргические механизмы могут реализовать свои эффекты непосредственно и опосредовано. В экспериментальных исследованиях панкреатической секреции у людей выявлено, что под влиянием даларгина происходит снижение панкреатической секреции. Обьем панкреатического сока уменьшался в 3

раза, а выделение в его составе протеаз - в 4-6 раз. Тормозное действие препарата продолжается в течении 2 часов после внутримышечной инъекции 2-3 мг даларгина. Аналогичные исследования были проведены на собаках. Полученные данные свидетельствуют о том, что энкефалининдуцированное угнетение панкреатической секреции носит опосредованный характер (Коротько и др., 1987).

Накоплено много фактов, доказывающих роль даларгина в регуляции процессов клеточного деления. Установлено, что этот синтетический аналог лей-энкефалина ускоряет регенерацию головной капсулы у планарии (Шейман и др., 1985). Был проведен анализ процессов клеточного деления в эпителии языка белых крыс (Тимошин, Жданов, 1987) Он показал, что даларгин вызывает активацию процессов синтеза ДНК. Индекс мышечных ядер увеличивался у животных, получавших препарат, в 1.5-1.7 раза. Результаты этого исследования позволяют считать эндогенные опиоидные пептиды важным звеном регуляции процессов клеточного деления. Это подтверждается исследованием влияния даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговицы глаза белых крыс (Тимошин и др., 1987). Исследователями был сделан вывод о том, что даларгин вызывает стимуляцию процессов пролиферации; об этом свидетельствует увеличение ДНК - синтезирующих ядер, как при однократном, так и при пятикратном введении препарата. В связи с этим представляется важным свойство этого лиганда блокировать образование внутриклеточного цАМФ, являющегося ингибитором процессов пролиферации.

1.4,7. Фармакологическая активность даларгина.

В настоящее время даларгин внедрен в медицинскую практику.

Группой авторов было показано влияние даларгина на гемодинамику. На моделях острого некроза было обнаружено, что под влиянием даларгина снижалась активность в крови животных ряда ферментов, характеризующих наличие ишемии миокарда: креатинкиназы, лактатдегидрогеназы, аспартат-и аланинаминотрансферазы. Наблюдалась также нормализация параметров ЭКГ. Полученные результаты позволили предположить, что данный аналог лей-энкефалина способствует ограничению зоны ишемии миокарда. В

механизме этого влияния, по видимому, лежит ограничение повреждающих эффектов на миокард избыточных количеств катехоламинов. Не исключено, что препарат способствует и стабилизации мембран кардиомиоцитов. Учитывая эти экспериментальные данные, в клиниках Сибирского филиала ВКНЦ АМН России проведены клинические испытания препарата даларгина у больных острым инфарктом миокарда (Чазов и др., 1984).

Известно, что даларгин обладает выраженным защитным антистрессорным эффектом, влияет на уровень АКТГ, кортизона, гормонов гипофизарно-тиреоидного комплекса в плазме крови и содержание цАМФ в тканях надпочечников тимуса при стрессе (Лишманов и др., 1985). Установлено, что даларгин защищает слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки в условиях язвообразования. Механизм действия может быть связан с ускорением восстановительных процессов в тканях. Удалось установить, что налоксон предотвращает регенеративное действие даларгина. Это свидетельствует о том, что активность даларгина проявляется через специфические опиатные рецепторы (Лишманов и др., 1985).

Изучается роль эндогенных опиоидных пептидов в иммунологии. Исследования показали, что даларгин изменяет как спонтанную, так и стимулированную бласттрансформацию лимфоцитов периферической крови человека. Это изменение не было однонаправленным: у одних обследованных наблюдалось усиление, а у других снижение или отсутствие влияния на пролиферативный эффект. Показано, что характер влияния даларгина на уровень стимулирования бласттрансформации лимфоцитов статистически достоверно связан с высотой исходного пролиферативного ответа: пептид усиливает слабый ответ и подавляет высокий ответ (Виноградов и др., 1984).

В наше время особую актуальность приобретает поиск рациональной терапии, корригирующей различные нарушения, возникающие у потомства вследствие алкоголизации матери в период беременности. С этой целью был использован даларгин, обладающий способностью активизировать рост ткани в местах повреждения и недоразвития, а также нормализовать тканевое дыхание в коре головного мозга (Левина и др., 1987).

В лаборатории института медико-биологических проблем даларгин применяется для лечения вестибуловегетативного синдрома (ВВС). Изучено его влияние на динамику содержания АКТГ, кортизона и р-эндорфина на фоне вестибулярного стресса (Ясмецов и др., 1987). Отмечено, что контроль выброса АКТГ осуществляется через опиоидные рецепторы, с которыми взаимодействует даларгин. Нарушение отношения АКТГ/р-эндорфин в сторону его увеличения характерно для хронического стресса и приводит к повышению чувствительности к боли. В экспериментах это соотношение было наибольшим после введения даларгина.

Таким образом, синтетический аналог лей-зн кефали на - даларгин обладает более широким спектром физиологического и фармакологического действия на организм животных и человека, чем эндогенные опиоидные пептиды.

Итак, из анализа всех приведенных выше литературных данных следует, что современные представления о регуляторных пептидах животных, и насекомых в частности, сводятся в первую очередь к констатации общности пептидэргического материала у животных различных таксономических групп, о чем свидетельствует сходство иммуноподобия пептидов низших животных к пептидам высших животных. В связи с этим осуществляются попытки проследить филогенез низкомолекулярных регуляторных пептидов на основе сопоставления их первичной структуры и функциональной роли. Однако, исследование роли пептидов ограничивается как правило, изучением поведенческих реакций и изменений физиологических процессов у животных. Сведений о регуляции низкомолекулярными пептидами метаболизма на биохимическом уровне в литературе крайне мало.

Литературные данные последних лет свидетельствует и о том, что регуляторные пептиды насекомых являются объектом пристального внимания. Учитывая принципиальное сходство пептидэргических систем у позвоночных и насекомых, а также огромную экономическую важность насекомых и особенностей их развития, характеризующихся быстрой сменой

морфологических форм под контролем гормональных систем, становится очевидным, что насекомые являются не только удобным биологическим материалом, но и прекрасным объектом для изучения регуляции метаболизма в целом. Между тем, именно регуляция развития низкомолекулярными пептидами у насекомых совершенно не изучена.

Хорошо известно, что в тканях представителей класса насекомых присутствует много разнообразных пептидов различного метаболического назначения и физиологического действия. Среди них, в частности, ди- и трипептиды, выполняющие уникальную функцию запасания незаменимых аминокислот, пептиды средней молекулярной массы, обладающие сильным и ярко выраженным физиологическим действием, такие как миотропные, кардиоактивные, диуретические и многие другие. Среди этих пептидов наибольший интерес вызывают опиоидные пептиды лей- и мет-энкефалины, найденные у нескольких видов насекомых. Роль этих пептидов в регуляции обменных процессов остается неизвестной.

Наряду с выявлением физиологической роли эндогенных пептидов осуществляются попытки изучения действия на организм их синтетических аналогов, что открывает возможность создания высокоэффективных фармакологических агентов и регуляторов роста. Учитывая, что даларгин, синтетический аналог лей-энкефалина, используется в настоящее время в качестве лекарственного препарата, оценка его воздействия на обмен веществ, как при однократном, так и при хроническом введении представляет не только теоретический, но и практический интерес.

Одновременное использование для изучения метаболизма метода радиоактивных индикаторов и синтетических аналогов низкомолекулярных регуляторных пептидов может раскрыть молекулярные механизмы воздействия пептидов на отдельные пути обмена веществ, оценить возможность их применения в качестве регуляторов роста.

Таким образом, анализ литературных данных, касающихся низкомолекулярных пептидов животных различных таксономических групп, убеждает в актуальности выбранной темы исследования, целесообразности дальнейшего более углубленного изучения регуляции низкомолекулярными пептидами различных путей метаболизма прежде всего у насекомых, но не

только потому, что у этого самого многочисленного на Земле классе животных это явление практически не изучено. Это актуально и в сравнительно биохимическом аспекте, открывающем новые горизонты в понимании молекулярных основ биоразнообразия и эволюции. Этой задаче и посвящена наша диссертация.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Минькова, Наталья Олеговна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Наша работа посвящена изучению регуляции лей-энкефалином и его синтетическим аналогом даларгином некоторых сторон метаболизма белков и нуклеиновых кислот у насекомых.

Целью данного исследования была детальная характеристика влияния лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на. обмен нуклеиновых кислот у насекомых, установление оптимальных доз и времени воздействия исследуемых пептидов, характера их влияния на биосинтез ДНК и РНК, сравнение уровня действия природного опиоидного пептида и его синтетического аналога и их локализации в клетке, а также характеристика действия этих пептидов на содержание белков и интенсивность их синтеза у восковой моли на заключительном этапе её личиночного развития.

В литературном обзоре обобщены результаты исследований низкомолекулярных регуляторных пептидов у одноклеточных организмов и животных различных таксономических групп. Особое внимание уделено регуляторным пептидам насекомых и их сравнению с таковыми у высших животных.

Детальное рассмотрение литературы, касающейся низкомолекулярных пептидов у насекомых показало, что все сведения о регуляторных пептидах насекомых сводятся к установлению их первичной структуры и функциональной роли на физиологическом уровне, а также к доказательству иммуноподобия этих пептидов таковым позвоночных животных. Сведения об энкефалинах у насекомых с одной стороны, носят ограниченный характер, и сводятся в основном к данным об участии опиоидной системы в регуляции питания, поведения, двигательной активности, размножения и формировании иммунного ответа. Участие опиоидов в регуляции метаболизма у насекомых остается неизвестным. С другой стороны показано, что энкефалины и их синтетические аналоги могут контролировать у млекопитающих такие биохимические процессы, как биосинтез ДНК, РНК и белков, а также модулировать активность некоторых ферментов (лактатдегидрогеназы, аспартат- и аланинаминотрасферазы, орнитиндекарбоксилазы). Учитывая сходство пептидэргической системы насекомых и позвоночных, мы в нашей работе, используя ряд современных методов попытались раскрыть механизмы воздействия энкефалинов и их синтетических аналогов на отдельные стороны метаболизма белков и нуклеиновых кислот у насекомых и оценить возможность использования этих пептидов в качестве регуляторов роста.

В работе впервые представлены данные об изменении содержания нуклеиновых кислот под действием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина. Установлено, что введение в организм личинок восковой моли лей-энкефалина в количестве 10 &-1012 моль на особь и даларгина в количестве 10"8-10"11 моль на особь приводит к дозозависимому увеличению содержания ДНК и РНК, причем эта зависимость носит сложный характер с неустойчивым, а иногда и противоположным эффектом при малых концентрациях. Даларгин вызывает изменение содержания нуклеиновых кислот и у имаго мучного хрущака. Увеличение содержания ДНК составляло 60-31% по сравнению с контролем после введения 10" -10" моль даларгина. При длительном воздействии в течение 3-х суток оптимальной была доза 10"|3 моль пептида на особь, эффект составлял 91%. Менее ярко был выражен эффект синтетического аналога лей-энкефалина на обмен РНК у обоих видов насекомых, причем максимальное увеличение содержания РНК не превышало 25% по сравнению с контролем. Следует отметить, что направление действия обоих пептидов одинаково, но количественно более выражено у лей-энкефалина, чем у даларгина.

Исследование влияния лей-энкефалина и даларгина на интенсивность синтеза ДНК у насекомых показало, что введение этих пептидов личинкам восковой моли вызывает дозозависимое увеличение радиоактивности ДНК, причем эта зависимость носит сложный полимодальный характер колоколообразного типа с максимальным ответом в диапазоне доз 10" °-10"% моль при введении лей-энкефалина и 10"в-10"и моль при инъекции даларгина и выражается приростом радиоактивности на 124-136% и 42-68% соответственно.

Следовательно, эффект воздействия лей-энкефалина на интенсивность синтеза ДНК у восковой моли значительно больше, чем даларгина. У мучного хрущака при исследовании влияния даларгина наблюдалась сходная, но не идентичная картина. Максимальный ответ на введение даларгина выражается в приросте радиоактивности ДНК на 162% в опыте по сравнению с контролем при инъекции 10~9 моль пептида на особь, что существенно превосходит таковой показатель у восковой моли. По-видимому, это связано с различной интенсивность метаболизма, определяемой фазой развития и видоспецифичностью насекомого.

Аналогичная дозовая зависимость характерна практически для всех регуляторных пептидов. Сложный характер дозовой зависимости сейчас объясняют существованием субпопуляций рецепторов, которые имеют различную аффинность к действующему веществу и дают различные суммарные эффекты (Сазанов и др.,1992, Brown et al., 1985, Robertson, Grutsch, 1987). Регуляторные пептиды, которые несомненно являются биологически активными веществами, по-видимому, могут иметь в клетке одновременно несколько мишеней, воздействие на которые вызывает изменение тех или иных сторон клеточного метаболизма. Взаимодействие мишеней и путей обмена, расположенных на разных иерархических уровнях системы клеточной регуляции, может отражаться, в частности, в сложном характере наблюдаемых дозовых зависимостей (Календо, 1982, Копанев и др., 1988, Robertson, Grutsch, 1987). На молекулярном уровне предложен ряд моделей взаимодействия рецепторов, их положительной и отрицательной кооперации, кластеризации, интернализации и т.д., приводящих к сложному виду дозовых кривых (Бурлакова и др., 1990).

Различия в динамике накопления дополнительных количеств ДНК и интенсивностью включения меченого предшественника возможно связаны с наличием в клеточных ядрах животных свободных молекул ДНК, которые так же, как и хромосомные ДНК содержат уникальные и повторяющиеся последовательности и отличаются только скоростью включения 3Н-тимидина, что вероятно свидетельствует о разных путях их синтеза (Сухова и др.,1996). Установлено, что свободные ДНК имеют кольцевую структуру и представляют собой субмикроскопические экстрахромосомные элементы (Rulz et а!., 1989, Esnault et а!., 1994) и обладают метаболической автономностью (Шелепов и др., 1995). Существует мнение, что специфическая фракция относительно быстро обменивающихся ДНК представлена экстракопиями наиболее активных генов. Окончательная функция метаболически лабильной ДНК не установлена (Ашмарин и др., 1996).

Учитывая тот факт, что под влиянием пептидов у восковой моли и мучного хрущака происходит мощное усиление биосинтеза ДНК, логично было предположить, что это может быть связано с увеличением активности ДНК-полимеразного комплекса у исследуемых насекомых. При исследовании воздействия лей-энкефалина и даларгина на ДНК-полимеразную активность установлено, что под влиянием лей-энкефалина суммарная активность ДНК-полимераз увеличивается на 21%, а под влиянием даларгина - на 30%. Следовательно, обнаруженное нами некоторое увеличение активности ДНК-синтезирующих ферментов до определенной степени можно считать коррелирующим с увеличением интенсивности включения меченого предшественника в ДНК. Полученные данные дают основание полагать, что в регуляции обмена ДНК исследуемыми пептидами задействованы разнообразные, в том числе и ферментативные механизмы.

Под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у исследуемых насекомых наблюдалось увеличение включения меченого предшественника в РНК . У обоих видов насекомых уровень увеличения общей радиоактивности зависит от количества вводимого пептида, но эта зависимость не является линейной, а носит четко выраженный полимодальный характер с различным количеством экстремумов. Характер и пределы изменений удельной радиоактивности РНК, являющейся показателем интенсивности её синтеза, у восковой моли под влиянием лей-энкефалина и даларгина практически полностью совпадают с таковыми общей радиоактивности. Это свидетельствует о том, что под влиянием пептидов происходит значительное увеличение биосинтеза РНК

Сравнение влияния лей-энкефалина и его аналога даларгина на интенсивность синтеза РНК показывает, что характер действия пептидов одинаков, но количественные характеристики в данном случае выше у даларгина.

Из вышеизложенного следует, что лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин вызывают значительные изменения в обмене нуклеиновых кислот, проявляющиеся в мощном усилении биосинтеза ДНК и РНК, и накоплении их дополнительных количеств.

Столь яркие изменения в биосинтезе нуклеиновых кислот, по нашему мнению, не могли не отразится и на процессах биосинтеза белков у насекомых. Поэтому мы исследовали влияние лей-энкефалина и даларгина на обмен белков на заключительной стадии личиночного развития восковой моли, то есть в период шелкообразования. Нами установлено, что инъекции исследуемых пептидов в гемолимфу восковой моли также вызывают дозозависимое изменение содержания растворимых белков как на стадии перед завивкой , так и в первый день завивки кокона, причем зависимость доза - эффект носит сложный полимодальный характер с четко выраженными двумя максимумами в области 10~9 и 10' ^ 10"13 моля пептидов. Следует отметить, что лей-энкефалин и даларгин индуцируют сходные изменения содержания белка, как по количественному выражению эффекта, так и по набору доз, вызывающих этот эффект.

При сопоставлении количественного содержания белка и уровня радиоактивности под действием лей-энкефалина оказалось, что кривые зависимости изменения содержания белка и изменения радиоактивности белков от дозы идентичны, что является показателем интенсивного белкового синтеза.

Идентичными являются и кривая зависимости радиоактивности РНК от дозы вводимого лей-энкефалина и кривая радиоактивности растворимых белков в период завивки кокона в зависимости от вводимых доз лей-энкефалина. Следовательно прослеживается важная корреляция между новообразованием РНК под действием пептидов и синтезом белков под действием эндогенного пептида.

Исследование влияния синтетического аналога даларгина на биосинтез белков у личинок восковой моли дало возможность сопоставить характер влияния этих пептидов. Даларгин индуцировал аналогичные изменения в содержании белков, интенсивности их синтеза и способен влиять на радиоактивность белков кокона.

Исследование субклеточной локализации опиоидных пептидов дает возможность подойти к выяснению их функциональной роли и в некоторой степени механизма их действия. Нами показано, что 'Н-даларгин способен проникать через клеточные мембраны и достигать клеточных органелл уже через 1 час после его введения в гемолимфу восковой моли, о чем свидетельствует высокой уровень радиоактивности в цитозоле. Значительное количество меченого даларгина обнаружено в ядерной фракции. В течение суток радиоактивность ядерной фракции увеличивалась в 1,4 раза, она достигала максимума через сутки после введения пептида, а затем уменьшалась. По прошествии суток в ядерной фракции обнаружено 0,00924x10"12 моль даларгина, что составляет 1,5% от инъецированного количества. Следовательно, в ядра проникает 5;б><10|С молекул пептида.

Полученные данные подтверждают наши предположения о прямом или косвенном действии энкефалинов на геном на уровне ядра. Именно через сутки после введения даларгина у восковой моли наблюдалось дозозависимое увеличение содержания ДНК на 35% и РНК на 25% по сравнению с контролем, то есть происходило изменение интенсивности синтеза нуклеиновых кислот (на 30-111% в случае РНК и 43-88% в случае ДНК) при инъекции различных доз пептида.

Оказывая столь глубокое воздействие на метаболизм нуклеиновых кислот энкефалины, их синтетические аналоги и другие опиоидные пептиды в клетках, вероятно, действуют не только по классической схеме, а именно -связываются с рецепторами в клеточной оболочке, активируя протеи ншназы, в результате чего происходит фосфорилирование ряда белков, которые регулируют репликацию, транскрипцию и трансляцию. Следует учитывать и другой возможный механизм действия опиоидов: проникая в цитоплазму: энкефалины связываются с рецепторами, находящимися в ядерной оболочке, и переходят в ядро, где специфически связываются с хроматином и, в конечном счете, изменяя процессы репликации и транскрипции тех или иных генов.

В целом изучение влияния лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот позволило установить возможность регуляции опиоидными пептидами биохимических процессов у насекомых. Показана регуляция энкефалинами и подобными им веществами деятельности ядерного аппарата клеток и синтеза белков на уровне транскрипции. Расшифровка механизма этих явлений представляет большой интерес с целью использования этих энкефалинов и их аналогов в качестве регуляторов роста и численности насекомых.

ЕЗЬэ1 ВОДЫ I

1. Лей-энкефалин и даларгин вызывают дозозависимое изменение содержания нуклеиновых кислот у двух исследованных видов насекомых (СаИепа теПопеПа Ь. и ТепеЬпо тоПЬэг 1.). Оба пептида проявляют наибольшую активность при введении 10"8 -Ю"10 моля на особь и в большей мере изменяют содержание ДНК чем РНК, причем максимальный эффект лей-энкефалина выше, чем даларгина.

2. Лей-энкефалин и даларгин вызывают дозозависимое изменение интенсивности синтеза ДНК у обоих исследованных видов насекомых. Для всех исследуемых доз влияние лей-энкефалина на изменение радиоактивности ДНК выражено сильнее, чем даларгина. Количественное выражение влияния пептидов зависит от вида насекомого и интенсивности метаболизма у него.

3. Под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у личинок восковой моли происходит увеличение активности ДНК-си нтезирующих ферментов.

4. Дозозависимое влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на биосинтез РНК у личинок восковой моли и мучного хрущака выражается в накоплении дополнительных количеств РНК и усилении биосинтеза РНК. На стадии перед завивкой кокона у восковой моли лей-энкефалин и даларгин в количестве 10"э и 10"!3 моль на особь значительно усиливают включение 3Н-уридинмонофосфата в одну из фракций РНК, по-видимому, метаболически активную, быстрометящуюся РНК. Полученные нами, а также имеющиеся литературные данные, позволяют предположить, что лей-энкефалин и даларгин контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции.

5. Лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин индуцируют сходные изменения содержания белков у личинок восковой моли на заключительном этапе личиночного развития, как по количественному выражению эффекта, так и по набору доз, вызывающих этот эффект.

8. Лей-энкефалин и даларгин модулируют биосинтез белков у личинок восковой моли на стадии перед завивкой и в период завивки, регулируя процессы шелкообразования.

7. Доказано проникновение значительного количества '"Н-даларгина в ядра клеток личинок СаПепа теНопеПа, что, вероятно, свидетельствует о возможности прямого воздействия опиоидных пептидов на геном насекомых.

8. Определенные количества даларгина модулируют развитие восковой моли, что позволяет обсуждать перспективы его применения в качестве регулятора роста и численности насекомых.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Минькова, Наталья Олеговна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Аванов А.Я. Конформационный анализ тахикининов.// Биоорганическая химия. 1991. Т. 17. №5. С.637-640.

2. Амбарцумова С.И. Азотистый обмен у контрастных по продуктивности пород тутового шелкопряда: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ашхабад. 1968. 16с.

3. Арефьев В.А., Ми код и на Е.В., Нарушение метафазных хромосомных наборов стальноголового лосося Salmo gairdneri Rich, после воздействия олигопептида даларгина.// Генетика. 1989. Т.25. №11. С.12-15.

4. Ашмарин И.П. Гипотеза о существовании новой высшей категории в иерархии регуляторных пептидов.// Нейрохимия. 1987. Т.6. №1. С.23-27.

5. Ашмарин И.П. Длительное изменение физиологического статуса организма посредством иммунизации эндогенных регуляторов. // ДАН СССР сер. Биология. 1989. №1. С. 11 -18.

6. Ашмарин И.П. Филогенетически древние регуляторные пептиды новейших систем высших позвоночных. // Эволюционная биохимия и физиология. 1986. Т. 22. №4. С. 119-124.

7. Ашмарин И.П. Филогенетическое происхождение регуляторных пептидов. // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Физиология человека и животных. 1988. Т.34. С.369-375.

8. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П Нейропептиды.//в кн. "Нейрохимия" под ред. Ашмарина И.П. и Стукал о ва П.В.. М.: изд-во Института Биомедицинской химии РАМН. 1996. С.296-333.

9. Ашмарин И.П.; Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность.// Биохимия. 1986. Т.51. В.4. С.531-545.

Ю.Бахарев В.Д. Пептиды - регуляторы.// сер. "Биология". М.: изд-во "Знание". 1985. №6. С.23-40.

И.Булаев В.М. Рецепторы опиатов и их лиганды. // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Фармакология и химиотерапевтические средства. М. 1982. Т. 13. С.101-156.

12.Бурлакова Е.Б., Конрадов A.A., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990. N2. С. 184-193.

13.Видута О.Д. Структурное состояние ДНК и активность генома в онтогенезе тутового шелкопряда. //Дис. канд. биол. наук. М. 1975. С.31-33.

14. Виноградов В. А., Васильева Е.В., Насонов Е.Л. Модуляция пролиферативного ответа лимфоцитов новым аналогом знкефалинов-даларгином.//Терапевт, архив. 1984. Т.56. №11. С.114-116.

15.Власов В.А., Дымшиц Г.М., Лаврик О.И. Структурно-функциональная динамика ДНК- и РНК-полимераз.// Молекулярная биология. 1998. Т.32. №1. С.5-18.

16.Вознесенский В.Л. Некоторые вопросы интерпретации результатов исследований, проводимых с помощью радиоактивных изотопов. // Транспорт ассимиляторов и отложение веществ в запас у растений. Труды биолого-почвенного института. Дальневосточный науч. центр АН СССР. 1973. Т.20(123). С.282-288.

17.Гайгер Р. Химия регуляции нейропептидами.//в кн. "Эндорфины" под ред. Э. Коста и М. Тарабукки. М.: Мир. 1981. С.35-42.

18.Галкин В.И., Павленко Л.В. Влияние аналогов энкефалинов на устойчивость животных к гипоксической гипоксии.// В сб. "Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии". Тезисы докл. I Всесоюз. конф. по нейропептидам. Томск. 1985. С. 41-42.

19.Громов Л.А., Криворотов C.B. Локализация опиатных рецепторов на внутренней поверхности клеточной мембраны.// Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1991. Т.77. №3. С. 126-130.

20.Гроховский С.Л., Николаев В.А., Зубарев В.Е., Суровая А Н... Жузе А.Л., Чернов Б.К, Сидорова Н.Ю., Заседателев A.C., Гурский Г.В. Специфическое расщепление ДНК аналогом нетропсина, содержащим хелатирующий ион меди (II) пептид Gly-Gly-His.// Молекулярная биология. 1992. Т.26. №6. С. 1274-1297.

21.Гроховский С.Л., Суровая А.Н., Жузе А.Л., Гурский Г.В. Синтез и взаимодействие с ДНК двух пептидов, модулирующих ДНК-связывающий

домен активатора транскрипции v-Jun.// Молекулярная биология. 1994. Т.28. №5. С.1137-1148.

22.Диш Т. Н., Пузырева Т. Г. Влияние нейропептидов на обучение и память крыс разного возраста.// в сб. "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" под ред. В.Н. Ярыгина и Е.И. Гусева. М. 1987. С.24-28.

23. Дубинин К. В., Захарова Л. А. Факторы, опосредующие иммуномодулирующий эффект мет-эн кефали на: влияние дозы митогена, стадии клеточной активации и времени внесения опиоида.// Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1995. Т.119. №4. С.398-401.

24.3агуляев А.К. Моли и огневки- вредители зерна и продовольственных запасов. М.: Наука. 1965. С.270-281.

25.3амятнин A.A. Компьютерная биохимия эндогенных регуляторных олигопептидов. // Успехи биологической химии. 1996. Т.36. С.87-112.

26.Изыкенова Г. А., Таранова Н.П. Даларгинсвязывающие белки синаптических мембран мозга крыс: выделение и сравнение их свойств со свойствами опиатных рецепторов.// Биохимия. 1992. Т.52. №5. С.663-669.

27.Ильинский О.Б., Спевак С.Е., Соловьёва А.И., Шехгер А.Б., Титов М.И., Беспалова Ж.Д. Влияние пептидов на заживление кожных ран.//В сб. "Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии." Тезисы I Всесоюз, конф. по нейропептидам. Томск. 1985. С.58-59.

28.Инакина Н.М.. Розенталь Г.Ф., Чипенс Г.И. Определение опиодной активности D-ala2 содержащих аналогов энкефалинов методом радиорецепторного анализа, //в сб. "Методы получения и анализа биохимических препаратов." Тезисы докл. V Всесоюз. конф. Рига. 1987. С.175.

29.Исакова О.Л., Сепетов Н.Ф., Беспалова М.Д., Бушуев В.Н., Виноградов В.А., Рууге Э.К., Титов М.И. Исследование деградации пептидов в сыворотке крови методом 1Н-ЯМР.// Биоорганическая химия. 1986. Т. 12. №1. С. 106-111.

30.Календо Г.С. Ранние реакции клеток на ионизирующее излучение и их роль в защите и сенсибилизации. М.: Энергоиздат. 1982. 96с.

31.Камкин А. Г. Влияние некоторых поведенческих активных пептидов на межклеточное взаимодействие гигантских нейронов беспозвоночных. // Дис. канд. мед. наук. М. 1984. 276с.

32.Карамян А.И. Вопросы эволюционной физиологии нервной системы. // Вестник АН СССР. 1956. Т.8. С. 119-122.

33.Карамян А.И., Соллертинекая Т.И. Влияние опиоидных нейропептидов и дериватов в регуляции поведенческой деятельности в восходящем ряду млекопитающих. // В сб. "Олигопептиды, как регуляторы функций организма." под ред. В.Н. Ярыги на и Е.И. Гусева. 1987. С.43-65.

34.Карамян А.И.: Соллертинская Т.И. О некоторых особенностях развития гипоталамо- полушарных взаимодействий в филогенезе позвоночных. // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1984. Т.50. №8. С.962-974.

Зб.Колесанова Е.Ф. Аминопептидазы мозга- ферменты деградации энкефалинов.//в сб. "Олигопептиды как регуляторы функций организма", под ред. В.Н. Ярыгина и Е.И. Гусева. М. 1987. С.75-79.

36.Коничев A.C., Гаверова Ю.П, Пиункова С.А., Бородин С.А., Филиппович Ю.Б. Влияние даларгина на активность фосфоглюкомутазы, РНК-азы и фосфатазного комплекса тутового шелкопряда./МПГУ им. Ленина. М. 1996. депонировано в ВИНИТИ. №2443-В96.

37.Копанев В.А., Гинзбург Э.Х., Семенова В.Н. Метод вероятностной оценки токсического эффекта. Новосибирск: Наука. 1988. 123С.

38.Коростылев С. А. Влияние эндогенных опиоидных пептидов на антителогенез при первичном иммунном ответе на эритроциты барана.// Фармакология и токсикология. 1988. №4. С.83-85.

ЗЭ.Коротько Г.Ф., Курзанов А.Н., Сухотерина Л.А., Алейник В.А., Ахмедов Г.Э. Пептидергическая коррекция секреции ферментов желудочными и поджелудочными железами.// в сб. "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" М. 1987. С.130-135.

40.Костерлиц Г.В., Хьюс Д. Развитие концепций опиатных рецепторов и их лигандов.// в кн. Эндорфины. М.: Мир. 1981. С.43-55.

41.Краевский А.Л., Куханова М.К. Репликация ДНК у эукариот.// Итоги науки и техники ВИНИТИ. Молекулярная биология. М. 1986. Т.22. С.5-132.

4 2.Кривченкова P.C. Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий.// В кн. "Современные методы в биохимии" под ред. Ореховича В.Н. М.: Медицина. 1977. С.47-49.

43.Куранова О.П., Краснов П.А., Караванов A.A., Филиппович Ю.Б. Выделение и очистка ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда. // Онтогенез. 1985. Т.16. №1. С.88-91.

44.Курганов Б.И. Аллостеричекие ферменты.//М.:Наука. 1978. 387С.

45.Лаптева Т.И. Метаболизм белков в тканях тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития в связи с шелкообразованием и продуктивностью.//Дис. канд. биол. наук. М. 1981. 246с.

46.Лаптева Т.И., Микодина Е.В., Фомина Г.Т., Филиппович Ю.Б. Влияние синтетического аналога лей-энкефалина даларгина на содержание белка и нуклеиновых кислот в мышцах радужной форели. II Бюл. эксп. биологии и медицины. 1989. Т. 107. №4. С.473-475.

47.Левина О.Л., Коломейцева И.А., Нозрачева Л.В. Коррегирующий эффект синтетического гексапептида даларгина при нарушениях, вызванных антенатальной алкогольной интоксикацией.// В сб. "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" под ред. В.Н. Ярыгина и Е.И. Гусева. М. 1987. С.28-31.

48.Легостаев Г.Н., Захаров Н.Д. Влияние энкефалинов на активность центральных нейронов у улитки Helix pomatia и белой мыши. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 1986. Т.21. №3. С.327-328.

49.Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Титов М.И. О механизме антистрессорного воздействия ала2-лей5-арг6-энкефалина.// Бюл. эксп. биологии и медицины. 1985. Т. 100. №9. С.168-270.

50.Маслова Л.В.. Лишманов Ю.Б.. Смагин Г.Н. Участие опоидных пептидов в регуляции биосинтеза миокардиального белка при стрессе и адаптации. // Вопр. мед. химии. 1991. Т.37. №1. С.63-65.

51.Мик Д.Л., Бохан Т.Н. Использование жидкостной хроматографии под высоким давлением для изучения энкефалинов.// в кн. "Эндорфины" под ред. Э. Коста и М. Тарабукки. М.: Мир. 1981. С.148-154.

52.Микодина Е.В., Лаптева Т.И. Синтез нуклеиновых кислот в онтогенезе радужной форели Salmo gairdneri индуцированный синтетическим аналогом лей-энкефалина даларгином.// Вопросы ихтиологии. 1990. Т.ЗО. №1. С. 158-161.

53.Морозова В.П., Безбородова С.И. Кислая внеклеточная фосфомоноэстераза Aspergillus clavatus.// Микробиология. 1972. Т.12. №3. С.404-412.

54.Муратов О.В., Незлин А.П., Сахаров Д.А. Нейрогормоны беспозвоночных иммунореактивные к пептидному морфогену гидры. // 11 Всесоюз. конф. по нейронаукам. Тез. докл. 1988. С. 141-142.

55.Нарыжная Н.В., Дыгай И.А. Рецепторопосредованные механизмы модулирующего влияния энкефалинов на синтез миокардных белков при остром охлаждении.// Труды молодых ученых института фармакологии ТНЦ РАМН. Томск. 1995. С.33-35.

56.Николаев В.А,, Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю.. Гроховский С.Л., Заседателев A.C., Гурский Г.В., Жузе А.Л. Лиганды, обладающие сродством к определенным последовательностям пар ДНК. Синтез и связывание с ДНК аналогов нетропсина, содержащих хелатирующий ион меди пептид.// Молекулярная биология. 1993. Т.27. №1. С. 192-210.

57.Петровский Г. Г. Биохимические механизмы развития и метаболическая коррекция локальных нейродистрофий./Y Автореф. дис. доктора биол. наук. Минск. 1991. 32С.

58. Полонский В.М. Протективное действие синтетического аналога энкефалинов даларгина на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта у крыс.// В сб. "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" под ред. В.Н. Ярыги на и Е.И. Гусева. М. 1987. С.19-21.

59.Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: "Высшая школа". 1964. 326с.

60.Ружицин Б. Г. Белки и белково-нуклеиновые комплексы нервной ткани в филогенезе и онтогенезе животных: Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 1991. 17с.

• 61.Сегал O.A.. Мац В.Н., Боброва И.В. Влияние подкожного введения аналога энкефалина на содержание белка в нейронах гиппакампа крыс при выработке условного рефлекса двустороннего избегания.// Биологические науки. 1989. №5. С.59-64.

62.Седова М.А. Влияние олигопептида даларгина на морфо-физиологические показатели у рыб.// Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 1991. 21с.

63.Семина Н.В., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Влияние мет-эн кефали на на активность ферментов у американского таракана.// Научные труды МПГУ. сер.: Естественные науки. М.: Прометей. 1998. С.238-240.

64.Сепетов Н.Ф., Исакова О.Л. Исследование деградации даларгина в мембранах щеточной каймы энтероцитов.// Бюл. Всес. кардиол. науч. центра АН СССР. 1986. Т.9. №2. С.81-83.

бб.Смагин В.Г., Виноградов В.А., Булгаков С.А. Клиническая оценка гексапептида даларгина как средства лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.//Терапевт, архив. 1984. Т.56. №11. С.49-52.

66.Смирнов В.Н., Спирин A.C., Куллыев П., Збарский И.Б. Синтез РНК в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда.// Доклады АН СССР. 1964. Т. 155. №4. С.957-964.

67.Сухова Т.И., Сердюк О.И., Алехина Р.П., Шелепов В.П., Моисеев В.Л., Арсенин С.Л.. Раевская Г.Б., Лихтенштейн A.B. Свойства свободных ДНК, обнаруживаемых в клеточных ядрах.// Молекулярная биология. 1996. Т.ЗО. №3. С.552-557.

68.Такси Ж., Ласкар Ж. Нейропептиды синаптических ганглиев млекопитающих и амфибий. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986. Т.90. №5. С. 14-20.

69.Телепнева В. И. Четвертичная структура НАД-киназ и регуляция активности фермента.// В сб. "Молекулярные основы действия ферментов" под ред. С.Е. Северина и Г.А. Кочетова. М.:МГУ. 1985. С.136-156.

70.Тимошин С.С., Жданова Т.Ф. Изучение сравнительного влияния различных рецепторов на процессы клеточного деления эпителия языка

белых крыс.// Бюл. эксп. биологии и медицины. 1987. Т. 104. №9. С.354-355.

71 .Тимошин С.С., Панькова Т.Д., Титов М.И. Влияние лигандов огшоидных рецепторов на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.// Бюл. эксп. биологии и медицины. 1987. Т. 104. №8. С.229-230.

72.Филиппович Ю.Б. Связь белков и аминокислот гемолимфы с синтезом белков шелка в организме дубового шелкопряда.// Уч. записки МПГИ им.

B.И. Ленина, каф. орг. и биол. химии. 1953. Т.27. №17. С.125-181.

73.Филиппович Ю.Б., Алиева. М.И. Белки гемолимфы у разных пород тутового шелкопряда.// Прикладная биохимия и микробиология. 1967. Т.З. №2. С.192-197.

74.Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. "Практикум по общей биохимии".//М.: Просвещение. 1982. С. 184-185.

75.Филиппович Ю.Б., Макулин А.И. Аминокислотный состав белковых фракций гемолимфы тутового шелкопряда, полученных методом высаливания.// "Биохимия насекомых." Сб. трудов кафедры орг. и биол. химии МПГИ им. Ленина. 1977. В.19. С.55-59.

76.Харченко Е.П., Иванова В.П., Соколова Т.В., Левченко В.Ф. Блочный принцип организации регуляторных пептидов. // Биохимия. 1987. Т.52. №2.

C.279-289.

77.Чазов Е.И., Титов М.И., Виноградов В.А., Смагин В.Г. Клинико-экспериментальное изучение нейропептидов.// Вопр. мед. химии. 1984. Т.ЗО. №3. С.47-50.

78.Шагов Е.М., Уланова Г.И., Асланян Е.М. Оптимизированный метод культивирования пчелиной огневки (Galleria meilonella L.) как тест- объекта для оценки активности инсектицидов.// Сельскохозяйственная биология. 1986. №1. С.119-122.

79.Шейман И.М., Тирас Х.П., Виноградов В.А., Ефимов И.А. Аналог лей-энкефалина даларгин ускоряет регенерацию головного конца тела планарий // ДАН СССР. 1985. Т.284. №2. С.481-483.

80.Шелепов В.П., Арсенин С.Л., Алехина Р.П., Сухова Т.И., Моисеев В.Л., Раевская Г.Б., Лихтенштейн A.B. // Бюл. эксп. биологии и медицины. 1995. Т. 119. С.533-536.

81 .Шитин А.Г. Взаимодействие даларгина с центральными опиоидными рецепторами и с мембранами клеток внутренних органов.// Автореф. дисс. канд. биол. наук. ВКНЦ АМН СССР. М. 1987. 18 с.

82.Якубке Х.Д., Ешкай Т.Х. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: "Мир". 1985.

83.Янг X., Хонг Ю.Г., Фратта Д.С. Распад и биосинтез знкефалинов. //в кн. "Эндорфины" под ред. Э. Коста и М. Тарабукки. М.: "Мир". 1981. С.155-164.

84.Яновский О.Г., Захарова Л.А.. Василенко A.M. Влияние высоко- и низкомолекулярных факторов костного мозга на антителообразование и болевую чувствительность у животных.// Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1990. Т. 109. №1. С.55-57.

85.Ярыгин К.Н. Использование радиолиганд- рецепторного метода для изучения биологической активности опиоидных пептидов.// В сб. "Олигопептиды как регуляторы функций организма" под ред. В.Н. Ярыгина и Е.И. Гусева. М. 1984. С.24-30.

86.Ярыгин К.Н., Павлов С.А., Блохин А.Ф. Изучение взаимодействия синтетического аналога знкефалинов даларгина с мембранами энтероцитов крыс и человека: доказательство непрямого противоязвенного действия.// Функциональная диагностика и лечение заболеваний органов пищеварения: Мат. респ. науч. конф. при участии ВНОГ. Вильнюс, 22-23 сентября. 1988. ч.4. С.620-621.

87.Яснецов В.В., Шашков B.C. Дрозд Ю.В., Афонин Б.В. Функционирование системы гипофиз - кора надпочечников при вистибуло-вегетативном синдроме на фоне введения даларгина.// Бюл. эксп. биологии и медицины. 1987. Т. 104. №9. С.321-323.

88.Audsley N., Goldworthy G.J., Coast G.M. Circulation level of Locusta diuretic hormone: the effect of feeding. // Peptides. 1997. V.18. N1. P.59-S5.

89.Banner S.E., Osborn R.H., Cattell R.J. The pharmacology of the isolated foregut of the locust Schictocerca gregaria. The effect of a range of putative neurotransmitters.//Сотр. Biochem. and Physiol. 1987. V.88. N1. P. 131-138.

9Q.Bendena W.G., Donly B.C., Fuse M., Lee E.N., Larige А.В., Orchard I., Tobe S.S. Molecular characterization of inhibitory myotropic peptide leucomyosuppressin. // Peptides. 1997. V.18. N1. P.157-163.

91.Benuck M., Martin J., Marks B., Marks N. Met-enkephalin-argb-phe' metabolism: conversion to rnet-enkephiin by brain and kidney depetidyl carboxypeptidases.// Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1981. V.99. N2. P.630-636.

92.Bogus M.J., Scheller K. identification of aliatotropin- secreting cells in the brain of an insect larva. // Naturwissenschaften. 1994. V.81. N2. P.87-89.

93.Bradford M.A. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitaties of protein utilising the principle of protein - dye binding.// Analitical Biochemistry. 1976. V.72. N2. P.248-254.

94.Brown S.L., van Epps D.E. Suppression of lymphocyte-T chemotactic factor by the opioid peptides p-endorphin abd rnet-enkephiin.// J. Immunol. 1985. V.134. №5. P.3384-3390.

95.Buckmann D. The phylogeny of hormones and hormonal system.// Nova acta Leopoldina. 1984. V.56. N255. P.437-452.

96.Buckmann D., Koch P.B. Interspecific distribution of peptide factor controling pupal pigmentation in Lepidoptera. //Cen. and Comp. Endocrinol. 1989. V.74. N2. P.256.

97.Buckmann D., Maisch A. Exstraction and partial purification of the pupal melanization reducing factor (PMRF) from Inachis io (Lepidoptera).// Insect Biochern. 1987. V.17. N6. P.841-844.

98.Clark T.M., Bradley T.J. Malpigian tubules of larval Aedes aegypty are hormonally stimulated by 5-hydroxytryptamine in response to increased salinity. //Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1997. V.34. N2. P. 123-141.

99.Coast G.M., Rayne R.G., Hayes T.K., Mallet A.Y., Thompson K.S.J.: Bacon J.P. A comparison of effects of two putative diuretic hormones from Locusta migratoria on isolated locust malpighian tubules.// J. Exp. Biol. 1993. V.175. P.1-14.

100.Coast G.M., Wheeter C.H. The distribution and relative potency of diuretic peptides in the hous cricket, Acheta domesticus.// Phys. Entomol. 1990. V.15. N1. P. 13-21.

101 .Cook B.J., Wagner R.M. Miotropic neuropeptides- physiological and pharmacological action.//Arch. Insect Biochem. 1991. V.18. N2. P.81-93.

1Q2.Davies S.A., Huesmann G.R., Maddrel S.H.P., 0:;Donnel! M.J., Skaer N.J.V., Dow J.A.T., Tubiitz N.J. // CAP2b: a cardioacceieratory peptide of Lepidopteran insect, can also stimulate fluid production by malpighian tubules of Drosophila melanogaster through a mechanism involving cAMP.// Amer. J. Physiol. 1995. V.269. N6. Pt.2. P. 1321-1326.

103.Davis N.T., Veenstra J.A., Feyereisen R., Hilderbrand J.G. Allatostatin - like-immunoreactive neurons of the tobacco hornworm, Manduca sexta, and isolation and identification of new neuropeptide related to cockroach ailatostatins. //J. Comp. Neurol. 1997. V.385. N2. P.265-284.

104.De Loof A., Huybrechts R., Verhaert P. Vertebrate - peptide hormone - like materials in Arthoropods: Identification methods and functions.// Bull. Acad. Serbe Sci. et Arts. CI. Sci. Math, et Natur. 1987. V.96. N29. P.25-35.

105.De Loof A., Palmen L., Schoofs L. Myotropic peptides isolated from the accessory glands of male.// 19 Int. Corig. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc.:Abstr. 1992. P.88.

106.De Loof A., Verhaert D., Schoofs L., Van den Broeck J., Tobe S., Passeier P., Devreese B., Couillaund F. Novel neuropeptides from the desert locust, Schistocerca gregaria.// 20 int. Congr. Entomol., Firenze, Aug.25-31, 1996: Proc. -Firenze. 1996. P.273.

107.De Loof A., Verhaert P., Schoofs L., Nuybrechts R., Frankenne F., Vandry H., Jegou S. Vertebrate-type hormones in insects.// Endocrinol. Frontiers Physiol. Insect Ecol.: Proc. Int. Conf. "Low-Mol. Bioregulators Cellular Metabolism". Wroslaw. 1988. V.2. P.813-831.

108.Duve H., Johnsen A.H., Maestro J.L., Scott A.G., Crook N., Winstanley D., Thorpe A. Identification, tissue localization and physiological effect in vitro of a neuroendocrine peptide identical to a Dipteran Leu-callatostatin in the codling moth, Cydia pomonella (Tortricidae, Lepidoptera). // Cell and Tissue Res. 1997. V.289. N1. P.73-83.

109.Duve H., Johnsen A.H., Sewell J.C., Scoffa A.G., Orchard J., Rehfeld J.F., Thore A. Isolation, structure and activity of Phe-Met-Arg-nh2 neuropeptides from blowfly, Calliphora vomitoria.// Pros. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. N6. P. 2326-2330.

HO.Duve H., Jons en A.H., Scott A.G., Yu C.G., Yagi K.J., lobe S.S., Thore A. Callatostatins: Neuropeptides from the blowfly Calliphora vornitoria with sequence homology to cockroach aliatostatins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.2456-2460.

111.Duve H., Thorpe A. Mapping of enkephalin-related peptides in the nervous system of the blowfly, Calliphora vornitoria and their co-localization with choiecystokinin- and pancreatic polipeptide- like peptides. //Cell and Tissue Res. 1988. V.251. N2. P.399-415.

112.Esnault C., Lee H., Lai E. Structure and organization of the stable extrachrornosomal element in human cells.// Gene. 1994. V.144. N2. P. 205211.

11 S.Evans P.D., Myers C.M. The modulatory action of FRMFamide and related peptides on Locust skeletal muscle.//J. Exp. Biol. 1986. V.126. N11. P.403-422.

114.Faith R.E., Liang H.J., Mugro A.J., Plotnikoff N.P. Neuroimmunomoduiation with enkephalins- enhancement of human natural-killer (NK) ceil activity in vitro.//Clin. Immunol. Immunopath. 1984. V.31. N3. P. 412-418.

115.Farrar Y.J.K., Evans R.K., Beach C.M., Coleman M.S. Interactions of photoactive DNAs with terminal deoxynucleotidyl transferase - identification of peptides in the DNA-binding domain.// Biochem. 1991. V.3Q. N12. P.3075-3082.

116.Ford R., Jackson D.M., Tetrault L., Torres J.C.,Assanah P., Harper J., Leonge M.X., Stefano G.B. A behavioral role for enkephalins in regulating locomotor activity in the insect Leucophaea maderae: evidence for high affinity happa-like opioid binding sites. // Comp. Biochem. and Physiol. 1986. V.85. N1. P.61-66.

117.Fukuda T., Fiorkin M. Contribution to silkworm biochemistry.// Arch. Intern. Physiol, and Biochem. 1959. V.67. N2. P. 185-189,214-221.

118.Furuy A.K., Lia O.S., Reynolds S.E., Ota R.B., Hackett M., Schooley D.A. Isolation and identification of cardioacive peptide from Tenebrio mo!¡tor and Spodoptera eridania.//J. Biol. Chem. 1993. V.374. N12. P1065-1074.

119.Gade G. Characterization arid amino acid composition of a hypertrehalosemic neuropeptide from the corpora cardiaca of the cockroach, Nauphoeta cinerea.//Z. Naturforsch. 1987. Bd.42. Hf.3. S.225-230.

120.Gade G., Rosinski G. The primary structure of the hypertrehalosemic neuropeptide from tenebrionid beetles: a novel member of the AKH/RRCH family.// Peptides. 1990. V.11. N3. P.455-459.

121.Gade G., Wilps H., Kellner R. isolation and amino acid composition of new neuropeptide from the corpora cardiaca of Phormia terraenovae, belonging to the AKH/RPCH peptide family.// Biochem. J. 1990. V.269. N3. P.309-313.

122.Gadot M., Rafaeli A., Applebaum S.VV. Partial purification and characterization of locust allatotropin. // Arch. Insect Biochem. and Phisiol. 1987. V.4. N3. P.213-223.

123.Garside C.S., Hayes Т.К., Tobe S.S. Degradation of Dip-allatostatins by hemolymph from the cockroach, Diploptera punctata. // Peptides. 1997. V.18. N1. P. 17-25.

124.Guan X. Современные успехи в исследовании аллатостатинов и аллатотропинов у насекомых.// Acta Entomoi. Sinica. 1996. V.39, N2. P.214-219.

125.Hayes Т.К. Beyendach K.W. Progress toward the isolation of the mosquito natriuretic hormone and other excretoring factor from Aedes aegypti.// Proc. 18th Int. Congr. Entomoi., Vancouver, July 3-9th, 1988. P.105.

126.Hertei W., Pass G., Penzlin H. The effects of the neuropeptide proctolin and of octopamine on the antennal heart of Periplaneta americana.// Proc. Sattei. Symp. 2nd World Congr. Neurosci. 22-26 Aug.,1987, Budapest, 1988. P.265-275.

127.Holbrook G.L., Chiang A.S., Schoi C. Allatostatin inhibition and farnesol stimulation of corpus allatum in embrios of the viviparous cockroach, Diploptera puntata. // Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1996. V.31. N3-4. P.341-352.

128.Holman G.M., Cook B.J., Nachman R.J. Isolation, primary structure and synthesis of leucomyosuppressin, an insect neuropeptide that inhibits spontaneous contractions of the cockroach hindgut.// J. Сотр. Biochem. and Physiol. 1986. V.85. N2. P.329-333.

129.Holman G.M., Cook B.J., Nachman R.J. Primary structure and synthesis of blocked miotropic neuropeptide isolated from cockroach, Leucophaea maderae.//J. Comp. Biochem. and Physiol. 1986. V.85. N1. P.219-224.

130.Holman G.M., Nachman R.J., Wright M.S. Insect neuropeptides.// Annual. Rev. EntomoS. 1990. V.35. P.201-217.

131.Homberg U. Davis N.T., Hildebrand J.G. Peptide -Immunocytochemistry Neurosecretory-cells in brain and Retrocerebral Complex Sphinx Moth Manduca Sexta.//J. Comp.Neurol. 1991. V. 303. N1. P. 35-52.

132.Huang H.W., Li D., Cowan J.A. Biostructural chemistry of magnesium. Regulation of mithramycin - DNA interaction by Mg"+ coordination.// Biochem. 1995. V.77. N9. P.729-738.

133.llynsky O.B., Kozlova E.V., Kondricova E.S., Kalentchuk V.U., Titov M.I., Bespalova Z.A. Effects of opioid peptedes and naloxone on nevrous tissue in culture.//Neurosciensce. 1987. V.22. N2. P.719-735. 134.!ovanna J.L., Calvo E.L., Dagorn J.C. Transcriptional regulation by cholecystokinin- pankreozymin in rat pancreas. // Regul. Peptides. 1991. V.33. N2. P. 165-173.

135.lwana A., Nakagawa A., Kanzaki R. Distribution of serotonin- and FMRFamide- like im muri o reactivity in the brain silkworm, Bombix mori./Y Zool. Sei. 1992. V.9. N6. P. 1240.

136.Johard H.A.D., Lundquist C.T., Rokaeus A., Nassel D.R. Autoradiographic localization of 25l-galanin binding sites in blowfly brain.// Regul. Peptides. 1992. V.42. N3. P.123-134.

137.Karabensch K.H., Otto D., Neubert K., Born I., Hartrodt B., Jahubke H.D., Kuh I P., Hoffman S., Walter P., Matth ies H., Grundler W., Barth A. Zur Zeitabhangigheit der Wirkung von ß-Casomorpin-5 und zwei Analoga auf das Neivensystem von Insecten. // Biologische Zentraeblatt. 1985. Bd. 104. H.5. S.539-550.

138.Karlson P., Sekeris C.E., Richards A.G., Richards P.A. The amino acid composition of the varios types of cuticle of Limulus polythemus.// J. Insect Physiol. 1996. V.15. N3. P.495-507.

139.Kavaliers M., Guglick M.A., Hirst M. Opioid involvement in control of feeding in an insect the american cockroach. // Life Sei. 1987. V.40. N7. P.665-672.

140.Kim M.Y., Muren J.E., Lundquist C.T., Nassel D.R. Insect tachykinin-related neuropeptides - developmental changes in expression of caliitachykinin isoforms in the central nervous system and intestine of the blowfly, Caliiphora vomitoria.//Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1997. V.34. N4. P.475-491.

141.Kingan T.L., Shabanowtz J., Hunt D.F., Witten J.L. Charactrization of two myotropic neuropeptides in the FRMF-amide family from segmental ganglia of the moth Manduca sexta: Candidate neuropeptide and neuromodulators.// J. Exp. Biol. 1996. V.199. N5. P.1095-1104.

142.Kodrik D., Filippov V.A., Filippova M.A., Sehnal F. Sericotropin: an neurohormonal factor affecting RNA transcription.// Netherland Journal of Zoology. 1995. V.45. N1-2. P.68-70.

143.Kuniyoshi H., Suzuki A., Nagasava H,, Ando T. Structure and activity of Bornbyx pheromone biosynthesis activating neuropeptude.// 19 Int. Cong. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc.:Abstr. 1992. P.93.

144.Le Roith D., Roith J. Vertebrate hormone and neuropeptides in microbes: evolutionary of intercellular communication.// Frontiers in neuroendocrinology. 1984. V.8. P. 1-26.

145.Lee M.S., Gottesfeld J.M., Wright P.E. Zinc is required for folding and binding of single zinc finger to DNA. //FEBS letters. 1991. V.279. N2. P.289-294.

146.Lowry O.H., Rosefrough N.Y., Farr A.L., Randball R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.//J. Biol. Chem. 1951. V.193. N1. P.265-275.

147.Lu K.H., Koo C.R., Wang P.Y., Chu Y.S. Ribonucleic acid in the silkgland of silkworm Attacum ricini.//Scientia sinica. 1966. V.15. N5. P.683.

148.Ma M., Blackburn M. A new diuretic hormone from the tobacco hornworm, Manduca sexta. //19 Int. Cong. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc.:Abstr. 1992. P.130.

149.Maddrell S.H.P., Herman W.S., Farndalle R.W., Riegel J.A. Synergism of hormones controlling epithelian fluid in an insect. //J. Exp. Biol. 1993. V.174. P.65-80.

150.Masler E.P., Kovaleva E.S. Aminopeptidase-like activity in hemolymph plasma from larvae of the gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera, Lymantriidae).//' Comp. Biochem. and Physiol. 1997. V.116. N1. P. 11-18.

151.Matsumoto S., Brown M.R., Joe A.O. Isolation, characterization and distribution of RF-arnide peptides in female mocquito, Aedes aegypti.// Proc. 18th Int. Congr. Entomol., Vancouver, July 3rd-9th, 1988. P.123.

152.Matsumoto S., Fonagy A., Kyrihara M., Uchiurni K., Magamine T., Mitsui T. Isolation and characterization of pheromonotropic neuropeptide from the armyworm larvae Pseudaletia separata. //19 Int. Cong. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc.:Abstr. 1992. P.108.

153.Meo!a S.M., Wright M.S., Holman G.M., Thompson J.M. Localization of leucomyosuppressin-like peptides in central nervous system of the stable fly with immunocytochemistry.// J. Med. Entomol. 1991. V.28. N5. P.712-718.

154. Milton G.W.A.,Verhaert P.D.E.M., Downer R.G.H. Immunofluorescent localization of dopamin-like and leucine-enkepalin-like neurons in the supraesophageal ganglia of the american cockroach, Periplaneta americana. //Tissue &Cell. 1991. V.23. N3. P.331-340.

155.Nachman R.J., Holman M.G., Cook B.J. Haddon W.F., Ling N. Leucosulfakinin, a sulfated insect neuropeptide with homology to gastrin and cholecystokinin.// Biochem. and Biophys. Res. 1986. V.140.N1. P.356-365.

156.Nagabhusharnan R., Sarojini R., Reddy P.S., Devi M., Firigerman M. Opioid-Peptides in Invertebrates - Localisation, Distribution and Possible Functional Roles. //Current Science. 1995. V.69. N8. P.659-671.

157.Nassel D.R. Neuropeptides in insect brain: a review.// Cell and Tissue Res. 1993. N273. P. 1-29.

158.Nassel D.R. Neuropeptides in insect brain: wtat are their message?// 20 Int. Congr. Entomol., Firenze, Aug.25-31, 1996: Proceedings. P.205.

159.Nichols R., McCormic- J.B., Lim I.A., Starkman J.S. Spatial and temporal analysis of the Drosophila FMRFamide neuropeptide gene product SDNFMRFamide: evidence for a restricted expression pattern.// Neuropeptides. 1995. V.29. N4. P.205-213.

160.0"Shea M., Adams M. Neuropeptides in insect: posseble leads to new control methods.//Adv. Insect Physiol. 1986. V.19. N1, P. 133-151.

161.Orchard J., Belanger J.H., Lange A.B. Proctolirt: a rewiev with emphasis on insect.//J. Neurobiol. 1989. V.20. N5. P.470-496.

162.Orchard J., Lange A.B. The release of octopamine and proctoliri from an insect visceral muscle: effects of high- potassium saline and neural stimulation.// Brain Res. 1987. V.413. N2. P.251-258.

163.Penzlin H. Neuropeptides - occurrence and functions in insects.// Naturwissenschaften. 1989. Bd.76. Hf.6. S.243-252.

164.Perizlin H., Wieduwilt Y., Hertel W. Evidence for a miotropic effect of substance P in Periplaneta americana.// Gen. and Comp. Endocrinol. 1989. V.75. N1. P.88-95.

165.Predel R., Kellner R., Kaufmann R., Penzlin H., Gade G. Isolation and structural elucidation of 2 pyrokinins from the retrocerebral complex of the american cockroach.// Peptides. 1997. V.18. N4. P.473-478.

166.Proux J.P.: Herault J.P. Cyclic AMP: a second messenger of the newly characterized AVP- like insect diuretic hormone. //Neuropeptides. 1988. V.12. N1. P.7-12.

167.Raina A.K. Neuroendocrine control of sex pheromone biosyntesis in Lepidoptera. //Ann. Rev. Entomol. 1993. V.38. P.329-349.

168.Raina A.K., Yaffe H., Kempe T.G., Keirn P., Blacher R.W., Fales H.M., Riley C.T., Kluri J.A., Ridgway R.L., Hayes D.K. Identification of a neuropeptide hormone that regulates sex peromone production in female moths.// Science. 1989. V.244. N4906. P.796-798.

169.Raina A.K., Yaffe H., Klun J.A., Ridgway R.L., Hayes D.K. Characteristics of a neurohormone that controls sex pheromone production in Heliothis zea.// J. Insect Physiol. 1987. V.33. N11. P.809-814.

170.Rayne R.S., O'Shea M. Neuropeptide biosyntesis: Molecular mechanism and insecticide targets. // 20 Int. Congr. Entomol., Firenze, Aug.25-31, 1996: Proceedings. P.202.

171.Robb S., Evans P.D. FMRFamide-like peptides in the locust: distribution, partial characterization and bioactivity.// J. Exp. Biol. 1990. V.147. N3. P.335-

360.

172.Robb S., Packman L.S., Evana P.D. Isolation, primary structure and bioactivity schistoFLRF-amide. a FMRF-amide-like neuropeptide from locust, Schistocerca gregaria.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1989. V.160. N2. P.850-856.

173.Robertson A.D.J., Grutsch J.F. Biphasic responses, quantal signals and cellular behaviour. // J. theor. biol. 1987. V.125. N1. P. 41-60.

174.Roith J., Le Roith D., Collier E.S., 'Weaver R. Evolutionary origins of neuropeptides. Hormones and receptors: possible applications to innunology.// J. Immunol. 1985. V.135. suppl.2. P.8163-8193.

175.Ruiz J.C., Choi K., Von Hoff D.D., Roninson LB., Wahi G.M. Autonomously replicating episomes contain MDR 1 genes in a multidrug-resistant human cell-line.// Mol. Cell. Biol. 1989. V.9. N1. P. 109-115.

176.Schaffer M.H., Noyes B.E., Slaughter C.A., Torne G.C., Gaskel! S.J. Isolation and identification new neuropeptide from the corpus cardiacum of Drosophila melanagaster.// Biochem. J. 1990. V.269. N2. P.315-320.

177.Schiebe M., Walther C. Pre and postsynaptic action of FRMFamide-like peptides in insect neuromuscular synapse.// Proc. Sattel. Symp. 2nd World Congr. Neurosci. 22-26 Aug.,1987, Budapest, 1988. P.265-275.

178.Schneider L., Sun E.T., Garland D.J., Taghert P.H. Ari immunocytochemical stude of the FRMFamide neuropeptide gene product in Drosophila.// J. Comp. Neurol. 1993. V.337. N3. P.446-460.

179.Schols D., Verhaert P., Huybrechts R., Vandry H., De Loof A. Immunohistochemical demonstration of proopiomelanocortin- and other opioid-reiated substances and a CRF- like peptide in the gut of american cockroach, Periplaneta americana. // Histochemistry. 1987. V.88. N4. P.345-351.

180,Schoofs L, Holman J.M., Hayes T.K., Tips A., Nachman R.J., Vandesande F., De Loof A. Isolation, identification and synthesis of iocustamiotropin (Lom-MT), a novel biologically active insect peptide.// Peptides. 1990. V.11. N3. P.427-433.

181.Schoofs L., Jegou S., Andersen A.S., Tonon M.C., Eberle A.N., Huybrechts R., De Loof A. Coexistence of melanin - concentrating hormone and cx-melanocyte- stimulating hormone immunoreactivities in the central nervous system of the locust, Locusta migratoria. // Brain Res. 1988. V.450. N1-2. P.202-208.

182.Schoofs L., Jegou S., Vaudry H., Verhaert P., De Loof A. Localization of melanotropin -like peptides in the centra! nervous system of two insect species

migratory locust, Locusta migratoria, and the fieshfly, Sarcophaga bullata.// Cell and Tissue Res. 1987. V.248. N1. P.25-31.

183,Schoofs L., Schrooteri S., Huybrechts R., De Loot A. Metionine- enkephalin immunoreactivity in the gonads and nervous system of two insect species: Locusta migratoria and Sarcophaga bullata. // Gen. and Corrip. Endocrinol. 1988. V.69. N1. P.1-12.

184.Schooley D.A., Miller C.A., Proux J.P. Isolation of two arginine vasopressin-like factors from ganglia of Locusta migratoria.// Arch, insect Biochem. and Physiol. 1987. V.5. N3. PI 57-166.

1S5.Sharp B.M., Keane W.F., Suh H.J., Gekker G., Tsukayamo D., Referson P.K. Opioid peptedes rapidly stimulate superoxide production by human polymorphonuclear leukocytes and macrophages.// Eridocrynology. 1985. V.117. N2. P.793-795.

186.Shigematsu H.; Takes hita H. Formation of silk proteins by the silkworm, Bombyx mori after gamma-rey irradiation in the embrionic stage.// J. Insect Physiol. 1968. V.14. N7. P.1013-1024.

187.Siegert K.J., Morgan P.J.,Mordue W. Isolation of hyperglycaemic peptdes from the corpus cardiacum of the american cockroach, Periplaneta americana.//Insect Biochem. 1986. V.16. N2. P.365-371.

188.Simantov R., Snyder S.H. Isolatuiori and structure identification of morphinelike peptide "enkephalin" in bovine brane.// Life Sci. 1976. V.18. N8. P.781-785.

189.Slama K., Konopinska D., Sobotka W. Effects of proctoline on autonomic physiological function in insects.// Eur. J. Entomol. 1993. V.90. N1. P.23-35.

190.Stanger J., Keller R. Isolation and characterization of a CCAP- like peptide in the nervous system of the migratory locust, Locusta migratoria.// Gen. and Comp. Endocrinol. 1989. V.74. N2. P.271-272.

191.Stay B. Allatostatins of the cockroach: Structure and immunochemical localization in the nervous system. //19 Int. Cong. Entomol., Beijing, June 28-July4, 1992: Proceedings. P.95.

192.Stefano G.B., Melchiorri P., Negri L., Hughes T.K., Scharrer B. (D-Ala2) Deltorphin-I Binding and Pharmacological Evidence for a Special Subtype of Delta-Opioid Receptor on Human and Invertebrate immune Cells.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. N 19. P.9316-9320.

193.Stevenson E., Wyatt C.K. The metabolism of silkworm tissues. Incorporation of leucine into protein.// Arch. Biochem. and Physiol. 1962. V.99. N1. P.65-71.

194.Streg L. The effect of locust PBAN activity on sex pheromone production by female European corn borer moth, Ostrinia nubilalis.//19 Int. Cong. Entomol., Beijing, June 28-July4, 1992: Proceedings. P.93.

195.Strivastava R.P. The amino acid composition of cuticular proteins of different developmental stades of Galleria mellonella.// J. Insect Physiol. 1971. V.17. P.189-196.

196.Susumu F., Mihori K. Synthesis of [D-his2]-analog of enkephalin and several [D-ala'j-enkephalin analogs.//Chem. and Pharm. Bull. 1987. V.35. N6. P.2561-2568.

197.Takahashi Т., Muneoka Y., Iwasaki M., ifoh Т., Tominaga Y., Ikeda Т., Minacata H., Nomoto K. Apisin: a novel bioactive peptide isolated from the heney bee, Apis mellifera.//Zool. Sci. 1993. V.10. N6,suppl. P.89.

198.Tamarelle M., Romeuf M., Vanderhaeghen J.J. Immunohistochemical localization of gastrin- cholecystoksnin- like material in the central nervous system of the migratory locust.// Histochemistry. 1988. V.89. N2. P.201-207.

199.Terra W.R., Bianchi A.G. Chemical composition of the cocoon of the fly, Rhynchosciara americana.// insect Biochem. 1974. V.4. N2. P.173-183.

200.Thorpe A., Duve H. Immunochemical application in the study of insect neuropeptides with special emphasis on the peptides of vertebrate type.// Insect Neurochem. and Neurophysiol.: Proc. Int. Conf. London. 1984. P. 197222.

201.Thorpe A., Johnsen A.H., Rehfeld J.F., East P.D., Duve H. Insect neuropeptide hormones: unity and diversity.// Netherland Journal of Zoology. 1995. V.45. N1-2. P.251-259.

202.Tips A., Schoofs L., Holman G.M., Hayes Т., De Loof A. The reasearch of biological activity of myotropic peptides of the locust, Locusta migratoria.// Belg. J. Zool. 1990. V.120. N1. P.86.

2Q3.Tubiitz N.J. Insect cardioactive neuropeptides: peptidergic modulation of the intrinsic rhythm of art insect heart is mediated by inositol 1,4,5- triphosphate.// Neurosci. 1988. V.8. N11. P.4394-4399.

204.Tub!itz N.J., Truman J.W. Insect cardioactive peptides. Distribution and molecular characteristic of two cardioacceleratory peptides in the Manduca sexta. It J. Exp. Biol. 1985. V.114. P.385-367.

205.Van Marrewijk W.J.A., Oudejans R.C.H.M., Van den Houst D.J. Adipokinetic hormone in the locust: their structure and action.// 19 Int. Cong. EntomoL, Beijing. June 28-July 4, 1992: Proceedings. P. 130.

206.Veenstra J.A,, Lehman H.K., Davies N.T. Allatotropin is a cardioacceleratory peptide in Manduca sexta.//J. Exp. Biol. 1994. V.183. N3. P.347-354.

2G7.Vizan J.L., Hernandezchico C., Delcastillo I., Moreno F. The peptide antibiotic Microcin B17 induces double- strand cleavage of DNA mediated by Escherichia coii DNA.// EMBO Journal. 1991. V.10. N2. P.467-476.

208.Weiss A., Penzlin H. Effect of morphine and naloxone on shoch avoidance barning in headless cockroach, Periplaneta americana.// Physiol. Behav. 1987. V.39. N4. P.445-451.

209.Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. Effects of beta-endorphin on specific immune responses in man.// immunology. 1989. V.65. N1. P.47-51.

210.Witten J.L., O'Shea M. Peptidergic innervation of insect sceletal muscle; immunochemical observation.//J. Comp. Neurol. 1985. V.242. N1. P.93-1G1.

211.Wolfner M.F. Tokens of love- functions and regulation of Drosophila male accessory - gland products. // Insect Biochem. and Molec. Biol. 1997. V.27. N3. P. 179-192.

212.Xu W.H., Stao Y., Yamashita O. Molecular - cloning of pheromone biosynthesis activating neuropeptide in silkworm, Bombyx mori. // Scince in China Series C- Life Scinces. 1998. V.39. N1. P.63-70.

213.Yang C., Sehnal F.. Schelier K. Juvenile hormone restores larval pattern of sericin gene transcripts.// Arch, of Insect Biochem. and Physiol. 1996. V.31. N.3-4. P.353-382.

214.Yasuyama K., Kimura T., Yamaguchi T. Proctolin-like immunoreactivity in the dorsal unpaired median neurons innervating the accessory grand of the maie cricket, Gryllus bimaculatus.//Zool. Sci. 1992. V.9. N1. P.53-64.

215.Yi S.X., Tirry L., Bai C., Devreesse B., Van Beeuman J., Degheeie P. Isolation, identification and synthesis of Mas-MG-MT-I, a novel peptide from the

larva! midgut of Manduca sexta (Lepidoptera, Sphirtgidae).// Arch, of Insect Biochem. and Physiol. 1995. V.28. N2. P. 159-171.

216.Yonezawa A., Kuwahara J., Fujii N., Sugiura Y. Binding of tachyplesin I to DNA by footprinting analysis to DNA-binding and implication for biological action.//Biochem. 1992. V.31. N11. P.2998-3004.

217.Yu S.J., Stay B., Joshi S., Tobe S.S. Quantatification of ailatoastatin in tissues of Diploptera punctata in vivo: development of a high specificity and sensivity ELIA based on purified antibody and mini-CisRP solid-phase extraction chromatography. //19 Int. Cong. Entomoi., Beijing; June 28-July 4, 1992: Proceedings. P. 131.

218.Zaitsev S.V.,Sazanov L.A., Koshkin A.A., Sud'iria G.F., Varfblomeev S.D. The role of adhesive interaction and extracellular- matrix fibronectin from leukocytes in the respiratory burst.// Biochim. Biophys. Acta. 1990. V.55. N10. P. 17951811.

219.Ziegler R., Kegel G,, Kellr R. AKH and GPAH are not identical in Manduca sexta.//J. Cell. Biochem. 1986. Suppl.lOC. P.71.

220.Zoiotarev Yu. A., Dorokhov E.M., Nezavibatko V.N., Borisov Y.A. The solid state katalitic aynthesis of thritiurn label it amino acids, peptides and proteins.// J. Amino Acids. 1995. V.8. N4. P.353-365.

221.Zurovec M., Sehnai F., Sheller K, Kumaran A.K Silk gland specific cDNA from Gaiieria mellonella.// Insect Biochem. 1992. V.22. N1. P.55-87.