Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae b тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Орлова, Ольга Евгеньевна

• Орлова, Ольга Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Орлова, Ольга Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГЕМОФИЛЬНЫХ

ИНФЕКЦИЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ

1.1. Эпидемиология заболеваний, вызываемых Н. influenzae b

1.2. Вакцины, применяемые для профилактики гемофильных инфекций

Глава 2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

H. INFLUENZAE В

2.1. Полноценные питательные среды

2.2. Синтетические питательные среды

2.3. О полусинтетических питательных средах и компонентах питательных сред, влияющих на синтез капсульного полисахарида Н. influenzae b

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I.1. Штаммы Н. influenzae b, использованные в работе

1.2. Питательные среды

1.2.1. Полноценная питательная среда

1.2.2. Синтетические питательные среды

1.2.3. Полусинтетическая питательная среда на основе аминопептида

1.3. Процессы культивирования

1.4. Методы анализа процессов культивирования

1.4Л. Методы изучение динамики накопления биомассы

1.4.2. Методы изучения динамики накопления капсульного полисахарида в культуральной жидкости

1.5. Методы статистической обработки результатов

Глава 2. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА И СИНТЕЗА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ

Н. INFLUENZAE В В СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Глава 3. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА РОСТ И СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО

ПОЛИСАХАРИДА Я. INFL UENZAE В

Глава 4. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ АМИНОПЕПТИДА

4.1. Изучение влияния внесения в среду на основе аминопептида глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глютатиона на рост Я influenzae Ъ и синтез капсульного полисахарида

4.2. Влияние изменения концентрации аминопептида на рост Я influenzae b и синтез капсульного полисахарида

4.3. Изучение влияния повышенных концентраций НАД и гемина при различном содержании в питательной среде аминопептида на рост

Я influenzae b и синтез капсульного полисахарида

4.4. Динамика роста и синтеза капсульного полисахарида Я. influenzae b штамма № 6 в полусинтетической питательной среде на основе аминопептида при масштабировании процесса культивирования

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae b»

Актуальность проблемы. Haemophilus influenzae тип b (Hib) вызывает менингит, пневмонию, септицемию, эпиглоттит, остеомиелит и септический артрит. Первое место по частоте возникновения среди перечисленных заболеваний занимает менингит [81]. Группой риска для гемофильных инфекций являются дети в возрасте до пяти лет [55, 58, 64, 65, 72]. Во всем мире Hib приводит к заболеванию трех миллионов детей, семьсот тысяч из которых погибают [101].

Эпидемиологическая значимость гемофильных инфекций подтверждена в большинстве стран Европы, Америки и ряде государств Африки [78, 81]. В России ввиду отсутствия общедоступных методов диагностики официальная регистрация случаев гемофильных инфекций не проводилась. Однако даже отдельные исследования частоты гнойных бактериальных менингитов и осложненных пневмоний, обусловленных Hib, проведенные в ряде городов Европейской части России, позволили оценить важность гемофильной инфекции в нашей стране. Высокая частота бактерионосительства, способствующая распространению гемофильной инфекции, тяжесть протекания заболеваний, множественность их осложнений, полирезистентность Hib к большинству применяемых в практике антибиотиков указывают на необходимость вакцинопрофилактики [8,11].

Установлено, что капсульный полисахарид Hib - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) определяет вирулентные свойства бактерий и позволяет микроорганизмам преодолевать воздействие неспецифических механизмов защиты макроорганизма [53, 75]. ПРФ является антигеном и способен индуцировать иммунный ответ, однако иммунитет формируется по Т-независимому типу [86]. В то же время, до 18 месячного возраста, В-лимфоциты ребенка недостаточно зрелы для того, чтобы сформировать адекватный иммунный ответ без участия Т-лимфоцитов. Для обеспечения полноценного иммунного ответа у детей младшего возраста

ПРФ конъюгируют с белком-носителем, что придает полисахариду свойства Т-зависимого антигена. [85]. Показана высокая эффективность конъюгированных вакцин у детей первых месяцев жизни [46,47,84].

С 1986 года вакцинация против Hib введена в обязательный календарный план прививок в 38 странах [81]. К 2001 году уже 90 стран стали применять вакцину против гемофильных инфекций. В настоящее время поставлена задача включения вакцинации против Hib в национальный календарь прививок в пятидесяти наиболее развитых странах, где доказан высокий уровень заболеваемости [91].

В России вакцина против инвазивных Hib-заболеваний не производится. Вместе с тем вакцина «Акт-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция) сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность [2,4, 18,39].

Для разработки высокочувствительных наборов как для диагностики возбудителя, так и для оценки поствакцинального иммунитета и, тем более, для производства вакцины, необходимы стандартные методы культивирования Я influenzae b, позволяющие получать достаточное количество капсульного полисахарида высокой степени очистки.

Капсульный полисахарид в процессе роста культуры Я influenzae Ъ накапливается в среде культивирования [41]. Поэтому, согласно требованиям ВОЗ, для получения капсульного полисахарида следует, по возможности, избегать выращивания H.influenzae Ъ в питательных средах, содержащих высокомолекулярные продукты животного происхождения [99].

Традиционно культивирование Hib для получения капсульного полисахарида осуществляют в полноценных питательных средах. Среда с казаминовыми кислотами и дрожжевым экстрактом (Difco, США), по данным литературы, позволяет получать достаточное количество капсульного полисахарида [73]. Однако для производства отечественной вакцины и диагностических препаратов необходима доступная по цене питательная среда, обеспечивающая высокую скорость роста Hib и синтеза капсульного полисахарида.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась оценка влияния отдельных компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Я. influenzae b. Задачи исследования:

1. Оценить скорость роста и уровень синтеза капсульного полисахарида различных штаммов Я influenzae Ъ при их культивировании в синтетических питательных средах известного состава.

2. Изучить влияние исключения из состава синтетической питательной среды отдельных аминокислот на рост штаммов Я. influenzae b и синтез капсульного полисахарида.

3. Подобрать составы синтетической и полусинтетической питательных сред для культивирования Я influenzae Ъ и получения капсульного полисахарида.

4. Выбрать штамм Я. influenzae b, обладающий минимальными потребностями в аминокислотах и максимальной скоростью роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде.

Научная новизна работы

1. Различные штаммы Я influenzae b обладают высокими скоростями роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде известного состава [Herriot R.M et al., 1970], предназначенной для бескапсульного штамма Я influenzae.

2. Исключение из состава многокомпонентной синтетической питательной среды серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и снижение концентрации инозина до 500 мг/л не приводят к снижению скорости роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов.

3. Показана возможность использования аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды для культивирования Я. influenzae Ъ и получения капсульного полисахарида.

4. Синтез капсульного полисахарида Я. influenzae Ъ зависит от концентраций аминопептида, НАД и гемина.

Практическая ценность

1. Выбран штамм Я. influenzae b, обладающий максимальной скоростью роста и наибольшим накоплением капсульного полисахарида (более 150 мг/л) при росте в синтетической питательной среде, что позволяет рекомендовать его в качестве штамма -продуцента капсульного полисахарида. Штамм депонирован в коллекцию ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ под № 267 (02.07.2003).

2. Модифицирована жидкая синтетическая питательная среда Herriot, культивирование в которой обеспечивает высокую скорость роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов Я. influenzae Ъ.

3. Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей аминопептид в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов, который позволяет при культивировании Я influenzae Ъ получать более высокий выход капсульного полисахарида, чем в полноценной питательной среде - сердечно-мозговом бульоне. Подана заявка о выдаче патента РФ на изобретение № 2003126461, приоритетная справка от 1 сентября 2003 года.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Отобран, охарактеризован и селекционирован штамм Н. influenzae b, обладающий высоким уровнем синтеза капсульного полисахарида и высокой скоростью роста при культивировании в синтетической питательной среде.

2. Ряд аминокислот (серии, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин) не является необходимым для роста и синтеза капсульного полисахарида Н. influenzae Ъ.

3. При использовании аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды синтез капсульного полисахарида Н. influenzae b зависит от концентраций аминопептида, никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и гемина.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы в центральной печати. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимических методов исследований ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2003).

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 13 рисунками и 16 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 источник.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Орлова, Ольга Евгеньевна

выводы

4. Отобран, охарактеризован и депонирован под № 267 в ГНИИСК им. JI.A. Тарасевича МЗ РФ штамм Я. influenzae Ъ — продуцент капсульного полисахарида, выделенный от больного менингитом ребенка, способный при культивировании в многокомпонентной синтетической среде к высокому синтезу полисахарида (> 150 мг/л полисахариада) при высокой скорости роста (время удвоения 40 мин).

5. Определено влияние серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и инозина в составе синтетической питательной среды, а также НАД, гемина и аминопептида в составе полусинтетической питательной среды на рост Я. influenzae Ь и синтез капсульного полисахарида.

6. Модифицирована синтетическая питательная среда Herriot путем исключения из ее состава 6 аминокислот (серина, глицина, лизина, метионина, лейцина и тирозина) и понижения концентрации инозина. Накопление капсульного полисахарида при культивировании штамма Я. influenzae Ъ № 267 в модифицированной синтетической питательной среде составляет 82,0 ± 6,3% от синтезированного в исходной среде при значительном снижении стоимости среды и упрощении процедуры ее приготовления.

7. Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов аминопептид, а также минеральные соли, НАД, гемин, пантотенат кальция и тиамин, на которой при культивировании Я. influenzae Ъ № 267 синтезируется 90±8,5 мг/л капсульного полисахарида.

8. Культивирование Я. influenzae Ъ № 267 в разработанной полусинтетической питательной среде в ферментере объемом 4 литра позволяет получать высокоочищенный препарат капсульного полисахарида в количествах, достаточных для последующего приготовления около 10000 доз вакцины.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Орлова, Ольга Евгеньевна, 2004 год

1. Бойли Н. Статистические методы в микробиологии. М., Иностранная литература. 1962.

2. Горбунов М.А., Павлова Л.И., Чупрынина Р.П., Немировская Т.И. Результаты регистрационных клинических испытаний вакцины «Акт-ХИБ» производства фирмы «Пастер Мерье Коннот», Франция. Журн. Микробиол. 1999,2:45 48.

3. Горбунов С.Г. Демина A.A., Спирихина A.M., Грачева A.M., Самсонова И.М. Диагностическая ценность различных методов лабораторной диагностики пневмонии, обусловленной Haemophilus influenzae типа b. Журн. Микробиол. 2002,4: 51 54.

4. Грубер И.М., Стрельникова Л.М., Поляченко В.М., Горбачев И.Д., Рощупкина М.Н., Шмыгалева Т.П., Вячкилева О.В. Разработка полунепрерывных процессов культивирования Я influenzae типа Ъ. Журн. Микробиол. 1995,6: 3 -4.

5. Грушина Т.А., Ременцова М.М., Меньшиков Л.Ф. Питательная среда для выделения гемокультур от пациентов, больных бруцеллезом. Журн. Микробиол. 1978,9: 82 85.

6. Девяткина Н.П., Ильина Т.В., Королева И.С., Мартынов Ю.В., Демина A.A. Особенности заболеваемости гнойными бактериальными менингитами, вызванными Streptococcus pneumonia и Haemophilus influenzae типа b. Журн. Микробиол. 1990, 1:45 49.

7. Демина A.A. Эпидемиология инвазивных форм заболеваний, обусловленных Haemophilus influenzae типа b. Международный медицинский журнал. 1998,4:315- 322.

8. Демина A.A., Ильина Т.В. Специфические латекс-препараты в этиологической диагностике гнойных бактериальных менингитов. Журн. Микробиол. 1985, 11:3-6.

9. Демина А.А., Ильина Т.В., Ларина Л.И., Девяткина Н.П., Журавлева Г.В., Покровская Н.Я. Этиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов в современных условиях. Журн. Микробиол. 1985,3:3-6.

10. Демина А.А., Покровский В.И., Самсонова И.М. Заболеваемость, обусловленная Haemophilus influenzae типа Ь и вакцинопрофилактика этой инфекции. Журн. Микробиол. 1996, 5: 99- 104.

11. Демина А.А., Самсонова И.М., Блинковский A.M., Журавлева Г.В., Полинский А.С., Ярославов А.А. Методы микроанализа: латекс-агглютинация и иммуноферментный анализ в диагностике менингококковой инфекции. Журн. Микробиол. 1987, 9: 94 98.

12. Журавлева Г.В., Демина А.А., Ильина Т.В., Ларина Л.И. Иммуноферментный анализ в диагностике менингококковой инфекции. Журн. Микробиол. 1984, 9:28 32.

13. Катосова Л.К., Сидорина Т.М., Клюкина Л.П., Ряховская И.О. Биологические свойства Haemophilus influenzae, выделенных от здоровых детей и больных острыми и хроническими респираторными заболеваниями. Журн. Микробиол. 1994,1: 21 -26.

14. Ковтун М.Ф., Дайн Т.В., Колодии О.В., Аксиленко Н.Д. Результаты использования селенитового бульона с аминопептидом в исследованиях Shigella и Salmonella. Лаб. Дело. 1980,3: 181.

15. Костюкова Н.Н, Коржуева Н.А., Деркач С.А., Багирова Л.Ш., Мерзенюк З.А, Гульман Л.А. Этиологическая сруктура острых бактериальных менингитов в различных регионах. Журн. Микробиол. 1992, 7-8: 14- 17.

16. Львов В.Л., Апарин П.Г., Ванеева Н.П, Елкина С.И. Способ получения Vi антигена. Патент РФ № 2088244. 1997,27 августа.

17. Маргулис И.Л., Головина Н.М., Раскин Б.М., Мельникова В.А., Бочкова В.А. Новая сухая питательная среда для выделения Corynebacterium diphtheria (разработка и экспериментальное исследование). Журн. Микробиол. 1988, 10: 6 8.

18. Остерман Л.А. Исследование биологических маромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М. «Наука». 1983: 139 143.

19. Падюков Л.Н., Таранов В.А., Асеева В.Г. и др. Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинации. Патент РФ № 1762242. 1993, 14 июля.

20. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Москва, "Мир". 1978: 14-16.

21. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С., Шипулина О.Ю. Перспективы диагностики бактериальных менингитов. Журн. Микробиол. 1999,2: 71 76.

22. Покровский В.И. Таточенко В.К. Гемофильная инфекция тип Ь. Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики. Информационный бюллетень. 2003,2 (26): 2.

23. Поляченко В.М., Мельникова В.А., Грубер И.М., Смирнова Г.А., Раскин В.М. Конструирование питательной среды для бактерий рода Haemophilus, продуцентов рестриктирующих эндонуклеаз. Журн. Микробиол. 1989,3:3 8.

24. Раскин Б.М. Штанчаева С.М. Разработка и экспериментальное изучение сухой селенитовой среды для стафилококков. Журн. Микробиол. 1980, 9: 39 43.

25. Раскин Б.М., Денисова C.B. Конструирование микробиологических питательных сред. Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии. Современное состояние, проблемы, перспективы. Сборник трудов НИИВС им. И.И. Мечникова АМН СССР, М. 1992:123-135.

26. Раскин Б.М., Мельникова В.А, Денисова С.В., Перельман Е.В., Лобова Е.А., Штанчаева С.М. Перспективы использования кровозаменителей отечественного производства с истекшим сроком годности. Журн. Микробиол. 1978,6: 85 89.

27. Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Мельникова В.А., Целигорова Е.Л. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред. Журн. Микробиол. 1985, 12: 22-26.

28. Спирихина Л.В. Совершенствование лабораторной диагностики заболеваний, вызванных Haemophilus influenzae типа b на основе иммуноферментного анализа. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 1999.

29. Стрельникова Л.М., Поляченко В.М., Рощупкина М.Н., Грубер И.М., Боровкова В.М. Динамика роста и биосинтетические свойства Haemophilus influenzae b в различных условиях культивирования. Журн. Микробиол. 1995,6: 12- 13.

30. Таточенко В.К. Катосова Л.К. Кузнецова Т.А. Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae тип Ъ. Сборник трудов научно-практической конференции. Пастер Мерье Коннот. М., 1998: 64-70.

31. Улуханова Л.У. Диагностические критерии ранних проявлений и последствий гнойных бактериальных менингитов у детей в условиях комплексного лечения. Автореф. дисс. канд. М. 2002.

32. Урбах В.Ю. Математические методы для биологов и медиков. М. 1975.

33. Храмова Н.И. Агглютинирующие типоспецифические сыворотки к капсульным штаммам Haemophilus influenzae. Журн. Микробиол. 1975,3: 745 746.

34. Шапиро А.В. Характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных из мокроты больных острой пневмонией при гриппе. Журн. Микробиол. 1983,4: 39-42.

35. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под редакцией Н. Тица. М., 1997.

36. Юшкова И.Ю., Кулькина В.Ф., Огурцов А.А., Устюжанин Ю.В. Проблема гемофильной инфекции в Тюменской области. Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики. Информационный бюллетень. 2003,2 (26): 10- 11.

37. Adegbola R.A., Falade A.G., Sam В.Е., Aidoo M„ Baldeh I., Hazlett D., Whittle H., Greenwood B.M., Mulholland E.K. The etiology of pneumonia in malnourished and well-nourished Gambian children. Pediatr. Infect. Dis. J. 1994, 13: 975 982.

38. Anderson P., Pitt J., Smih D.H. Synthesis and release of polyribophosphate by Haemophilus influenzae type b in vitro. Infect. Immun. 1976, Feb.: 581 589.

39. Anderson P., Smih D.H. Isolation of capsular polysaccharide from culture supernatant of Haemophilus influenzae type b. Infect. Immun. 1977, Feb.: 472 477.

40. Berg S., Trollfors В., Nylen O., Hugosson S., Prellner K., Carenfelt C. Incidence, aetiology, and prognosis of acute epiglottitis in children and adults in Sweden. Scand. J. Infect. Dis. 1996, 28(3): 261 -264.

41. Bijlmer H.A., L. van Alphen. A prospective, population-based study on Haemophilus influenzae type b meningitis in The Gambia and the possible consequences. J. Infect. Dis. 1992, 165:29-32.

42. Bisgard K.M., Kao A., Leake J., Strebel P.M., Perkins B.A., Wharton M. Haemophilus influenzae invasive disease in the United States, 1994-1995: near disappearance of a vaccine-preventable childhood disease. Emerging Infect. Dis. 1998,4: 229 237.

43. Booy R., Hodgson S., Carpenter L., Mayon-White R.T., Slack M.P., Macfarlane J.A., Haworth E.A., Kiddle M., Shribman S., Roberts J. St. Clair, Moxon E.R. Efficacy of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine PRP-T. Lancet 1994,344:362 366.

44. Booy R. Getting Hib vaccine to those who need it. Lancet. 1998, May 16; 351(9114): 1446-1447.

45. Bulter L.O. A Defined Medium for Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae. Journal of General Microbiology. 1962,27: 51 60.

46. Carmody J.M. Herriot M. Thymine and thymidine uptake by Haemophilus influenzae and labeling of deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 1970, Feb., 101 (2): 525 530.

47. Carty C.E., Mancinelli R, Hagopian A., Kovach F.X., Rodrigues E., Burke P., Dunn N.R., McAleer W.J., Maigetter R.Z., Kniskern P.J. Fermentation studies with Haemophilus influenzae. Dev. Ind. Microbiol. 1985,26: 763 767.

48. Children's Vaccine Initiative. Vaccination news. Haemophilus influenzae. Hib use rising slowly. Newswatch. 1999, 1:7-8.

49. Crisel R.M., Baker R.S, Dorman D.E. Capsular polymer of Haemophilus influenzae type b. J. Biol. Chem. 1975,250: 4926-4930.

50. Dajani A.S., Asmar B.I., Thirumoorthi M.C. Systemic Haemophilus influenzae disease: an overview. J. Pediatr. 1979,94: 355 364.

51. Edwards J.S., Palson B.O. Systems properties of Haemophilus influenzae Rd metabolic genotype. J. Biol. Chem. 1999,274 (25): 17410-17416.

52. Eskola J., Ward J., Dagan R., Zepp F., Goldblatt D, Siegrist C. A. Combined vaccination of Haemophilus influenzae type b conjugate and diphtheria-tetanus-pertussis containing acellular pertussis. Lancet. 1999,354: 2063-2068.

53. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clauton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R., et.al. Whole-genome random sequence and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science. 1995, 269:496-512.

54. Hanna J. The epidemiology of invasive Haemophilus influenzae infections in children under five years of age in the Northern Territory: a three year study. Med. J. Aust. 1990, 152: 234-240.

55. Herriot R.M., Meyer E.M., Vogt M., Modan M. Defined medium for growth of Haemophilus influenzae. J. Bacteriol. 1970, Feb.: 513-516.

56. Hollander R. Energy metabolism of some representatives of the Haemophilus group. Antonie van Leeuwenhoek. 1976,42:429 444.

57. Hussey G., Hitchcock J., Schaaf H., Coetzee G., Hanslo D., E. van Schalkwyk, Pitout J., Clausen J., W. van der Horst. Epidemiology of invasive Haemophilus influenzae infections in Cape Town, South Africa. Ann. Trop. Paediatr. 1994, 14: 97 103.

58. Immunization Monitoring Program, Active (IMPACT) of the Canadian Pediatric Society and Laboratory Centre for Deasease Control. Haemophilus influenzae type b infection in Canada. Can. Med. Assoc. J. 1996,154: 1041 1047.

59. Inzana TJ. A chemically defined medium induces resistance to lipopolysaccharide antibody in Haemophilus influenzae type b. Microb. Pathog. 1986,1 (5): 483 489.

60. Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113:409-411.

61. Kuratana M, Anderson P. Host metabolites that phenotypically increase the resistance of Haemophilus influenzae type b to clearance mechanisms. J. Infect Dis. 1991, May;163(5): 1073-1079.

62. Kuratana M., Hansen E.J, Anderson P. Multiple mechanisms in serum factor-induced resistance of Haemophilus influenzae type b to antibody. Infect. Immun. 1990, Apr; 58 (4): 914 919.

63. Langford P.R., Moxon E.R. Growth of Haemophilus influenzae type b in continious culture: effect of dilution rate on outer-membrane protein and lipopolysaccharide expression. FEMS Microbiol. Lett. 1992,93:43-48.

64. Lee H.J. Epidemiology of systemic Haemophilus influenzae disease in Korean children. Pediatr. Infect. Dis. J. 1998, 17: 185 189.

65. Merrit J., Allard G., O Tool, Swartz R., Licari P. Development of a fed-batch process for the production of capsular polysaccharide from Haemophilus influenzae. J. Biotechnol. 2000, 8: 189- 197.

66. Mimica I., Donoso E., Howard J. E., Ledermann G. W. Lung puncture in the etiological diagnosis of pneumonia. Am. J. Dis. Child. 1971, 122: 278 282.

67. Moxon R.E., Kroll J.S. The role of bacterial polisaccharide capsules as virulent factor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990; 150: 65 85.

68. Murray C.J.L, Lopez A.D. Global burden of disease and injury series: global health statistics. A compendium of incidence, prevalence and mortality estimates for over 200 conditions. Harvard University Press, Cambridge, Mass. 1996.

69. Musser J.M., Kroll J.S., Granoflf D.M., Moxon E.R., Brodeur B.R., Capson G. Global genetic variation and molecular epidemiology of encapsulated Haemophilus influenzae. Rev. Infect. Dis. 1990, 12: 75- 111.

70. Olarte D.G., Trujillo H.S., Uribe A.P., Agudelo N.O. Lung puncture-aspiration as a bacteriologic diagnostic procedure in acute pneumonias of infants and children. Clin. Pediatr. 1971, 10: 346-350.

71. Oymar K. Bacterial tracheitis in children. Tidsskr. Nor. Laegeforen. 2000, 120 (12): 1417-1419

72. Rohn R.J., Moxon R. Phenotypic variation in Haemophilus influenzae: The interrelationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide. Microb. Pathog. 1995, 18: 129- 140.

73. Rubin L.G. Comparition of in vivo and in vitro multiplication rates of Haemophilus influenzae type b. Infect. Immun. 1986, 52 (3): 911 913.

74. Schneerson R., Barrera O., Sutton A., Robbins J.B. Preparation, characterization and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide protein conjugates. J. Exp. Med. 1980,152:361 -76.

75. Shann F., Gratten M., Germer S., Linnemann V., Hazlett D., Payne R. Aetiology of pneumonia in children in Goroka Hospital, Papua New Guinea. Lancet 1984, Sept 8,2 (8402): 537-541.

76. Shaw S., Smith A.L., Anderson P., Smith D.H. The paradox of Haemophilus influenzae type b bacteremia in presence of serum bactericidal activity. J. Clin. Invest. 1976, 58: 1019 1029.

77. Shilling C.H., Palson B.O. Assessment of the Metabolic capabilities of Haemophilus influenzae Rd through a Genom-scale Pathway Analysis. J. Theor. Biol. 2000,203 (3): 249 283.

78. Spencer HT, Herriot R.M. Development of competence of Haemophilus influenzae. J Bacteriol. 1965, Oct; 90 (4): 911 -20.

79. State of World's vaccines and Immunization, WHO, Geneva. 2002: 39-41.

80. Takala A.K., Peltola H., Eskola J. Disappearance of epiglottitis during large-scale vaccination with Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine among children of Finland. Laryngoscope. 1994,104: 731 -735.

81. Talmade M.B., Herriot R.M. A chemically defined medium for growth, transformaton and isolation of nutritional mutants of Haemophilus influenzae. Biocem. Biophys. Res. Commun. 1960,2: 203-206.

82. Tatusov R.L., Mushegian A.R. et. al. Metabolism and evolution of Haemophilus influenzae deduced from whole-genome comparison with Escherichia coli. Curr. Biol. 1996, 6(3): 279-291.

83. The Children's Vaccine Initiative. Hib who's using it, who isn't and why not? CVI Forum. 1998, 16: 13-15.

84. Voss L., Lennon D., Gillies M. Haemophilus influenzae type b disease in Auckland children 1981-1987. N. Z. Med. J. 1989,102: 149- 151.

85. Wall R.A., Corrah P.T., Mabey D.C.W, Greenwood B.M. The etiology of pneumonia in The Gambia. Bull. World Healht Organ. 1986,64: 553 558.

86. Watt J.P., Levine O.S., Santosham M. Global reduction of Hib disease: what are the next step?: Proceeding of the meeting Scottsadale, Arizona, September 25, 2002. J. Pediatr. 2003. Dec; 143 (6 suppl): 163-87.

87. WHO Technical Report Series 897. WHO Expert committee on biological standartization. Forty-nith Report. WHO, Geneva. 2000:29 -60.

88. Wolin H.L. Defined medium for Haemophilus influenzae type b. J. Bacterid. 1963, 85:253-254.

89. World Health Organization. 1998. Global program for vaccines and immunization. The WHO position paper on Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines. Wkly Epidemiol Rec. 1998, 73:64.