Иммунобиологические свойства различных углеводсодержащих препаратов Haemophilus influenzae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат медицинских наук Головинская, Ольга Вячеславовна

• Головинская, Ольга Вячеславовна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Головинская, Ольга Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. РОЛЬ HAEMOPHILUS INFLUENZAE В ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА.

2.2. АНТИГЕННЫЙ СОСТАВ ШТАММОВ HAEMOPHILUS INFLUENZA

2.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО ОТВЕТА У ЛЮДЕЙ, СТРАДАЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, ВЫЗВАННЫМИ H.INFL UENZAE.

2.4. ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕМОФИЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ. РОЛЬ УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ В ИХ СОСТАВЕ.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1.1. Штаммы Н.influenzae, использованные в работе.

3.1.2. Биомасса Н. influenzae.

3.1.3. Сыворотки.

3.1.4. Животные.

3.1.5. Антигены, диагностические наборы и другие препараты.

3.1.6. Коммерческие препараты.

3.1.7. Методы выделения и очистки бактериальных антигенов.

3.1.8. Детоксикация липоолигосахаридов.

3.1.9. Методы химического анализа.

3.1.10. Методы физико-химического анализа.

3.1.11. Методы иммунохимического анализа.

3.1.12. Методы оценки иммунобиологических свойств препаратов на животных.

3.1.13. Методы статистической обработки результатов исследования.

3.2. ВЫБОР НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ В ПОПУЛЯЦИИ

СУБТИПОВ БЕСКАПСУЛЬНЫХ ШТАММОВ H.INFLUENZAE.

3.2.1 Распространенность субтипов ЛОС среди бескапсульных штаммов

Н.influenzae по результатам SDS-электрофореза в ПААГ.

3.2.2. Сравнительная характеристика специфического гуморального ответа к ЛОС NTHi у клинически здоровых и больных различными бронхолегочными заболеваниями людей.

3.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ХИМИЧЕСКИХ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ H.INFLUENZAE

3.3.1. Химический состав антигенных препаратов.

3.3.2. Исследование молекулярно-весовой гетерогенности антигенных препаратов Н. influenzae.

3.3.3. Изучение серологической специфичности антигенных препаратов H.influenzae.

3.4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДЕТОКСИЦИРУЮЩИХ АГЕНТОВ НА ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ И ТОКСИЧНОСТЬ ЛИПООЛИГОСАХАРИДОВ H.INFLUENZAE.

3.5. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ H.influenzae.

3.5.1. Влияние углеводсодержащих препаратов H.influenzae на показатели поглотительной способности лейкоцитов: фагоцитарного индекса и фагоцитарной активности.

3.5.2.Влияние антигенных препаратов H.influenzae на продукцию цитокинов

3.5.3. Влияние антигенных препаратов H.influenzae на уровень экспрессии поверхностных маркеров мононуклеарных лейкоцитов селезенок мышей.

3.5.4. Изучение гуморального иммунного ответа на углеводсодержащие антигенные препараты H.influenzae у мышей.

3.5.5. Сравнительная характеристика токсичности и протективной активности углеводсодержащих антигенов H.influenzae.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунобиологические свойства различных углеводсодержащих препаратов Haemophilus influenzae»

Инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae, являются важной причиной заболеваемости и смертности в экономически развитых и развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего возраста [18, 35]. Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что эти инфекции имеют широкое распространение на территории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [36, 37].

Заболевания, вызываемые наиболее вирулентным капсульным штаммом Н. influenzae типа b - Hib - (гнойный менингит, гнойный эпиглоттит, пневмония, септический артрит, остеомиелит, целлюлит, бактериемия), имеют широкое распространение и тяжелое течение, вместе с тем, нельзя недооценивать медико-социальную значимость заболеваний, вызываемых бескапсульными или нетипируемыми (NTHi) штаммами гемофильной палочки (сепсис, средний отит, синусит, обострение хронического бронхита, конъюнктивит) [9, 87].

Если вопрос защиты от инфекций, вызванных капсульными штаммами H.influenzae, в настоящее время решается применением конъюгированных вакцин на основе капсульного полисахарида H.influenzae типа b (КПС Hib) и белков-носителей, то вакцины против инфекций, вызванных NTHi, до сих пор нет. В качестве основы для вакцинных препаратов, направленных на профилактику заболеваний, вызванных бескапсульными штаммами H.influenzae, за рубежом изучается роль белков наружной мембраны и липоолигосахаридов (ДОС) [3, 42, 51]. Следует отметить, что JIOC NTHi имеют уникальную структуру, и среди бескапсульных штаммов Н. influenzae обнаружено более 10-ти субтипов, различающихся по электрофоретической подвижности ДОС [28, 55].

В нашей стране субтипирование циркулирующих NTHi штаммов не проводилось. Вместе с тем, решение этого вопроса может способствовать определению наиболее распространенных в популяции субтипов возбудителей с дальнейшим получением из них детоксицированных JIOC, обеспечивающих перекрестную защиту от NTHi. Не изучена также возможность создания вакцинного препарата на основе двух Т-независимых антигенов (КПС и JIOC) H.influenzae для одновременной защиты от капсульных и бескапсульных штаммов.

Учитывая высокую эффективность вакцинных препаратов, получаемых из грамнегативных бактерий с помощью солянокислого гидроксиламина, содержащих в своем составе ЛПС, КПС и, вероятно, белки наружной мембраны [13, 14], представляется целесообразным включение гидроксил-аминового препарата Н. influenzae (ГАП) в состав изучаемых углеводсодержащих антигенов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является получение углеводсодержащих антигенов H.influenzae и характеристика их иммунобиологических свойств.

Задачи исследования:

1. Провести выбор бескапсульных штаммов H.influenzae, наиболее распространенных в популяции больных бронхолегочными заболеваниями (БЛЗ).

2. Получить препараты капсульного полисахарида Hib, гидроксил-аминовые препараты капсульного и бескапсульного штаммов H.influenzae, ЛОС NTHi и охарактеризовать их по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

3. Изучить влияние гидроксиламингидрохлорида, безводного гидразина, гидроксида натрия на жирнокислотный состав липида А липоолигосахарида бескапсульного штамма и его токсичность.

4. На основании результатов изучения иммунобиологических свойств антигенных препаратов Н.influenzae определить наиболее перспективный препарат для разработки вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.

Научная новизна

Впервые при использовании SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) проведен скрининг ДОС, выделенных из 62 бескапсульных штаммов Н. influenzae, циркулирующих на территории России (Москва) среди больных с бронхолегочными заболеваниями. По электрофоретической подвижности ДОС выявлено 10 основных субтипов, имеющих один электрофоретический компонент, и 13 дополнительных, включающих 2-3 основных компонента в различных сочетаниях. Наиболее распространены среди больных - VI (17,7±4,8%), VIII (12,9±4,3) и X (12,9±4,3) субтипы.

Впервые при использовании твердофазного ИФА на основе ДОС 67 штаммов NTHi определена частота повышенного уровня ДОС-специфических IgG-антител к Н.influenzae у больных бронхолегочными заболеваниями и здоровых доноров. Наиболее часто повышенный уровень антител наблюдали к 11 штаммам (16,7-54,8%), которые также имели признаки или принадлежали к трем основным субтипам (VI, VIII, X).

Выделены и охарактеризованы по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам три группы бактериальных антигенов: КПС 1095 Hib; ГАП 1095 Hib и 58 NTHi; ДОС штаммов 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib. По результатам иммунохимических исследований наиболее выраженной перекрестной активностью обладал ДОС штамма 45 NTHi (X субтип).

Впервые проведено сравнительное изучение детоксицирующих свойств безводного гидразина (БГ), солянокислого гидроксиламина (ГА) и гидроксида натрия. На примере ДОС 45 NTHi показано, что при использованных концентрациях БГ и ГА приводят к удалению основной массы жирных кислот из липида А, что, в свою очередь, ведет к уменьшению токсичности препарата в опытах на животных в 31,5-25 раз (1Х>50ЛОСисх=0,063 мкг; 1ЛЭ50дЛОСБг=1,99 мкг; LD50 дЛОСГА=1,58 мкг).

Изучение иммунобиологических свойств КПС, ГАП, ЛОС, дЛОС и смесей КПС с ЛОС 45 NTHi и КПС с дЛОСГА показало, что смесь КПС Hib (10 мкг) и дЛОСга 45 NTHi (0,1-10мкг) является наиболее перспективным углеводсодержащим препаратом в качестве основы для разработки новой вакцины против гемофильной инфекции, обусловленной как капсульными, так и бескапсульными штаммами. При испытанных дозах и схемах введения смесь указанных препаратов обладает низкой токсичностью, высокой перекрестной протективной активностью при заражении иммунизированных мышей капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae и вызывает активацию эффекторов системы врожденного и адаптивного иммунитета, приводя к повышению фагоцитарной способности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, увеличению числа Т-клеток, экспрессирующих молекулы cd4, активационные молекулы cd25 и МНСИ, повышению продукции специфических IgG-антител к ЛОС.

Практическая значимость

Установлено, что циркулирующие на территории России (Москва) NTHi штаммы по структуре ЛОС относятся к десяти основным субтипам, среди которых VI, VIII и X субтипы наиболее распространены у больных бронхолегочными заболеваниями. Предложенный способ субтипирования может быть использован для проведения эпидемиологического мониторинга штаммов в разных географических регионах России.

Высокая степень очистки и специфическая активность КПС 1095 Hib позволяет рекомендовать его использование в качестве референс-препарата, а также для создания современных диагностических и профилактических препаратов. В рамках выполнения федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» КПС 1095 Hib использовали для создания количественной иммуноферментной тест-системы для оценки поствакцинального иммунитета.

Солянокислый гидроксиламин может быть использован в качестве детоксицирующего агента для JIOC NTHi штаммов.

Смесь капсульного полисахарида Hib и детоксицированного JIOC NTHi может быть использована в качестве основы для разработки вакцины с серотиповой (Hib) и видовой (NTHi) перекрестной протективной активностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие в популяции больных бронхолегочными заболеваниями людей, по электрофоретической подвижности ДОС относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2. Среди выделенных углеводсодержащих препаратов - КПС 1095 Hib, ГАП 1095 Hib и 58NTHÍ, ДОС 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib - высокой перекрестной серологической активностью обладают ГАП и ДОС 45 NTHi.

3. Действие 1% водного раствора гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению из липида А ДОС NTHi 3-гидроксикаприновой, миристиновой, олеиновой и стеариновой кислот и снижению токсичности полученного дЛОС в 25 раз.

4. Низкая токсичность, высокая степень внутривидовой перекрестной защиты смеси КПС Hib и дЛОС NTHi, способность этой смеси активировать эффекторы врожденного иммунитета, а также инициировать процесс формирования адаптивного иммунитета является основанием для разработки новой вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызванных капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум", Санкт-Петербург, 2008; на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 2009. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 18 ноября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 18 рисунками и 20 таблицами, состоят из введения, четырех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 109 источников, в том числе, 41 на русском языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Головинская, Ольга Вячеславовна

выводы

1.Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие на территории Москвы, по структуре JIOC относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2.Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых людей содержат повышенный уровень IgG-антител к ДОС NTHi (что доказывает важную роль бескапсульных штаммов в инициации заболеваний).

3.Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых доноров, содержат повышенный уровень IgG-антител к JIOC разных субтипов, что свидетельствует о частой смене субтипа возбудителя.

4.В сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями, достоверно чаще, чем у клинически здоровых доноров определяется повышенный уровень антител к 11 бескапсульным штаммам Н. influenzae, относящимся к VI, VIII и X субтипам.

5.Установлено, что 3 группы антигенов, полученных из капсульного (1095) и бескапсульных (45, 54, 58 и 65) штаммов H.influenzae, различны по химическому составу. В иммунохимических реакциях КПС Hib проявляет серотиповую специфичность; ГАП Hib и NTHi - серотиповую и видовую специфичность; ДОС NTHi - внутривидовую специфичность, причем наибольшей перекрестной серологической активностью обладает ДОС штамма 45 NTHi (X субтип).

6.Детоксикация ДОС 1% раствором гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению 4-х из 6-ти ВЖК липида А и 25-кратному снижению токсичности по сравнению с нативным препаратом ДОС.

7.Установлено, что при испытанных дозах и схемах иммунизации КПС Hib, ГАП капсульного и бескапсульного штаммов и ДОС H.influenzae вызывают активацию эффекторов системы врожденного иммунитета, что проявляется в повышении фагоцитарной активности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, при этом смеси КПС Hib с ДОС и КПС Hib с дЛОС 45NTHi обладают наиболее высокой стимулирующей активностью.

8. Смесь КПС Hib с ДОС и дЛОС45ГА NTHi вызывает у мышей повышение количества клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры (CD4, CD25, CD4/CD25, CD19, MHCII) в большей степени, чем введение монопрепаратов.

9. Смесь КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi обладает более высокой протективной активностью при заражении вирулентным капсульным штаммом H.influenzae типа b по сравнению с монопрепаратами ГАП и КПС Hib. Наиболее выраженной внутривидовой перекрестной протективной активностью обладают ГАП NTHi, ДОС и дЛОС45ГА NTHi, а также смеси КПС Hib с ЛОС 45 NTHi и КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi.

10. Способность смеси КПС 1095 Hib с дЛОС45ГА NTHi к активации систем врожденного и адаптивного иммунитета позволяет рекомендовать эту комбинацию в качестве основы для создания вакцины для профилактики инфекций, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Головинская, Ольга Вячеславовна, 2011 год

1. Ахматова Н.К. Молекулярные и клеточные механизмы действия иммуномодуляторов микробного происхождения на функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета: дис. . докт. мед. наук. Москва, 2006. - 289 с.

2. Бактериальные гнойные менингиты, Биографии Рихард Пфайффер, Маргарет Питтман // Информационный бюллетень Вакцинация. 1999. - №2. - http://medi.ru/doc/15b0201.htm

3. Бектимиров Т. А. Рекомендации ВОЗ по профилактике гемофильной инфекции тип b // Информационный бюллетень Вакцинация. 2003. - №2(26). - С. 4-5.

4. Воронина Л.Г. Микробиологические аспекты инфекций, вызванных Haemophilus influenzae, у детей: Автореф. дис. .д-ра мед. наук. Санкт-Петербург, 2007. 38 с.

5. Брикун И.К., Козловский М.Т., Никитина Л,В. Гидразин и гидроксиламин и их применение в аналитической химии. Алма-Ата.: Наука, 1967.- 175 с.

6. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Современные проблемы токсикологии. 2002. - С. 1-7.

7. Варбанец Л.Д., Здоровенко Г.М., Книрель Ю.А. Методы исследования эндотоксинов // Киев.: Наукова думка, 2006. —237 с.

8. Варден Ван дер Б.Л. Математическая статистика: Пер.с нем. — М.: Иностранная литература, 1960 — 450 с.

9. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae: Методические рекомендации. -Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2000. -№2-Т. 2.-С. 93-109.

10. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. М.: Практика, 1998.-459.

11. Горбунов С.Г., Орлова O.E., Захарова Н.Е. с соавт. Результаты динамического наблюдения за детьми раннего возраста в закрытом коллективе, иммунизированными вакциной «АКТ-ХИБ» // Бюллетень Вакцинация. 2003. - №2(26). - С. 6-7.

12. Грабар П., Буртен П. Иммуноэлектрофоретический анализ. М.: Изд-во иностр. лит., 1961. - 305 с.

13. Егорова Н.Б., Мансурова H.JL, Кузьмина JI.A. с соавт. Протективная активность поликомпонентной вакцины из антигенов условнопатогенных микроорганизмов при оральном введении // Журнал микробиол., иммун., и эпидем. 1993. -№6. — С. 48-51.

14. Жукова Л.Ф. Энтеральная иммунизация антигенными комплексами сальмонелл и шигелл в экспенрименте // Дис. канд. мед. наук. -М.- 1980.- 167с.

15. Захарова Н.Е. Определение влияния гидроксиламингидрохлорида на состав и свойства антигенов Shigella dysenteriae 1: Дис. . канд. биол. наук. Москва, 2001. - 121с.

16. Коровина Н.А., Заплатников А. Л. Пневмонии у детей // Информационный бюллетень Вакцинация 2003. - №5(29). - С. 4-5

17. Куртасова Л.М., Рузаева А. А. Современные аспекты гемофильной инфекции у детей раннего возраста // Красноярск, ООО «Версо».-2010.- 148 с.

18. Малов В.А., Пак С.Г., Суджян Е.В. Синдром интоксикации в инфекционной патологии: новый взгляд на старую проблему //

19. Журн.микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1994. -№5.-С.105-109.

20. Мейбаум В.В. Определение пентоз в нуклеотидах и нуклеозидах посредством реакции Биаля // Биохимия. 1945. - 10, №5. - С. 353-358.

21. Микробиология и иммунология: Учебник // под редакцией А.А.Воробьева. М.: Медицина, 1999. - 464с.

22. Миронов К.О. Метод мультилокусного секвенирования-типирования N. meningitidis и Н. influenzae серотипа b в эпидемиологическом надзоре за бактериальными менингитами: дис. канд. мед. наук. Москва, 2004. - 136с.

23. Митрохин С.Д. Значение представителей рода Haemophilus в инфекционной патологии человека // Инфекции и антимикробная терапия. 2005. - Т.07. - № 1 - http://old.consilium-medicum.com/media/infektion/0501/32.shtml

24. Одрит JL, Огг Т. Химия гидразина: Пер. с англ. М.: Изд. иностр. Лит., 1954.-238 с.

25. Онищенко Г.Г. Письмо Минздрава РФ от 30 декабря 1997г. № 2510/10099-97-32 О профилактике гемофильной инфекции // Информационный бюллетень Вакцинация. 2003. -№2(26). - С. 5.

26. Орлова О.Е.: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва, - 2004. -23 с.

27. Орлова О.Е., Елкина С.И., Ванеева Н.П. с соавт. Питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b // Патент № 2258737, 2005.

28. Орлова О.Е. Поверхностные антигены нетипируемых штаммов Haemophilus influenzae II Журн.микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии . 2006 . - №5. - С. 113-120.

29. Остерман Л.Р. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.- М.: Наука, 1981. -286 с.

30. Пелтола X. Заболевания, вызванные Haemophilus influenzae тип b, в начале 21-го столетия: глобальный анализ актуальности инфекции после 10 лет использования конъюгированных вакцин // Информационный бюллетень Вакцинация 2003. - №2(26). - С. 3.

31. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЕОТАР-МЕД,2002.-768с.

32. Покровский В.И., Таточенко В.К. Гемофильная инфекция тип b // Информационный бюллетень Вакцинация. — 2003. №2(26). — С. 2.

33. Сидоренко С.В., Гучев И.А. Острый средний отит: современный взгляд на проблему с позиций доказательной медицины // Инфекции и антимикробная терапия. 2005. — Т.07. — N 1.

34. Синяшин Н.И., Лобачева Л.А. Щадящий метод выделения растворимых антигенов из патогенных бактерий // Использование разных методов в изучении и изготовлении вакцин и анатоксинов: Сб.науч. тр. М., 1964. - С. 8-9.

35. Таточенко В.К. Инфекция, вызванная Haemophilus influenzae тип b, (вопросы и ответы) // Информационный бюллетень Вакцинация.2003. №2(26). - обложка.

36. Таточенко В.К. Перспективы развития иммунопрофилактики в России // Журн.микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2010.-№15.-С. 92.

37. Улуханова Л.У. Вести из регионов // Информационный бюллетень Вакцинация. 2003. - №2(26). - С. 11.

38. Учайкин В.Ф., Шамшева О.В. Гнойные менингиты: клиника и вакцинопрофилактика Гнойные менингиты: клиника и вакцинопрофилактика // Информационный бюллетень Вакцинация -1999.-№2(2).-С. 6.

39. Шевчик Ю.С., Новикова О.В., Ахматова Н.К. с соавт. Действие рекомбинантного белка теплового шока Mycobacterium tuberkulosis (rHSP70) на иммуногенную активность капсульного полисахарида

40. Haemophilus influenzae типа b // Журн.микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. - №6. - С. 83-89.

41. Шипулин Г.А., Королева И.С., Платонов А.Е. с соавт. Генетическая характеристика штаммов Haemophilus Influenzae серотипа В, изолированных в регионах России // Журн.микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. - №1. - С. 24-28.

42. Юшкова И.Ю., Кулькина В.Ф., Огурцов A.A. с соавт. Проблема гемофильной инфекции в Тюменской области // Информационный бюллетень Вакцинация. 2003. - №2(26). - С. 10-11.

43. Alrawi A.M., Chern K.C., Cevallos V., et al. Biotypes and serotypes of Haemophilus influenzae ocular isolates // Br.J.Ophthalmol. 2002. -Vol.86. - p. 276-277.

44. Apicella M.A., Dudas K.C., Campagnari A. et al. Antigenic Heterogeneity of Lipid A of Haemophilus influenzae II Infection and Immunity. 1985.- Vol.50. - № 1.- p. 9-14.

45. Boivin, A., Mesrobeanu, I., Mesrobeanu, L. Extraction D'un Complexe Toxique Et Antigdnique A Partir Du Bacille D'aertrycke // Compt. Rend. Soc. Biol. 1933. - Vol. 114.-p. 307-310.

46. Buscher A.Z., Burmeister К., Barenkamp S J. et al. Evolutionary and Functional Relationships among the Nontypeable Haemophilus influenzae

47. HMW Family of Adhesins // J.Bacteriol. 2004. - Vol. 186(13). - p. 42094217.

48. Cox R.A., Slack M.P.E. Clinical and microbiological features of Haemophilus influenzae vulvovaginitis in young girls // J.Clin.Pathol. -2002. Vol.55. - p. 961-964.

49. Daniel M. Musher, Hague-Park M., Robert E. Baughn, et al. Opsonizing and bactericidal effects of normal human serum on nontypable H.influenzae // Infection and immunity. 1983. - 297. - C. 39-40.

50. Dubois M., Gillor K.A., Hamilton J.K. et al. A colometrie method for the determinayion of sugars. // Anal.Chemistry. 1959. - Vol.28. - p. 350

51. Foxwell A.R., Jennelle M.K. et al. Nontypeable Haemophilus influenzae: Pathogenesis and prevention // Microbiol mol Biol Rev. — 1998. Vol.62. - № 2. - p. 294-308.

52. Gotschlich E.C., Liu T.Y., Artenstein M.S. Human immunity to the meningococcus. 3. Preparation and immunochemical properties of the group A, group B, and group C meningococcal polysaccharides // J.Exp.Med. -1969.-Vol. 129(6).-p. 1349-1365.

53. Green B.A, Farley J.E, Quinn-Dey T, et al. The e (P4) outer membrane protein of Haemophilus influenzae: biologic activity of anti-e serum and cloning and sequencing of the structural gene // Infect Immun. -1991. № 59(9). - p. 3191-3198.

54. Gu X.X., Tsai Tsai C-M., Apicella M.A. et al. Quantitation and Biological Properties of Released and Cell-Bound Lipooligosaccharides from Nontypeable Haemophilus influenzae II Infection And Immunity. -1995.-Vol.63. №10.- p. 4115-4120.

55. Gu X.X., Sun J., Jin S. et al. Detoxified lipooligosaccharide from nontypeable Haemophilus influenzae conjugated to proteins confers protection against otitis media in chinchillas. Infect.Immun. - 1997. -Vol.65. - №11. - p. 4488-4493.

56. Gu X.X., Tsai C.M., Ueyama T. et al. Synthesis, characterization, and immunologic properties of detoxified lipooligosaccharide from Nontypeable Haemophilus influenzae conjugated to proteins // Infect, immun. 2001. -Vol.69 (4).-p. 2636-2642.

57. Harabuchi Y., Faden H., Yamanaka N., et al. Nasopharyngeal colonization with nontypeable Haemophilus influenzae and recurrent otitis media//J.Infect.Dis. 1994.- Vol.170. - C. 862-868.

58. Heiander I.M., Lindner B., Brade H. et al. Chemical structure of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae strain 1-69 Rd-/b+. Description of a novel deep-rough chemotype. Eur J. Biochem. 1988. — Vol. 177(3). -p. 483-492.

59. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity amond Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylammide gels // J.Bacteriol. 1983. - № 4. - p. 269-277

60. Hou Y., Gu X.X. Development of Peptide Mimotopes of Lipooligosaccharide from Nontypeable Haemophilus influenzae as Vaccine Candidates // J.Immunol. 2003. - Vol. 170(8). - p. 4373-4379.

61. Jianjun L., Cox A.D., Hood D.W. et al. Electrophoretic and mass spectrometric strategies for profiling bacterial lipopolysaccharides // Mol. Biosyst. 2005. - Vol.1 . - p. 46-52.

62. Jones C. Vaccines Based On The Cell Surface Carbohydrates Of Pathogenic Bacteria // An Acad.Bras.Cienc. 2005. - Vol.77(2). - p. 293324.

63. Jones PA, Samuels NM, Phillips NJ, Haemophilus influenzae type b strain A2 has multiple sialyltransferases involved in lipoologosaccharide sialylation // J.Biol.Chem. 2002. - Vol.277(17). - p. 598-611.

64. Kaur R., Sharma A., Majumdar S.,et al. Outer-membrane-protein subtypes of Haemophilus influenzae isolates from North India // J.Med.Microbiol. 2003. - Vol.52(8). - p. 693-696.

65. Kimura A., Hansen E.J. Antigenic and phenotypic variations of Haemophilus influenzae type b lipopolysaccharide and their relationship to virulence // Infect. Immun. 1986.- Vol.51. - p. 69-79.

66. Kimura A., Patrick C.C., Miller E.E. et al. Haemophilus influenzae type b lipooligosaccharide: stability of expression and association with virulence // Infect Immun. 1987. Vol.55(9). - p. 1979-1986.

67. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol.227. - p. 680 - 685.

68. Loeb M.R., Woodin K.A. Cross-Reactivity of Surface-Exposed Epitopes of Outer Membrane Antigens of Haemophilus influenzae Type b // Infect Immun. 1987. - Vol.55. - №12. - p. 2977-2983.

69. Loosmore S.M, Yang Y.P, Coleman D.C, et al. Outer membrane protein D15 is conserved among Haemophilus influenzae species and may represent a universal protective antigen against invasive disease // Infect Immun. 1997. - Vol 65. - № 9. - p. 3701-3707.

70. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J.Biol.Chem. 1951. - Vol.193, - p. 265-275.

71. Lundström S. Detailed structural studies towards the understanding of lipopolysaccharide glycan expression in non-typeable Haemophilus influenzae: thesis for Ph.D. Stockholm, 2008. - 63 p.

72. Mänsson, M., Hood, D.W., Li, J., Richards, J.C., Moxon, E.R. & Schweda, E.K.H. Structural analysis of the lipopolysaccharide from nontypeable Haemophilus influenzae strain 1003 // Eur. J. Biochem. — 2002. -№269.-p. 808-818.

73. Mattsby-Baltzer I., Gemski P., Alving C.R. Heterogeneity of Lipid A: Comparison of Lipid A Types from Different Gram-Negative Bacteria // Journal of Bacteriology. 1984. - Vol.159. - №3. - p. 900-904.

74. Mertsola J., Cope L.D., Säez-Llorens X. et al. In vivo and in vitro expression of Haemophilus influenzae type b lipooligosaccharide epitopes // J.Infect.Dis. 1991.- Vol. 164(3).-p. 555-563.

75. Mikhail I., Yildirim H.H., Lindahl E.C.H et al. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: Variability of fatty acid substitution // Analytical Biochemistry. -2005.- Vol.340. №2.-p. 303-316.

76. Möller L.V., Regelink A.G., Grasselier H. Multiple Haemophilus influenzae strains and strain variants coexist in the respiratory tract of patients with cystic fibrosis II J.Infect.Dis. 1995. - Vol. 172(5) . - p. 13881392.

77. Novotny L.A., Jurcisek J.A., Pichichero M.E., et al. Epitope Mapping of the Outer Membrane Protein P5-Homologous Fimbrin Adhesin of Nontypeable Haemophilus influenzae II Infect Immun. 2000. - Vol.68(4) . -p.2119-2128.

78. Ouchterlony O. Antigen-antibody reaction in gels. IV. Types of reactions in coordinated systems of diffusion // Acta.Patol.Microbiol. -1953.-Vol. 32.- p. 231-240.

79. Patrick C.C., Kimura A., Jackson M.A. et al. Antigenic Characterization of the Oligosaccharide Portion of the Lipooligosaccharide of Nontypable Haemophilus influenzae II Infection and Immunity. 1987. -Vol.55.-№ 12.-p. 2902-2911.

80. Peltola H., Salo E., Saxen H. Incidence of Haemophilus influenzae type b meningitis during 18 years of vaccine use: observational study using routine hospital data II BMJ. 2005. - Vol.330(7481). - p.18-19.

81. Pieroni R.B., Broderich E.J., Bundeally A. et al. A simple method for the quentitation of submicrogram amounts of Bacterial endotoxin. -Proc.Soc.Exp. Biol.Med. -1970. Vol.133. - №3. - p. 790-794.

82. Poolman J.T, Bakaletz L, Cripps A, et al. Developing a nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) vaccine // Vaccine, 2000, № 8. P. 108-115.

83. Porras O., Caugant D.A., Gray B. et al. Difference in structure between type b and nontypable Haemophilus influenzae populstions // Infection and immunity. 1986. - Vol.53. - №.1. - p.79-86.

84. Rahman M.M., Gu X.X., Tsai C-M. et al. Structural heterogeneity of the lipooligosaccharide (LOS) expressed by pathogenic non-typeable Haemophilus influenzae strain NTHi 9274 // Glycobiology. 1999- Vol.9. - №12.- p. 1371-1380.

85. Rao V.K, Krasan G.P. et all. Molecular determinants of the pathogenesis of disesae due to non-typable Haemophilus influenzae II FEMS Microbiol. Rev. 1999. - № 23. - p. 99-129.

86. Rodriguez C.A., Avadhanula V., Buscher A. et al. Prevalence and Distribution of Adhesins in Invasive Non-Type b Encapsulated Haemophilus influenza // Infect Immun. 2003. - Vol.71(4) . -p. 1635-1642.

87. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology, 5th ed. London.: Mosby-Wolfe, 1998.-423 p.

88. Sethi S, Murphy T.F. Bacterial infection in cronic obstructive pulmonary disease in 2000: a state-of-art review //Clin. Microbiol. Rew. -2001.-Vol. 14.-№2.-p. 336-363.

89. Sethi S., Wrona C., Grant B.J.B, et al. Strain-specific Immune Response to Haemophilus influenzae in Chronic Obstructive Pulmonary

90. Disease // American Journal Of Respiratory And Critical Care Medicine. -2004,-Vol.169.-p. 448-453.

91. Sikkema D.J., Murphy T.F. Molecular analysis of the P2 porin protein of nontypeable Haemophilus influenzae // Infect Immun. 1992. -Vol.60(12). - p.5204-5211.

92. Snow J.B Jr. Progress in the prevention of otitis media through immunization // Otol. Neurotol. 2002. - № 23(1). - p. 1-2.

93. Spinola S.M., Peacock J., Denny F.W., et al. Epidemiology of colonization with nontypable Haemophilus influenzae in children: A longitudinal study // J.infect.Dis. 1986. - Vol.154. - №1. - C. 100-109.

94. St. Gerne J.W., III. Molecular and cellular determinants of nontypeable Haemophilus influenzae adherence and invasion // Cellular Microbiol. 2002. - Vol.4. - № 4. - p. 191-203.

95. Tolan R.W., Munson R.S., Granoff D.N. Lipopolysaccharide gel profiles of Haemophilus influenzae nype b are not steble epidemiologic markers // J.Clin.Microbiol. 1986. - № 8. - p. 223-227.

96. Todar K. Haemophilus influenzae and Hib meningitis // Todar's Online Textbook of Bacteriology. Wisconsin, 2009. - p. 388-395.

97. Weeke B. Rocket immunoelectrophoresis // Scand.J.Immunol. 1973. -2, №1.-p. 37-46

98. Weiser, J.N., Shchepetov, M., Chong, S.T.H. Decoration of lipopolysaccharide with phosphorylcholine: a phase-variable characteristic of Haemophilus influenzae II Infect. Immunity. 1997. - № 65. - p. 943950.

99. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Meth. Carbohyd. Chem. 1965. - №5 — p.83-91.

100. Yi K.} Murphy T.F. Importance of an immunodominant surface-exposed loop on outer membrane protein P2 of nontypeable Haemophilus influenzae II Infect. Immun. 1997 - № 65. - 150-155.