Устойчивость Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам на фоне генетического разнообразия и микроэволюции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кандинов Илья Денисович

• Кандинов Илья Денисович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Кандинов Илья Денисович

Список сокращений

Введение

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов и апробация работы

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Объём и структура диссертации

1. Обзор литературы

1.1 Гонококковая инфекция и патогенез N. gonorrhoeae

1.2 Механизмы лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к р-лактамным антибиотикам

1.2.1 Пенициллины

1.2.1.1 Устойчивость к пенициллину, ассоциированная с хромосомными мутациями

1.2.1.2 Пенициллиназа-продуцирующие штаммы N. gonorrhoeae и номенклатура Р-лактамаз

1.2.2 Цефалоспорины III поколения

1.2.3 Карбапенемы

1.3 Устойчивость N. gonorrhoeae к актуальным препаратам других классов

1.3.1 С пектиномицин

1.3.2 Азитромицин

1.3.3 Разработка новых лекарственных препаратов

1.4 Диагностические методы выявления гонококковой инфекции и оценки чувствительности патогена к антимикробным препаратам

1.4.1 Культуральные методы

2

1.4.2 Полимеразная цепная реакция

1.4.3 Секвенирование нуклеиновых кислот и молекулярное типирование

1.4.3.1 Методы генотипирования N. gonorrhoeae: NG-MAST и MLST

1.4.3.2 Типирование с анализом детерминант резистентности: NG-STAR

1.4.3.3 Анализ генетических детерминант резистентности N. gonorrhoeae с использованием биологических микрочипов

1.4.3.4 Анализ с использованием технологии полногеномного секвенирования

1.5 Регрессионные модели для предсказания уровней устойчивости к АМП

1.6 Молекулярная эпидемиология и генетическое разнообразие изолятов

N. gonorrhoeae, устойчивых к р-лактамным антибиотикам

1.6.1 Российская Федерация

1.6.2 Страны Евросоюза

1.6.3 Азиатско-Тихоокеанский регион

1.6.4 Северная и Южная Америка

2. Материалы и методы

2.1. Сбор и анализ клинических изолятов N. gonorrhoeae

2.1.1. Первичная идентификация возбудителя гонококковой инфекции и сбор клинических изолятов

2.1.2. Культивирование N. gonorrhoeae и определение фенотипической чувствительности к антимикробным препаратам

2.1.3. Выделение ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae и формирование коллекции

2.2. Молекулярное генотипирование и секвенирование ДНК N. gonorrhoeae

2.2.1. Амплификация целевых фрагментов ДНК и типирование по протоколу NG-MAST

2.2.2. Полногеномное секвенирование с использованием платформ Illumina и Oxford Nanopore

2.2.3. Полногеномный анализ клинических изолятов N. gonorrhoeae

2.3. Разработка метода идентификации генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам на основе гидрогелевого биочипа

2.3.1. Подбор олигонуклеотидных зондов

2.3.2. Изготовление гидрогелевых биочипов

2.3.3. Амплификация целевых фрагментов ДНК и гибридизация на биочипе

2.3.4. Обработка флуоресцентных сигналов и гибридизационных профилей биочипов

2.4. Филогенетический анализ изолятов N. gonorrhoeae

2.5. Конструирование клеточных моделей для оценки жизнеспособности и устойчивости к р-лактамным антимикробным препаратам

2.5.1. Конструирование векторных конструкций

2.5.2. Генно-инженерные работы с E. coli

2.5.3. Генно-инженерные работы с N. gonorrhoeae

2.5.4. Оценка жизнеспособности N. gonorrhoeae: исследование роста и гибели клеток

2.6. Построение математических моделей роста и гибели клеток

2.7. Построение регрессионной модели для предсказания МПК к р-лактамным антимикробным препаратам

3. Результаты и обсуждение

3.1. Формирование и анализ коллекции образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae

3.1.1. Анализ молекулярных генотипов изолятов N. gonorrhoeae, собранных на территории РФ

3.1.2. Филогенетический анализ сиквенс-типов, обнаруженных у российских изолятов

3.1.3. Установление ассоциаций между фенотипической чувствительностью к Р-лактамным препаратам и генотипами изолятов N. gonorrhoeae

3.2. Сравнительный филогенетический анализ NG-MAST типов и геногрупп

N. gonorrhoeae России и Европы

3.3. Полногеномный анализ наиболее часто встречающихся NG-MAST генотипов

N. gonorrhoeae в России и других странах

3.4. Разработка метода идентификации генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам на основе гидрогелевого биочипа

3.5. Оценка вклада генетических детерминант устойчивости к р-лактамам, в уровень фенотипической чувствительности изолятов N. gonorrhoeae

3.5.1. Анализ устойчивости к цефтриаксону

3.5.2. Анализ устойчивости к пенициллину

4

3.6. Создание метода точного предсказания уровня устойчивости N. gonorrhoeae к Р-лактамам, используя полученные данные и характеристики изолятов со всего мира

3.6.1. Построение регрессионных моделей для предсказания значений МПК к цефтриаксону и пенициллину

3.6.2. Оценка полученной регрессионной модели

3.7. Разработка генно-инженерных клеточных моделей N. gonorrhoeae, для оценки устойчивости патогена к препаратам р-лактамного ряда

3.7.1. Получение векторных конструкций и штаммов E. coli и N. gonorrhoeaе, содержащих плазмиды pblaTEM

3.7.2. Оценка фенотипической чувствительности штаммов, содержащих различные варианты pblaTEM

3.7.3. Исследование роста и гибели клеток N. gonorrhoeaе, несущих разные плазмиды pblaTEM, и математические модели, описывающие изменения КОЕ

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

АМП - Антимикробный препарат

БЛРС - Бета (Р) - лактамаза расширенного спектра действия

ВОЗ/WHO - Всемирная организация здравоохранения

ЕСНО - Единая система нумерации образцов

ИППП - Инфекции передаваемые половым путём

КОЕ - Колониеобразующие единицы

ЛОС - Липоолигосахарид

МЛУ - Множественная лекарственная устойчивость

МПК - Минимальная подавляющая концентрация

МУК - Методические указания

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

ATCC - Американская коллекция клеточных культур

CDC - Центр по контролю и профилактике заболеваний (США)

CLSI - Институт клинических и лабораторных стандартов (США)

ECDC - Европейский центр профилактики и контроля заболеваний

EUCAST - Европейский комитет по тестированию на чувствительность к АМП

GASP - Программа по контролю за распространением гонококковой инфекции

GGI - Гонококковый генетический остров

MLST - Мультилокусное типирование последовательностей

NG-MAST - мультиантиген-сиквенс-типирование N. gonorrhoeae

NGS - Технологии секвенирования следующего поколения

NG-STAR - Схема типирования по устойчивости к противомикробным препаратам PPNG - Пенициллиназа-продуцирующие штаммы N. gonorrhoeae ST - Сиквенс-тип

WGS - Полногеномное секвенирование

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Устойчивость Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам на фоне генетического разнообразия и микроэволюции»

Введение

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Гонококковая инфекция, вызываемая патогенным микроорганизмом Neisseria gonorrhoeae, является одной из самых опасных и распространенных инфекций, передаваемых половым путём (ИППП). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в мире ежегодно диагностируется более полумиллиарда случаев ИППП, из них порядка 80 миллионов случаев составляет гонорея (WHO, Global progress report on HIV, viral hepatitis and sexually transmitted infections, 2021). Возбудителем гонореи является грамотрицательный диплококк, характеризующийся высокой скоростью как фенотипических, так и генетических адаптивных изменений.

ВОЗ включила N. gonorrhoeae в список 12 патогенов, представляющих глобальную угрозу и требующих безотлагательной разработки новых лекарственных препаратов (Tacconelli et al., 2018). Особое опасение вызывает то, что для каждого из препаратов, применяемых для лечения гонореи, обнаруживаются устойчивые к ним изоляты (Unemo et al., 2014). Естественная компетентность способствует развитию генетического разнообразия, в том числе, за счёт межвидового горизонтального транспорта генов. Помимо высокой скорости приобретения устойчивости к антимикробным препаратам за счет генетических изменений, гонококк способен уклоняться от иммунной системы человека вследствие фазовых вариаций. В настоящее время не существует эффективных вакцин против возбудителя гонококковой инфекции, что делает антимикробные препараты единственным и чрезвычайно важным инструментом в лечении гонореи.

Препаратами для терапии гонококковой инфекции в России и в мире являются антибиотики ß-лактамного ряда: цефалоспорины III поколения - цефтриаксон и цефиксим (Министерство здравоохранения Российской Федерации, приказ №415 от 20.08.2003; WHO, Guidelines for the Treatment of Neisseria gonorrhoeae, 2016). Однако в нескольких странах мира уже зарегистрированы подтвержденные неудачи лечения цефтриаксоном из-за устойчивости N. gonorrhoeae к данному препарату (Attram et al., 2019; Unemo et al., 2019). Вышеназванные явления рассматриваются системами здравоохранения разных стран как угроза репродуктивному здоровью населения. Отдельное опасение вызывает потенциальная опасность возникновения ß-лактамаз расширенного спектра действия, способных гидролизовать цефалоспорины III поколения.

Современная российская популяция гонококка изучена недостаточно. Отсутствуют

данные о молекулярных генотипах, циркулирующих на территории РФ, и их молекулярно-

генетических характеристиках, не проведён анализ российской популяции в контексте

глобального генетического ландшафта. У изолятов, обнаруженных на территории РФ,

7

отсутствует информация о генетических детерминантах устойчивости к актуальным препаратам, что также объясняется отсутствием инструмента пригодного для массового эпидемиологического скрининга изолятов N. gonorrhoeae. В связи с этим важным и своевременным является изучение биологического разнообразия и микроэволюционных процессов в популяции N. gonorrhoeae, в том числе, приводящих к снижению чувствительности к антимикробным препаратам, получение клеточных моделей N. gonorrhoeae для оценки чувствительности к антимикробным препаратам и жизнеспособности, а также разработка метода, пригодного для массового эпидемиологического наблюдения за встречаемостью детерминант резистентности к препаратам выбора с одновременным предсказанием уровней МПК.

Цель исследования

Установление особенностей генетического разнообразия и микроэволюционных процессов в популяции N. gonorrhoeae, связанных с применением антимикробных препаратов, в первую очередь, препаратов Р-лактамного ряда.

Задачи исследования

1. Провести генотипирование коллекции образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae, собранных на территории РФ, выявить основные детерминанты устойчивости к Р-лактамным препаратам.

2. Определить характерные и доминирующие генотипы N. gonorrhoeae в России и в мире, провести их сравнительный филогенетический анализ.

3. Провести сравнительный полногеномный анализ преобладающих генотипов N. gonorrhoeae в России и других странах.

4. Разработать метод идентификации генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к Р-лактамным препаратам на основе олигонуклеотидного гидрогелевого биочипа. С использованием созданного метода получить генетические профили детерминант устойчивости.

5. Разработать математическую модель предсказания устойчивости N. gonorrhoeae к цефтриаксону и пенициллину, используя данные, полученные при анализе коллекции, а также характеристики изолятов со всего мира.

6. Создать генно-инженерные клеточные модели N. gonorrhoeae, экспрессирующие Р-лактамазы, в том числе расширенного спектра действия, для оценки устойчивости патогена к препаратам Р-лактамного ряда и жизнеспособности.

Научная новизна и практическая значимость

Выявлены доминирующие в России молекулярные типы N. gonorrhoeae, идентифицированы мутационные профили, ассоциированные с устойчивостью возбудителя к актуальным антимикробным препаратам. Филогенетический анализ изолятов показал генетическую отдалённость наиболее распространенных российских и европейских молекулярных типов, что указывает на локальный характер формирования и эволюции российской популяции возбудителя гонококковой инфекции.

Обнаружена функциональная зависимость между генотипами гонококка и аллелями гена penA - ключевой детерминанты устойчивости к цефалоспоринам, что важно для мониторинга выявления в России штаммов, устойчивых к цефтриаксону.

Впервые проведено полногеномное секвенирование изолятов N. gonorrhoeae, преобладающих в России генотипов. Произведено сравнение полученных данных с наиболее распространёнными генотипами N. gonorrhoeae в мире. Для доминирующих в мировой популяции генотипов определены характерные гены, потенциально отражающие различные стратегии выживаемости.

Разработан гидрогелевый биочип для идентификации генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к актуальным препаратам для лечения гонореи -цефалоспоринам III поколения. Впервые обнаружены изоляты РФ с мутациями, снижающими чувствительность к цефтриаксону, что подчеркивает необходимость постоянного мониторинга антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae с использованием созданного биочипа. На основании полученных данных, а также характеристик изолятов N. gonorrhoeae из баз данных со всего мира разработан и валидирован метод предсказания устойчивости патогена к цефтриаксону на основе регрессионной модели. Созданный метод стал основой для разработки набора реагентов «NG-ТЕСТ» для идентификации генетических детерминант устойчивости возбудителя гонококковой инфекции N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III поколения методом ПЦР с последующей гибридизацией на биологическом микрочипе.

Создана генно-инженерная клеточная модель, позволяющая проводить оценку устойчивости N. gonorrhoeae к Р-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины. Впервые показано, что штаммы N. gonorrhoeae, способные продуцировать Р-лактамазу расширенного спектра действия TEM-20, эффективно расщепляющую цефалоспорины, обладают сниженной жизнеспособностью, что, возможно, объясняет отсутствие таких изолятов в мировой популяции гонококковой инфекции.

Методология и методы исследования

В работе использован комплекс современных молекулярно-биологических, микробиологических и статистических подходов. Ключевой инструмент для идентификации генетических детерминант лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III поколения на основе гидрогелевого биочипа был разработан непосредственно автором работы. Оценка вклада генетических детерминант лекарственной устойчивости в уровень фенотипической чувствительности изолятов N. gonorrhoeae проведена на выборках значительного объёма образцов, что позволило получить статистически значимые результаты.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный метод идентификации генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к Р-лактамным препаратам на основе олигонуклеотидного гидрогелевого биочипа позволяет выявлять мутации в генах ponA, porB, mtrR и penA, в том числе, с учётом мозаичной структуры гена penA.

2. Созданная регрессионная модель на основе анализа полиморфизмов в генах устойчивости к Р-лактамным препаратам позволяет прогнозировать МПК с точностью до одного двукратного разведения.

3. Исследованная коллекция, состоящая из 951 образца ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae. Выявлены характерные для изолятов N. gonorrhoeae РФ геногруппы и установлено соответствие с аллелями penA.

4. Проведённый полногеномный анализ наиболее часто встречающихся молекулярных генотипов в России и мире позволил выявить характерные гены, среди которых оказались детерминанта устойчивости к Р-лактамам - penA, и гены из системы секреции ДНК IV типа. Для глобально распространённых молекулярных типов выявлена ассоциация между снижением чувствительности изолятов N. gonorrhoeae к АМП и отсутствием нарушений в генах гонококкового острова, значимых для функционирования системы секреции ДНК IV типа.

5. Клеточная модель, в которой экспериментально показано, что природному штамму N. gonorrhoeae достаточно одной аминокислотной замены Gly238Ser в плазмидном гене Р-лактамазы, чтобы этот фермент приобрел способность гидролизовать цефалоспорины, сохраняя при этом способность к гидролизу пенициллинов. Генно-инженерный штамм N. gonorrhoeae, содержащий плазмиду с вариантом гена blaTEM, экспрессирующим Р-лактамазу расширенного спектра действия TEM-20, способную гидролизовать цефалоспорины разных поколений, обладал сниженной жизнеспособностью.

Степень достоверности результатов и апробация работы

Выносимые на защиту положения и выводы подкреплены фактическим материалом и отражают основные достижения соискателя по теме работы. Достоверность результатов определяется достаточным объёмом выборки анализируемых данных и их адекватной статистической обработкой.

Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых «Геномика, метагеномика и молекулярная биологи микроорганизмов» (Москва, 2022); VIII Пущинской конференции "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (Москва, 2022); XXI и XXII всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2021-22); III всероссийской конференции "Высокопроизводительное секвенирование в геномике" (Новосибирск, 2022); XXXIII зимней международной молодёжной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (Москва, 2021); 3-ем Российском микробиологическом конгрессе (Псков, 2021); 9-ой всероссийской научно-практической конференции по геномному секвенированию и редактированию (Москва, 2021); XXXIII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2021).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 10 статей в журналах, входящих в перечень ВАК РФ (9 - в зарубежных журналах, 1 - в отечественных журналах), 8 тезисов конференций, получено 2 патента РФ на изобретения.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 203 источников. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 42 рисунка и 17 таблиц.

1. Обзор литературы

1.1 Гонококковая инфекция и патогенез N. gonorrhoeae

Гонококковая инфекция, вызываемая облигатным патогеном N. gonorrhoeae, передается половым путем и характеризуется гнойным воспалением слизистой оболочки мочеполовых путей (гонорея), конъюнктивы глаз (бленнорея) или других органов. В процессе гонококковой инфекции поражается слизистая оболочка нижних отделов половых путей, что проявляется в виде уретрита у мужчин и цервицита у женщин (Martin et al., 2003). До 50 % случаев у женщин остаются бессимптомными, что приводит к невыявленной и невылеченной инфекции, которая, в свою очередь, может позволить микроорганизму подняться в верхние отделы половых путей и привести к воспалительным заболеваниям органов малого таза, повышающим риск возникновения внематочной беременности и бесплодия (Chisholm et al., 2013).

Еще одним путём передачи гонококковой инфекции является инфицирование новорожденного от матери во время родов. Гонококковый конъюнктивит, вызванный N. gonorrhoeae, требует быстрого и эффективного лечения для предотвращения рубцевания или перфорации роговицы, приводящих к слепоте (Martin et al., 2003). Также было показано, что на фоне гонококковой инфекции увеличивается риск передачи и заражения ВИЧ инфекцией (Fleming et al., 1999; Wasserheit, 1999), что является острой проблемой общественного здравоохранения.

Основным ареалом обитания N. gonorrhoeae является слизистая оболочка нижних отделов половых путей. Однако почти любая слизистая человека может являться потенциальной экологической нишей для развития инфекции. К факторам патогенности гонореи относятся (Рис.1): (1)-пили (фимбрии); (2)-липоолигосахариды (ЛОС); (3)-поверхностные белки наружной мембраны; (4)-трансфериновые рецепторы TbrA и TbrB; (5)-IgA-протеаза; а также фазовые вариации-(6).

Рис.1 Схематичное изображение клетки N. gonorrhoeae и факторов патогенности

Процесс взаимодействия гонококков с уротелием начинается сразу после передачи инфекции от донора к реципиенту. Попав на слизистую оболочку, гонококки закрепляются на поверхности эпителиальных клеток за счет микроворсинок (фимбрий/пилей), и начинают колонизацию цилиндрического эпителия уретры или шейки матки. Пили обеспечивают адгезию гонококка к уротелию и состоят из белков пилинов (Green et al., 2019). У N. gonorrhoeae обнаружено 23 белка, ассоциированных с пилями, которые кодируются генами pilE, pilQ, и др. Особенно выделяют ген pilC, который может менять свою последовательность в ходе гомологичной рекомбинации ДНК, что приводит к изменению антигенного состава фимбрий. Связываясь с мембранным кофакторным белком CD46 с помощью пилей, гонококки способны индуцировать иммуносупрессорный фенотип T-клеток, тем самым подавляя иммунный ответ организма хозяина (Persson et al., 2010; Soderholm et al., 2011). Вариабельность строения пилей также важна, так как она способствует выживаемости гонококков на эпителиальных клетках при смене хозяина и воздействии новых антител (Morand et al., 2004).

Под действием липоолигосахаридов (ЛОС) происходит синтез цитокинов, вызывающих развитие воспалительной реакции. ЛОС гонококков обладают свойствами эндотоксина и отличаются от липоолигосахаридов других грамотрицательных бактерий тем, что имеют разветвленное ядро и не имеют боковой цепи (О-антигена) (Zhang et al., 2016). Липоолигосахариды способны изменять антигенный состав, что позволяет гонококкам «уклоняться» от воздействия иммунной системы человека. Также в результате продукции медиаторов воспаления - цитокинов, происходит гибель и слущивание эпителиальных клеток, нарушается процесс очищения слизистых оболочек (Ngampasutadol et al., 2008; Yamasaki et al., 2010).

После подавления защитных факторов иммунной системы человека и начала воспалительной реакции возбудитель с помощью поверхностных белков наружной мембраны проникает путем эндоцитоза внутрь эпителиальной клетки. Эндоцитоз осуществляется при помощи поверхностного белка наружной мембраны I класса (Рог-белок), который является порином и образует каналы, пронизывающие наружную мембрану гонококков (Welsch et al., 2008). Показано, что Рог-белок способен отрываться от наружной мембраны гонококков и встраиваться в мембрану эпителиальных клеток человека, формируя в ней каналы необходимые для дальнейшей инвазии клеток (Jiang et al., 2011).

Кроме того, инвазии возбудителя внутрь эпителиальных клеток способствует поверхностный белок II класса (Ора-белок, белок мутности, инвазин). Инициация инвазии происходит после специфичного связывания Opa-белка с карциноэмбриональной антигеноподобной клеточной адгезионной молекулой (CEACAM). Так называемое Opa-CEACAM взаимодействие является необходимым условием проникновения патогена в эпителиальную клетку (Alcott et al., 2022; Stein et al., 2015). В ходе инвазии и размножения трансфериновые рецепторы TbrA и TbrB взаимодействуют с трансферином человека и извлекают из него железо, необходимое для дальнейшего роста бактерий. Поверхностный белок III класса (Rmp-белок) осуществляет защиту гонококка от антител класса IgM (Wang et al., 2016). Посредством IgA-протеазы и поверхностных белков возбудитель подавляет защитные факторы организма путём расщепления секреторного иммуноглобулина и инактивации местных антител слизистых оболочек (Hill et al., 2016).

Механизм инвазии гонококков в эпителиальные клетки уротелия у женщин и мужчин отличается благодаря поверхностному рибосомному белку L12 у гонококков. Этот белок специфически связывается с рецептором лутропина/хориогонадотропина (LHR) у женщин, имитируя человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ) (Spence et al., 2002). Взаимодействие рибосомного белка L12 c рецептором LHR способствует более быстрой инвазии и развитию восходящей инфекции. Использование механизма трансцитоза гормона

14

ХГЧ для прохождения через поверхность слизистой оболочки маточной трубы является одной из причин быстрой генерализации инфекции и восходящей воспалительной реакции у женщин (Spence et al., 2000).

Повторные гонококковые инфекции могут возникать у одних и тех же пациентов из-за недостаточного гуморального иммунного ответа на гонококковую инфекцию (Gulati et al., 2019; Liu et al., 2014). Способность микроорганизма уходить от иммунной системы за счет фазовых вариаций поверхностных антигенов и точечных генетических мутаций создает дополнительные трудности для разработки вакцин. При отсутствии вакцины и препаратов фаговой терапии антибиотики являются единственным и чрезвычайно важным инструментом в лечении гонококковой инфекции не только для предотвращения последствий, но и для прерывания пути передачи инфекции (Golparian et al., 2021).

1.2 Механизмы лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к р-лактамным

антибиотикам

Появление лекарственно-устойчивых изолятов N. gonorrhoeae, является проблемой мирового масштаба. Селективное давление антимикробных препаратов, применяемых в клинической практике, зачастую неконтролируемо приводит к появлению гонококков, обладающих резистентностью (Golparian et al., 2021). В отдельных случаях встречаются штаммы, способные одновременно формировать устойчивость к большинству применяемых против них препаратов (мультирезистентность) (Unemo et al., 2014). Рост уровня устойчивых форм гонореи в мире повышается с каждым годом, уже известны случаи формирования устойчивости N. gonorrhoeae ко всем применяемым препаратам (суперустойчивость) (Fedarovich et al., 2014; Unemo et al., 2012). Развитие лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам, использующимся для терапии инфекции, в большинстве случаев ассоциировано с нуклеотидными заменами, заимствованием плазмид, рекомбинацией генов, или частей генов, приобретенных в результате селективного отбора (Unemo et al., 2014).

1.2.1 Пенициллины

Пенициллины - антимикробные препараты, относящиеся к классу Р-лактамных антибиотиков. Природным продуцентом пенициллинов являются грибы рода Penicillium. Главным компонентом всех пенициллинов служит 6-АПК (6-аминопенициллановая кислота), состоящая из Р-лактама и тиазолидинового кольца. Все пенициллины различаются лишь по строению радикала (Рис. 2). Как и все Р-лактамные антибиотики, пенициллины являются ингибиторами синтеза клеточной стенки, блокирующими транспептидазную активность пенициллинсвязывающих белков.

Рис.2 Общая структурная формула пенициллинов

1.2.1.1 Устойчивость к пенициллину, ассоциированная с хромосомными мутациями

Пенициллин был введен для терапии гонококковой инфекции в 1943 году (Fedarovich et al., 2012; Unemo et al., 2012), однако через несколько лет были обнаружены изоляты со сниженной чувствительность к новому антибиотику (Lewis, 2010). Устойчивость гонококка к пенициллину, ассоциированная с хромосомными мутациями, накапливалась постепенно, при этом пенициллин применялся для терапии гонококковой инфекции по схеме монотерапии. Однако разовое введение АМП может приводить к неполной элиминации патогена в организме человека, а также к селекции наиболее устойчивых штаммов, что приводит к снижению эффективности терапии. Через несколько лет после начала монотерапии пенициллином начали появляться изоляты с пограничной устойчивостью, что привело к необходимости увеличения терапевтической дозы (Thayer et al., 1956). А спустя еще несколько лет после начала терапии гонореи пенициллином уже были обнаружены первые резистентные изоляты.

Сегодня в мире обнаруживается большое количество штаммов со сниженной чувствительностью к пенициллину, что не позволяет вернуться к терапии гонококковой инфекции данным антимикробным препаратом. Как и у большинства патогенных грамотрицательных бактерий, у N. gonorrhoeae существует несколько причин формирования лекарственной устойчивости к пенициллинам, ассоциированных с хромосомными мутациями.

Модификация лекарственных мишеней, приводящая к снижению аффинности связывания с антибиотиками. Патогенные бактерии способны уменьшать активность АМП посредством структурных модификаций собственных мишеней, тем самым снижая аффинность связывания с антибиотиками. Мишенью действия пенициллина являются пенициллинсвязывающие белки (ПСБ) в клетке бактерии. ПСБ участвуют в стадии синтеза пептидогликана, который является основным компонентом клеточных стенок бактерий. Поскольку синтез клеточной стенки является ключевым фактором деления и роста бактериальных клеток, изменение структуры ПСБ приводит к нарушению формы и дефектам клеточных стенок, и, в конечном итоге, ведет к гибели клетки

Самой распространённой мутацией в гене penA, связанной с резистентностью к пенициллинам, является инсерция целого кодона (insAsp345), который кодирует еще одну аспарагиновую кислоту в 345-346 положении ПСБ-2. Эта и/или другие сопутствующие мутации на С-концевом участке белка способны увеличить МПК пенициллина в 6-8 раз (Kubanov et al., 2017; Zhao et al., 2018). Также мутация (Leu421Pro) в гене ponA, который кодирует ПСБ-1, приводят к более низкой скорости ацилирования пенициллином (снижение в 2-4 раза) и соответственно к снижению чувствительности N. gonorrhoeae (Ropp et al., 2002).

Позднее у изолятов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к пенициллину были обнаружены мотивы транспептидазного домена ПСБ из других близкородственных видов Neisseria (см. 1.2.2). Мозаичный ген penA является ключевой детерминантой устойчивости N. gonorrhoeae к Р-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины (Marangoni et al., 2020; Vincent et al., 2018).

Вывод АМП из клетки посредством эффлюксных насосов. Активным механизмом, обеспечивающим защиту от АМП в патогенных бактериях, является вывод препаратов посредством эффлюксных систем, состоящих из комплекса мембранных белков. Большинство из них важны для физиологии или метаболизма бактерий, например, для транспорта питательных веществ, токсинов, отходов или сигнальных молекул через клеточную стенку. Таким образом, функции формирования резистентности к АМП для многих эффлюксных насосов могут быть вторичными и обусловлены неспецифической транспортировкой.

У N. gonorrhoeae большинство помп эффлюкса состоят из трёх полипептидных цепей - компонентов внешней и внутренней мембраны, а также периплазматического белка MFP (membrane fusion protein). В собранном виде трехкомпонентные системы эффлюкса пересекают внутреннюю и внешнюю мембраны и периплазматическое пространство между ними. Процесс формирования лекарственной устойчивости обусловлен нарушением в работе эффлюкс-насосов и связан со сверхэкспрессией кодирующих их генов или изменением конформации белков помпы, ассоциированных с мутациями в хромосомных генах.

Бактерия N. gonorrhoeae экспрессирует помпы MtrCDE, кодируемые опероном mtrC-mtrD-mtrE. Устойчивость к антимикробным препаратам формируется за счет полиморфизмов в гене mtrR, репрессоре транскрипции MtrCDE, а также его промоторной области. Замены Ala39Thr, Arg44His, Gly45Asp, Leu47Pro а также делеция «delA» в положении -35 в промоторной области и/или инсерция нуклеотидов «insTT»/«instT» в положении -10 ведут к увеличению экспрессии всей помпы эффлюкса MtrCDE (Endimiani et al., 2014; Ilina et al., 2008).

Стоит отметить, что большинство эффлюксных насосов способны транспортировать субстраты разных классов антимикробных препаратов. По этой причине штаммы с мутациями в хромосомных генах или их промоторах, ассоциированные с нарушением в работе эффлюкс-насосов, зачастую характеризуются как мультирезистентные.

Нарушение проницаемости наружной мембраны. Еще одной причиной сниженной чувствительности гонококка к пенициллинам является нарушение проницаемости наружной мембраны. Изменение конформации поверхностного белка PorB, который кодируется геном porB, вызванное нуклеотидными заменами в этом гене, приводит к снижению притока противомикробных препаратов в периплазму.

Мутации Gly120Asp, Gly120Lys, Ala121Asp и Ala121Asn в пориновом белке Por, в совокупности с мутациями в mtrR, вызывают изменение проницаемости наружной мембраны клетки, что приводит к снижению чувствительности к целому ряду антибиотиков: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину и цефалоспоринам расширенного спектра (Olesky et al., 2006; Zhao et al., 2009).

Клеточные модели N. gonorrhoeae построенные in vivo показали, что патогену достаточно мутаций в гене PilQ (penC) для приобретения резистентности к пенициллинам. Было показано, что мутация Glu666Lys у лабораторных изолятов уменьшает приток пенициллина в клетку, что, в совокупности с уже существующими детерминантами, ведет к появлению резистентных к пенициллину штаммов (Criss et al., 2005). Однако, позднее, было показано, что при наличии этой мутации нарушается формирование пилей, и, как следствие, прикрепление бактерий к эпителиальным тканям, что делает ее присутствие в клинических изолятах маловероятным (Whiley et al., 2010).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кандинов Илья Денисович, 2023 год

Список литературы

1. Кубанов А.А., Соломка В.С., Рахматулина М.Р., Дерябин Д.Г., Устойчивость Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам и средства терапии гонококковой инфекции: вчера, сегодня, завтра Вестник дерматологии и венерологии 2022: p. 15-23.

2. Лейнсоо, А.Т., Шайскольский Б.Л., Дементьева Е.И., Грядунов Д.А., Кубанов А.А., Честков А.В., Образцова О.А., Шпилевая М.В., Дерябин Д.Г., Олигонуклеотидный микрочип для идентификации возбудителей инфекций репродуктивного тракта с одновременным анализом детерминант резистентности к антимикробным препаратам. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2017, Том 164, № 7, 2017.

3. Министерство здравоохранения Российской Федерации, приказ №415 от 20.08.2003.

4. Abrams A.J., Kirkcaldy R.D., Pettus K., Fox J.L., Kubin G., and Trees D.L., A Case of Decreased Susceptibility to Ceftriaxone in Neisseria gonorrhoeae in the Absence of a Mosaic Penicillin-Binding Protein 2 (penA) Allele. Sex Transm Dis, 2017. 44(8): p. 492-494.

5. Alcott A.M., Werner L.M., Baiocco C.M., Belcher Dufrisne M., Columbus L., and Criss A.K., Variable Expression of Opa Proteins by Neisseria gonorrhoeae Influences Bacterial Association and Phagocytic Killing by Human Neutrophils. J Bacteriol, 2022: p. e0003522.

6. Alexander S. and Ison C., Evaluation of commercial kits for the identification of Neisseria gonorrhoeae. J Med Microbiol, 2005. 54(Pt 9): p. 827-831.

7. Alfsnes K., Eldholm V., Olsen A.O., Brynildsrud O.B., Bohlin J., Steinbakk M., and Caugant D.A., Genomic epidemiology and population structure of Neisseria gonorrhoeae in Norway, 2016-2017. Microb Genom, 2020. 6(4).

8. Arenas J., Caton L., van den Hoeven T., de Maat V., Cruz Herrero J., and Tommassen J., The outer-membrane protein MafA of Neisseria meningitidis constitutes a novel protein secretion pathway specific for the fratricide protein MafB. Virulence, 2020. 11(1): p. 1701-1715.

9. Arlet G., Goussard S., Courvalin P., and Philippon A., Sequences of the genes for the TEM-20, TEM-21, TEM-22, and TEM-29 extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 1999. 43(4): p. 969-71.

10. Ashford W.A., Golash R.G., and Hemming V.G., Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae. Lancet, 1976. 2(7987): p. 657-8.

11. Bala M., Kakran M., Singh V., Sood S., Ramesh V., and Members of W.H.O.G.S.N., Monitoring antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in selected countries of the WHO South-East Asia Region between 2009 and 2012: a retrospective analysis. Sex Transm Infect, 2013. 89 Suppl 4: p. iv28-35.

12. Bartling C.M. and Raetz C.R., Crystal structure and acyl chain selectivity of Escherichia coli LpxD, the N-acyltransferase of lipid A biosynthesis. Biochemistry, 2009. 48(36): p. 8672-83.

13. Bazzo M L., Golfetto L., Gaspar P.C., Pires A.F., Ramos M.C., Franchini M., Ferreira W.A., Unemo M., Benzaken A.S., and Brazilian G.N., First nationwide antimicrobial susceptibility surveillance for Neisseria gonorrhoeae in Brazil, 2015-16. J Antimicrob Chemother, 2018. 73(7): p. 1854-1861.

14. Bignell C., Fitzgerald M., Guideline Development G., British Association for Sexual H., and Hiv U.K., UK national guideline for the management of gonorrhoea in adults, 2011. Int J STD AIDS, 2011. 22(10): p. 541-7.

15. Bradford P.A., Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev, 2001. 14(4): p. 933-51, table of contents.

16. Bradford P.A., Miller A.A., O'Donnell J., and Mueller J.P., Zoliflodacin: An Oral Spiropyrimidinetrione Antibiotic for the Treatment of Neisseria gonorrheae, Including Multi-Drug-Resistant Isolates. ACS Infect Dis, 2020. 6(6): p. 1332-1345.

17. Bush K. and Jacoby G.A., Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(3): p. 969-76.

18. Camara J., Serra J., Ayats J., Bastida T., Carnicer-Pont D., Andreu A., and Ardanuy C., Molecular characterization of two high-level ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Catalonia, Spain. J Antimicrob Chemother, 2012. 67(8): p. 1858-60.

19. CDC, National Overview of STDs, 2019.

20. CDC, Update to CDC's Treatment Guidelines for Gonococcal Infection, 2020. p. 1911-1916.

21. Centers for Disease control prevention. Workowski K.A. and Berman S.M., Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR Recomm Rep, 2006. 55(RR-11): p. 1-94.

22. Chen M.Y., McNulty A., Avery A., Whiley D., Tabrizi S.N., Hardy D., Das A.F., Nenninger A., Fairley C.K., Hocking J.S., Bradshaw C.S., Donovan B., Howden B.P., Oldach D., and Solitaire U.T., Solithromycin versus ceftriaxone plus azithromycin for the treatment of uncomplicated genital gonorrhoea (SOLITAIRE-U): a randomised phase 3 non-inferiority trial. Lancet Infect Dis, 2019. 19(8): p. 833-842.

23. Chen S.C., Hu L.H., Zhu X.Y., and Yin Y.P., Gonococcal urethritis caused by a multidrug resistant Neisseria gonorrhoeae strain with high-level resistance to spectinomycin in China. Emerg Microbes Infect, 2020. 9(1): p. 517-519.

24. Chisholm S.A. and Ison C., Emergence of high-level azithromycin resistance in Neisseria gonorrhoeae in England and Wales. Euro Surveill, 2008. 13(15).

25. Chisholm S.A., Dave J., and Ison C.A., High-level azithromycin resistance occurs in Neisseria gonorrhoeae as a result of a single point mutation in the 23S rRNA genes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010. 54(9): p. 3812-3816.

26. Chisholm S.A., Unemo M., Quaye N., Johansson E., Cole M.J., Ison C.A., and Van de Laar M.J., Molecular epidemiological typing within the European Gonococcal Antimicrobial Resistance Surveillance Programme reveals predominance of a multidrug-resistant clone. Euro Surveill, 2013. 18(3).

27. Chisholm S.A., Wilson J., Alexander S., Tripodo F., Al-Shahib A., Schaefer U., Lythgow K., and Fifer H., An outbreak of high-level azithromycin resistant Neisseria gonorrhoeae in England. Sex Transm Infect, 2016. 92(5): p. 365-7.

28. Cole M.J., Spiteri G., Jacobsson S., Pitt R., Grigorjev V., Unemo M., and Euro G.N., Is the tide turning again for cephalosporin resistance in Neisseria gonorrhoeae in Europe? Results from the 2013 European surveillance. BMC Infect Dis, 2015. 15: p. 321.

29. Cole M.J., Quinten C., Jacobsson S., Day M., Amato-Gauci A.J., Woodford N., Spiteri G., Unemo M., and Euro G.n., The European gonococcal antimicrobial surveillance programme (Euro-GASP) appropriately reflects the antimicrobial resistance situation for Neisseria gonorrhoeae in the European Union/European Economic Area. BMC Infect Dis, 2019. 19(1): p. 1040.

30. Criss A.K., Kline K.A., and Seifert H.S., The frequency and rate of pilin antigenic variation in Neisseria gonorrhoeae. Mol Microbiol, 2005. 58(2): p. 510-9.

31. Day M.J., Spiteri G., Jacobsson S., Woodford N., Amato-Gauci A.J., Cole M.J., Unemo M., and Euro G.n., Stably high azithromycin resistance and decreasing ceftriaxone susceptibility in Neisseria gonorrhoeae in 25 European countries, 2016. BMC Infect Dis, 2018. 18(1): p. 609.

32. De Silva D., Peters J., Cole K., Cole M.J., Cresswell F., Dean G., Dave J., Thomas D.R., Foster K., Waldram A., Wilson D.J., Didelot X., Grad Y.H., Crook D.W., Peto T.E., Walker A.S., Paul J., and Eyre D.W., Whole-genome sequencing to determine transmission of Neisseria gonorrhoeae: an observational study. Lancet Infect Dis, 2016. 16(11): p. 1295-1303.

33. Demczuk W., Lynch T., Martin I., Van Domselaar G., Graham M., Bharat A., Allen V., Hoang L., Lefebvre B., Tyrrell G., Horsman G., Haldane D., Garceau R., Wylie J., Wong T., and Mulvey M.R., Whole-genome phylogenomic heterogeneity of Neisseria gonorrhoeae isolates with decreased cephalosporin susceptibility collected in Canada between 1989 and 2013. J Clin Microbiol, 2015. 53(1): p. 191-200.

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

Demczuk W., Martin I., Peterson S., Bharat A., Van Domselaar G., Graham M., Lefebvre B., Allen V., Hoang L., Tyrrell G., Horsman G., Wylie J., Haldane D., Archibald C., Wong T., Unemo M., and Mulvey M.R., Genomic Epidemiology and Molecular Resistance Mechanisms of Azithromycin-Resistant Neisseria gonorrhoeae in Canada from 1997 to 2014. J Clin Microbiol, 2016. 54(5): p. 1304-13.

Demczuk W., Sidhu S., Unemo M., Whiley D.M., Allen V.G., Dillon J.R., Cole M., Seah C., Trembizki E., Trees D.L., Kersh E.N., Abrams A.J., de Vries H.J.C., van Dam A.P., Medina I., Bharat A., Mulvey M.R., Van Domselaar G., and Martin I., Neisseria gonorrhoeae Sequence Typing for Antimicrobial Resistance, a Novel Antimicrobial Resistance Multilocus Typing Scheme for Tracking Global Dissemination of N. gonorrhoeae Strains. J Clin Microbiol, 2017. 55(5): p. 1454-1468.

Demczuk W., Martin I., Sawatzky P., Allen V., Lefebvre B., Hoang L., Naidu P., Minion J., VanCaeseele P., Haldane D., Eyre D.W., and Mulvey M.R., Equations To Predict Antimicrobial MICs in Neisseria gonorrhoeae Using Molecular Antimicrobial Resistance Determinants. Antimicrob Agents Chemother, 2020. 64(3).

Deng X., Allan-Blitz L.T., and Klausner J.D., Using the genetic characteristics of Neisseria gonorrhoeae strains with decreased susceptibility to cefixime to develop a molecular assay to predict cefixime susceptibility. Sex Health, 2019. 16(5): p. 488-499.

Dillon J.A., Trecker M.A., Thakur S.D., Gonococcal Antimicrobial Surveillance Program Network in Latin A., and Caribbean, Two decades of the gonococcal antimicrobial surveillance program in South America and the Caribbean: challenges and opportunities. Sex Transm Infect, 2013. 89 Suppl 4: p. iv36-41.

Dy R.L., Przybilski R., Semeijn K., Salmond G.P., and Fineran P.C., A widespread bacteriophage abortive infection system functions through a Type IV toxin-antitoxin mechanism. Nucleic Acids Res, 2014. 42(7): p. 4590-605.

ECDC, Molecular typing of Neisseria gonorrhoeae - a study of 2013 isolates. 2018. ECDC, Molecular typing of Neisseria gonorrhoeae - a study of 2013 isolates. European Centre for Disease Prevention and Control, 2018. Stockholm.

ECDC, Gonococcal antimicrobial susceptibility surveillance in Europe, 2020. (ISBN:978-92-9498-464-7)

Egli K., Roditscheff A., Fluckiger U., Risch M., Risch L., and Bodmer T., Molecular characterization of a ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae strain found in Switzerland: a case report. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2021. 20(1): p. 52.

Endimiani A., Guilarte Y., Tinguely R., Hirzberger L., Selvini S., Lupo A., Hauser C., and Furrer H., Characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Switzerland (19982012): emergence of multidrug-resistant clones less susceptible to cephalosporins. BMC Infectious Diseases, 2014. 14(1): p. 106.

Eyre D.W., De Silva D., Cole K., Peters J., Cole M.J., Grad Y.H., Demczuk W., Martin I., Mulvey M R., Crook D.W., Walker A.S., Peto T.E.A., and Paul J., WGS to predict antibiotic MICs for Neisseria gonorrhoeae. J Antimicrob Chemother, 2017. 72(7): p. 1937-1947. Fedarovich A., Djordjevic K.A., Swanson S.M., Peterson Y.K., Nicholas R.A., and Davies C., High-throughput screening for novel inhibitors of Neisseria gonorrhoeae penicillin-binding protein 2. PLoS One, 2012. 7(9): p. e44918.

Fedarovich A., Cook E., Tomberg J., Nicholas R.A., and Davies C., Structural effect of the Asp345a insertion in penicillin-binding protein 2 from penicillin-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae. Biochemistry, 2014. 53(48): p. 7596-603.

Fleming D.T. and Wasserheit J.N., From epidemiological synergy to public health policy and practice: the contribution of other sexually transmitted diseases to sexual transmission of HIV infection. Sex Transm Infect, 1999. 75(1): p. 3-17.

Fukui K. and Kuramitsu S., Structure and Function of the Small MutS-Related Domain. Mol Biol Int, 2011. 2011: p. 691735.

50. Gawthorne J.A., Beatson S.A., Srikhanta Y.N., Fox K.L., and Jennings M.P., Origin of the diversity in DNA recognition domains in phasevarion associated modA genes of pathogenic Neisseria and Haemophilus influenzae. PLoS One, 2012. 7(3): p. e32337.

51. George C.R.R., Enriquez R.P., Gatus B.J., Whiley D.M., Lo Y.R., Ishikawa N., Wi T., and Lahra M.M., Systematic review and survey of Neisseria gonorrhoeae ceftriaxone and azithromycin susceptibility data in the Asia Pacific, 2011 to 2016. PLoS One, 2019. 14(4): p. e0213312.

52. Gernert K.M., Seby S., Schmerer M.W., Thomas J.C.t., Pham C.D., Cyr S.S., Schlanger K., Weinstock H., Shafer W.M., Raphael B.H., Kersh E.N., and Antimicrobial-Resistant Neisseria gonorrhoeae Working Group, Azithromycin susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in the USA in 2017: a genomic analysis of surveillance data. Lancet Microbe, 2020. 1(4): p. e154-e164.

53. Gianecini R., Oviedo C., Guantay C., Piccoli L., Stafforini G., and Galarza P., Prevalence of bla TEM-220 gene in Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae strains carrying Toronto/Rio plasmid in Argentina, 2002 - 2011. BMC Infect Dis, 2015. 15: p. 571.

54. Golparian D., Johansson E., and Unemo M., Clinical Neisseria gonorrhoeae isolate with a N. meningitidis porA gene and no prolyliminopeptidase activity, Sweden, 2011: danger of false-negative genetic and culture diagnostic results. Euro Surveill, 2012. 17(9).

55. Golparian D., Rose L., Lynam A., Mohamed A., Bercot B., Ohnishi M., Crowley B., and Unemo M., Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae isolate, belonging to the internationally spreading Japanese FC428 clone, with ceftriaxone resistance and intermediate resistance to azithromycin, Ireland, August 2018. Euro Surveill, 2018. 23(47).

56. Golparian D. and Unemo M., Antimicrobial resistance prediction in Neisseria gonorrhoeae: Current status and future prospects. Expert Rev Mol Diagn, 2021.

57. Golparian D. and Unemo M., Antimicrobial resistance prediction in Neisseria gonorrhoeae: current status and future prospects. Expert Rev Mol Diagn, 2022. 22(1): p. 29-48.

58. Grad Y.H., Kirkcaldy R.D., Trees D., Dordel J., Harris S.R., Goldstein E., Weinstock H., Parkhill J., Hanage W.P., Bentley S., and Lipsitch M., Genomic epidemiology of Neisseria gonorrhoeae with reduced susceptibility to cefixime in the USA: a retrospective observational study. Lancet Infect Dis, 2014. 14(3): p. 220-6.

59. Grad Y.H., Harris S.R., Kirkcaldy R.D., Green A.G., Marks D.S., Bentley S.D., Trees D., and Lipsitch M., Genomic Epidemiology of Gonococcal Resistance to Extended-Spectrum Cephalosporins, Macrolides, and Fluoroquinolones in the United States, 2000-2013. J Infect Dis, 2016. 214(10): p. 1579-1587.

60. Green L.R., Dave N., Adewoye A.B., Lucidarme J., Clark S.A., Oldfield N.J., Turner D.P.J., Borrow R., and Bayliss C.D., Potentiation of Phase Variation in Multiple Outer-Membrane Proteins During Spread of the Hyperinvasive Neisseria meningitidis Serogroup W ST-11 Lineage. J Infect Dis, 2019. 220(7): p. 1109-1117.

61. Gryadunov D.A., Shaskolskiy B.L., Nasedkina T.V., Rubina A.Y., and Zasedatelev A.S., The EIMB Hydrogel Microarray Technology: Thirty Years Later. Acta Naturae, 2018. 10(4): p. 418.

62. Gubensek U., de Laat M., Foerster S., Boyd A., and van Dam A.P., Pharmacodynamics of Ceftriaxone, Ertapenem, Fosfomycin and Gentamicin in Neisseria gonorrhoeae. Antibiotics (Basel), 2022. 11(3).

63. Gulati S., Shaughnessy J., Ram S., and Rice P.A., Targeting Lipooligosaccharide (LOS) for a Gonococcal Vaccine. Front Immunol, 2019. 10: p. 321.

64. Harris S.R., Cole M.J., Spiteri G., Sanchez-Buso L., Golparian D., Jacobsson S., Goater R., Abudahab K., Yeats C.A., Bercot B., Borrego M.J., Crowley B., Stefanelli P., Tripodo F., Abad R., Aanensen D.M., Unemo M., and Euro G.s.g., Public health surveillance of multidrug-resistant clones of Neisseria gonorrhoeae in Europe: a genomic survey. Lancet Infect Dis, 2018. 18(7): p. 758-768.

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

Harrison OB., Clemence M., Dillard J.P., Tang C.M., Trees D., Grad Y.H., and Maiden M.C., Genomic analyses of Neisseria gonorrhoeae reveal an association of the gonococcal genetic island with antimicrobial resistance. J Infect, 2016. 73(6): p. 578-587. Harrison O.B., Cehovin A., Skett J., Jolley K.A., Massari P., Genco C.A., Tang C.M., and Maiden M.C.J., Neisseria gonorrhoeae Population Genomics: Use of the Gonococcal Core Genome to Improve Surveillance of Antimicrobial Resistance. J Infect Dis, 2020. 222(11): p. 1816-1825.

Hill S.A., Masters T.L., and Wachter J., Gonorrhea - an evolving disease of the new millennium. Microb Cell, 2016. 3(9): p. 371-389.

Hiyama Y., Takahashi S., Sato T., Shinagawa M., Fukushima Y., Nakajima C., Suzuki Y., Masumori N., and Yokota S.I., Evaluation of Susceptibilities to Carbapenems and Faropenem Against Cephalosporin-Resistant Neisseria gonorrhoeae Clinical Isolates with penA Mosaic Alleles. Microb Drug Resist, 2019. 25(3): p. 427-433.

Huang C.T., Niu J., Liao M.H., and Li S.Y., A duplex PCR method to identify mosaic penA gene and predict reduced susceptibility to oral cephalosporins in Neisseria gonorrhoeae. J Microbiol Methods, 2010. 83(2): p. 257-9.

Ilina E.N., Vereshchagin V.A., Borovskaya A.D., Malakhova M.V., Sidorenko S.V., Al-Khafaji N.C., Kubanova A.A., and Govorun V.M., Relation between genetic markers of drug resistance and susceptibility profile of clinical Neisseria gonorrhoeae strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008. 52(6): p. 2175-2182.

Ilina E.N., Malakhova M.V., Bodoev I.N., Oparina N.Y., Filimonova A.V., and Govorun V.M., Mutation in ribosomal protein S5 leads to spectinomycin resistance in Neisseria gonorrhoeae. Front Microbiol, 2013. 4: p. 186.

Jacobsson S., Golparian D., Cole M., Spiteri G., Martin I., Bergheim T., Borrego M.J., Crowley B., Crucitti T., Van Dam A.P., Hoffmann S., Jeverica S., Kohl P., Mlynarczyk-Bonikowska B., Pakarna G., Stary A., Stefanelli P., Pavlik P., Tzelepi E., Abad R., Harris S.R., and Unemo M., WGS analysis and molecular resistance mechanisms of azithromycin-resistant (MIC >2 mg/L) Neisseria gonorrhoeae isolates in Europe from 2009 to 2014. J Antimicrob Chemother, 2016. 71(11): p. 3109-3116.

Jamet A. and Nassif X., Characterization of the Maf family of polymorphic toxins in pathogenic Neisseria species. Microb Cell, 2015. 2(3): p. 88-90.

Jensen J.N., Disinfection model based on excess inactivation sites: implications for linear disinfection curves and the Chick-Watson dilution coefficient. Environ Sci Technol, 2010. 44(21): p. 8162-8.

Jiang J.H., Davies J.K., Lithgow T., Strugnell R.A., and Gabriel K., Targeting of Neisserial PorB to the mitochondrial outer membrane: an insight on the evolution of beta-barrel protein assembly machines. Mol Microbiol, 2011. 82(4): p. 976-87.

Jorgenson M.A., Chen Y., Yahashiri A., Popham D.L., and Weiss D.S., The bacterial septal

ring protein RlpA is a lytic transglycosylase that contributes to rod shape and daughter cell

separation in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol, 2014. 93(1): p. 113-28.

Joseph S.J., Thomas J.C., Schmerer M.W., Cartee J.C., St Cyr S., Schlanger K., Kersh E.N.,

Raphael B.H., Gernert K.M., and Antimicrobial Resistant Neisseria gonorrhoeae Working G.,

Global Emergence and Dissemination of Neisseria gonorrhoeae ST-9363 Isolates with

Reduced Susceptibility to Azithromycin. Genome Biol Evol, 2022. 14(1).

Kandinov I., Dementieva E., Kravtsov D., Chestkov A., Kubanov A., Solomka V., Deryabin

D., Gryadunov D., and Shaskolskiy B., Molecular Typing of Neisseria gonorrhoeae Clinical Isolates in Russia, 2018-2019: A Link Between penA Alleles and NG-MAST Types. Pathogens, 2020. 9(11).

Katz AR., Komeya A.Y., Soge O.O., Kiaha M.I., Lee M.V.C., Wasserman G.M., Maningas

E.V., Whelen A.C., Kirkcaldy R.D., Shapiro S.J., Bolan G.A., and Holmes K.K., Neisseria gonorrhoeae with high-level resistance to azithromycin: case report of the first isolate identified in the United States. Clinical Infectious Diseases, 2012. 54(6): p. 841-843.

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

Katz A.R., Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae, Canada, 2017. Emerg Infect Dis, 2018. 24(3).

Kivata M.W., Mbuchi M., Eyase F., Bulimo W.D., Kyanya C.K., Oundo V., Mbinda W.M., Sang W., Andagalu B., Soge O.O., McClelland R.S., and Distelhorst J., Plasmid mediated penicillin and tetracycline resistance among Neisseria gonorrhoeae isolates from Kenya. BMC Infect Dis, 2020. 20(1): p. 703.

Kohler PL., Chan Y.A., Hackett K.T., Turner N., Hamilton H.L., Cloud-Hansen K.A., and Dillard J.P., Mating pair formation homologue TraG is a variable membrane protein essential for contact-independent type IV secretion of chromosomal DNA by Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol, 2013. 195(8): p. 1666-79.

Kubanov A., Vorobyev D., Chestkov A., Leinsoo A., Shaskolskiy B., Dementieva E., Solomka V., Plakhova X., Gryadunov D., and Deryabin D., Molecular epidemiology of drug-resistant Neisseria gonorrhoeae in Russia (Current Status, 2015). BMC Infect Dis, 2016. 16: p. 389.

Kubanov A., Gallyamova Y., and Kravchenko A., Clinical picture, diagnosis and treatment of rosacea, complicated by Demodex mites. Dermatol Reports, 2019. 11(1): p. 7675. Kubanov A., Solomka V., Plakhova X., Chestkov A., Petrova N., Shaskolskiy B., Dementieva E., Leinsoo A., Gryadunov D., and Deryabin D., Summary and Trends of the Russian Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme, 2005 to 2016. J Clin Microbiol, 2019. 57(6).

Kubanov A.A., Leinsoo A.T., Chestkov A.V., Dementieva E.I., Shaskolskiy B.L., Solomka V.S., Gryadunov D.A., and Deryabin D.G., [Drug resistance mutations and susceptibility phenotypes of Neisseria gonorrhoeae isolates in Russia]. Mol Biol (Mosk), 2017. 51(3): p. 431-441.

Kubanova A., Kubanov A., Frigo N., Solomka V., Semina V., Vorobyev D., Khairullin R., and Unemo M., Russian gonococcal antimicrobial susceptibility programme (RU-GASP)--resistance in Neisseria gonorrhoeae during 2009-2012 and NG-MAST genotypes in 2011 and 2012. BMC Infect Dis, 2014. 14: p. 342.

Kueakulpattana N., Wannigama D.L., Luk-In S., Hongsing P., Hurst C., Badavath V.N., Jenjaroenpun P., Wongsurawat T., Teeratakulpisan N., Kerr S.J., Abe S., Phattharapornjaroen P., Shein A.M.S., Saethang T., Chantaravisoot N., Amarasiri M., Higgins P.G., and Chatsuwan T., Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae infection in heterosexual men with reduced susceptibility to ceftriaxone, first report in Thailand. Sci Rep, 2021. 11(1): p. 21659. Kulkarni S., Bala M., and Risbud A., Performance of tests for identification of Neisseria gonorrhoeae. Indian J Med Res, 2015. 141(6): p. 833-5.

Kwong J.C., Goncalves da Silva A., Dyet K., Williamson D.A., Stinear T.P., Howden B.P., and Seemann T., NGMASTER:in silico multi-antigen sequence typing for Neisseria gonorrhoeae. Microb Genom, 2016. 2(8): p. e000076.

Le W., Su X., Lou X., Li X., Gong X., Wang B., Genco C.A., Mueller J.P., and Rice P.A., Susceptibility Trends of Zoliflodacin against Multidrug-Resistant Neisseria gonorrhoeae Clinical Isolates in Nanjing, China, 2014 to 2018. Antimicrob Agents Chemother, 2021. 65(3).

Lee R.S., Seemann T., Heffernan H., Kwong J.C., Goncalves da Silva A., Carter G.P., Woodhouse R., Dyet K.H., Bulach D.M., Stinear T.P., Howden B.P., and Williamson D.A., Genomic epidemiology and antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in New Zealand. J Antimicrob Chemother, 2018. 73(2): p. 353-364.

Lewis D.A., The Gonococcus fights back: is this time a knock out? Sex Transm Infect, 2010. 86(6): p. 415-21.

Lewis D.A., New treatment options for Neisseria gonorrhoeae in the era of emerging antimicrobial resistance. Sex Health, 2019. 16(5): p. 449-456.

Li et al. S.A., Wang L., Microarray Technology. Methods and Applications., 2016. (ISBN:9781493931361)

96. Li M.S., Langford P.R., and Kroll J.S., Inactivation of NMB0419, Encoding a Sel1-Like Repeat (SLR) Protein, in Neisseria meningitidis Is Associated with Differential Expression of Genes Belonging to the Fur Regulon and Reduced Intraepithelial Replication. Infect Immun, 2017. 85(5).

97. Li X., Le W., Lou X., Wang B., Genco C.A., Rice P.A., and Su X., In Vitro Efficacy of Gentamicin Alone and in Combination with Ceftriaxone, Ertapenem, and Azithromycin against Multidrug-Resistant Neisseria gonorrhoeae. Microbiol Spectr, 2021. 9(2): p. e0018121.

98. Lindberg R., Fredlund H., Nicholas R., and Unemo M., Neisseria gonorrhoeae isolates with reduced susceptibility to cefixime and ceftriaxone: association with genetic polymorphisms in penA, mtrR, porB1b, and ponA. Antimicrob Agents Chemother, 2007. 51(6): p. 2117-22.

99. Liu Y., Liu W., and Russell M.W., Suppression of host adaptive immune responses by Neisseria gonorrhoeae: role of interleukin 10 and type 1 regulatory T cells. Mucosal Immunol, 2014. 7(1): p. 165-76.

100. Lysov Y., Barsky V., Urasov D., Urasov R., Cherepanov A., Mamaev D., Yegorov Y., Chudinov A., Surzhikov S., Rubina A., Smoldovskaya O., and Zasedatelev A., Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomed Opt Express, 2017. 8(11): p. 4798-4810.

101. Mahajan N., Sood S., Das B.K., Kapil A., Sreenivas V., Kar H.K., and Sharma V.K., Molecular characterization of decreased susceptibility to ceftriaxone and genotyping of Neisseria gonorrheae isolates in New Delhi, India. Diagn Microbiol Infect Dis, 2021. 101(1): p.115423.

102. Marangoni A., Marziali G., Salvo M., D'Antuono A., Gaspari V., Foschi C., and Re M.C., Mosaic structure of the penA gene in the oropharynx of men who have sex with men negative for gonorrhoea. Int J STD AIDS, 2020. 31(3): p. 230-235.

103. Martin I.M. and Ison C.A., Detection of mixed infection of Neisseria gonorrhoeae. Sex Transm Infect, 2003. 79(1): p. 56-8.

104. Mlynarczyk-Bonikowska B., Kujawa M., Mynarczyk G., Malejczyk M., and Majewski S., Dominating types of penicillinase-plasmids in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in 20102012 in Warsaw. Med Dosw Mikrobiol, 2016. 68(1): p. 34-38.

105. Mlynarczyk-Bonikowska B., Malejczyk M., Majewski S., and Unemo M., Antibiotic resistance and NG-MAST sequence types of Neisseria gonorrhoeae isolates in Poland compared to the world. Postepy Dermatol Alergol, 2018. 35(6): p. 346-551.

106. Morand P.C., Bille E., Morelle S., Eugene E., Beretti J.L., Wolfgang M., Meyer T.F., Koomey M., and Nassif X., Type IV pilus retraction in pathogenic Neisseria is regulated by the PilC proteins. EMBO J, 2004. 23(9): p. 2009-17.

107. Mortimer T.D., Pathela P., Crawley A., Rakeman J.L., Lin Y., Harris S.R., Blank S., Schillinger J.A., and Grad Y.H., The Distribution and Spread of Susceptible and Resistant Neisseria gonorrhoeae Across Demographic Groups in a Major Metropolitan Center. Clin Infect Dis, 2021. 73(9): p. e3146-e3155.

108. Motulsky H.J. and Ransnas L.A., Fitting curves to data using nonlinear regression: a practical and nonmathematical review. FASEB J, 1987. 1(5): p. 365-74.

109. Muhammad I., Golparian D., Dillon J.A., Johansson A., Ohnishi M., Sethi S., Chen S.C., Nakayama S., Sundqvist M., Bala M., and Unemo M., Characterisation of blaTEM genes and types of beta-lactamase plasmids in Neisseria gonorrhoeae - the prevalent and conserved blaTEM-135 has not recently evolved and existed in the Toronto plasmid from the origin. BMC Infect Dis, 2014. 14: p. 454.

110. Muller E.E., Fayemiwo S.A., and Lewis D.A., Characterization of a novel beta-lactamase-producing plasmid in Neisseria gonorrhoeae: sequence analysis and molecular typing of host gonococci. J Antimicrob Chemother, 2011. 66(7): p. 1514-7.

111. Nakayama S., Tribuddharat C., Prombhul S., Shimuta K., Srifuengfung S., Unemo M., and Ohnishi M., Molecular analyses of TEM genes and their corresponding penicillinase-

producing Neisseria gonorrhoeae isolates in Bangkok, Thailand. Antimicrob Agents Chemother, 2012. 56(2): p. 916-20.

112. Ng L.-K., Martin I., Liu G., and Bryden L., Mutation in 23s rRNA associated with macrolide resistance in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002. 46(9): p. 3020-3025.

113. Ng L.K. and Martin I.E., The laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae. Can J Infect Dis Med Microbiol, 2005. 16(1): p. 15-25.

114. Ngampasutadol J., Tran C., Gulati S., Blom A.M., Jerse E.A., Ram S., and Rice P.A., Species-specificity of Neisseria gonorrhoeae infection: do human complement regulators contribute? Vaccine, 2008. 26 Suppl 8: p. I62-6.

115. Nguyen D., Gose S., Castro L., Chung K., Bernstein K., Samuel M., Bauer H., and Pandori M., Neisseria gonorrhoeae strain with reduced susceptibilities to extended-spectrum cephalosporins. Emerg Infect Dis, 2014. 20(7): p. 1211-3.

116. Nguyen M.K., Ornekian V., Kao L., Butch A.W., and Kurtz I., Defining the role of albumin infusion in cirrhosis-associated hyponatremia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014. 307(2): p. G229-32.

117. Ohnishi H., Tochio H., Kato Z., Kimura T., Hiroaki H., Kondo N., and Shirakawa M., 1H, 13C, and 15N resonance assignment of the TIR domain of human MyD88. Biomol NMR Assign, 2010. 4(2): p. 123-5.

118. Ohnishi M., Ono E., Shimuta K., Watanabe H., and Okamura N., Identification of TEM-135 beta-lactamase in penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae strains in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(7): p. 3021-3.

119. Ohnishi M., Golparian D., Shimuta K., Saika T., Hoshina S., Iwasaku K., Nakayama S., Kitawaki J., and Unemo M., Is Neisseria gonorrhoeae initiating a future era of untreatable gonorrhea?: detailed characterization of the first strain with high-level resistance to ceftriaxone. Antimicrob Agents Chemother, 2011. 55(7): p. 3538-45.

120. Ohnishi M., Saika T., Hoshina S., Iwasaku K., Nakayama S., Watanabe H., and Kitawaki J., Ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae, Japan. Emerg Infect Dis, 2011. 17(1): p. 148-9.

121. Ohnishi T., Kanoh T., Tono T., Danno K., Watanabe A., Nakamura H., Tsukao Y., Inatome J., Kim T., Kagara N., Taniguchi H., Kimura Y., Nakano Y., Monden T., and Imaoka S., [Adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 regimen after curative resection of liver metastases from colorectal cancer]. Gan To Kagaku Ryoho, 2010. 37(12): p. 2554-6.

122. Olesky M., Zhao S., Rosenberg R.L., and Nicholas R.A., Porin-mediated antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae: ion, solute, and antibiotic permeation through PIB proteins with penB mutations. J Bacteriol, 2006. 188(7): p. 2300-8.

123. Osaka K., Takakura T., Narukawa K., Takahata M., Endo K., Kiyota H., and Onodera S., Analysis of amino acid sequences of penicillin-binding protein 2 in clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae with reduced susceptibility to cefixime and ceftriaxone. J Infect Chemother, 2008. 14(3): p. 195-203.

124. Osnes M.N., Didelot X., Korne-Elenbaas J., Alfsnes K., Brynildsrud O.B., Syversen G., Nilsen O.J., De Blasio B.F., Caugant D.A., and Eldholm V., Sudden emergence of a Neisseria gonorrhoeae clade with reduced susceptibility to extended-spectrum cephalosporins, Norway. Microb Genom, 2020. 6(12).

125. Osnes M.N., Dorp L.V., Brynildsrud O.B., Alfsnes K., Schneiders T., Templeton K.E., Yahara K., Balloux F., Caugant D.A., and Eldholm V., Antibiotic Treatment Regimes as a Driver of the Global Population Dynamics of a Major Gonorrhea Lineage. Mol Biol Evol, 2021. 38(4): p. 1249-1261.

126. Pachulec E., Siewering K., Bender T., Heller E.M., Salgado-Pabon W., Schmoller S.K., Woodhams K.L., Dillard J.P., and van der Does C., Functional analysis of the Gonococcal Genetic Island of Neisseria gonorrhoeae. PLoS One, 2014. 9(10): p. e109613.

127. Pagotto F., Aman A.T., Ng L.K., Yeung K.H., Brett M., and Dillon J.A., Sequence analysis of the family of penicillinase-producing plasmids of Neisseria gonorrhoeae. Plasmid, 2000. 43(1): p. 24-34.

128. Pagotto F.J., Salimnia H., Totten P.A., and Dillon J.R., Stable shuttle vectors for Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus spp. and other bacteria based on a single origin of replication. Gene, 2000. 244(1-2): p. 13-9.

129. Palmer H.M., Young H., Winter A., and Dave J., Emergence and spread of azithromycin-resistant Neisseria gonorrhoeae in Scotland. J Antimicrob Chemother, 2008. 62(3): p. 490-4.

130. Pandori M., Barry P.M., Wu A., Ren A., Whittington W.L., Liska S., and Klausner J.D., Mosaic penicillin-binding protein 2 in Neisseria gonorrhoeae isolates collected in 2008 in San Francisco, California. Antimicrob Agents Chemother, 2009. 53(9): p. 4032-4.

131. Peleg M., On the comparison between the performance of the Weibull/log-logistic and the log-Linear/Arrhenius survival models in sterility calculations. J Food Sci, 2007. 72(6): p. vii-viii; author reply viii.

132. Peleg M., Normand M.D., Horowitz J., and Corradini M.G., An expanded Fermi solution for microbial risk assessment. Int J Food Microbiol, 2007. 113(1): p. 92-101.

133. Peleg M. and Corradini M.G., Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr, 2011. 51(10): p. 917-45.

134. Peleg M., Modeling the dynamic kinetics of microbial disinfection with dissipating chemical agents-a theoretical investigation. Appl Microbiol Biotechnol, 2021. 105(2): p. 539-549.

135. Persson B.D., Schmitz N.B., Santiago C., Zocher G., Larvie M., Scheu U., Casasnovas J.M., and Stehle T., Structure of the extracellular portion of CD46 provides insights into its interactions with complement proteins and pathogens. PLoS Pathog, 2010. 6(9): p. e1001122.

136. Phillips C.W., Aller R.D., and Cohen S.N., Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae. Lancet, 1976. 2(7992): p. 960.

137. Powell A.J., Tomberg J., Deacon A.M., Nicholas R.A., and Davies C., Crystal structures of penicillin-binding protein 2 from penicillin-susceptible and -resistant strains of Neisseria gonorrhoeae reveal an unexpectedly subtle mechanism for antibiotic resistance. J Biol Chem, 2009. 284(2): p. 1202-12.

138. Rim J.H., Kim H., Lee H., Yong D., Jeong S.H., and Lee K., Recent Increase in the Incidence of TEM-135 beta-Lactamase-harboring Neisseria gonorrhoeae in Korea. Ann Lab Med, 2018. 38(4): p. 324-330.

139. Ropp P.A., Hu M., Olesky M., and Nicholas R.A., Mutations in ponA, the gene encoding penicillin-binding protein 1, and a novel locus, penC, are required for high-level chromosomally mediated penicillin resistance in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(3): p. 769-77.

140. Ryan L., Golparian D., Fennelly N., Rose L., Walsh P., Lawlor B., Mac Aogain M., Unemo M., and Crowley B., Antimicrobial resistance and molecular epidemiology using whole-genome sequencing of Neisseria gonorrhoeae in Ireland, 2014-2016: focus on extended-spectrum cephalosporins and azithromycin. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018. 37(9): p. 1661-1672.

141. Sanchez-Buso L., Golparian D., Corander J., Grad Y.H., Ohnishi M., Flemming R., Parkhill J., Bentley S.D., Unemo M., and Harris S.R., The impact of antimicrobials on gonococcal evolution. Nat Microbiol, 2019. 4(11): p. 1941-1950.

142. Scangarella-Oman N.E., Dixon P., Koeth L.M., DiFranco-Fisher J., and Miller L.A., Analysis of antimicrobial susceptibility testing methods and variables and in vitro activity of gepotidacin against urogenital Neisseria gonorrhoeae in men. Diagn Microbiol Infect Dis, 2021. 101(4): p. 115484.

143. Schmerer M.W., Abrams A.J., Seby S., Thomas J.C.t., Cartee J., Lucking S., Vidyaprakash E., Pham C.D., Sharpe S., Pettus K., St Cyr S.B., Torrone E.A., Kersh E.N., Antimicrobial-Resistant Neisseria gonorrhoeae Working G., Gernert K.M., and Antimicrobial-Resistant Neisseria gonorrhoeae Working G., Genomic Characterization of Neisseria gonorrhoeae

Strains from 2016 U.S. Sentinel Surveillance Displaying Reduced Susceptibility to Azithromycin. Antimicrob Agents Chemother, 2020. 64(5).

144. Seike K., Yasuda M., Hatazaki K., Mizutani K., Yuhara K., Ito Y., Fujimoto Y., Ito S., Tsuchiya T., Yokoi S., Nakano M., and Deguchi T., Novel penA mutations identified in Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to ceftriaxone isolated between 2000 and 2014 in Japan. J Antimicrob Chemother, 2016. 71(9): p. 2466-70.

145. Shaskolskiy B., Dementieva E., Kandinov I., Filippova M., Petrova N., Plakhova X., Chestkov A., Kubanov A., Deryabin D., and Gryadunov D., Resistance of Neisseria gonorrhoeae isolates to beta-lactam antibiotics (benzylpenicillin and ceftriaxone) in Russia, 2015-2017. PLoS One, 2019. 14(7): p. e0220339.

146. Shaskolskiy B., Kandinov I., Kravtsov D., Vinokurova A., Gorshkova S., Filippova M., Kubanov A., Solomka V., Deryabin D., Dementieva E., and Gryadunov D., Hydrogel Droplet Microarray for Genotyping Antimicrobial Resistance Determinants in Neisseria gonorrhoeae Isolates. Polymers (Basel), 2021. 13(22).

147. Shimuta K., Watanabe Y., Nakayama S., Morita-Ishihara T., Kuroki T., Unemo M., and Ohnishi M., Emergence and evolution of internationally disseminated cephalosporin-resistant Neisseria gonorrhoeae clones from 1995 to 2005 in Japan. BMC Infect Dis, 2015. 15: p. 378.

148. Shimuta K., Lee K., Yasuda M., Furubayashi K., Uchida C., Nakayama S.I., Takahashi H., and Ohnishi M., Characterization of 2 Neisseria gonorrhoeae Strains With High-Level Azithromycin Resistance Isolated in 2015 and 2018 in Japan. Sex Transm Dis, 2021. 48(7): p. e85-e87.

149. Singh A.E., Gratrix J., Martin I., Friedman D.S., Hoang L., Lester R., Metz G., Ogilvie G., Read R., and Wong T., Gonorrhea Treatment Failures With Oral and Injectable Expanded Spectrum Cephalosporin Monotherapy vs Dual Therapy at 4 Canadian Sexually Transmitted Infection Clinics, 2010-2013. Sex Transm Dis, 2015. 42(6): p. 331-6.

150. Singh R., Perera S.R., Katselis G.S., Chumala P., Martin I., Kusalik A., Mitzel K.M., and Dillon J.R., A beta-lactamase-producing plasmid from Neisseria gonorrhoeae carrying a unique 6 bp deletion in blaTEM-1 encoding a truncated 24 kDa TEM-1 penicillinase that hydrolyses ampicillin slowly. J Antimicrob Chemother, 2019. 74(10): p. 2904-2912.

151. Soderholm N., Vielfort K., Hultenby K., and Aro H., Pathogenic Neisseria hitchhike on the uropod of human neutrophils. PLoS One, 2011. 6(9): p. e24353.

152. Somsri M., Oransathid W., Vesely B., Wojnarski M., Demons S., Waters N., Kana K., Chaitaveep N., Chotanaphuti T., and Lurchachaiwong W., Antimicrobial Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Adult Patients Seeking Care at Military Hospitals in Thailand From 2014 to 2020. Mil Med, 2022.

153. Sonksen U.W., Christensen J.J., Nielsen L., Hesselbjerg A., Hansen D.S., and Bruun B., Fastidious Gram-Negatives: Identification by the Vitek 2 Neisseria-Haemophilus Card and by Partial 16S rRNA Gene Sequencing Analysis. Open Microbiol J, 2010. 4: p. 123-31.

154. Spence J.M. and Clark V.L., Role of ribosomal protein L12 in gonococcal invasion of Hec1B cells. Infect Immun, 2000. 68(9): p. 5002-10.

155. Spence J.M., Tyler R.E., Domaoal R.A., and Clark V.L., L12 enhances gonococcal transcytosis of polarized Hec1B cells via the lutropin receptor. Microb Pathog, 2002. 32(3): p. 117-25.

156. Stamatakis A., Using RAxML to Infer Phylogenies. Curr Protoc Bioinformatics, 2015. 51: p. 6 14 1-6 14 14.

157. Stein D.C., LeVan A., Hardy B., Wang L.C., Zimmerman L., and Song W., Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae across Polarized Epithelial Cells. PLoS One, 2015. 10(8): p. e0134342.

158. STI, Adopting a Sexual Health Paradigm, 2021. (ISBN:9780309683951)

159. Tanaka M., Furuya R., Kobayashi I., Ohno A., and Kanesaka I., Molecular characteristics and antimicrobial susceptibility of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae isolates in Fukuoka, Japan, 1996-2018. J Glob Antimicrob Resist, 2021. 26: p. 45-51.

160. Thayer J.D., Perry M.I., Field F.W., and Garson W., Failure of penicillin, chloramphenicol, erythromycin, and novobiocin to kill phagocytized gonococci in tissue. Antibiot Annu, 1956: p. 513-7.

161. Thomas J.C., Seby S., Abrams A.J., Cartee J., Lucking S., Vidyaprakash E., Schmerer M., Pham C D., Hong J., Torrone E., Cyr S.S., Shafer W.M., Bernstein K., Kersh E.N., Gernert K.M., and Antimicrobial-Resistant Neisseria gonorrhoeae Working G., Evidence of Recent Genomic Evolution in Gonococcal Strains With Decreased Susceptibility to Cephalosporins or Azithromycin in the United States, 2014-2016. J Infect Dis, 2019. 220(2): p. 294-305.

162. Tomberg J., Unemo M., Ohnishi M., Davies C., and Nicholas R.A., Identification of amino acids conferring high-level resistance to expanded-spectrum cephalosporins in the penA gene from Neisseria gonorrhoeae strain H041. Antimicrob Agents Chemother, 2013. 57(7): p. 3029-36.

163. Town K., Field N., Harris S.R., Sanchez-Buso L., Cole M.J., Pitt R., Fifer H., Mohammed H., and Hughes G., Phylogenomic analysis of Neisseria gonorrhoeae transmission to assess sexual mixing and HIV transmission risk in England: a cross-sectional, observational, whole-genome sequencing study. Lancet Infect Dis, 2020. 20(4): p. 478-486.

164. Trembizki E., Buckley C., Lawrence A., Lahra M., Whiley D., and Investigators G.S., Characterization of a novel Neisseria gonorrhoeae penicillinase-producing plasmid isolated in Australia in 2012. Antimicrob Agents Chemother, 2014. 58(8): p. 4984-5.

165. Tribble G.D., Rigney T.W., Dao D.H., Wong C.T., Kerr J.E., Taylor B.E., Pacha S., and Kaplan H.B., Natural competence is a major mechanism for horizontal DNA transfer in the oral pathogen Porphyromonas gingivalis. mBio, 2012. 3(1).

166. Tribuddharat C., Pongpech P., Charoenwatanachokchai A., Lokpichart S., Srifuengfung S., and Sonprasert S., Gonococcal Antimicrobial Susceptibility and the Prevalence of blaTEM-1 and blaTEM-135 Genes in Neisseria gonorrhoeae Isolates from Thailand. Jpn J Infect Dis, 2017. 70(2): p. 213-215.

167. Unemo M., Olcen P., Fredlund H., and Thulin S., Real-time PCR and subsequent pyrosequencing for screening of penA mosaic alleles and prediction of reduced susceptibility to expanded-spectrum cephalosporins in Neisseria gonorrhoeae. APMIS, 2008. 116(11): p. 1004-8.

168. Unemo M. and Dillon J.A., Review and international recommendation of methods for typing neisseria gonorrhoeae isolates and their implications for improved knowledge of gonococcal epidemiology, treatment, and biology. Clin Microbiol Rev, 2011. 24(3): p. 447-58.

169. Unemo M., Golparian D., Limnios A., Whiley D., Ohnishi M., Lahra M.M., and Tapsall J.W., In vitro activity of ertapenem versus ceftriaxone against Neisseria gonorrhoeae isolates with highly diverse ceftriaxone MIC values and effects of ceftriaxone resistance determinants: ertapenem for treatment of gonorrhea? Antimicrob Agents Chemother, 2012. 56(7): p. 36039.

170. Unemo M., Golparian D., Nicholas R., Ohnishi M., Gallay A., and Sednaoui P., High-level cefixime- and ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae in France: novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure. Antimicrob Agents Chemother, 2012. 56(3): p. 1273-80.

171. Unemo M. and Nicholas R.A., Emergence of multidrug-resistant, extensively drug-resistant and untreatable gonorrhea. Future Microbiol, 2012. 7(12): p. 1401-22.

172. Unemo M., Golparian D., and Hellmark B., First three Neisseria gonorrhoeae isolates with high-level resistance to azithromycin in Sweden: a threat to currently available dual-antimicrobial regimens for treatment of gonorrhea? Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2014. 58(1): p. 624-625.

173. Unemo M. and Janier M., The 2014 European guideline on the management of syphilis has now been published. Euro Surveill, 2014. 19(45): p. 20957.

174. Unemo M. and Shafer W.M., Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in the 21st century: past, evolution, and future. Clin Microbiol Rev, 2014. 27(3): p. 587-613.

175. Unemo M. and Jensen J.S., Antimicrobial-resistant sexually transmitted infections: gonorrhoea and Mycoplasma genitalium. Nat Rev Urol, 2017. 14(3): p. 139-152.

176. Unemo M., Ross J., Serwin A.B., Gomberg M., Cusini M., and Jensen J.S., 2020 European guideline for the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults. Int J STD AIDS, 2020: p. 956462420949126.

177. Unemo M., Ahlstrand J., Sanchez-Buso L., Day M., Aanensen D., Golparian D., Jacobsson S., Cole M.J., and European Collaborative G., High susceptibility to zoliflodacin and conserved target (GyrB) for zoliflodacin among 1209 consecutive clinical Neisseria gonorrhoeae isolates from 25 European countries, 2018. J Antimicrob Chemother, 2021. 76(5): p. 1221-1228.

178. Vester B. and Douthwaite S., Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA. Antimicrob. Agents Chemother., 2001. 45: p. 1-12.

179. Vincent L.R., Kerr S.R., Tan Y., Tomberg J., Raterman E.L., Dunning Hotopp J.C., Unemo M., Nicholas R.A., and Jerse A.E., In Vivo-Selected Compensatory Mutations Restore the Fitness Cost of Mosaic penA Alleles That Confer Ceftriaxone Resistance in Neisseria gonorrhoeae. mBio, 2018. 9(2).

180. Wang L., Li X., Shen H., Mao N., Wang H., Cui L., Cheng Y., and Fan J., Bacterial IgA protease-mediated degradation of agIgA1 and agIgA1 immune complexes as a potential therapy for IgA Nephropathy. Sci Rep, 2016. 6: p. 30964.

181. Wasserheit J.N., HIV infection and other STDs: so close and yet so far. Sex Transm Dis, 1999. 26(10): p. 549-50.

182. Welsch J.A. and Ram S., Factor H and neisserial pathogenesis. Vaccine, 2008. 26 Suppl 8: p. I40-5.

183. Wheeler H.L., Skinner C.J., Khunda A., Aitken C., Perpanthan D., and Staite E., Molecular testing (strand displacement assay) for identification of urethral gonorrhoea in men: can it replace culture as the gold standard? Int J STD AIDS, 2005. 16(6): p. 430-2.

184. Whelan J., Abbing-Karahagopian V., Serino L., and Unemo M., Gonorrhoea: a systematic review of prevalence reporting globally. BMC Infect Dis, 2021. 21(1): p. 1152.

185. Whiley D.M., Goire N., Lambert S.B., Ray S., Limnios E.A., Nissen M.D., Sloots T.P., and Tapsall J.W., Reduced susceptibility to ceftriaxone in Neisseria gonorrhoeae is associated with mutations G542S, P551S and P551L in the gonococcal penicillin-binding protein 2. J Antimicrob Chemother, 2010. 65(8): p. 1615-8.

186. Whiley D.M., Jacobsson S., Tapsall J.W., Nissen M.D., Sloots T.P., and Unemo M., Alterations of the pilQ gene in Neisseria gonorrhoeae are unlikely contributors to decreased susceptibility to ceftriaxone and cefixime in clinical gonococcal strains. J Antimicrob Chemother, 2010. 65(12): p. 2543-7.

187. WHO, Gonococcal antimicrobial resistance in the Western Pacific Region, 2017. p. 2-7. (ISBN:1447-4514)

188. WHO, (Geneva), Global action plan to control the spread and impact of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae, 2012. (ISBN:9789241503501)

189. WHO, (Geneva), Guidelines for the Treatment of Neisseria gonorrhoeae, 2020. (ISBN:9789241549691)

190. Wong L.K., Hemarajata P., Soge O.O., Humphries R.M., and Klausner J.D., Real-Time PCR Targeting the penA Mosaic XXXIV Type for Prediction of Extended-Spectrum-Cephalosporin Susceptibility in Clinical Neisseria gonorrhoeae Isolates. Antimicrob Agents Chemother, 2017. 61(11).

191. Xu W.Q., Zheng X.L., Liu J.W., Zhou Q., Zhu X.Y., Zhang J., Han Y., Chen K., Chen S.C., Chen X.S., and Yin Y.P., Antimicrobial Susceptibility of Ertapenem in Neisseria gonorrhoeae Isolates Collected Within the China Gonococcal Resistance Surveillance Programme (China-GRSP) 2018. Infect Drug Resist, 2021. 14: p. 4183-4189.

192. Yahara K., Nakayama S.I., Shimuta K., Lee K.I., Morita M., Kawahata T., Kuroki T., Watanabe Y., Ohya H., Yasuda M., Deguchi T., Didelot X., and Ohnishi M., Genomic

surveillance of Neisseria gonorrhoeae to investigate the distribution and evolution of antimicrobial-resistance determinants and lineages. Microb Genom, 2018. 4(8).

193. Yahara K., Ma K.C., Mortimer T.D., Shimuta K., Nakayama S.I., Hirabayashi A., Suzuki M., Jinnai M., Ohya H., Kuroki T., Watanabe Y., Yasuda M., Deguchi T., Eldholm V., Harrison O.B., Maiden M.C.J., Grad Y.H., and Ohnishi M., Emergence and evolution of antimicrobial resistance genes and mutations in Neisseria gonorrhoeae. Genome Med, 2021. 13(1): p. 51.

194. Yamamoto S., Kiyokawa K., Tanaka K., Moriguchi K., and Suzuki K., Novel toxin-antitoxin system composed of serine protease and AAA-ATPase homologues determines the high level of stability and incompatibility of the tumor-inducing plasmid pTiC58. J Bacteriol, 2009. 191(14): p. 4656-66.

195. Yamasaki R., Yabe U., Kataoka C., Takeda U., and Asuka S., The oligosaccharide of gonococcal lipooligosaccharide contains several epitopes that are recognized by human antibodies. Infect Immun, 2010. 78(7): p. 3247-57.

196. Yan J., Zhang J., and van der Veen S., High prevalence of TEM-135 expression from the Asian plasmid in penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae from Hangzhou, China. Int J Antimicrob Agents, 2019. 54(3): p. 361-366.

197. Zapun A., Morlot C., and Taha M.K., Resistance to beta-Lactams in Neisseria ssp Due to Chromosomally Encoded Penicillin-Binding Proteins. Antibiotics (Basel), 2016. 5(4).

198. Zhang D., de Souza R.F., Anantharaman V., Iyer L.M., and Aravind L., Polymorphic toxin systems: Comprehensive characterization of trafficking modes, processing, mechanisms of action, immunity and ecology using comparative genomics. Biol Direct, 2012. 7: p. 18.

199. Zhang S., Tu Y.T., Cai H.H., Ding H.H., Li Q., He Y.X., Liu X.X., Wang X., Hu F., Chen T., and Chen H.X., Opacity proteins of neisseria gonorrhoeae in lipooligosaccharide mutants lost ability to interact with neutrophil-restricted CEACAM3 (CD66d). J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2016. 36(3): p. 344-349.

200. Zhao L., Liu A., Li R., and Zhao S., Trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae and molecular characteristics of N. gonorrhoeae with decreased susceptibility to ceftriaxone in Shandong, China, 2007 to 2014. Int J Antimicrob Agents, 2018. 51(1): p. 5256.

201. Zhao S., Duncan M., Tomberg J., Davies C., Unemo M., and Nicholas R.A., Genetics of chromosomally mediated intermediate resistance to ceftriaxone and cefixime in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother, 2009. 53(9): p. 3744-51.

202. Zheng H., Wu X., Huang J., Qin X., Xue Y., Zeng W., Lan Y., Ou J., Tang S., and Fang M., The prevalence and epidemiology of plasmid-mediated penicillin and tetracycline resistance among Neisseria gonorrhoeae isolates in Guangzhou, China, 2002-2012. BMC Infect Dis, 2015. 15: p. 412.

203. Zhou K., Chen S.C., Yang F., van der Veen S., and Yin Y.P., Impact of the gonococcal FC428 penA allele 60.001 on ceftriaxone resistance and biological fitness. Emerg Microbes Infect, 2020. 9(1): p. 1219-1229.