Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Верещагин, Владимир Александрович

• Верещагин, Владимир Александрович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Верещагин, Владимир Александрович

Список используемых сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Общая характеристика Neisseria gonorrhoeae

1.2 Гонококковая инфекция.

1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез гонореи

1.2.2 Эпидемиология

1.2.3 Лечение. Проблема лекарственной устойчивости

1.3 Внутривидовая вариабельность N. gonorrhoeae и гетерогенность популяции

1.3.1 Морфологический полиморфизм гонококков

1.3.2 Физиологическая и серологическая гетерогенность гонококков

1.3.3 Фепотипическая гетерогенность гонококков. Лекарственная устойчивость

1.3.3.1 Формирование устойчивости к различным классам антимикробных препаратов

1.3.3.2 Методы оценки лекарственной устойчивости возбудителя. Анализ генетических маркеров

1.3.4 Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae

1.3.4.1 рог-типирование

1.3.4.2 Типирование мультилокусным секвенированием

1.3.4.3 Прямое белковое профилирование с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии

2 Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы

2.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae

2.2.1 Бактериальные клетки

2.2.2 Экстракция белков (грубый лизис бактериальных клеток)

2.2.3 Сокристализация матрицы и аналита

2.2.4 Масс-спектрометрический анализ

2.2.5 Интерпретация масс-спектров

2.3 Генетический анализ штаммов N. gonorrhoeae

2.3.1 Выделение тотальной ДНК N. gonorrhoeae

2.3.2 Амплификация фрагментов генома N. gonorrhoeae

2.3.3 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа

2.3.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции

2.3.5 Секвенирование фрагментов генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»

2.3.6 Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»

2.4 Математический анализ данных

3 Результаты

3.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов Ж gonorrhoeae

3.2 Прямое белковое профилироваиие штаммов N. gonorrhoeae

3.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae

3.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции

3.4.1 /?ог-типирование

3.4.2 Типирование мультилокуспым секвенированием

4 Обсуждение

4.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N.gonorrhoeae

4.2 Прямое белковое профилирование

4.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae

4.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae»

Гонорея - одна из наиболее распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость гонореей в мире составляет около 60 миллионов случаев в год [1]. В России этот показатель также остается на достаточно высоком уровне - около 100 случаев на 100 тысяч населения в год [2, 3]. По этой причине, как в Российской Федерации (РФ), так и во многих странах мира, гонорея включена в список инфекций, подлежащих обязательной статистической регистрации на национальном уровне (наряду с сифилисом, хламидийной инфекцией и др.) [4, 5].

Возбудитель гонореи - грамотрицательный диплококк Neisseria gonorrhoeae, способный колонизировать эпителий уретры, шейки матки, глотки, прямой кишки, конъюнктивы и некоторые другие эпителии с развитием инфекций нижних отделов мочеполового тракта, воспалительных заболеваний органов малого таза, конъюнктивита, проктита, фарингита, диссеминированной гонококковой инфекции. Особенностью современной гонореи является увеличение вялотекущих и асимптомных форм заболевания, хроническое течение, многоочаговость поражения верхнего и нижнего отделов мочеполового тракта. Отмечен высокий уровень постгонорейных осложнений, приводящих к женскому и мужскому бесплодию, случаев генерализации гонококковой инфекции с поражением суставов, клапанов сердца, аорты, кожи [6].

Объяснением указанных свойств гонококковой инфекции, очевидно, служит высокая изменчивость и пластичность возбудителя, способность к быстрому адаптивному изменению фенотипических и генетических характеристик. Так, предпосылки для хронизации и генерализации патологического процесса создает способность гонококка к L-трансформации и внутриклеточной инвазии. Генетические механизмы, способствующие формированию гетерогенности популяции N. gonorrhoeae, включают внутри- и межвидовую ДНК-трансформацию, что примечательно, в любом периоде жизненного цикла, активную передачу информации с помощью плазмид, рекомбинацию. Гонококк характеризует высокое содержание в геноме супермутабельных и мозаичных генов, значительная вариабельность структуры пилей, белков наружной мембраны (Рог, Ора), и как следствие, культуральных и антигенных свойств гонококка (в частности, антигенная мимикрия), его вирулентных и персистентных характеристик. Благодаря высокой пластичности генома, под давлением воздействия антибактериальных средств N. gonorrhoeae реализует практически все известные механизмы лекарственной устойчивости.

Поэтому, с точки зрения современной клинической микробиологии, особенно актуальным становится разработка не только максимально точных, но и быстрых, сравнительно недорогих методик идентификации и характеристики N. gonorrhoeae по основным, клинико-эпидемиологическим параметрам (так называемых, методов «быстрой микробиологии»). Между тем, использование традиционных подходов к диагностике гонококковой инфекции сопряжено на практике с известными трудностями. Гонококки относятся к достаточно прихотливым бактериям, требуют сложных питательных сред для культивирования и высокой квалификации персонала лаборатории. Поэтому процедуры микробиологической идентификации гонококка, включающие высев на питательной среде отделяемого уретры или цервикального канала, выделение чистой культуры гонококка, поддержание жизнеспособности микроба для определения профиля чувствительности к антибиотикам, характеризуются сложностью стандартизации, трудоемкостью и длительностью анализа.

Тогда как современные достижения молекулярной биологии открывают возможности альтернативных подходов к идентификации и характеристике отдельных штаммов N. gonorrhoeae и популяции в целом. Вслед за различными диагностическими тестами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification tests, NAATs), для оценки лекарственной устойчивости возбудителя был предложен новый подход, представляющий собой определение генетических детерминант устойчивости. В его основе лежит амплификация мобильных детерминант устойчивости наравне с амплификацией генов, белковые продукты которых являются мишенями для действия антибиотиков, и определение в структуре детерминант точечных нуклеотидных полиморфизмов, являющихся маркерами формирования устойчивости, с помощью реакции минисеквенирования и анализом продуктов с использованием MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.

Этот же высокоточный и быстрый метод анализа молекулярных масс биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, липидов) лежит в основе предложенного недавно подхода, предназначенного для быстрой идентификации и внутривидовой классификации микроорганизмов путём регистрации и сравнительного анализа белковых масс-спектров, специфичных для разных видов. Интересным представляется оценка возможности использования этого подхода для идентификации и, возможно, типирования гонококка, проявляющего, как указывалось выше, высокую пластичность и гетерогенность в популяции.

Действительно, давно описанный морфофизиологический полиморфизм, а затем и генетическая пластичность N. gonorrhoeae, являются центральными проблемами молекулярной эпидемиологии гонококка. Разрабатываются и совершенствуются различные методы штаммовой идентификации и типирования N. gonorrhoeae с целью прояснить некоторые общие аспекты структуры популяции гонококка, а также выявить локальные эпидемиологические особенности возбудителя, определить тенденции в динамике и распространении клинически значимых признаков в популяции.

Одним из перспективных признан подход, заключающийся в определении изменений последовательности рог гена гонококка (рог-типирование). Стоит отметить, что Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток, характеризуется высокой изменчивостью, поэтому отдельные структурные вариации в соответствующих генетических локусах рог гена, могут иметь эволюционные преимущества, из чего следует подверженность их селекции. Эти свойства "объекта" типирования позволяют использовать данный подход для оценки быстрых адаптационных изменений гонококка, краткосрочных эволюционных тенденций развития популяции, а также для оценки её гетерогенности в небольших, относительно замкнутых группах пациентов.

Отличную идеологию содержит в себе, предложенный относительно недавно для типирования популяции N. gonorrhoeae, метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST, в основе которого лежит секвенирование строго определенного набора фрагментов «генов домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллельных вариантов, характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. Предполагаемая область его использования - это оценка макроэволюции популяции в целом и тенденций в динамике больших популяций, затрагивающих обширные территории.

Отдельно следует заметить, что в РФ отсутствует какая-либо развитая система типирования N. gonorrhoeae, информация о региональных особенностях лекарственной устойчивости крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна (ретроспективные исследования).

Таким образом, дальнейшая разработка и адаптация методов молекулярного типирования гонококка, а также комплексная характеристика популяции N.gonorrhoeae, распространенной на территории РФ, представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Целыо настоящей работы являлалсь разработка и сравнение различных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae и использование их для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.

2. Разработка системы комплексной оценки антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

3. Оптимизация методики прямого масс-спектрометрического белкового профилирования и оценка возможности типирования клинических штаммов N. gonorrhoeae с использованием данного подхода.

4. Реализация схемы рог-типирования для характеристика коллекции российских клинических штаммов N.gonorrhoeae.

5. Анализ гетерогенности «генов домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae и разработка схемы типирования мультилокусным секвенированием клинических штаммов гонококка.

6. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, включающая 1) анализ распространенности и вклада различных механизмов в формирование лекарственной устойчивости N.gonorrhoea, 2) анализ структуры и оценка гетерогенности исследуемой популяции N.gonorrhoea.

1 Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Верещагин, Владимир Александрович

6 Выводы

1. Сформирована коллекция из 464 образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от пациентов из 14 региональных центров РФ.

2. Разработан и реализован подход к оценке антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, основанный на одновременном анализе 15 генетических локусов, позволивший выделить маркеры (и их сочетания), обнаружение которых с точностью более 81 % прогнозирует фенотипическую устойчивость гонококка к пенициллинам, тетрациклину, фторхинолонам.

3. Предложена методика прямого белкового профилирования с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. Показана низкая дискриминирующая способность этого подхода (D = 0,27), что не позволяет использовать его для типирования N. gonorrhoeae, но указывает на возможность видовой идентификации.

4. Показана высокая дискриминирующая способность рог-типирования (D = 0,97) и возможность анализа получаемых данных в рамках системы серотипирования (D = 0,78). Установлен вклад мутаций репВ локуса рог гена в формирование мультирезистентности.

5. Анализ нуклеотидных вариаций 13 генов «домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae позволил установить 7 наиболее информативных локусов: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC, позволяющих осуществлять молекулярного типирования с высокой степенью дискриминации (D = 0,98).

6. Впервые на основании молекулярно-эпидемиологической характеристики географически неоднородной группы штаммов N. gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, а) показан преимущественно хромосомный механизм формирования лекарственной устойчивости к пенициллину и тетрациклину; б) определены частоты встречаемости различных серотипов с преобладание PIB серовара (88,6 %); в) выявлено значительное генетическое разнообразие циркулирующих в популяции штаммов.

5 Заключение

Высокий уровень изменчивости N. gonorrhoeae обуславливает продолжающийся рост лекарственной устойчивости возбудителя и увеличение числа бессимптомных, хронических и диссеминированных форм инфекции. В РФ отсутствует какая-либо система эпидемиологического мониторинга популяции N. gonorrhoeae. Разработка методов молекулярного типирования штаммов N. gonorrhoeae для российской популяции возбудителя актуальна и имеет важное практическое и эпидемиологическое значение.

В настоящей работе предложен комплексный подход оценки клинически и эпидемиологически значимых свойств возбудителя, апробированный на географически неоднородной группе российских штаммов N. gonorrhoeae. Для всех исследованных регионов подтверждена высокая распространенность резистентных и мультирезистентных штаммов, охарактеризованных с позиций известных генетических механизмов формирования лекарственной устойчивости. Впервые исследованы возможности прямого белкового профилирования для характеристики штаммов гонококка. Полученные результаты указывают на возможность использования этого подхода для видовой идентификации возбудителя. Данные о гетерогенности исследованной выборки штаммов получены с использованием двух подходов (рог-типирование, мультилокусное секвенирование), основанных на прямом анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генома, отличающихся по уровню изменчивости и подверженности селекции в эволюционном процессе. Описана дискриминирующая способность и специфика молекулярно-эпидемиологической информации, получаемой каждым из методов.

Результаты представленной работы способствуют осуществлению на территории РФ мониторинга гонококковой инфекции на современном методологическом и технологическом уровне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Верещагин, Владимир Александрович, 2006 год

1. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates. WHO, 2001. - P.43.

2. CDC. Case Definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. // MMWR. 1997. - Vol. 46 (RR10). - P. 1-55.

3. European STD Guidelines. // Inter. J. of STD & AIDS. 2001. - Vol. 12, № 10,supp.3.

4. Бухарин O.B., Усвяцов Б.Я., Карташова O.JI. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - 282 с.

5. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 1200 с.

6. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова O.JI. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - 282 с.

7. Murray P. R. Medical Microbiology, 3rd ed. / P. R. Murray. Mosby, 1998.-464 p.

8. Cannon J.G., Sparling P.F. The genetics of the gonococcus // Annu. Rev. , Microbiol. 1984. - Vol. 38. - P. 111-133.

9. Tinsley C. R., Nassif X. Analysis of the genetic differences between Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae: Two closely related bacteria expressing two different pathogenicities // Microbiology. 1996. - Vol. 93, № 20.- P. 11109-11114.

10. Sox Т. E., Mohammed W., Blackman E., Biswas G., Sparling P.F. Conjugative plasmids in Neisseria gonorrhoeae // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 1346№1. -P. 278-286.

11. Palmer H.M., Leeming J.P., Turner A. A multiplex polymerase chain reaction to differentiate P-lactamase plasmids of Neisseria gonorrhoeae И J. Antimicrob. Chemoter. 2000. - Vol. 45. - P. 777-782.

12. Dillon J.R., Li H., Yeung K.H., Aman T.A. A PCR assay for discriminating Neisseria gonorrhoeae P-lactamase-producing plasmids // Mol. Cell Probes. 1999.-Vol. 13.-P. 89-92.

13. Morse S.A., Johnson S.R., Biddle J.W., Roberts M.C. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae is result of acquisition of streptococcal tetM determinant // Antimicrob. Agents Chemother. 1986. - Vol. 30,№5.-P. 664-670.

14. Fussenger M., Rudel Т., Barten R. et al. Transformation competence and typ-4 pilus biogenesis in Neisseria gonorrhoeae a review // Gene. - 1997. -Vol. 192,№ l.-P. 125-134.

15. Saunders N., Hood D., Moxon E. Bacterial evolution: bacteria play pass the gene//Curr. Biol. 1999. - Vol. 9, № 5. - P. 180-183.

16. Kellogg D. S., Peacock W. L., Deacon W. E., Brown L., and Pirkle C. L. Neisseria gonorrhoeae I. Virulence genetically linked to clonal variation. // J. Bacteriol. 1963.-Vol. 85.-P. 1274.

17. Kellogg D., Cohen O., Norins L., et al. Neisseria gonorrhoeae II. Colonial variation and pathogenity during 35 months in vitro // J.Bacteriol. -1968. Vol. 96. - P. 596 - 605.

18. Seifert H. Questions about gonococcal pilus phase- and antigenic variation // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 21, №3. - P. 433 - 440.

19. Gregg C.R., Johnson A.P., Taylor-Robinson D., Melly M.A., McGee Z.A. Host species-specific damage to oviduct mucosa by Neisseria gonorrhoeae lipopolysaccharide // Infect Immun. 1981. -Vol. 34. - P. 1056 - 1058.

20. Apicella M.A., Westerink M.A.J., Morse S.A., Schneider H., Rise P.A., Griffiss J.M. Bactericidal antibody response of normal human serum to the lipooligosaccharide of Neisseria gonorrhoeae I I J. Infect. Dis. 1986. - Vol. 153.-P. 520-526.

21. Blake M.S. Functions of the outer membrane proteins of Neisseria gonorrhoeae, P.51-66. In G.G.Jackson and H.Thomas (ed.), The pathogenesis of bacterial infections. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 1985.

22. Gorby G., Simon D., and Rest R. F. Escherichia coli that express Neisseria gonorrhoeae opacity-associated proteins attach to and invade human fallopian tube epithelium. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 730. - P. 286289.

23. Rest R. F., Liu J., Talukdar R., Frangipane J. V., and Simon D. Interaction of pathogenic Neisseria with host defenses. What happens in vivo? // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 730. - P. 182 -196.

24. Morse S.A. The biology of the gonococcus // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1978.-Vol. 7,№2.-P. 93-189.

25. Morse S.A. Neisseria gonorrhoeae: physiology and metabolism // Sex. Transm. Dis. 1979. - Vol. 6, № 1. - P. 28-37.

26. Morse S.A., Cacciapuoti A.F., Lysko P.G. Physiology of Neisseria gonorrhoeae. Adv. Microb. Physiol. 1979. - Vol. 20. - P. 251-320.

27. Guidelines for the management of sexually transmitted infections. -WHO, 2003. P. 33-34.

28. CDC. Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines, 2002 // MMWR. 2002. - Vol. 51, (RR-6). - P.37-38.

29. CDC. Increases in Fluoroquinolone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Among Men Who Have Sex with Men United States, 2003, and Revised RecoMMendations for Gonorrhea Treatment, 2004. // MMWR. - 2004. - Vol. 53. -P. 335-338.

30. Лечение и профилактика гонореи. Методические рекомендации. Минздрав РФ.- М., 1993.

31. Васильев М.М. Диагностика, клиника и терапия гонорейной инфекции // Рус. мед. жур. 1998. - Т.6, № 15.

32. Кисина В.И., Колиева Г.Л. Клинико-микробиологическое и фармакоэкономическое обоснование выбора фторхинолонов для лечения гонорейной и хламидийной инфекций // Пробл. стандар. здравоохр. 2001.- № 4. С. 120-121.

33. Кубанова А.А., Кисина В.И., Васильев М.М. Результаты изучения эффективности и переносимости цефтриаксона (роцефина) и спектиномицина (тробицина) при лечении неосложненной гонореи // Кремл. мед. клин. вест. 2001. - № 1. - С. 59 - 62.

34. Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи. Протоколы ведения бодьных, лекарственные средства / под ред. А.А. Кубановой. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2003. С. 53-56.

35. Кунцевич Л.Д., Никулин Н.К., Жукова Г.И., Борщевская Р.П., Мишанов В.Р., Воронова Н.Ю. Динамика чувствительности к пенициллину и b-актамазопродуцирующая способность гонококков // Вест. дерм, венер.- 1999. N 1. - С. 35 - 37.

36. Протокол ведения больных «Гонококковая инфекция». Утвержден приказом Минздрава России от 20.08.2003 г. N 415. М.- 2003.

37. Jephcott А. Е., Reyn A., Birch-Andersen A. Brief report: Neisseria gonorrhoeae. III. Demonstration of presumed appendages to cells from different colony type // Acta Pathol. Microbiol. Scan B.: Microbiol. Immunol. 1971. -Vol. 79, №3.-P. 437-439.

38. Swanson J, Kraus SJ, and Gotschlich EC. Studies on gonococcus infection. I. Pill and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns// J. Exp. Med. 1971.-Vol. 134.-P. 886.

39. Sandstrom, E., and D. Danielsson. 1980. Serology of Neisseria gonorrhoeae. Classification by co-agglutination // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. 1980. - Vol. 88. - P. 27-38.

40. Tam M.R., Buchanan T.M., Sandstrom E.G., Holmes K.K., Knapp J.S., Siadak A.W., Nowinski R.C. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with monoclonal antibodies // Infect. Immun. 1982. Vol. 36. - P. 1042- 1053.

41. Knapp J.S., Tam M.R., Nowinski R.C., Holmes K.K., Sandstrom E.G. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with use of monoclonal antibodies to gonococcal outer membrane protein I // J. Infect. Dis. 1984. -Vol. 150.-P. 44-48.

42. Cannon J. G., Buchanan Т. M., Sparling P. F. Confirmation of association of protein I serotype of Neisseria gonorrhoeae with ability to cause disseminated infection // Infect. Immun. 1983. - Vol. 40. - P. 816 - 819.

43. Sandstrom E. G., Knapp J. S., Reller L. В., Thompson S. E., Hook E. W., Holmes К. K. Serogrouping of Neisseria gonorrhoeae: correlation of serogroup with disseminated gonococcal infection // Sex. Transm. Dis. 1984. - Vol. 11.-P. 77 - 80.

44. Brunham R. C., Plummer F., Slaney L., Rand F., DeWitt W. Correlation of auxotype and protein I type with expression of disease due to Neisseria gonorrhoeae. J. Infect. Dis. 1985. - Vol. 152. - P. 339 - 343.

45. Van Putten J.P.M., Duensing T.D., Carlson J. Gonococcal invasion of epithelial cells driven by the P.IA porin // Abstr. 11 Inter, pathogenic Neisseria conference / Edited by X.Nassif, M.J. Quentin-Millet, M.K.Taha. Paris, 1998. -P. 35 35.

46. Bygdeman S. M., Mardh P. A., Sandstrom E. G. Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to rifampicin and thiamphenicol: correlation with protein I antigenic determinants // Sex, Transm. Dis. 1984. - Vol. 11. - P. 366 - 370.

47. Abeck D., Johnson A.P., Grimm W., Zaba R., Korting H.C. Plasmid content, serotypes, and antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeaestrains isolated in Munich in 1987-1988 // Eur. J. Epidemiol. 1989 Vol. 5. - P. 170-172.

48. Gill M.J. Serotyping Neisseria gonorrhoeae: a report of the Fourth International Workshop // Genitourin. Med. -1991. Vol. 67. - P. 53-57.

49. NCCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 1993. Approved standard M7-A3. NCCLS, Villanova, Pa.

50. Surveillance of antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae in the World Health Organization Western Pacific Region, 2003 // Commun. Dis. Itell. -2005.-Vol. 29.-P. 62-64.

51. CDC. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2003 Supplement: Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP) Annual Report 2003. Atlanta, Georgia: U.S. Department of Health and Human Services, November 2004.

52. Berron S., Vazquez J.A., Gimenez M.J., Fuente L., Aguilar L. In vitro susceptibilities of 400 Spanish isolates of Neisseria gonorrhoeae to gemifloxacin and 11 other atimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2543-2544.

53. Zarantonelli L., Borthagaray G., Lee E-H, Shafer W.M. Decreased Azithromycin Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Due to mtrR Mutations // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43, № 10. - P. 2468-2472.

54. Zarantonelli L., Borthagaray G., Lee E-H, Veal W., Shafer W.M. Decreased Susceptibility to Azithromycin and Erythromycine mediated by a novel mtr(R) promoter mutation in Neisseria gonorrhoeae II J. Antimicrob. Chemother. 2001. - Vol. 47. - P. 651 -654.

55. Cousin S.L.J., Whittington W.L., Roberts M.C. Acquired macrolide resistance genes and the 1 bp deletion in the mtrR promoter in Neisseria gonorrhoeae //J. Antimicrob. Chemother.-2003. Vol. 51,№ l.-P. 131-133.

56. Veal W.L., Nicholas R.A., Shafer W.M. Overexpression of the MtrC-MtrD-MtrE Efflux Pump Due to an mtrR Mutation Is Required for Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 5619-5624.

57. Ropp P.A., Ни M., Olesky M., Nicholas R.A. Mutations in ponA, the Gene Encoding Penicillin-binding Protein 1, and a novel Locus, penC, are required for high-level Chromosomally mediated penicillin resistance in

58. N.gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46, № 3. - P. 769-777.

59. Neeling A.J., Santen-Verheuvel M., Spaargaren J., Willems R.J.L. Antimicrobial Resistance of Neisseria gonorrhoeae and emerging ciprofloxacin resistance in the Netherlands, 1991 to 1998 // Antimicrob. Agents Chemother. -2000.-Vol. 44.-P. 3184-3185.

60. Nikaido H. Multiple antibiotic resistanse and efflux // Curr. Opin. Microbial. 1998.-Vol. 1. P. 516-523.

61. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Control and Prevention Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR Morb Mortal WklyRep 1989; 38:S8.

62. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1993; 42 (RR-14):4-5.

63. Верещагин B.A., Ильина E.H., Малахова M.B., Зубков М.М., Сидоренко С.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Устойчивость к фторхинолонам среди Российских изолятов Neisseria gonorrhoeae // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2005. - Т.1. - С. 23-27.

64. Belland R.J., Morrison S.G., Ison С., Huang W.M. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in ana-logous regions of gyrA and parC in fluoroquinolone-resistant isolates 11 Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 14. - P. 371380.

65. Deguchi Т., Yasuda M., Asano M., Tada К., Iwata H., Komeda H., et al. DNA gyrase mutations in fluoro-quinolone-resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 1995. Vol. 39. - P. 561-563.

66. Trees D.L., Sandul A.L., Whittington W.L., Knapp J.S. Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacin-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol. 42. P. 2103-2105.

67. Corkill J.E., Percival A., Lind M. Reduced uptake of ciprofloxacin in a resistant strain of Neisseria gonorrhoeae and transformation of resistance to other strains // J. Antimicrob. Chemother. 1991. - Vol. 28. - P. 601-604.

68. Tanaka M., Fukuda H., Hirai K., Hosaka M., Matsumoto Т., Kumazawa J. Reduced uptake and accumulation of norfloxacin in resistant strains of Neisseria gonorrhoeae isolated in Japan. // Genitourin. Med. 1994. - Vol. 70. P. 253-255.

69. Poole K. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-negative bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2233-2241.

70. Rouquette-Loughlin C, Dunham SA, Kuhn M, Balthazar JT, Shafer WM. The NorM Efflux Pump of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis Recognizes Antimicrobial Cationic Compounds // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, №3.- 1101-1106.

71. Luna V.A., Cousin S. Jr, Whittington W. L., and Roberts M. C. Identification of the conjugative mef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, №9. -P. 2503-2506.

72. Ng L-K, Martin I., Liu G., Bryden L. Mutation in 23S rRNA Associated with Macrolide Resistance in Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46, № 9. - P. 3020-3025.

73. Сидоренко С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра действия: клиническое значение и методы детекции // Инфек. антимикроб, терап.2002. Т.4 - №6. - С. 23-29

74. Wang S.A., Lee M.V., O'Connor N., et al. Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to cefixime Hawaii, 2001 // Clin. Infect. Dis. - 2003. Vol. - 37. P. 849-852.

75. Australian Gonococcal Surveillance Programme. Annual report of the Australian Gonococcal Surveillance Programme, 2002 // Commun. Dis. Intell.2003.-Vol. 27.-P.l 89-95.

76. Tanaka M., Nakayama H., Notomi Т., et al. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in Japan, 1993 to 2002: continuous increasing of ciprofloxacin-resistant isolates // Int. J. Antimicrob. Agents 2004. - 24S:S15-22.

77. Ray K., Bala M., Kumari S., Narain J.P. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in selected World Health Organization Southeast Asia Region countries: an overview // Sex. Transm. Dis. 2005. - Vol. 32. - P. 17884.

78. Ito M., Deguchi Т., Mizutani K.S., et al. Emergence and spread of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates harboring mosaic-like structure of penicillin-binding protein 2 in central Japan I I Antimicrob. Agents Chemother. -2005.-Vol. 49.-P. 137-143.

79. Galimand M., Gerbaund G., Courvalin P. Spectinomycin Resistance in Neisseria spp. Due to Mutations in 16S rRNA // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, № 5. - P. 1365-1366.

80. Marta C.C., Olga A.S., Olga M.N., Aida P.R.H. In vitro Comparison of Disk Diffusion and Agar Dilution Antibiotic Susceptibility Test Methods for Neisseria gonorrhoeae II Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 1998. - Vol. 93, № 4. - P. 517-522.

81. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9. 1999. - V.19. - N.l.

82. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. EUCAST Definitive document // Clin. Microbiol. Infect. -1998. Vol. 4.-P. 291-296.

83. Courvalin P. Genotypic approach to the study of bacterial resistance to antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 1991. - Vol. 35, № 6. - P. 10191023.

84. Tenover B. F. C., Kirby W. and Crick. Antimicrobial susceptibility testing in the molecular era // ASM News. 1992. - Vol. 58. - P. 669-672.

85. Lapierre P, Huletsky A, Fortin V, Picard FJ, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Real-Time PCR Assay for Detection of Fluoroquinolone Resistance Associated with grlA Mutations in Staphylococcus aureus II J. Clin. Microbiol. 2003.-Vol.41. - P. 3246-3251.

86. Bergeron M.G., Ouellette M. Preventing Antibiotic Resistance through Rapid Genotypic Identification of Bacteria and of Their Antibiotic Resistance Genes in the Clinical Microbiology Laboratory // J. Clin. Microbiol. 1998. - P. 2169-2172.

87. Pitt T.L., Saunders N.A. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for the millennium. 2000. - J. Clinical. Pathol. - Vol. 53. - P. 71-75.

88. Fluit C., Visser M.R., and Schmitz F.-J. Molecular detection of antimicrobial resistance // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol.14. - P. 836-871.

89. Woodford N., Sundsfjord A. Molecular detection of antibiotic resistance: when and where? // J. Antimicrob. Chemother. 2005. - Vol. 56. - P. 259-261.

90. Persing DH, Relman DA, Tenover FC. Genotypic detection of antimicrobial resistance, p. 33-57. In D. H. Persing (ed.), PCR protocols for emerging infectious diseases. ASM Press, Washington, D.C., 1996.

91. Иванов И., Ершов Г., Барский В., Бельговский А., Кириллов Е., Крейндлин Э., Паринов С., Мологина Н., и Мирзабеков А. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах // Мол. Биол. -1997.-Т.31.-С. 159-167.

92. Storm N., Darnhofer-Demar В., van den Boom D., Rodi C.P. 2002. MALDI-TOF Mass Spectrometry-Based SNP Genotyping // Meth. Mol. Biol. -Vol. 212.-P. 241-262.

93. Nordhoff E., Luebbert C., Thiele G., Heiser V. and Lehrach H. Rapid determination of short DNA sequences by the use of MALDI-MS // Nucl. Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 86-92.

94. Camarena J.J., Nogueira J. M., Dasi M. A., Moreno F., Garcia R., Ledesma E., Llorca J., Hernandez J. DNA amplification fingerprinting for subtyping Neisseria gonorrhoeae strains I I Sex. Transm. Dis. 1995. - Vol. 22. -P. 128 - 136.

95. Poh С. L., Ramachandran V., Tapsall J. W. Genetic diversity of Neisseria gonorrhoeae IB-2 and IB-6 isolates revealed by whole-cell repetitive element sequence-based PCR // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 292 -295.

96. Palmer H.M., Arnold C. Genotyping Neisseria gonorrhoeae Using Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39, № 6. - P. 2325 - 2329.

97. Poh CL, Lau QC. Subtyping of Neisseria gonorrhoeae auxotype-serovar groups by pulsed-field gel-electrophoresis // J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 38.-P. 366 - 370.

98. Xia M., Whittington W.L., Holmes K.K., PIuMmer F.A., Roberts M.C. Pulsed-field gel electrophoresis for genomic analysis of Neisseria gonorrhoeae //J. Infect. Dis. 1995. - Vol.171. - P. 455-458.

99. Ng L., Carballo M., Dillon J.R. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae isolates requiring proline, citrulline, and uracil by plasmid content, serotyping, and pulsed-field gel electrophoresis // J. Clin. Microbiol. 1995. - P. 1039 -1041.

100. Cooke SJ, de la Paz H, La Poh C, Ison CA, Heckels JE. Variation within serovars of Neisseria gonorrhoeae detected by structural analysis of outer-membrane protein PIB and by pulsed-field gel electrophoresis // Microbiol. 1997.-Vol. 143.-P. 1415 1422.

101. Gurtler V, Stanisich VA. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S- 23S rDNA spacer region //Microbiol. 1996. - Vol. 142. -P. 3-16.

102. Heyndrickx M, Vauterin K, Vandamme P, Kerstens K, De Vos P. Applicability of combihed amplified ribosomal DNA // 1996;

103. O Rourke M., Ison CA, Renton AM, Spratt BG. Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea // Mol. Microbiol. -1995.-Vol. 8.-P. 151-156.

104. Van Looveren M, Ison CA, Ieven M, Vandamme P, Martin IM, Vermeulen K, Renton A, Goossens H. Evaluation of the Discriminatory Power of Typing Methods for Neisseria gonorrhoeae. // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol.37. P.2183-2188.

105. Lau QC, Chow VT, Poh CL. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae strains by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of outer membrane protein IB genes // Genitourin. Med. 1995. -Vol.71, No. 6.-P.363-366.

106. Gotschlich EC, Seiff ME, MS Blake, Koomey M. Porin protein of Neisseria gonorrhoeae: cloning and gene structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987.-Vol. 84. -P. 8135-8139.

107. Butt NJ, Lambden PR, Heckels JE. The nucleotide sequence of the por gene from Neisseria gonorrhoeae strain P9 encoding outer membrane protein PIB // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18, No. 14. - P. 4258.

108. Poh CL, Lau QC, Chow VT. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae IB-3 and IB-7 serovars by direct sequencing of protein IB gene and pulsed-field gel electrophoresis // J. Med. Microbiol. - 1995. - Vol 43. - P. 201-207.

109. Fudyk TC, Maclean IW, Simonsen JN, Njagi EN, Kimani J, Brunham RC, Plummer FA. Genetic Diversity and Mosaicism at the por Locus of Neisseria gonorrhoeae //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, No. 18. - P.5591-5599.

110. Viscidi RP, Demma JC, Gu J, Zenilman J. Comparison of Sequencing of the por Gene and Typing of the opa Gene for Discrimination of Neisseria gonorrhoeae Strains from Sexual Contacts // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4430-4438.

111. Thompson DK, Deal CD, Ison CA, Zenilman JM, Bash MC. Typing System for Neisseria gonorrhoeae Based on Biotinylated Oligonucleotide Probes to PIB Gene Variable Regions // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 1652-1660.

112. De la Fuente L, Vazquez JA. Multilocus enzyme analysis of African type penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae (PPNG) strains isolated in Spain. // Sex. Transm. Dis. 1991. - Vol.18. -P.l50-152.

113. Poh CL, Ocampo JC, Loh GK. Genetic relationships among Neisseria gonorrhoeae serovars analysed by multilocus enzyme electrophoresis // Epidemiol. Infect. 1992. - Vol. 108. - P. 31-38.

114. O'Rourke M, Stevens E. Genetic structure of Neisseria gonorrhoeae populations: a non-clonal pathogen // J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol. 139. - P. 2603-2611.

115. Gutjahr TS, O'Rourke M, Ison CA, Spratt BG. Arginine-, hypoxanthine-, uracil-requiring isolates of Neisseria gonorrhoeae are a clonal lineage within a non-clonal population // Microbiol. 1997. - Vol. 143. - P. 633-640.

116. Viscidi RP, Demma JC. Genetic Diversity of Neisseria gonorrhoeae Housekeeping Genes // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41 - P. 197-204.

117. Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry // Anal. Chem. 1975. - Vol.47. - P. 219-225.

118. Despeyroux D, Phillpotts R, Watts P. Electrospray mass spectrometry for detection and characterization of purified cricket paralysis virus (CrPV) // Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1996 . - Vol. 10. - P.937-941.

119. Krishnamurthy T, Ross PL, Rajamani U. Detection of pathogenic and non-pathogenic bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 1996. - Vol. 10. -P. 883-888.

120. Fenselau C, Demirev PA. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr. Rev. 2001. - Vol. 20. - P. 157-171.

121. Lynn EC, Chung MC, Tsai WC, Han С С. Identification of Enterobacteriaceae Bacteria by Direct Matrix-assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometric Analysis of Whole Cells // Rapid Comm. Mass Spectrom. 1999. - Vol.13. - P. 2022-2027.

122. Edwards-Jones V, Claydon MA, Evason DJ, Walker J, Fox AJ, Gordon DB. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant

123. Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry // J. Med. Microbiol. -2000.-Vol. 49.-P. 295-300.

124. Hettick JM, Kashon ML, Simpson JP, Siegel PD, Mazurek GH, Weissman DN. Proteomic Profiling of Intact Mycobacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // Anal. Chem. -2004.-Vol. 76.-P. 5769-5776.

125. Kumar MP, Vairamani M, Raju RP, Lobo C, Anbumani N, Kumar CP, Menon T, Shanmugasundaram S. Rapid discrimination between strains of beta haemolytic streptococci by intact cell mass spectrometry // Indian J. Med. Res. -2004.-Vol. 119.-P. 283-288.

126. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9. 1999. - Vol. 19. - N.l.

127. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.H., Wertheim van Dillen P.M.E., Van der Noordaa J. Rapid and Simple method for purification of nucleic acids // J. Clinical. Microb. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

128. Turner A., Gough K.R., Leeming J.P. Molecular epidemiology of tetM genes in Neisseria gonorrhoeae II Sex. Transm. Inf. 1999. - Vol. 75. - P. 6066.

129. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Academ. Sci. USA. 1977. - Vol.74. - P. 5463-5467.

130. Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief. Bioinform. -2004.-Vol. 5.-P.l50-163.

131. Jolley KA, Feil EJ, Chan MS, Maiden MC. Sequence type analysis and recombinational tests (START) // Bioinform. 2001. - Vol.17. - P.1230-1231.

132. Simpson E. H. Measurement of diversity // Nature (London). 1949. -Vol. 163.-P. 688.

133. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol.26, №11.- P. 2465-2466.

134. Meetani MA, Voorhees KJ. MALDI Mass Spectrometry Analysis of High Molecular Weight Proteins from Whole Bacterial Cells: Pretreatment of Samples with Surfactants // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2005. - Vol.16. - P. 1422-1426.

135. Ryzhov V, Fenselau C. Characterization of the Protein Subset Desorbed by MALDI from Whole Bacterial Cells // Anal. Chem. 2001. - Vol.73. -P.746-750.

136. Arnold RJ, Reilly JP. Observation of Escherichia coli Ribosomal Proteins and Their Posttranslational Modifications by Mass Spectrometry // Anal. Biochem. 1999. - Vol. 269. - P.105-112.

137. Tapsall J. Current concepts in the managment of gonorrhoeae. Expert Opin Pharmacother. 2002. - Vol. 3. - P. 147-157.

138. Lay JO Jr. MALDI-TOF Mass Spectrometry of Bacteria // Mass Spectr. Rev.-2001.-Vol. 20. P. 172-194.

139. Olesky M, Zhao S, Rosenberg RL, Nicholas RA. Porin-Mediated Antibiotic Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Ion, Solute, and Antibiotic Permeation through PIB Proteins with penB Mutations. J. Bacteriol. - 2006. -Vol. 188,No. 7.-P. 2300-2308.

140. Shafer WM, Folster JP. Towards an Understanding of Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Evidence for a Porin-Efflux Pump Collaboration // J. Bacteriology. 2006. - Vol. 188, No. 7. - P. 2297-2299.

141. Jacoby GA, Walsh KE, Mills DM, Walker VJ, Oh P, Robicsek A, Hooper DC. qnrB, Another Plasmid-Mediated Gene for Quinolone Resistance // Antimicrob. Agents Chemoth. - 2006. - Vol. 50, No. 4. - P. 1178-1182.

142. Posada GD, Crandall KA, Nguyen M, Demma JC, Viscidi RP Population Genetics of the porB Gene of Neisseria gonorrhoeae: Different Dynamics in Different Homology // Mol. Biol. Evol. 2000. - Vol. 17, № 3. - P. 423 - 436.