Участие транскрипционных факторов USF и CTCF в регуляции синтеза белка-предшественника β-амилоида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Востров, Александр Аркадьевич

• Востров, Александр Аркадьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Востров, Александр Аркадьевич

Список сокращений.

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели исследования.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы.

1.4. Основные положения, выносимые на защиту.

1.5. Апробация работы.

1.6. Публикации.

2. Обзор литературы.

2.1. Болезнь Альцгеймера.

2.1.1. Общие сведения.

2.1.2. Характерные невропатологические черты.

2.1.3. Нейрофибриллярные сплетения.

2.1.4. Отложения амилоида. Состав амилоидных бляшек. Бета амилоидный пептид.

2.1.5. Наличие сходной патологии у больных синдромом Дауна.

2.2. Белок-предшественник амилоида (АРР).

2.2.1. Клонирование гена АРР. Первичная последовательность белка АРР. Наличие различных форм белка АРР, возникающих в результате альтернативного сплайсинга.

2.2.2. Протеолитический гидролиз белка АРР и образование бета-амилоидного пептида.

2.2.3. АРР-подобные белки.

2.2.4. Существующие гипотезы об участии белка АРР в патологических процессах при болезни Альцгеймера.

2.3. Регуляция синтеза АРР на стадии транскрипции гена. . 14 2.3.1. Промотор гена АРР. Функциональные элементы ДНК в проксимальном промоторе гена АРР, связывающие транскрипционные факторы (сайты АРВа и АРВр).

2.3.2. Другие элементы ДНК, участвущие в регуляции экспрессии гена АРР.

2.4. Транскрипционный фактор USF. Димерная структура фактора. Существование двух различных белков USF, образующих гомо- и гетеродимеры. Разнообразие сайтов ДНК, связывающих USF.

2.5. Транскрипционный фактор CTCF.

2.5.1. Необычность структуры фактора. ДНК-связывающий домен CTCF содержит 11 цинковых пальцев.

2.5.2. Использование различных комбинаций цинковых пальцев позволяет CTCF связываться с необычайно широким спектром последовательностей ДНК.

2.5.3. Полифункциональность CTCF. Участие CTCF в активации и репрессии промоторов, а также в процессах инсуляции и импринтинга.

3. Материалы и методы

3.1. Материалы.

3.1.1. ДНК

3.1.2. Антитела.

3.1.3. Экстракты ядер.

3.2. Методы.

3.3. Общие биохимические методы.

3.4. Анализ связывания белков с ДНК методом сдвига электрофоретической мобильности (ретардации электрофоретических зон).

3.4.1. Анализ белков методом сшивки с ДНК ультрафиолетовым облучением.

3.4.2. Анализ связывания белков с ДНК методом футпринтинга ДНК-азой 1.

3.4.3. Получение рекомбинантного белка CTCF.

3.4.3.1. Культивирование рекомбинантных дрожжей Pichia Pastoris.

3.4.3.2. Очистка рекомбинантного CTCF.

3.4.4. Транскрипция in vitro.

4. Результаты.

4.1. USF связывается с АРВа последовательностью промотора гена АРР.

4.1.1. Белки экстракта ядер клеток HeLa , мозга быка и мозга крысы образуют сходные комплексы с AdMLP, CDEI и АРВа мотивами ДНК.

4.1.2 AdMLP, CDEI и АРВа последовательности ДНК связывают одни и те же ядерные белки.

4.1.3 Транскрипт человеческого гомолога гена CDEBP мыши подвергается альтернативному сплайсингу.

4.1.4 Синтезированные in vitro белки USF связываются с AdMLP, CDEI и АРВа элементами ДНК.

4.1.5 Антитела против USF43 реагируют с белками, связывающимися с АРВа элементом промотора гена АРР.

4.2 CTCF связывается с АРВр последовательностью промотора гена

4.2<1 Цвиттерионный детергент CHAPS позволяет зарегистрировать связывание очищенного ядерного белка с АРВр последовательностью.

4.2.|2 Идентификация методом ультрафиолетовой сшивки 140 «Да белка, связывающегося с АРВр элементом.

4.2J 3 Частично очищенные фракции экстракта ядер клеток HeLa, демонстрирующие связывание с АРВр последовательностью, содержат CTCF - белок с кажущейся молекулярной массой

140 «Да.

4.2]4 АРВр элемент в промоторе гена АРР и сайт связывания CTCF в промоторе гена с-тус курицы конкурируют за связывание с одним и тем же ядерным фактором

4.2J5 Антитела против пептидов из последовательности CTCF узнают белок, связывающийся с АРВр элементом.

4.2.16 Связывание CTCF с АРВр элементом активирует промотор гена АРР in vitro.

4.3 CTCF регулирует усиление экспрессии гена АРР в процессе дифференциации нейронов гиппокампа крысы.

4.3J1 CTCF и USF связываются с промотором гена АРР в культивированных нейронах гиппокампа.

4.312 В процессе дифференцировки нейронов количество CTCF в клетке, способного к связыванию с промотором гена АРР, возрастает многократно.

4.313 Замена последовательности, прилегающей к АРВр-сайту с 5'-стороны, на последовательность векторной ДНК приводит к снижению эффективности связывания CTCF с сайтом.

4.4 Очистка рекомбинантного белка CTCF экспрессированного в Pichia Pastoris.

4.4.1 Экспрессия CTCF в дрожжах и получение грубого экстракта.

4.4.2 Катион-обменная хроматография на SP-сефарозе.

4.4]3 Аффинная хроматография на Ni-сефарозе.

4.4.14 Хроматография на гепарин-сефарозе.

4.5 Влияние делеций индивидуальных цинковых пальцев на связывание CTCF с АРВр последовательностью промотора гена АРР.

4.5.1 Для связывания с АРВр элементом промотора гена АРР, необходимо присутствие цинковых пальцев №5, №6 и №7 в молекуле CTCF.

4.5.|2 В молекуле CTCF, при связывании с АРВр элементом промотора гена АРР, N-концевые цинковые пальцы располагаются на ДНК ближе к транскрипционному старту.

4.5.3 Делеции периферических цинковых пальцев снижают стабильность комплекса CTCF с АРВр элементом промотора гена АРР.

4.5.|4 Замена последовательности, прилегающей к АРВр-сайту с 5'-стороны, на последовательность векторной ДНК приводит к изменению картины футпринтинга ДНК-азой I. . 85 4.6 N-концевая часть белка CTCF необходима для активации транскрипции с промотора гена АРР.

4.6.11 Истощение ядерного экстракта антителами против CTCF приводит к снижению транскрипционной активности промотора гена АРР.

4.6.12 Добавление рекомбинантного CTCF к истощённому ядерному экстракту восстанавливает активность промотора гена АРР.

4.6]3 N-концевая часть белка CTCF необходима для активации транскрипции с промотора гена АРР.

5 Обсуждение.

6 Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие транскрипционных факторов USF и CTCF в регуляции синтеза белка-предшественника β-амилоида»

1.1. Актуальность проблемы.

Болезнь Альцгеймера проявляется как постепенная и прогрессирующая потеря памяти у людей пожилого возраста. При микроскопическом исследовании мозга умерших пациентов наблюдается нейродегенерация мозга, сочетающаяся с наличием в мозге внеклеточных отложений амилоида (сенильных бляшек или амилоидных бляшек), а также с присутствием внутринейронных нейрофибриллярных сплетений.

В развитых странах, в связи с увеличивающейся долей престарелых среди населения, болезнь Альцгеймера выходит на первый план среди социальных проблем. Согласно оценкам экспертов, в США этой болезнью страдают до 4-х миллионов человек, в то время как общие экономические потери превышают 100 миллиардов долларов в год.

Причины возникновения болезни Альцгеймера до сих пор окончательно не ясны. В последнее время, однако, стало ясно, что при заболевании в патологические процессы на клеточном уровне вовлечено множество различных факторов, как белковой, так и небелковой природы, роль которых в развитии болезни является предметом интенсивных исследований. Одной из наиболее пристально изучаемых в этой связи макромолекул, является белок-предшественник амилоида (amyloid precursor protein, АРР). К причинам интереса к данному белку относится тот факт, что бета-амилоидный пептид, являющийся основным компонентом сенильных бляшек /Glenner & Wong, 1984/, представляет собой фрагмент белка АРР, образующийся в результате протеолиза. Более того, мутации в гене АРР, кодирующем данный белок приводят к развитию семейной формы болезни Альцгеймера, составляющей, однако, очень малую долю в общем числе случаев заболевания /Goate et al., 1991/.

Одна из ведущих гипотез о механизме образования сенильных бляшек предполагает, что в его основе лежит дисбаланс между производством бета-амилоидного пептида и его утилизацией организмом /Гольдгабер, 2003/. В связи с этим, актуальной является задача выяснения механизма регуляции образования пептида на уровне транскрипции гена белка-предшественника, т.е. белка АРР. К моменту начала данной работы промотор гена АРР был детально изучен в структурном /Salbaum et al., 1988/ и функциональном /Quitschke, 1994/ аспектах. В участке промотора длиной примерно ~ 100 нп, примыкающем с 5'-стороны к старту транскрипции, были выделены два регуляторных элемента ДНК (сайты АРВа и АРВр), отвечающие за высокий уровень транскрипции гена /Quitschke, 1994/. Также было показано, что эти элементы ДНК специфически узнаются не идентифицированными белками из экстрактов ядер клеток HeLa и РС12. Таким образом, для дальнейшего понимания механизма регуляции транскрипции гена АРР стало необходимым решить задачу идентификации белков, связывающихся с элементами АРВа и АРВр в промоторе данного гена.

1.2. Цели исследования.

Целью исследования являлось: идентифицировать белки, связывающиеся с регуляторными элементами АРВа и АРВр в промоторе гена АРР, выяснить особенности взаимодействия данных белков с промотором.

В связи с этим перед нами встали следующие задачи:

1. Проверить ранее опубликованные данные о связывании белков USF /Bram & Kornberg, 1987/ и APLP2 /Vidal et al., 1992/ с CDEI последовательностью ДНК, сходной с АРВа элементом промотора гена АРР. Выяснить, связываются ли эти белки с АРВа элементом.

2. Выделить белок, связывающийся с АРВр элементом промотора гена АРР. Степень очистки выделенного белка должна позволить идентифицировать белок-кандидат микросеквенированием. Проверить, действительно ли данный белок связывается с АРВр элементом промотора гена АРР.

3. Выяснить, как в процессе дифференцировки изменяется в ядрах нейронов гиппокампа крысы количество белков, связывающихся с

АРВа и АРВр элементами промотора гена АРР.

4. Получить препаративные количества белка, связывающегося с АРВр элементом промотора гена АРР.

5. Выяснить, какие элементы ДНК-связывающего домена белка, узнающего АРВр сайт, взаимодействуют с 12-нуклеотидным ядром сайта и являются необходимыми для связывания белка с сайтом. Выяснить, какую роль в связывании играет взаимодействие белка с периферическими последовательностями сайта.

6. Определить, какой участок молекулы белка, связывающегося с АРВр элементом промотора гена АРР, отвечает за активацию транскрипции.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Востров, Александр Аркадьевич

6. Выводы.

1. Методами сдвига электрофоретической мобильности (ретардации), конкурентного связывания белков с ДНК, а также иммуноретардации с использованием антител против белка USF43 установлено, что транскрипционный фактор USF связывается с АРВа последовательностью в промоторе гена АРР.

2. Очищенный белок, связывающийся с АРВр последовательностью в промоторе гена АРР, идентифицирован, как ядерный фактор CTCF. Факт связывания CTCF с АРВр элементом подтвержден методом конкурентного связывания белков с ДНК, а также комбинацией сдвига уэлектрофоретической мобильности q Вестерн блоттингом.

3. Разработана процедура препаративной очистки рекомбинантного белка CTCF из дрожжей Pichia Pastoris, включающая в себя катион-обменную хроматографию на SP-сефарозе, аффинную хроматографию на Ni-сефарозе и хроматографию на гепарин-сефарозе.

4. Методами сдвига электрофоретической мобильности, конкурентного связывания белков с ДНК, а также иммуноретардации показано что белки USF и CTCF связываются с элементами АРВа и АРВр промотора гена АРР в ядрах дифференцирующихся нейронов гиппокампа крысы. Количественная оценка комплексов ядерных белков USF и CTCF с радиоактивно меченными олигонуклеотидами методом сдвига электрофоретической мобильности показала, что в процессе дифференцировки нейронов количество CTCF в клетках возрастает у pUr -/ s,— примерно в 5 раз, а количество USF - примерно в 2 раза. Результаты экспериментов по конкурентному связыванию CTCF с делеционными вариантами промотора гена АРР в совокупности с полученными ранее данными опытов по транзиентной трансфекции свидетельствуют о том, что количество CTCF в данных клетках является фактором, лимитирующим активность промотора гена АРР.

5. Методом сдвига электрофоретической мобильности с использованием вариантов белка CTCF, несущих индивидуальные делеции цинковых пальцев, а также методом футпринтинга ДНК-азой I, показано, что во взаимодействии CTCF с АРВр промоторным сайтом ДНК принимают участие цинковые пальцы с №1 по №9. При этом критическим является взаимодействие цинковых пальцев №5, №6 и №7 с последовательностью промотора, расположенной мехзду нуклеотидами в позиции -94 и в позиции -83. Исследование кинетики диссоциации комплексов CTCF с АРВр элементом ДНК позволило утвериодать, что периферические цинковые пальцы усиливают связывание CTCF с элементом.

6. Методом транскрипции in vitro с использованием экстракта ядер клеток HeLa, истощённого антителами против CTCF, получены прямые доказательства того, что, в контексте промотора гена АРР, CTCF является активатором транскрипции. Путём восстановления специфической транскрипционной активности истощённого ядерного экстракта добавлением делеционных вариантов рекомбинантного белка CTCF показано, что в осуществлении транскрипционной активации принимает участие N-концевая часть белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Востров, Александр Аркадьевич, 2004 год

1. Гольдгабер Д.Я. Молекулярные основы болезни Альцгеймера. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Москва, 2003.

2. Bahmanyar S, Higgins GA, Goldgaber D, Lewis DA, Morrison JH, Wilson MC, Shankar SK, Gajdusek DC. (1987) Localization of amyloid beta protein messenger RNA in brains from patients with Alzheimer's disease. Science. 237, 77-80

3. Bell AC, West AG, Felsenfeld G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98, 387-96

4. Bourbonniere M, Nalbantoglu J. (1996) The helix-loop-helix transcription factor USF interacts with the basal promoter of human amyloid precursor protein. Brain Res Mol Brain Res. 35, 304-8

5. Bram RJ, Kornberg RD. Isolation of a Saccharomyces cerevisiae centromere DNA-binding protein, its human homolog, and its possible role as a transcription factor. Mol Cell Biol. 1987 Jan;7(1):403-9

6. Carthew RW, Chodosh LA, Sharp PA. (1987) The major late transcription factor binds to and activates the mouse metallothionein I promoter. Genes Dev. 1, 973-80.

7. Chernak JM. (1993) Structural features of the 5' upstream regulatory region of the gene encoding rat amyloid precursor protein. Gene. 133, 255-60.

8. Chodosh LA, Carthew RW, Morgan JG, Crabtree GR, Sharp PA. (1987) The adenovirus major late transcription factor activates the rat gamma-fibrinogen promoter. Science. 238, 684-8.

9. Cotman C.W., Cummings В.J., and Pike C.J. (1993) Molecular cascade in adaptive versus pathological plasticity. Neurodegeneration II (Gorio A., ed.), pp. 217-240. Raven Press, New York.

10. Danilition SL, Frederickson RM, Taylor CY, Miyamoto NG. (1991) Transcription factor binding and spacing constraints in the human beta-actin proximal promoter. Nucleic Acids Res. 19, 6913-22.

11. Dawirs RR, Teuchert-Noodt G, Kacza J. (1992) Naturally occurring degrading events in axon terminals of the dentate gyrus and stratum lucidum in the spiny mouse (Acomys cahirinus) during maturation, adulthood and aging. Dev Neurosci. 14, 210-20.

12. Ellis J, Talbot D, Dillon N, Grosveld F. (1993) Synthetic human beta-globin 5'HS2 constructs function as locus control regions only in multicopy transgene concatamers. EMBOJ. 12, 127-34.

13. Glenner, G.G., and Wong, C.W. (1986) Alzheimer's disease: Initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 6084-6089

14. Goldgaber, D., Lerman, M.I., McBride, O.W., Saffiotti, U. and Gaidusek, D.C. (1987) Characterization and chromosomal localization of a cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease. Science 235, 877-884

15. Goldgaber D, Harris HW, Hla T, Maciag T, Donnelly RJ, Jacobsen JS, Vitek MP, Gajdusek DC. (1989) Interleukin 1 regulates synthesis of amyloid beta-protein precursor mRNA in human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 7606-10

16. Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M, Brown J, Crawford F, Fidani L, Giuffra L, Haynes A, Irving N, James L, et al. (1991) Segregation of amissense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349, 704-6.

17. Gregor PD, Sawadogo M, Roeder RG. (1990) The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimer. Genes Dev. 4, 1730-1740

18. Gu J, Stephenson CG, ladarola MJ. (1994) Recombinant proteins attached to a nickel-NTA column: use in affinity purification of antibodies. Biotechniques. 17, 257, 260, 262.

19. Hark AT, Schoenherr CJ, Katz DJ, Ingram RS, Levorse JM, Tilghman SM. (2000) CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/lgf2 locus. Nature. 405(6785):486-9.

20. Hoffman PW, Chernak JM. (1994) The rat amyloid precursor protein promoter contains two DNA regulatory elements which influence high level gene expression. Biochem Biophys Res Commun. 201, 610-617

21. Kang, J., Lemaire, H.-G., Unterbeck, A., Salbaum, M.J., Masters, C.L., Grzeschik, K.H., Multhaup G., Beyreuther K., Muller-Hill B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature 325, 733-736.

22. Klenova EM, Fagerlie S, Filippova GN, Kretzner L, Goodwin GH, Loring G,

23. Neiman РЕ, Lobanenkov W. (1998) Characterization of the chicken CTCF genomic locus, and initial study of the cell cycle-regulated promoter of the gene. J Biol Chem. 273, 26571-9.

24. Korhonen P, Huotari V, Soininen H, Salminen A. (1997) Glutamate-induced changes in the DNA-binding complexes of transcription factor YY1 in cultured hippocampal and cerebellar granule cells. Brain Res Mol Brain Res. 52, 3303.

25. Kovacs DM, Wasco W, Witherby J, Felsenstein KM, Brunei F, Roeder RG, Tanzi RE. (1995)The upstream stimulatory factor functionally interacts with the Alzheimer amyloid beta-protein precursor gene. Hum Mol Genet. 4, 152733.

26. La Fauci G, Lahiri DK, Salton SR, Robakis NK. (1989) Characterization of the 5'-end region and the first two exons of the beta-protein precursor gene. Biochem Biophys Res Commun. 159, 297-304.

27. Lee TC, Shi Y, Schwartz RJ. (1992) Displacement of BrdUrd-induced YY1 by serum response factor activates skeletal alpha-actin transcription in embryonic myoblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 9814-8.

28. Lukiw WJ, Rogaev El, Wong L, Vaula G, McLachlan DR, St George Hyslop P. (1994) Protein-DNA interactions in the promoter region of the amyloid precursor protein (APP) gene in human neocortex. Brain Res Mol Brain Res. 22,121-31.

29. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY.

30. Marquez-Sterling NR, Lo AC, Sisodia SS, Koo EH. (1997) Trafficking of cell-surface beta-amyloid precursor protein: evidence that a sorting intermediate participates in synaptic vesicle recycling. J Neurosci. 17,140-51.

31. Masliah E, Fagan AM, Terry RD, DeTeresa R, Mallory M, Gage FH. (1991) Reactive synaptogenesis assessed by synaptophysin immunoreactivity is associated with GAP-43 in the dentate gyrus of the adult rat. Exp Neurol. 113, 131-42.

32. Morimoto T, Ohsawa I, Takamura C, Ishiguro M, Kohsaka S. (1998) Involvement of amyloid precursor protein in functional synapse formation in cultured hippocampal neurons. J Neurosci Res. 51,185-95.

33. Morishima M, lhara Y. (1994) Posttranslational modifications of tau in paired helical filaments. Dementia. 5, 282-8.

34. Murre C, McCaw PS, Baltimore D. (1989) A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins. Cell. 56, 777-83.

35. Pollwein P, Masters CL, Beyreuther K. (1992) The expression of the amyloid precursor protein (APP) is regulated by two GC-elements in the promoter. Nucleic Acids Res. 20, 63-68

36. Pollwein P. (1993) Overlapping binding sites of two different transcription factors in the promoter of the human gene for the Alzheimer amyloid precursor protein. Biochem Biophys Res Commun. 190, 637-47.

37. Potter JJ, Cheneval D, Dang CV, Resar LM, Mezey E, Yang VW. (1991) The upstream stimulatory factor binds to and activates the promoter of the rat class I alcohol dehydrogenase gene. J Biol Chem. 266, 15457-63.

38. Quitschke WW, Lin ZY, DePonti-Zilli L, Paterson BM. (1989) The beta actin promoter. High levels of transcription depend upon a CCAAT binding factor. J Biol Chem. 264, 9539-46.

39. Quitschke WW, Goldgaber D. (1992) The amyloid beta-protein precursor promoter. A region essential for transcriptional activity contains a nuclearfactor binding domain. J Biol Chem. 267, 17362-17368

40. Quitschke WW. (1994) Two nuclear factor binding domains activate expression from the human amyloid beta-protein precursor promoter. J Biol Chem. 269, 21229-21233.

41. Quitschke WW, Matthews JP, Kraus RJ, Vostrov AA. (1996) The initiator element and proximal upstream sequences affect transcriptional activity and start site selection in the amyloid beta-protein precursor promoter. J Biol Chem. 271, 22231-9.

42. Quitschke WW, Taheny MJ, Fochtmann LJ, Vostrov AA. (2000) Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene. Nucleic Acids Res. 28, 3370-8

43. Selkoe, D.J. (1997) Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments. Science. 275,630-631.

44. Salbaum JM, Weidemann A, Lemaire HG, Masters CL, Beyreuther K. (1988) The promoter of Alzheimer's disease amyloid A4 precursor gene. EMBO J. 7, 2807-2813

45. Sawadogo M, Roeder RG. (1985) Interaction of a gene-specific transcription factor with the adenovirus major late promoter upstream of the TATA box region. Cell. 43, 165-175

46. Sawadogo M, Van Dyke MW, Gregor PD, Roeder RG. (1988) Multiple forms of the human gene-specific transcription factor USF. I. Complete purification and identification of USF from HeLa cell nuclei J Biol Chem. 263, 1198511993

47. Schwarzman AL, Gregori L, Vitek MP, Lyubski S, Strittmatter WJ, Enghilde JJ, Bhasin R, Silverman J, Weisgraber KH, Coyle PK, et al. (1994)

48. Transthyretin sequesters amyloid beta protein and prevents amyloid formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8368-72.

49. Scotto KW, Kaulen H, Roeder RG. (1989) Positive and negative regulation of the gene for transcription factor IIIA in Xenopus laevis oocytes. Genes Dev. 3, 651-62.

50. Selkoe, D.J. (1997) Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments.Science. 275,630-631.

51. Sinha S, M^ity SN, Lu J, de Crombrugghe B. (1995) Recombinant rat CBF-C, the third subunit of CBF/NFY, allows formation of a protein-DNA complex with CBF-A and CBF-B and with yeast HAP2 and HAP3. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 1624-8.

52. Sinha S, Maity SN, Seldin MF, de Crombrugghe B. (1996) Chromosomal assignment and tissue expression of CBF-C/NFY-C, the third subunit of the mammalian CCAAT-binding factor. Genomics. 37, 260-3.

53. Sirito M, Walker S, Lin Q, Kozlowski MT, Klein WH, Sawadogo M. (1992) Members of the USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo- as well as heterodimers. Gene Expr. 2, 231-240

54. Small DH. (1998) The role of the amyloid protein precursor (APP) in Alzheimer's disease: does the normal function of APP explain the topography of neurodegeneration? Neurochem Res. 23, 795-806.

55. St George-Hyslop PH. (2000) Genetic factors in the genesis of Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 924,1-7.

56. Stewart MJ, Dipple KM, Stewart TR, Crabb DW. (1996) The role of nuclear factor NF-Y/CP1 in the transcriptional regulation of the human aldehyde dehydrogenase 2-encoding gene. Gene. 173,155-61.

57. Ulaner GA, Yang Y, Hu JF, Li T, Vu TH, Hoffman AR. (2003) CTCF binding at the insulin-like growth factor-ll (IGF2)/H19 imprinting control region is insufficient to regulate IGF2/H19 expression in human tissues Endocrinology. 144, 4420-6.

58. Vidal F, Blangy A, Rassoulzadegan M, Cuzin F. (1992) A murine sequence-specific DNA binding protein shows extensive local similarities to the amyloid precursor protein. Biochem Biophys Res Commun. 189, 1336-41.

59. Vostrov AA, Quitschke WW, Vidal F, Schwarzman AL, Goldgaber D. (1995) USF binds to the APB alpha sequence in the promoter of the amyloid beta-protein precursor gene. Nucleic Acids Res. 23, 2734-2741.

60. Vostrov AA, Quitschke WW. (1997) The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation . J Biol Chem. 272, 33353-9

61. Vostrov AA, Taheny MJ, Quitschke WW. (2002) A region to the N-terminal side of the CTCF zinc finger domain is essential for activating transcriptionfrom the amyloid precursor protein promoter J Biol Chem. 277,1619-27.

62. Yang Y, Quitschke WW, Vostrov AA, Brewer GJ. (1999) CTCF is essential for up-regulating expression from the amyloid precursor protein promoter during differentiation of primary hippocampal neurons. J Neurochem. 73, 2286-2298

63. Выражаю свою искреннюю благодарность всем коллегам, без помощи и участия которых было бы невозможным выполнение этой работы.

64. Выражаю глубочайшую благодарность своему научному руководителю Наталье Дмитриевне Ещенко за огромную помощь в получении результатов и в написании данной работы, а также за терпение и понимание.

65. Благодарю сотрудников кафедры Биохимии СпбГУ за помощь и участие. Спасибо Людмиле Ивановне Тищенко за конструктивную критику, приведшую к значительному улучшению данной работы.

66. Благодарю всех своих коллег, в соавторстве с которыми были получены и опубликованы приведённые в этой диссертации результаты. Хочу упомянуть в их числе Майкла Тахени, Яошинга Янга, Грегори Бревера и Лору Фохтман.