Участие клеточных элементов тканей внутренней среды в формировании внеклеточного матрикса у медузы Aurelia aurita и асцидий Styela rustica, Boltenia echinata и Molgula citrina тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.11, кандидат биологических наук Шапошникова, Татьяна Григорьевна

• Шапошникова, Татьяна Григорьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шапошникова, Татьяна Григорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мезоглея и мезоглеальные клетки кишечнополостных

Морулярные клетки и туника асцидий

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мезоглея и мезоглеальные клетки Aurelia aurita

Туника и морулярные клетки асцидий

ОБСУЖДЕНИЕ

Мезоглея и мезоглеальные клетки A. aurita.

Туника и морулярные клетки асцидий

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие клеточных элементов тканей внутренней среды в формировании внеклеточного матрикса у медузы Aurelia aurita и асцидий Styela rustica, Boltenia echinata и Molgula citrina»

Внеклеточный матрикс (ВКМ) имеется у всех многоклеточных животных и может составлять значительную часть объема их тканей (Заварзин, 1985; Албертс и др., 1994). Молекулярный состав ВКМ очень сложен, и сведения по его организации фрагментарны. ВКМ активно участвует в регуляции множества процессов, происходящих в организме, начиная с самых первых шагов эмбрионального развития. Он определяет форму контактирующих с ним клеток, их миграцию, пролиферацию, метаболизм и т.д. Велика роль ВКМ в защитных реакциях организма - тонко координированных многоступенчатых процессах. ВКМ - межклеточное вещество - является основой опорных тканей; в функциональной деятельности последних развитый внеклеточный матрикса играет ведущую роль.

Взаимодействие клеток и межклеточного матрикса, естественно, не ограничивается только влиянием матрикса на клетки - не меньшее значение для функционирования матрикса имеет и жизнедеятельность клеток, и в частности, синтез внеклеточного матрикса. Основными его продуцентами являются клетки эпителиев и тканей внутренней среды. Так, например, базальные мембраны синтезируются эпителиальными клетками, а матрикс соединительных тканей вырабатывается фибробластами - специализированными клетками тканей внутренней среды.

Основная масса исследований, посвященных ВКМ, проводится на позвоночных животных - и преимущественно млекопитающих (традиционных объектах лабораторных исследований). Результаты исследований ВКМ позвоночных непосредственно используются в медицине для создания новых способов лечения ран, лечебной косметики и т.д.

Однако вопрос о становлении процессов синтеза ВКМ и его организации в эволюции весьма слабо изучен - сведения о составе и синтезе ВКМ беспозвоночных животных в мировой литературе крайне фрагментарны.

Сравнительный анализ структуры ВКМ и процессов его синтеза на широком круге объектов, находящихся на разных ступенях эволюционного развития, предоставляет ценный материал для изучения закономерностей формирования, функционирования и эволюции ВКМ, а, следовательно, позволяет выявить как общие закономерности, так и специфические особенности организации тканей внутренней среды у представителей разных таксонов.

В качестве модельных объектов для такого рода исследований определенный интерес представляют кишечнополостные и асцидии - филогенетически удаленные друг от друга группы многоклеточных с хорошо развитым ВКМ. В пределах группы кишечнополостных, недалеко ушедших от истоков возникновения Ме1агоа, возможно проследить становление тканей внутренней среды на примере развития мезоглеи - аналога рыхлых соединительных тканей позвоночных животных (Заварзин, 1945; Горышина, Чага, 1990; Напара, 1995). Асцидии же, как известно, находятся у основания ветви хордовых, ткани внутренней среды у которых получают впоследствии максимальное развитие (Горышина, Чага, 1990).

Обе группы, к тому же, представляют собой традиционные объекты сравнительно-гистологических исследований на кафедре цитологии и гистологии СПбГУ, благодаря чему за предшествующие годы был накоплен большой материал по морфо-функциональной организации некоторых тканевых систем этих животных. (Чага, 19806, 1998а, б, в; Оскольский, 1989; Напара, 1995).

Внеклеточный матрикс обеспечивает выполнение опорной функции -одной из основных функций туники асцидий и мезоглеи кишечнополостных. Было показано, что ВКМ представителей обеих групп синтезируется покровным эпителием (Chapman D., 1974; Goodbody, 1974; Чага, Соловей, 1986; Lub-bering et al, 1993). Однако было выдвинуто предположение, что в формировании этих типов ВКМ могут участвовать также и клеточные элементы тканей внутренней среды - клетки крови асцидий и мезоглеальные клетки медуз (Smith, 1970; Чага, 19806, 19986; Напара и др., 1994, 1996а). Прояснить этот вопрос может анализ белков ВКМ, синтезируемых клеточными элементами тканей внутренней среды, а исследование взаимодействий данных клеток и ВКМ будет способствовать пониманию общих принципов функционирования этих тканевых систем.

Целью настоящей работы являлось выявление и характеристика белков внеклеточного матрикса, синтезируемых подвижными элементами тканей внутренней среды представителей двух таксонов - Кишечнополостных и Оболочников: сцифоидной медузы Aurelia aurita (Cnidaria: Scyphozoa) и асци7 дий Styela rustica, Boltenia echinata и Molgula citrina (Tunicata: Ascidiacea). Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести авторадиографический анализ процессов синтеза межклеточного вещества мезоглеи у медуз разного возраста.

2. Определить белковый состав мезоглеи медуз, выявить мажорные белки и получить антитела против белков, которые предположительно могут синтезироваться мезоглеальными клетками.

3. Определить с помощью иммунохимических методов, участвуют ли мезоглеальные клетки в продукции данных белков.

4. Выделить фракцию морулярных клеток крови асцидий, охарактеризовать их белковый состав и получить антитела к мажорным белковым компонентам.

5. Определить локализацию этих белков с помощью полученных антител.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мезоглея и мезоглеальные клетки кишечнополостных

Кишечнополостные (Coelenterata или Cnidaria) - низшие многоклеточные животные, тело которых образовано двумя эпителиальными слоями. Между наружным (эпидерма) и внутренним (гастродерма) слоями тела расположена прослойка межклеточного вещества, называемая мезоглеей (Chapman, 1974; Догель, 1981). Степень развития мезоглеи отличается как в разных группах, так и на разных стадиях жизненного цикла - от тонкой пластинки у гидры до обширной массы у зрелых сцифомедуз. У многих кишечнополостных мезоглея не содержит клеток, однако у ряда представителей этого типа мезоглея заселена мезоглеальными клетками (Заварзин, 1945; Chapman, 1974). По своей структуре мезоглея кишечнополостных может быть весьма сложно организована и сравнима с рыхлыми соединительными тканями других животных (Заварзин, 1945).

Матрикс мезоглеи состоит из фибрилл, заключенных в аморфное вещество. Методами дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии было показано, что основная масса мезоглеальных фибрилл имеет коллагено-вую природу (Adams, 1978). Позднее биохимическими и иммунохимическими методами в составе матрикса были обнаружены фибриллярный коллаген с высокой степенью гликозилирования, фибриллярный коллаген, сходный с коллагеном V типа позвоночных, а также нефибриллярный коллаген IV типа (Franc et al., 1984; Miura, Kimura, 1985; Sarras et al., 1991; Tillet et al., 1996).

Коллагеновые фибриллы образуют в мезоглее пучки разной толщины (Chapman D, 1974).

В мезоглее гидроидных и сцифоидных медуз имеются также волокна, отличающиеся по своим химическим и физическим свойствам от коллагено-вых (Chapman G., 1959). Они выполняют функцию антагониста мускулатуры и потому были названы эластическими волокнами. Располагаются они в мезоглее в направлении от гастро- к эпидерме, поэтому второе их название - вертикальные волокна (Elder, 1973; Weber, Schmid, 1985; Оскольский, 1989). Химическая природа эластических волокон не ясна.

Что касается присутствия в мезоглее кислых гликозамингликанов, важного компонента соединительных тканей многоклеточных животных, то гистохимический анализ показал отсутствие этих веществ у актиний, гидромедуз и сидячей сцифомедузы Lucernaria quadricornis, в мезоглее же мягкого коралла Gersemia fructicosa сульфатированные гликозамингликаны присутствуют в большом количестве (Оскольский, 1989). Мезоглея сцифомедуз Cyanea arctica и Aurelia aurita по этому показателю занимает промежуточное положение (Оскольский, 1989; Напараи др., 1996).

Кроме того, в мезоглее ряда видов кишечнополостных выявлены белки, сходные с фибриллином, а также с ламинином и фибронектином, входящими в состав базальных пластин (Schmid et al., 1991; Reber-Muller et al., 1995).

У представителей класса Hydrozoa мезоглея обычно не содержит клеток (Chapman G., 1966), но у гидроидных полипов, имеющих хитиновый пери-сарк, имеются подвижные гранулярные клетки (Заварзин, 1945; Knight, 1971).

У ряда представителей классов Scyphozoa и Anthozoa мезоглея заселена свободными подвижными клетками (Chapman G., 1966). Однако выявить закономерности их появления в мезоглее кишечнополостных в целом не удается. Например, в роде Су anea у одного вида клетки в мезоглее имеются, у другого вида их нет (Наумов, 1961); на одной стадии жизненного цикла (сцифи-стома Chrysaora quinquencirrha) мезоглея содержит клетки, а на другой стадии (медуза Chrysaora quinquencirrha) клетки в мезоглее отсутствуют (Bynum, Black, 1974).

О функциях мезоглеальных клеток известно крайне мало. Описана способность этих клеток к амебоидному движению и фагоцитозу (Мечников, 1947; Праздников, Михайлова, 1962; Напара и др., 1994).

У кишечнополостных, мезоглея которых заселена мезоглеальными клетками, она приобретает внешнее сходство с соединительными тканями других животных (Заварзин, 1945; Chapman, 1974). Хотя многие авторы исследовали механизмы синтеза мезоглеи, в том числе методом авторадиографии с 3Н-пролином (Hausman, Burnett, 1971; Singer, 1974; Young, 1974; Franc et al., 1976), возможная роль мезоглеальных клеток в формировании экстраклеточного матрикса остается неясной.

Мезоглея кишечнополостных выполняет те же основные функции, что и рыхлые соединительные ткани других многоклеточных животных. Она является частью скелетной системы этих животных (Chapman G., 1974); служит антагонистом мускулатуры (Elder, 1973); выполняет транспортную функцию и, возможно, служит местом резервирования питательных веществ (Chapman

G., 1966); участвует в регуляции миграции и дифференцировки клеток в мор-фогенетических и регенерационных процессах (Sarras et al., 1993; Schmid et al., 1993; Stidwill, Christen, 1998; Frank, Rinkevich, 1999; Schmid et al., 1999). Таким образом, мезоглею, заселенную мезоглеальными клетками, можно рассматривать, как тканевую систему, сопоставимую по своим функциям с тканями внутренней среды других многоклеточных животных (Напара, Чага, 19926). Исследования взаимоотношений клеток и ВКМ, организации и синтеза межклеточного вещества мезоглеи у кишечнополостных позволяют проследить ранние этапы становления этой тканевой системы. Одним из интереснейших объектов для такого рода исследований является медуза Aurelia aurita - один из представителей класса Scyphozoa.

Обыкновенная, или ушастая, медуза A. aurita широко распространена в водах Мирового океана от арктических до тропических морей и обладает типичным жизненным циклом, в ходе которого чередуются полипоидная и ме-дузоидная стадии (Догель, 1937). Одиночные полипы (сцифистомы), прикрепленные при помощи ножки к субстрату, живут, питаются и размножаются почкованием. В определенный период начинается стробиляция - полип делится путем ряда поперечных перетяжек, в результате чего получается стопка дисков, соединенных между собой центральным стволом, стробила. Каждый диск представляет собой будущую молодую медузку, называемую эфирой. Эфиры, считающиеся особой личиночной стадией, последовательно отрываются от стробилы и переходят к плавающему образу жизни (Догель, 1981; Иванов и др., 1981). После стробиляции сцифистомы восстанавливаются и, достигнув обычных размеров, вновь приступают к почкованию. Превращение эфиры во взрослую медузу сопровождается выравниванием краев зонтика, формированием щупалец и ротовых лопастей, развитием системы пищеварительных каналов, появлением зачатков гонад. Медузы растут и, достигнув зрелости, приступают к половому размножению. Медузы раздельнополы. Оплодотворение и эмбриональное развитие протеакает в специальных карманах ротовых лопастей самок. Образующиеся планулы некоторое время плавают, а затем прикрепляются к подходящему субстрату и превращаются в сцифистом. Таким образом, А. аигЫа обладает ярко выраженным чередованием полового и бесполого поколений (метагенезом), характерным для сцифомедуз, с хорошо развитым медузоидным (половым) поколением (Догель, 1981).

Сравнение особенностей жизненного цикла А. аигЫа из водоемов с разным гидрологическим режимом выявило такие особенности жизненного цикла беломорской популяции, как синхронизацию всех стадий цикла, строгую приуроченность их к определенным сезонам, короткую продолжительность жизни медуз (Напара, 1995). Оказалось, что скорость роста медуз в Белом море в несколько раз выше, чем в других морях. После превращения эфир в медуз наступает стадия быстрого роста, которая длится около 40 - 50 дней. Масса животных в этот период удваивается каждые несколько суток, и зрелые особи достигают значительных размеров - диаметр зонтика наиболее крупных экземпляров составляет 30 - 40 см (Напара, 1995). Для поддержания высокой скорости роста требуется значительная интенсификация всех ростовых и синтетических процессов. Не исключено, что именно необходимость обеспечения интенсификации ростовых процессов у медуз А. аигЫа послужила причиной участия мезоглеальных клеток в формировании ВКМ.

Благодаря особенностям жизненного цикла беломорской популяции медузы А. аигЫа являются необыкновенно привлекательным объектом для исследований процессов синтеза и организации внеклеточного матрикса.

В мезоглее медуз А. аигНа на светооптическом уровне выделяются три компонента: аморфное основное вещество, анизотропные волокна и изотропные эластические волокна (Напара и др., 1994).

Структура основного вещества мезоглеи значительно изменяется на протяжении жизненного цикла. У ранних сцифистом основное вещество мезоглеи представлено лишь тонкой прослойкой между эпителиальными пластами, тогда как у зрелых полипов мезоглея хорошо развита. У эфир и молодых медуз нежная мезоглея обладает слабой базофилией и содержит отдельные тонкие волокна, идущие в разных направлениях. По мере роста медуз объем мезоглеи быстро увеличивается, при этом количество и толщина волокон резко возрастает (Напара и др., 1994; Напара, 1995). Коллагеновые волокна прямые и расположены в разных направлениях; эластические - лежат более упо-рядоченно: наиболее толстые из них образуют слой под эпителием эксум-бреллы, от которого вглубь мезоглеи уходят более тонкие волокна.

Мезоглея сцифомедузы А. аигЫа на всех стадиях ее жизненного цикла содержит многочисленные клетки (Напара и др., 1994). В ходе жизненного цикла А. аигЫа изменяется как морфология, так и пролиферативная активность мезоглеальных клеток.

Первые мезоглеальные клетки появляются на самых ранних стадиях развития сцифистом. Однако из какого эпителиального пласта они происходят остается неясным. По мере дальнейшего развития и роста сцифистом количество мезоглеальных клеток возрастает. Мезоглеальные клетки сцифистом способны делиться, однако их пролиферативная активность низка и увеличение числа этих клеток на данной стадии жизненного цикла, по всей видимости, связано с выселением клеток-предшественников из эпителиев (Напара, Чага, 1995). В мезоглее стробил встречается два варианта свободных клеток, различающихся по морфологии и пролиферативной активности (Напара, Чага, 19926). Клетки полипоидной части стробилы по своим характеристикам идентичны мезоглеальным клеткам сцифистом и практически не делятся. Для мезоглеальных клеток формирующихся эфир характерна высокая пролиферативная активность. Практически все мезоглеальные клетки молодых медуз находятся в митотическом цикле, длительность которого составляет около 2 суток (Напара, Чага, 1992а). Уровень пролиферативной активности мезоглеальных клеток медуз, находящихся в фазе быстрого роста, оказывается вполне достаточным для того, чтобы полностью обеспечить наблюдаемое увеличение популяции этих клеток. В ходе полового созревания рост медуз постепенно останавливается, и размножение клеток в мезоглее прекращается. Таким образом, пролиферативная активность мезоглеальных клеток связана со скоростью роста животных (Напара, 1995).

По мере развития А. аигЫа меняется не только пролиферативная активность мезоглеальных клеток, но и их морфология. Клетки сцифистом имеют овальную форму и мелкие ядра с конденсированным хроматином. На стадии формирования эфиры в цитоплазме этих клеток появляются многочисленные вакуоли, похожие на гетерофагосомы (Напара, 1995). У поздних эфир и молодых медуз в этих клетках развивается мощный белок-синтезирующий аппарат, появляются специфические ацидофильные гранулы, фагоцитарные вакуоли исчезают, в ядрах появляются крупные ядрышки. По мере роста медуз размеры мезоглеальных клеток увеличиваются, а количество специфических гранул в их цитоплазме возрастает (Напара и др., 1994).

Мезоглеальные клетки обладают амебоидной подвижностью и способны фагоцитировать инородные частицы, например, при введении в мезоглею медуз взвеси кармина уже через 1 час появляются мезоглеальные клетки с захваченными частицами (Напара и др., 1994).

Морфологический и гистохимический анализ показал, что мезоглеальные клетки медуз накапливают в своей цитоплазме белковые гранулы и, по-видимому, выводят их путем экзоцитоза в окружающий матрикс мезоглеи (Напара и др., 1995; Напара и др., 1996). Материал специфических гранул содержит катионные белки или гликопротеины с высоким содержанием лизина, цистеина и дисульфидных связей (Напара и др., 1996).

Гистохимические характеристики мезоглеи оказались сходными у эфир и медуз разного возраста. При использовании комплекса гистохимических реакций на белки и полисахариды основное вещество и анизотропные (коллаге-новые) волокна окрашиваются практически одинаково, с той лишь разницей, что волокна, будучи более плотными структурами, всегда окрашиваются более интенсивно. Их гистохимические свойства соответствуют характеристикам гликозилированного коллагена (Напара и др., 1996). Эластические волокна А. аигЫа содержат нейтральные гликопротеины, белковый компонент которых имеет катионные свойства за счет высокого содержания лизина. Белки этих волокон также отличаются высокой концентрацией цистеина и дисуль-фидных связей (8с1шис1 еХ а1., 1991; Напара и др., 1996).

Предположение о том, что функции мезоглеальных клеток могут быть связаны с формированием межклеточного матрикса мезоглеи (Напара и др., 1994, 1996), проверялось в настоящей работе.

Морулярные клетки и туника асцидий

Асцидии - морские сидячие организмы, составляют один из классов подтипа оболочников, или личиночнохордовых - Титсага (ИгосЬогсЫа) (Вег-г Ш, 1950).

Ряд анатомических характеристик туникат, таких как образование хорды и спинной нервной трубки, наличие жаберных щелей и некоторые другие признаки, позволили в свое время А.О. Ковалевскому отнести эту группу к типу Оюгс^а (цит. по: Иванова-Казас, 1978).

Отличительными признаками взрослых оболочников служит наличие наружного скелета - туники и прогрессивное развитие фильтрационного аппарата на основе гипертрофии глотки и увеличения количества жаберных щелей (ВеггШ, 1950). Жизненный цикл асцидий протекает со сложным метаморфозом. Личинка - свободноживущая, взрослое животное ведет прикрепленный образ жизни, питаясь за счет фильтрации.

В пределах класса Ascidiacea выделяют три отряда. В отряд Aplousobranchiata объединяют колониальные формы, в состав других отрядов - Phlebobranchiata и Stolidobranchiata входят как одиночные, так и колониальные асцидии (Wright, 1981).

Полость тела взрослых асцидий является производным первичной полости тела - бластоцеля. Вторичная полость тела - целом, закладывается у поздней личинки энтероцельным способом, обычно двумя парами вентральных впячиваний глотки. Первая пара целомических мешочков образует у всех асцидий сердечную трубку и перикард, тогда как судьба второй пары - эпикардов - различна. У некоторых одиночных асцидий отряда Phlebobronchiata они утрачивают связь с глоткой и, сильно разрастаясь, формируют перивисце-ральную полость, эпителий которой выстилает все внутренние органы (Ива-нова-Казас, 1978). Такие отношения, характерные для типичных целомических животных являются, по-видимому, примитивным состоянием для асцидий, поскольку у более специализированных форм можно проследить постепенную редукцию эпикардов. Так, у некоторых семейств отряда Aplousobranchiata и Phlebobranchiata развивается только один эпикард. В семействах Ascidiacea и Correlidae (отр. Phlebobranchiata) эпикарды взрослых животных представлены многочисленными пузырьками - почками накопления. В пределах отряда Stolidobranchiata только в семействе Molgulidae сохраняется левый эпикард в виде единой почки накопления, тогда как у остальных представителей этого отряда эпикарды подвергаются полной редукции (Вег-rill, 1950; Чага, 1983).

Циркуляторная система асцидии - незамкнутая, состоит из сердца, заключенного в перикард, и системы лакун. Единственным настоящим сосудом является сердечная трубка. В сердце нет клапанов, на каждом конце сердца находится пейсмейкер, в результате работы которого направление течения крови поочередно меняется то в одну, то в другую сторону (Wright, 1981).

Так называемые "сосуды жаберного мешка" представляют собой лакуны между двумя пластами эпителия - глотки и перибранхиальной полости, "сосуды туники" - трубчатые выпячивания покровного эпителия. Собственно полость тела, несущая внутренние органы и мышечные волокна, подразделяе готся тяжами соединительной ткани на системы лакун (Иванова-Казас, 1978). Лакуны не имеют эндотелиальной выстилки. Следовательно, циркулирующие в полости тела жидкость и свободные клеточные элементы не являются кровью в строгом смысле. Термин "кровь" сохраняется, скорее, по традиции (Чага, 1983).

Клетки крови

Кровь асцидий была объектом для многих морфологических, биохимических и экспериментальных исследований (Wright, 1981). Так, клетки крови асцидий являются образцом для изучения примитивного распознавания "свое" - "чужое" на клеточном уровне (Fuke, 1980). Эти исследования, в свою очередь, являются важным звеном в изучении организации иммунной системы у животных, близких к предкам хордовых.

К сожалению, до сих пор отсутствует единая классификация клеток крови асцидий, различаются также данные об их функциональных характеристиках и гистогенетических отношениях. В различных исследованях авторы выделяют от четырех до двенадцати типов клеток крови у разных видов асцидий. При этом часто используется разная номенклатура для описания морфологических типов клеток (Goodbody, 1974; Чага, 1980а, 1983, 1998а; Rowley, 1981; Wright, 1981; Hirose et al., 1991; Fuke, Fukumoto, 1993; Sawada et al., 1993; Dan Sohkawa, 1995; Kaneko et al., 1995). В настоящее время, у большинства исследованных видов асцидий можно выявить четыре основные категории клеток крови:

1) гемоцитобласты,

2) гиалиновые амебоциты,

3) гранулоциты,

4) вакуолярные/морулярные клетки.

В ряде работ были исследованы гистогенетические взаимоотношения между клетками крови с помощью тимидиновой авторадиографии на разных видах асцидий (Endean, 1960; Smith, 1970; Ermak, 1975; Чага, 1982, 1983). Показано, что клетки крови асцидий представляют собой постоянно обновляющуюся тканевую систему, в основе которой лежит популяция камбиальных клеток - гемоцитобластов.

Гемоцитобласты. При исследованиях гистологических препаратов было обнаружено, что относительное содержание гемоцитобластов достигает 20 - 40 % от общего числа клеток крови. При этом значительная часть гемоцитобластов представлена оседлыми клетками, образующими тесные скопления - пролиферативные узелки, которые сосредоточены, в основном, в зоне пищеварительного канала, в соединительно-тканной строме (Goodbody, 1974; Ermak, 1975; Wright, 1981; Чага, 1983, 1998а; Kaneko, 1995). Показано, что в культуре гемоцитобласты также образуют клеточные скопления (Dan-Sohkawa, 1995). При помощи авторадиографического анализа было показано, что популяция гемоцитобластов асцидии Molgula citrina гетерогенна и подразделяется, по крайней мере, на две субпопуляции: быстро пролиферирую-щих и покоящихся (или медленно пролиферирующих) клеток. Полученные данные свидетельствуют о сложной организации системы камбиальных клеток асцидий (Шапошникова, Чага, 1984). Другие исследователи указывают, что гемоцитобласты в культуре, при определенных условиях, воспроизводят всю популяцию клеток крови (Dan-Sohkawa, 1995). Следовательно, гемоцитобласты представляют собой популяцию активно пролиферирующих камбиальных клеток, за счет которых осуществляется постоянное обновление остальных типов клеток.

Гиалиновые амебоциты. Для этих клеток характерно мелкое, обычно без ядрышка, ядро и прозрачная нейтрофильная цитоплама, часто без каких-либо специфических включений. Они отличаются высокой фагоцитарной активностью, амебоидной подвижностью и адгезивностью (Wright, 1981; Чага, 1983, 1998а). Специализируются эти клетки на распознавании "свое"-"чужое", элиминации чужеродных объектов (фагоцитоз, инкапсуляция) и дегенерирующих тканей собственного организма (например, во время резорбции колоний, Cima et al., 1996). Они также накапливают продукты обмена. Конечным этапом развития гиалиновых амебоцитов являются макрофаги, цитоплазма которых заполнена вакуолями, гранулами и различными включениями (Чага, 1983, 1998а). Гиалиновые амебоциты могут в большом количестве присутствовать в тунике асцидий. Показано, что при повреждении они могут инкапсулировать фрагменты туники или чужеродные клетки (Smith, 1970а).

Гранулоциты. В эту категорию входят молодые и зрелые гранулоциты. Отличительным признаком этого типа является наличие в цитоплазме большого числа тесно лежащих, мелких базофильных гранул. В настоящее время гранулоциты обнаружены у большинства исследованных видов асцидий, хотя они и несколько различаются по своим морфологическим характеристикам (Smith, 1970а; Milanesi, 1978; Wright, 1981; Чага, 1983; Sawada, 1991, 1993; Fuke, Fukumoto, 1993). О функциях гранулоцитов ничего не известно. Ряд исследователей высказывали предположение, что, возможно, эти клетки являются коагулоцитами (Smith, 1970b; Fuke, Fukumoto, 1993; Sawada, 1993). В условиях культуры клеток было показано, что гранулоциты способны быстро агрегировать вокруг небольших участков туники или жаберных карманов. Это поведение клеток объясняют участием гранулоцитов в предотвращении кровотечения (Dan-Sohkawa et al., 1995).

Клетки вакуолярного ряда. Этот тип клеток является наиболее многочисленным у асцидий, их содержание доходит до 60 - 80 % от общего числа клеток крови. В группу вакуолярных клеток объединяют клетки, сходные по целому ряду признаков. Для специфических включений этих клеток характерно наличие четырех независимых маркеров: основных белков, связанного железа, о-дифенолов и о-дифенолоксидазной активности (Чага, 1983, 1998а, б). Схема гистогенеза вакуолярных клеток была предложена Индином в 1960 году на примере клеток асцидии Phallusia mamillata (Endean, 1960), в дальнейшем она была подтверждена другими исследователями (Kalk, 1963; Smith, 1970а; Ermak, 1975; Чага, 1983, 1998а, б, с). Обобщенная схема гистогенеза клеток вакуолярного ряда включает в себя несколько стадий: гемоцитобласты - вакуолярные клетки - перстневидные клетки - отсековидные клетки - незрелые морулярные - зрелые морулярные клетки. Хотя морулярные клетки являются наиболее характерными клетками для крови всех асцидий, их морфология может сильно варьировать в разных систематических группах (Goodbody, 1974; Wright, 1981). Количество и морфология стадий созревания клеток вакуолярного ряда также несколько отличается у разных видов. Отличия касаются, в первую очередь, некоторых морфологических признаков клеток (размеры клеток и ядер, количество ядрышек, структура хроматина, число и размеры специфических включений). Варьирует как относительное содержание клеток данной категории, так и морфология отдельных стадий дифференци-ровки вакуолярных клеток (Endean, 1960; Smith, 1970; Чага, 1980а, 1998а; Fuke, Fukumoto, 1993). Так, у асцидии Molgula citrina в этот ряд входят вакуолярные, отсековидные, молодые и зрелые морулярные клетки; у Bolthenia echinata - вакуолярные, перстневидные, отсековидные и морулярные клетки; у Stye la rustica - отсековидные и морулярные клетки (Чага, 1980а, 1982, 1983, 1998а).

Подробный авторадиографический анализ динамики пролиферации и дифференцировки клеток крови у М. citrina не только подтвердил предложенную на основе морфологических и гистохимических данных схему гистогенеза вакуолярных клеток, но и позволил выявить сложную организацию этого процесса. Полученные данные свидетельствуют о постоянном обновлении ранних и завершающих стадий дифференцировки вакуолярных клеток и о наличии фонда молодых морулярных клеток, из которых в норме только часть трансформируется в зрелые морулярные клетки под контролем гуморальных факторов (Чага, 1982, 1983; Шапошникова, Чага, 1984; Kaneko, et al, 1995).

Клетки этого типа выполняют различные функции. Было показано, что зрелые клетки участвуют в реакции задубливания белков туники при ее формировании, а также принимают участие в процессе репарации туники (Endean, 1955; Smith, 1970; Чага, 19806, 1983; Чага, Соловей, 1986; Hirose et al., 1995; De Leo, 1996, 1997). Эти клетки участвуют также в распознавании "свое"-"чужое", могут проявлять цитотоксическую активность, выделять бактерицидные вещества, они играют большую роль в образовании некротических районов во время реакции отторжения между двумя несовместимыми колониями (Azumi et al., 1990а; Fuke, Fukumoto, 1993; Akita, Hoshi, 1995; Bailarín, et al, 1995; Parrinello, 1996). Ряд исследователей отмечает способность вакуолярных клеток к фагоцитозу (Fuke, 1979; Sawada et al, 1991). В ходе дифференцировки в гранулах вакуолярных клеток происходит накопление основных компонентов, необходимых для функционирования о-дифенолоксидазной системы (Agudelo et al., 1983; Kustin et al., 1990; Michibata et al., 1991; Smith,

Soderhall, 1991; Чага, 19806, 19986), с помощью которой эти клетки и осуществляют большую часть своих функций.

Фенолоксидазная система

Давно известно, что защитные реакции у многих беспозвоночных часто сопровождаются меланизацией. Ключевой фермент в образовании меланина -фенолоксидаза (ФО). Фенолоксидазная активность, которая обычно измеряется in vitro по окислению L-dopa при нейтральной рН, выявляется в гемолимфе, целомической жидкости или гемоцеле многих групп беспозвоночных, как первично-, так и вторичноротых: членистоногих, иглокожих, асцидий, некоторых моллюсков, олигохет (Чага, 19806; Ashida et al., 1982; Soderhall, 1982; Soderhall, Hall, 1984; Leonard et al., 1985; Ratcliffe et al., 1985; Aspan, Soderhall, 1991; Canicatti, Gotz, 1991; Smith, Soderhall, 1991; Valembois et al., 1991; Smith, Peddie, 1992; Bailarín et al., 1993; Coles, Pipe, 1993). Однако максимальное развитие эта система получила у членистоногих и асцидий. ФО катализирует окисление фенолов в хиноны, которые затем полимеризуются (уже без фермента) в меланин - коричневый или желтоватый пигмент, либо сшивают белки в так называемый склеротин. Как moho-, так и дифенолы могут окисляться ФО, и промежуточные компоненты, также как и меланин, токсичны для микроорганизмов.

Хотя ФО активность определялась в крови многих групп беспозвоночных, фермент или его неактивная форма, профенолоксидаза (проФО), изолированы пока только из крови артропод и одной асцидии - Halocynthia roretzi. В литературе содержится довольно много данных о молекулярных массах ФО и проФО, и значение их варьирует в широких пределах - от 40 до 200 кДа (Ashida, 1971; Munn, Bufton, 1973; Naqvi, Karlson, 1979; Aso et al., 1985; Tsu-kamoto et al., 1986; Ashida, Yoshida, 1988; Anderson et al., 1989; Aspan, Soder-hall, 1991; Durrant et al., 1993; Kopacek et al., 1995; Kwon et al., 1997; Hata et al., 1998). Однако, учитывая только очищенные белки, проанализированные в SDS-электрофорезе, проФО крови различных видов имеет молекулярную массу между 70 и 90 кД, активная ФО - между 60 и 70 кД.

Активация проФО зависит от каскада сериновых протеаз и других факторов крови. Все эти компоненты и образуют систему активации проФО (проФО система). После активации белки, входящие в эту систему, участвуют в целом ряде биологических ответов, включая фагоцитоз, инкапсуляцию, свертывание, цитотоксическую реакцию против микроорганизмов и репарацию поврежденных покровов (Kuo, Alexander, 1967; Soderhall, Ajaxon, 1982; St Leger et al., 1988; Rowley et al., 1990; Cammarata, 1997). Около 20 лет назад было высказано предположение, что система активации проФО представляет собой защитную и/или распознающую систему для артропод (Soderhall, 1982; Soderhall, Smith, 1986).

Наиболее подробно компоненты этой системы и их взаимодействие описаны у членистоногих (рис. 1). У всех исследованных до сих пор ракообразных фермент присутствует в гемоцитах - гранулярных амебоцитах, тогда как у насекомых он может храниться в гемоцитах или в плазме. Показано, что в гемолимфе ФО присутствует в виде неактивного предшественника - профе-нолоксидазы (проФО) (Ashida, 1971; Soderhall et al., 1979; Soderhall, Hall,

26

1984; Leonard et al., 1985; Ashida, Yoshida, 1988; Saul, Sugumaran, 1988; Aspan, Soderhall, 1991). Высвобождение профермента из клеток крови, как показано у рака, происходит при участии специфических рецепторов с последующим регулируемым экзоцитозом компонентов проФО из клеток. При этом деграну-ляция гемоцитов и активация проФО - два независимых процесса (Smith, 1996; Soderhall, Cerenius, 1998).

Для некоторых артропод показано, что активная ФО склонна агрегировать и такие агрегаты с трудом диссоциируют (Munn, Button, 1973; Soderhall et al., 1979; Ashida, 1981; Andersson et al., 1989). Таким образом, сообщаемые в литературе высокие значения молекулярных весов проФО и ФО могут являться следствием агрегации. ФО легко активируется различными нефизиологическими растворами, детергентами, нагреванием и другими агентами и обработками, что также осложняет ее очистку (Aspan, Soderhall, 1991).

Медиаторы защитных реакций □

Сериновые протеиназы О П □□ V

Ингибиторы протеиназ

Профенолоксидаза

Фенолоксидаза V

Фенолы с>

Ог

Хиноны

Меланин

Рис. 1. Схема каскада активации проФО у артропод (из 8о<1ег11а11, Сег-ешш, 1998).

У ряда насекомых и ракообразных могут присутствовать две или более формы ФО, которые обнаруживаются в клетках крови и в кутикуле (Pentz et al., 1986; Simpson et al., 1988; Wright, 1987; Chen et al., 1991). В некоторых случаях - это различные изоформы (Hiruma, Riddiford, 1988).

Не так давно была определена первичная структура проФО некоторых членистоногих. Оказалось, что все они содержат два медь-связывающих функциональных сайта. В целом сходство четырех клонированных проФО (из гемолимфы пресноводного рака Pacifastacus leniusculus и насекомых Manduca sexta, Drosophila melanogaster, Bombix mor i) составляет около 40 %, тогда как сходство последовательностей в районе медь-связывающих сайтов - около 6070 % (Aspan et al., 1995; Fujimoto et al., 1995; Hall et al., 1995; Kawabata et al., 1995). Результаты построения филогенетического древа, созданного на основании сравнения нуклеотидных последовательностей, указывают на родство профенолоксидаз и гемоцианинов членистоногих, которые попадают в одно семейство белков, тогда как гемоцианины моллюсков и тирозиназы позвоночных составляют другое семейство (Fujimoto et al., 1995).

Морулярные клетки асцидий, несущие ФО систему, в отличие от членистоногих, накапливают не медь, а железо или ванадий (Goodbody, 1974; Milanesi, Burighel, 1978; Agudelo et al., 1983; Наточин, Чага, 1984; Kustin et al., 1990; Michibata et al., 1991). Кроме того, недавно был клонирован ген тирозиназы, отвечающей за пигментацию чувствительных пигментных клеток в глазу плавающей личинки асцидии Halocynthia roretzi (Sato et al., 1997; Sato et al., 1999). Гомология этого гена с тирозиназами позвоночных составляет около

40 %. Но степень родства тирозиназы и ФО из клеток крови Н. roretzi не определена.

Многие компоненты, необходимые для работы проФО системы, выделены и частично охарактеризованы у артропод, некоторых асцидий и иглокожих. Сюда относятся (см. рис. 1): сериновые протеиназы, активирующие проФО, - выделены из гемолимфы ракообразных, насекомых, асцидий, из целомической жидкости голотурий (Andersson et al., 1989; Aspan et al., 1990; Canicatti, 1990; Jackson, Smith, 1993; Shishikura et al., 1997; Ji et al., 1997). В кутикуле ряда насекомых также существуют протеазы, которые могут активировать проФО гемолимфы (Do-hke, 1973; Munn, Bufton, 1973; Hughes, Price, 1975; Naqvi, Karlson, 1979; Aso et al., 1985); игибиторы этих протеиназ - выделены из гемолимфы мечехвоста, ракообразных и насекомых (Hall, Soderhall, 1982; Andersson et al., 1989; Armstrong et al., 1990); асцидий (Yokosawa et al., 1985; Azumi et al., 1991a; Shishikura et al., 1996), целомической жидкости голотурий (Canicatti, 1991); молекулы, распознающие компоненты клеточных стенок грибов и бактерий - р-1,3-глюкан-, пептидогликан- и ЛПС-связывающие белки - выделены из гемолимфы мечехвоста, ракообразных, насекомых и асцидий (Nakamura et al., 1986; Ochiai, Ashida, 1988; Duvic, Soderhall, 1990; Azumi et al., 1991b); соединения, содержащие фенолы, - выделены из гемолимфы насекомых (Ricketts, Sugumaran, 1994), асцидий (Dorsett et al., 1987; Azumi et al., 1990b; Kustin et al., 1990).

После активации проФО система генерирует опсонин-подобные факторы (Smith, Soderhall, 1983; Soderhall et al., 1984; Ratcliffe et al., 1984), продуцирует литические факторы (Smith, Soderhall, 1983) и фунгистатические вещества (Soderhall, Aj axon, 1982).

Показано взаимодействие ФО системы с белками клеточной адгезии и белками свертывания, выделенными из гемолимфы ракообразных и насекомых (Johansson, Soderhall, 1988; Kobayashi et al., 1990).

Таким образом, система активации проФО работает как сложный биохимический каскад.

Функциональное значение гранулярных амебоцитов, являющихся носителями ФО системы, как у членистоногих, так и у асцидий не ограничивается их ролью в защитных реакциях, они участвуют также и в процессе нормального формирования кутикулы. Взаимодействие системы гранулярных амебоцитов с покровными тканями при образовании кутикулярной пластинки наиболее ярко выражено у асцидий.

Туника

Покровы асцидий состоят из однослойного эпителия и туники, наличие которой - один из отличительных признаков асцидий.

Туника асцидий является разновидностью кутикулярных покровов арт-роподного типа, в которых все основные функции выполняет выделяемое клетками межклеточное вещество - кутикулярная пластинка. Основной фибриллярный компонент кутикулы представлен нейтральными гомополисахари-дами (Заварзин, 1981; Чага, Соловей, 1986). У членистоногих - это хитин, а у асцидий туника строится на основе целлюлозы (Smith, Dehnel, 1970; Andersen, 1979). Фибриллы заключены в аморфный матрикс, в состав которого входят в основном белки и сульфатированные протеогликаны. Кутикулярная пластинка подвергается склеротизации - фенольному задубливанию (Barrington, Thorpe, 1968; Чага, 19806). Обычно стабилизация белков происходит неравномерно по толщине кутикулы и образуются два основных слоя: менее плотная и эластичная эндокутикула и сильно задубленная экзокутикула (Endean, 1955; Smith, 1970; Goodbody, 1974; Чага, 1983). Степень выраженности зкзо-кутикулы значительно варьирует у разных видов. Например, туника В. ecinata образует сложные шипы, сформированные эндо- и экзокутикулой (Чага, 1983).

Миграция морулярных клеток в тунику, накопление и последующая де-грануляция их в тунике была показана многими исследователями (Endean, 1960; Kalk, 1963; Smith, 1970а, b; Goodbody, 1974; Чага, 1980a, 19806, 1983). Часть клеток при этом выводит материал своих гранул в эндокутикуле, другие клетки мигрируют в верхние слои туники и "целиком перерождаются в массу задубленного вещества", образуя тем самым экзокутикулу - верхний слой туники (Endean, 1960; Kalk, 1963; Barrington, Thorpe, 1968; Smith, 1970a, b; Чага, 19806, 1983). В ранних работах функцию морулярных клеток связывали с синтезом волокон целлюлозы в тунике (Endean,1960; Kalk, 1963). В более поздних работах методом авторадиографии было показано, что синтез волокон целлюлозы осуществляется клетками покровного эпителия. Морулярные клетки и их предшественники не включали меченую углекислоту и глюкозу, используемые для построения полисахаридных волокон в тунике (Robinson et al., 1983; Чага, 1983, 1998в). И. Барррингтон и А. Торп (Barrington, Thorpe, 1968) впервые выявили в тунике о-дифенолоксидазную активность и предположили существование в тунике асцидий системы склеротизации белков хи-нонами. М. Смит (Smith, 1970а, Ь) пришел к выводу, что морулярные клетки, по-видимому, переносят в тунику структурные белки и участвуют в формировании ее матрикса. При экспериментальном повреждении туники встраивание морулярных клеток в ее апикальную часть резко интенсифицируется: наблюдается массовая миграция морулярных клеток в область разреза. Часть клеток выходит в полость разреза, агглютинирует и образует защитную пробку. Другая часть клеток концентрируется на поверхности разреза, разрушается и формирует защитный слой, сходный по морфологии и гистохимическим реакциям с экзокутикулой. В результате на поверхности поврежденной эндокути-кулы образуется защитный слой, идентичный нормальной экзокутикуле (Smith, 1970а, Ъ; Чага, 19806, 1983).

У личинок асцидий во время образования туники морулярные клетки отсутствуют, их дифференцировка происходит позднее и лишь на последнем этапе морфогенеза наблюдается миграция морулярных клеток в уже полностью сформированную тунику личинки (Иванова-Казас, 1978). Личиночная туника у одиночных асцидий состоит в основном из экстраклеточных продуктов, которые секретируются эпидермальными клетками, начиная со стадии хвостовой почки (Mancuso, 1973, 1974).

У нескольких видов была исследована ультраструктура личиночных туник (Dilly, 1969; Terakado, 1970; Cloney, Cavey, 1982; Cavey, Cloney, 1983). Наружный кутикулярный слой (Cl) собирается на поверхности эпидермиса на стадии хвостовой почки. Этот слой постепенно отделяется от эпидермиса и появляется пространство, заполненное матриксом, которое называется внешним компартментом. Начинают формироваться плавники, затем появляется внутренний кутикулярный слой (С2).

Одна из гипотез о формировании личиночной туники на ранних стадиях эмбрионального развития предполагает участие в этом процессе тесталь-ных клеток - вспомогательных клеток, окружающих ооциты и эмбрионы ас-цидий (Kalk, 1963; Cloney, Cavey, 1982; Satoh et al., 1982; Kessel, 1983).

Герминативный эпителий стенки яичника дает начало ооцитам и окружающим их фолликулярным клеткам (Иванова-Казас, 1978). На своей внутренней поверхности фолликулярный эпителий выделяет оболочку - хорион, а затем разделяется на два слоя. Во время овуляции наружный слой сбрасывается, а внутренний сохраняется до конца эмбриогенеза (Иванова-Казас, 1978). Тестальные клетки во время оогенеза тесно прижаты к поверхности ооцита и часто "вдавливаются" в углубления на поверхности ооцитов. В раннем эмбриогенезе они выходят в перивителлиновое пространство, а затем у многих видов вновь прижимаются к поверхности эмбриона (Mancuso, 1973; Иванова-Казас, 1978; Sugino et al., 1987). При вылуплении личинки из хориона и фолликулярной оболочки тестальные клетки также обычно сбрасываются, но, например, у Ciona intestinalis они остаются на поверхности туники (внешнего кутикулярного слоя) и начинают перемещаться, собираясь в продольные полосы на теле личинки (Sato et al., 1997). Псевдоподии тестальных клеток проникают в личиночную тунику. Предполагается, что тестальные клетки у этого вида принимают участие в метаморфозе личинки.

Тестальные клетки уникальны для асцидий и не встречаются у других животных. Происхождение тестальных клеток вызывает споры. Большинство авторов считают, что они происходят из первичных фолликулярных клеток (Ermak, 1976; Иванова-Казас, 1978; Sugino et al., 1987), тогда как некоторые авторы придерживаются мнения, что тестальные клетки ведут свое начало от клеток крови, которые мигрируют в яичники (Mancuso, 1965; Newberry, 1968).

Морфология тестальных клеток изучена у разных видов асцидий (Иванова-Казас, 1948; Kessel, Kemp, 1962; Kessel, Beams, 1965; Dilly, 1969; Cavey, 1976; Reveberi, 1978; Cloney, Cavey, 1982; Satoh et al., 1982). Тестальные клетки Stye la plicata и Stye la sp. синтезируют и аккумулируют в вакуолях волокнистые пигментные структуры (Kessel, Beams, 1965). У некоторых видов тестальные клетки содержат железо или железо и ванадий (Botte et al., 1979; Hori, Michibata, 1981).

Ряд исследователей полагает, что тестальные клетки транспортируют в ооциты вещества, необходимые для созревания (Kessel, Kemp, 1962; Kalk, 1963; Mancuso, 1965). Хотя тестальные клетки дифференцируются одновременно с ооцитами, транспорт предшественников желтка, пигмента или других специфических молекул из них в ооциты не показан. Группа авторов предполагает их участие в процессах синтеза и организации личиночной туники

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор животных и их содержание в лаборатории. Медуз Aurelia aurita отлавливали на акватории Керетского архипелага в Чупинской губе Кандалакшского залива Белого моря. Асцидии Styela rustica, Boltenia echinata и Molgula citrina собраны в том же районе. Асцидий содержали в аквариумах с аэрируемой морской водой; медуз - в ваннах с ежесуточно сменяемой морской водой, 2 раза в сутки медуз обильно кормили свежим планктоном. Животные содержались в изотермической комнате при 10 °С. Часть экспериментальной работы выполнена на базах филиала сравнительной гистологии Морской биологической станции Санкт-Петербургского университета (о-в Средний) и Беломорской биологической станции ЗИН РАН (Картеш).

Авторадиографический анализ. В работе использованы молодые медузы с диаметром зонтика 2-4 см, собранные в конце июня, и крупные медузы диаметром 24 - 27 см, отловленные в начале августа. Молодых медуз инкубировали однократно в течение 1 часа в фильтрованной морской воде, со

3 3 3 державшей радиоактивную аминокислоту ( Н-пролин, Н-лейцин или Н-лизин) в конечной концентрации 185 кБк/мл, затем переносили в большой объем свежей воды без предшественников. Аналогичные эксперименты были проведены на взрослых медузах. В этом случае в растворах предшественников инкубировали кусочки зонтика медуз размером около 1 см. Через определенные промежутки времени после начала опыта (1, 2, 3, 7, 13, 24, 36 и 48 ч) по 4—5 молодых животных (или кусочки тела 3 крупных медуз) фиксировали жидкостью Буэиа в течение 24 ч, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 7 мкм. Препараты покрывали эмульсией типа М (НИИХИМФОТОпро-ект), экспонировали 4 с и после проявления окрашивали квасцовым гематоксилином Караччи и эозином (Епифанова и др., 1977). Для количественной оценки результатов авторадиографических опытов проводили подсчет числа зерен серебра на стандартной площади (один квадрат сетки окулярмикромет-ра) над различными участками тела (по 10 площадок у каждого животного над каждым участком), а также над клетками мезоглеи (60 клеток на 1 животное). Для анализа были выбраны следующие участки: эпителий эксумбреллы, слой мезоглеи под этим эпителием, слой мезоглеи на равном расстоянии между эпителием и гастродермой, эпителий гастродермы, мезоглея субумбреллы, эпителий субумбреллы. Размер площадки (одного квадрата сетки окулярмик-рометра) был выбран таким образом, чтобы он приблизительно соответствовал площади одной эпителиальной клетки и соответственно позволял сравнивать интенсивность мечения индивидуальных клеток эпидермы, гастродермы и мезоглеи. Кроме того, на каждом препарате определяли фоновый уровень включения, подсчитывая зерна серебра на 10 стандартных площадей рядом со срезом. На каждом сроке для подсчетов использовали по 4 медузы. Статистическая обработка данных включала в себя вычисление средних значений и их доверительных интервалов при 95 %-ном уровне значимости. Помимо мечения индивидуальных тканей оценивалась также суммарная интенсивность метки над всеми участками для определения длительности циркуляции меченых предшественников в теле медуз.

Получение изолированных мезоглеальных клеток и образцов мезоглеи. Изолированные мезоглеальные клетки получали из медуз разных возрастов с диаметром зонтика >12 см. У животных вырезали кусочки мезоглеи, под бинокулярным микроскопом очищали мезоглею от эпидермального и га-стродермального эпителиев. Очищенную мезоглею измельчали и смешивали с раствором коллагеназы из Clostridium histolyticum, (тип II, Sigma, С-6885) в фильтрованной морской воде в соотношении 1:1 (конечная концентрация коллагеназы 1 мг/мл). Через 2-3 часа инкубации при комнатной температуре полученную суспензию центрифугировали, клеточный осадок дважды промывали в большом объеме фильтрованной морской воды. Жизнеспособность клеток после выделения оценивали под фазово-контрастным микроскопом. Очищенные от эпителиев кусочки мезоглеи одинакового размера гомогенизировали в 25 мМ Tris-HCl буфере рН 7,0. Полученные препараты использовали для приготовления элекгрофоретических проб.

Разделение клеток крови асцидий в градиенте Перколла. Перед кровопусканием тунику S. rustica очищали от обрастателей, тщательно промывали фильтрованной морской водой и обсушивали фильтровальной бумагой. Область нанесения разреза стерилизовали 70 0 спиртом. Тунику надрезали до уровня мышц без повреждения внутренних органов. Вытекающую в разрез гемолимфу собирали пипеткой в охлажденные на льду пробирки с бескальциевой искусственной морской водой (ИМВ) следующего состава: 0,3 М NaCl; 20 mM КС1; 15 тМ ЭДТА; 10-50 тМ; Трис-HCl рН 7,6.

Перколл (Pharmacia) смешивали с соответствующим объемом ИМВ для получения растворов с конечной концентрацией Перколла 65 %, 50 %, 40 % и 30 %. Затем по 2 мл раствора каждой концентрации наслаивали последовательно в стеклянную центрифужную пробирку. Сверху на градиент наносили 2 мл гемолимфы и центрифугировали при 800 g 10 - 15 мин. Клетки из отдельных фракций собирали шприцем с длинной иглой и каждую фракцию дважды отмывали от Перколла в ИМВ и в фильтрованной морской воде. Фракции нумеровались сверху вниз. Сохранность клеток и клеточный состав фракций оценивали после отмывки под фазово-контрастным микроскопом. Все операции проводили при 10 °С.

Электрофоретическое разделение белков. Белковый состав плазмы и фракций клеток крови асцидий, а также мезоглеи и изолированных мезогле-альных клеток медузы определяли с помощью SDS-электрофореза в 12 % по-лиакриламидном геле (Laemmli, 1970). Для обнаружения катионных белков в морулярных клетках проводили кислый электрофорез (Panyrm, Chalckley, 1969). В качестве маркера использовали фракцию общих гистонов из ядер клеток печени крысы (любезно предоставлена Г.С. Ивановым, Институт Цитологии РАН). Все гели окрашивали Кумасси бриллиантовым синим G-250.

Пептидное картирование. Пептидное картирование проводили, основываясь на методе Кливленда в модификации Бэндмана и др. (Bandman et al., 1982). Белки 43 кДа и 47 кДа из морулярных клеток S. rustica и актин из мышц кролика (дар О. Антроповой, Институт Цитологии РАН) переваривали в течение 30 мин протеазой Staphylococcus aureus V8 (тип XVII В, Sigma: Р-2922) в концентрациях 0,2 мкг/мл; 1 мкг/мл; 5 мкг/мл; 10 мкг/мл в буфере Лэммли для проб. Контрольные образцы не содержали протеазы. Переваренные фрагменты разделяли с помощью SDS-электрофореза в 15 % полиакриламид-ном геле.

Получение поликлональных антител. Против двух мажорных белков морулярных клеток асцидии S. rustica 26 кДа и 47 кДа получали поликлональ-ные антисыворотки АВ26 и АВ47, соответственно; против мажорного белка 45/47 кДа из мезоглеи медузы A. aurita - антисыворотку RA45/47. Процедура иммунизации заключалась в следующем: белки фракции морулярных клеток или гомогенизированной мезоглеи разделяли электрофоретически, соответствующие белковые зоны вырезали из геля, гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и смешивали с адъювантом Фрейнда (1:1); каждую смесь инъецировали подкожно трем кроликам. Повторную инъекцию такими же смесями проводили через 4 недели внутримышечно. Неделю спустя проводили забор крови из ушной артерии. Сыворотки разделяли на порции по 50 мкл и хранили при -20 °С. Образцы преиммунной сыворотки получали от тех же самых кроликов за две недели до инъекции антигенов.

Иммуноблоттинг. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозу проводили в электродном буфере Лэммли с 20 % метанола (Towbin et al., 1979). Блоты отмывали в PBS, содержащем 0,05 % Tween 20 (PBS-Tw). Далее проводили инактивацию сайтов неспецифического связывания нитроцеллюлозы 3 % бычьим сывороточным альбумином или казеином в течение 1 ч, затем блоты инкубировали в растворе антисыворотки (рабочее разведение 1:1000

•ССИЙСЧЛЯ

1уСУДАРСТ ^бяяе. или 1:2000) в течение 1 ч, отмывали PBS-Tw 4 раза по 15 мин, инкубировали со вторыми антителами (GAR, конъюгированные со щелочной фосфатазой, или GAR, конъюгированные с пероксидазой хрена) и окрашивали BCIP-NBT или DAB. Часть препаратов до инкубации с казеином или альбумином предварительно обрабатывали 0,2 % раствором трипсина в течение 20 мин при 37 °С. Все операции проводили во влажной камере при комнатной температуре. В качестве вторых антител в ряде случаев использовали антитела, конью-гированными с FITC (Sigma), в разведении 1:100, срезы обрабатывали ими в течение 1 ч в темноте и отмывали 3 раза по 10 мин в PBS. Препараты изучали с помощью люминесцентного микроскопа Axioskop. При использовании вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, срезы дополнительно окрашивали гемалауном-эозином и исследовали в световом микроскопе NU-2. В качестве контроля срезы обрабатывали преиммунной сывороткой.

Иммуногистохимия. Для иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 2 % растворе параформальдегида, либо в фиксаторе Бу-эна. Затем материал заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 57 мкм. Особей В. echinata использовали для опытов с репарацией туники. На тунику наносили разрез длиной около 1 см и глубиной в половину толщины туники. Через 5 дней животных фиксировали жидкостью Буэна. Затем зафиксированный материал заливали в парафин и приготовляли срезы толщиной 57 мкм. После обеспарафинивания срезы промывали в PBS-Tw и проводили непрямое иммуногистохимическое окрашивание по схеме, аналогичной приведенной выше для окраски блотов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мезоглея и мезоглеальные клетки Aurelia auríta

Авторадиографический анализ. Синтез экстраклеточного матрикса мезоглеи исследовали с помощью метода авторадиографии после инкубации медуз A. aurita в течение 1 ч в среде с мечеными аминокислотами (3Нл <з пролином, Н-лейцином и Н-лизином). Экзогенные предшественники быстро диффундируют в тканях медузы, и уже через 1 ч после начала инкубации в среде с мечеными аминокислотами метка обнаруживается в покровном эпителии, гастродерме и мезоглеальных клетках. Общая радиоактивность тканей постепенно нарастает в течение 13-24 часов, а затем начинает снижаться (рис. 2).

Характер распределения метки в тканях молодых и зрелых медуз сходен для разных аминокислот. Во всех случаях наиболее интенсивно метится покровный эпителий эксумбреллы и субумбреллы, слабее - эпителий гастро-дермы и мезоглеальные клетки. В первые часы после начала опыта метка в мезоглее почти отсутствует, на более поздних сроках матрикс мезоглеи оказывается интенсивно меченным. У молодых медуз распределение метки более равномерно. Количественный анализ динамики мечения разных тканей про> водили именно на молодых медузах в следующих участках тела: эпителий эксумбреллы, субэпителиальный слой мезоглеи, центральная зона мезоглеи, мезоглеальные клетки, гастродермальный эпителий радиальных каналов, мезоглея субумбреллы, эпителий субумбреллы. При таком анализе удается выявить существенные различия в динамике включения разных аминокислот (рис. 3).

Динамика включения в ткани медуз 3Н-лейцина приведена на рис. 4А. На ранних сроках опыта наблюдается интенсивное включение этой аминокислоты в эпителий эксумбреллы и субумбреллы, а эпителий гастродермы и ме-зоглеальные клетки метятся несколько меньше. К 13 ч уровень включения возрастает в 1,5—2 раза во всех клетках, вероятно из-за особенностей циркуляции предшественника, затем плавно снижается. Метка в мезоглее через 1 ч после начала опыта не превышает уровня фона, через 7 ч интенсивное мече-ние выявляется как непосредственно под эпидермой, так и в центральной области мезоглеи. В первые часы уровень включения Н-лейцина в субэпителиальном слое мезоглеи почти в 2 раза выше, чем в удаленных от эпителия участках, а через 13 ч градиент в распределении меченого предшественника фактически исчезает.

Сходная динамика распределения метки прослеживается и после инкуо бации животных с Н-лизином (рис. 4Б). Однако в гастродерме включение превышает фон только через 13 ч. Слабое включение в субэпителиальном слое мезоглеи регистрируется на 2-м ч опыта, а через 13 ч более сильное и равномерное мечение наблюдается по всему объему мезоглеи. 5

Характер включения Н-пролина в ткани медуз иной (рис. 4В). Интенсивно метится эпителий эксумбреллы и субумбреллы. Метка в гастродерме в течение всего опыта почти не превышает фонового уровня и остается довольно слабой в мезоглеальных клетках. Заметное включение Н-пролина в субэпителиальную мезоглею наблюдается уже через 2 ч, а в центральную мезоглею - через 13 ч. Однако в данном случае значительный градиент распределения метки в мезоглее сохраняется в течение всего опыта.

Некоторые количественные оценки дают возможность более наглядно продемонстрировать различия включения аминокислот в разные ткани. Определение относительной радиоактивности эксумбреллярной эпидермы, субэпителиального слоя мезоглеи, гастродермы и мезоглеальных клеток позволяет оценить характер включения аминокислот в разные ткани медузы. Уровень включения данного предшественника в эпителий эксумбреллы принимался за 100 %, подсчеты проводились на сроке 13 ч после начала опытов (рис. 5). При такой обработке результатов видно, что включение 3Н-лейцина в клетки гастродермы составляет около 70 %, в мезоглеальные клетки — около 50 % и в субэпителиальную мезоглею - 18,7 % от уровня метки в эпидерме. Распределение меченого пролина в этих же тканях совсем иное. Так, максимальный уровень включения 3Н-пролина в гастродерму составляет всего 0,4 %, в мезоглеальные клетки — 4,3 %, а в субэпителиальную мезоглею - 33,7 % от уровня включения этой аминокислоты в эпидерму. Распределение меченого лизина в этих тканях занимает промежуточное положение: метка в гастродерме составляет 17,2 %, в клетках мезоглеи — около 40 %, в субэпителиальной мезоглее -23,2 %.

Была также проведена оценка относительной интенсивности включения разных аминокислот (доля от суммарной радиоактивности) в клетки определенной ткани и субэпителиальный слой мезоглеи на том же сроке - через 13 ч после начала опытов (рис. 6). В гастродерме радиальных каналов на долю меченого лейцина приходится 93 % суммарного включения всех трех предшестл л венников, тогда как на долю Н-пролина и Н-лизина — всего 0,4 и 6,4 %, соответственно. В клетках эпидермы включение 3Н-пролина составляет около 30 % суммарной радиоактивности, а на долю 3Н-лизина приходится около 15 %. В случае мезоглеи доля меченого пролина оказывается еще выше — более 40 %. В мезоглеальных клетках величина относительного включения 3Н-пролина выше, чем в клетках гастродермы, но значительно ниже, чем в эпи-дермальных клетках. Особенность метаболизма клеток мезоглеи заключается в более избирательном, чем в других тканях, включении 3Н-лизина: на долю этой аминокислоты приходится около 20 % общей радиоактивности.

Электрофоретический и иммунохимический анализ. При выделении мезоглеальных клеток из мезоглеи с помощью коллагеназы клетки остаются живыми, образуют псевдоподии, прикрепляются к стеклу. В клетках сохраняются специфические гранулы. С помощью электрофореза в полиакрила-мидном геле в присутствии БОБ проведен анализ белкового состава цельной мезоглеи у медуз разного возраста. Сравнение его с белковым составом очищенных мезоглеальных клеток показывает, что образец мезоглеи молодых животных с диаметром зонтика 12-14 см содержит преимущественно белки, характерных для мезоглеальных клеток, и выявляется мажорный белок с молекулярной массой 45/47 кДа (рис. 7,1). Этот белок доминирует в образцах мезоглеи и более крупных животных. Концентрация же клеточных белков начинает снижаться. У половозрелых животных с диаметром зонтика > 20 см

20-30 см) профиль белковых зон меняется, при этом клеточные белки практически не выявляются. По-видимому, масса белков популяции мезоглеаль-ных клеток неизмеримо меньше белковой массы внеклеточного матрикса на поздних стадиях развития медузы. Среди белков мезоглеи медуз этого возраста выделяются несколько мажорных зон с молекулярными массами около 30, 45/47 и 85 кДа, а также видны три белковые фракции с молекулярными массами в пределах от 100 до 200 кДа и белковые зоны с массами выше 300 кДа (рис. 7, II).

Против белков фракции 45/47 кДа были получены поликлональные антитела RA45/47. На иммуноблоте RA45/47 взаимодействуют в мезоглее с белком 45/47 кДа, против которого они и были получены (рис. 7, III, 2). В некоторых случаях в мезоглее оказывается окрашенной также зона в области 30 кДа, что, по-видимому, может быть связано с частичным протеолизом белка 45/47 кДа. Среди белков мезоглеальных клеток антитела RA45/47 окрашивают несколько дискретных зон, основной из которых является зона в области 120 кДа (рис. 7, III, 1). В эпидермальных клетках эта зона также окрашивается, хотя интенсивность окраски ниже, чем в препарате мезоглеальных клеток. Полученные антитела оказались достаточно специфичными для использования в морфологических исследованиях без дополнительной очистки.

При иммуногистохимическом окрашивании срезов молодой медузы с полученными антителами взаимодействует материал гранул мезоглеальных клеток и апикальных участков эпидермальных клеток (рис. 8). Экстраклеточный матрикс не окрашивается. Мезоглея медуз этого возраста представлена к I ш т 0) о 0

1 ш о X ш

II

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

•4ч. 4

-••♦-■- ЗН-лейцин —■— ЗН-пролин —О— ЗН-лизин — х — Фон

-----£-----------I и I I I I I II I I I I I I I I I I I И I I I I I I И I I I I

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, ч

Рис. 2. Динамика суммарной метки в тканях молодых медуз А. аигЫа после однократной инкубации животных с 3Н-лейцином, 3Н-пролином и 3Н-лизином.

По оси абсцисс - время после начала опыта, ч.

По оси ординат - интенсивность мечения, п = количество зерен серебра над условной площадью.

Приведены здесь и далее 95 %-ные доверительные интервалы средних значении.

Рис. 3. Схема разреза через тело медузы А. аигЫа. Прямоугольники с цифрами показывают участки, выбранные для количественного анализа: 1 - эпителий эксумбреллы, 2 - субэпителиальная мезоглея эксумбреллы, 3 - центральная мезоглея, 4 - мезоглеальные клетки, 5 - гастро-дерма радиального канала, 6 - мезоглея субумбреллы, 7 - эпителий субум-бреллы.

ЗН-лейцин

-♦— эпителии эксумбреллы а-- субэпэпителиальн ая мезоглея -л-- - центральная мезоглея -х— мезоглеальные клетки -ж— гастродерма

-■-•- мезоглея субумбреллы — эпителий субумбреллы ---фон

I I I I I I I I I И I I I I I I I I II I I II I I I I I I I II I I I I II I I И I 1

0 10 20 30 40 50 время, ч

Рис. 4 А. Динамика распределения метки в тканях молодых медуз о

А. аигЫа после однократной инкубации с Н-лейцином. По оси абсцисс - время после начала опыта, ч.

По оси ординат - интенсивность мечения, п = количество зерен серебра над условной площадью.

ЗН-лизин

16

14

12 ш 10 т

О) л Iо 0 1 со 15 0 1 а> 8 0 эпителии эксумбреллы - а - субэпэпителиаль ная мезоглея центральная мезоглея —х- - мезоглеальные клетки —*— гастродерма

------- мезоглея субумбреллы

-е-— эпителии субумбреллы фон 0

10

20 30 время, ч

40

50

Рис. 4 Б. Динамика распределения метки в тканях молодых медуз о

А. аигЫа после однократной инкубации с Н-лизином. По оси абсцисс - время после начала опыта, ч.

По оси ординат - интенсивность мечения, п = количество зерен серебра над условной площадью.

ЗН-пролин

25 л т

20 ее

X ф

X ф л & о X ш О

X р X

15

10 о эпителии эксумбреллы

-а - - субэпэпителиаль ная мезоглея

Д-- центральная мезоглея

-х- - мезоглеальные клетки гастродерма

•■•-мезоглея субумбреллы

-э— эпителий субумбреллы фон

10 20 30 40 50 время, ч

Рис. 4 В. Динамика распределения метки в тканях молодых медуз о

А. аигНа после однократной инкубации с Н-пролином. По оси абсцисс - время после начала опыта, ч.

По оси ординат - интенсивность мечения, п = количество зерен серебра над условной площадью.

15%

29%

15%

56% й ЗН-лейцин ■ ЗН-пролин □ ЗН-лшин

42%

3%

43%

78%

93%

Рис. 6. Относительная интенсивность включения трех аминокислот в ткани медузы А. аигНа через 13 ч после однократной инкубации животных в растворе меченых предшественников.

А - эпителий эксумбреллы, Б - мезоглея, В - гастродерма, Г - мезоглеальные клетки.

I II III

12 12 12

Рис. 7. Белковый состав мезоглеи и мезоглеальных клеток молодой (I) и зрелой (II) медуз А. аигНа (БОЗ-электрофорез в 12 % полиакриламидном геле, окраска Кумасси); имму н облогтинг препаратов зрелой медузы с антителами КА45/47 в разведении 1:1000 (III).

1 - мезоглеальные клетки, 2 - мезоглея.

Рис. 8. Взаимодействие антител ЯА45/47 (в разведении 1:1000 - А, 1:2000 - Б) с гранулами мезоглеальных клеток (А, Б) и апикальной частью эпителия эксумбреллы (Б) молодой медузы А. аигЫа выявлено с помощью щелочной фосфатазы. Об. ЮОх.

Рис. 9. Взаимодействие антител КА45/47 (в разведении 1:1000) с материалом мезоглеальных клеток и эластических волокон мезоглеи зрелой медузы А. аигНа выявлено с помощью ИТС (Б). Тот же участок мезоглеи в фазовом контрасте (А). Об. 40х.

Туника и морулярные клетки асцидий

Разделение клеток в градиенте Перколла. Разделение клеток крови проводили в градиенте, состоящем из 4-х ступеней, как указано в разделе «Материалы и методы». Фракции клеток образуются обычно на границе ступеней. Собранные из отдельных фракций и отмытые клетки остаются живыми и сохраняют свою подвижность. Большую часть клеток первой фракции (на границе плазмы и 20 % Перколла) составляют гиалиновые амебоциты, присутствуют также макрофаги и гемоцитобласты. В очень незначительных количествах могут встречаться остальные типы клеток. Вторая фракция - на границе ступеней 30 и 40 % Перколла - оказывается обогащенной гранулоци-тами, в ее состав также входят гиалиновые амебоциты, гемоцитобласты и макрофаги. Третья фракция - на границе ступеней 40 и 50 % Перколла - содержит все типы клеток, кроме гемоцитобластов, при этом количественное соотношение различных типов заметно варьирует. Данная фракция обогащена молодыми морулярными клетками. Четвертая фракция образуется на границе ступеней 50 и 65 % Перколла и содержит от 90 до 100 % зрелых морулярных клеток. Оставшуюся часть составляют молодые морулярные клетки, иногда встречаются отдельные гранулоциты и гиалиновые амебоциты.

Электрофоретическое разделение белков. Был проведен БЭЗ-электрофорез белков клеток всех полученных фракций и белков плазмы (рис. 10). Около 10 белков с молекулярными массами в пределах от 15 до 100 кДа удается выделить в плазме (рис. 10, 5). Сравнение белкового состава плазмы и клеточных фракций показало, что в процессе разделения клеток в градиенте Перколла не происходило заметного лизиса клеток, а также загрязнения клеточных фракций компонентами плазмы. Все клеточные фракции содержат 4 белковые зоны в области 16-19 кДа, которые, весьма вероятно, судя по их подвижности в условиях 8Б8-элеткрофореза и характерному соотношению зон, соответствуют коровым гистонам. В первой фракции можно насчитать не менее 20 белков в пределах от 10 до 250 кДа, представленных в клетках примерно в равных количествах. Исключение составляет белок с молекулярной массой 43 кДа, относительное количество которого значительно превышает количество остальных белков (рис. 10, 1). Клетки этой фракции отличаются высокой амебоидной подвижностью, поэтому зона 43 кДа может являться актином. Большинство белков, видимых в первой фракции, представлены и во второй фракции, меняется лишь их количественное соотношение. Отличительной чертой данной фракции является присутствие в значительном количестве белка с молекулярной массой в области 12-13 кДа (рис. 10, 2). В третьей фракции, обогащенной молодыми морулярными клетками, начинают преобладать белки с молекулярными массами 26, 43 и 47 кДа, при этом количество белка с молекулярной массой 47 кДа несколько выше, чем белка с молекулярной массой 26 кДа. Белок же с молекулярной массой 43 кДа присутствует в относительно меньшем количестве, чем в первых двух фракциях (рис. 10, 3). Видна также белковая зона с мол. массой около 12 кДа, сходная, по-видимому, с мажорной зоной предыдущей фракции в этой области. В 4-ой (нижней) фракции, которая содержит зрелые морулярные клетки, выделяются примерно в одинаковом количестве два мажорных белка с молекулярными массами 26 и 47 кДа, количество остальных белков заметно снижается (рис. 10, 4)

Пептидное картирование. Морулярные клетки асцидий обладают амебоидной подвижностью и в зрелых морулярных клетках белок 47 кДа, несмотря на незначительное отличие в молекулярной массе, мог бы быть необычной изоформой актина. Поэтому мы провели сравнительное пептидное картирование актина из поперечно-полосатых мышц кролика, белка с молекулярной массой 43 кДа из первой, второй и третьей фракций градиента Пер-колла и белка с молекулярной массой 47 кДа из фракции морулярных клеток (рис. 11). Мышечный актин кролика и белок 43 кДа асцидии разрезаются про-теазой на пептидные фрагменты с одинаковой электрофоретической подвижностью. Пептидные же фрагменты белка с молекулярной массой 47 кДа отличаются от актинов обоих видов. Таким образом, белок 47 кДа не является изоформой актина.

Антитела. Были получены поликлональные антитела против белков с молекулярными массами 26 и 47 кДа, вырезанных из акриламидного блока после 8Б8-электрофореза (АВ26 и АВ47, соответственно). Каждое из антител узнает оба белка среди белков морулярных клеток на иммуноблоте и не взаимодействует с белками клеток первой фракции (гиалиновые амебоциты, макрофаги, гемоцитобласты) при разведении антисыворотки 1:1000 (рис. 12). Аффинность АВ26 слегка выше, чем АВ47. Титр и специфичность антител полученных антисывороток оказались достаточными для использования их в дальнейшей работе.

Заряд мажорных белков морулярных клеток. Чтобы проверить, какой заряд несут белки, против которых получены антитела, был проведен кислый электрофорез морулярных клеток по Чокли, выявляющий положительно заряженные белки (рис. 13). Группа белков в нижней части геля соответствует, по всей видимости, гистонам, так как имеет ту же подвижность, что и гис-тоны из ядер печени крысы, использованные в качестве маркера. В верхней части геля были видны две белковые зоны, верхняя из которых является двойной (рис. 13, А). Обе зоны были вырезаны из геля, гомогенизированы в буфере для проб и разделены в 8Б8-электрофорезе. Результаты этого разделения показывают, что верхняя двойная полоса имеет молекулярную массу 47 кДа, а нижняя зона - молекулярную массу 26 кДа (рис. 13, В). После разделения в условиях кислого электрофореза был также проведен иммуноблот. Обе белковые зоны взаимодействовали с антителами. Но специфичность антител повысилась: не происходило перекрестного окрашивания белков антителами АВ26 и АВ47, как это было при иммуноблоте белков, разделенных в ЗББ-электрофорезе. АВ47 окрашивали только верхний белок, соответствующий белку с молекулярной массой 47 кДа, АВ26 окрашивали вторую зону с молекулярной массой 26 кДа (рис. 13, Б). Аффинность АВ47 при этом заметно выше, чем АВ26. Как белок 47 кДа, так и 26 кДа, отличаются высоким положительным зарядом.

Иммуногистохимия. Было проведено окрашивание парафиновых срезов трех видов беломорских асцидий S. rustica, В. echinata и М. citrina, принадлежащих к разным семействам одного отряда. Клетки крови на парафиновых срезах S. rustica и М. citrina не окрашиваются полученными антителами. На парафиновых срезах В. ecinata оба антитела взаимодействуют с клетками в полости тела и в тунике (рис. 14). Морфологические характеристики окрашенных клеток (размер и форма клеток, размер гранул) указывают на то, что окрашиваются морулярные клетки. Взаимодействие полученных антител именно с морулярными клетками особенно четко выявляется при обработке срезов участков репарирующей туники В. ecinata на 5-й день после нанесения разреза. На срезах, обработанных иммунными сыворотками оба антитела, как АВ26, так и АВ47 взаимодействуют с морулярными клетками в полости тела, в тунике и на раневой поверхности, где морулярные клетки, участвующие в репарации поврежденных покровов, скапливаются и выводят содержимое своих гранул на поврежденную поверхность (рис. 15). Матрикс туники дает фоновое окрашивание у S. rustica и В. ecinata и слабое, но отличное от фона, y^j I/ М. citrina.

Протеазная обработка срезов, как описано в «Материалах и методах», видимо, делает антигенные детерминанты более доступными для антител. Начинают прокрашиваться отдельные морулярные клетки М. citrina. Появляется !

I ! слабое, отличное от фона, окрашивание эндокутикулы у S. rustica и В. ecinata, j экзокутикула же остается неокрашенной. Туника М. citrina дает более интен- / сивную реакцию.

У личинки М. citrina, развитие которой происходит в клоакальной полости родительского организма, незадолго до вылупления матрикс туники окрашивается весьма интенсивно по всей толщине (рис. 16). Окрашивание это выявляется и без предварительной обработки срезов трипсином, но интенсивность окрашивания при этом снижается. В теле личинки окрашиваются также некоторые клетки мезенхимы (рис. 16, указаны стрелками).

Оказалось, что полученные антитела взаимодействуют также с гранулами отдельных тестальных клеток, окружающих зрелые ооциты, у S. rustica и В. ecinata (рис 17), гранулы же тестальных клеток М. citrina не окрашивались без предварительной обработки срезов трипсином. После обработки срезов протеазами окрашиваются гранулы большинства тестальных клеток у всех трех видов, при этом интенсивность окрашивания увеличивается. Интенсивность и специфичность окрашивания антителами АВ26 несколько выше, чем АВ47. Кроме того, у М. citrina происходило окрашивание (без предобработки протеазами) поверхности некоторых ооцитов, у S. rustica и В. ecinata такого окрашивания не наблюдалось.

При проведении иммуногистохимического исследования с использованием антител АВ26 не было показано существенных отличий при выявлении локализации антигена по сравнению с антителами АВ47 как в морулярных, так и в тестальных клетках исследованных видов асцидий.

1 2 3 4 5

Рис. 10. Белковый состав фракций клеток крови асцидии S. rustica, разделенных в градиенте Перколла. SDS-электрофорез в 12 % полиакриламидном геле, окраска Кумасси.

1 - фракция 1 (обогащена гиалиновыми амебоцитами, присутствуют макрофаги, гемоцитобласты); 2 - фракция 2 (обогащена гранулоцитами, присутствуют гиалиновые амебоциты, макрофаги, гемоцитобласты); 3 - фракция 3 (обогащена молодыми морулярными клетками, присутствуют гиалиновые амебоциты, макрофаги, гранулоциты); 4 - фракция 4 (зрелые морулярные клетки); 5 -плазма.

Рис. 13. Определение катионных свойств белков морулярных клеток S. rustica.

А - Электрофорез по Чокли белков из фракции морулярных клеток (2) выявляет два белка (обозначены # и *); в качестве маркера использован препарат гистонов из ядер клеток печени крысы (1). Окраска Кумасси. Б - Иммуноблоттинг белков морулярных клеток после электрофореза по Чокли с антителами АВ26 (1), АВ47 (3) и преимунными сыворотками (2, 4) в разведении 1:1000. Взаимодействие с антителами выявлено с помощью щелочной фосфатазы.

В - SDS-электрофорез белков # (1) и * (2), вырезанных из акриламидного блока после электрофореза по Чокли (А), в 12% полиакриламидном геле. Окраска Кумасси.

Рис. 14. Инкубация парафиновых срезов асцидии В. есЫпсйа с антителами АВ47 (А, Б) и АВ26 (В) в разведении 1:1000. Морулярные клетки в полости тела (А, В) и в тунике (Б) указаны стрелками. Взаимодействие антител с антигеном выявлено с помощью щелочной фосфатазы. Об. ЮОх.

Рис. 15. Инкубация парафиновых срезов асцидии В. есЫпШа на 5-й день репарации туники после нанесения разреза с антителами АВ26 (А) и с преиммунной сывороткой (Б) в разведении 1:1000.

Окрашиваются морулярные клетки (указаны стрелками) на поверхности разреза туники, в тунике, в полости тела. Взаимодействие антител с антигеном выявлено с помощью щелочной фосфатазы. Т - туника, П - полость тела. Об.: 25х.

Рис. 16. Инкубация срезов личинки М. citrina на поздней стадии эмбрионального развития с АВ47 после предобработки трипсином. Т - туника на теле личинки, X - туника образующая хвостовой плавник. Стрелками указаны окрашенные клетки в теле личинки. Взаимодействие антител с антигеном выявлено с помощью пероксидазы хрена. Об. 40х.

Рис. 17. Инкубация парафиновых срезов яичников S. rustica (А) и В. echinata (Б) с антителами АВ26 (1:1000).

С антителами взаимодействуют отдельные тестальные клетки (указаны стрелками). Взаимодействие антител с антигеном выявлено с помощью пероксида-зы хрена, препарат дополнительно окрашен гематоксилином-эозином. ФЭ -фолликулярный эпителий, Я - ядро ооцита, ЦО - цитоплазма ооцита. Об.: 40х.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мезоглея и мезоглеальные клетки A. aurita.

Для исследования синтеза внеклеточного матрикса мезоглеи был проведен авторадиографический анализ с использованием трех аминокислот: 3Н-лейцина, 3Н-пролина и 3Н-лизина. Выбор имеено этих аминокислот обусловлен следующими соображениями. Лейцин - аминокислота, часто встречающаяся в составе разных белков и при этом ни в одном из известных белков она не является основной. Поэтому включение 3Н-лейцина может служить маркером общих белковых синтезов и позволяет судить об общей интенсивности белкового обмена.

Хотя основной аминокислотой коллагена является глицин, его обычно не используют для исследования обмена коллагена, так как он широко представлен и в других белках и активно включается в метаболические пути. Про-лин, как в немодифицированном состоянии, так и в форме оксипролина, является второй по числу остатков аминокислотой коллагена. (Berg, 1982) В других белках он встречается в значительно меньшем количестве. Поэтому 3Н-пролин часто используют в качестве одного из маркеров коллагеновых волокон как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных (Singer, 1974; Franc et al., 1976; Заварзин, 1985; Miura, Kimura, 1985; Горышина, Чага, 1990; Ал-бертс и др., 1994).

Эластин и родственные ему белки обогащены лизином и содержат уникальный остаток (десмозин), выполняющий роль внутри- и межмолекулярных сшивок. Уникальные остатки образуютсяся при модификациях остатков лизина, уже включенных в состав белка. Поэтому 3Н-лизин был выбран как возможный маркер "эластических" волокон А. аигНа, так как согласно гистохимическим данным эти волокна содержат катионные белки, богатые лизином (Напара и др., 1996).

Таким образом, по включению лейцина можно судить об интенсивности общего белкового обмена, по накоплению пролина - об интенсивности синтеза коллагена и по включению лизина - об интенсивности синтеза эластина или его аналогов.

Авторадиографические эксперименты выявили высокую проницаемость эпителиев и подтвердили представление о матриксе мезоглеи как о среде, в которой легко диффундируют низкомолекулярные вещества. При этом предшественники могут удерживаться в тканях медуз довольно продолжительное время - до 1 сут.

Проведенный анализ показал, что интенсивный синтез матрикса мезоглеи происходит и у молодых, и у зрелых медуз. Очевидно, что у молодых животных эти процессы связаны с быстрым ростом (Напара, Чага, 1992). У зрелых животных рост замедляется и останавливается, а пролиферация мезо-глеальных клеток прекращается, но при этом происходит увеличение плотности мезоглеи за счет увеличения числа и толщины волокон (Напара, Чага, 1992; Напара и др., 1994; Напара, 1995). Следовательно, интенсивный синтез экстраклеточного матрикса на данной стадии жизненного цикла может быть связан с процессом уплотнения мезоглеи.

Характер включения разных аминокислот в ткани молодых медуз существенно различается. Так, включение 3Н-лизина в эпидерму всего в два раза превышает его включение в другие ткани, тогда как уровень включения 3Н-пролина в клетки эпидермы на ранних сроках на два порядка выше, чем в га-стродермальные клетки. Очевидно, у A. aurita основной тканью, продуцирующей коллаген, служит именно покровный эпителий. У гидры оба эпителиальных пласта способны продуцировать коллаген (Hausman, Burnett, 1971), тогда как у актинии Aiptasia diaphana — только эпидерма (Singer, 1974).

В опытах с 3Н-пролином отчетливый градиент метки в мезоглее сохраняется до 48 ч. По-видимому, молекулы коллагена, объединенные в фибриллы, медленнее перемещаются в глубокие слои мезоглеи и отложение коллагена в мезоглею медуз А. aurita носит преимущественно послойный, аппозиционный характер. В случае же 3Н-лейцина и 3Н-лизина градиент метки быстро исчезает, и через 13 ч метка равномерно распределены по всему объему мезоглеи. Поэтому можно предполагать, что значительная часть этих аминокислот используется эпителиальными клетками для синтеза белков, значительно легче мигрирующих в мезоглеальном матриксе.

Франк с соавторами (Franc et al., 1976) обнаружили интенсивное включение 3Н-пролина как в эпителиальные, так и в мезоглеальные клетки у морского пера Veretillum cynomorium. Включение 3Н-пролина в мезоглеальные клетки A. aurita также довольно значительное, в несколько раз более высокое, чем в гастродерме радиальных каналов. Однако количественная оценка показывает, что интенсивность мечения мезоглеальных клеток в этом случае на разных сроках в 20 - 40 раз ниже, чем эпителиальных. То есть, по-видимому, если мезоглеальные клетки и синтезируют коллаген, то в гораздо меньших количествах, чем клетки эпидермы. Следовательно, вопрос о возможной роли мезоглеальных клеток в синтезе коллагена остается дискуссионным.

С другой стороны, относительное включение лизина в мезоглеальные клетки выше, чем в клетки покровного эпителия, и в 2 - 3 раза выше, чем в клетки гастродермы. Таким образом, полученные данные указывают на определенную избирательность включения данной аминокислоты в белки, синтезируемые свободными клетками мезоглеи. Этот вывод соответствует результатам гистохимического анализа, согласно которым гранулы мезоглеальных клеток состоят из катионных белков с высоким содержанием лизина и цис-теина (Напара и др., 1995).

Сопоставление результатов морфологического, гистохимического (Напара и др., 1994, 1996) и описанного выше авторадиографического анализа показывает, что мезоглеальные клетки А. аигЫа синтезируют и секретируют в мезоглею неколлагеновые катионные белки, богатые лизином.

К настоящему времени из экстраклеточного матрикса кишечнополостных выделено и охарактеризовано несколько компонентов. Это белки, сходные по аминокислотному составу и антигенным свойствам с некоторыми составляющими экстраклеточного матрикса позвоночных животных - несколькими типами коллагенов, а также фибронектином, ламинином, фибриллином (Веек & а1., 1989; БсЫтис! е1 а1., 1991; Заггав ег а1., 1994; ЫеЪег-МиПег & а1., 1995). В этой связи необходимо отметить, что в более ранних работах в мезоглее медуз помимо аморфного вещества разные авторы выявляли также два типа волокон, которые морфологически были охарактеризованы как коллаге-новые и эластические (Chapman G., 1966; Elder, 1973; Franc et al., 1984; Weber, Schmid, 1985; Hanapa и др., 1994). Однако никаких компонентов, сходных с эластинами позвоночных, в мезоглее кишечнополостных до сих пор обнаружено не было.

Наиболее высокая концентрация эластических волокон у позвоночных обнаружена в тех тканях, которые подвергаются постоянным механическим деформациям, испытывают напряжение и перепады давления. "Эластичность" волокон придает ткани способность растягиваться под воздействием механической силы, а затем восстанавливаться после снятия механического воздействия (Rosenbloom et al., 1993). Морфологически эластический материал разделяют на два компонента: фибриллы и аморфный материал (Foster, 1982). В онтогенезе фибриллярный компонент появляется в ВКМ первым и, вероятно, служит остовом, на который накладывается, становясь нерастворимым, аморфный материал. Аморфный компонент является классическим эластином. Для него характерно высокое содержание неполярных аминокислотных остатков и уникальные сшивки, основанные на остатках лизина. В фибриллярном компоненте есть остатки полярных аминокислот и ощутимое количество дисульфидных сшивок (Foster, 1982 ). Аминокислотный анализ эластина позвоночных выявил высокое содержание глицина (около 30 %) и пролина (около 12 %), а также около 4 % лизина. Большинство лизиновых остатков являются предшественниками десмозина, который образуется из остатков лизина под воздействием фермента лизил-оксидазы. Десмозиновые сшивки могут образовываться как внутри одной цепи, так и между цепями, в зависимости от положения исходного остатка. С помощью той же реакции эластин может быть присоединен к коллагену. Эластин синтезируется в виде растворимого предшественника, тропоэластина, с молекулярной массой около 72 кДа (Foster, 19 82 , Rosenbloom et al., 1993).

Результаты электрофоретического анализа белкового состава мезоглеи зрелых медуз A. aurita показали наличие в ней нескольких мажорных белков. Белковый профиль мезоглеи A. aurita имеет сходство с матриксом Hydra vulgaris (Sarras et al., 1991) - у того и другого животного присутствует группа белков в области 100 - 200 кДа и >300 кДа и белок с молекулярной массой около 45 кДа. Определение антигенных свойств высокомолекулярных белков гидры показали, что эта группа белков соответствует коллаген-, фибронектин-и ламинин-подобным белкам (Sarras et al., 1991). Природа белка 45 кДа авторами не обсуждается.

В то же время белок 45/47 кДа яаляется мажором мезоглеи A. aurita. Он может оказаться не описанным до сих пор у беспозвоночных аналогом эластина.

Для проверки этого предположения были получены антитела к белку 45/47 кДа. На иммуноблоте в препарате мезоглеи данные антитела окрашивают белок, против которого они и были получены, а также в некоторых случаях зону в области 30 кДа, что, по-видимому, связано с частичным протеолизом белка 45/47 кДа. Среди белков мезоглеальных клеток при окрашивании антителами RA45/47 выявляется зона с более высокой молекулярной массой, чем собственно белок мезоглеи. Это может свидетельствовать о том, что белок 45/47 кДа синтезируется в виде высокомолекулярного предшественника, который затем подвергается модификации в процессе экскреции и включения его в ВКМ.

Такая же тенденция наблюдается при синтезе эластина позвоночных. Молекулярная масса тропоэластина - около 72 кДа. Были описаны его более высокомолекулярные формы и сложилось общее впечатление, что эти продукты представляют собой результат сшивки пептидов растворимого эластина со структурными гликопротеидами, лизил-оксидазой или обслуживающими трансформацию эластина пептидазами. Растворимые эластины с молекулярной массой меньше 72 кДа являются протеолитическими фрагментами тропоэластина, которые по каким-то причинам не включились в филаменты, не модифицированы лизил-оксидазой (Rucker, 1982).

Остатки лизина являются предшественниками сшивок в эластине. В ткани эластические волокна обычно содержат значительное количество реактивных альдегидов в форме ализила и других компонентов будущей сшивки. Эти альдегиды могут быть определены гистологически при сернокислой окраске реактивом Шиффа (Paz et al, 1982). Избирательное включение лизина ме-зоглеальными клетками может оказаться связанным с синтезом белка 45/47 кДа, принимая во внимание сходство окраски реактивом Шиффа (Напа-ра и др, 1996) и иммунохимической окраски RA45/47.

Результаты иммуногистохимического анализа гистологических препаратов А. аигЫа показали, что антиген локализуется в гранулах мезоглеальных клеток и в апикальной части клеток эпидермы, а у зрелых медуз он выявляется также в составе эластических волокон. Весьма вероятно, что мезоглеальные клетки секретируют белок, который может оказаться аналогом эластина позвоночных.

За исключением белка мембраны, подстилающего скорлупу яйца, эластин является единственным известным белком, который содержит уникальную аминокислоту - десмозин. Количество десмозина в нерастворимом эластине не различается у разных видов млекопитающих, поэтому эта сшитая аминокислота может быть использована для определения зрелого нерастворимого эластина или его аналога ^агсИег, 1982). Если эластино-подобный белок А. аигЫа не содержит десмозина из-за примитивного положения животного, может быть использован другой путь.

В аминокислотной последовательности эластина есть характерные повторяющиеся мотивы. Гексапептид А1а-Рго-01у-Уа1-01у-Уа1 (АРОУвУ) повторяется 5 раз подряд; пентапептид Уа1-Рго-01у-Уа1-01у (УРвУО) повторяется 11 раз подряд; менее поразительный тетрапептид Уа1-Рго-01у-01у (УРОв) повторяется 4 раза на кислом конце. Вдобавок эти пептиды часто повторяются в других местах последовательности и часто встречаются сходные пептиды с одной или несколькими конформационно нейтральными заменами. (11ггу, 1982). Оба пути окончательного доказательства эластино-подобия белка

45/47 кДа требуют выделения чистого растворимого белка, и это может быть сделано с помощью полученных антител RA45/47.

На данном этапе работы можно заключить, что мезоглеальные клетки A. aurita (наряду с эпидермальными клетками) определенно участвуют в процессах формирования межклеточного вещества мезоглеи.

Туника и морулярные клетки асцидий

В отличие от гемолимфы насекомых и ракообразных кровь S. rustica не коагулирует (Soderhall, Smith, 1983; Чага, 1998а). Гемоциты агглютинируют в морской воде, но добавление ЭДТА к ИМВ предотвращает агрегацию клеток. Сходные условия для разделения клеток крови асцидий использовались и другими авторами (Michibata et al., 1991; Smith, Peddie, 1992; Parrinello, Camma-rata, 1995; Azumi et al., 1997).

Разделение на фракции проведено для гемоцитов ряда видов асцидий (Schlumpberger et al., 1984; Hirata, Michibata, 1991; Smith, Peddie, 1992; Azumi et al., 1993; Camarata et al., 1993; Arizza et al., 1997). Однако состав фракций, полученных разными авторами для разных видов, довольно сильно варьирует. Это может быть связано, во-первых, с различиями в условиях разделения (плотность градиента, состав буфера для разделения, условия центрифугирования и т.д.) и, во-вторых, с различиями в составе и количественном соотношении гемоцитов у разных видов. Очевидно, что для каждого вида асцидий и для конкретной экспериментальной задачи необходимо подбирать оптимальные условия разделения.

Использованный в настоящей работе плотностный градиент Перколла дал достаточно хорошее разрешение. Четвертая фракция (65 % Перколла) содержит от 94 до 100 % зрелых морулярных клеток. Такая степень чистоты позволяет выявить основные белки, характерные для данного типа клеток. Нам удалось обнаружить два специфичных для зрелых морулярных клеток S. rustica мажорных белка с молекулярными массами 26 и 47 кДа. В молодых морулярных клетках присутствует также белок с молекулярной массой 43 кДа. Данные пептидного картирования позволяют с высокой степенью вероятности предполагать, что белок с молекулярной массой 43 кД является актином. Такое предположение подкрепляется тем фактом, что белок этот является мажорным во фракции, обогащенной гиалиновыми амебоцитами - клетками, способными к активному амебоидному движению.

Данные электрофоретического анализа показывают, что в молодых морулярных клетках белок 47 кДа присутствует в большем количестве, чем белок 26 кДа, тогда как в зрелых морулярных клетках соотношение этих белков примерно одинаково. Можно предположить, что, либо синтез белка с молекулярной массой 26 кДа начинается позже, либо он является продуктом расщепления белка с молекулярной массой 47 кДа. В пользу родства этих белков может свидетельствовать и перекрестное окрашивание белков обоими антителами.

Количество белков 26 и 47 кДа в морулярных клетках существенно превышает количество остальных белков. Известно, что морулярные клетки являются носителями фенолоксидазной (ФО) системы (Чага, 19806, 19986;

Wright, 1981; Smith, Soderhall, 1991; Jackson et al., 1993; Bailarín et al., 1994; Akita, Hoshi, 1995; Arizza et al., 1995). Поэтому, весьма вероятно, что белки, синтезируемые в этих клетках в таком количестве, являются ее компонентами.

Единственная, выделенная из гемоцитов асцидий, ФО имеет молекулярную массу 62 кДа (Hata et al., 1998). Выделение и оценка молекулярного веса фермента из гемоцитов Н. roretzi проводились методом гель-фильтрации. Поэтому сопоставить его с молекулярными весами выделенных в нашей работе белков представляется затруднительным. При ультрацентрифугировании лизата морулярных клеток асцидии Phallusia mamillata был обнаружен только белок с молекулярным весом 27 кДа, обладающий катионными свойствами (Bielig et al., 1966). Опыты по регенерации туники (Чага, 19806) свидетельствуют, что морулярные клетки, по-видимому, транспортируют в тунику структурный белок — предшественник склеротина (склеротизированного хинонами белка). В соответствии с этим было сделано предположение, что у асцидий сам фермент ФО может служить одновременно и мономерным предшественником внеклеточных склеротизированных структур (Чага, Соловей, 1986). Подобное использование о-дифенолоксидазы в качестве структурного белка имеет место при склеротизации кутикулы и оотеки у насекомых (см. обзор: Brunet, 1963), а также в случае желточных клеток, формирующих склеротизи-рованную хинонами белковую оболочку сложного яйца у трематод, цестод и моногеней (Smyth, Clegg, 1959; Ramalingam, 1971). В настоящей работе выявлены два мажорных катионных белка с общими антигенными детерминантами, и один из них имеет сходные характеристики (молекулярный вес и заряд) с белком из морулярных клеток Phallusia mamillata. К сожалению, не удалось определить, обладают ли выявленные белки фенолоксидазной активностью.

Субстратом для ФО системы служат о-дифенольные соединения. В литературе описаны несколько низкомолекулярных полипептидов (3-10 кДа), которые служат о-дифенольным компонентом ФО системы асцидий: туни-хромы, ферреасцидин, галоциамин и другие (Dorsett et al., 1987; Azumi et al., 1990; Kustin et al., 1990; Taylor et al., 1995). Все они образуют хиноны при окислении их ферментом. Как показал О.Ю. Чага (1998в), морулярные клетки S. rustica используют тирозин для синтеза о-дифенольных соединений, причем накопление их начинается довольно поздно - на стадии переходных морулярных клеток. В то время как у М. citrina накопление этих веществ идет с самой ранней стадии дифференцировки - стадии вакуолярных клеток (Чага, 1980а). Обнаруженные нами белки имеют больший молекулярный вес, а потому маловероятно, что они относятся к этой группе биополимеров.

Еще один компонент ФО системы - катионные белки, предшественники склеротина. Согласно гистохимическим данным белки морулярных клеток S. rustica содержат большое количество свободных s-аминогрупп лизина, что обеспечивает им высокий положительный заряд и делает подходящим субстратом для ФО системы (Чага, 19986). Выделенные нами катионные белки как раз и могут являться этими белками.

Одна из основных функций морулярных клеток связана с их участием в формировании кутикулярной пластинки (туники). В норме зрелые морулярные клетки активно мигрируют сквозь покровный эпителий, транспортируя в тунику все компоненты ФО системы. Часть клеток формирует белковые волокна в эндокутикуле, другие перемещаются к поверхности туники и участвуют в склеротизации верхних ее слоев, выводя содержимое своих гранул в межклеточное пространство (Endean, 1955; Barrington, Thorpe, 1968; Smith, 1970; Чага, 19806; Чага, Соловей, 1986).

Чтобы ответить на вопрос, участвуют ли белки 26 и 47 кДа в формировании туники асцидий, были проведены исследования с использованием по-ликлональных антител против этих белков.

Морулярные клетки S. rustica и М. citrina (в отличие от В. echinata) не окрашиваются полученными антителами при использовании стандартной схемы непрямого иммуногистохимического окрашивания препаратов. Возможно, это происходит вследствие специфической упаковки этих белков в гранулах морулярных клеток, маскирующей их антигенные детерминанты.

Экстраклеточные компоненты в тунике взрослых особей исследованных видов также не окрашиваются, по-видимому, из-за сильного задублива-ния белковых компонентов, выводимых в тунику. Известно, что при повреждении туники наблюдается массовая миграция клеток в область разреза, их дегрануляция и образование на поврежденной поверхности защитного слоя, который состоит из задубливаемых фенолами белков и по своим морфологическим и гистохимическим характеристикам оказывается почти идентичным нормальной экзокутикуле (Чага, 19806). Поэтому на начальных этапах восстановления поврежденной туники (на примере В. ecinata) удается наблюдать взаимодействие полученных антител с белками, выделяемыми на поверхность разреза из разрушающихся морулярных клеток. Обработка срезов растворами протеаз приводит к слабому окрашиванию матрикса туники взрослых животных, личиночная же туника - менее склеротизированная - при этих условиях окрашивается очень интенсивно.

Как и у взрослых асцидий, у личинок основную роль в морфогенезе туники играют эпидермальные клетки (Mancuso, 1965; Cavey, Cloney, 1984; Cloney, 1990). Морулярные клетки начинают проникать в тунику на поздних стадиях эмбриогенеза, когда туника личинки уже сформирована (Иванова-Казас, 1978). Одна из гипотез о формировании личиночной туники на ранних стадиях эмбриогенеза предполагает участие в этом процессе тестальных клеток (Kalk, 1963; Smith, 1967; Cavey, 1976, Cloney, Cavey, 1982; Satoh et al., 1982). Было показано, что белки, содержащие антигены АВ26 и АВ47, синтезируются тестальными клетками на ранних стадиях оогенеза, накапливаются и хранятся во время эмбриогенеза в их гранулах. При формировании личиночной туники антигены появляются в матриксе туники.

Исследования, проведенные японскими авторами (Takamura et al., 1996; Okada et al., 1996) с использованием моноклональных антител (UA165 и UA464), специфичных к белкам тестальных клеток асцидии Ciona intestinalis, также показали, что материал гранул тестальных клеток участвует в формировании личиночной туники. При этом антитела UA464 распознают антиген в периферической цитоплазме ооцита и на поверхности личинки на ранних стадиях эмбриогенеза. Необходимо отметить, что в своей работе авторы указывают на взаимодействие этих антител с частью клеток мезенхимы личинки и с некоторыми клетками крови взрослых асцидий. Однако авторы не определяют, с каким именно типом клеток взаимодействуют полученные ими антитела. Хотя сам факт такого взаимодействия, учитывая данные настоящей работы, может говорить о наличии аналогичных функций у тестальных и морулярных клеток, синтезирующих сходные белки. На основании полученных нами данных можно предположить, что мезенхимные клетки, взаимодействующие с антителами на поздней стадии личиночного развития, являются морулярными клетками, так как перед вылуплением личинки в тунике появляются зрелые морулярные клетки (Иванова-Казас, 1978).

Морулярные клетки в тунике участвуют в процессах ее формирования и регенерации: о-дифенольные соединения, окисляемые ФО, сшивают молекулы белкового субстрата и таким образом задубливают верхние слои туники (Endean, 1955; Smith, 1970; Чага, 19806). Они также участвуют в реакциях распознавания "свое - чужое" (Akita, Hoshi, 1995). И во всех этих реакциях морулярные клетки формируют экстраклеточный матрикс, состоящий из белков, стабилизированных ФО (Чага, 19806, 19986; Чага, Соловей, 1986; Bailarín et al., 1994; Akita, Hoshi, 1995). Основные белки морулярных клеток, выделенные в настоящей работе, могут являться предшественниками белков, стабилизируемых ФО.

Данные биохимических и иммуногистохимических исследований, представленные в настоящей работе, позволяют заключить, что белки 26 кДа и 47 кДа являются маркерами морулярных клеток и среди всех типов клеток крови полученные антисыворотки узнают именно этот тип клеток у исследованных видов асцидий. Эти компоненты морулярных клеток включаются в состав внеклеточного матрикса туники. Наличие в тестальных клетках белков, сходных по антигенным детерминантам с белками морулярных клеток, свидетельствует о возможной функциональной аналогии тестальных и морулярных клеток в процессах формирования туники асцидий.

Заключение

Как у кишечнополостного с сильно развитым ВКМ, медузы А. аигйа, так и у примитивных хордовых, асцидий, выявлены клеточные элементы тканей внутренней среды, которые синтезируют мажорные белки ВКМ. В обоих случаях определены, частично охарактеризованы и могут быть выделены в чистом виде с помощью полученных против них антител, не описанные ранее белки. В обоих случаях белки, синтезированные клетками, претерпевают модификации вне клетки при включении их в ВКМ: частичный протеолиз, видимо, эластино-подобного белка мезоглеи А. аигйа и ФО задубливание (скле-ротизацию) катионных белков морулярных клеток асцидий. В результате экстраклеточных модификаций в обоих случаях антигенные детерминанты белков становятся менее доступными. Выявленные клеточные элементы в обоих случаях принимают активное участие не только в синтезе ВКМ, но и в защитных реакциях организма.

В соответствии с менее продвинутым эволюционным положением вида А. аигка клеточные элементы, населяющие мезоглею и синтезирующие белки ВКМ, не являются сильно специализированными: белок ВКМ, входящий в со

ВЫВОДЫ

1. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita активно синтезируют белки на протяжении всего развития. Показана определенная изо бирательность включения Н-лизина в эти белки, что может свидетельствовать о синтезе мезоглеальными клетками белков неколлагеновой природы.

2. Белок из внеклеточного матрикса мезоглеи A. aurita с молекулярной массой 45/47 кДа накапливается в гранулах мезоглеальных клеток и в эпидер-мальных клетках эксумбреллы в течение всего развития медузы, а у зрелых животных с хорошо развитой мезоглеей обнаруживается также и в составе эластических волокон матрикса мезоглеи. Этот результат подтверждает предположение о том, что мезоглеальные клетки A. aurita участвуют в процессах формирования внеклеточного вещества мезоглеи, наряду с эпидермальными клетками.

3. В морулярных клетках асцидии Styela rustica выявляются два мажорных положительно заряженных белка с молекулярными массами 26 и 47 кДа. Эти белки присутствуют в зрелых клетках примерно в равных количествах и имеют ряд общих антигенных детерминант.

4. Белки, несущие подобные детерминанты, обнаружены в морулярных клетках других видов асцидий из отряда Stolidobranchiata - Boltenia echinata и Molgula citrina, а также в матриксе туники личинок М. citrina, что свидетельствует об участии белков 26 кДа и 47 кДа в процессах построения туники.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. 1994. Т. 2. М., Мир. 540 с.

Горышина E.H., Чага О.Ю. Сравнительная гистология тканей внутренней среды с основами иммунологии. 1990. JL, Изд. ЛГУ. 319.

Догель В.А. Тип кишечнополостных (Coelenterata). Руководство по зоологии. М.-Л. 1937. Т. 1.С. 268-369.

Догель В.А. Зоология беспозвоночных. М., Высшая школа. 1981. 559 с.

Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А.Ф. Радиоавтография. М., Высшая школа. 1977. 246 с.

Заварзин A.A. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани. М. Медгиз. 1945. 230 с.

Заварзин A.A. Основы сравнительной гистологии. 1985. Л., Изд. ЛГУ. 400 с.

Иванов A.B., Полянский Ю.И., Стрелков A.A. Большой практикум по зоологии беспозвоночных. 1981. Т. 1. М., "Высшая школа". 504 с.

Иванова-Казас О.М. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Низшие хордовые // М., Наука, 1978. 166 с.

Мечников И.И. Лекции о сравнительной патологии воспаления. М. Медгиз. 1947. 200 с.

Напара Т.О. Исследование клеток и вещества мезоглеи на разных стадиях жизненного цикла Aurelia aurita (Cnidaria: Scyphozoa). Дисс. на соиск. степени канд. биол. наук. 1995. С-Петербург. 115 с.

Напара Т. О., Чага О. Ю. Пролиферативная активность и рост популяции клеток мезоглеи у сцифомедузы Aurelia aurita. I. Мезоглеальные клетки молодых и зрелых медуз // Цитология, 1992а. Т. 34. С. 59—66.

Напара Т.О., Чага О.Ю. Пролиферативная активность и рост популяции клеток мезоглеи у сцифомедузы Aurelia aurita. И. Мезоглеальные клетки стробил и эфир // Цитология. 19926. Т. 34. С. 33-37.

Напара Т. О., Оскольский А. А., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita. I. Морфология клеток и матрикса мезоглеи // Цитология. 1994. Т. 36, № 7. С. 6—16.

Напара Т. О., Оскольский А. А., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita. II. Ультраструктурный и цитохимический анализ // Цитология. 1996. Т. 38, № 4/5. С. 456— 464.

Оскольский А. А. Гистохимическое изучение мезоглеальных эластических волокон некоторых книдарий // Фундаментальные исследования губок и кишечнополостных. Л., 1989. С. 91—93.

Праздников Е.В., Михайлова И.Г. К вопросу о характере ранних воспалительных реакций у некоторых кишечнополостных // Тр. Мурманск, морск. биол. ин-та. 1962. Вып. 4. С. 221-228.

Чага О.Ю. Морфология и гистохимия клеток крови асцидии Molgula citrina II Цитология. 1980а. Т. 22. С. 287-295.

Чага О.Ю. Орто-дифенолоксидазная система асцидий // Цитология. 19806. Т. 22. С. 619-625.

Чага О.Ю. Авторадиографический анализ процессов репродукции и диффе-ренцировки клеток крови асцидии Molgula citrina II Цитология 1982. Т. 24. С. 1305-1123.

Чага О.Ю. Исследование системы клеток крови асцидий и ее взаимодействия с туникой. Автореф. дисс. на соиск. уч. степени канд. биол. наук. Ленинград. 1983. 21 с.

Чага О.Ю. Клетки крови асцидии Styela (Goniocarpa) rustica. I. Гистологический анализ // Цитология. 1998а. Т. 40. С. 31-44.

Чага О.Ю. Клетки крови асцидии Styela (Goniocarpa) rustica. II. Цитохимический анализ //Цитология. 19986. Т. 40. С. 45-57.

Чага О.Ю. Клетки крови асцидии Styela (Goniocarpa) rustica. III. Авторадиографическое исследование метаболизма клеток крови // Цитология. 1998в. Т. 40. С. 58-68. Чага О.Ю., Соловей И.В. Кутикулярные эпителии и гранулярные амебоциты //

Цитология. 1986. Т. 28. С. 254-270. Шапошникова Т.Г., Чага О.Ю. Исследование структуры митотического цикла гемоцитобластов у асцидии Molgula citrina. Цитология. 1984. Т. 26, №

10, с. 1119-1123.

Adams Е. Invertebrate collagens // Science. 1978. Vol. 202. P. 591-598. Agudelo M.I., Kustin K., Mcleod G.C., Robinson W.E., Wang R.T. Iron accumulation in tunicate blood cells. I. Distribution and oxidation state of iron in the blood of Boltenia ovifera, Styela clava, and Molgula manhattensis II Biol. Bull. 1983. Vol. 165. P. 100-109. Akita, N., Hoshi, M. Hemocytes release phenoloxidase upon contact reaction, an allogeneic interaction, in the ascidian Halocynthia roretzi И Cell Struct. Funct. 1995. Vol. 20. P. 81-87. Andersson K., Sun S.C., Boman H.G., Steiner H. Purification of the prophenoloxidase from Hyalophora cecropia and four proteins involved in its activation // Insect Biochem. 1989. Vol. 19. P. 629-637. Arizza, V., Cammarata, M., Tomasino, M.C., Parrinello, N. Phenoloxidase characterization in vacuolar hemocytes from the solitary ascidian Styela plicata II J. Invertebr. Pathol. 1995. Vol. 66. P. 297-302. Arizza V., Cooper E., Parrinallo N. Circulating hemocytes and pharyngeal explants of Styela clava release hemagglutinin in vitro // J. Mar. Biotechnol. 1997. Vol. 5. P. 31-35.

Ashida M. A cane sugar factor suppressing activation of prophenoloxidase in hemolymph of the silkworm. Bombyx mori II Insect Biochem. 1981. Vol.

11. P. 57 65.

Ashida M. Purification and characterization of prophenoloxidase from haemolymph of the silkworm. Bombyx mori II Arch. Biochem. Biophys. 1971. Vol. 144. P. 749-762.

Ashida M., Yoshida H. Limited proteolysis of prophenoloxidase during activation by microbial products in insect plasma and effect of phenoloxidase on electrophoretic mobilities of plasma proteins // Insect Biochem. 1988. Vol. 18. P. 11 19.

Aso Y., Kramer K.J., Hopkins T.L., Lookhart G.L. Characterization of haemolymph protyrosinase and a cuticular activator from Manduca sexta (L) // Insect Biochem. 1985. Vol. 15. P. 9-17.

Aspan A., Soderhall K. Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells and its activation by an endogenous serine protease // Insect Biochem. 1991. Vol. 21. P. 363-373.

Aspan A., Huang T., Cerenius L., Soderhall K. cDNA cloning of prophenoloxidase from the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus and its activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 939-943.

Azumi, K., Yokosawa, H., Ischii, S. Halocyamins: novel antimicrobial tetrapeptide-like substences isolated from the hemocytes of the solitary ascidian Halocynthia roretzi II Biochemistry. 1990a. Vol. 29. P. 159-165.

Azumi K., Yokosawa H., Ishii S-I. Presence of 3, 4 dihydroxyphenylalanine-conlaining peptides in hemocytes of the ascidian, Halocynthia roretzi II Experientia. 1990b. Vol. 46. P. 1020-1023.

Azumi K., Yokosawa H., Ishii S-I. Lipopolysaccharide induces release of a metalloprotease from hemocytes of the ascidian Halocynthia roretzi II Dev. Comp. Immunol. 1991a. Vol. 15. P. 1-7.

Azumi K., Ozeki S., Yokosawa H., Ishii S-I. A novel lipopolysaccharide-binding hemagglutinin isolated from hemocytes of the solitary ascidian Halocynthia roretzi: it can agglutinate bacteria // Dev. Comp. Immunol. 1991b. Vol. 15. P. 9-16.

Azumi K., Satoh N., Yokosama H. Functional and structural characterization of hemocytes of the solitary ascidian, Halocynthia roretzi II J. Exp. Zool. 1993. Vol. 265. P. 309-316.

Ballarin L., Cima F., Sabbadin A. Histochemical staining and characterization of the colonial ascidian Botryllus schlosseri hemocytes // Boll. Zool. 1993. Vol. 60. P. 19-24.

Ballarin, L., Cima, F., Sabbadin, A. Phenoloxidase in the colonial ascidian Botryllus schlosseri (Urochordata: Ascidiacea) // Anim. Biol. 1994. Vol. 3. P. 41-48.

Bandman, E., Matsuda, R., Strohman, R.C. Myosin heavy chains from two different adult fast-twitch muscles have different peptide maps but identical mRNAs // Cell. 1982. Vol. 92. P. 645-650.

Barrington E.J.W., Thorpe A. Histochemical and biochemical aspects iodine binding in the tunic of the ascidian, Dendrodoa grossularia (Van Beneden) // Proc. Roy. Soc. 1968. Vol. B171. P. 91-109.

Bayer, E., Schiefer, G., Waidelich, D., Scippa, S., De Vicentiis, M. Structure of the tunichrome of tunicates and its role in concentrating vanadium // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992. Vol. 31. P. 52-54.

Beck K., McCarthy R.A., Chiquet M., Masuda-Nakagawa L., Schlage W.K. Structure of the basement membrane protein laminin: Variations on a theme. In: "Cytoskeletal and Extracellular Proteins in Biophysics" (U. Aebi & J. Engel, Eds.). Springer-verlag, NY/Berlin. Vol. 3. P. 102-105.

Berg R.A. Determination of 3- and 4-Hydroxiproline. In: Methods in Enzymology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederiksen D.W.). P. 372-398.

Berrill N.J. The Tunicata. 1950. London: The Ray Society. 411 p.

Bielig H.J., Bayer E., Dell H.D., Rohms G., Mollinger H., Rudiger W. Chemistry of hemovanadin // Prot. Biol Fluids. 1966. Vol. 14. P. 197-204.

Birbeck M.S.C. Electron microscopy of melanocytes: fine structure of hair-bulb premelanosomes // Ann. N.Y. Acad. Sci. Vol. 100. P. 540-547.

Brunet P. C. J. Tyrosine metabolism in insects // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1963. Vol. 100 P. 1020—1034.

Brunet P.C.J. Sclerotins // Endeavour. 1967. Vol. 26. P. 68-74.

Bynum M.A., Black R.E. Ultrastructure of mesoglea in strobilae of Chrysaora quinquencirrha (Scyphozoa) // J. Exp. Zool. 1974. Vol. 187. P. 323-334.

Cammarata M., Parrinello N., Arizza V. In vitro release of lectin from Phallusia mamillata hemocytes after their fractionation on a density gradient // J. Exp. Zool. 1993. Vol. 266. P. 319-327.

Cammarata M., Arizza V., Parrinello N., Candore G., Caruso C. Phenoloxidase-dependent cytotoxic mechanism in ascidian (Styela plicata) hemocytes active against erythrocytes and K562 tumor cells // Eur. J. Cell Biol. 1997. Vol. 74. P. 302-307

Canicatti C., Gotz P. Dopa oxidation by Holothuria polii coelomocyte lysate // J. Invertebr. Pathol. 1991. Vol. 58. P. 305-310.

Cavey M.J. Ornamentation of the larval tunic by test cells // J. Ultrastruct. Res. 1976. V. 55, P. 297-298.

Cavey M.J., Cloney R.A. Development of the larval tunic in a compound ascidian: morphogenetic events in the embryos Distaplia occidentalis II Can. J. Zool. 1984. Vol. 62. P. 2392-2400.

Chapman D.M. Cnidarian histology. In: Coelenterate biology. Reviews and new perspectives. Eds. Muskatine L., Lenhoff H. Acad. Press. NY - SF - London. 1974. P. 1-93.

Chapman G. The mesoglea of Pelagia noctiluca II Quart. J. Micr. Sci. 1959. Vol. 100, P. 599-610.

Chapman G. The structure and function of the mesoglea. Cnidaria and their evolution// Symp. Soc. Ed. Rees. London. 1966. Vol. 16. P. 147-168.

Chen J.S., Rolle R.S., Marshall M.R., Wei C.I. Comparison of phenoloxidase activity from Florida spiny lobster and Western Australian lobster // J. Food Sei. 1991. Vol. 56. P. 154-160.

Chosa N., Fukumitsu T., Ohnishi E. Activation of prophenoloxidase Al by an activating enzyme in Drosophila melanogaster II Insect Biochem. Mol. Biol. 1997. Vol. 27. P. 61-68.

Cima F., Ballarin L., Sabbadin A. New data on phagocytosis in the compound as-cidian Botryllus schlössen (Tunicata: Ascidiacea) // Ital. J. Zool. 1996. Vol. 63. P. 357-364.

Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W., Laemmli, U.K. Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252. P. 1102-1106.

Cloney R.A. Larval tunic and the function of test cells in ascidians // Acta Zool. 1990. Vol. 71. P. 151-159.

Cloney R.A., Cavey M.J. Ascidian larval tunic: Extraembrionic structures influence morphogenesis // Cell Tissue Res. 1982. V. 222, P. 547-562.

Coles J.A., Pipe R.K. Phenoloxidase activity in the haemolymph and haemocytes of the marine mussel, Mytilus edulis II Fish Shellfish Immunol. 1993. Vol. 4. P. 337-352.

Dan-Sohkawa M., Morimoto M., Mishima H., Kaneko H. Characterization of coelomocytes of the ascidian Halocynthia roretzi based on phase-contrast, time-lapse video and scanning electron microscopic observations // Zool. Sei. 1995. Vol.12. P. 289-301.

De Leo G., Parrinello N., Parrinello D., Cassara G., di Bella M.A. Encapsulation response of Ciona intestinalis (Ascidiacea) to intratunical erythrocyte injection. I. The inner capsular architecture // J. Invertebr. Pathol. 1996. Vol. 67. P. 205-212

De Leo G., Parrinello N., Parrinello D., Cassara' G., Russo D., Di Bella M.A. Encapsulation response of Ciona intestinalis (Ascidiacea) to intratunical erythrocyte injection // J. Invertebr. Pathol. 1997. Vol. 69. P. 14-23

Dilly P.N. The ultrustructure of the test of the tadpole larva of Ciona intestinalis II Z. Zellforsch. 1969. V. 95, P. 331-346.

Dohke K. Studies on prophenoloxidase-activating enzyme from cuticle of the silkworm, Bombyx mori II Arch. Biochem. Biophys. 1973. Vol. 157. P. 203-209.

Dorsett, L.C., Hawkins, C.J., Grice, J.A., Lavin, M.F., Merefield, P.M., Parry, D.L., Ross, I.L. Ferreascidin: a highly aromatic protein containing 3,4-dihydroxiphenylalanine from the blood cells of a stolidobranch ascidian // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 8078-8082.

Durrant H.J., Ratcliffe N.A., Hipkin C.R., Aspan A., Soderhall. Purification of the prophenoloxidase enzyme from haemocytes of the cockroach Blaberus dis-coidalis I I Biochem. J. 1993. Vol. 289. P. 87-91.

Elder H. Distribution and function of elastic fibres in the invertebrates // Biol. Bull. 1973. Vol. 144. P. 43-63.

Endean, R. Studies of the blood and test of some Australian ascidians. I. Blood of Pyura stolonifera (Heller) // Austr. J. Mar. Freshwater Res. 1955. Vol. 6. P.35-59.

Endean R. The blood cells of the ascidian, Phallusia mammaliata II Quart. J. Mic. Sci. 1960. Vol.101. P.177-197.

Ermak T.H. An autoradiographic demonstration of blood cells renewal in Styela clava II Experementia, 1975, v.31, p.857-839.

Foster J.A. Elastin structure and biosynthesis: an overview. In: Methods in Enzy-mology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederiksen D.W.). P. 559-570.

Franc S., FrancJ. M., Garrone R. Fine structure and cellular origin of collagenous matrices in primitive animals: Porifera, Cnidaria and Ctenophora // Front. Matrix Biol. 1984. Vol. 3. P. 143—156.

Frank U., Rinkevich B. Scyphozoan jellyfish's mesoglea supports attachment, spreding and migration of anthozoans' cells in vitro // Cell Biol. Int. 1999. Vol. 23. P. 307-311.

Fujimoto K., Okino N., Kawabata S-I., Iwanaga S., Ohnishi E. Nucleotide sequence of the cDNA encoding the proenzyme of phenol oxidase Ai of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 7769-7773.

Fuke M.T. Studies on the coelomic cells of same Japanese ascidians // Bull. Mar. Biol. 1979. Vol. 16. P.143-159.

Fuke M.T. "Contact reactions" between xenogenic or allogenic coelomic cells of solitary ascidians // Biol. Bull. 1980. Vol. 158. P. 304-315.

Fuke, M., Fukumoto, M. Correlative fine structural, behavioral, and histochemical analysis of ascidian blood cells // Acta Zool. 1993. Vol. 74. P. 61-71.

Goodbody, I. The physiology of ascidians // Adv. Mar. Biol. 1974. Vol. 12. P. 2149.

Hall M., Scott T., Sugumaran M., Soderhall K., Law J.H. Proenzyme of Manduca sexta phenol oxidase: Purification, activation, substrate specificity of the active enzyme, and molecular cloning // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 7764-7768.

Har-el R., Tanzer M.L. Extracellular matrix. 3: Evolution of the extracellular matrix in invertebrates // FASEB J. 1993. Vol. 7. P. 1115-1123.

Harvey L.A. The of the cytoplasmic inclusions of the egg of Ciona intestinalis (L.) during oogenesis and fertilization // Proc. Roy. Soc. London. 1927. V. 101, P. 136-162.

Hata S., Yokosawa H. Ascidian phenoloxidase: its release from hemocytes, isolation, characterization and physiological roles // Comp. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 119. P. 769.

HausmanR.E., Burnett A.L. The mesoglea of Hydra. IV. A qualitative radioautographic study of the protein component // J. Exp. Zool. 1971. Vol. 177. P. 435—446.

Hirose E., Y.Saito, H.Watanabe. Tunic cell morphology and classification in botryllid ascidians // Zool. Sci. 1991. Vol. 8. P. 951-958.

Hirata J., Michibata H. Valency of vanadium in the vanadocytes of Ascidia gem-mata separated by density-gradient centrifugation // J. Exp. Zool. 1991. Vol. 257. P.160-165.

Hiruma K., Riddiford L.M. Granular phenoloxidase involved in cuticular melaniza-tion in the tobacco hornworm: regulation of its synthesis in the epidermis by juvenile hormone // Develop. Biol. 1988. Vol. 130. P. 87-97.

Hughes L., Price G.M. Tyrosinase activity in the larva of the fleshfly, Sarcophaga barbarta II J. Insect Physiol. 1975. Vol. 21. P. 1373-1384.

Jackson, A.D., Smith, V.J., & Peddie, C.M. In vitro phenoloxidase activity in the blood of Ciona intestinalis and other ascidians // Dev. Comp. Immunol. 1993. Vol. 17. P. 97-108.

Ji X., Azumi K., Sasaki M., Nonaka M. Ancient origin of the complement lectin pathway revealed by molecular cloning of mannan binding protein-associated serine protease from a urochordate, the Japanese ascidian, Halo-cynthia roretzi // Proc . Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 6340-6345.

Johansson, M.W., Soderhall, K. The prophenoloxidase activating system and associated proteins in invertebrates // Prog. Mol. Subcell. Biol. 1996. Vol. 15. P. 46-66.

Kalk M. Cytoplasmic transmission of a vanadium compound in a tunicate oocyte, visible with electronmicroscopy // Acta Embryol. Morphol. Exp. 1963. V. 76, P. 289-303.

Kaneko A., T.Uyama,, Y.Moriyama, H.Michibata. Localization, with monoclonal antibodies and by detection of autonomous fluorescence, of blood cells in the tissues of the vanadium-rich ascidian, Ascidia sydneyensis samea II Zool. Sci. 1995. Vol. 12. P. 733-739.

Kawabata T., Yasuhara Y., Ochiai M., Matsuura S., Ashida M. Molecular cloning of insect pro-phenol oxidase: A copper-containing protein homologous to arthropod hemocyanin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 7774-7778.

Kessel R.G., Beams H.W. An unusual configuration of the Golgi complex in pigment-producing "test" cells of the ovary of the tunicate, Styela II J. Cell Biol. 1965. V. 25, P. 55-67.

Kessel R.G., Kemp N.E. An electron microscope study on the oocyte, test cells and follicular envelope of the tunicata, Molgula mahattensis II J. Ultrustruct. Res. 1962. V. 6, P. 57-76.

Knight D.P. Sclerotization of the Calyptoblastic hydroid Laomedea flexuosa. 2. Histochemical demonstration of phenoloxidase and attempted demonstration of peroxidase // Tissue and Cell. 1971. Vol. 3. P. 57-64.

Kopacek P., Weise C., Gotz P. The prophenoloxidase from the wax moth Galleria mellonella: Purification and characterization of the proenzime // Insect Bio-chem. Mol. Biol. 1995. Vol. 25. P. 1081-1091.

Kuo M.J., Alexsander M. Inhibition of the lysis of fungi by melanins // J. Bacteriol. 1967. Vol. 94. P. 624-629.

Kustin, K., Robinson, W.E., Smith, M.J. Tunichromes, vanadium, and vacuolated blood cells in tunicates // Invert. Reprod. Dev. 1990. Vol. 17. P. 129-139.

Kwon T.H., Lee S.Y., Lee J.H., Choi J.S., Kawabata S., Iwanaga S., Lee B.L. Purification and characterization of prophenoloxidase from the hemolymph of coleopteran insect, Holotrichia diomphalia larvae // Mol. Cells. 1997. Vol. 28. P. 90-97.

Laemmli, U.K. Cleavage of structural protein during the essambly of the head of the bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 4. P. 680-682.

Lee H.S., Cho M.Y., Lee K.M., Kwon T.H., Homma K., Lee B.L. The prophenoloxidase of coleopteran insect, Tenebrio molitor, larvae was activated during cell clump/cell adhesion of insect cellular defense reactions // FEBS Lett. 1999. Vol. 444. P. 255-259.

Leonard C., Soderhall K., Ratclifle N.A. Studies on prophenoloxidase and protease activity of Blaberus craniifer haemocytes // Insect Biochem. 1985. Vol. 15. P. 803-810.

Mancuso V. An electron microscope study on the oocyte, test cells and follicle cells of Ciona intestinalis during oogenesis // Acta Embryol. Morphol. Exp. 1965. Vol. 8. P. 239-266.

Michibata, H. New aspects of accumulation and reduction of vanadium ions in as-cidians, based on concerted investigation both a chemical and biological viewpoint // Zool. Sci. 1989. Vol. 6. P. 639-647.

Michibata H., J. Hirata, M. Uesaka, T. Numakunai, H. Sakurai. Separation of va-nadocytes: Determination and characterization of vanadium ion in the separated blood cells of the ascidian, Ascidia ahodori II J. Exp. Zool. 1987. Vol. 244. P. 33-38.

Michibata H., Iwata Y., Hirata J. Isolation of highly acidic and vanadium-containing blood cells from among several types of blood cell from As-cidiidae species by density-gradient centrifugation // J. Exp. Zool. 1991. Vol. 257. P. 306-313.

Milanesi C., Burighel P. Blood cell ultrastructure of the ascidian Botrillus schlosseri. I. Hemoblast, granulocyte, macrophage, morula cell and nephro-cyte//Acta Zool. 1978. Vol. 59. P. 135-147.

Miura S., Kimura S. Jellifish mesoglea collagen. Characterization of molecules as ala2a3 hetrotrimers // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 15352-15356.

Munn E.A., Bufton S.F. Purification and properties of a phenoloxidase from the blowfly Calliphora erythrocephala II Eur. J. Biochem. 1973. Vol. 35. P. 310.

Naqvi S.N.H., Karlson P. Purification of prophenoloxidase in the haemolymph of Calliphora vicina (R & D) // Arch. Int. Physiol. Biochem. 1979. Vol. 87. P. 687-695.

Nellaiaippan K., Sugumaran M. On the presence of prophenoloxidase in the hemo-lymph of the horseshoe crab, Limulus II Сотр. Biochem. Physiol. 1996. Vol. 113B.P. 163-168.

Okada Т., Takamura K., Yamaguchi Y., Yamamoto M. Secretory function of the test cell in larval tunic formation in the ascidian Ciona intestinalis: an im-munoelectron microscopic study // Zool. Sci. 1996. V. 13, P. 253-261.

Oltz E.G., Bruening R.C., Smith M.J., Kustin K., Nakanishi K. The tunichromes. A class of reducing blood pigments from sea squirts: isolation, structures, and vanadium chemistry // J. Amer. Chem. Soc. 1988. Vol. 110. P.6162-6172.

Panyrm, S., Chalckley, R. High resolution akiylamide gel electrophoresis of his-tones // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 130. P. 337-346.

Parrinello, N., Cammarata, M. Collection, separation, identification and phagocytic activity of tunicate hemocytes. In: Techniques in Fish Immunology-4 (J.S. Stolen, T.C. Fletcher, S.A. Smith, J.T. Zelikoff, S.L. Kaattari, R.S. Anderson, K. Soderhall, and B.A. Weeks-Perkins, eds.). SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA. 1995. P. 1-15.

Parrinello N., Cammarata M., Arizza V. Univacuolar refractile hemocytes from the tunicate Ciona intestinalis are cytotoxic for mammalian erythrocytes in vitro // Biol. Bull. 1996. Vol. 190. P. 418-425.

Parry D.L., Brand S.G., Kustin K. Distribution of tunichrome in the Ascidiancea // Bull. Mar. Sci. 1992. Vol. 50. P. 302-306.

Paz M.A., Keith D.A., Gallop P.M. Elastin isolation and cross-linking. In: Methods in Enzymology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederik-sen D.W.). P. 571-587.

Pentz E.S., Black B.C., Wright T.R.F. A diphenoloxidase gene is part of a cluster of genes involved in catecholamine metabolism and sclerotization in Droso-phila. I. Identification of the biochemical defect in Dox-A2 (l(2)37Bf) mutants // Genetics. 1986. Vol. 112. P. 823-841.

Pentz E.S., Wright T.R.F. Drosophila melanogaster diphenoloxidase A2: gene structure and hhomology with the mouse mast-cell turn" transplantation antigen, P91A // Gene. 1991. Vol. 103. P. 239-242.

Ramalingam K. Studies on vitelline cells of monogenea. IV. Presence of masked phenol and its significance // Acta histochem. 1971. Vol. 41. P. 72—78.

Ratcliffe, N.A., Rowley, S.W., Fitzerald, S.W., Rhodes, C.P. Invertabrate immunity: basic concepts and recent advances // International review of cytology. 1985. Vol. 97. P. 184-350.

Reber-Muller S., Spissinger T., Schuchert P., Spring J., Schmid V. An extracellular matrix protein of jellyfish homologous to mammalian fibrillins forms different fibrils depending on the life stage of animal // Dev. Biol. 1995. Vol. 169. P. 662-672.

Reveberi G. Observations on the ultrastructure of the "test cells" of Molgula impura II Acta Embriol. Exp. 1978. V. 2, P. 29-245.

Robinson W.E., Kustin K., McLeod G.C. Incorporation of 14C-glucose into the tunic of the ascidian, Ciona intestinalis (Linnaeus) // J. Exp. Zool. 1983. Vol. 225. P. 187-195.

Rosenbloom J., Abrams W.R., Mecham R. Extracellular matrix 4: The elastic fiber // FASEB J. 1993. Vol. 7. P. 1208-1218.

Rowley A.F. The blood cells of the sea squirt, Ciona intestinalis: morphology, differential counts and in vitro phagosytic activity // J. Invertbr. Pathol. 1981. Vol. 37. P. 91-100.

Rowley A.F., Brookman J.L., Ratcliffe N.A. Possible involvement of the prophe-noloxidase system of the locust, Locusta migratoria, in antimicrobial activity // J. Invertebr. Pathol. 1990. Vol. 56. P. 31-38.

Rucker R.B. Isolation of soluble elastin from copper-deficient chick aorta. In: Methods in Enzymology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederiksen D.W.). P. 650-656.

Sarras M.P. Jr., Madden M.E. et al. Extracellular matrix (mesoglea) of Hydra vulgaris. I. Isolation and characterization // Dev. Biol. 1991. Vol. 148. P. 481-494.

Sarras M.P. Jr., Zhang X., Huff J.K., Accavitti M.A., St John P.L., Abrahamson D.R. Extracellular matrix (mesoglea) of Hydra vulgaris. III. Formation and function during morphogenesis of hydra cell aggregates // Dev. Biol. 1993. Vol. 157. P. 383-398.

Sato S., Masuya H., Numakunai T., Satoh N., Ikeo K., Gojobori T., Tamura K., Ide H., Takeuchi T., Yamamoto H. Ascidian tyrosinase gene: its unique structure and expression in the developing brain // Dev Dynamics. 1997. Vol. 208. P. 363-74

Sato S., Toyoda R., Katsuyama Y., Saiga H., Numakunai T., Ikeo K., Gojobori T., Yajima I., Yamamoto H. Structure and developmental expression of the ascidian TRP gene: insights into the evolution of pigment cell-specific gene expression // Dev Dynamics. 1999. Vol. 215. P. 225-237

Satoh N., Numakunai T., Hori R. Behaviour and cellular morphology of the test cells during embriogenesis of the ascidian Halocynthia roretzi II J. Mor-phol. 1982. V. 171, P. 29-223.

Saul S., Sugumaran M. Prophenoloxidase activation in the hemolymph of Sarcophaga bullata larvae // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1988. Vol. 7. P. 91-103.

Sawada T., Fujikura Y., Tomonaga S., Fukumoto T. Cllassification of ten hemocyte types in the tunicate Halocynthia roretzi II Zool. Sci. 1991. Vol. 8. P. 939950.

Sawada T., Zhaug J., Cooper E.L. Classification and characterization of hemocytes in Styela clava II Biol. Bull. 1993. Vol. 184, P. 87-96.

Schlumpberger J.M., Weissman I.L., Scofield V.L. Separation and labelling of specific subpopulation of Botryllus blood cells // J. Exp. Zool. 1984. Vol. 229. P. 401-411.

Schmid V., Bally A, Beck K., Haller M, Schlage W.K., Weber C. The extracellular matrix (mesoglea) of hydrozoan jellyfish and its ability to support cell adhesion and spreading // Hydrobiologia. 1991. Vol. 216/217. P. 3—10.

Schmid V., Baader C., Bucciarelli A., Reber-Muller S. Mechanochemical interactions between striated muscle cells of jellyfish and grafted extracellular matrix can induce and inhibit DNA replication and transdifferentiation in vitro // Dev. Biol. 1993. Vol. 155. P. 483-496.

Schmid V., Ono S.I., Reber-Muller S. Cell-substrate interactions in cnidaria // Mi-crosc. Res. Tech. 1999. Vol. 15. P. 254-268.

Sekeris C.E., Mergenhagen D. Phenoloxidase system of the blowfly, Calliphora erytrocephala // Science. 1964. Vol. 145. P. 68-69.

Simpson B.K., Marshall M.R., Otwell W.S. Phenoloxidase from pink and white shrimp: kinetic and other properties // J. Food Biochem. 1988. Vol. 12. P. 205-209.

Singer I. 1. An electron microscopic and autoradiographic study of mesogleal organization and collagen synthesis in the sea anemone Aiptasia diaphana II Cell Tissue Res. 1974. Vol. 149. P. 537—554.

Smith K. Genetic control of macromolecular synthesis during development of an ascidian Ascidia nigra II J. Exp. Zool. 1967. V. 164, P. 393-406.

Smith M.J. The blood cells and tunic of the ascidian Halocynthia aurantuim (P.). I. Hematology, tunic morphology and partition of cells between blood and tunic // Biol. Bull. 1970a. Vol. 139. P. 354-378.

Smith, M.J. The blood cells and tunic of the ascidian Halocynthia aurantium (Pallas). II. Histochemistry of blood cells and tunic // Biol. Bull. 1970. Vol. 138. P. 379-388.

Smith, V.J. The prophenoloxidase activating system: a common defence pathway for deuterostomes and protostomes? // Adv. Comp. Environm. Physiol. 1996. Vol. 23. P. 75-114.

Smith, V.J., Soderhall, K. A comparison of phenoloxidase activity in the blood of marine invertebrates //Dev. Comp. Immunol. 1991. Vol. 15. P. 251-261.

Smith, V.J., Peddie, C.M. Cell cooperation during host defence in the solitary tunicate Ciona intestinalis (L) // Biol. Bull. 1992. Vol. 183. P. 211-219.

Smyth J.D., CI egg J. A. Egg shell formation in trematodes and cestodes // Exper. Parasitol. 1959. Vol. 8. P. 286—323.

Soderhall K. Prophenoloxidase activating system and melanization - a recognition mechanism of arthropods? A review // Dev. Comp. Immunol. 1982. Vol. 6. P. 601-611.

Soderhall K., Ajaxon R. Effect of quinones and melanin on mycelial growth of Aphanomyces astaci, a parasite on crayfish // J. Invertebr. Pathol. 1982. Vol. 39. P. 105-109.

Soderhall K., Cerenius L. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity // Curr. Opin. Immunol. 1998. Vol. 10. P. 23-28.

Soderhall K., Hall L. Lipopolysaccharide-induced activation of prophenoloxidase activating system in crayfish haemocyte lysate //Biochem. Biophys. Acta. 1984. Vol. 797. P. 99-104.

Soderhall K., Hall L., Unestam T., Nyhlen L. Attachment of phenoloxidase to fungal cell walls in arthropod immunity // J. Invertebr. Pathol. 1979. Vol. 34. P. 285-294.

Soderhall K., Smith V.J. The prophenoloxidase activating system as a recognition and defense system in arthropods. In: Gupla A.P. (ed.) Hemocytic and humoral immunity in arthropods. Wiley, New York. 1986. P. 251-286.

Soderhall, K., Smith, V.J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution // Dev. Comp. Immunol. 1983. Vol. 7. P. 229-239.

St Leger R.J., Cooper R.M., Charnely A.K. The effect of melanization of Manduca sexta cuticle on growth and infection by Metarhizium anisopliae II J. Invertebr. Pathol. 1988. Vol. 52. P. 459-470.

Starcher B.C. Antibodies to desmosine. In: Methods in Enzymology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederiksen D.W.). P. 759-761.

Stidwill R.P., Christen M. Alteration of fibronectin affinity during differentiation modulates the in vitro migration velocities of Hydra nematocytes // Cell Motil. Cytoskeleton. 1998. Vol. 41. P. 68-73.

Sugumaran M., Nellaiappan K. Lysolethitin - a potent activator of prophenoloxidase from the hemolymph of the lobster, Homarus americanas II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 176. P. 1371-1376.

Takamura K., Ueda Y., Irie U., Yamaguchi Y. Immunohistology with antibodies specific to test cells in the ascidian Ciona intestinalis suggests their role in larval tunic formation // Zool. Sci. 1996. V. 13, P. 241-251.

Taylor, S.W., Ross, M.M., Waite, J.H. Novel 3,4-di- and 3,4,5-trihydroxiphenylalanine-containing polypeptides from the blood cells of the ascidians Ascidia ceratodes and Molgula manhattensis II Arch. Biochem. Biophys. 1995. Vol. 324. P. 228-240.

Thomson J.A., Sin Y.T. The control of prophenoloxidase activation in larval haemolymph of Calliphora II J. Insect Physiol. Vol. 16. P. 2063-2074.

Tillet E., Franc J.M., Franc S., Garrone R. The evolution of fibrillar collagens: a sea-pen collagen shares common features with vertebrate type V collagen // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1996. Vol. 113. P. 239246.

Towbin, H., Staechelin, T., Gordon, J. Electrophoretic trasfer of prteins from poly-acrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 4350-4354.

Tsukamoto T., Ishiguro M., Funatsu M. Isolation of latent phenoloxidase from prepupae of the housefly, Musca domestica II Insect Biochem. 1986. Vol. 16. P. 573-581.

Urry D.W. Characterization of soluble peptides of elastin by physical techniques. In: Methods in Enzymology. 1982. Vol. 82. Part A (Ed. by Cunningham L.W., Frederiksen D.W.). P. 673-715.

Weber C., Schmid V. The fibrous system in the extracellular matrix of hydromedu-sae//Tissue & Cell. 1985. Vol. 17. P. 811-822.

Wright, R.K. Urochordates. In: Invertebrate blood cells. Academic Press, London. 1981. P. 565-626.

Young J.A. The nature of tissue regeneration after wounding in the sea anemona Calliactisparasitica (Couch) // Mar. Biol. Ass. U.K. 1974. Vol. 54. P. 559617.