Токсиколого-гигиеническая характеристика промышленно-производимых одностенных углеродных нанотрубок тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Тимербулатова Гюзель Абдулхалимовна

• Тимербулатова Гюзель Абдулхалимовна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Тимербулатова Гюзель Абдулхалимовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ЭКСПОЗИЦИЙ И ЭФФЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Физико-химические особенности, методы производства углеродных нанотрубок

1.2 Подходы к оценке производственных экспозиций к углеродным нанотрубкам на рабочих местах

1.3 Современные подходы к нормированию углеродных нанотрубок на рабочих местах

1.4 Подходы к получению биосовместимых дисперсий углеродных нанотрубок

1.5 Эффекты воздействия углеродных нанотрубок на клетки дыхательной системы в экспериментах in vitro

1.6 Эффекты воздействия углеродных нанотрубок на дыхательную систему животных в экспериментах in vivo

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Схема организации исследования

2.2 Обоснование диапазона доз одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ для экспериментов in vitro и in vivo на основании гигиенической характеристики экспозиции в условиях производства

2.3 Разработка способа получения биосовместимых дисперсий одностенных углеродных нанотрубок

2.4 Методы оценки воздействия одностенных углеродных нанотрубок на клетки дыхательной системы в экспериментах in vitro

2.5 Методы оценки воздействия одностенных углеродных нанотрубок на органы дыхательной системы крыс в эксперименте in vivo

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Обоснование концентраций/доз одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ в условиях производства для экспериментов in vitro и in vivo

3.2 Способ получения биосовместимых дисперсий одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™

3.3 Оценка воздействия одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ на клетки дыхательной системы в экспериментах in vitro

3.3.1 Оценка цитотоксичности и способности к индукции апоптоза одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™

3.3.2 Визуализация одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ в клетках дыхательной системы человека

3.3.3 Оценка экспрессии гена остеопонтина в клетках дыхательной системы под воздействием ОУНТ TUBALL™

3.3.4 Оценка генотоксичности одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™

3.4 Оценка реакции легочной ткани на воздействие одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ в экспериментах in vivo

3.5 Обоснование критериев безопасности для одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Токсиколого-гигиеническая характеристика промышленно-производимых одностенных углеродных нанотрубок»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Глобальный рынок наноматериалов, в том числе углеродных нанотрубок (УНТ), растет с каждым годом. Согласно отчету исследований рынка, выполненному Transparency Market Research (TMR) [192], ожидается большой спрос на производство углеродных нанотрубок. По данным TMR, в 2016 году глобальный рынок углеродных нанотрубок оценивался в 1,6 млрд. долларов, к концу 2023 года этот рынок составит по прогнозам уже 6,9 млрд. долларов. Ожидаемый среднегодовой рост рынка УНТ в период с 2016 г. по 2023 г. составит 22,1 %.

Углеродные нанотрубки представляют собой целый класс наноматериалов, включающий отдельные типы УНТ, различающихся по физико-химическим характеристикам. Диаметр УНТ составляет от долей до десятков нанометров, длина может достигать нескольких сантиметров, что позволяет отнести УНТ к классу нановолокон [65]. В зависимости от количества графеновых слоев, углеродные нанотрубки подразделяются на одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) и многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ). Кроме того, УНТ могут отличаться наличием функциональных групп, которые способны придавать УНТ новые свойства [61, 95, 120, 128].

Углеродные нанотрубки улучшают механические, электрические и термические свойств полимеров в составе композитных материалов и находят широкое применение в таких отраслях, как строительство, автомобилестроение, аэрокосмическая промышленность, энергетика [61, 95]. Прогнозируется, что полимерная промышленность будет потреблять более 68% всех углеродных нанотрубок, произведенных в 2023 году [192]. Уникальные свойства УНТ открывают широкий потенциал для их использования в электронике [42, 95, 185], в составе материалов для защиты от коррозии [83, 178], солнечных элементов [69, 88, 111, 180], химических сенсоров [68, 82, 129], аккумуляторных батарей [40, 87], для производства биосенсоров, композитных датчиков, имплантов [49, 57, 95, 148].

Считается, что ОУНТ более подходящий наноматериал для создания композитов, поскольку в МУНТ наблюдается проскальзывание графеновых стенок одной относительно другой, так как взаимодействие между ними обусловлено в основном за счет слабой силы Ван-дер-Ваальса, а не за счет химических связей. Таким образом, при разрушении МУНТ внутренние графеновые слои могут быть извлечены из внешних слоев по «телескопическому» механизму [181], что приводит к потерям нагрузки, передаваемой от матрицы композита к армирующему компоненту. Кроме того, одна одностенная УНТ обладает практически такими же прочностными свойствами, как одна двадцатистенная, но весит в 20 раз меньше. Таким образом, для модификации материалов углеродными нанотрубками одностенных требуется значительно меньше, чем многостенных [8]. ОУНТ имеют ряд преимуществ, связанных с уникальными оптическими свойствами последних, что делает их более привлекательными для применения в области нанобиотехнологии по сравнению с МУНТ [57]. Такие свойства ОУНТ, как рамановское рассеяние, ближняя инфракрасная фотолюминесценция и высокая оптическая абсорбция, находят свое применение в методах биомедицинской молекулярной визуализации in vitro и in vivo, например, в качестве оптических меток [57] или контрастных агентов [146] для детекции и визуализации различных биомолекул, включая белки и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) [148]. Помимо этого, сильное оптическое поглощение ОУНТ в ближней инфракрасной области [57] позволяет применять их для проведения фототермической терапии рака, минимально инвазивной по сравнению с другими методами лечения рака, такими как лучевая терапия и хирургия [80]. Потенциальной областью применения ОУНТ в области биомедицины может служить также разработка бионаносенсоров [148].

Несмотря на преимущества в области применения ОУНТ, на рынке углеродных нанотрубок доминировали МУНТ. Широкое применение ОУНТ в промышленности было невозможно из-за дорогостоящих технологий их массового производства и недостаточно разработанных методов их внесения в материалы. В настоящее время российские производители [151] заявляют о том, что им удалось

разработать технологию получения ОУНТ, значительно снижающую их стоимость, что позволяет выйти на промышленные масштабы производства.

С учетом растущих объемов производства, проведение исследований в области обеспечения безопасности при производстве и применении УНТ следует считать одним из приоритетных направлений, способствующих гармоничному развитию инновационной отрасли наноиндустрии. Безопасность УНТ вызывает обеспокоенность у специалистов в области охраны труда и потребителей продукции. Малые размеры и высокая проникающая способность, большая площадь и физико-химические свойства поверхности УНТ и, как следствие, высокая реакционная способность, обуславливают активное взаимодействие с биологическими объектами [61], что может служить причиной токсичности данного типа наноматериалов.

С увеличением воздействия наноматериалов на человека, идентификация опасности и методы оценки безопасности этих материалов приобретают большое значение [1, 7, 9, 16-20, 27, 31, 34, 35, 45, 48, 98, 116, 141, 144, 147, 155, 165, 167, 168]. Понимание того, как свойства новых наноматериалов определяют их взаимодействие с клетками, тканями и органами, становится первостепенной задачей, которую необходимо решать для обоснования подходов к безопасному использованию [133].

Важным этапом при оценке безопасности УНТ является гигиеническая оценка содержания УНТ на рабочих местах. На сегодняшний день не разработаны стандартизованные и общепринятые методы по оценке содержания УНТ в воздухе рабочей зоны. В настоящее время имеется несколько методов оценки экспозиции УНТ на рабочих местах, включающих косвенные методы (по остаточным количествам катализатора) [47, 108, 187]; измерение концентрации элементного неорганического углерода, входящего в состав углеродных нанотрубок [108, 187]; метод экспресс оценки содержания УНТ в воздухе рабочей зоны, основанный на применении Рамановской спектроскопии [169]. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки; разработка подходов по оценке экспозиции требует учета вида и физико-химических особенностей УНТ, условий производства и

факторов окружающей среды. Несмотря на отсутствие стандартизованных методов, в настоящее время уже накоплен достаточный объем данных по концентрациям УНТ в воздухе рабочих мест различных производств [108]; диапазон концентраций МУНТ составил 7,4-10 мкг/м3, концентраций ОУНТ (немногочисленные исследования) - 0,68-38 мкг/м3.

Большинство исследований по оценке токсичности УНТ направлены на изучение свойств МУНТ [63, 99, 114, 118, 139, 161, 162]. Систематический обзор литературных данных по токсичности МУНТ в экспериментах in vitro подтверждает наличие цитотоксических эффектов в отношении эпителиальных клеток дыхательных путей и макрофагов в ответ на внесение МУНТ [63]. В экспериментах in vivo выявлены локальные воспалительные, гранулематозные и фиброзные изменения в тканях дыхательной системы [99, 114, 162]. Была показана транслокация МУНТ из дыхательных путей в интерстиций, субплевральное пространство и плевру [118, 161, 139].

Оценка токсических эффектов ОУНТ в основном проводилось с использованием ОУНТ типа HiPco (High Pressure CO2) [99, 118, 162, 183]. В экспериментах in vitro описаны такие эффекты ОУНТ как индукция воспалительных процессов [46], снижение жизнеспособности клеток [183], индукция апоптоза [43]. При воздействии на органы дыхательной системы в экспериментах in vivo действие ОУНТ проявилось в развитии острого и хронического воспаления, образовании гранулемы, отложении коллагена и развитии фиброза [99, 162].

Общими ограничениями для опубликованных исследований являются: высокие концентрации/дозы, подобранные в расчете на получение хорошо фиксируемого биологического ответа; использование лабораторных очищенных и/или модифицированных образцов, а не промышленных МУНТ и ОУНТ; слабая связь модели экспозиции с реальными производственными условиями.

Для ускорения и оптимизации процесса оценки безопасности ОУНТ перспективными являются системы in vitro [97]. В настоящее время при оценке токсичности широко используются методы, альтернативные классическим тестам

на экспериментальных животных, - модели с использованием культур клеток. Широкое распространение получила концепция «3Rs» (Refinement, Reduction and Replacement), или концепция «меньше животных - меньше болезненных процедур - применение альтернативных методов», согласно которой правильная организация эксперимента должна основываться на методах, снижающих стрессовые воздействия и уменьшающих число животных, необходимых для проведения теста, или заменяющих животных моделями, например, клеточными культурами in vitro [143]. Учитывая такие преимущества экспериментов in vitro, как сравнительно низкая стоимость, высокая пропускная способность, эти исследования имеют значительный потенциал при оценке токсичности, в том числе наноматериалов [143]. Необходимость в короткие сроки оценки опасности для здоровья человека ежегодно увеличивающейся номенклатуры промышленно производимых наноматериалов и наносодержащей продукции, предназначенной для широкого использования всеми категориями населения, затрудняет использование классических токсикологических методов исследования in vivo, требующих значительных временных, трудовых затрат и больших материальных ресурсов [25]. В соответствии с REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Регистрация, оценка, авторизация и ограничение производства и использования химических веществ) испытания на позвоночных животных (например, крысах, других млекопитающих) могут использоваться только в качестве крайней меры для выполнения требований к информации для регистрации. Действиями, которые рекомендуется предпринять до экспериментов на животных, являются: 1) наличие доказательств, полученных на веществах со сходной структурой, 2) использование компьютерных моделей, например, моделей QSAR (quantitative structure-activity relationship - методы количественного предсказания и описания связи структуры с биологической активностью, 3) методы in vitro. В любом случае, результаты, полученные в моделях in vitro, должны рассматриваться как важная часть доказательств для принятия решений [158].

В связи с этим возникает необходимость выбора методов и моделей in vitro, которые могли бы если не полностью заменить эксперименты на животных, то по крайней мере сократить количество животных в исследованиях [130].

Эксперименты на культурах клеток могут также служить для выявления молекулярно-клеточных механизмов и особенностей действия веществ при контакте с биологическими объектами; полученные результаты могут быть использованы для разработки скрининговых тестов на моделях in vitro [143, 158].

Таким образом, учитывая растущие объемы производства новых типов углеродных нанотрубок и их потенциально высокую биологическую активность, проведение исследований в области обеспечения безопасности УНТ следует считать одним из приоритетных направлений, призванных сохранить здоровье работающих и помочь гармоничному развитию инновационной отрасли наноиндустрии. ОУНТ имеют ряд технологических преимуществ по сравнению с МУНТ, однако широкое применение ОУНТ в промышленности было ограничено из-за дорогостоящих технологий их массового производства и недостаточно разработанных методов их внесения в материалы. Внедрение инновационной технологии масштабного производства российских ОУНТ меняет ситуацию на рынке углеродных нанотрубок и одновременно ставит на повестку дня вопросы оценки безопасности этих материалов, включая обоснование методологических подходов.

Степень разработанности темы.

При изучении токсического действия ОУНТ в большинстве исследований органом-мишенью выбрана дыхательная система, как наиболее вероятный орган-мишень при ингаляционном пути поступления ОУНТ. В исследованиях in vitro для этих целей использовались модели с культурами клеток бронхиального эпителия (BEAS-2B) [58, 66, 174, 176, 184], альвеолярного эпителия легких (А549, LE, SAECs) [37, 46, 63, 66, 75, 113, 115, 157, 164, 172, 174, 183, 197], культуры фибробластов легких (V79, CRL1490, NHLFs) [76, 81, 103, 172], макрофагов (MDM, HMDM, RAW 264.7) [39, 59, 70, 79, 101, 134, 173, 194], клетки мезотелиомы легкого человека (MSTO-211H) [141], а также 3D модель с использованием человеческих

бронхиальных эпителиальных клеток (HBE) и человеческих фибробластов (NHLFs) [43]. В упомянутых экспериментах в основном использован ОУНТ типа HiPco [43, 46, 66, 172, 173, 176, 183, 184]. Авторами получены противоречивые результаты. В ряде исследований по оценке токсического действия ОУНТ на культуры клеток прослеживается дозозависимая степень проявления тех или иных эффектов, таких как снижение жизнеспособности клеток [66, 79, 81, 176, 184], высвобождение оксида азота [43, 184], снижение уровня антиоксидантов [172], цитотоксичность [43, 134], ингибирование клеточной пролиферации [39, 66] и апоптоз [39]. Некоторые исследователи сообщили об отсутствии цитотоксичности ОУНТ при воздействии на линии альвеолярных эпителиальных клеток человека A549 [113, 157, 164, 197].

Воздействие ОУНТ на органы дыхательной системы в экспериментах in vivo оценивалось в основном на мышах при интрафарингеальном и ингаляционном введении [50, 56, 67, 77, 90, 96, 99, 117, 126, 160, 170, 177, 191, 194, 195] интратрахеальном введении на крысах [54, 121, 123, 162]. В экспериментах чаще всего использовали ОУНТ типа HiPco [56, 90, 99, 117, 126, 162, 170, 194, 195] . При воздействии на органы дыхательной системы в экспериментах in vivo действие ОУНТ проявилось в развитии острого и хронического воспаления, образовании гранулемы, отложении коллагена и развитии фиброза [50, 54, 56, 67, 77, 90, 96, 99, 117, 121, 123, 126, 160, 162, 170, 177, 191, 194, 195].

Общими ограничениями для опубликованных исследований являются: высокие концентрации/дозы; использование лабораторных очищенных и/или модифицированных образцов, а не промышленных УНТ; слабая связь модели экспозиции в экспериментах с реальными производственными условиями.

Углеродные нанотрубки являются наноматериалами с уникальным физико-химическим свойствами, имеющими широкий потенциал применения [8, 40, 42, 49, 57, 61, 68, 69, 80, 82, 83, 87, 88, 95, 111, 129, 146, 148, 178, 180, 181, 185]. УНТ представлены большой группой наноматериалов, отличающихся методами производства, количеством слоев, наличием функциональных групп на поверхности [61, 95, 120, 128]. Разработка новых способов производства ОУНТ

приведет к появлению на рынке нового типа наноматериалов [151] с неизвестными свойствами и повлечет за собой необходимость токсиколого-гигиенической оценки с обоснованием критериев безопасности ОУНТ. В настоящее время отсутствуют национальные, в том числе российские, нормативы содержания УНТ в воздухе рабочей зоны. Для углеродных нанотрубок имеются нормативы, разработанные отдельными научно-исследовательскими центрами, и корпоративные нормативы [48, 86, 116, 142, 147, 150, 155, 168, 167]. Данные были получены в 90-дневных ингаляционных экспериментах [116, 156], 14-дневных ингаляционных экспериментах [132]; 4-недельных ингаляционных экспериментах с последующим 90-дневным наблюдением [159, 163]; 4-дневных ингаляционных экспериментах с 28-дневным наблюдением [195]; экспериментах с однократным интрафарингеальным введением с 56-дневным наблюдением [139] и интратрахельным введением с 90-дневным наблюдением [162]. По данным проведённых исследований, диапазон рекомендуемых уровней воздействия УНТ на рабочих местах составляет от 0,67 до 80 мкг/м3.

В большинстве случаев концентрации, используемые в экспериментах по обоснованию норматива УНТ [116, 132, 156, 159, 195], не соответствовали производственным экспозициям [108].

Несмотря на отсутствие стандартизованных методов, в настоящее время уже накоплен достаточный объем данных по концентрациям УНТ в воздухе рабочих мест различных производств, свидетельствующий о наличии в воздухе рабочей зоны относительно невысоких концентраций [108], что диктует необходимость нового этапа токсикологических исследований с применением более низких доз и концентраций по сравнению с ранними исследованиями.

Вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: токсиколого-гигиеническая характеристика нового типа промышленно-производимых ОУНТ на основе изучения реакции легочной ткани в экспериментах in vitro и in vivo с обоснованием подходов к разработке критериев безопасности ОУНТ.

Задачи:

1. Обосновать диапазон концентраций/доз нового типа промышленно-производимых ОУНТ для проведения токсикологических экспериментов in vitro и in vivo на основании гигиенической характеристики экспозиции к ОУНТ в условиях производства.

2. Разработать способ получения биосовместимых дисперсий нового типа промышленно-производимых ОУНТ.

3. Оценить цитотоксическое, проапоптогенное, профиброгенное, генотоксическое воздействие нового типа промышленно-производимых ОУНТ на клеточные культуры дыхательной системы в экспериментах in vitro.

4. Оценить реакцию легочной ткани в ответ на воздействие нового типа промышленно-производимых ОУНТ в экспериментах in vivo.

5. Разработать подходы к обоснованию критериев безопасности нового типа промышленно-производимых ОУНТ.

Научная новизна исследования. Впервые представлена токсиколого-гигиеническая характеристика нового типа промышленно-производимых ОУНТ при воздействии на дыхательную систему в экспериментах in vitro и in vivo.

Установлено, что в концентрациях/дозах, соответствующих реальным производственным экспозициям ОУНТ TUBALL™ не обладают профиброгенным и генотоксическим действием. Минимальная цитотоксическая концентрация ОУНТ (25 мкг/мл, для клеточной культуры бронхиального эпителия BEAS-2B), минимальная действующая концентрация, повышающая уровень экспрессии гена профиброгенного цитокина - остеопонтина (100 мкг/мл, для клеточной культуры бронхиального эпителия BEAS-2B), минимальная действующая доза, вызывающая реакцию в виде начальных признаков развития соединительной ткани в легких экспериментальных животных (40 мкг на крысу) соответствовали депонированным легочным дозам, рассчитанным для концентраций ОУНТ TUBALL™ в воздухе рабочей зоны, многократно превышающих производственные экспозиции.

Разработан способ диспергирования ОУНТ TUBALL™ с получением стабильных биосовместимых дисперсий для использования в токсикологических экспериментах in vitro и in vivo.

Разработан способ определения диапазона концентраций/доз для токсикологических экспериментов in vitro и in vivo на основе компьютерного моделирования массы ОУНТ, осевшей в легких человека или животных, с учетом концентраций и дисперсности ОУНТ в воздухе рабочей зоны в реальных производственных условиях.

Показано, что определение уровня экспрессии гена остеопонтина в культуре клеток бронхиального эпителия человека BEAS-2B может применяться в качестве скринингового теста для прогнозирования профиброгенного потенциала ОУНТ.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведенные исследования на клетках дыхательных путей человека позволили показать, что ОУНТ могут проникать в клетки, а механизм токсического действия ОУНТ связан с нарушением метаболизма и повреждением мембран клеток. Профиброгенный и цитотоксический эффекты наблюдались лишь при высокодозных воздействиях; при этом профиброгенный эффект отмечался при более высоких концентрациях, чем цитотоксический эффект. ОУНТ с агломератами меньших размеров проявляли более выраженное цитотоксическое действие. Данные факты позволяют предположить необходимость накопления больших количеств ОУНТ в клетке для проявления токсических эффектов на клеточном уровне, зависимость проникновения в клетки от размеров частиц, а также участие метаболических нарушений и мембранных повреждений в активации процессов фиброгенеза.

На основе полученных результатов in vitro на клетках различных отделов дыхательной системы человека определена наиболее подходящая экспериментальная клеточная модель для оценки воздействия ОУНТ - клетки бронхиального эпителия BEAS-2B.

В ходе выполнения диссертационной работы разработано, получен и коммерциализован секрет производства (ноу-хау) «Способ оценки параметров

токсичности ОУНТ в клеточных культурах, в эксперименте in vivo, и контроля содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны» (акт оценки исключительного права использования объекта интеллектуальной собственности секрета производства (ноу-хау) №1А от 23.04.2018 г.; акт приема-передачи №1 от 01.03.2019 г. между ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России и ООО «Международный Научный Центр по Теплофизике и Энергетике»). Разработан способ получения биосовместимых дисперсий ОУНТ TUBALL™ в биосовместимых средах; способ внедрен в работу центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России (акт внедрения от 3 марта 2020 г.).

Материалы диссертационного исследования использованы при разработке методических рекомендаций «Оценка параметров токсичности ОУНТ «TUBALL» в эксперименте in vivo», методических рекомендаций «Оценка параметров токсичности ОУНТ «TUBALL» в клеточных культурах», методических рекомендаций «Определение корпоративного норматива содержания ОУНТ «TUBALL» в воздухе рабочей зоны», методических рекомендаций «Контроль содержания ОУНТ «TUBALL» в воздухе рабочей зоны». Разработанные методические рекомендации внедрены в работу Фонда инфраструктурных и образовательных программ РОСНАНО и в работу предприятия-производителя ОУНТ (акт сдачи-приемки выполненных работ от 12.12.2019 г. по договору №2/2019 от 23.09.2019 г. между Фондом инфраструктурных и образовательных программ и ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России).

Материалы диссертационного исследования внедрены в работу лаборатории токсико-гигиенических исследований ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан (Татарстан)» (акт внедрения от 8 апреля 2021 г.).

С использованием материалов диссертационного исследования разработаны рабочая программа, фонд оценочных средств и учебно-методические пособие по дисциплине «Токсикология», внедренные в учебный процесс ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России, на кафедре гигиены, медицины труда (акт внедрения от 20 января 2020 г.), на кафедре профилактической медицины и экологии человека ФПК И ППС (акт внедрения от 3 февраля 2020 г.).

Методология и методы исследования. Методология диссертационной работы базировалась на совокупности методов токсиколого-гигиенической оценки в экспериментах in vitro и in vivo, статистических методов исследования.

Положения, выносимые на защиту:

Диапазон концентраций/доз для токсикологических экспериментов in vitro и in vivo должен включать концентрации/дозы, полученные с учетом массы ОУНТ, депонированных в легких человека или животных. Масса депонированных ОУНТ рассчитывается на основе компьютерного моделирования осаждения взвешенных частиц в различных отделах дыхательной системы с учетом концентраций и дисперсности ОУНТ в воздухе рабочей зоны в производственных условиях.

Для получения биосовместимых дисперсий ОУНТ TUBALL™ следует применять ультразвуковую соникацию суспензий ОУНТ на основе дисперсионных агентов, содержащих белково-ростовые комплексы, в режиме 750 Вт, 20 кГц, 40% амплитуды, пульс 5/6, 30 минут.

Воздействие ОУНТ TUBALL™ в концентрациях, соответствующих экспозициям при их производстве, не оказывает цитотоксического, апоптогенного, профиброгенного, генотоксического действия на культуры клеток дыхательной системы человека. При концентрациях, многократно превышавших реальные производственные экспозиции, был выявлен цитотоксический и профиброгенный потенциал ОУНТ TUBALL™

Интратрахеальная инстилляция ОУНТ TUBALL™ в дозе 1 мкг на животного (крыса), соответствующая производственной экспозиции (1 мкг/м3), в 20 раз превышавшей реальную концентрацию ОУНТ в воздухе рабочей зоны, не вызвала изменений легочной ткани животных спустя 90 дней наблюдения и рассматривается как недействующая доза. Начальные признаки формирования соединительной ткани в легких крыс наблюдались через 90 дней после интратрахеальной инстилляции ОУНТ TUBALL™ только в дозе 40 мкг на животное (крыса).

Методические подходы к обоснованию критериев безопасности ОУНТ должны быть основаны на последовательном применении in vitro и in vivo методов.

В качестве скрининговых тестов рекомендуется определение уровней экспрессии гена остеопонтина, цитотоксических эффектов и генотоксичности с применением метода ДНК-комет при внесении биосовместимых дисперсий ОУНТ в культуру клеток бронхиального эпителия человека BEAS-2B.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности работы подтверждается тем, что исследование проводилось с достаточным количеством наблюдений, использованием современных методов исследования, которые соответствуют поставленным в работе целям и задачам. Научные положения, выводы и рекомендации подкреплены убедительными фактическими данными, наглядно представленными в приведенных таблицах и рисунках. Подготовка, статистический анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации и статистического анализа.

Проведенная диссертационная работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) проект №219-315-90046 Аспиранты (годы реализации проекта с 2019 г. по 2022 г).

Основные положения диссертации были доложены на V международной научно-практической конференции «Наноматериалы и живые системы» (NLS-2018), г. Казань, 21-23 марта 2018 г.; X Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Современные проблемы эпидемиологии, микробиологии и гигиены», г. Москва, 24-26 октября 2018г.; XV Российском Национальном Конгрессе с международным участием «Профессия и здоровье», г. Самара, 24-27 сентября 2019 г.; Всероссийской научно-практическая конференции «Научное сопровождение деятельности учреждений Роспотребнадзора», г. Екатеринбург, 23-25 октября 2019г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по программам инноваций в области медицины труда «Трудовое долголетие: инновационная кристаллизация проблем ранней диагностики, лечения и реабилитации сердечно-сосудистых, респираторных и онкологических заболеваний», г. Новосибирск, 06-07 июня 2019 г.; 9th Nano

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тимербулатова Гюзель Абдулхалимовна, 2022 год

- - -

F——I Доксорубицин I———I Контроль F—I ОУНТ неочищенные Fj-| ОУНТ очищенные

ОУНТ неочищенные

ОУНТ очищенные

Доксорубицин Контроль

Рисунок 26 - Доля ДНК в хвосте кометы (%) при воздействии очищенных и неочищенных ОУНТ на клеточную культуру БЕЛБ-2Б в концентрации 0,0006 мкг/мл, инкубация 72 часа; контроль - клеточная культура БЕЛБ-2Б без воздействия; доксорубицин - клеточная культура БЕЛБ-2Б под воздействием доксорубицина 0,01мМ, инкубация 8 часов.

3.4 Оценка реакции легочной ткани на воздействие одностенных углеродных нанотрубок TUBALL™ в экспериментах in vivo

Крысы хорошо перенесли интратрахеальное введение дисперсий ОУНТ и восстановились в течение 30 минут.

Оценку реакции легочной ткани через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 1 и 40 мкг/животное проводили путем оценки морфологических изменений в легких экспонированных животных (группы 1 и 40 мкг/крысу) в сравнении с группой контроля (1% бычий сывороточный альбумин).

При гистологическом исследовании легких крыс контрольной группы через 90 дней от начала эксперимента существенных структурных изменений в легочной ткани не выявлено: элементы ацинусов свободны, межальвеолярные перегородки не утолщены, содержат тонкую сеть аргирофильных волокон (Рисунок 27). Плевра не утолщена.

Рисунок 27 - Группа контроля. Легкие крысы контрольной группы через 90 дней от начала эксперимента. Просветы альвеол свободны, аргирофильный каркас легочной ткани не утолщен (стрелка). Окр. серебрение по Гомори, Ув.100.

При гистологическом исследовании легких крыс через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 1 мкг/крысу очагово в просветах альвеол определяются рыхлые скопления из макрофагов, в некоторых участках межальвеолярные перегородки умеренно расширены, отмечается огрубение аргирофильного каркаса (Рисунок 28), имеются небольшие фокусы эмфиземы. Формирования клеточно-пылевых узелков не выявлено. Просветы бронхов свободны.

Рисунок 28 - Легкие крысы через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 1 мкг/крысу. В части альвеол содержатся рыхло лежащие макрофаги. Имеется очаговое утолщение межальвеолярных перегородок с огрубением аргирофильного каркаса. Окр. серебрение по Гомори, Ув. 100

При гистологическом исследовании легких крыс через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 40 мкг/крысу в просветах альвеол и в межальвеолярных перегородках часто определяются рыхлые макрофагальные скопления, такие же скопления можно видеть перибронхиально и периваскулярно, в части случаев имеется внеклеточно лежащий материал. Межальвеолярные перегородки расширены за счет наличия макрофагальных скоплений и клеточной инфильтрации гистиоцитами, лимфоцитами, единичными сегментоядерными лейкоцитами. В расширенных межальвеолярных перегородках имеется огрубение аргирофильного каркаса, также иногда встречаются клеточно-пылевые очажки с начальными признаками склерозирования: при серебрении по

Гомори единичные аргирофильные волокон проникают внутрь клеточно -пылевых очажков (Рисунки 29, 30). Вне зон склероза имеются участки эмфиземы.

Рисунок 29 - Легкие крысы через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 40 мкг/крысу. Диффузное расширение межальвеолярных перегородок, утолщение аргирофильного каркаса, сужение просветов альвеол, наличие в небольшом количестве клеточно-пылевых узелков с начальными признаками склерозирования (стрелка). Окр. серебрение по Гомори, Ув. 100.

Рисунок 30 - Легкие крысы через 90 дней после однократного интратрахеального введения ОУНТ в дозе 40 мкг/крысу. Формирование клеточно-пылевого узелка с единичными аргирофильными волокнами (стрелка). Окр. серебрение по Гомори, Ув. 200.

Таким образом, при однократном интратрахельном введении ОУНТ в дозе, соответствующей производственным экспозициям (1 мкг/крысу), существенных изменений со стороны легочной ткани не выявлено. Введение ОУНТ в дозе 40 мкг/крысу, во много раз превышающей концентрации ОУНТ на рабочих местах, через 90 дней привело к выраженной реакции со стороны легочной ткани крыс: диффузное расширение межальвеолярных перегородок с огрубением аргирофильного каркаса и наличием макрофагальных и рыхлых клеточно-пылевых скоплений; начальные признаки формирования клеточно-пылевых узелков с начальными признаками склерозирования в виде проникновения вглубь отдельных аргирофильных волокон.

3.5 Обоснование критериев безопасности для одностенных углеродных

нанотрубок TUBALL™

Данные проведенных исследований по оценке эффектов ОУНТ in vivo, полученные с основном с использованием ОУНТ HiPco [56, 90, 99, 117, 126, 162, 170, 194, 195], свидетельствуют о наличии профиброгенного потенциала ОУНТ и их способности индуцировать фиброзные изменения в легких лабораторных животных. Подобные результаты получены также в ходе настоящего исследования.

Учитывая многообразие ОУНТ, связанных с разными методами получения, наличием примесей, модификацией поверхности ОУНТ [55, 60, 61, 95, 100, 122, 124], последние могут иметь различающиеся физико-химическими свойствами. Утверждать, что все типы ОУНТ одинаково проявляют профиброгенные свойства, несколько преждевременно. Необходимо проводить оценку безопасности отдельных типов ОУНТ с обоснованием критериев безопасности [21] в целях установления - на начальном этапе - корпоративного норматива, а в последующем - государственного норматива содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны. Критерием безопасности является уровень воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект и/или наименьший уровень воздействия, при котором наблюдается вредный эффект.

Если уровни безопасного воздействия для разных типов ОУНТ окажутся схожими, это позволит в будущем разработать критерии безопасности для всего класса ОУНТ, но данном этапе получено недостаточно данных, и следует продолжать исследования в этом направлении.

С учетом полученных в настоящей работе результатов, планирование экспериментов по определению профиброгенного потенциала ОУНТ следует начинать с выбора подходящих моделей для тестирования in vitro и совокупности применяемых методов оценки. По данным настоящего исследования оценка экспрессии гена остеопонтина на клеточной культуре бронхиального эпителия человека BEAS-2B служит хорошей скрининговой моделью для оценки профиброгенного потенциала ОУНТ TUBALL™ При 72-часовом воздействии ОУНТ TUBALL™ в концентрациях 0,0006; 0,03; 50 и 100 мкг/мл на клеточные

культуры BEAS-2B, выявлено достоверное повышение экспрессии гена остеопонтина при концентрации ОУНТ 100 мкг/мл, многократно превышающей производственные экспозиции.

Обнаружение профиброгенного эффекта ОУНТ на клеточной модели позволяет на следующем этапе обосновать критерий безопасности ОУНТ на основе оценки профиброгенного потенциала ОУНТ на уровне целостного организма - в легких лабораторных животных - с применением сокращенной схемы эксперимента. С этой целью моделью выбора может явиться 90-дневный субхронический эксперимент с однократным интратрахеальным введением ОУНТ в организм крыс. Учитывая способность ОУНТ к длительной персистенции и аккумуляции в легких [51, 127, 171] подобный подход моделирует условия 90-дневного субхронического ингаляционного эксперимента [152] и подходит для оценки воздействия низкоаэрозолизируемых ОУНТ. В нашем исследовании показано, что через 90 дней после интратрахеальной инстилляции ОУНТ TUBALL™ в дозе 1 мкг на крысу, в 20 раз превышающей производственные экспозиции, не выявлено признаков изменений легочной ткани. Начальные признаки формирования соединительной ткани в легких крыс наблюдались через 90 дней после интратрахеальной инстилляции ОУНТ TUBALL™ в дозе 40 мкг на крысу.

Генотоксичность ОУНТ является важным показателем токсического действия ОУНТ. Этот показатель не может быть использован самостоятельно при определении критериев безопасности, так как генотоксичность не имеет порогового действия; однако данные по генотоксичности необходимо иметь ввиду при разработке профилактических программ. Подходящим in vitro тестом оценки генотоксичности ОУНТ является тест ДНК-комет. Однако, прежде чем перейти к оценке генотоксичности, следует определить цитотоксические концентрации ОУНТ с целью оценки генотоксического потенциала ОУНТ в диапазоне нецитотоксических концентраций. В настоящем исследовании для определения цитотоксических свойств ОУНТ TUBALL™ использованы два теста - MTS-тест и ЛДГ-тест, оценивающих разные механизмы: нарушение метаболических

процессов в клетках и повреждение мембран клеток при воздействии ОУНТ на клеточную культуру BEAS-2B. Получены сопоставимые результаты по двум тестам, что позволило определить цитотоксический диапазон ОУНТ и приступить к следующему этапу - оценке генотоксичности с использованием метода ДНК-комет. Показано, что воздействие ОУНТ TUBALL™ в диапазоне концентраций 0,0001-200 мкг/мл на клеточные культуры BEAS-2B в течение 72 часов, начиная с концентрации 25 мкг/мл, приводит к появлению цитотоксических эффектов; в диапазоне концентраций, включающего производственные экспозиции, - 0,000110 мкг/мл - цитотоксические эффекты ОУНТ TUBALL™ не проявились. Оценка генотоксичности проводилась при нецитотоксической концентрации ОУНТ TUBALL™ 0,0006 мкг/мл при инкубации в течение 72 часов, результаты анализа теста ДНК-комет показали отсутствие признаков генотоксичности ОУНТ TUBALL™ в отношении клеток BEAS-2B.

Важным этапом при планировании исследования является определение диапазона концентраций для исследований in vitro и in vivo. Выбранный диапазон для эксперимента in vitro должен включать концентрацию, соответствующую по данным компьютерного моделирования депонированию аэрозоля ОУНТ в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах легких человека за 25 лет работы в условиях производства ОУНТ, с расширением в сторону более низких концентраций, соответствующих экспозициям на производстве, а также более высоких токсичных концентраций по данным ранее проведенных исследований in vitro [37, 39, 43, 46, 58, 59, 63, 66, 70, 75, 76, 79, 81, 101, 103, 134, 172-174, 176, 183, 184, 194]. Для проведения in vivo исследований диапазон доз должен включать дозу, соответствующую 90-дневному депонированию аэрозоля ОУНТ в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах легких крысы при интратрахеальной инстилляции, а также токсичную дозу по данным ранее проведенных исследований in vivo [50, 54, 56, 67, 77, 90, 96, 117, 121, 123, 126, 160, 170, 177, 191, 194, 195]. В настоящем исследовании при расчете депонирования был использован консервативный сценарий, при котором концентрация ОУНТ TUBALL™ в воздухе рабочей зоны была принята 1 мкг/м3 при 8-часовой экспозиции (длительность

рабочей смены), что соответствовало рекомендуемому референтному уровню NIOSH (REL NIOSH) и с запасом превышало реальные уровни ОУНТ в воздухе рабочей зоны. Концентрация, соответствующая депонированию ОУНТ TUBALL™ в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах легких человека в условиях производства, составила 0,0011 мкг/мл, и диапазон концентраций для проведения эксперимента in vitro составил от 0,0001 до 200 мкг/мл. Концентрация, соответствующая депонированию ОУНТ TUBALL™ в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах легких крысы за 90 дней, составила 1 мкг/крысу; в качестве токсичной дозы принята доза 40 мкг/крысу.

Полученные в ходе эксперимента in vivo данные позволили определить диапазон между дозой, соответствующей производственной экспозиции и дозой, вызывающей токсические эффекты, в пределах которого может определена минимальная действующая доза ОУНТ TUBALL™ Учитывая данные экспериментов in vitro и in vivo, концентрация ОУНТ TUBALL™ в воздухе рабочей зоны 1 мкг/м3, в 20 раз превышающей производственные экспозиции, может быть рекомендована для мониторинга содержания TUBALL™ на рабочих местах до установления государственного норматива.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

За последнее десятилетие проведен ряд исследований по выявлению эффектов одностенных углеродных нанотрубок в отношении различных типов клеточных культур [28, 39, 46, 58, 59, 63, 66, 70-75, 79, 81, 101, 103-105, 113, 115, 134, 157, 164, 172-176, 183, 184, 188, 194, 197] и различных видов лабораторных животных [50, 54, 56, 67, 77, 90, 96, 117, 121, 123, 126, 160, 170, 177, 191, 194, 195]. Преимущественно эксперименты были направлены на оценку воздействия ОУНТ на органы дыхательной системы, как наиболее вероятному пути поступления ОУНТ. В отношении клеточных культур дыхательной системы были получены такие эффекты ОУНТ как цитотоксичность, снижение жизнеспособности клеток, ингибирование клеточной пролиферации, апоптоз, высвобождение оксида азота, оксидативный стресс, снижение уровня антиоксидантов [28, 39, 46, 58, 59, 63, 66, 70-75, 79, 81, 101, 103-105, 115, 134, 172-176, 183, 184, 188, 194]. При оценке реакции легочной ткани лабораторных животных в ответ на введение ОУНТ наблюдались развитие острого и хронического воспаления, образование гранулемы, отложение коллагена и развитие фиброза [50, 54, 56, 67, 77, 90, 96, 117, 121, 123, 126, 160, 170, 177, 191, 194, 195]. Примечательно, что концентрации, используемые в экспериментах, значительно превосходили соответствующие им производственные экспозиции к ОУНТ. Диапазон используемых концентраций в большинстве экспериментов in vitro составлял 0,005-800 мкг/мл, в экспериментах in vivo - 5-80 мкг/мышь, 40-1000 мкг/крысу. При этом концентрации ОУНТ в воздухе рабочей зоны [108], соответствующие концентрациям для внесения в клеточные культуры, составляют от 0,02 до 0,0004 мкг/мл; дозы для введения животным - от 1 до 38 мкг/крысу.

В настоящей работе было проведено обоснование диапазона концентраций/ доз для токсикологических экспериментов in vitro и in vivo с учетом гигиенической характеристики производственных экспозиций к ОУНТ на рабочем месте. Выявленная концентрация в воздухе рабочей зоны предприятия-производителя

составляла 0,05 мкг/м3, что составляет 5 % от REL NIOSH [147]. При подборе доз для исследования был выбран консервативный сценарий, при котором для расчета была использована концентрация 1 мкг/м3, которая соответствовала концентрации 0,0011 мкг/мл для внесения в клеточные культуры и дозе 1 мкг/крысу. При оценке результатов исследования показано, что на концентрациях, соответствующих производственным экспозициям к ОУНТ (0,0001-10 мкг/мл), не выявлено токсичности ОУНТ в отношении культур дыхательной системы - отсутствовали признаки цито- и генотоксичности. При увеличении диапазона в сторону более высоких концентраций до 200 мкг/мл, удалось обнаружить цитотоксические эффекты ОУНТ на концентрациях, начиная с 25 мкг/мл, которые значительно превышали экспозиции на рабочих-местах на предприятиях по производству ОУНТ [108]. В экспериментах in vivo также на дозе, соответствующей производственным экспозициям (1 мкг/крысу) реакция легочной ткани крыс не отличалась от контроля - в легких животных не обнаружено существенных изменений; тогда как на дозе, превышающей производственные экспозиции, наблюдалась выраженная реакция легочной ткани в виде начальных признаков формирования клеточно-пылевых узелков в легких крыс.

Следует отметить, что в некоторых случаях при работе с ОУНТ не исключено наличие высоких концентраций ОУНТ в воздухе рабочей зоны, значительно превосходящих используемые в настоящем исследовании. Подобные ситуации могут возникнуть при работе на производствах, где не предусмотрены закрытые установки и выгрузка ОУНТ из реактора будет сопровождаться распылением ОУНТ в воздухе рабочей зоны; кроме того, на предприятиях по использованию ОУНТ в качестве добавки к различным материалам, происходит размол и смешивание ОУНТ с основным продуктом, что также чревато высоким содержанием ОУНТ на рабочих местах подобных производств. В таких случаях, ввиду высоких уровней концентраций ОУНТ в воздухе рабочей зоны, не исключены неблагоприятные эффекты ОУНТ в отношении дыхательной системы работающих.

Важным этапом при оценке эффектов ОУНТ in vitro и in vivo было получение биосовместимых дисперсий. Как отмечалось ранее, гидрофобные свойства ОУНТ создают затруднения при получении биосовместимых дисперсий. ДПФХ (0,01 мкг/мл в фосфатно-буферном растворе) и Survanta® (0,15 мг/мл в фосфатно-буферном растворе), рассматривавшиеся нами как наиболее перспективные биосоместимые дисперганты ОУНТ, не показали эффективность в отношении изучавшихся ОУНТ. Описано исследование, где показана высокая эффективность ДПФХ (0,01 мкг/мл в фосфатно-буферном растворе) [91] в качестве дисперганта ОУНТ (Hanwha Nanotech, Корея) даже на более высоких концентрациях ОУНТ (0,2, 1 и мг 5 /мл) и при меньшей ультразвуковой обработке (в течение 10 мин., другие параметры авторами не указаны), но данные ОУНТ имели другие физико-химические характеристики. В другом исследовании при применении Survanta® (0,15 мг/мл в фосфатно-буферном растворе) [77] достигнута высокая степень диспергирования ОУНТ HiPco в концентрации 0,1 мг/мл, с минимальной ультразвуковой обработкой в течение в течение 5-10 секунд, при мощности 130 Вт, частоте 20 кГц. Для диспергирования ОУНТ TUBALL™ выбраны два типа клеточных культуральных сред BEGM и DMEM с добавлением бычьей сыворотки. Подобные результаты могут быть получены и при применении других культуральных сред, но, учитывая их многообразие, при планировании исследований с использованием клеточных культуральных сред в качестве дисперганта ОУНТ следует проводить предварительные эксперименты по диспергированию. Для проведения исследования in vivo (на лабораторных животных) средой выбора может служить 1% бычий сывороточный альбумин [78], так как культуральные среды не используются в in vivo исследованиях. Следует добавить, что хорошей альтернативой бычьему сывороточному альбумину при проведении исследований на крысах и мышах могут стать крысиный и мышиный сывороточные альбумины, оценка которых как диспергантов ОУНТ также требует дальнейших исследований. Расхождения полученных результатов других авторов с данными проведенного исследования преположительно связаны с такими факторами как отличающиеся физико-химические характеристики, концентрации

ОУНТ, различия в условиях экспериментов, которые возможно были упущены при описании предыдущих исследований. Например, даже незначительные изменения ионного состава используемых фосфатно-буферных растворов могут повлиять на степень диспергируемости ОУНТ, что было выявлено нами на подготовительном этапе исследования. Таким образом, требуется разработка индивидуальных подходов к диспергированию в случае с разными типами ОУНТ.

В настоящее время все большую популярность приобретают исследования на клеточных культурах. Ввиду ежегодно увеличивающейся номенклатуры промышленно производимых наноматериалов и наносодержащей продукции, предназначенной для широкого использования всеми категориями населения, возникает необходимость провести оценку безопасности для здоровья человека в короткие сроки [25]. Возникает необходимость выбора методов и моделей in vitro, которые могли бы если не полностью заменить эксперименты на животных, то по крайней мере сократить количество животных в исследованиях [130].

В ходе проведения исследования in vitro показано, что наиболее подходящей моделью для тестирования ОУНТ, является клеточная культура бронхиального эпителия человека BEAS-2B. На данной клеточной культуре установлен цитотоксический диапазон ОУНТ TUBALL™ с применением двух методов оценки цитотоксичности, на цитотоксических концентрациях выявлен высокий уровень экспрессии гена остеопонтина. Воздействие ОУНТ в тех же концентрациях, в отношении клеток альвеолярного эпителия А549 не вызвало значимого снижения жизнеспособности клеток, экспрессия гена остеопонтина в клетках А549 не отличалась от контроля. В одном из исследований для оценки токсичности УНТ использовался схожий дизайн - были использованы клетки BEAS-2B и А549 для оценки токсичности углеродных нанотрубок в отношении упомянутых клеток [92]. После воздействия УНТ в течение 24 часов в концентрации 1-100 мкг/мл по данным МТS-теста было показано, что клетки бронхиального эпителия оказались более чувствительными к воздействию УНТ, чем альвеолярные клетки, что в целом согласуется с полученными нами результатами. Описано исследование, в котором токсичность ОУНТ исследовалась в отношении клеточных линий BEAS-2B и А549;

были использованы концентрации 2, 20 и 200 мкг/мл, выбраны две временные точки - 24 часа и 96 часов [174]. По результатам исследования показана повышенная чувствительность клеток BEAS-2B, в которых отмечено дозозависимое снижение жизнеспособности клеток уже через 24 часа воздействия ОУНТ; тогда как в клетках А549 цитотоксичность наблюдалась только через 96 часов на самых высоких концентрациях. Предположительно устойчивость клеток А549 к воздействию ОУНТ может быть связана со способностью клеток альвеолярного эпителия секретировать сурфактант, богатый фосфолипидами, выработка которого является защитной реакцией клеток в ответ на воздействие инородного агента [113]. При сравнительной оценке эффектов двух типов ОУНТ, используемых в исследовании, выявлено, что при воздействии очищенных ОУНТ на клеточные культуры BEAS-2B цитотоксические эффекты проявились на более низких концентрациях по данным MTS-теста, начиная с 25 мкг/мл, у неочищенных ОУНТ - с 50 мкг/мл. При морфометрической характеристике методом ПЭМ двух типов ОУНТ выявлено, что агломераты очищенных ОУНТ в среде BEGM меньше по размеру, чем неочищенных в той же среде. В связи с этим возникает предположение, что агломераты ОУНТ, имеющие меньшие размеры, обладают более высокой проникающей способностью и, как следствие, большей токсичностью.

Для оценки эффектов ОУНТ в отношении дыхательной системы в рамках настоящего исследования проведен эксперимент in vitro в комбинации с экспериментом in vivo. Применение комплексного подхода при оценке эффектов ОУНТ показало, что результаты, полученные в ходе экспериментов in vitro в отношении клеточных культур дыхательной системы человека, соотносятся с данными по реакции легочной ткани животных, показанными в экспериментах in vivo. В обоих случаях токсические эффекты ОУНТ в отношении дыхательной системы показаны на концентрациях/дозах, значительно превышающих производственные экспозиции.

Проведение токсикологических экспериментов является одним из основных этапов при обосновании норматива содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны

[152]. Высокий спрос на продукцию, расширение объемов производства, появление на мировом рынке новых УНТ приведет к необходимости разработки норматива для выхода на мировые и внутренние рынки. На сегодняшний день ввиду отсутствия государственных и национальных нормативов это становится особенно актуальным. Широкое разнообразие УНТ затрудняет процесс унификации подходов к обоснованию норматива. Исследователи сталкиваются со многими сложностями, связанными с выбором метода оценки содержания УНТ в воздухе рабочей зоны, подготовкой биосовместимых дисперсий ОУНТ для тестирования in vitro и in vivo, выбором наиболее подходящих методов и модели для тестирования новых наноматериалов. Промежуточным этапом перед установлением государственного норматива для УНТ может быть разработка корпоративного норматива, что позволит предприятию внедрить мониторинг условий труда и состояния здоровья работников, в дальнейшем провести мероприятия по корректировке принятого норматива и приступить к этапу разработки государственного норматива.

В настоящем исследовании с учетом производственных экспозиций определены концентрации/дозы ОУНТ TUBALL™ для экспериментов in vitro и in vivo, разработан способ получения биосовместимых дисперсий, проведены токсикологические эксперименты для оценки реакции дыхательной системы в ответ на введение ОУНТ в экспериментах in vitro и in vivo. Проведенная работа показала, что ОУНТ TUBALL™ в концентрациях, соответствующих производственным экспозициям, не оказывает неблагоприятного эффекта в отношении клеточных культур дыхательной системы человека и легочной ткани крыс. Полученные результаты могут быть использованы, в том числе, для разработки корпоративного норматива содержания в воздухе рабочей зоны предприятия-производителя ОУНТ TUBALL™

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Углеродные нанотрубки являются наноматериалами с уникальными физико-химическим свойствам, имеющими широкий потенциал применения. Они представлены большой группой, отличающихся методами производства, количеством слоев, наличием функциональных групп на поверхности. Малые размеры и высокая проникающая способность, большая площадь и физико-химические свойства поверхности УНТ и, как следствие, высокая реакционная способность, обуславливают активное взаимодействие с биологическими объектами, что может служить причиной токсичности данного типа наноматериалов. Разработка новых способов производства ОУНТ приведет к появлению на рынке нового типа наноматериалов с неизвестными свойствами, что диктует необходимость тщательного изучения их свойств, в том числе при взаимодействии с живыми системами.

В настоящее время отсутствуют национальные, в том числе российские, нормативы содержания углеродных нанотрубок в воздухе рабочей зоны. Для углеродных нанотрубок имеются нормативы, разработанные отдельными научно -исследовательскими центрами, и корпоративные нормативы.

Проведенное исследование показало отсутствие неблагоприятного эффекта ОУНТ ТиВДЬЬ™ в отношении клеточных культур дыхательной системы человека и легочной ткани животных на концентрациях/дозах, соответствующих производственным экспозициям. Применяемые в настоящем исследовании концентрации/дозы были существенно ниже применяемых другими авторами. Большой объем накопленных данных по производственным экспозициям на рабочих местах предприятий-производителей углеродных нанотрубок в настоящее время позволяет оценивать их эффекты в более низком диапазоне концентраций. В условиях производственных экспозиций основной путь поступления ОУНТ -ингаляционный, поэтому особый интерес представляет реакция со стороны органов дыхательной системы: клеточных культур дыхательных путей и легочной

ткани экспериментальных животных. Критерием безопасности при обосновании норматива, как корпоративного, так и государственного, может служить реакция со стороны легочной ткани при воздействии ОУНТ в экспериментах in vitro и in vivo. Таким образом, результаты, полученные в ходе проведения исследования, могут служить основой для разработки корпоративного норматива содержания в воздухе рабочей зоны предприятия-производителя ОУНТ TUBALL™ Наличие корпоративного норматива позволит предприятию-производителю УНТ провести мероприятия по разработке и реализации программы производственного контроля с внедрением мониторинга за состоянием воздуха рабочей зоны. Разработка корпоративного норматива может рассматриваться как подготовительный этап перед установкой государственного норматива, что станет необходимым при расширении объёма производства и будет способствовать повышению конкурентоспособности предприятий-производителей УНТ на мировом рынке.

ВЫВОДЫ

1. На рабочих местах предприятия-производителя концентрация ОУНТ TUBALL™ в воздухе рабочей зоны не превышала 0,05 мкг/м3. Диапазон концентраций/доз для исследования обоснован с использованием компьютерного моделирования осаждения взвешенных частиц в различных отделах дыхательных путей человека или крысы с учетом производственных экспозиций и дисперсности аэрозоля ОУНТ. Для экспериментов in vitro диапазон концентраций составил 0,0001-200 мкг/мл, включая концентрации, соответствующие депонированию аэрозоля ОУНТ в легких человека за 25 лет стажа при концентрации ОУНТ в воздухе 1 мкг/м3, с расширением в сторону низких концентраций, соответствующих экспозициям на производстве, и высоких токсичных концентраций по данным научной литературы. Для экспериментов in vivo обоснованы дозы 1 мкг на крысу, аппроксимирующая депонирование ОУНТ в легких крысы при 90-дневном ингаляционном поступлении при концентрации ОУНТ в воздухе 1 мкг/м3, и 40 мкг на крысу как потенциально токсичная по данным научной литературы.

2. Разработан способ получения стабильных биосовместимых дисперсий ОУНТ TUBALL™, заключающийся в ультразвуковой соникации суспензий на основе дисперсионных агентов, содержащих белково-ростовые комплексы, в режиме 750 Вт, 20 кГц, 40% амплитуды, пульс 5/6, 30 минут. Способ позволил получить биосовместимые дисперсии с размером агломератов до 1000 нм для внесения в клеточные культуры и интратрахеальной инстилляции экспериментальных животных.

3. Как очищенные, так и неочищенные ОУНТ TUBALL™ способны проникать в клетки дыхательных путей человека BEAS-2B и А549. В концентрации, соответствующей депонированию аэрозоля ОУНТ в легких человека за 25 лет стажа, ОУНТ не оказывали цитотоксического, апоптогенного, профиброгенного, генотоксического действия на культуры клеток

дыхательной системы BEAS-2B, А549 и макрофаги RAW264.7. Токсические эффекты были обнаружены только в культуре клеток бронхиального эпителия BEAS-2B: минимальная цитотоксическая концентрация ОУНТ по данным MTS-теста составила 25 мкг/мл; минимальная действующая концентрация, повышающая уровень экспрессии гена профиброгенного цитокина - остеопонтина в клетках BEAS-2B, равна 100 мкг/мл.

4. При интратрахеальной инстилляции в дозе 1 мкг на крысу, соответствующей реальной производственной экспозиции, ОУНТ TUBALL™ не вызывают изменений со стороны легочной ткани крыс. Начальные признаки формирования соединительной ткани в легких крыс наблюдаются при интратрахеальной инстилляции ОУНТ TUBALL™ в дозе 40 мкг на крысу, многократно превышающей производственные экспозиции.

5. Обоснование критериев безопасности ОУНТ должно проводиться с использованием методических подходов, включающих последовательное применение in vitro и in vivo методов. Определение уровней экспрессии гена остеопонтина, цитотоксических эффектов и генотоксичности с применением метода ДНК-комет при внесении биосовместимых дисперсий ОУНТ в культуру клеток бронхиального эпителия человека BEAS-2B рекомендуется применять в качестве скрининговых тестов для оценки токсичности ОУНТ.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Проведенное исследование показало отсутствие неблагоприятного эффекта ОУНТ ТЦВАЬЬ™ в отношении клеточных культур дыхательной системы человека и легочной ткани животных на концентрациях/дозах, соответствующих производственным экспозициям при производстве ОУНТ ТЦВАЪЬ™ Следует отметить, что в некоторых случаях при работе с ОУНТ не исключено наличие высоких концентраций ОУНТ в воздухе рабочей зоны, значительно превосходящих используемые в настоящем исследовании. Подобные ситуации могут возникнуть на предприятиях по использованию ОУНТ в качестве добавки к различным материалам, где происходит размол и смешивание ОУНТ с основным продуктом, что чревато высоким содержанием ОУНТ на рабочих местах подобных производств. В таких случаях, ввиду высоких уровней концентраций ОУНТ в воздухе рабочей зоны, не исключены неблагоприятные эффекты ОУНТ в отношении дыхательной системы работающих. В связи с этим также необходимо проводить исследования по оценке экспозиций и проведение токсиколого-гигиенической оценки ОУНТ на предприятиях, выпускающих продукцию на основе ОУНТ.

Биомедицинское применение полученных дисперсий имеет ряд ограничений, связанных с несоответствием состава используемых сред физико-химическому составу сред внутренней среды человека и животных. Принимая во внимание результаты нашего исследования и исследований других авторов, а также уникальные области применения в биомедицине изучаемых наноматериалов, необходимо продолжать поиск и изучение новых биосовместимых диспергантов, имеющих минимальные ограничения при введении их в организм человека и животных.

Дальнейшее изучение клеточных реакций на разных типах клеток, в том числе моделях, может способствовать выявлению фундаментальных

механизмов действия разных типов ОУНТ для определения биомаркеров,

сигнализирующих об определенном пути гибели клеток, которые могут быть использованы, в том числе, для разработки скрининговых тестов для работающих в сфере производства и применения ОУНТ.

Проведение эпидемиологических исследований с участием работающих в сфере производства и применения ОУНТ следует рассматривать как следующий этап при оценке безопасности ОУНТ. Необходимо осуществлять сбор и накопление банка биологических образцов для обеспечения возможности проведения дополнительных исследований при получении новых экспериментальных данных.

Необходимы дальнейшие исследования по определению критериев безопасности различных типов ОУНТ с последующей разработкой корпоративного норматива содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны предприятий-производителей и предприятий, использующих ОУНТ в качестве добавки. Наличие корпоративного норматива позволит предприятиям-производителям ОУНТ разрабатывать программу производственного контроля и внедрять мониторинг за состоянием воздуха окружающей среды. Разработка корпоративного норматива может рассматриваться как подготовительный этап перед установкой государственного норматива, что станет необходимым при расширении объема производства и будет способствовать повышению конкурентоспособности предприятий на мировом рынке. Кроме того, демонстрация ясной и объективной информации о параметрах безопасности своей продукции потенциальным потребителям и регулирующим органам свидетельствует об ответственности и открытости компании, которая готова публично заявить не только о выгоде производимого товара.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для производителей ОУНТ ТиБЛЬЬ™

Рекомендуется 1 раз в 6 месяцев проводить мониторинг содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны на производственных участках, связанных с работой с материалом до и после помола (в большей степени - в процессе выгрузки готового продукта из реактора, механическом измельчении продукта, взвешивании и фасовке готового продукта, при проведении аналитических исследований в лабораториях). Количественную оценку и определение размеров агломератов ОУНТ в воздухе рабочей зоны рекомендуется проводить с использованием спектрометра наночастиц. При регулярном обнаружении агломератов ОУНТ в воздухе рабочей зоны в программу мониторинга следует включить проведение ПЭМ для оценки морфологии ОУНТ и термооптического анализа для определения концентрации элементного углерода в образце пробы воздуха рабочей зоны. В качестве мониторируемого показателя рекомендуется содержание ОУНТ в воздухе рабочей зоны 1 мкг/м3.

В программу проведения мониторинга за состоянием здоровья работников в рамках ежегодного медицинского осмотра рекомендуется включать исследование функции внешнего дыхания для оценки влияния ОУНТ на дыхательную систему работающих на производстве. Необходимо собирать и накапливать банк биологических образцов (цельная кровь, сыворотка крови, супернатант индуцированной мокроты), полученных в ходе проведения периодических медицинских осмотров, для обеспечения возможности проведения дополнительных исследований при получении новых экспериментальных данных. Сбор биологических образцов необходимо проводить с учетом прав работников на защиту персональной информации.

Для предприятий, выпускающих продукцию на основе TUBALL™

Рекомендуется применять следующую схему эксперимента для обоснования и корректировки безопасных уровней воздействия (корпоративного норматива).

Обоснование безопасных уровней воздействия ОУНТ проводится на основании последовательного проведения экспериментов in vitro и in vivo. На клеточных культурах оценивается профиброгенный, цитотоксический, генотоксический потенциал ОУНТ. С учетом данных, полученных в эксперименте in vitro, проводится эксперимент in vivo с применением сокращённой либо расширенной схемы эксперимента. Подбор диапазона доз для исследования проводится на основании компьютерного моделирования осаждения ОУНТ в различных отделах дыхательной системы человека или крысы с учетом данных мониторинга содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны предприятий и дисперсности аэрозоля ОУНТ.

Внесение ОУНТ в клеточные культуры и введение в организм животных должно проводиться в виде биосовместимых дисперсий ОУНТ. Для подготовки биосовместимых дисперсий ОУНТ TUBALLTM для экспериментов in vitro рекомендуется применение стерильных культуральных сред; для исследования на лабораторных животных (крысах) - 1% бычий сывороточный альбумин - с проведением ультразвуковой обработки суспензий при помощи прибора Sonic Vibra Cell Sonicator (Sonics&Materials, США), со следующими параметрами работы прибора: 750 Ватт, 20 кГц, 40% амплитуда, пульс 5/6, время 30 минут.

Для моделирования ингаляционного пути воздействия ОУНТ как наиболее вероятного пути поступления его в организм человека в качестве модели in vitro для тестирования ОУНТ TUBALLTM рекомендуется использовать клеточную линию нормального человеческого эпителия человека BEAS-2B. Для оценки профиброгенного потенциала ОУНТ TUBALLTM рекомендуется метод оценки экспрессии гена остеопонтина с использованием диапазона концентраций, включающего концентрации, соответствующие производственным экспозициям и цитотоксические концентрации по данным научной литературы, с продолжительностью экспозиции ОУНТ не менее 72 часов. Достоверное

повышение уровня экспрессии гена остеопонтина в исследуемых клетках будет свидетельствовать о наличии профиброгенного потенциала ОУНТ.

Обнаружение профиброгенного эффекта ОУНТ на клеточной модели позволяет на следующем этапе обосновать критерий безопасности ОУНТ на основе оценки профиброгенного потенциала ОУНТ на уровне целостного организма - в легких лабораторных животных - с применением сокращенной схемы эксперимента. С этой целью рекомендуется использовать 90-дневный субхронический эксперимент с однократным интратрахеальным введением ОУНТ TUBALL™ в организм крыс. Учитывая способность ОУНТ к длительной персистенции и аккумуляции в легких подобный подход моделирует условия 90-дневного субхронического ингаляционного эксперимента и подходит для оценки воздействия низкоаэрозолизируемых ОУНТ. Дозы (минимум две), вводимые животным, должны включать дозы, рассчитанные на основе производственных экспозиций и потенциально токсичные дозы по данным других исследователей. По истечении 90 дней проводится морфологическая оценка тканей легких крыс.

Генотоксичность ОУНТ является важным показателем токсического действия ОУНТ. Этот показатель не может быть использован самостоятельно при определении критериев безопасности, так как генотоксичность не имеет порогового действия; однако данные по генотоксичности необходимо иметь ввиду при разработке профилактических программ. Подходящим in vitro тестом оценки генотоксичности ОУНТ является тест ДНК-комет. Однако, прежде чем перейти к оценке генотоксичности, следует определить цитотоксические концентрации ОУНТ с целью оценки генотоксического потенциала ОУНТ в диапазоне нецитотоксических концентраций. Для оценки цитотоксичности рекомендуется группа методов, принцип которых заключается в окраске клетки или специфических клеточных компонентов клеточным красителем, который взаимодействуют с конкретными биомолекулами. Примерами таких тестов являются тест МТS и тест на измерение активности фермента лактатдегидрогеназы в культуральной среде. Следует применять не менее двух тестов для оценки цитотоксичности для сопоставления полученных результатов с использованием

диапазона концентраций, рассчитанных на основе производственных экспозиций и учитывающих токсичные концентрации по данным других исследователей; продолжительность экспозиции ОУНТ с клетками не менее 72 часов. После получения данных по диапазону цитотоксических эффектов ОУНТ проводится оценка генотоксичности ОУНТ с использованием метода ДНК-комет на нецитотоксической концентрации ОУНТ с продолжительностью эксперимента не менее 72 часов.

При отсутствии по данным эксперимента in vitro признаков профиброгенного потенциала ОУНТ, следует расширить верхний диапазон используемых концентраций и удлинить время экспозиции до 96 часов. В случае отсутствия профиброгенных эффектов ОУНТ следует перейти к проведению эксперимента на лабораторных животных с расширенной схемой эксперимента, включающего применение нескольких доз и совокупность методов оценки токсического влияния ОУНТ, включающих в себя оценку клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа и биохимического состава надосадочной жидкости бронхоальвеолярного лаважа; клеточного и биохимического состава крови; цитологические и морфологические исследования органов (легкие и окололегочные лимфатические узлы, печень, почки, селезенка, головной мозг, сердце, аорта); определение коллагена/оксипролина (легкие и окололегочные лимфатические узлы); оценку генотоксичности ОУНТ. Учитывая, что основным органом-мишенью являются легкие, рекомендуется проведение прижизненной МРТ легких экспериментальных животных для определения легочной нагрузки ОУНТ, а также определение маркеров легочного воспаления, фиброза и канцерогенеза.

Важным этапом исследования является подбор диапазона концентраций/доз. Подбор концентраций/доз ОУНТ для экспериментов in vitro и in vivo, рекомендуется осуществлять на основе расчета массы аэрозоля, осажденного совокупно в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах легких при различных сценариях нахождения человека в запыленной воздушной среде с использованием результатов мониторинга за содержанием ОУНТ в воздухе рабочей зоны на

рабочих местах предприятия и/или имеющихся в открытых источниках данных о загрязнении воздуха рабочей зоны ОУНТ.

Выбранный диапазон должен включать концентрации, соответствующие по данным компьютерного моделирования, депонированию аэрозоля ОУНТ в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах и концентрации/дозы, на которых наблюдались токсические эффекты ОУНТ в экспериментах in vitro и in vivo по данным других авторов. Расчёт количества и массы осевших частиц в дыхательных путях человека при различных сценариях его нахождения в запылённой воздушной среде для экспериментов in vitro и in vivo рекомендуется проводить с использованием компьютерного моделирования (программное обеспечение Multiple-Path Particle Dosimetry) с учетом результатов полевых исследований загрязнения воздуха рабочей зоны ОУНТ на рабочих местах предприятия и дисперсности аэрозоля ОУНТ по данным ПЭМ.

Полученные в ходе эксперимента in vivo данные позволят определить уровень воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект и/или наименьший уровень воздействия (пороговая концентрация), при котором наблюдается вредное воздействие на животных. Для перехода от пороговой концентрации ОУНТ к величине корпоративного норматива рекомендуется использовать фактор неопределённости (коэффициент запаса) 10, учитывающий различия между разными видами животных и человеком (коэффициент 2 - переход между различными видами животных, 5 - переход от животных к человеку).

После этапа обоснования корпоративного норматива на предприятии в течение нескольких лет должны проводиться мероприятия по корректировке корпоративного норматива на основе данных клинико-гигиенических исследований, в ходе которых проводится мониторинг условий труда и состояния здоровья работников, и расширенных токсиколого-гигиенических исследований.

В случае получения данных, свидетельствующих о периодическом превышении корпоративного норматива в зоне дыхания рабочих, вопрос о необходимости корректировки корпоративного норматива ОУНТ должен решаться с учётом величины и частоты превышения концентраций.

Для установления отклонений в состоянии здоровья работающих при корректировке корпоративного норматива могут быть использованы следующие материалы: а) результаты анализа случаев профессиональных заболеваний; б) результаты периодических и углублённых медицинских осмотров и диспансерного наблюдения; в) результаты углублённого изучения заболеваемости с временной утратой трудоспособности, смертности; г) биомониторинг биологических маркеров воспаления, фиброза, канцерогенных эффектов.

Для испытательных лабораторных центров учреждений Роспотребнадзора

Рекомендуется внедрение в работу токсико-гигиенических лабораторий скрининговых тестов по оценке токсичности углеродных нанотрубок с набором тестов по оценке профиброгенного потенциала, цитотоксичности, генотоксичности УНТ.

В качестве скрининговой модели in vitro рекомендуется использовать клеточную культуру нормального человеческого бронхиального эпителия человека BEAS-2B. Профиброгенный потенциал углеродных нанотрубок исследовать методом оценки экспрессии гена остеопонтина. Цитотоксические эффекты углеродных нанотрубок оценивать не менее чем двумя методами: MTS-тест и ЛДГ-тест. В качестве теста на генотоксичность применять тест ДНК-комет.

Для контрольно-надзорных органов в области охраны труда и здоровья

работников

Проведение профилактических визитов с целью информирования работников, занятых в сфере производства и применения ОУНТ, о возможных потенциальных эффектах ОУНТ на здоровье и необходимости соблюдения правил безопасного обращения с ОУНТ: минимизация экспозиции ОУНТ на рабочих местах путем работы в закрытых установках, организации фильтрации воздуха рабочих помещений с использованием HEPA-фильтров; соблюдение правил

личной гигиены; применение средств индивидуальной защиты (костюмы, маски с HEPA-фильтрами при работе с ОУНТ).

Для образовательных медицинских учреждений высшего образования

Включение в программу обучения в рамках дополнительного профессионального обучения по дисциплинам: общая гигиена, гигиена труда, коммунальная гигиена, гигиена питания, профилактическая токсикология - курса по токсикологии, включающего модуль по этапам токсиколого-гигиенической оценки безопасности наноматериалов, в том числе углеродных нанотрубок, особенно в регионах где активно развивается производство новых видов наноматериалов.

Программа обучения должна включать следующие разделы дисциплины:

1) Оснащение лабораторий, необходимое для проведения токсиколого-гигиенической оценки новых типов наноматериалов.

2) Физико-химическая характеризация новых типов наноматериалов.

3) Обоснование диапазона доз для проведения экспериментов по оценке воздействия новых типов наноматериалов in vitro и in vivo.

4) Выбор моделей in vitro и in vivo для проведения токсиколого-гигиенической оценки новых типов наноматериалов.

5) Методы in vitro, используемые при проведении токсиколого-гигиенической оценке новых типов наноматериалов.

6) Методы in vivo, используемые при проведении токсиколого-гигиенической оценке новых типов наноматериалов.

7) Обоснование критериев безопасности новых типов наноматериалов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАЛЖ - надосадочная жидкость бронхоальвеолярного лаважа

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДДС - додецилсульфат натрия

ДДБС - додецилбензолсульфонат натрия

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСР - динамическое светорассеяние

ДПФХ - 1,2-дипальмитоил-8п-глицеро-3-фосфохолин

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

КР спектроскопия - спектроскопия комбинационного рассеяния света (или Рамановская спектроскопия)

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МУНТ - многостенные углеродные нанотрубки

ОБУВ - ориентировочный безопасный уровень воздействия

ОУНТ - одностенные углеродные нанотрубки

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПИД - пламенно-ионизационный детектор

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

РНК - рибонуклеиновая кислота

РФФИ - Российский фонд фундаментальных исследований СЭЦ-фильтр - фильтр из смешанных эфиров целлюлозы УНТ - углеродные нанотрубки

ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора - ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора

ЦКП - центр коллективного пользования

ЦНИЛ - центральная научно-исследовательская лаборатория

BEGM -Bronchial Epithelial Cell Growth Medium - клеточная среда

DMEM - Dulbecco's modified Eagle's medium - клеточная среда

FRC (Functional Residual Capacity) - функциональная остаточная емкость легких

HiPco - High Pressure CO2

MPPD (Multi-Path Particle Dosimetry) - многовариантная дозиметрия частиц

NIOSH - Национальный институт охраны и медицины труда США (National Institute for Occupational Safety and Health)

QSAR (quantitative structure-activity relationship) - методы количественного предсказания и описания связи структуры с биологической активностью

REACH - Registration, Evaluation, Authorisation, Restriction of Chemicals - Регламент Европейского Экономического Сообщества № 1907/2006 Европейского парламента и Совета от 18 декабря 2006 г. по регистрации, оценке, разрешению и ограничению химических веществ

REL - Recommended Exposure Level - рекомендованный уровень экспозиции URT (Upper Respiratory Tract) - объем верхних дыхательных путей

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анализ некоторых результатов экспериментального изучения токсикологии наночастиц с позиций гигиенического нормирования / Б. А. Кацнельсон, Л. И. Привалова, Т. Д. Дегтярева [и др.] // Уральский медицинский журнал. - 2011. - № 9 (87). - С. 35-38.

2. Гигиенические нормативы ГН 1.2.2633-10 «Гигиенические нормативы содержания приоритетных наноматериалов в объектах окружающей среды» (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 25 мая 2010 г. N 60 // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

3. ГОСТ Р 8.774-2011. Дисперсный состав жидких сред. Определение размеров частиц по динамическому рассеянию света // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

4. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV. - URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14 (дата обращения: 01.06.2022).

5. Дьячкова, Т. П. Методы функционализации и модифицирования углеродных нанотрубок: учебник для вузов / Т. П. Дьячкова, А. Г. Ткачев. - Москва: Спектр, 2013. - 151 с. - ISBN 978-5-4442-0050-6.

6. Иксанова, А. Г. Методы исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов : учебно-методическое пособие к практическим занятиям по курсу «Методы скрининга физиологически активных веществ» / А. Г. Иксанова, О. В. Бондарь, К. В. Балакин. - Казань: Казанский университет, 2016. -40 с.

7. Исследование биологических аспектов безопасности многостенных углеродных нанотрубок / А. А. Гусев, А. В. Емельянов, С. В. Шутова [и др.] // Актуальные инновационные исследования: наука и практика. - 2009. - № 3-4. - С. 1.

8. Керамический композит на основе диоксида циркония, армированный одностенными углеродными нанотрубками / А. А. Леонов, Э. С. Двилис, О. Л.

Хасанов [и др.] // Российские нанотехнологии. - 2019. - Т. 14, № 3-4. - С. 32-38. -doi: 10.21517/1992-7223-2019-3-4-32-38.

9. Металлсодержащие наночастицы как факторы риска патоморфологических изменений в тканях внутренних органов в эксперименте / Н. В. Зайцева, М. А. Землянова, А. М. Игнатова [и др.] // Анализ риска здоровью. - 2021. - № 2. - С. 114-122. - doi: 10.21668/health.risk/2021.2.11.

10.Методические рекомендации МР 1.2.0037-11 «Контроль наноматериалов в воздухе» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 17 октября 2011 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

11. Методические рекомендации МР 1.2.2639-10 «Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 24 мая 2010 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

12. Методические рекомендации МР 4.2.0014-10 «Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 октября 2010 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

13.Методические указания МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 5 июня 2009 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

14. Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 мая 2010 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

15. Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 мая 2010 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://www.garant.ru/ (дата обращения: 01.06.2022).

16.Наноматериалы и нанотехнологии: методы анализа и контроля / И. В. Гмошинский, С. А. Хотимченко, В. О. Попов [и др.] // Успехи химии. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 48-76.

17.Онищенко, Г. О мерах по обеспечению безопасности окружающей среды и здоровья населения при разработке и внедрении нанотехнологий и наноматериалов / Г. Г. Онищенко // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2011. - № 3. - С. 28-31.

18.Оценка биологических эффектов воздействия наносеребра на ткань головного мозга экспериментальных животных / Л. М. Соседова, М. А. Новиков, Е. А. Титов,

B. С. Рукавишников // Медицина труда и промышленная экология. - 2015. - № 4. -

C. 26-30.

19. Оценка реакции дыхательных путей на однократное интратрахеальное введение нано- и микроразмерных частиц оксида алюминия / М. А. Землянова, Н. В. Зайцева, А. М. Игнатова, М. С. Степанков // Гигиена и санитария. - 2019. - Т. 98, № 2. - С. 196-202. - doi: 10.18821/0016-9900-2019-98-2-196-202.

20. Пилотное кросс-секционное исследование по оценке потенциального фиброгенного риска в условиях реальных экспозиций к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок на рабочих местах / Л. М. Фатхутдинова, Т. О. Халиуллин, О. Л. Васильева [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2013. - Т. 94, № 5. - С. 770-774.

21. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 13 июля 2001 г. N 18 «О введении в действие санитарных правил - СП 1.1.1058-01» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 10 июля 2001 г., с 1 января 2002 года.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://base.garant.ru/12124738/ (дата обращения: 01.06.2022).

22. Принципы оценки генотоксичности углеродсодержащих наноматериалов in vitro (на примере углеродных нанотрубок) (обзор литературы) / Габидинова Г.Ф., Тимербулатова Г.А., Фатхутдинова Л.М. // Токсикологический вестник. - 2021. -Т. 29, № 6. - С. 16-23. - doi: 10.36946/0869-7922-2021-29-6-16-23.

23. Руководство Р 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27 декабря 2013 г.) // Справочно-правовая система «ГАРАНТ». - URL: https://base.garant.ru/71315562/ (дата обращения: 01.06.2022).

24. Синтез наночастиц серебра при помощи ультразвука и галлуазита для создания нанокомпозита с антибактериальными свойствами / Ю. В. Чередниченко, В. Г. Евтюгин, Л. Р. Нигаматзянова [и др.] // Российские нанотехнологии. - 2019. - Т. 14, № 9-10. - С. 64-70. - doi: 10.21517/1992-7223-2019-9-10-64-70.

25.Сравнительная оценка исследования токсических свойств наноматериалов в экспериментах in vivo и in vitro / О. А. Гуськова, Н. В. Завьялов, Е. Л. Скворцова, Х. Х. Хамидулина // Токсикологический вестник. - 2015. - № 1 (130). - С. 22-28.

26. Сравнительная характеристика различных волокнистых материалов в экспериментах in vitro / Г. А. Тимербулатова, П. Д. Дунаев, А. М. Димиев [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2021. - Т. 102, № 4. - С. 501-509. - doi: 10.17816/KMJ2021-501.

27.Сутункова, М. П. Экспериментальные данные и методические соображения к обоснованию предельно допустимой концентрации железо-оксидных наночастиц в воздухе рабочей зоны / М. П. Сутункова // Токсикологический вестник. - 2016. - № 6 (141). - С. 11-17. - doi: 10.36946/0869-7922-2016-6-11-17.

28. Тимербулатова, Г. А. Токсичность одностенных углеродных нанотрубок, исследованная на различных типах культур клеток (обзор современного состояния проблемы) / Г. А. Тимербулатова, Л. М. Фатхутдинова // Российские Нанотехнологии. - 2018. - Т. 13, № 5 ,6. - С. 240 - 245.

29.Тимербулатова, Г. А., Оценка цитотоксичности одностенных углеродных нанотрубок на клеточной культуре макрофагов RAW 264.7 и клетках бронхиального эпителия BEAS-2B / Г. А. Тимербулатова Г.А, П. Д. Дунаев, Л. М.

Фатхутдинова // Медицина труда и промышленная экология. - 2019. - № 9. - С. 770.

30.Тимербулатова, Г. А Методологические основы обоснования безопасных уровней воздействия искусственных наноматериалов (на примере углеродных нанотрубок) (обзор литературы) / Г. А. Тимербулатова, Л. М. Фатхутдинова // Токсикологический вестник. - 2021. - Т. 29, № 6. - С. 5-15. - doi: 10.36946/08697922-2021-29-6-5-15.

31. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты / И. В. Гмошинский, В. А. Шипелин, И. В. Ворожко [и др.] // Вопросы питания. - 2016. -Т. 85, № 2. - С. 14-23.

32. Токсические эффекты углеродных нанотрубок в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия / Т. О. Халиуллин, Е. Р. Кисин, Р. Э. Мюррэй [и др.] // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2014. - № 1 (25). -С. 199-210.

33.Трудовой кодекс Российской Федерации от 30 декабря 2001 г. № 197-ФЗ: (с изменениями от 24, 25.07.2002, 30.06.2003, 27.04., 22.08., 29.12.2004, 09.05.2005, 30.06.2006): с комментариями к изменениям, внесенным Федеральным законом № 90-ФЗ от 30 июня 2006 г. / под ред. Ю. А. Васиной. - Москва: ИндексМедиа, 2006. - 447 с. - ISBN 5-98965-039-6.

34.Хамидулина Х.Х. Международные подходы к оценке токсичности и опасности наночастиц и наноматериалов / Х. Х. Хамидулина, Ю. О. Давыдова // Токсикологический вестник. - 2011. - № 6. - С. 53-57.

35. Экспериментальное и теоретическое исследование транспорта наночастиц серебра при их длительном введении в организм лабораторных млекопитающих / А. А. Анциферова, Ю. П. Бузулуков, П. К. Кашкаров, М. В. Ковальчук // Кристаллография. - 2016. - Т. 61, № 6. - С. 988-994. - doi: 10.7868/S0023476116060035.

36.15 Years of Small: Research Trends in Nanosafety / S. Zhu, L. Li, Z. Gu [et al.] // Small. - 2020. - Vol. 16, No 36. - Pp. e2000980. - doi: 10.1002/smll.202000980.

37.A new approach to the toxicity testing of carbon-based nanomaterials - the clonogenic assay / E. Herzog, A. Casey, F. M. Lyng [et al.] // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 174, No № 1-3. - Pp. 49-60. - doi: 10.1016/j.toxlet.2007.08.009.

38.A chemoattractant cytokine associated with granulomas in tuberculosis and silicosis / G. J. Nau, P. Guilfoile, G. L. Chupp [et al.] // ProcNatlAcadSci USA. - 1997. - Vol. 94, No 12. - Pp. 6414-6419. - doi: 10.1073/pnas.94.12.6414.

39.A comparative study of different in vitro lung cell culture systems to assess the most beneficial tool for screening the potential adverse effects of carbon nanotubes / M. J. Clift, C. Endes, D. Vanhecke [et al.] // Toxicological Sciences. - 2014. - Vol. 137, No 1. - Pp. 55-64. - doi: 10.1093/toxsci/kft216.

40.Advanced Lithium Metal-Carbon Nanotube Composite Anode for High-Performance Lithium-Oxygen Batteries / F. Guo, T. Kang, Z. Liu [et al.] // Nano Lett. - 2019. - Vol. 19, No 9. - Pp. 6377-6384. - doi: 10.1021/acs.nanolett.9b02560.

41.Afrin, R. Room temperature gas sensors based on carboxyl and thiol functionalized carbon nanotubes buckypapers / R. Afrin, N. A. Shah // Diam. Relat. Mater. - 2015. -Vol. 60. - Pp. 42-49. - doi: 10.1016/j.diamond.2015.10.010.

42.Ajori, S. Vibration characteristics of single- and double-walled carbon nanotubes functionalized with amide and amine groups / S. Ajori, R. Ansari, M. Darvizeh // Phys. B Condens. Matter. - 2015. - Vol. 462. - Pp. 8-14. - doi: 10.1016/j.physb.2015.01.003.

43.Alternative estimation of human exposure of single-walled carbon nanotubes using three-dimensional tissue-engineered human lung / E. Stoker, F. Purser, S. Kwon [et al.] // International Journal of Toxicology. - 2008. - Vol. 27, No 6. - Pp. 441-448. - doi: 10.1080/10915810802552138.

44.Ashley, K. NIOSH Manual of Analytical Methods 5th Edition and Harmonization of Occupational Exposure Monitoring / K. Ashley // Gefahrst Reinhalt Luft. - 2015. - Vol. 2015, No 1-2. - Pp. 7-16.

45.Assessing the protection of the nanomaterial workforce / P. A. Schulte, I. Iavicoli, J. H. Rantanen [et al.] // Nanotoxicology. - 2016. - Vol. 10, No 7. - Pp. 1013-1019. - doi: 10.3109/17435390.2015.1132347.

46.Baktur, R. Effect of exposure conditions on SWCNT-induced inflammatory response in human alveolar epithelial cells / R. Baktur, H. Patel, S. Kwon // Toxicology in Vitro. -2011. - Vol. 25, No 5. - Pp. 1153-1160. - doi: 10.1016/j.tiv.2011.04.001.

47.Baron, P. A. Evaluation of aerosol release during the handling of unrefined single walled carbon nanotube materials / P. A. Baron, A. D. Maynard, M. Foley // Carbon Nanotube Aerosol Generation. - 2003. - Vol. 11. - Pp. 1-22.

48.Baytubes - URL: https://foresight.org/baytubes/ (accessed: 25.06.2022).

49.Bianco, A. Applications of Carbon Nanotubes in Drug Delivery / A. Bianco, K. Kostarelos, M. Prato // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2005. - Vol. 9, No 6. - Pp. 674-679. -doi: 10.1016/j.cbpa.2005.10.005.

50.Biocompatible nanoscale dispersion of single-walled carbon nanotubes minimizes in vivo pulmonary toxicity / G. M. Mutlu, G. R. S. Budinger, A. A. Green [et al.] // Nano Lett. -2010. - Vol. 10, No 5. - Pp. 1664-1670. - doi: 10.1021/nl9042483.

51.Biological Effect of Carbon Graphite Whisker in Rat Lung by Long-Term Inhalation / S. Ishimatsu, H. Hori H., T. Kasai [et al.] // Inhal. Toxicol. - 2009. - Vol.21. - Pp. 668-673.

52.Birch, M. E. Occupational monitoring of particulate diesel exhaust by NIOSH method 5040 / M. E. Birch // Appl Occup Environ Hyg. - 2002. - Vol. 17, No 6. - Pp. 400-405. - doi: 10.1080/10473220290035390.

53.Carbon nanotube as electrode materials for supercapacitors / B. De, S. Banerjee, K. D. Verma [et al.] // In Springer Series in Materials Science (Handbook of Nanocomposite Supercapacitor Materials II). - 2020. - Vol. 302. - Pp. 229-243.

54.Carbon nanotube dosimetry: from workplace exposure assessment to inhalation toxicology / A. Erdely, M. Dahm, B. T. Chen [et al.] // Part Fibre Toxicol. - 2013. - Vol. 10, No 1. - Pp. 53. - doi: 10.1186/1743-8977-10-53.

55.Carbon Nanotubes - Curse or Blessing / J-P. Kaiser, M. Roesslein, T. Buerki-Thurnherr, P. Wick // Current medicinal chemistry. - 2011. - Vol. 18, No 14. - Pp. 2115-2128. -doi: 10.2174/092986711795656171.

56.Carbon nanotubes enhance metastatic growth of lung carcinoma via up-regulation of myeloid-derived suppressor cells / А. А. Shvedova, А. V. Tkach, E. R. Kisin [et al.] // Small. - 2013. - Vol. 9. - No 9-10. - Pp. 1691-1695. - doi: 10.1002/smll.201201470.

57.Carbon nanotubes in biology and medicine: In vitro and in vivo detection, imaging and drug delivery / Z. Liu, S. Tabakman, K. Welsher, H. Dai // Nano Res. - 2009. - Vol. 2, No 2. - Pp. 85-120. - doi: 10.1007/s12274-009-9009-8.

58.Carbon nanotubes induce malignant transformation and tumorigenesis of human lung epithelial cells / L. Wang, S. Luanpitpong, V. Castranova [et al.] // Nano Letters. - 2011. - Vol. 11. - No 7. - Pp. 2796-2803.

59.Carbon nanotubes induce oxidative DNA damage in RAW 264.7 cells / L. Migliore, D. Saracino, A. Bonelli [et al.] // Environ Mol Mutagen. - 2010. - Vol. 51, No 4. - Pp. 294303. - doi: 10.1002/em.20545.

60.Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety / K. Donaldson, R. Aitken, L. Tran [et al.] // Toxicol Sci. - 2006. - Vol. 92, No 1. - Pp. 5-22. - doi: 10.1093/toxsci/kfj130.

61.Carbon nanotubes: properties, synthesis, purification, and medical applications / A. Eatemadi, H. Daraee, H. Karimkhanloo [et al.] // Nanoscale Research Letters. - 2014. -Vol. 9, No 1. - Pp. 393. - doi: 10.1186/1556-276X-9-393.

62.Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique / R. C. Murdock, L. Braydich-Stolle, A. M. Schrand [et al.] // Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 101, No 2. - Pp. 239-253. - doi: 10.1093/toxsci/kfm240.

63.Chetyrkina, M. R. In vitro toxicity of carbon nanotubes: a systematic review / M. R. Chetyrkina, F. S. Fedorov, A. G. Nasibulin // RSC Adv. - 2022. - Vol. 12, No 25. - Pp. 16235-16256. - doi: 10.1039/d2ra02519a.

64.Collins, P. G. Nanotubes for Electronics / P. G. Collins, P. Avouris // Sci Am. - 2000. -Vol. 283, No 6. - Pp. 62-69. - doi: 10.1038/scientificamerican1200-62.

65.Commission Recommendation of 18 October 2011 on the definition of nanomaterial Text with EEA relevance (Рекомендация комиссии Евросоюза относительно определения термина «наноматериал»). - URL: http://eur-

lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32011H0696:EN:NOT (accessed: 08.06.2022).

66.Comparative in vitro cytotoxicity study of carbon nanotubes and titania nanostructures on human lung epithelial cells / S. Wadhwa, C. Rea, P. O'Hare [et al.] // Journal of Hazardous Materials. - 2011. - Vol. 191, No 1-3. - Pp. 56-61. - doi: 10.1016/j.jhazmat.2011.04.035.

67.Comparative proteomics and pulmonary toxicity of instilled single-walled carbon nanotubes, crocidolite asbestos, and ultrafine carbon black in mice / J. G. Teeguarden, B. J. Webb-Robertson, K. M. Waters [et al.] // Toxicol Sci. - 2011. - Vol. 120. - No 1. -Pp. 123-35. - doi: 10.1093/toxsci/kfq363.

68.Composites based on conductive polymer with carbon nanotubes in DMMP gas sensors

- An overview / N. M. Nurazzi, M. M. Harussani, N. D. Siti Zulaikha [et al.] // Polimery.

- 202. - Vol. 66. - Pp. 85-97. - doi: 10.3390/polym13071047.

69.Controlled Synthesis of Nickel Encapsulated into Nitrogen-Doped Carbon Nanotubes with Covalent Bonded Interfaces: The Structural and Electronic Modulation Strategy for an Efficient Electrocatalyst in Dye-Sensitized Solar Cells / M. Chen, G. Zhao, L. L. Shao [et al.] // Chem. Mater. - 2017. - Vol. 29. - Pp. 9680-9694. - doi: 10.1021/acs.chemmater. 7b03385.s001.

70.Cytotoxicity assessment of some carbon nanotubes and related carbon nanoparticle aggregates and the implications for anthropogenic carbon nanotube aggregates in the environment / L. E. Murr, K. M. Garza, K. F. Soto [et al.] // International Journal of Environmental Research and Public Health. - 2005. - Vol. 2, No 1. - Pp. 31-42. - doi: 10.3390/ijerph2005010031.

71. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene / G. Jia, H. Wang, L. Yan [et al.] // Environmental Science and Technology. -2005. - Vol. 39, No 5. - Pp. 1378-1383. - DOI:10.1021/es048729l.

72.Cytotoxicity of single-wall carbon nanotubes on human fibroblasts / F. Tian, D. Cui, H. Schwarz [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2006. - Vol. 20, No. 7. - Pp. 1202-1212. - doi: 10.1016/j.tiv.2006.03.008.

73. Comparative and mechanistic genotoxicity assessment of nanomaterials via a quantitative toxicogenomics approach across multiple species / J. Lan, N. Gou, C. Gao [et al.] // Environ Sci Technol. - 2014. - Vol. 48, No 21. - Pp. 12937-12945. - doi: 10.1021/es503065q.

74.Differences in MWCNT- and SWCNT-induced DNA methylation alterations in association with the nuclear deposition / D. Oner, M. Ghosh, H. Bove [et al.] // Part Fibre Toxicol. - 2018. - Vol. 15, No 1. - Pp. 11. - doi: 10.1186/s12989-018-0244-6.

75.Differential effects of single-walled carbon nanotubes on cell viability of human lung and pharynx carcinoma cell lines / K. Hitoshi, M. Katoh, T. Suzuki [et al.] // Journal of Toxicological Sciences. - 2011. - Vol. 36, No 3. - Pp. 379-387. - doi: 10.2131/jts.36.379.

76.Direct fibrogenic effects of dispersed single-walled carbon nanotubes on human lung fibroblasts / L. Wang, R. R. Mercer, Y. Rojanasakul [et al.] // J Toxicol. Environ. Health A. - 2010. - Vol. 73, No 5. - Pp. 410-422. - doi: 10.1080/15287390903486550.

77. Dispersion of single-walled carbon nanotubes by a natural lung surfactant for pulmonary in vitro and in vivo toxicity studies / L. Wang, V. Castranova, A. Mishra [et al.] // Particle and Fibre Toxicology. - 2010. - Vol. 7. - Pp. 31. - doi: 10.1186/1743-8977-7-31.

78.Dispersion of Single-Walled Carbon Nanotubes in Biocompatible Environments / G. A. Timerbulatova, S. V. Boichuk, P. D. Dunaev [et al.] // Nano-technologies in Russia. -2020. - Vol. 15, No 7-8. - P. 437-444. - doi: 10.1134/S1995078020040163.

79.Dong, P. X. In vitro toxicity of acid-functionalized single-walled carbon nanotubes: effects on murinemacrophages and gene expression profiling / P. X. Dong, B. Wan, L. H. Guo // Nanotoxicology. - 2012. - Vol. 6, No 3. - Pp. 288-303. - doi: 10.3109/17435390.2011.573101.

80.Doxorubicin-Loaded Single Wall Nanotube Thermo-Sensitive Hydrogel for Gastric Cancer Chemo-Photothermal Therapy / M. Zhou, S. Liu, Y. Jiang [et al.] // Adv. Funct. Mater. - 2015. - Vol. 25, No 29. - Pp. 4730-4739. - doi: 10.1002/adfm.201501434.

81.Effect of fiber length on carbon nanotube-induced fibrogenesis / A. Manke, S. Luanpitpong, C. Dong [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2014. -Vol. 15, No 5. - Pp. 7444-7461. - doi: 10.3390/ijms15057444.

82.Effect of functionalized carbon nanotubes in the detection of benzene at room temperature / N. Janudin, N. Abdullah, W. M. Z. Wan Yunus [et al.] // J. Nanotechnol. - 2018. - Vol. 2018. - 2107898. - doi: 10.1155/2018/2107898.

83.Effects of varying electrodeposition voltages on surface morphology and corrosion behavior of multi-walled carbon nanotube coated on porous Ti-30 at. %-Ta shape memory alloys / A. G. Hassan, M. A. Mat Yajid, S. N. Saud [et al.] // Surf. Coat. Technol. - 2020. - Vol. 401. - 126257.

84.Eller, P. M. Method 7402 asbestos by TEM (modified for carbon nanotubes) / P. M. Eller, M. E. Cassinelli // In NIOSH method of analytical methods. - 4th ed. - Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health, DHHS (NIOSH), 2006. - Pp. 94-113.

85.Engineered nanomaterials cause cytotoxicity and activation on mouse antigen presenting cells / J. Palomäki, P. Karisola, L. Pylkkänen [et al.] // Toxicology. - 2010. - Vol. 267, No 1-3. - Pp. 125-131. - doi: 10.1016/j.tox.2009.10.034.

86.Engineered Nanoparticles: Review of Health and Environmental Safety (ENRHES). Final Report / V. Stone, S. Hankin, R. Aitken. - United Kingdom, 2009. - URL: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/whatsnew/enhres-final-report (accessed: 25.06.2022).

87.Engineering the Core-Shell-Structured NCNTs-Ni2Si@Porous Si Composite with Robust Ni-Si Interfacial Bonding for High-Performance Li-Ion Batteries / M. Chen, Q. S. Jing, H. B. Sun [et al.] // Langmuir. - 2019. - Vol. 35, No 19. - Pp. 6321-6332. - doi: 10.1021/acs.langmuir.9b00558.

88.Enhanced Synergetic Catalytic Effect of Mo2C/NCNTs@Co Heterostructures in Dye-Sensitized Solar Cells: Fine-Tuned Energy Level Alignment and Efficient Charge Transfer Behavior / M. Chen, G. C. Wang, W. Q. Yang [et al.] // ACS Appl. Mater. Interfaces. - 2019. - Vol. 11, No 45. - Pp. 42156-42171. - doi: 10.1021/acsami.9b14316.

89.Environmental United States Environmental Protection Agency (ЕРА). EPA Leads International Case Study to Reduce Animal Testing for Chemical Safety. - URL: https://www.epa.gov/sciencematters/epa-leads-international-case-study-reduce-animal-testing-chemical-safety (accessed: 25.10.2021).

90.ESR evidence for in vivo formation of free radicals in tissue of mice exposed to singlewalled carbon nanotubes / A. A. Shvedova, E. R. Kisin, A. R. Murray [et al.] // Free Rad. Biol. Med. - 2014. - Vol. 73. - Pp. 154-165. - doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2014.05.010.

91. Evaluation of biocompatible dispersants for carbon nanotube toxicity tests / J. S. Kim, K. S. Song, J. H. Lee, I. J. Yu // Archives of Toxicology. - 2011. - Vol. 85, No 12. - Pp. 1499-1508. - doi: 10.1007/s00204-011-0723-0.

92.Evaluation of uptake, cytotoxicity and inflammatory effects in respiratory cells exposed to pristine and -OH and -COOH functionalized multi-wall carbon nanotubes / C. L. Ursini, R. Maiello, A. Ciervo [et al.] // J Appl Toxicol. - 2016. - Vol. 36, No 3. - Pp. 394-403. - doi: 10.1002/jat.3228.

93.Exposure and emission measurements during production, purification, and functionalizationof arc-discharge-produced multi-walled carbon nanotubes / M. Hedmer, C. Isaxon, P. Nilsson [et al.] // Ann. Occup. Hyg. - 2014. - Vol. 58, No 3. - Pp. 355-379. - doi: 10.1093/annhyg/met072.

94.Exposure and emissions monitoring during carbon nanofiber production - Part I: Elemental carbon andiron-soot aerosols / M. E. Birch, B. K. Ku, D. E. Evans, T. A. Ruda-Eberenz // Ann. Occup. Hyg. - 2011. - Vol. 55, No 9. - Pp. 1016-1036. - doi: 10.1093/annhyg/mer073.

95.Fabrication, Functionalization, and Application of Carbon Nanotube-Reinforced Polymer Composite: An Overview / N. M. Nurazzi, M. R. M. Asyraf, A. Khalina [et al.] // Polymers (Basel). - 2021. - Vol. 13, No 7. - Pp. 1047. - doi: 10.3390/polym13071047.

96.Factoring-in agglomeration of carbon nanotubes and nanofibers for better prediction of their toxicity versus asbestos / A. R. Murray, E.R. Kisin, A. V. Tkach [et al.] // Part Fibre Toxicol. - 2012. - Vol. 9. - Pp. 10. - doi: 10.1186/1743-8977-9-10.

97.Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials / Y. Li, S. H. Doak, J. Yan [et al.] // Mutagenesis. - 2017. - Vol. 32, No 1. - Pp. 151-159. - doi: 10.1093/mutage/gew040.

98.Fadeel, B. Adverse Effects of Engineered Nanomaterials: Exposure, Toxicology, and Impact on Human Health / B. Fadeel, A. Pietroiusti, A. A. Shvedova. - London:

Academic Press, 2017. - 2nd edition. - eBook ISBN: 9780128094907. - URL: https://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&scope=site&db=nlebk&db=nlabk &AN=1169378 (accessed: 25.10.2021).

99.Francis, A. P. Toxicity of carbon nanotubes: A review / A. P. Francis, T. Devasena // Toxicology and Industrial Health. - 2018. - Vol. 34, No 3. - Pp. 200-210.

100. Functionalized carbon nanotubes and their promising applications in therapeutics and diagnostics / B. Singh, S. Lohan, P. S. Sandhu [et al.] // Nanobiomater. Med. Imaging Appl. Nanobiomater. - 2016. - Vol. 8. - Pp. 455-478. - doi: 10.1016/B978-0-323-41736-5.00015-7.

101. Functionalized carbon nanotubes are non-cytotoxic and preserve the functionality of primary immune cells / H. Dumortier, S. Lacotte, G. Pastorin [et al.] // Nano Letters. -2006. - Vol. 6, No 7. - Pp. 1522-1528. - doi: 10.1021/nl061160x.

102. Gene expression profile of collagen types, osteopontin in the tympanic membrane of patients with tympanosclerosis / M. Sakowicz-Burkiewicz, J. Kuczkowski, T. Przybyla [et al.] // Adv Clin Exp Med. - 2017. - Vol. 26, No 6. - Pp. 961-966. - doi: 10.17219/acem/68984.

103. Genotoxicity of carbon nanofibers: are they potentially more or less dangerous than carbon nanotubes or asbestos? / E. R. Kisin, A. R. Murray, L. Sargent [et al.] // Toxicol Appl Pharmacol. - 2011. - Vol. 252, No 1. - Pp. 1-10. - doi: 10.1016/j.taap.2011.02.001.

104. Genotoxicity of short single-wall and multi-wall carbon nanotubes in human bronchial epithelial and mesothelial cells in vitro / H. K. Lindberg, G. C. Falck, R. Singh [et al.] // Toxicology. - 2013. - Vol. 313, No 1. - Pp. 24-37. - doi: 10.1016/j.tox.2012.12.008.

105. Genotoxicity, cytotoxicity, and reactive oxygen species induced by single-walled carbon nanotubes and C (60) fullerenes in the FE1-Mutatrade mark Mouse lung epithelial cells / N. R. Jacobsen, G. Pojana, P. White [et al.] // Environ Mol Mutagen. - 2008. -Vol. 49, No 6. - Pp. 476-487. - doi: 10.1002/em.20406.

106. Gokfen, T. Modeling of the HiPco process for carbon nanotube production. II. Reactor-scale analysis / T. Gokfen, C. E. Dateo, M. Meyyappan // J Nanosci

Nanotechnol. - 2002. - Vol. 2, No 5. - Pp. 535-544. - doi: 10.1166/153348802760394124.

107. Highly stretchable electromagnetic interference (EMI) shielding segregated polyurethane/carbon nanotube composites fabricated by microwave selective sintering / D. Feng, D. Xu, Q. Wang, P. Liu // J. Mater. Chem. C. - 2019. - Vol. 7, No 26. - Pp. 7938-7946.

108. Human exposure to carbon-based fibrous nanomaterials: A review / I. Guseva Canu, T. F. Bateson, V. Bouvard [et al.] // International Journal of Hygiene and Environmental Health. - 2016. - Vol. 219, No 2. - Pp. 166-175. - doi: 10.1016/j.ijheh.2015.12.005.

109. Iijima, S. Helical microtubules of graphitic carbon / S. Iijima // Nature. - 1991. -Vol. 354. - Pp. 56-58.

110. Imagej. - URL: https://imagej.nih.gov/ij/ (accessed: 25.10.2021).

111. In situ growth of Niencapsulated and N-doped carbon nanotubes on N-doped ordered mesoporous carbon for high-efficiency triiodide reduction in dye-sensitized solar cells / M. Chen, L. L. Shao, X. W. Lv [et al.] // Chem. Eng. J. - 2020. - Vol. 390. -124633.

112. In vitro evaluation of cytotoxicity of engineered carbon nanotubes in selected human cell lines / X. Hu, S. Cook, P. Wang [et al.] // Science of the Total Environment. - 2010. - Vol. 408, No 8. - Pp. 1812-1817. - doi: 10.1016/j.scitotenv.2010.01.035.

113. In vitro toxicity evaluation of single walled carbon nanotubes on human A549 lung cells / M. Davoren, E. Herzog, A. Casey [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2007. - Vol. 21, No 3. - Pp. 438-448. - doi: 10.1016/j.tiv.2006.10.007.

114. In vitro-in vivo correlations of pulmonary inflammogenicity and genotoxicity of MWCNT / E. Di Ianni, J. S. Erdem, P. M0ller [et al.] // Part Fibre Toxicol. - 2021. - Vol. 18, No 1. - Pp. 25. - doi: 10.1186/s12989-021-00413-2.

115. Induction of stem-like cells with malignant properties by chronic exposure of human lung epithelial cells to single-walled carbon nanotubes / S. Luanpitpong, L. Wang, V. Castranova [et al.] // Particle and Fibre Toxicology. - 2014. - Vol. 11.

116. Inhalation toxicity of multiwall carbon nanotubes in rats exposed for 3 months / L. Ma-Hock, S. Treumann, V. Strauss [et al.] // Toxicol Sci. - 2009. - Vol. 112, No 2. - Pp. 468-481. - doi: 10.1093/toxsci/kfp146.

117. Inhalation vs. aspiration of single-walled carbon nanotubes in C57BL/6 mice: inflammation, fibrosis, oxidative stress, and mutagenesis / A. A. Shvedova, E. Kisin, A. R. Murray [et al.] // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2008. - Vol. 295, No 4. - Pp. 552-565. - doi: 10.1152/ajplung.90287.2008.

118. Inhaled carbon nanotubes reach the subpleural tissue in mice / J. P. Ryman-Rasmussen, M. F. Cesta, A. R. Brody [et al.] // Nat Nanotechnol. - 2009. - Vol. 4, No 11. - Pp. 747-751. - doi: 10.1038/nnano.2009.305.

119. International Guiding Principles For Biomedical Research Involving Animals. -URL: https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guiding_Principles_2012.pdf (accessed: 03.09.2021).

120. Kharissova, O. V. Dispersion of carbon nanotubes in water and non-aqueous solvents / O. V. Kharissova, B. I. Kharisov, E. G. De Casas Ortiz // RSC Advances. -2013. - Vol. 3, No 47. - Pp. 24812-24852. - doi: 10.1039/c3ra43852j.

121. Kobayashi N, Pulmonary and systemic responses of highly pure and well-dispersed single-wall carbon nanotubes after intratracheal instillation in rats / N. Kobayashi, M. Naya, K. Mizuno [et al.] // Inhal Toxicol. - 2011. - Vol. 13. - Pp. 814-828. - doi: 10.3109/08958378.2011.614968.

122. Large scale CVD synthesis of single walled carbon nanotubes / A. M. Cassell, J. A. Raymakers, J. Kong, H. J. Dai // J Phys Chem B. - 1999. - Vol. 103, No 31. - Pp. 6484-6492. - doi: 10.1021/JP990957S.

123. Length effects of single-walled carbon nanotubes on pulmonary toxicity after intratracheal instillation in rats / M. Ema, H. Takehara, M. Naya [et al.] // Toxicol Sci. -2017. - Vol. 42. - No 3. - Pp. 367-378. - doi: 10.2131/jts.42.367.

124. Liu, X. Structure, synthesis, and sensing applications of single-walled carbon nanohorns / X. Liu, Y. Ying, J. Ping // Biosens Bioelectron. - 2020. - Vol. 167. -112495. - doi: 10.1016/j.bios.2020.112495.

125. Livak, K. J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. -2001. - Vol. 25, No 4. - Pp. 402-408. - doi: 10.1006/meth.2001.1262.

126. Long-term effects of carbon containing nanomaterials and asbestos in the lung: one year postexposure comparisons / A. A. Shvedova, N. Yanamala, E. R. Kisin [et al.] // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2014. - Vol. 306, No 2. - Pp. 170-182. - doi: 10.1152/ajplung.00167.2013.

127. Lung macrophages «digest» carbon nanotubes using a superoxide/peroxynitrite oxidative pathway / V. E. Kagan, A. A. Kapralov, C. M. St Croix [et al.] // ACS Nano. - 2014. - Vol. 8. - No 6. - Pp. 5610-5621. - doi: 10.1021/nn406484b.

128. Madani, S. Y. A concise review of carbon nanotube's toxicology / S. Y. Madani, A. Mandel, A. M. Seifalian // Nano Rev. - 2013. - Vol. 4. - doi: 10.3402/nano. v4i0.21521.

129. Maity, D. Polyvinyl alcohol wrapped multiwall carbon nanotube (MWCNTs) network on fabrics for wearable room temperature ethanol sensor / D. Maity, K. Rajavel, R. T. R. Kumar // Sens. Actuators B Chem. - 2018. - Vol. 261. - Pp. 297-306. - doi: 10.1016/j.snb.2018.01.152.

130. Makarova, M. N. Alternative methods for studying toxicity. Bioethical principles / M. N. Makarova, V. G. Makarov // Laboratory Animals for Science. - 2022. - Vol. 1. -Pp. 52-76. - doi: 10.29296/2618723X-2022-01-07.

131. Maruyama, B. Carbon nanotubes and nanofibers in composite materials / B. Maruyama, K. Alam // SAMPE J. - 2002. - Vol. 38, No 3. - Pp. 59-70.

132. Mechanisms for how inhaled multiwalled carbon nanotubes suppress systemic immune function in mice / L. A. Mitchell, F. T. Lauer, S. W. Burchiel, J. D. McDonald // Nat Nanotechnol. - 2009. - Vol. 4, No 7. - Pp. 451-456. - doi: 10.1038/nnano.2009.151.

133. Mechanisms of genotoxicity. A review of in vitro and in vivo studies with engineered nanoparticles / Z. Magdolenova, A. Collins, A. Kumar [et al.] // Nanotoxicology. - 2014. - Vol. 8, No 3. - Pp. 233-278. - doi: 10.3109/17435390.2013.773464.

134. Mediation of the single-walled carbon nanotubes induced pulmonary fibrogenic response by osteopontin and TGF-01 / T. O. Khaliullin, E. R. Kisin, A. R. Murray [et al.] // Experimental Lung Research. - 2017. - Vol. 43, No 8. - Pp. 311-326. - doi: 10.1080/01902148.2017.1377783.

135. Methner, M. M. Engineering case reports. Effectiveness of local exhaust ventilation (LEV) in controlling engineered nanomaterial emissions during reactor cleanout operations / M. M. Methner // J Occup Environ Hyg. - 2008. - Vol. 5, No 6. -Pp. 63-69. - doi: 10.1080/15459620802059393.

136. Monitoring multiwalled carbon nanotube exposure in carbon nanotube research facility / J. H. Han, E. J. Lee, J. H. Lee [et al.] // Inhal Toxicol. - 2008. - Vol. 20, No 8.

- Pp. 741-749. - doi: 10.1080/08958370801942238.

137. Morsi, M. A. Reinforcement of the optical, thermal and electrical properties of PEO based on MWCNTs/Au hybrid fillers: Nanodielectric materials for organoelectronic devices / M. A. Morsi, A. Rajeh, A. A. Al-Muntaser // Compos. Part B Eng. - 2019. -Vol. 173. - 106957. - doi: 10.1016/j.compositesb.2019.106957.

138. Mossman, B. T. Mechanisms in the pathogenesis of asbestosis and silicosis / B. T. Mossman, A. Churg // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1998. - Vol. 157, No 5 Pt 1. -Pp. 1666-1680. - doi: 10.1164/ajrccm.157.5.9707141.

139. Mouse pulmonary dose- and time course-responses induced by exposure to multiwalled carbon nanotubes / D. W. Porter, A. F. Hubbs, R. R. Mercer [et al] // Toxicology.

- 2010. - Vol. 269, No 2-3. - Pp. 136-147. - doi: 10.1016/j.tox.2009.10.017.

140. Multiple-Path Particle Dosimetry Model (MPPD v 3.04). - URL: https://www.ara.com/products/multiple-path-particle-dosimetry-model-mppd-v-304 (accessed: 25.10.2021).

141. Nanocyl. NC7000™ Industrial multiwall carbon nanotubes. - URL: https://www.nanocyl.com/product/nc7000/ (accessed: 25.10.2021).

142. Nanocyl. Responsible care and nanomaterials case study Nanocyl. - URL: http://www.cefic.org/Documents/ResponsibleCare/04_Nanocyl.pdf (accessed: 25.06.2022).

143. NANoREG. Grant Agreement Number 310584. Deliverable D 2.06. Validated protocols for test item preparation for key in vitro and ecotoxicity studies. - Due date of deliverable: 2016/01/31 (approved postponement). - Actual submission date: 2016/03/24.

144. Nanotechnology in agriculture: Opportunities, toxicological implications, and occupational risks / I. Iavicoli, V. Leso, D. H. Beezhold, A. A. Shvedova // Toxicol Appl Pharmacol. - 2017. - Vol. 329. - Pp. 96-111. - doi: 10.1016/j.taap.2017.05.025.

145. National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme (NICNAS). -URL: https://www.industrialchemicals.gov.au/sites/default/files/2020-09/Slides%20NICNAS%20to%20AICIS%20%5BPDF%20911 %20KB%5D.pdf (accessed: 25.10.2021).

146. Near-infrared fluorescence microscopy of single-walled carbon nanotubes in phagocytic cells / P. Cherukuri, S. M. Bachilo, S. H. Litovsky, R. B. Weisman // J Am Chem Soc. - 2004. - Vol. 126, No 48. - Pp. 15638-15639. - doi: 10.1021/ja0466311.

147. NIOSH Current intelligence bulletin 65. Occupational exposure to carbon nanotubes and nanofibers. - URL: https://www.cdc.gov/niosh/docs/2013-145/pdfs/2013-145.pdf?id=10.26616/NIOSHPUB2013145 (accessed: 25.10.2021).

148. Noncovalent functionalization of carbon nanotubes for highly specific electronic biosensors / R. J. Chen, S. Bangsaruntip, K. A. Drouvalakis, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - Vol. 100, No 9. - Pp. 4984-4989. - doi: 10.1073/pnas.0837064100.

149. Occupational exposure assessment in carbon nanotube and nanofiber primaryand secondary manufacturers / M. M. Dahm, D. E. Evans, M. K. Schubauer-Berigan [et al.] // Ann. Occup. Hyg. - 2012. - Vol. 56, No 5. - Pp. 542-556. - doi: 10.1093/annhyg/mer 110.

150. Occupational exposure limits for manufactured nanomaterials, a systematic review / R. Mihalache, J. Verbeek, H. Graczyk // Nanotoxicology. - 2016. - Vol. 11, No 1. - Pp. 7-19. - doi: 10.1080/17435390.2016.1262920.

151. OCSiAl - URL: https://ocsial.com/ (accessed: 08.06.2022).

152. OECD Test Guideline 413: Subchronic Inhalation Toxicity: 90-day Study. - URL: https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd-tg413.pdf (accessed: 25.10.2021).

153. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). OECD encourages the development of non-animal test methods for the detection of thyroid disrupters. - URL: https://www.oecd.org/env/ehs/oecd-encourages-development-of-non-animal-test-methods-for-detection-of-thyroid-disrupters.html (accessed: 25.10.2021).

154. Ostling, D. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells / D. Ostling, K. J. Johanson // Biochemical and biophysical research communications. - 1984. - Vol. 123, No 1. - Pp. 291-298. - doi: 10.1016/0006-291x(84)90411-x.

155. Pauluhn, J. Multi-walled carbon nanotubes (Baytubes): approach for derivation of occupational exposure limit / J. Pauluhn // Regul Toxicol Pharmacol. - 2010. - Vol. 57, No 1. - Pp. 78-89. - doi: 10.1016/j.yrtph.2009.12.012.

156. Pauluhn, J. Subchronic 13-week inhalation exposure of rats to multiwalled carbon nanotubes: toxic effects are determined by density of agglomerate structures, not fibrillar structures / J. Pauluhn // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, No 1. - Pp. 226-242. - doi: 10.1093/toxsci/kfp247.

157. Physical properties of single - wall carbon nanotubes in cell culture and their dispersal due to alveolar epithelial cell response / K. Fujita, M. Fukuda, S. Endoh [et al.] // Toxicology Mechanisms and Methods. - 2013. - Vol. 23, No 8. - Pp. 598-609. - doi: 10.3109/15376516.2013.811568.

158. Practical guide: How to use alternatives to animal testing to fulfil your information requirements for REACH registration. Version 2.0 July 2016. - URL: https: //echa.europa.eu/documents/10162/13655/practical_guide_how_to_use_alternativ es_en.pdf/148b30c7-c186-463c-a898-522a888a4404 (accessed: 25.10.2021).

159. Pulmonary and systemic responses of highly pure and well-dispersed single-wall carbon nanotubes after intratracheal instillation in rats / N. Kobayashi, M. Naya, K. Mizuno [et al.] // Inhal Toxicol. - 2011. - Vol. 13. - Pp. 814-828. - doi: 10.3109/08958378.2011.614968.

160. Pulmonary biocompatibility assessment of inhaled single-wall and multiwall carbon nanotubes in BALB/c mice / P. Ravichandran, S. Baluchamy, R. Gopikrishnan [et al.] // J Biol Chem. - 2011. - Vol.286. - No 34. - Pp. 29725-33. - doi: 10.1074/jbc.M111.251884.

161. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi-walled carbon nanotubes / R. R. Mercer, A. F. Hubbs, J. F. Scabilloni [et al.] // Part Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8. - Pp. 21. - doi: 10.1186/1743-8977-8-21.

162. Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation / C. W. Lam, J. T. James, R. McCluskey, R. L. Hunter // Toxicol Sci. - 2004. - Vol. 77, No 1. - Pp. 126-134. - doi: 10.1093/toxsci/kfg243.

163. Pulmonary toxicity of well-dispersed single-wall carbon nanotubes after inhalation / Y. Morimoto, M. Hirohashi, N. Kobayashi [et al.] // Nanotoxicology. - 2012. - Vol. 6, No7. - Pp. 766-775. - doi: 10.3109/17435390.2011.620719.

164. Pulskamp, K. Carbon nanotubes show no sign of acute toxicity but induce intracellular reactive oxygen species in dependence on contaminants / K. Pulskamp, S. Diabaté, H. F. Krug // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 168, No 1. - Pp. 58-74. - doi: 10.1016/j .toxlet.2006.11.001.

165. Rakitskii, V. Comparative toxicity of metribuzin based pesticides in nano- and macrodisperse forms / V. Rakitskii, K. Lokhin // Toxicology Letters. - 2016. - Vol. 258, No S. - Pp. 265. - doi: 10.1016/j.toxlet.2016.06.1933.

166. Reference Methods for Measuring Airborne Man-Made Mineral Fibers. Environmental Health Series 4. - Copenhagen: World Health Organization, 1985.

167. Review of carbon nanotubes toxicity and exposure-Appraisal of human health risk assessment based on open literature / K. Aschberger, H. Johnston, V. Stone [et al.] // Critical Reviews in Toxicology. - 2010. - Vol. 40, No 9. - Pp. 759-790. - doi: 10.3109/10408444.2010.506638.

168. Risk Assessment of the Carbon Nanotube Group / J. Nakanishi, Y. Morimoto, I. Ogura [et al.] // Risk Anal. - 2015. - Vol. 35, No 10. - Pp. 1940-1956. - doi: 10.1111/risa.12394.

169. Sensing Solution for Airborne Carbon Nanotube Exposure in Workplaces Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy / R. Bieri, J. Borek-Donten, T. Bürgi [et al.] // TechConnect Briefs. - 2017. - Pp. 275-278.

170. Sequential exposure to carbon nanotubes and bacteria enhances pulmonary inflammation and infectivity / A. A. Shvedova, J. P. Fabisiak, E. R. Kisin [et al.] // Am. J. Res. Cell. Mol. Biol. - 2008. - Vol. 38, No 5. - Pp. 579-590. - doi: 10.1165/rcmb.2007-0255OC.

171. Shvedova, A. A. The Role of Nanotoxicology in Realizing the 'Helping Without Harm' Paradigm of Nanomedicine: Lessons from Studies of Pulmonary Effects of SingleWalled Carbon Nanotubes / A. A. Shvedova, V. E. Kagan // J. Int. Med. - 2010. - Vol. 267. - 106 - Pp. 118.

172. Single-walled carbon nanotube induces oxidative stress in rat lung epithelial cells / S. C. Sharma, S. Sarkar, A. Periyakaruppan [et al.] // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. - 2007. - Vol. 7, No 7. - Pp. 2466-2472. - doi: 10.1166/jnn.2007.431.

173. Single-walled carbon nanotubes impair human macrophage engulfment of apoptotic cell corpses / E. Witasp, A. A. Shvedova, V. E. Kagan, B. Fadeel // Inhalation Toxicology. - 2009. - Vol. 21. - Pp. 131-136. - doi: 10.1080/08958370902942574.

174. Single-Walled Carbon Nanotubes Induce Fibrogenic Effect by Disturbing Mitochondrial Oxidative Stress and Activating NF-kB Signaling / X. He, S. H. Young, J. E. Fernback, Q. Ma // J Clin Toxicol. - 2012. - Suppl 5. - Pp. 5. - doi: 10.4172/2161-0495.S5-005.

175. Single-walled carbon nanotubes: differential genotoxic potential associated with physico-chemical properties / B. B. Manshian, G. J. Jenkins, P. M. Williams [et al.] // Nanotoxicology. - 2013. - Vol. 7, No 2. - Pp. 144-156. - doi: 10.3109/17435390.2011.647928.

176. Single-walled carbon nanotubes: geno- and cytotoxic effects in lung fibroblast V79 cells / E. R. Kisin, A. R. Murray, M. J. Keane [et al.] // Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A-Current Issues. - 2007. - Vol. 70, No 24. - Pp. 2071-2079. - doi: 10.1080/15287390701601251.

177. Size effects of single-walled carbon nanotubes on in vivo and in vitro pulmonary toxicity / K. Fujita, M. Fukuda, S. Endoh [et al.] // Inhalation Toxicol. - 2015. - Vol. 27, No 4. - Pp. 207-223. - doi: 10.3109/08958378.2015.1026620.

178. Souto, L. F. C. Polyaniline/carbon nanotube hybrids modified with ionic liquids as anticorrosive additive in epoxy coatings / L. F. C. Souto, B. G. Soares // Prog. Org. Coat.

- 2020. - Vol. 143. - 105598.

179. Stat Peel. - URL: https://www.statpeel.com/ (accessed: 25.06.2022).

180. Strategic Design of Vacancy-Enriched Fe1- xS Nanoparticles Anchored on Fe3C-Encapsulated and N-Doped Carbon Nanotube Hybrids for High-Efficiency Triiodide Reduction in Dye-Sensitized Solar Cells / M. Chen, G. C. Wang, L. L. Shao [et al.] // ACS Appl. Mater. Interfaces. - 2018. - Vol. 10, No 37. - Pp. 31208-31224. - doi: 10.1021/acsami.8b08489.

181. Strength and breaking mechanism of multiwalled carbon nanotubes under tensile load / M. Yu, O. Lourie, M. J. Dyer [et al.] // Science. - 2000. - Vol. 287, No 5453. - Pp. 637-640. - doi: 10.1126/science.287.5453.637.

182. Structural profiling and biological performance of phospholipid-hyaluronan functionalized single-walled carbon nanotubes / R. Dvash, A. Khatchatouriants, L. J. Solmesky [et al.] // J. Control Release. - 2013. - Vol. 170, No 2. - Pp. 295-305. - doi: 10.1016/j.jconrel.2013.05.042.

183. SWCNT suppress inflammatory mediator responses in human lung epithelium in vitro / E. Herzog, H. J. Byrne, A. Casey [et al.] // Toxicology and Applied Pharmacology.

- 2009. - Vol. 234, No 3. - Pp. 378-390. - doi: 10.1016/j.taap.2008.10.015.

184. SWCNTs induced autophagic cell death in human bronchial epithelial cells / E. J. Park, N. E. Zahari, E. W. Lee [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2014. - Vol. 28, No 3. -Pp. 442-450. - doi: 10.1016/j.tiv.2013.12.012.

185. Synergistic effect of graphene and carbon nanotube for high-performance electromagnetic interference shielding films / E. Zhou, J. Xi, Y. Guo [et al.] // Carbon. -2018. - Vol. 133. - Pp. 316-322. - doi: 10.1016/j.carbon.2018.03.023.

186. Synergistic effect of MWCNTs functionalization on interfacial and mechanical properties of multi-scale UHMWPE fibre reinforced epoxy composites / M. Ahmadi, O. Zabihi, M. Masoomi, M. Naebe // Compos. Sci. Technol. - 2016. - Vol. 134. - Pp. 1-11.

187. Systematic Review of Reported Exposure to Engineered Nanomaterials / M. Debia, B. Bakhiyi, C. Ostiguy [et al.] // Ann. Occup. Hyg. - 2016. - Vol. 60, No 8. - Pp. 916935. - doi: 10.1093/annhyg/mew041.

188. The degree and kind of agglomeration affect carbon nanotube cytotoxicity / P. Wick, P. Manser, L. K. Limbach [et al.] // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 168, No 2. - Pp. 121-131. - doi: 10.1016/j.toxlet.2006.08.019.

189. The National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH). NIOSH Program Portfolio. - URL: https://www.cdc.gov/niosh/programs/default.html (accessed: 25.10.2021).

190. The R Project for Statistical Computing. - URL: https://www.R-project.org/ (accessed: 03.09.2021).

191. Toxicological Profiling of Highly Purified Metallic and Semiconducting SingleWalled Carbon Nanotubes in the Rodent Lung and E. coli / X. Wang, N. D. Mansukhani, L. M. Guiney [et al.] //ACS Nano. 2016. - Vol.10. - No 6. - Pp. 6008-6019. - doi: 10.1021/acsnano.6b01560.

192. Transparency Market Research. - URL: https://www.transparencymarketresearch.com/ (accessed: 08.06.2022).

193. TUBALLTM graphene nanotubes. - URL: https://tuball.com/about-tuball (accessed: 03.09.2021).

194. Unusual inflammatory and fibrogenic pulmonary responses to single-walled carbon nanotubes in mice / A. A. Shvedova, E. R. Kisin, R. Mercer [et al.] // American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. - 2005. - Vol. 289, No 5. - Pp. 698-708. - doi: 10.1152/ajplung.00084.2005.

195. Vitamin E deficiency enhances pulmonary inflammatory response and oxidative stress induced by single-walled carbon nanotubes in C57BL/6 mice / A. A. Shvedova, E. R. Kisin, A. R. Murray [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2007. - Vol. 221, No 3. -Pp. 339-348. - doi: 10.1016/j.taap.2007.03.018.

196. William, I. G. Flame Ionization Detector for Gas Chromatography / I. G. William, R. A. Dewar // Nature. - 1958. - Vol. 181, No 4611. - Pp. 760. -doi.org/10.1038/181760a0.

197. Worle-Knirsch, J. M. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays / J. M. Worle-Knirsch, K. Pulskamp, H. F. Krug // Nano Letters. - 2006. - Vol. 6, No 6. - Pp. 1261-1268. - doi: 10.1021/nl060177c.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Таблица 1 - Виды и объем исследований, выполненных на разных этапах

исследования..................................................................................................................42

Таблица 2 - Данные о химическом строении и физико-химических свойствах

очищенных и неочищенных от металлических примесей ОУНТ TUBALL™.......45

Таблица 3 - Дисперсность аэрозоля в пробе, отобранной на СЭЦ-фильтр, на

которым были визуализированы агломераты ОУНТ................................................64

Таблица 4 - Количество и масса частиц ОУНТ, осевших в различных отделах дыхательных путей человека при 8-часовой экспозиции, по данным

компьютерного моделирования...................................................................................66

Таблица 5 - Количество и масса частиц ОУНТ, осевших в различных отделах дыхательных путей крысы при 8-часовой экспозиции, по данным компьютерного

моделирования...............................................................................................................68

Таблица 6 - Цитотоксичность ОУНТ на различных типах клеток по литературным

данным............................................................................................................................69

Таблица 7 - Литературные данные по дозам, применявшимся в экспериментах на

животных........................................................................................................................69

Таблица 8 - Результаты ДСР по распределению размеров агломератов неочищенных и очищенных ОУНТ TUBALL™ (средний размер агломератов), (X ±

а)......................................................................................................................................74

Таблица 9 - Результаты ПЭМ по распределению размеров агломератов УНТ (средний размер, нм), (X ± а).......................................................................................75

Рисунок 1 - Интратрахеальная инстилляция дисперсий ОУНТ крысам под эфирным

рауш-наркозом...............................................................................................................61

Рисунок 2 - Агломерат ОУНТ в пробе воздуха рабочей зоны. ПЭМ-изображение, увеличение в 6300 раз...................................................................................................64

Рисунок 3 - Доля частиц ОУНТ, осевших в различных отделах дыхательных путей человека, по данным компьютерного моделирования в зависимости от размеров. Примечание: ВДП - верхние дыхательные пути, НДП - нижние дыхательные пути (трахеобронхиалъная зона), АЗ - альвеолярная зона, Общее - общее осаждение в

дыхательных путях......................................................................................................66

Рисунок 4 - Доля частиц ОУНТ, осевших в различных отделах дыхательных путей крысы, по данным компьютерного моделирования в зависимости от размеров. Примечание: ВДП - верхние дыхательные пути, НДП - нижние дыхательные пути (трахеобронхиальная зона), АЗ - альвеолярная зона, Общее - общее осаждение в

дыхательных путях......................................................................................................67

Рисунок 5 - Дисперсии ОУНТ в ДПФХ 0,01 мкг/мл в фосфатно-буферном растворе

(0,1 мг/мл).......................................................................................................................71

Рисунок 6 - Дисперсии ОУНТ в Survanta® 0,15 мг/мл в фосфатно-буферном

растворе (0,1 мг/мл)......................................................................................................72

Рисунок 7 - Дисперсии ОУНТ в 1% бычьем сывороточном альбумине в фосфатно-

буферном растворе (0,1 мг/мл)....................................................................................72

Рисунок 8 - Дисперсии ОУНТ в культуральной среде DMEM с добавлением 10%

бычьей сыворотки.........................................................................................................73

Рисунок 9 - Дисперсии ОУНТ в культуральной среде BEGM с добавлением 10%

бычьей сыворотки.........................................................................................................73

Рисунок 10 - ПЭМ изображения дисперсии неочищенных ОУНТ в среде BEGM (А,

В); очищенных ОУНТ в среде DMEM (Б, Г)..............................................................75

Рисунок 11 - Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии RAW 264.7; среднее значение ± стандартное отклонение выживаемости клеток в MTS-тесте после 48-часовой экспозиции исследуемых материалов: А — очищенные ОУНТ; Б — неочищенные ОУНТ; p >0,05 для всех

сравнений с 0 мкг/мл в контроле.................................................................................78

Рисунок 12 - Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии BEAS-2B; среднее значение ± стандартное отклонение выживаемости клеток в MTS-тесте после 48-часовой экспозиции исследуемых

материалов: А — очищенные ОУНТ; Б — неочищенные ОУНТ; p >0,05 для всех

сравнений с 0 мкг/мл в контроле.................................................................................79

Рисунок 13 - Картина репрезентативного вестерн-блота на клетках линии RAW 264.7 (инкубация 48 ч): А — очищенные ОУНТ; Б — неочищенные ОУНТ; материалы использовали в концентрациях 0,0006, 0,04 и 2,5 мкг/мл; маркёры апоптоза — расщеплённые формы каспазы-3 и поли-АДФ(рибоза)-полимеразы (ПАРП); актин отражает уровень белка в образцах; доксорубицин (Д) — 0,5 мкг/мл

.........................................................................................................................................80

Рисунок 14 - Картина репрезентативного вестерн-блота на клетках линии BEAS-2B (инкубация 48 ч): очищенные и неочищенные ОУНТ использовали в концентрациях 0,0006, 0,04 и 2,5 мкг/мл; маркёр апоптоза —поли-АДФ(рибоза)-полимеразы (ПАРП); актин отражает уровень белка в образцах; доксорубицин

(Д) — 0,5 мкг/мл............................................................................................................80

Рисунок 15 - Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии BEAS-2B; среднее значение ± стандартное отклонение выживаемости клеток в MTS-тесте после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов: А — неочищенные ОУНТ; Б — очищенные ОУНТ; * - p<0,05 по

сравнению с контролем................................................................................................82

Рисунок 16 - Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии BEAS-2B по данным ЛДГ-теста; среднее значение ± стандартное отклонение; 72-часовая экспозиция исследуемых материалов: неочищенные

ОУНТ; очищенные ОУНТ; * - p<0,05 по сравнению с контролем..........................83

Рисунок 17 - Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии А549; среднее значение ± стандартное отклонение после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов: А — неочищенные ОУНТ; Б — очищенные