Комплексообразование фуллерена С60 и одностенных углеродных нанотрубок с ароматическими биологически активными соединениями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Воронин Дмитрий Петрович

• Воронин Дмитрий Петрович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Воронин Дмитрий Петрович

ВВЕДЕНИЕ

1. БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УГЛЕРОДНЫХ НАНОСТРУКТУР

1.1. Биологическая активность фуллеренов и углеродных нанотрубок

1.1.1. Виды углеродных наноструктур и их применение

1.1.2. Биологическая активность фуллеренов

1.1.3. Биологическая активность углеродных нанотрубок

1.2. Ароматические биологически активные соединения

1.3. Комбинированное использование фуллеренов и углеродных

нанотрубок с ароматическими биологически активными веществами

1.4. Агрегация фуллеренов и нековалентное комплексообразование фуллеренов и углеродных нанотрубок с биологически активными веществами

1.4.1. Характеризация состояния фуллерена Сбо в водной среде

1.4.2. Агрегация фуллерена Сбо в водной среде

1.4.3. Комплексообразование фуллеренов и углеродных нанотрубок с ароматическими биологически активными соединениями

1.5. Нековалентное комплексообразование ароматических биологически активных соединений как механизм модуляции их биологической активности

1.5.1. Физико-химические особенности комплексообразования ароматических биологически активных соединений

1.5.2. Интерцепторный механизм

1.5.3. Протекторный механизм

1.6. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Водный раствор фуллерена Сбо

2.1.2. Водный раствор одностенных углеродных нанотрубок

2.1.3. Доксорубицин

2.1.4. Профлавин

2.1.5. Бромистый этидий

2.1.6. Метиленовый голубой

2.2. Методы

2.2.1. Атомно-силовая микроскопия

2.2.2. Сканирующая туннельная микроскопия

2.2.3. Изотермическое калориметрическое титрование

2.2.4. Спектрофотометрическое титрование

2.2.5. ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье

2.2.6. Метод динамического светорассеяния

2.2.7. ЯМР-спектроскопия

3. ТЕРМОДИНАМИКА АГРЕГАЦИИ ФУЛЛЕРЕНА С60 В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

3.1. Современный уровень знания о термодинамике агрегации С60 в водных растворах

3.2. Агрегация фуллерена С60 в водном растворе

3.2.1. Анализ данных атомно-силовой микроскопии и сканирующей туннельной микроскопии

3.2.2. Анализ данных титрования в УФ/видимом диапазоне

3.2.3. Анализ данных динамического светорассеяния

3.2.4. Физическая модель агрегации фуллерена С60 в растворе

3.2.5. Строгая модель агрегации фуллерена С60

3.2.6. Масштабируемая модель агрегации фуллерена С60

3.2.7. Анализ результатов аппроксимации данных динамического светорассеяния с помощью масштабированной модели

3.2.8. Проверка устойчивости параметров «масштабированной» модели ме-

тодом Монте-Карло

3.2.9. Метод расчета энергетики агрегации

3.2.10. Анализ энергетики агрегации фуллерена Сбо

3.3. Доказательство энтропийной природы агрегации фуллерена Сбо в

водном растворе

3.3.1. Анализ данных динамического светорассеяния

3.3.2. Анализ данных изотермического калориметрического

титрования

3.3.3. Природа сил, стабилизирующих агрегаты фуллерена в водном растворе

3.4. Заключение

4. КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ФУЛЛЕРЕНА Сбо С АРОМАТИЧЕСКИМИ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

4.1. Общее представление о биологической роли взаимодействия фуллерена Сбо с ароматическими биологически активными соединениями ......................................................................................................... 8б

4.2. Анализ экспериментальных кривых титрования

4.3. Построение модели комплексообразования в системе Лиганд-Сбо

4.3.1. Общие требования

4.3.2. Модель комплексообразования с непрерывной агрегацией фуллерена

4.3.3. Модель комплексообразования с дискретной агрегацией

фуллерена

4.3.4. Модель индуцированной лигандом агрегации фуллерена Сбо.............1оо

4.3.5. Анализ результатов вычислений.............................................................Ю4

4.4. Структуры комплексов Лиганд-Сбо...................................................................Ю4

4.5. Энергетика комплексообразования в системе Лиганд-Сбо..............................Ю7

4.6. Биофизический смысл равновесной константы комплексообразования Фуллерен-БАС

4.7. Оценка возможности инжиниринга смеси Фуллерен-БАС

4.8. Заключение

5. КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ОДНОСТЕННЫХ УГЛЕРОДНЫХ

НАНОТРУБОК С АРОМАТИЧЕСКИМИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

5.1. Проблематика комплексообразования малых молекул с углеродными нанотрубками

5.2. Характеризация исследуемых лигандов и одностенных углеродных нанотрубок

5.3. Качественный анализ комплексообразования профлавина с поверхностью одностенных углеродных нанотрубок

5.3.1. Анализ данных спектроскопии в УФ/видимой области

5.3.2. Анализ данных ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье

5.3.3. Анализ данных ЯМР-спектроскопии

5.3.3. Выводы

5.4. Количественный анализ комплексообразования ароматических

лигандов с поверхностью одностенных углеродных нанотрубок

5.4.1. Исследование в УФ/видимой области

5.4.2. Модель комплексообразования в системе Лиганд-

Одностенная углеродная нанотрубка

5.4.3. Расчет параметров связывания комплексов Лиганд-

Одностенная углеродная нанотрубка

5.4.4. Структуры комплексов Лиганд-Одностенная углеродная нанотрубка

5.4.5. Энергетика комплексообразования в системах Лиганд-Одностенная углеродная нанотрубка

5.5. Заключение

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексообразование фуллерена С60 и одностенных углеродных нанотрубок с ароматическими биологически активными соединениями»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Работа посвящена изучению механизмов нековалентного комплексообразования наночастиц углерода (немодифициро-ванного фуллерена Сбо и одностенных углеродных нанотрубок) с различными ароматическими биологически активными соединениями (БАС) ДНК-направленного действия - антибиотиками и мутагенами - в водном растворе.

Ароматические биологически активные соединения составляют важную группу химиотерапевтических препаратов, обладающих широким спектром медико-биологического действия и активно применяющихся в клинической практике в настоящее время. В качестве примера можно привести типичные ароматические БАС - противоопухолевый антибиотик доксорубицин, мутаген профлавин, краситель метиленовый голубой, использующийся в фотодинамической терапии, и др. Механизм биологического действия ряда ароматических БАС обусловлен интерка-ляцией в ядерную ДНК с последующим блокированием жизненно важных процессов - репликации и транскрипции ДНК в клетке. С физико-химической точки зрения интеркаляция является следствием наличия в структуре ароматических БАС плоского гетероциклического хромофора, способного формировать прочные неко-валентные стэкинг-комплексы с парами оснований нуклеиновых кислот. С другой стороны, этот же механизм, отчасти, является и причиной высокой побочной токсичности ароматических БАС, затрудняющей их применение на практике.

Одним из эффективных способов понижения токсичности и повышения медико-биологической активности ароматических БАС является создание молекулярных систем, способных образовывать нековалентные комплексы с лекарственными препаратами и выступать, тем самым, в качестве «модуляторов» их медико-биологического отклика непосредственно на уровне ДНК. Типичным примером таких систем является класс ароматических молекул-интерцепторов (метилксантины, некоторые витамины, хлорофиллин и др), введение в биологическую жидкость которых приводит к образованию нековалентных гетерокомплексов по типу п-стекинга с ароматическими препаратами. Молекулярный механизм модуляции интерцепто-рами биологического отклика препарата в этом случае может проявляться двояко и разнонаправленно: (1) увеличение времени жизни препарата в гетерокомплексе

и, как следствие, увеличение концентрации препарата в окрестности ДНК за счет предотвращения потери на связывание с белками крови и/или его метаболической деактивации, и (2) блокирование интерцептором молекул препарата (либо мест посадки на ДНК) и, как следствие, снижение концентрации комплексов препарат-ДНК. Считается, что фармакологический синергизм в паре препарат-интерцептор может быть напрямую связан с физико-химическими особенностями формирования гетерокомплексов в двух- (препарат-интерцептор) и трехкомпонентных смесях (препарат-интерцептор-ДНК).

За последние 10 лет в научной литературе появился ряд биологических данных, указывающих на то, что наночастицы углерода - углеродные нанотрубки и фуллерены - могут действовать in vivo и in vitro как молекулы-интерцепторы. Эти соединения обладают поверхностью с насыщенной п-электронной системой, потенциально допускающей эффективный п-стекинг с ароматическими БАС по аналогии с интеркаляцией в ядерную ДНК. Кроме этого, наночастицы углерода обладают выраженными гидрофобными свойствами, что делает их интересным объектом для выявления роли гидрофобного фактора в стабилизации комплексов БАС в водной среде. В связи с этим, изучение механизмов и определение физико-химических параметров комплексообразования наночастиц углерода с различными биологически активными соединениями является актуальным и критически важным для инжиниринга новых типов молекулярных систем на основе водных растворов фул-леренов и нанотрубок.

Степень разработанности темы исследования. Поведение фуллеренов в водном растворе сравнительно малоизучено, однако многие его полезные свойствами находят свое применение в практической биофизике, физической химии, медицине и других областях. В начале 2000-х появился общедоступный способ приготовления стабильного коллоидного водного раствора немодифицированного фуллерена Сбо и свидетельства об отсутствии выраженной его токсичности для биосистем различного уровня организации. Однако на данный момент детального понимания структурной, энергетической и термодинамической специфики комплек-сообразования фуллерена и ОУНТ с различными по структуре и размерам БАС нет.

Цель и задачи. Целью работы является определение структурно-термодина-

мических характеристик комплексообразования наночастиц углерода (немодифи-цированного фуллерена Сбо и одностенных углеродных нанотрубок - ОУНТ) с различными ароматическими соединениями ДНК-направленного действия - антибиотиками и мутагенами - в водном растворе, а также оценка возможности корреляции параметров комплексообразования с относительным изменением биологического эффекта in vitro в системах фуллерен-БАС.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. определение термодинамических параметров агрегации молекул фуллерена Сбо в водном растворе и природы физических сил, вовлеченных в этот процесс;

2. определение структурных и термодинамических параметров комплексообразо-вания молекул фуллерена Сбо и БАС в водном растворе и роли различных физических факторов, вовлеченных в этот процесс;

3. определение структурных и термодинамических параметров комплексообразования одностенных углеродных нанотрубок и БАС в водном растворе и роли различных физических факторов, вовлеченных в этот процесс;

4. оценка роли комплексообразования БАС-Фуллерен при связывании ароматических БАС с биорецептором - ДНК.

Научная новизна. Предложен новый подход для количественного описания процесса агрегации фуллерена Сбо в водной среде с использованием равновесной константы агрегации Kf (т.н. «масштабированная» модель агрегации, рассматривающая данный процесс как равновесное комплексообразование агрегатов фулле-рена и неагрегированных конгломератов мономерных молекул фуллерена), и впервые измерено значение константы Kf в водной среде. Экспериментально показано, что агрегация молекул Сбо в водном растворе является энтропийно обусловленным процессом с практически нулевым изменением энтальпии.

С использованием различных модельных подходов, учитывающих полидисперсный характер распределения агрегатов фуллерена в растворе, а также данных спектрофотометрического титрования для различных ароматических соединений, впервые получены значения равновесной константы комплексообразования Фул-лерен-БАС и ОУНТ-БАС. Выявлена не сильно выраженная специфичность связывания БАС как с фуллереном Сбо, так и c ОУНТ, обусловленная структурными особенностями БАС. Установлено, что стабилизация комплексов БАС-Фуллерен и

БАС-ОУНТ в водном растворе в основном определяется ван-дер-ваальсовыми и гидрофобными взаимодействиями при относительно малом электростатическом вкладе. Получены предварительные данные, указывающие на существование эффекта индуцированной лигандом дополнительной агрегации фуллерена, являющегося следствием адсорбции молекул БАС в агрегаты фуллерена, а также корреляции параметров комплексообразования фуллерен-БАС с биологическим эффектом смеси in vitro.

Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенная «масштабированная» модель агрегации фуллерена может быть использована для описания кривых титрования, полученных различными экспериментальными методами, что дает возможность более детального изучения структурно-термодинамических особенностей агрегации фуллерена. Дальнейшая перспектива развития «масштабированной» модели - описание адсорбции БАС в агрегаты фуллерена с учетом их полидисперсного характера. Предложенные подходы для определения параметров связывания ароматических БАС с поверхностью ОУНТ и фуллерена Сбо могут быть использованы для количественной характеристики нековалентного связывания различных групп БАС с наночастицами углерода. Предложен подход к оценке соотношения концентраций фуллерен:БАС для достижения предсказуемого биологического эффекта in vitro как прообраз методики инжиниринга молекулярных систем на основе водных растворов фуллерена.

Методология и методы исследования. В диссертационной работе для исследования водного раствора фуллерена Сбо и одностенных углеродных нанотру-бок использовались методы атомно-силовой микроскопии и изотермического калориметрического титрования. Метод динамического светорассеяния применялся для исследования полидисперсности водного раствора фуллерена Сбо. Спектроскопические методы (ИК-спектроскопия, УФ/видимая-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия) применялись для исследования взаимодействия фуллерена Сбо и ОУНТ с ароматическими БАС. Методы молекулярной механики использовались для расчета пространственных структур комплексов Лиганд-Сбо и Лиганд-ОУНТ. Методы статистической термодинамики использовались для построения моделей агрегации и комплексообразования.

Положения, выносимые на защиту.

1. «Масштабированная» модель агрегации фуллерена Сбо в водном растворе, позволяющая по данным титрования средневзвешенного по интенсивности коэффициента поступательной диффузии, полученного в методе динамического светорассеяния (ДСР), определить величину равновесной константы агрегации Kf.

2. Структурно-термодинамическая характеристика агрегации фуллерена Сбо в водном растворе, включающая описание размерной структуры агрегатов фул-лерена, физическую модель агрегации фуллерена и анализ термодинамической природы движущих сил процесса агрегации.

3. Структурно-термодинамическая характеристика комплексообразования фуллерена Сбо и ОУНТ с различными по структуре ароматическими БАС ДНК-направленного действия:

- модели комплексообразования и полученные на их основании значения равновесных констант комплексообразования K в водном растворе;

- структурная характеристика комплексов БАС-Фуллерен/ОУНТ;

- оценка вклада различных физических факторов в экспериментальное значение изменения полной энергии Гиббса реакции комплексообразования БАС-Фуллерен/ОУНТ.

4. Обоснование гипотезы существования корреляции структурно-термодинамических параметров комплексообразования и относительного изменения биологического эффекта in vitro в системе фуллерен-БАС, а также роли интерцептор-ного механизма действия фуллерена при связывании ароматических БАС с ДНК.

Личный вклад автора. Автором лично проводились все представленные в работе спектрофотометрические эксперименты, регистрация ИК и ЯМР спектров, расчеты термодинамических параметров комплексообразования, моделирование молекулярной динамики, квантово-химические и полуэмпирические расчеты структур комплексов, расчеты составляющих изменения полной энергии Гиббса, анализ литературных данных. Постановка задач и планирование экспериментов, интерпретация результатов экспериментов, написание научных статей, построение моделей комплексообразования осуществлялись диссертантом совместно с научным руководителем.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается их согласованностью, использованием современных экспериментальных методов исследования, анализом и статистической обработкой полученных результатов, и сравнением полученных данных с имеющимися на данный момент литературными источниками.

Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на 10 международных и 1 всероссийской научных конференциях: XII Харьковская конференция молодых ученых по радиофизике, электронике, фотонике и биофизике (Харьков, 2012 г.); 13я Международная конференция «Нанобиофизика: фундаментальные и прикладные аспекты» (Харьков, 2013 г.); Международная научно-техническая конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2013 г.); 2я Украино-французская школа-семинар «Углеродные наноматериалы: структура и свойства» (Береговое, 2013 г.); 5й Международный симпозиум «Методы и приложения вычислительной химии (МАСС-5)» (Харьков, 2013 г.); Международная научная конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. (БФФХ)» (Севастополь, 2013, 2015, 2019 (2 доклада), 2020 г.); V Съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015 г.); XXI Международная конференция по химической термодинамике в России (RCCT-2017) (Новосибирск, 2017 г.).

По материалам диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 6 - в специализированных научных журналах, индексированных в Scopus и Web of Science, 1 - в научном журнале, индексированном в РИНЦ, 1 - в сборнике научных статей.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературных данных, изложение и обсуждение результатов, заключения и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах, включает 9 таблиц и 43 рисунка. Список литературы включает 276 источников.

1. БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УГЛЕРОДНЫХ НАНОСТРУКТУР

1.1. Биологическая активность фуллеренов и углеродных нанотрубок

1.1.1. Виды углеродных наноструктур и их применение

В настоящее время известно множество различных структурных форм углерода, среди которых значительное место в плане практического применения занимают углеродные наноструктуры, в частности, фуллерен, нанотрубка и графен [1].

Графен представляет собой слой атомов углерода, соединенных в гексагональную сетку толщиной в один атом [2]. Его можно представить также как отдельную плоскость графита. Графен обладает высокой прочностью и хорошей проводимостью [3].

Чистый графен (см. рисунок 1.1а) проявляет цитотоксичные эффекты, связанные с сильными гидрофобными взаимодействиями, следствием которых является аккумуляция графена на клеточных мембранах и блокирование им мембранных пор.

Рисунок 1.1 - Структура графена (а) и углеродной нанотрубки (б)

Углеродная нанотрубка (УНТ, рисунок 1.1б) представляет собой цилиндрически свернутый графен [4]. В зависимости от количества свернутых графеновых

слоев УНТ делятся на одностенные и многостенные (МУНТ). МУНТ - это совокупность коаксиально вложенных одна в другую цилиндрических ОУНТ. Обычно внутренний диаметр ОУНТ составляет от 0,4 до нескольких нм. Длина УНТ варьируется в диапазоне от сотен нм до нескольких десятков мкм.

Фуллеренами называют замкнутые молекулы типа Сбо, С70, С76, С84 и др., в которых все атомы углерода находятся на сферической или сфероидальной поверхности (см. рисунок 1.2) [5]. В этих молекулах атомы углерода расположены в вершинах правильных шестиугольников или пятиугольников, которые покрывают поверхность сферы или сфероида.

а б в

Рисунок 1.2 - Структура фуллеренов С50 (а), Сбо (б) и С70 (в)

Среди возможных типов фуллеренов наибольший интерес для экспериментальных биологических исследований имеет молекула Сбо.

Фуллерен Сбо - это молекула почти сферической формы (диаметр 0,72 нм), поверхность которой состоит из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников, в узлах которых содержится 60 атомов углерода, соединенных между собой одинарными и двойными химическими связями (см. рисунок 1.2б) [6]. Молекула Сбо характеризуется высокой химической стабильностью и уникальными фотофизическими свойствами [7, 8].

В настоящей работе будут рассматриваться фуллерены Сбо и ОУНТ, в связи с чем остановимся на описании их медико-биологических свойств более подробно.

1.1.2. Биологическая активность фуллеренов

Фуллерены Сбо проявляют множественные биологические эффекты как на клеточном, так и на организменном уровнях. Молекула Сбо благодаря своей гидро-фобности и высокой липофильности способна легко проникать в мембрану клетки. В частности, именно поэтому в настоящее время работы многих ученых направлены на то, чтобы использовать молекулу фуллерена в качестве вектора доставки лекарств.

Фуллерены Сбо, благодаря восстановительной способности, действуют в биологических системах как ловушки свободных радикалов, в том числе и активных форм кислорода [9, 10], гиперпродукция которых приводит к возникновению многих заболеваний. При этом установлено, что немодифицированные фуллерены Сбо при низких концентрациях (близких к физиологическим) не проявляют токсического действия в системах in vitro и in vivo [11, 12]. Эти свойства открывают перспективу медико-биологического применения фуллеренов.

Один из возможных способов использования фуллеренов Сбо в терапии злокачественных образований основывается на их модификации путем присоединения биологически активных лигандов, имеющих противоопухолевую активность. Например, фуллерены Сбо могут служить вектором доставки оксида азота (NO) к клеткам-мишеням [13]. Обнаружено хемосенсибилизирующее влияние фуллеренов Сбо как доноров NO в терапии рака, что позволяет достичь практически 100%-го выживания экспериментальных животных [14, 15]. Аминокислотные производные фуллеренов Сбо в комбинации с противоопухолевым антибиотиком адриамицином проникают через липидный бислой биологической мембраны и являются эффективными ингибиторами пероксидного окисления липидов [16]. Фуллерены Сбо и их производные также могут блокировать образование новых микрососудов в опухоли, предотвращая ее дальнейший рост и развитие [17].

В целом, на сегодняшний день можно считать общепризнанным, что фулле-рены С60 и их производные являются высокоэффективными противоопухолевыми

агентами, которые способны блокировать рост злокачественных опухолей, в комбинации с традиционными цитостатиками предотвращать их токсическое действие на организменном уровне, усиливать генерирование активных форм кислорода в клетках опухолей, что приводит к их необратимым повреждениям [18, 19].

Важнейшей физико-химической особенностью фуллеренов является их способность к агрегации в растворе и связыванию с биологически активными веществами, что будет подробно обсуждено ниже. Как агрегация, так и комплексообра-зование оказывают существенное влияние на их биологическую активность. В частности, проникновение фуллерена внутрь мембраны зависит от размера агрегатов. Если агрегаты содержат 16 и более молекул, то они не способны пассивно проникнуть внутрь мембраны. Только агрегаты, состоящие из 10 и менее молекул, поступают внутрь липидного слоя. Их проникновение осуществляется через образующиеся поры. Сначала через пору проходит первый фуллерен из кластера. После этого остальные наночастицы проникают внутрь мембраны приблизительно за несколько микросекунд. Доказано, что в результате повышения концентрации фул-лерена увеличивается площадь липидных головок и толщина мембраны. После прохождения через мембрану, молекулы фуллерена локализуется в митохондриях клеток. Такие выводы были сделаны в результате исследований с использованием моноклональных антител и флуоресцентной микроскопии [20].

1.1.3. Биологическая активность углеродных нанотрубок

В настоящее время большое внимание исследователей привлекает взаимодействие УНТ с малыми молекулами [20] и биополимерами, такими как нуклеиновые кислоты [21, 22].

Нековалентное комплексообразование ароматических противоопухолевых антибиотиков с УНТ может выступать в качестве регулятора их биологического действия [23, 24] примерно таким же образом, как и хорошо изученное на данный момент связывание ароматических лигандов с ДНК [25]. В частности, адсорбция лекарственного препарата на поверхности УНТ приводит к снижению его активной

концентрации в растворе, тем самым ограничивая его связывание с биорецептором [23, 24]. Комплексообразование Лиганд-УНТ рассматривается в качестве способа перевода УНТ в жидкое состояние [26-28], а также может выступать в качестве средства доставки адсорбированных на поверхности препаратов к биологическим рецепторам [29-32]. Как следствие, были проведены исследования комплексообра-зования УНТ с антибиотиками [33-35], красителями [36-42] и другими типами ли-гандов [43-45] с целью определения параметров связывания в растворе.

ОУНТ используются в качестве биосенсоров для выявления наличия или определения концентрации биомолекул в растворе [46, 47].

Взаимодействие ОУНТ с белками описывается двумя моделями [48]: молекулы белка могут либо проникать внутрь нанотрубки, либо закрепляться на ее поверхности, при этом происходят конформационные изменения белка [49].

Односпиральная ДНК легко связывается с УНТ с образованием стабильного водного раствора ОУНТ/ДНК [50]. Существует несколько моделей механизма взаимодействия ДНК с ОУНТ и в зависимости от последовательности, структуры ДНК и от размера (диаметра) ОУНТ, однако выделяют основные две из них: 1) оборачивание молекулой ДНК поверхности нанотрубки (см. рисунок 1.3) [49-51]; 2) инкапсуляция ДНК в нанотрубку [52].

Рисунок 1.3 - Оборачивание молекулой ДНК поверхности нанотрубки [50]

Известно применение функционализированных МУНТ в качестве наноэлек-тродов для детектирования молекул ДНК в растворе [53]. Удалось достичь высокой чувствительности детектирования ДНК до нескольких молекул в растворе.

1.2. Ароматические биологически активные соединения

Ароматические биологически активные соединения представляют собой очень распространенный класс фармацевтических препаратов, обладающих полезными медико-биологическими свойствами. К данному классу соединений относятся антибиотики антрациклиновой группы (дауномицин, доксорубицин, ногала-мицин, митоксантрон и др.), феноксазоновые антибиотики (актиномицин Б и его производные), метилксантины (кофеин, теофиллин и др.) и ряд других ароматических препаратов [54, 55].

Рассмотрим медико-биологические свойства некоторых типичных ароматических БАС, которые далее будут исследованы в настоящей работе (см. рисунок 1.4): антибиотик БОХ, мутагены ЕВ и РБ, тиазиновый краситель МВ.

О ОН

ОН

сн2—ОН

10

ОМе О ОН

Ме,

НО

3О

+ 2' №

а)

\ / \ J

4 Вг -

СН2СН3

б)

ОД

N Н

в)

^2

Ж

г)

Рисунок 1.4 - Структурные формулы молекул доксорубицина (а), бромистого эти-дия (б), профлавина (в) и метиленового голубого (г)

9

1

2

8

9

1

7

2

8

1

7

2

5

4

Широкое распространение в стандартных режимах химиотерапии раковых заболеваний получили антибиотики антрациклинового семейства. Вещества этого класса непосредственно воздействуют на ядро клетки путем интеркаляции в ДНК и вызывают сестринский хроматидный обмен и хромосомные аберрации [56, 57]. Считается, что взаимодействие с ДНК является основной причиной антиканцерогенной активности, проявляемой этими антибиотиками, что обусловило широкое использование их для химиотерапии многих видов раковых заболеваний [54-58]. Доксорубицин (рисунок 1.4а) [54, 55], обладает наилучшим среди антрациклинов химиотерапевтическим индексом [59].

Структуру DOX (см. рисунок 1.4а) образуют три основные функциональные группы: (1) хромофор - плоская ароматическая антрахиноновая кольцевая система (кольца B-D), непосредственно интеркалирующая в ДНК; (2) положительно заряженный аминосахар, или даунозамин, который при интеркаляции укладывается в малую канавку ДНК [60]; (3) заместители на кольце А, выступающие в роли доноров и акцепторов водородных связей с ДНК, стабилизирующих комплексы [61, 62]. Незначительные модификации структуры антибиотика приводят к существенным изменениям в спектре терапевтического действия [63].

Бромистый этидий (рисунок 1.4б) - ДНК-интеркалирующий агент, обычно используемый в молекулярной биологии в качестве флуоресцентного маркера для нуклеиновых кислот. ЕВ также обладает выраженным противоопухолевым и противовирусным действием [64, 65], однако одновременно может проявлять мутагенные и канцерогенные свойства. Считается, что мутагенная активность EB обусловлена его высоким сродством к ДНК. Встраиваясь в двойную спираль, этот краситель искажает структуру ДНК [66-69], что нарушает процессы репликации и транскрипции. Применение EB в качестве противоопухолевого агента обусловлено его токсичностью к митохондриям [65, 70]. Недавние исследования показали, что ЕВ также ингибирует топоизомеразу I [71].

Структурную основу молекулы EB образует плоский ароматический хромофор с присоединёнными фенильной и этильной группами (см. рисунок 1.4б). Фе-нильная группа располагается почти перпендикулярно плоскости хромофора. На

атоме азота хромофора красителя при физиологических условиях делокализован единичный положительный заряд [72].

Профлавин (рисунок 1.4в) -3,6-диаминоакридин - применяется в качестве дезинфицирующего средства, обладает бактериостатическим эффектом против многих грам-положительных бактерий. В настоящее время используется в роли антисептика в форме солей: дигидрохлорида и хемисульфата [73]. РБ обладает выраженным мутагенным действием, интеркалируя между парами оснований ДНК [64, 74, 75]. Этот препарат отличается от большинства других мутагенных компонентов тем, что вызывает мутации типа «сдвиг рамки» [76].

PF (см. рисунок 1.4в) в структуре своего хромофора не содержит разветвлённых боковых цепей, положительный заряд локализован на атоме азота в структуре хромофора при нейтральных рН. В положениях 3 и 6 находятся аминогруппы, которые могут участвовать в водородном связывании с биорецептором [77].

Метиленовый голубой (рисунок 1.4г) относится к группе тиазиновых красителей, обладающих наибольшей антималярийной активностью по сравнению с другими типами препаратов, и является наиболее важным представителем группы ти-азинов [78, 79]. МВ получил широкое применение в биомедицине. Фармакологическое значение МВ заключается в фотосенсибилизирующем и противомалярийном действии [78, 80-82].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Воронин Дмитрий Петрович, 2021 год

Источн

света /

сравнения

Рисунок 2.5 - Блок-схема двулучевого спектрофотометра Основной количественной характеристикой, получаемой спектрофотометри-ческим методом, является зависимость интенсивности поглощения света от длины волны. Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэффициент поглощения е (коэффициент экстинкции), определяемый согласно закону Бугера-Ламберта-Бера как в = Л/с1, где Л = - ^ Т = - ^ 1/10, Т - пропускание, 10 и I - интенсивности соответственно пада-

ющего и прошедшего через вещество излучения, c - молярная концентрация вещества, поглощающего излучение, l - толщина поглощающего слоя (кюветы). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количественного анализа спектров поглощения.

В настоящей работе спектры поглощения были измерены с помощью двулу-чевого спектрофотометра SQ-4082 (UNICO, США) в полиметилакрилатных кюветах, имеющих длину оптического пути 1 см (Испания), что дало возможность проводить измерения в области длин волн 280-800 нм. Температура поддерживалась постоянной и равной 300 К (для комплексов с фуллереном Сбо) и 298 К (для комплексов с ОУНТ).

Водный раствор фуллерена и суспензия ОУНТ при миллимолярных концентрациях дают широкий спектр, охватывающий УФ и видимую области в результате рассеяния света [176]. Для того, чтобы исключить фоновое рассеяние, все эксперименты проводились путем регистрации спектров смеси лиганда и фуллерена Сбо или лиганда и ОУНТ относительно раствора чистого фуллерена или суспензии чистых ОУНТ с аналогичной концентрацией в кювете сравнения.

Измерения комплексов лигандов с фуллереном Сбо проводились в соответствии со следующим протоколом: четыре кюветы были заполнены водным раствором фуллерена (0,5 мл, 0,07 мгмл-1). После этого в одну из кювет добавляли 0,5 мл бидистиллированной воды, а в другие три кюветы - по 0,5 мл раствора каждого из исследуемых лигандов. Следовательно, исходная концентрация фуллерена в каждой паре кювет, одна из которых всегда была эталонной, а вторая - с исследуемым раствором, составляла 0,035 мгмл-1. Спектры регистрировались в области 300-750 нм с шагом 0,5 нм. Титрование проводили путем отбора определенных объемов раствора из каждой кюветы и последующего добавления такого же количества би-дистиллированной воды в кювету сравнения и раствора лиганда в рабочую кювету.

Измерения смеси лигандов и ОУНТ проводились согласно следующей методике: пять кювет были заполнены ОУНТ (0,5 мл, 5 мкг/мл). После этого в одну из кювет добавляли 0,5 мл бидистиллированной воды, а в другие четыре кюветы - по 0,5 мл раствора каждого из исследуемых лигандов. Полученные растворы были

тщательно перемешаны. Следовательно, исходная концентрация ОУНТ в каждой паре кювет, одна из которых всегда была эталонной, а вторая - с исследуемым раствором, составляла 2,5 мг/мл. Спектры регистрировались в области 300-750 нм с шагом 0,5 нм. Титрование проводили путем отбора определенных объемов суспензии из каждой кюветы и последующего добавления такого же количества биди-стиллированной воды в кювету сравнения и раствора лиганда в рабочую кювету.

В обоих случаях объем раствора в каждой кювете оставался постоянным (1 мл), и концентрация лиганда также не изменялась. Кювета сравнения была заполнена либо бидистиллированной водой (1 мл), либо водным раствором фулле-рена/суспензией ОУНТ (1 мл) с определенной концентрацией. Зависимость оптической плотности от концентрации фуллерена Сбо / ОУНТ при фиксированной концентрации лиганда измерялась при длине волны, соответствующей максимуму поглощения лиганда в видимой области спектра.

Во время проведения эксперимента не наблюдалось никаких изменений спектра лиганда в смеси с ОУНТ. Это косвенно указывает на то, что исследуемая система находится в равновесии. Осаждение ОУНТ в ходе эксперимента не наблюдалось.

2.2.5. ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье

Фурье-спектрометр является интерферометром Майкельсона с ИК источником. Оптическая схема спектрометра приведена на рисунке 2.6. Контролируемое смещение подвижного зеркала дает интерферограмму на детекторе. Выходной сигнал детектора подвергается преобразованию Фурье и конвертируется (через функцию автокорреляции) в спектр измерения [177].

ИК спектры характеризуют поглощение света при прохождении через слой вещества. Изменяя несколько элементов спектрофотометра, можно исследовать как поглощение, так и отражение света образцом.

Рисунок 2.6 - Общая схема Фурье-спектрометра

В настоящей работе для получения ИК спектров в режиме отражения в диапазоне 400-4000 см-1 использовался спектрометр IFS-66 (Bruker, Германия) с соответствующей приставкой (угол падающего пучка 16,5о). Оценка и обработка спектров были выполнены с помощью программного обеспечения Opus (версия 5.5). Точность определения волновых чисел и коэффициента пропускания составила 0,01 см-1 и 0,1 % соответственно.

2.2.6. Метод динамического светорассеяния

Метод динамического светорассеяния используется для определения индекса полидисперсности, размеров и форм агрегатов в растворе вплоть до 1 нм, коэффициента диффузии и др. [178]. Типичными объектами исследования в данном методе являются мицеллы, полимеры, белки и наночастицы. Принцип заключается в том, что образец облучается лазерным лучом, а флуктуации рассеянного света обнаруживаются при известном угле рассеяния 0 быстрым детектором фотонов.

Размер частиц может быть определен путем измерения случайных следов интенсивности света, рассеянного от суспензии или раствора. Динамическая информация о частицах получается из автокорреляции следов световой интенсивности. Кривая автокорреляции второго порядка генерируется следующим образом:

g

2(„_\ < I ^V ^ + т) >

< I ($) >2

где g2(q; т) - автокорреляционная функция частного волнового вектора д, т - время задержки, I - интенсивность. Волновой вектор д вычисляется как

4пп0 . в

д =-- sш—

Л 2'

Автокорреляционная функция первого порядка g1(д; т) получается из уравнения Зигерта:

g2(д; т) = 1 + в ^2(д; т)]2 ,

где в - корреляционный фактор, который зависит от геометрии и регулировки лазерного луча.

Для полидисперсных растворов автокорреляционная функция имеет вид:

^(д; т) = С (Г)е-/МГ,

где Г - спектральная полуширина монохроматического света, являющаяся обратной величиной времени релаксации флуктуаций.

Коэффициент диффузии В определяется из соотношения:

Г = Вд2.

Связь коэффициента диффузии В с гидродинамическим радиусом частиц Ян выражается через уравнение Стокса-Эйнштейна:

D = kBT

6nr/Rh

где кв - постоянная Больцмана; Т - температура; п - коэффициент вязкости.

В настоящей работе с помощью метода ДСР измерение распределения агрегатов фуллерена по размерам проводилось при фиксированной (25 оС), либо варьируемой (15-60 оС) температуре на приборе ДСР DAWN HELEOS™ 243-HHC (Wyatt Technology Corp.), оснащенном Ga-As-лазером (60 мВт), работающем на длине волны 658,0 нм. Измерения проводились под углом рассеяния 99о. Автокорреляционная функция интенсивности рассеянного света исследовалась с помощью регуляризационного анализа DYNALS, входящего в состав программного обеспечения Wyatt ASTRA. Измерения проводились трижды при каждой температуре, результаты усреднялись.

2.2.7. ЯМР-спектроскопия

Теория метода ЯМР-спектроскопии подробно изложена в ряде монографий и обзорных статей [179-186]. Физические основы спектроскопии ядерного магнитного резонанса определяются магнитными свойствами атомных ядер. Ядра, обладающие собственным механическим моментом, или спином, имеют связанный с ними ядерный магнитный момент. Условие резонанса для любых экспериментов ЯМР имеет вид: V = у Во / 2п, где у - гиромагнитное отношение для данного типа ядер; Во - вектор индукции приложенного магнитного поля.

Магнитные моменты ядер вращаются вокруг оси, совпадающей с направлением вектора Во с ларморовой частотой вращения, являющейся частотой ЯМР поглощения со = 2п V. Вращение может быть по часовой стрелке или против часовой стрелки в зависимости от знака у, но оно одинаково для любых ядер данного вида.

Из условия резонанса следует, что для получения ЯМР-спектра поглощения образца можно варьировать либо величину поля, либо частоту ввиду прямой пропорциональности между V и Во.

На практике наиболее широкое применение получили методики импульсной ЯМР-спектроскопии, в которых на исследуемый образец, находящийся в стационарном магнитном поле Во, подаются радиочастотные импульсы определенных длительностей и последовательностей.

Одним из основных параметров ЯМР-спектра является интенсивность сигнала ЯМР, определяемая как площадь под резонансной кривой и содержащая информацию об относительном числе эквивалентных ядер в группе, дающей рассматриваемый сигнал. Важнейшей характеристикой является также химический сдвиг 8 - разность констант экранирования о для данного типа ядер в исследуемом и стандартном веществах (см. рисунок 2.7). Измеряется химический сдвиг в безразмерных единицах - миллионных долях (млн-1 или ppm) от рабочей частоты спектрометра:

6 )

8 = ^= 10

V

обр

где о и Ообр - константы экранирования, а V и Уобр - резонансные частоты исследуемого вещества и вещества, используемого в качестве стандарта, соответственно.

Рисунок 2.7 - Основные характеристики ЯМР спектра

Метод ЯМР является чувствительным к образованию молекулярных комплексов, что проявляется в экранировании/деэкранировании магнитных ядер. Эффект экранирования обусловлен тем, что эффективное магнитное поле В, действующее на ядро, отличается от Во (внешнего магнитного поля, приложенного к образцу) вследствие появления локального магнитного поля В', обусловленного влиянием электронных оболочек молекулы и химического окружения данного ядра (нелокальное экранирование): В = Во-В' = Во(1-а). При этом уменьшается расстояние между уровнями ядерной магнитной энергии или, другими словами, приводит к сближению зеемановских уровней. Энергия квантов, вызывающая переходы между уровнями, становится меньше и, следовательно, резонанс наступает при меньших частотах.

Важным случаем, имеющим отношение к настоящей работе, являются ароматические соединения, в которых наиболее ярко проявляется нелокальное экранирование ядер. Ароматические соединения представляют собой плоские кольца, образованные сопряженными двойными С=С связями с делокализованными п-электронами. Если поместить такую молекулу во внешнее магнитное поле, то возникает диамагнитный кольцевой ток в плоскости ароматического кольца. Вторичное поле, создаваемое этим током, можно аппроксимировать полем диполя, направленного противоположно Во и расположенного в центре кольца перпендикулярно его плоскости (см. рисунок 2.8).

4

Рисунок 2.8 - Схематическое представление структуры магнитного поля, индуцированного диамагнитным кольцевым током в плоскости бензольного кольца

Описанный эффект сильно анизотропен. В результате протоны, лежащие в плоскости молекулы, но вне кольца, деэкранируются, и, наоборот, протоны в области выше и ниже плоскости кольца экранируются. Квантово-механические расчеты экранирующего действия оснований нуклеиновых кислот показывают, что их кольцевые токи дают основной вклад (~70 %) в экранирование ядер соседних молекул [187, 188].

В настоящей работе 1Н ЯМР спектр комплекса PF-ОУНТ был получен на ЯМР спектрометре Avance (Bruker, Германия). Химические сдвиги необменных протонов были измерены относительно внутреннего стандарта, бромида тетраме-тиламмония (ТМА) и пересчитаны по 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоната натрия (ДСС): ¿дсс = ¿тмл + 3,178 млн-1. Измерения проводились с помощью стандартных 5-мм ЯМР пробирок, содержащих раствор объемом не менее 0,5 мл при Т = 298 К. Все измерения ЯМР проводились в условиях быстрого обмена для взаимодействующих молекул в масштабе времени ЯМР. Соотнесение протонов PF проводилось в соответствии с ранее опубликованными данными [189].

3. ТЕРМОДИНАМИКА АГРЕГАЦИИ ФУЛЛЕРЕНА Сбо В ВОДНОМ

РАСТВОРЕ

3.1. Современный уровень знания о термодинамике агрегации Сбо

в водных растворах

Как отмечалось в разделе 1, одним из наиболее известных физико-химических свойств фуллеренов является их выраженная тенденция к агрегации, приводящая к образованию сферических кластеров различного диаметра в диапазоне 10-100 нм [113]. В настоящее время эффект агрегации интенсивно изучается с точки зрения кинетики и равновесного распределения кластеров фуллерена [113, 114, 190]. Недавно было обнаружено, что токсичность фуллерена in vitro связана с его способностью к агрегации [132], и специфически агрегированные формы фуллерена могут эффективно связываться с биополимерами [133]. Однако на сегодняшний день равновесные параметры агрегации, такие как равновесная константа, изменение свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии остаются неизвестными. Возможно, это связано с неполным пониманием микроскопической картины образования кластеров фуллерена в растворе, и, как следствие, со сложностями в построении теоретической модели агрегации фуллерена. В работах [125, 126, 135] величина изменения свободной энергии Гиббса при агрегации и величины ее компонент оценивались исключительно с помощью методов молекулярного моделирования. Помимо исследования физико-химических свойств, знание параметров агрегации молекул фуллерена также важно при рассмотрении биомедицинского приложения водных растворов Сбо, и ответа на вопрос: какая форма фуллерена обладает биологической активностью - одиночные молекулы или их кластеры [191]?

Целью данного раздела является определение термодинамических параметров агрегации молекул фуллерена Сб0 в водном растворе и природы физических сил, вовлеченных в этот процесс.

3.2. Агрегация фуллерена Сбо в водном растворе

3.2.1. Анализ данных атомно-силовой микроскопии и сканирующей туннельной

микроскопии

На АСМ изображении (рисунок 3.1а) четко видны случайным образом расположенные отдельные молекулы Сбо и их кластеры размером 1,5-10 нм. Аналогичные результаты были получены и в СТМ исследованиях (см. рисунок 3.1б), что хорошо согласуется с теоретическими расчетами и измерениями малоуглового рассеяния нейтронов [105, 110, 192]. Важно отметить, что на всех полученных нами изображениях зондовой микроскопии также наблюдается присутствие небольшого количества отдельных агрегатов Сбо размером 10-100 нм. Полученные результаты свидетельствуют о полидисперсности водного раствора фуллерена Сбо, исследуемого в данной работе.

Рисунок 3.1 - АСМ изображение (полуконтактный режим) фуллеренов Сбо на поверхности слюды (а) и СТМ изображение фуллеренов Сбо на поверхности Au(111), осажденных из водного раствора фуллерена Сбо с начальной концентрацией 0,1 мгмл-1 (б)

3.2.2. Анализ данных титрования в УФ/видимом диапазоне

На рисунке 3.2 представлены спектры титрования (разбавления) водного раствора фуллерена Сбо. Особенностью этих спектров является монотонное смещение базовой линии спектра во всем исследованном спектральном диапазоне при изменении концентрации. Это свидетельствует о значительном вкладе светорассеяния в измеренную оптическую плотность, что характерно для большинства растворов наночастиц углерода [100]. Отделение вклада светорассеяния от процессов агрегации является проблематичным в рамках использованного оборудования, и в настоящей работе не рассматривалось. Таким образом, метод УФ/видимой спектрофото-метрии не может быть использован для определения термодинамических параметров агрегации фуллерена Сбо.

1.8 1.6 * 1-4

н о

§ 1.2 о

5 10

и

S

§ 0.8

о о

в 0.6

н В

О 0.4 0.2

0.0--Т-—-—-Т-—----1-1-

400 500 600 700

Длина волны, нм

Рисунок 3.2 - Электронные спектры поглощения водного раствора фуллерена при

различных концентрациях

3.2.3. Анализ данных динамического светорассеяния

Для оценки величины равновесной константы агрегации фуллерена Сбо производилось стандартное титрование водного раствора фуллерена Сбо и измерение интенсивности светорассеяния с помощью метода ДСР на каждой концентрации.

В результате эксперимента ДСР получается типичное распределение интенсивности светорассеяния по гидродинамическим диаметрам светорассеивающих частиц (спектр ДСР) при фиксированной концентрации растворенного вещества (см. рисунок 3.3). Как следует из ДСР спектра, основная часть светорассеивающих частиц имеет диаметры в диапазоне 140-260 нм. Подобное распределение размеров агрегатов фуллерена Сбо соответствует полученному ранее другими авторами [113, 133, 193]. Многочисленные исследования продемонстрировали полидисперсную природу водного раствора фуллерена Сбо, содержащего как мономеры, так и агрегаты с диаметрами в диапазоне от десятков до сотен нм [105, 113, 133, 134], что полностью согласуется также и с АСМ/СТМ исследованиями, описанными выше.

14 -

^ 12 -

'—'

- 10 -

л"

У 8-

К

К 6 -

и

К

£ 4 -

К

к

2 -0 -

0.1 1 10 100 1000 10000

Гидродинамический диаметр кластеров, dz (нм)

Рисунок 3.3 - Экспериментальное распределение интенсивности рассеянного света в зависимости от диаметров светорассеивающих частиц

На рисунке 3.4 приведена экспериментальная зависимость среднего гидродинамического диаметра светорассеивающих частиц (z-average) dz и соответствующего коэффициента поступательной диффузии В (Б к 1^) от концентрации фулле-

рена Сбо Со/г (где г - коэффициент разбавления). Принимая во внимание, что коэффициент поступательной диффузии В в ДСР задается как средневзвешенный физический параметр, дальнейшее обсуждение данных титрования, представленных на рисунке 3.4, будет производиться по параметру В.

280 п

2 Ж

а

и

140 -I-1-1-1-1-1

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

Концентрация С60, С^/г (ммоль/л)

Рисунок 3.4 - Экспериментальная зависимость среднего гидродинамического диаметра светорассеивающих частиц й.2 и коэффициента поступательной диффузии В от концентрации фуллерена Со/г (Со= 0,14 мМ)

Согласно принятой в настоящее время точке зрения на агрегацию малых молекул в разбавленных водных растворах с увеличением концентрации растворенного вещества коэффициент поступательной диффузии должен уменьшаться вследствие увеличения размеров агрегатов [194, 195]. Качественно подобная точка зрения существует также и по отношению к агрегации фуллерена Сбо, что подтверждено теоретическим расчетом зависимости В от концентрации фуллерена в толуоле [134]. Однако экспериментальная зависимость В(Со/г), полученная в данной работе (см. рисунок 3.4) с использованием хорошо апробированного метода подготовки водного раствора фуллерена Сбо и стандартного метода ДСР, демонстрирует обратную тенденцию: увеличение концентрации растворенного вещества приводит

к увеличению значения В. К сожалению, прямое сравнение полученных результатов с существующими литературными данными невозможно, поскольку имеющиеся в настоящее время публикации содержат измерение коэффициента диффузии В фуллерена Сбо в растворе лишь для фиксированного значения концентрации [113, 133, 193]. Тем не менее подтверждением полученных нами результатов является работа [196], в которой аналогичная тенденция для В была зафиксирована в полярном растворителе ацетонитриле. Следовательно, результаты, полученные в настоящей работе, указывают на наличие некоторого не учтенного ранее фактора, который заметно влияет на поведение фуллерена Сбо при титровании.

Анализ литературных данных, связанных с агрегацией малых молекул, указывает на то, что при достижении мицелльных концентраций зависимость экспериментально измеряемого коэффициента поступательной диффузии (например, с помощью ДСР или альтернативного метода) от концентрации может менять характер на противоположный [197, 198]. Этот результат обычно интерпретируется с точки зрения непосредственного взаимодействия мицелл друг с другом в растворе за счет дальнодействующих нековалентных сил [197-199] (например, ван-дер-ва-альсовых сил, интегрируемых по атомам коллоидной частицы, и трансформируемых из типичного потенциала 1/гб в потенциал 1/г2). Примерно аналогичное, но «поверхностное» объяснение аномалии концентрационной зависимости В для Сбо в ацетонитриле было дано и авторами работы [196]. Взаимодействие мицелл действует как добавка к броуновскому движению и, как следствие, приводит к увеличению коэффициента диффузии при повышении концентрации растворенного вещества. Оценка этой добавки выходит за рамки настоящей работы, однако, по-видимому, должна быть выполнена по аналогии с оценкой потенциала интегрального ван-дер-ваальсового взаимодействия наночастиц фуллерена при агрегации, рассчитываемого из теории DLVO [112].

Принимая во внимание полидисперсный характер водного раствора фулле-рена Сбо и существование кластеров фуллерена с диаметром в диапазоне Ю-100 нм, можно утверждать, что обратная зависимость В(Со/г), приведенная на рисунке 3.4, вероятнее всего, обусловлена взаимодействием кластеров (Сбо)« (мицелл) друг с

другом. Будем далее называть этот эффект кинетическим эффектом (interaction effect [197-199]).

Обзор литературы показывает, что для описания кинетического эффекта лучше всего подходит линейная функция (3.1а) [197-199] или реже используемая экспоненциальная функция (3.1б) [200]

где А - параметр, характеризующий взаимодействие кластеров (в случае (3.1а) являющийся вторым вириальным коэффициентом); См - концентрация кластеров; Во - коэффициент поступательной диффузии при бесконечном разбавлении, т.е. когда взаимодействие отсутствует.

Линейная зависимость типа (3.1а) наиболее часто наблюдается в экспериментах с типичными мицеллообразующими растворами и при миллимолярных (иногда выше) концентрациях [198, 201]. Отклонение от линейной зависимости обычно связывают с увеличением размера мицелл. Увеличение размера объясняется связыванием с поверхностью мицеллы мономера или небольшого агрегата исследуемого соединения [198, 201]. Стоит отметить, что концентрационная зависимость В, полученная в данной работе (см. рисунок 3.4), имеет выраженный нелинейный характер. Учитывая миллимолярную концентрацию исходного раствора фуллерена Сбо (~0,1 мМ), разумно предположить, что нелинейность кривой В(Оо/г) обусловлена ростом размеров кластеров Сбо с ростом концентрации, т.е. агрегацией. Если увеличение размера за счет агрегации приводит к уменьшению В, то, следовательно, выпуклая форма кривой В(Оо/г) обусловлена одновременным действием двух противоположных тенденций, а именно, линейное увеличение В, связанное с непосредственным взаимодействием кластеров Сбо (т.е. кинетический эффект, (3.1а)), компенсируется уменьшением В вследствие агрегации.

Наличие агрегации также подтверждается резким увеличением индекса полидисперсности, наблюдаемого при разбавлении (см. рисунок 3.5), что характерно

D = Do (1 + ACM),

(3.1а)

(3.1б)

для агрегирующих систем [202]. Следовательно, при анализе концентрационной зависимости спектра ДСР нужно учитывать два основных фактора: агрегацию и кинетический эффект.

0.34 ±

0.00 0.02 0.04 0.06 0.0В 0.10 0.12 0.14 Концентрация С^, Ср/г (ммаль/л]

Рисунок 3.5 - Экспериментальная зависимость индекса полидисперсности (PDI) от концентрации фуллерена Сбо (Со = 0,14 мМ). Величина PDI рассчитана с помощью программного обеспечения Wyatt ASTRA как нормированная дисперсия скорости затухания автокорреляционной функции интенсивности

Обобщая проведенный выше анализ, можно выделить следующие ключевые моменты:

1. Наличие агрегации молекул фуллерена Сбо, приводящей к росту кластеров, дает физическое основание для определения равновесной константы агрегации Kf. Равновесное состояние исследуемой системы подтверждается неизменностью спектров ДСР, получаемых при заданных концентрациях.

2. Наличие кинетического эффекта полностью изменяет форму концентрационной зависимости коэффициента поступательной диффузии, что ставит под сомнение корректность использования метода ДСР (и, возможно, других методов,

чувствительных к поступательной диффузии) для измерения коэффициента диффузии и диаметров кластеров Сбо при фиксированной концентрации, как это практикуется в некоторых работах различных авторов. Эта проблема будет рассмотрена ниже.

3.2.4. Физическая модель агрегации фуллерена Сбо в растворе

Качественный анализ данных ДСР, описанный выше, предоставляет физическую модель агрегации молекул Сбо в растворе, которая может быть сформулирована следующим образом.

1. Поведение кластеров фуллерена аналогично поведению раствора мицелл с концентрацией См. Это подтверждается экспериментальной зависимостью В(Со/г) (см. рисунок 3.4) и хорошо согласуется с общепринятой точкой зрения, утверждающей, что физико-химические свойства водного раствора фуллерена Сбо схожи с типичными коллоидными растворами [100, 203].

2. Концентрационная зависимость коэффициента поступательной диффузии В и усредненного диаметра кластеров dz определяется двумя факторами: кинетическим эффектом (3.1) и связыванием частиц Сбо с кластерами (т.е. агрегацией). Далее предположим, что комплексообразование самих кластеров друг с другом и соответствующее образование более крупных кластеров не происходит. Косвенным свидетельством этого является преобладание кинетического эффекта в форме кривой титрования, вытекающего из рисунка 3.4. Следовательно, концентрация кластеров линейно связана с коэффициентом разбавления г: См = СМй /г, где СМо - концентрация кластеров в начальной точке разбавления при г = 1 (в настоящей работе в качестве стартовой концентрации использовалось максимальное значение концентрации Со = 0,14 мМ).

3. Пусть кластеры содержат ядро из М молекул Сбо. При повышении концентрации фуллерены Сбо связываются с этим ядром, что приводит к росту кластеров. В первом приближении будем считать, что с ядром связываются только мономеры фуллерена Сбо. Это означает, что в рамках предложенной модели динамическое

равновесие в растворе в основном определяется мономерами фуллерена Сбо с концентрацией С1 и кластерами с концентрацией См. Это позволяет определить Ке как константу микроскопического связывания фуллерена Сбо с кластерами Сбо.

Сформулированные допущения позволяют построить модель агрегации фул-лерена Сбо на основе данных ДСР.

3.2.5. Строгая модель агрегации фуллерена Сбо

В эксперименте ДСР наблюдаемый коэффициент поступательной диффузии определяется как средневзвешенная сумма коэффициентов диффузии агрегатов всех типов, присутствующих в растворе. Учитывая квадратичную зависимость сигнала ДСР от молекулярной массы светорассеивающих частиц и обратно пропорциональную зависимость В от dz, можно записать

ю 1

■2 г 1

УI у.

1 ^ 1 1

1 1=м (л,

1 ю 2 , (3.2)

dz У Ъ

1=м

где . - количество фуллеренов Сбо в агрегате; - мольная доля агрегатов, состоящих из I молекул; - диаметр агрегата, состоящего из . молекул. Будем считать, что кластеры Сбо имеют сферическую форму. Следовательно, объем кластеров можно связать с количеством молекул Сбо в них. Исходя из этого, можно записать выражение, связывающее диаметр и количество молекул ¿, в виде 1. = , где 11 » 0,7 нм - диаметр молекулы Сбо. После введения поправки в (3.2) для учета кинетического эффекта (3.1а), получаем следующее выражение:

=

(л

ъ' л

г=М

С Ю 5/ 1 + А^ ъ I /з лг

(3.3)

г г=м

Далее необходимо вывести уравнение для величины Л. Поверхность кластера, состоящего из г молекул, содержит большое число N возможных сайтов посадки мономеров фуллерена. Следовательно, для получения точного значения микроскопической константы связывания К необходимо учесть распределение связанных молекул Сбо по всем доступным сайтам связывания на кластере. Принимая во внимание, что в рамках представленной физической модели агрегации рост кластеров происходит при увеличении концентрации растворенного вещества, разумно предположить, что каждая связанная молекула С6о увеличивает размер кластера и, как следствие, общее число доступных для связывания сайтов.

В первом приближении за величину N примем число квадратных участков одной молекулы Сбо (т.е. (12), которые могут быть размещены на поверхности кластера диаметром (г

N =

^2

п

V (1)

п • I

■ 213

(3.4)

где квадратные скобки обозначают целую часть числа. Следовательно, общее число возможных вариантов связывания (г - М) молекул с ядром кластера состав-

1 г'-1

ляет ^ П N)■, при этом мольная доля кластеров, содержащих заданное коли-

чество г молекул фуллерена (г > М), имеет вид:

С (к С )-М '-1 г = См 0 _П N

Л г (г - М)! П '

(3.5)

Уравнение (3.5) при подстановке в (3.3) позволяет полностью описать экспериментальную кривую dz(Co/r). Кроме того, с учетом (3.5) можно записать закон сохранения масс:

С с

(3.6)

= с + М^ + X I/.

I = М +1

Окончательные уравнения содержат четыре подгоночных параметра: СМо, А,

Кг, М, и не сворачиваются к удобному аналитическому виду, т.к. суммы в них могут быть раскрыты только численно. Определение микроскопической константы Кг по этой модели оказалось крайне проблематичным, т.к. процедуры суммирования и умножения в (3.3) должны быть произведены для каждой связанной молекулы, т.е. в диапазоне пробега индексов порядка 106. Эту проблему можно решить, если при аналитическом расчете сумм ввести макроскопическую константу связывания Кр , не учитывающую распределение связанных мономеров на поверхности кластера.

Тогда (3.6) можно переписать в более простой форме:

-г Смо (у п у-М

Л =-(КгС1) . (3.7)

Подставим (3.7) в (3.6):

да

I -М

Со = с + См о XI (КС )

I =М

или

Со = С + См о X I (КС )'-М

I =М

Последнее уравнение перепишем с учетом того, что М >> 1:

да да оо

Со = гСх + См о Х( г + М )( КРСХ) = ГС1 + См о ^ г ( КС) + МСм о Х( К,С1)

г=0 г=0 г=о

м -(м -1) КС, ^ МС (1 - КС.)

Со = ГС1 + См о ^ ^ ; / 1 * гС_ + 1-Км^, (3.8)

^^ 1

Уравнение (3.8) выражает закон сохранения масс. Дальнейшее упрощение возможно при условии, что индекс г не достигает значений, близких к М. С учетом этого можно найти точную концентрацию мономера фуллерена:

Г + КРСо Г - К^Со )2 + 4гКРЖио

С = 2КР • <39)

Уравнение (3.3) с учетом (3.7) имеет вид:

X г2Л ^ Х(<+м)2 (ад)г

( ^ ы

"1 г=М ' "1 г=о

1 + АСмо X Г + АСмо ]Г(г + м)5/3 (КРС1)

Г г =М г=о

Сумму в знаменателе нельзя рассчитать аналитически, в то время как сумма в числителе может быть преобразована следующим образом:

о о о о

Х( г + м )2 (ад )г = Х г2 (КС ) + 2М X г (К^С1 )г + м 2( ^^^^) =

г=о г=о г=о г=о

= (1 + КГС1) КС 2МКС м2 = = (1 - КС )3 +(1 - КС )2 +1 - КС = ■

(м2 - (М -1)2 КС )(1 - КС) + 2КС = (1 - КС )3

Окончательно получим:

^ =

г + АС

М 0

М2 -(М -1)2 КрС-1 2К^С!

(1 - К^С1) (1 - КС)

£( /+М )5/3 (ад)

. (3.10)

i=0

Выражения (3.9) и (3.10) являются ключевыми уравнениями строгой модели с макроскопической константой связывания. Тем не менее, полный аналитический расчет суммы в знаменателе в (3.10) также оказывается проблематичным, и, следовательно, с помощью этого подхода провести численный анализ данных ДСР не представляется возможным.

В целом, неприменимость строгой модели для численного анализа экспериментальной кривой dz(Co/r) вытекает из того факта, что модель описывает связывание наноразмерных объектов, т.е. отдельных молекул Сбо, по экспериментальным данным светорассеяния микроскопических объектов - кластеров, имеющих размер порядка 0,1 мкм и состоящих из ~106 молекул Сбо, т.е. наблюдается несоизмеримость величин входных и выходных переменных. Устранить эти сложности можно путем модификации первоначальной физической модели агрегации таким образом, чтобы порядок величин параметров модели был сопоставим.

3.2.6. Масштабированная модель агрегации фуллерена Сбо

Будем считать неизменными первые два постулата физической модели агрегации, и изменим третий постулат следующим образом.

Поверхность кластеров намного больше, чем размер молекулы Сбо. Это означает, что процесс агрегации можно рассматривать как процесс одновременного связывания Я фуллеренов на поверхность кластера с разных сторон, т.е. кооперативное образование молекулярного слоя на кластере. Косвенное, но важное подтверждение этого предположения вытекает из хорошо известного факта существования дискретных стабильных агрегатов фуллерена Сбо в растворе [105, 134], допускающих кооперативное связывание определенного количества мономеров. По

мере роста размеров кластеров количество Я также изменяется. В первом приближении пренебрежем этим изменением и примем за Я среднее число молекул Сбо, одновременно связывающихся с кластерами различных размеров, содержащими не менее М молекул. С учетом этих двух предположений можно рассматривать равновесие кластеров и мономеров С60 как сосуществование двух различных молекулярных форм в растворе, а именно, кластеров, содержащих м агрегированных молекул Сбо в каждом, и конгломератов, каждый из которых состоит из Я неагрегиро-ванных мономеров фуллерена Сбо (см. рисунок 3.6). В результате, анализ агрегации фуллерена С60 в растворе может быть сведен к рассмотрению гетероассоциации кластеров, имеющих ядро из М молекул, с конгломератами, содержащими Я фул-леренов в каждом. Взаимодействием между кластерами и между агрегатами пренебрегаем. Конгломераты являются условно введенными объектами и не дают вклад в сигнал ДСР. Отметим, что модели двухкомпонентной гетероассоциации в настоящее время детально разработаны (см., например, [204]), что упрощает дальнейшее построение масштабированной модели.

Рисунок 3.6 - Схематическое представление кластеров и конгломератов

Обозначим через См и СЯ общие концентрации кластеров и конгломератов при фиксированной общей концентрации Со фуллерена Сбо; пусть См и СЯ — мо-

номерные концентрации несвязанных друг с другом кластеров и конгломератов соответственно; Кк - равновесная константа одновременного связывания Я фуллере-нов с произвольным кластером. С учетом введенных обозначений, закон сохранения масс можно записать в форме, типичной для двухкомпонентной гетероассоци-ации:

С = MCM + RC

С

M „

CM1 + XCMi (KRCR1 )

i=1

(3.11)

C

= CR1 +X iCM1 (krCR1 )

i=1

Система уравнений (3.11) все еще не допускает численного решения, т.к. содержит параметры, несоизмеримые по порядку величины, а именно, ~ 10-3 М (для Со), ~ 106 (для М, Я), ~ 10-9 М (для См , Ск ), ~ 109 М-1 (для Кк). Проведем замену

переменных с соответствующим выравниванием порядка величин параметров путем умножения/деления слагаемых в (3.11) на М:

c=Mcm0 И MM 1^cRo ]

Mcm 0 ]

lMCR„ ]

\mcmi ]+z|mcmi!

i=1

|mcri ]+£ i\mcmi ]

Кк

M

Kl

M

\MCR1

\MCRl ]]

(3.12)

0

r

0

r

r

r

Теперь все параметры, входящие в (3.12) в квадратных скобках, имеют «нормализованные» или «масштабированные» значения по порядку величины: милли-моли - для концентрации, приблизительно тысячи - для модифицированной равновесной константы, и близкие к единице значения для параметра [R/M]. Физический смысл концентраций в квадратных скобках - концентрации кластеров (или

конгломератов), выраженные в единицах молей одиночных фуллеренов. То же самое относится к равновесной константе [Kr/M] - это осредненное значение константы связывания одного конгломерата R, отнесенное к М молекулам Сбо. Переход к искомой константе связывания Kf осуществляется путем пересчета Kr относительно R, т.е. нормирование на число реакций комплексообразования фуллерена Сбо с кластером:

K

f

Г Kr 1 Г M '

_ M _ _ R _

(3.13)

Вводя обозначение В = [R/M] и штрихи для концентраций и равновесных констант в квадратных скобках, получим систему уравнений, аналогичную (3.12), но без сильного расхождения в порядке величин и удобную для дальнейшей численной оценки и аналитических преобразований:

Co = Cm + BC

Ro

C

Mn

r

= CM 1 + CM 1 I KR CRi

i =1

C

Ro

r

= CR1 + 2 iCM 1 I KR CR1

(3.14)

i =1

k„ = KR

"F

B

о

Упростим систему (3.14), сворачивая бесконечные ряды:

Со = См + ВСк

С

М о

С

М1

1 - Кя Сях

С

С ' + СМ1 Кя Ся1

11 - к„С

я ^я.

к, = Кя

В

(3.15)

Решение системы (3.15) относительно Ся имеет вид:

о

г

о

г

С =■

г + Смо ВКР +1 Со -Смо ]К,-.

г + Смо ВКР +1 Со - Смо ]к р I 4гК, I Со Смо

2гВК„

(3.16)

Аналогично можно преобразовать выражение (3.2), используемое для анализа экспериментальной кривой dz(Cо/r). Однако в этом случае пробег индекса г идет не по отдельным молекулам Сбо, как в строгой модели (см. п. 3.2.5), а по конгломератам, связанным с кластерами. Индекс г = 0 соответствует кластерам, не связанным с конгломератами:

да 1

1 г=о а1

й.

ои

Е(м + гЯ )2I, .

(3.17)

г=о

2

Учитывая приведенный выше вывод системы (3.14) и кинетический эффект в форме (3.1а), получаем £ = СМ1 Сщ ^ , й2 = ^ЦМ+т = ё0\[\+Тв , что позволяет далее упростить (3.17):

d„ =

dA

C

1 + A ^

uu

Z(1 + B )2 f

i=0

iaj

E(1+«

i=0

(3.18)

Дальнейшее преобразование числителя в (3.18) дает:

d. =

d„

1 + A'

C

M 0

1 +(b - оявд1

+ B3 KC

F R

1 - BKfCr1 1 2(1 + Bi )53 f BKfCr

i=0

(3.19)

Аппроксимация экспериментальной кривой, приведенной на рисунке 3.3, проводится с помощью (3.16) и (3.19) с тем же набором подгоночных параметров, что и в строгой модели: CMo, A, Kf, В. Однако теперь все параметры, входящие в

(3.16) и (3.19), имеют схожий порядок величин, и индекс i при вычислении суммы в знаменателе (3.19) можно ограничить небольшим конечным значением, например, 10 или 100. Значение do можно оценить по экспериментальной кривой при бесконечном разбавлении, либо использовать d0 как пятый подгоночный параметр, аналогично параметру d1 в строгой модели. Полученные данные ДСР на рисунке 3.4 можно аппроксимировать выражением (3.19) с помощью стандартного математического программного обеспечения, например, MATLAB.

Приведенный выше вывод формул и алгоритм численного анализа и составляют суть «масштабированной» модели агрегации Сбо (up-scaled model).

r

2

r

3.2.7. Анализ результатов аппроксимации данных динамического светорассеяния с помощью масштабированной модели

Результаты аппроксимации данных по масштабированной модели (3.19) приведены в таблице 3.1. Расчетная зависимость ^(Со/г) приведена на рисунке 3.7. Величина коэффициента детерминации Я2 свидетельствует о достаточно хорошем описании экспериментальных данных моделью. Важной особенностью проведенной аппроксимации является достоверное определение глобального минимума независимо от начальных значений подгоночных параметров. Расчет по масштабированной модели с учетом экспоненциальной формы (3.1б) для кинетического эффекта дал худший результат. Таким образом, можно сделать вывод, что линейная форма (3.1а) лучше подходит для описания кинетического эффекта в водном растворе фуллерена Сбо.

Таблица 3.1 - Расчетные значения параметров агрегации

См о', мМ Кр, М-1 В йо, нм А, 103 М-1 Я2

о,оо9 5бооо о,914 28о 2об4 о,997

Из данных, приведенных в таблице 3.1, следует, что по масштабированной модели ядра кластеров имеют диаметр 280 нм, и рост размеров кластеров за счет агрегации происходит путем добавления в среднем Я молекул, что близко к числу молекул М в самом ядре, т.е. В ~ 1, следовательно, Я ~ м. Согласно выводу выражения (3.18), каждый такой молекулярный слой увеличивает диаметр кластера не более чем в 3/22 ~ 1,26 раза.

280 п

£ :=

и

14 0 -I-1-1-1-1-1

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

Концентрация С60, С^/г (м моль/л)

Рисунок 3.7 - Аппроксимация экспериментальных данных ДСР по масштабированной модели

Расчетная константа связывания Ке = 56000 М-1 имеет порядок величины, типичный для констант самоассоциации ароматических молекул, содержащих в своей структуре 3-4 ароматических кольца (~103 М-1), и констант интеркаляции ароматических молекул в ДНК (~105-106 М-1) [205]. Также стоит отметить, что величина свободной энергии Гиббса взаимодействия двух молекул Сбо, рассчитанная методом молекулярной динамики в работе [135], составляет -7,5 ккалмоль-1, что хорошо согласуется с полученным с данной работе значением: ДGE = -ЯЛпКе = -6,5 ккалмоль-1. Однако прямое сравнение этих значений затруднительно, поскольку значение ДGE, полученное в данной работе, соответствует связыванию одной молекулы фуллерена с кластером (адсорбция), а не простого взаимодействия между двумя молекулами фуллерена С60, рассмотренного в [135]. Отметим, что экспериментальное определение константы агрегации Ке фуллерена Сбо выполнено в настоящей работе впервые.

3.2.8. Проверка устойчивости параметров «масштабированной» модели методом

Монте-Карло

Для численной оценки устойчивости оптимизационных параметров при условии флуктуации экспериментальных данных был применен метод Монте-Карло по схеме Марковские цепи (MCMC). Было сгенерировано 1200 наборов экспериментальных данных по N = 11 экспериментальных точек с заданной величиной флуктуации индивидуальных измерений 5dZ = 15 нм и в предположении нормального распределения экспериментального параметра относительно истинного (заведомо известного) значения в данной концентрационной точке.

Для генерации использовался MCMC алгоритм t-walk [206], по функциональности близкий к стандартной схеме Метрополиса-Хастингса. Этот алгоритм имеет ряд преимуществ, например, отсутствие каких-либо масштабирующих параметров при адаптации Марковской цепи к сложным распределениям. Метод может применяться для генерации выборки из распределений произвольного масштаба и корреляционной структуры. В настоящей работе предварительно генерировалось 2000 наборов по N экспериментальных точек. При этом отбрасывались первые 800 точек, необходимые для адаптации цепи Маркова к распределению. В результате итоговое количество наборов составило M = 1200.

Для каждого из M наборов осуществлялась аппроксимация теоретической кривой путем минимизации функции невязки по N виртуальным экспериментальным точкам методом Левенберга-Маквардта при одних и тех же начальных условиях, заданных по истинным значениям параметров для попадания в область глобального минимума.

По сгенерированной таким образом совокупности оценок параметров модели производился расчет среднего значения и рассеяния (стандартное отклонение о) для каждого параметра модели. По рассчитанным значениям был получен коэффициент вариации для каждого параметра, выраженный в % и характеризующий степень неопределенности параметра по отношению к истинному значению (см. таблицу 3.2).

Таблица 3.2 - Коэффициенты вариации параметров «масштабированной» модели

Параметры С ' ^м о Кр В йо А

Коэффициент вариации, Су, % 16,9 1о,7 11,4 1,6 15,1

Из таблицы 3.2 видно, что наибольшее рассеяние испытывают параметры

Смо и А, но их вариация не превосходит 17% от их действительной величины.

Наиболее устойчивым параметром оказался йо, степень вариации которого оказалась менее 2%. В целом видно, что процедура аппроксимации для указанной теоретической модели является устойчивой относительно флуктуаций экспериментальных точек.

Установленная погрешность параметра Кр примерно 10% хорошо соответствует типовой экспериментальной погрешности измерения констант самоассоциации малых молекул в водной среде [99]. Из этого следует, что качество использованных в настоящей работе экспериментальных данных для оценки параметров агрегации фуллерена является удовлетворительным.

3.2.9. Метод расчета энергетики агрегации

С целью оценки возможности воспроизводства значения АОр методами молекулярного моделирования, в настоящей работе был проведен энергетический анализ изменения свободной энергии Гиббса при связывании одной молекулы Сбо с кластером, имеющим гораздо большую массу. Анализ энергетики агрегации молекулы Сбо проводился в соответствии с ранее предложенным методом [205], дающим хорошо согласующиеся теоретически рассчитанные и экспериментально измеренные значения изменения свободной энергии Гиббса для широкого ряда ароматических молекул и их комплексов. Данный подход был незначительно модифицирован в настоящей диссертации для учета специфики агрегации фуллерена.

При рассмотрении реакций агрегации учитывались следующие компоненты свободной энергии Гиббса: ван-дер-ваальсовы (ВДВ) взаимодействия (межмолекулярные, АО™^, и в водном окружении, АО"°°1), электростатические взаимодействия (межмолекулярные, АО^, и в водном окружении, АО^1), гидрофобные взаимодействия (АОМ), потеря поступательных и вращательных степеней свободы (АО1га1), образование новых колебательных степеней свободы химических связей (АО'уЛ) и механических вибраций молекул в комплексе (АО"ь). Сумма всех этих составляющих (3.20) дает изменение свободной энергии Гиббса в процессе агрегации, АОр (Леог),

которая, в свою очередь, может быть получена по экспериментально измеренной равновесной константе агрегации, кр, следующим образом: АОр (ехр) =-ЯТ 1п Кр,

АОр) = АО^ + АвЮ; + АОет + АОТ + АО^ + АО^ + АО^ + АОЦь.

(3.20)

Вычисление каждой из вышеперечисленных составляющих проводилось по следующим методикам [205]. Расчет межмолекулярной энергии Ван-дер-Ваальса АО™№

проводился путем усреднения ван-дер-ваальсовой составляющей энергии взаимодействия в процессе моделирования молекулярной динамики в Х-РЬОЯ (версия 3.851) [207] с силовым полем CHARMM27 и водным окружением из молекул воды в форме Т1Р3Р, размещенных в кубическом боксе с длиной ребра 35 А (1423 молекулы). Общее время эволюции составило 1 нс, что соответствовало стабильным значениям средней энергии межатомных взаимодействий, удовлетворительно воспроизводящих среднюю энергию ван-дер-ваальсового взаимодействия между жесткими ароматическими молекулами [205]. Энергия ван-дер-ваальсового взаимодействия с растворителем, АО^, была оценена по скорректированной величине коэффициента микроскопического поверхностного натяжения, = -0,063(± 0,008) ккал моль-1А-2 [208], в уравнении АО^ = уус№АА, где АА - из-

менение доступной для растворителя площади поверхности (в А2). Энергия электростатических взаимодействий рассчитывалась путем решения нелинейного уравнения Пуассона-Больцмана с помощью программного комплекса DelPhi [209].

Энергетика гидрофобных взаимодействий вычислялась по изменению доступной для растворителя площади поверхности следующим образом: АОИуй = /Иуй АЛ, где уИуй =0,05 ккалмоль-1А-2. Расчет энергии вибрации химических

связей (АО1ь) производился с помощью метода нормальных мод Дрейдинга в Gaussian09. Расчет энергии механических колебаний молекул в комплексе (АО"ь) проводился путем оценки коэффициента жесткости в приближении малых поступательных смещений молекул в агрегате. Изменение свободной энергии Гиббса, связанное с потерей поступательных и вращательных степеней свободы, оценивалось с помощью асимптотического выражения для связывания малых лигандов с большим рецептором, полученного в работе [210]:

АОм = ЯТ

' V л 3. 16жък Т2Л 1п— +1 + — 1п

ЫА 2 И

4

+ - ЯТ 1п тр +1 ЯТ 1п(прх1р1р)