Теоретический анализ эффективности эритроцитов-биореакторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Протасов Евгений Сергеевич

• Протасов Евгений Сергеевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Протасов Евгений Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика физиологии и метаболизма эритроцита

1.2. Регуляция объема и энергетического метаболизма эритроцита

1.3 Транспорт веществ сквозь мембрану эритроцита

1.4 Конструирование метаболических путей

1.5 Математическое моделирование метаболизма эритроцита

1.6 Создание и использование эритроцитов-биореакторов в мировой практике

1.7 Ферменты, использованные для создания ЭБР, анализируемых в работе

1.8 Математическая модель метаболизма эритроцита, использованная в работе

2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы

3.2 Выделение эритроцитов

3.3 Получение ЭБР с глутаматдегидрогеназой и аланинаминотрансферазой методом обратимого гипотонического диализа

3.4 Измерение активности глутаматдегидрогеназой и

аланинаминотрансферазой

3.5 Измерение зависимости концентрации аммония в растворе от времени in vitro

3.6 Метод математического моделирования метаболизма ЭБР

3.7 Математическая модель потребляющих аммоний ЭБР на основе глутаматдегидрогеназы

3.8 Математическая модель потребляющих аммоний ЭБР на основе глутаминсинтетазы

3.9 Математическая модель потребляющих аммоний ЭБР на основе аланиндегидрогеназы

3.10 Математическая модель потребляющих аммоний ЭБР на основе совместной работы глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы

3.11 Математическая модель потребляющих этанол ЭБР на основе алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы

3.12 Программное обеспечение

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Анализ эффективности потребляющих аммоний ЭБР на основе глутаматдегидрогеназы

4.2 Анализ эффективности потребления аммония ЭБР на основе глутаминсинтетазы

4.3 Анализ эффективности потребления аммония ЭБР на основе аланиндегидрогеназы

4.4 Анализ эффективности потребления аммония ЭБР на основе глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы

4.5 Экспериментальная верификация математической модели ЭБР на основе глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы

4.6 Анализ эффективности потребления этанола ЭБР на основе алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы

4.7 Обобщение результатов анализа

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

В последние десятилетия быстрый прогресс в накоплении данных о внутриклеточных процессах и развитие геномики, протеомики, метаболомики и т. д. привели к быстрому возрастанию объема наших знаний о том, что происходит в клетке. Сегодня доступно огромное количество данных о внутриклеточных процессах. Наступает этап активного осмысления накопленного массива информации - извлечения знаний из данных. Это осмысление имеет шанс в ближайшее время сильно продвинуть представления человечества об устройстве метаболических систем, а, следовательно, открыть новые возможности для направленного вмешательства в их работу. Математические и компьютерные методы более чем за полвека своего развития показали свою высокую эффективность в решении такого рода задач. Поэтому в ближайшем будущем стоит ожидать все более широкого применения такого рода методов в биологических науках.

Метаболические системы живых клеток представляют собой сложные последовательности ферментативных реакций, взаимодействующих друг с другом как через общие метаболиты, так и непрямыми методами (аллостерическая регуляция, ковалентная модификация ферментов и т. д.). Такая сложная структура позволяет клетке не только производить необходимые для поддержания жизнедеятельности вещества и энергию, но и, путем введения сложных, но чрезвычайно эффективных инструментов регуляции метаболизма, обеспечить высокую устойчивость метаболической системы к внешним воздействиям различной природы (гомеостаз). Многие метаболические системы могут продолжать функционировать в очень широких диапазонах значений ключевых параметров (таких как концентрации метаболитов, активности ферментов, проницаемость мембран для тех или иных веществ, скорость каких-либо химических реакций и т. д.) - изменение этих параметров в разы, а иногда и в десятки раз все еще не приводит к выходу метаболической системы из строя [1,2]. Современные биотехнологические методы позволяют активно вмешиваться в метаболизм клеток, с целью изменения их функционирования или даже приобретения ими новых функций, желательных человеку в медицинских, промышленных, научных и т. д. целях. Высокая стабильность функционирования метаболических систем клетки, с одной стороны, позволяет рассчитывать на то, что такое вмешательство человека в метаболизм не сильно повлияет на состояние клетки, с другой стороны, трудно предвидеть последствия такого вмешательства в силу

сложности метаболических систем. Наличие огромного количества взаимосвязанных химических превращений (для примера, в эритроците -простейшей клетке млекопитающих, одновременно протекает более 200 биохимических реакций [3]), сильно затрудняет интуитивное понимание назначения каждого блока биохимической системы, а также его взаимодействия с другими блоками. Попытки экспериментального анализа сложных метаболических систем in vitro помимо вышеперечисленных факторов осложняются еще и тем, что из-за тесной взаимосвязи метаболических путей небольшие части метаболических систем крайне трудно поддаются изоляции для воспроизведения и изучения в лабораторных условиях. Таким образом, предсказание последствий вмешательства человека в метаболизм даже относительно просто устроенных клеток, а, следовательно, и подбор правильного воздействия, а также оценка допустимых пределов такого воздействия становится трудноразрешимой задачей.

Инструменты огромной силы и важности для решения такого рода задач дают теоретические методы исследования биологических систем. Примеры таких инструментов - огромные базы данных по кинетике отдельных ферментов и стадий метаболических систем, математическое моделирование и компьютерные методы исследования сложных систем. Главным достоинством этого подхода по сравнению с экспериментальными методами является возможность выделения и анализа любой части исследуемой системы, а также произвольного изменения любых параметров, что в экспериментах in vitro и in vivo требует больших трудозатрат, а часто и вовсе невозможно. На основе результатов системного анализа клеточного метаболизма могут быть сформулированы предсказания, которые относительно легко поддаются экспериментальной проверке. Полученное на основе такого анализа понимание устройства метаболической системы открывает возможности для планирования направленных модификаций метаболизма от терапии болезней до конструирования новых метаболических путей. Начиная с середины прошлого века математические модели метаболических систем и другие методы теоретического исследования в биологии все более широко используются научными коллективами по всему миру [4,5].

Эритроцит - одна из наиболее просто устроенных и хорошо изученных клеток в организме млекопитающих. Простое физиологическое устройство и относительная немногочисленность биохимических реакций, протекающих в эритроците, делают его удобным объектом для изучения функционирования и регуляции клеточного метаболизма, а также одним из наилучших кандидатов для модификаций.

Один из возможных способов модификации эритроцита заключается во введении в него ферментов, катализирующих реакции, отсутствующие в нормальном эритроците. Эритроциты, модифицированные таким образом, называются эритроцитами-биореакторами (ЭБР). ЭБР могут применяться в медицине, в тех случаях, когда лечение требует производства в кровотоке некоторого целевого вещества, или же наоборот, его удаления из кровотока. В этом случае в эритроцит могут быть помещены ферменты, катализирующие реакции метаболического пути, в котором целевое вещество производится или потребляется. Использование ЭБР обладает двумя главными преимуществами по сравнению с прямой инъекцией ферментов в кровь пациента.

Внутри эритроцита ферменты изолированы от воздействия на них иммунной системы пациента. Первым следствием этого является сильное снижение вероятности аллергической реакции на введение ферментов. Второе, не менее важное следствие, заключается в том, что из-за невозможности деактивации введенных ферментов иммунной системой и протеазами плазмы крови время их функционирования увеличивается с десятков часов до десятков дней [6,7]. В разное время разными научными группами создавались ЭБР, потребляющие аспарагин [6], аммоний [8-10], этанол [11,12] и другие вещества. Некоторые из таких биореакторов в настоящее время используются в клинической практике [13,14]. Большинство предложенных биореакторов, однако, демонстрировали низкую эффективность in vitro и in vivo [8,9,11]. Попытки выяснения причин такого исхода, а также оценки пределов возможной эффективности ЭБР и последствий, к которым может привести взаимодействие встроенного метаболического пути с метаболической системой клетки до настоящего времени практически не предпринимались. Помочь в этом может математическое моделирование работы ЭБР, однако таких моделей до недавнего времени не существовало. Это обстоятельство делает данное исследование актуальным.

Разработанность темы исследования

ЭБР различного назначения разрабатывались с начала 1980-х годов разными научными группами по всему миру. Некоторые из разработанных ЭБР (например ЭБР для утилизации аспарагина) успешно применяются в клинической практике. К моменту написания настоящей работы в литературе было описано два типа ЭБР для утилизации аммония - ЭБР на основе глутаматдегидрогеназы и ЭБР на основе глутаминсинтетазы. Несмотря на то, что была продемонстрирована работоспособность описанных ЭБР in vitro и in vivo, оба варианта ЭБР продемонстрировали низкую эффективность. Анализ

причин наблюдаемой низкой эффективности в опубликованных работах не проводился.

Также в литературе были описаны различные варианты ЭБР для утилизации этанола. Все эти варианты сводились к использованию двух ферментов -алкогольдегидрогеназы (ADH) и альдегиддегидрогеназы (ALDH). Были предложены ЭБР, основанные на работе каждого из этих ферментов по отдельности, а также на совместной работе двух ферментов. ЭБР на основе совместной работы ADH и ALDH продемонстрировали достаточно высокую эффективность in vitro. Также в 2017 году была предпринята попытка теоретического анализа факторов, ограничивающих эффективность работы таких ЭБР. Анализ упрощенной математической модели метаболической системы рассматриваемых ЭБР показал, что скорость окисления этанола ограничена скоростью притока пирувата в систему из внешней среды. Экспериментальная проверка результатов этого анализа подтвердила, что увеличение концентрации пирувата во внешней среде приводит к увеличению скорости окисления этанола. Эта попытка оставалась единственной попыткой теоретического анализа эффективности ЭБР. Несмотря на успешность проведенного анализа, полученные результаты не были полными, так как использованная математическая модель не включала в себя описания гликолиза, с которым встроенная метаболическая система взаимодействует через общие метаболиты, и, следовательно, не позволяла проанализировать ограничения эффективности ЭБР, связанные со взаимодействием реакций встроенного метаболического пути с собственным метаболизмом эритроцита.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретический анализ эффективности эритроцитов-биореакторов»

Цель работы

Целью настоящей работы является теоретический анализ факторов, ограничивающих эффективность работы описанных в литературе биореакторов и использование результатов этого анализа для конструирования эффективных биореакторов на примере ЭБР, утилизирующих аммоний и ЭБР, утилизирующих этанол.

Задачи исследования

1. Создание математических моделей ЭБР, утилизирующих аммоний на основе различных метаболических путей, теоретически способных перерабатывать аммоний и этанол.

2. Выявление с помощью анализа построенных моделей причин низкой эффективности ранее предложенных ЭБР и конструирование на основе

полученных выводов метаболического пути для создания более эффективных ЭБР, утилизирующих аммоний.

3. Построение математической модели, описывающей метаболизм новых предложенных ЭБР для удаления аммония; ее анализ с целью оценки возможной эффективности этих ЭБР и выявления факторов, ограничивающих эту эффективность.

4. Экспериментальная проверка in vitro некоторых предсказаний модели новых ЭБР для удаления аммония.

5. Построение и анализ математической модели ЭБР для утилизации этанола с целью оценки возможной эффективности таких ЭБР, а также выявления факторов, ограничивающих эту эффективность.

Научная новизна

1. На основе существующих математических моделей метаболизма глюкозы в эритроците человека впервые построены модели метаболических систем ЭБР для удаления аммония из кровотока на основе глутаминсинтетазы (GS), глутаматдегидрогеназы (GDH), аланиндегидрогеназы (AlaDH).

2. Выявлены причины низкой эффективности удаления аммония ранее предложенными в литературе ЭБР, содержащими GDH или GS - низкая проницаемость мембраны для а-кетоглутората, глутамата, а также выявлена причина неэффективности ЭБР на основе AlaDH - протекание реакции в сторону производства аммония в условиях, близких к физиологическим.

3. Результаты системно-биологического анализа метаболической системы ЭБР впервые использованы для конструирования нового ЭБР для удаления аммония. Предложен вариант такого ЭБР, содержащий одновременно GDH и аланиаминотрансферазу (ААТ). Использование такого метаболического пути позволяет избежать проблем с транспортом субстратов и продуктов встроенных реакций через мембрану, так как при совместной работе обоих ферментов эти субстраты (глутамат и а-кетоглутарат) потребляются и производятся внутри эритроцита циклически.

4. Проанализированы возможные последствия взаимодействия встроенного метаболического пути с метаболизмом эритроцита для ЭБР на основе GDH и ААТ. Показано, что при увеличении активности ферментов встраиваемой системы происходит дополнительное окисление NADPH в реакции GDH, что приводит к снижению концентрации NADPH, активации пентозофосфатного пути и, в конечном итоге, к потере стационарного состояния в гликолизе.

5. Впервые построена полная математическая модель метаболической системы ЭБР, потребляющего этанол, на основе совместной работы двух ферментов алкогольдегидрогеназы (ADH) и альдегиддегидрогеназы (AlDH).

6. Выявлено два возможных ограничения для эффективности ЭБР потребляющих этанол: скорость поступления пирувата в клетку из внешней среды и потеря стационарного состояния в гликолизе при увеличении активности ферментов встраиваемой системы в результате конкуренции за окисленный никотинамидадениндинуклеотид (NAD) между гликолизом и реакциями встраиваемого пути. Обнаружено, что при переходе от устойчивого стационарного состояния гликолиза к нестационарному с накоплением ряда метаболитов, в гликолизе возникает колебательный режим.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые проведен теоретический анализ функционирования эритроцитов-биореакторов. Анализ математических моделей ЭБР, утилизирующих аммоний и этанол выявил две главные группы факторов, ограничивающих возможную эффективность ЭБР: низкая скорость транспорта субстратов или продуктов целевых реакций сквозь мембрану эритроцита и нарушения работы метаболизма эритроцита из-за взаимодействия с реакциями встраиваемого метаболического пути. Примененные методы анализа, а также выводы, полученные в результате этого анализа, могут быть использованы для конструирования новых эффективных ЭБР разного назначения.

Разработанный ЭБР для утилизации аммония на основе совместной работы двух ферментов (GDH и AAT) может оказаться потенциально полезным при лечении гипераммониемии.

Методология и методы исследования

Теоретический анализ метаболических систем ЭБР проводился с помощью математического моделирования. Математические модели представляют собой системы обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ) первого порядка, описывающих зависимости концентраций веществ в клетке от времени. Различные модели включают в себя ОДУ, описывающие работу различных частей метаболизма эритроцита (гликолиз, пентозофосфатный путь окисления глюкозы (РРР), окислительно-восстановительный метаболизм) и реакций встроенных метаболических путей. Правые части ОДУ представляют собой разности скоростей потребления и производства соответствующих метаболитов. Скорости ферментативных реакций описаны согласно представлениям ферментативной кинетики, данные о кинетических

константах и механизмах ферментов взяты из литературы. Для метаболитов, способных проходить сквозь мембрану эритроцита учтены также скорости трансмембранного транспорта.

Численные решения систем ОДУ получены методами Рунге-Кутты переменного порядка и шага, использующими формулы численного дифференцирования порядка 1-5 в MATLAB 2009.b.

В анализе математических моделей метаболических систем использованы также методы теории динамических систем и качественной теории дифференциальных уравнений.

ЭБР, утилизирующие аммоний, были получены из эритроцитов здоровых доноров методом обратимого гипотонического диализа. Активности глутаматдегидрогеназы и алнинаминотрансферазы в лизате ЭБР измерены энзиматическими методами, скорость реакций определялась фотометрическим методом по изменению концентрации восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH). Изменение концентрации аммония в суспензии ЭБР in vitro определено с помощью ион-селективного электрода.

Положения, выносимые на защиту

1. Построены математические модели эритроцитов-биореакторов, убирающих из кровотока аммоний или этанол, включающие подробное описание реакций гликолиза и встроенных в эритроцит ферментов.

2. Выявлены факторы, ограничивающие эффективность ранее предложенных ЭБР для утилизации аммония.

3. Предложен новый вариант ЭБР для удаления аммония из кровотока на основе совместной работы глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы.

4. Выявлены факторы, ограничивающие эффективность вновь предложенных ЭБР для утилизации аммония, а также ЭБР для утилизации этанола на основе совместной работы алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы.

5. Получены оценки максимально допустимых значений скоростей целевых реакций и активностей встраиваемых ферментов, допустимых при практическом использовании ЭБР

6. Описаны механизмы, приводящие к выходу ЭБР из строя из-за потери метаболической системой устойчивого стационарного состояния в случае превышения критических значений активностей встраиваемых ферментов.

Личный вклад автора

Все работы по построению и анализу математических моделей ЭБР, получению ЭБР, утилизирующих аммоний, проведению экспериментов in vitro, обработке результатов, написанию статей и тезисов конференций по материалам диссертации проведены либо лично автором, либо при его непосредственном участии.

Достоверность и обоснованность результатов

Достоверность результатов гарантируется использованием современных данных о кинетических параметрах всех включенных в модели реакций и концентрациях метаболитов, наблюдаемых в физиологических условиях, совершенством программ для решения дифференциальных уравнений моделей, согласованностью результатов теоретического расчета с результатами, полученными при исследовании данных ЭБР в экспериментах in vitro, а также внутренней согласованностью всех полученных результатов.

Связь с плановыми исследованиями

Работы, положенные в основу диссертации выполнены в рамках госзаданий «Изучение биофизических и молекулярных механизмов регуляции движения хромосом в процессах деления клеток, тромбообразования, разработка новых методов диагностики нарушений свертывания крови, создание нового поколения плазмозамещающих противосвертывающих средств, выявление и изучение неблагоприятных факторов внешней среды, образа жизни и полиморфизма генов, определяющих предрасположенность к возникновению мультифакторных заболеваний, а также разработка методов создания новых лекарственных форм и биореакторов на базе эритроцитов», 122041100273-9, 2022-2024; «Разработка методов создания новых лекарственных форм и биореакторов на базе эритроцитов», АААА-А19-119111690006-9, 2019-2021 и при поддержке грантов РНФ (16-14-00224), РФФИ (15-29-01228), президиума РАН (грант по программе фундаментальных исследований «Фундаментальные основы технологии физиологических адаптаций»), РНФ (23-24-00178).

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на II Национальном Конгрессе по Регенеративной Медицине (3-5 декабря 2015, Москва), 10th Asia

Continental Branch Congress of International Society of Pediatric Oncology (10th SIOP Asia), 25-28 May 2016, Moscow, Russia; International Conference and Exhibition on Pharmaceutical Science and Pharmacognosy (16-18 ноября 2017, Барселона, Испания); 4 International Conference on Pharmaceutics and Advanced Drug Delivery Systems (5 April, 2021, London, Great Britain); первой международной виртуальной конференции «Системная Биология и Системная Физиология: Регуляция Сложных Биологических Систем» (7-9 декабря 2020, Москва, Россия); второй международной гибридной конференции «Системная Биология и Системная Физиология: Регуляция Сложных Биологических Систем» (25-27 августа 2021, Москва, Россия); 5 Conference on Pharmaceutics and Advanced Drug Delivery Systems (13 October, 2021, London, Great Britain).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, 1 патент и 8 публикаций в материалах конференций и съездов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы (глава 1), постановку задачи (глава 2), описание материалов и методов (глава 3), результаты (глава 4), выводы, список сокращений и обозначений, список цитированной литературы (129 ссылок), а также благодарности. Работа содержит 36 рисунков и 17 таблиц.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика физиологии и метаболизма эритроцита

Эритроцит - клетка крови, осуществляющая транспорт кислорода от дыхательных органов к тканям, потребляющим кислород, и углекислого газа в обратном направлении. Нормальный эритроцит человека имеет форму двояковогнутого диска диаметром 8 мкм и толщиной 1 мкм в самом тонком месте и 2,5 мкм у края диска. Объем эритроцита в нормальном состоянии -около 100 мкм3 [15] (Рис. 1.1.1).

Рисунок 1.1.1 - Электронная микрофотография эритроцитов [16].

Главная функция эритроцита - служить вместилищем для гемоглобина, белка, состоящего из 4 одинаковых субъединиц, обратимо связывающего кислород и углекислый газ при их транспортировке в крови. Каждая субъединица способна связывать одну молекулу кислорода или углекислого газа. Молекулярная масса гемоглобина составляет 66-68 кДа [17]. Концентрация гемоглобина внутри эритроцита составляет примерно 5 мМ, на его долю приходится около 95% сухой массы клетки [17].

В природе встречаются организмы, у которых белок, связывающий кислород, растворен в крови [18]. Помещение гемоглобина в эритроциты позволяет существенно снизить вязкость крови по сравнению с раствором гемоглобина той же концентрации [19]. Таким образом, главная функция эритроцита -

служить контейнером для транспортировки гемоглобина. С этим связано крайне простое физиологическое и метаболическое устройство эритроцита по сравнению с большинством других клеток. В зрелых эритроцитах человека отсутствует ядро, эндоплазматическая сеть, митохондрии, рибосомы. Срок жизни зрелых эритроцитов здорового человека составляет 90-120 дней [19].

Главные физиологические задачи эритроцита сводятся к поддержанию своей жизнедеятельности, а именно, в первую очередь, сохранению постоянного объема и формы, а также целостности и деформируемости мембраны. Эти задачи требуют затрат энергии, поэтому эритроциту необходимо постоянное производство аденозинтрифосфата (АТР). Единственным путем производства АТР в эритроците служит гликолиз [19]. Схема гликолиза в эритроците представлена на Рис. 1.1.2.

В гликолизе молекула глюкозы посредством 10 последовательных химических реакций окисляется до двух молекул пирувата. Дальнейшая судьба пирувата зависит от специализации и метаболического устройства клеток, в которых протекает гликолиз. В эритроцитах человека с полученным в гликолизе пируватом происходит два параллельных процесса - восстановление его до лактата в реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой, и транспорт в плазму крови сквозь мембрану эритроцита [19]. Восстановление пирувата до лактата необходимо для окисления NADH, который восстанавливается в шестой стадии гликолиза (реакция, катализируемая глицеральдегидфосфат дегидрогеназой). Из плазмы крови пируват может поступать в другие клетки и использоваться в других метаболических путях, например, в клеточном дыхании, синтезе аминокислот и т. д.

Рисунок 1.1.2 - Схема гликолиза в эритроците человека [2]. Использованные сокращения: GLC - глюкоза; G6P - глюкозо-6-фосфат; F6P - фруктозо-6-фосфат; FDP - фруктозо-1,6-дифосфат; DAP - дигидроксиацетонфосфат; GAP - глицеральдегид-3-фосфат; 1,3-DPG -1,3-дифосфоглицерат; 2,3-DPG - 2,3-дифосфоглицерат; 3-PG - 3-фосфоглицерат; 2-PG - 2-фосфоглицерат; PEP - фосфоенолпируват; PYR - пируват; LAC - лактат; NAD и NADH -окисленная и восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида, соответственно; ATP - аденозинтрифосфат; ADP - аденозиндифосфат; PO4 - неорганический фосфат; HK -гексокиназа; GPI - глюкозо-6-фосфатизомераза; PFK - фосфофруктокиназа; ALD -альдолаза; TPI - триозофосфатизомераза; GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа; PGK - фосфоглицераткиназа; PGM - фосфоглицератмутаза; ENO - енолаза; PK -пируваткиназа; LDH - лактатдегидрогеназа.

Главная функция гликолиза - фосфорилирование ADP с превращением его в АТР. На подготовительной стадии гликолиза (фосфорилирование глюкозы) происходит гидролиз двух молекул АТР на молекулу глюкозы (гексокиназная и фосфофруктокиназная реакции). В нижней части гликолиза (фосфоглицераткиназная и пируваткиназная реакции) происходит

фосфорилирование одной молекулы ADP на молекулу пирувата. Таким образом, итоговый выход гликолиза по ATP составляет две молекулы ATP на одну молекулу глюкозы или одну молекулу ATP на молекулу пирувата. В эритроцитах человека это количество может быть уменьшено за счет перенаправления части потока потребления 1,3-дифосфоглицерата через 2,3-дифосфоглицератный шунт (последовательность из

дифосфоглицератмутазной и дифосфоглицератфосфатазной реакций на Рис. 1.1.2).

Так как кислород и его радикалы, а также образующийся при их участии пероксид водорода являются сильными окислителями, второй важнейшей для эритроцита задачей является борьба с окислительным стрессом. Она состоит в деактивации радикалов кислорода и борьбе с последствиями окисления макромолекул в клетке (в частности, белков и мембранных липидов).

Основным источником активных форм кислорода в эритроците является неферментативное окисление гемоглобина до метгемоглобина с образованием супероксид-радикала (02) [20]:

Hb + 02 ^ MetHb + 02 (1.1.1)

Далее, посредством взаимодействия с другими молекулами супероксид-радикал порождает ряд других радикалов и пероксидов:

02 + е + 2Н+^ Н202 (1.1.2)

Н202 + е + Н+ ^ Н20 + ОН- (1.1.3)

Также супероксид-радикал способен образовывать органические пероксиды. Деактивация супероксид-радикала в эритроците осуществляется в две стадии. Первая стадия катализируется супероксиддисмутазой. В ней образуется пероксид водорода

202 +2Н+ ^ Н202 + 02 (1.1.4)

В следующей стадии, катализируемой каталазой, пероксид разлагается до кислорода и воды:

2Н202 ^2Н20 + 02 (1.1.5)

Однако, несмотря на работу этих систем, активные формы кислорода успевают частично окислить внутриклеточные молекулы (в первую очередь ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов мембраны и SH-группы

белков). Восстановление этих окисленных групп происходит при посредстве глутатиона (у-глутамилцистеинглицина, GSH). В окисленной форме глутатион существует в виде димера (GSSG). Окисленные SH-группы белков восстанавливаются глутатионом неферментативно. Восстановление органических пероксидов катализируется глутатионпероксидазой при участии GSH в качестве восстановителя:

ЯООН+ 2СБН ^ ЯОН+ 2С5БС (1.1.6)

Восстановление окисленного глутатиона происходит за счет окисления NADPH и катализируется глутатионредуктазой:

+ ЫАБРН ^ 2СБН + ЫАБР (1.1.7)

В нормальном физиологическом состоянии доля восстановленной формы глутатиона —^^— поддерживается очень высокой (около 0,995 [21]).

С5Я+2

Восстановление окисленного NADP до NADPH происходит при окислении глюкозы в пентозофосфатном пути. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы состоит из двух этапов - окислительного и неокислительного [20, 22]. В окислительной фазе пентозофосфатного пути глюкоза окисляется до рибозо-5-фосфата и С02, при этом происходит восстановление 2 молекул NADP (Рис. 1.1.3).

Рисунок 1.1.3 - Пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Окислительная фаза обведена синей рамкой [23].

Задача неокислительной фазы - превращение рибозо-5-фосфата под действием транскетолаз и трансальдолаз при участии других углеводов в углеводы, тип которых определяется потребностями метаболизма клеток конкретной ткани. Поэтому в разных тканях в зависимости от потребности в NADPH и конкретных углеводах неокислительная фаза может быть различна [22]. В эритроцитах человека основными итоговыми продуктами

неокислительной фазы пентозофосфатного пути являются глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и глицеральдегидфосфат, являющиеся метаболитами гликолиза [24].

Три перечисленных выше метаболических блока - гликолиз, антиоксидантный метаболизм и пентозофосфатный путь окисления глюкозы вместе с процессами, потребляющими энергию (главным из которых является работа Na/K-АТРаз) образуют основную часть метаболизма эритроцита человека.

1.2. Регуляция объема и энергетического метаболизма эритроцита

Одной из главных задач любой клетки является борьба с осмотическим давлением. Осмотическое давление на мембрану клетки пропорционально разности осмолярностей среды внутри и снаружи клетки:

р = ЯТАс (1.2.1)

где R - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, Ас -разность концентраций осмотически активных частиц внутри и снаружи клетки.

Так как в цитоплазме любой клетки должно постоянно находиться какое-то количество растворенных веществ от белков до различных низкомолекулярных промежуточных метаболитов, которые не должны выходить во внешнюю среду, на внутреннюю сторону мембраны клетки будет действовать осмотическое давление. Так как мембрана клетки практически нерастяжима, действие на нее больших давлений приводит к нарушению ее целостности, что влечет за собой гибель клетки. Таким образом, борьба с осмотическим давлением становится вопросом выживания клетки. Но для эритроцитов критическую важность поддержания постоянного объема обуславливает еще одно обстоятельство.

Наиболее мелкие капилляры в организме человека имеют диаметр 2-3 мкм [25]. Чтобы проходить сквозь такие капилляры эритроцит должен существенно деформироваться. Это возможно при условии существования избытка площади поверхности мембраны относительно объема клетки, что позволяет клетке сворачиваться, меняя форму без изменения площади поверхности мембраны. Так как мембрана эритроцита практически нерастяжима, площадь его поверхности можно считать постоянной величиной. Увеличение объема эритроцита по сравнению с физиологическим приближает его форму к шарообразной, что не оставляет возможности для деформаций, поскольку шар

- фигура с максимальным объемом при заданной площади поверхности. С другой стороны, при сильном уменьшении объема эритроцита внутри него возрастает концентрация белков (главным образом гемоглобина), что приводит к резкому увеличению вязкости внутренней среды и ухудшению деформируемости клетки (Рис. 1.2.1).

Обьем/площадь поверхности, мкм

Рисунок 1.2.1 - Зависимость минимального диаметра капилляра (кривая 2), через который способен пройти эритроцит и вязкости его внутриклеточной среды (кривая 1) от отношения объема клетки к площади ее поверхности [1].

Из Рис. 1.2.1 видно, что как сильно увеличенный, так и сильно уменьшенный объем клетки по сравнению с его физиологическим значением отрицательно влияет на способность эритроцита проходить сквозь мелкие капилляры. Зависимость скорости прохождения эритроцита сквозь капилляр имеет выраженный максимум, который достигается при физиологическом объеме (Рис. 1.2.2).

Таким образом, для эритроцита критически важно не просто поддержание физиологического объема для недопущения разрывов мембраны, но еще и обеспечение как можно более малого отклонения значения объема от его физиологического значения.

Рисунок. 1.2.2 - Зависимость относительной скорости прохождения эритроцита через капилляр диаметром 3 мкм; wo - скорость прохождения через капилляр нормального эритроцита (с физиологическим объемом и формой) [1].

Так как мембрана может выдержать давление не более 2 кПа [26], что соответствует разности осмотичностей внутри и снаружи мембраны в несколько мМ, а реальная разность концентраций осмотически активного материала внутри и снаружи клетки составляет десятки мМ, клетке необходимо бороться с избыточным осмотическим давлением. Существует два метода такой борьбы. Первый - окружить мембрану клетки снаружи прочной клеточной стенкой, способной выдерживать большие давления. Второй -удалять из клетки часть осмотически активного материала, не имеющую значения для метаболизма, чтобы снизить осмотическое давление за счет снижения разности осмолярностей внутренней и внешней среды. В животных клетках (в частности, в эритроцитах) реализован второй метод.

В качестве осмотически активного материала, удаление которого компенсирует избыточную осмотичность внутриклеточной среды, используются ионы натрия. Клеточная мембрана обладает низкой неспецифической проницаемостью для катионов (порядка 10-2 ч-1 [1]). Поэтому необходимо постоянно поддерживать концентрацию ионов натрия внутри клетки, выкачивая их против градиента концентрации во внешнюю среду. Эту функцию выполняет трансмембранный белок-транспортер - Na/K-

АТРаза, которая за один такт работы обменивает три иона натрия на два иона калия с расщеплением одной молекулы АТР.

Постоянно происходящее окисление фосфолипидов клеточной мембраны приводит к неспецифическому увеличению проницаемости мембраны для катионов. Проницаемость ее для анионов высока (около 2 ч-1 [1]) и в физиологическом состоянии, из-за чего их внутренняя и внешняя концентрации близки к электрохимическому равновесию. Интенсивность окисления фосфолипидов мембраны зависит от множества меняющихся внешних факторов, поэтому неспецифическая проницаемость мембраны для катионов может увеличиваться в несколько раз. Следовательно, эритроциту необходимо сохранять постоянный объем в широком диапазоне проницаемостей мембраны для катионов. Из литературы известно, что объем эритроцита остается стабильным (слабо отличается от нормального) при увеличении проницаемости мембраны для катионов до 8-10 раз [27]. Такая стабилизация обеспечивается несколькими механизмами.

Первый из таких механизмов - использование Na/K-АТРазой двух градиентов - натриевого и калиевого. Обмен трех ионов натрия на два иона калия дает преимущество по сравнению с простой откачкой ионов натрия против градиента, так как позволяет снижать концентрацию натрия в клетке до сколь угодно малых значений, что обеспечивает лучшую чувствительность клетки к ее изменению (даже небольшое абсолютное изменение концентрации ионов натрия приводит к большому ее относительному изменению). Второй механизм, обеспечивающий еще лучшую стабилизацию объема - наличие в мембране специфических калиевых каналов, активируемых кальцием. В нормальном состоянии внутриклеточная концентрация ионов кальция крайне мала (порядка 10-4 мМ [28]). Эта концентрация поддерживается на низком уровне постоянно работающими АТР-зависимыми кальциевыми насосами, транспортирующими ионы кальция во внешнюю среду против градиента концентрации. Концентрация кальция в плазме крови составляет около 3 мМ [25]. Этот огромный градиент приводит к тому, что даже небольшое увеличение проницаемости мембраны для кальция приводит к быстрому увеличению его концентрации внутри клетки. Активация калиевых каналов приводит к увеличению проницаемости мембраны для калия в сотни раз [28], что в свою очередь ведет к выходу калия из клетки и быстрому снижению осмолярности внутриклеточной среды.

Все эти механизмы позволяют достигнуть очень высокой стабильности объема клетки в широком диапазоне неспецифической проницаемости мембраны для катионов (Рис. 1.2.3).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Протасов Евгений Сергеевич, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атауллаханов, Ф. И. Как регулируется объем эритроцита, или что могут и чего не могут математические модели в биологии. / Ф. И. Атауллаханов, Н. О. Корунова, И. С. Спиридонов, И. О. Пивоваров, Н. В. Калягина, М. В. Мартынов. // Биологические мембраны - 2009. - V. 26. - №3. - P. 163-179.

2. Martinov, M. V. Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia. / M. V. Martinov, A. G. Plotnikov, V. M. Vitvitsky, F. I. Ataullakhanov. // Biochim. Biophys. Acta - 2000. - V. 1474. - P. 75-87.

3. Атауллаханов Ф. И. Регуляция метаболизма в эритроцитах млекопитающих. / Ф. И. Атауллаханов. // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности Биофизика, ЦТП ФХФ РАН, Москва, 1983.

4. Trewavas, A. A. brief history of system biology. / A. A. Trewavas. // The Plant Cell. - 2006. - V. 18. - P. 2420-2430.

5. Butcher, E. C. Systems biology in drug discovery. / E. C. Butcher, E. L. Berg, E. J. Kunkel. // Nature Biotechnology. - 2004.

6. Борсакова, Д. В. L-аспарагиназа: новые подходы к улучшению фармакологических свойств. / Д. В. Борсакова, Е. И. Синауридзе. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2018. - V. 17. - .№4. - P. 82-99.

7. Sinauridze, E. I. A new chemotherapeutic agent: L-asparaginase entrapped in red blood cells. / E. I. Sinauridze, V. M. Vitvitsky, A. V. Pichugin, A. M. Zhabotinsky. // The use of resealed erythrocytes as carriers and bioreactors. - 1992. - 326. P. 203206.

8. Sanz, S. In vitro and in vivo study of glutamate dehydrogenase encapsulated into mouse erythrocytes by a hypotonic dialysis procedure. / S. Sanz, C. Lizano, J. Luque, M. Pinilla. // Life sciences. - 1999. - V. 65. - №26. - P. 2781-2789.

9. Kosenko, E. A. Encapsulation of glutamine synthetase in mouse erythrocytes: a new procedure for ammonia detoxification. / E. A. Kosenko, N. I. Venediktova, A.

A. Kudryavtsev, F. I. Ataullakhanov, Y. G. Kaminsky, V. Felipo, C. Montoliu. // Biochem. Cell Biol. - 2008. - V. 86. - P. 469-476.

10. Protasov, E. S. Erythrocytes as bioreactors to decrease excess ammonuium concentration in blood. / E. S. Protasov, D. V. Borsakova, Y. G. Alexandrovich, A. V. Korotkov, E. A. Kosenko, A. A. Butylin, F. I. Ataullakhanov, E. I. Sinauridze. // Scientific Reports. - 2019. - 9:1445.

11. Sanz, S. Biochemical properties of alcohol dehydrogenase and glutamate dehydrogenase encapsulated into human erythrocytes by a hypotonic dialysis procedure. / S. Sanz, C. Lizano, M. I. Garin, J. Luque, M. Pinilla. // Erythrocytes as drug carriers in medicine. - 1997. - P. 101-108.

12. Alexandrovich, Y. G. Rapid elimination of blood alcohol using erythrocytes: mathematical modelling and in vitro study. / Y G. Alexandrovich, E. A. Kosenko, E. I. Sinauridze, S. I. Obydennyi, I. I. Kireev, F. I. Ataullakhanov, Y G. Kaminsky. // BioMed Research International. - 2017. - 2017.

13. Halfon-Domenech, C. l-asparaginase loaded red blood cells in refractory or relapsing acute lymphoblastic leukaemia in children and adults: Results of the GRASPALL 2005-01 randomized trial. / C. Halfon-Domenech, X. Thomas, S. Chabaud, A. Baruchel, F. Gueyer, F. Mazingue, A. Auvrignon, S. Corm, H. Dombret, P. Chevallier. // Br. J. Haematol. - 2011. - V. 153. - P. 58-65.

14. Hunault-Berger, M. A Phase 2 study of l asparaginase encapsulated in erythrocytes in elderly patients with Philadelphia chromosome negative acute lymphoblastic leukemia: The GRASPALL/GRAALL-SA2-2008 study. / Hunault-M. Berger, T. Leguay, F. Huguet, S. Lepretre, E. Deconinck, M. Ojeda-Uribe, C. Bonmati, M. Esco_re-Barbe, P. Bories, C. Himberlin. // Am. J. Hematol. - 2015. -V. 90. - P. 811-818.

15. Evans, E. Improved measurements of erythrocyte geometry. / E. Evans, Y-C. Fung // Microvascular Research. - 1972. - V. 4. - 335-347.

16. Berg, J. M. Biochemistry. / J. M. Berg, J. L. Tymoczko, Jr. G. J. Gatto, L. Stryer. // 2015. - 1050 c.

17. Атауллаханов, Ф. И. Эритроцит: мешок с гемоглобином или живая, активная клетка? / Ф. И. Атауллаханов, Д. В. Борсакова, Е. С. Протасов, Е. И. Синауридзе, А. М. Зейналов. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2018. - V. 17. - №1. - P. 9-15.

18. Terwilliger, N. B. Functional adaptations of oxygen-transport proteins. / N. B. Terwilliger. // Journal of Experimental Biology - 1998. - V. 201. - №8. - P. 10851098.

19. Уайт, А. Основы биохимии. / А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит, Р. Хилл, И. Лемман. // 1981. - 1878 c.

20. Северин, С. Е. Биологическая химия с упражнениями и задачами. / С. Е. Северин. // 2011. - 624 c.

21. Атауллаханов, Ф. И. Зависимость скорости функционирования пентозофосфатного пути в эритроцитах от степени восстановленности глютатиона. / Ф. И. Атауллаханов, А. М. Жаботинский, А. В. Пичугин, Н. Ф. Толокнова. // Биохимия. - 1981. - V. 46. - №3. - P. 530-540.

22. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология. / В. Эллиот, Д. Эллиот. // 2002. - 444 c.

23. Березов Т.Т. Метаболизм углеводов. Пентозофосфатный путь окисления углеводов. В «Биологическая химия» / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин // 1998. -704 с.

24. Атауллаханов, Ф. И. Регуляторные характеристики метаболических систем и стабилизация относительных концентраций АТФ и восстановленного глютатиона в эритроцитах человека. / Ф. И. Атауллаханов, В. М. Витвицкий, А. М. Жаботинский, Л. А. Пирузян, А. В. Пичугин, Б. Н. Холоденко. // Вестник АН СССР, серия биологическая. - 1982. - V. 3. - P. 406-417.

25. Циммерман, М. Физиология человека в 3 томах. т. 2 / М. Циммерман, В. Ениг, В. Вутке, Х. Вайс, В. Елькман, Х. Антони, Э. Вицлеб, Г. Тевс, Й. Гроте; под ред. Р. Шмидта, Г. Тевса// 1996. - 314 с.

26. Guharay, F. Stretch-activated single ion channel currents in tissue-cultured embryonic chick skeletal muscle. / F. Guharay, F. Sachs. // J. Physiol. - 1984. - V. 352. - P. 685-701.

27. Deuticke, B. Leak formation in human erythrocytes by the radical-forming oxidant t-butilhydroperoxide. / B. Deuticke, K. B. Heller, C. W. M. Haest // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - V. 854. - P. 169-183.

28. Lew, V. L. Calcium Transport and the Properties of a Calcium-Activated Potassium Current Topics in Membranes and Transportsium Channel in Red Cell Membranes. / V. L. Lew, H. G. Ferreira, // Current Topics in Membranes and Transport. - 1978. - V. 10. - P. 217-277.

29. Атауллаханов, Ф. И. Математическая модель метаболизма эритроцитов. Независимость нормированной характеристики гликолиза от индивидуальных особенностей доноров. / Ф. И. Атауллаханов, В. Н. Буравцев, В. М. Витвицкий, Б. Ф. Дибров, А. М. Жаботинский, А. В. Пичугин, Б. Н. Холоденко, Л. И. Эрлих. // Биохимия. - 1980. - V. 45. - №7. - P. 1267-1272.

30. Атауллаханов, Ф. И. Количественная модель гликолиза эритроцита человека. / Ф. И. Атауллаханов, В. М. Витвицкий, А.М. Жаботинский, Б. Н. Холоденко, Л. И. Эрлих. // Биофизика. - 1977. - V. 22. - №3. - P. 483-487.

31. Атауллаханов, Ф. И. Влияние гликолиза на метаболизм аденилатов в эритроцитах человека. / Ф. И. Атауллаханов, В. М. Витвицкий, А.М. Жаботинский, А. В. Пичугин, В. В. Помазанов, Н. Ф. Титкова. // Биохимия. -1984. - V. 49. - №1. - P. 104-110.

32. Ataullakhanov, F. I. What determines the intracellular ATP concentration. / F. I. Ataullakhanov, V. M. Vitvitsky. // Bioscience Reports. - 2002. - V. 22. - №5,6. - P. 501-511.

33. Ataullakhanov, F. I. A possible role of adenylate metabolism in human erythrocytes: simple mathematical model. / F. I. Ataullakhanov, S. V. Komarova, V. M. Vitvitsky. // J. theor. Biol. - 1996. - V. 179. - P. 75-86.

34. Bishop, C. Purine metabolism in human blood studied in vivo by injection of C14-adenine. / C. Bishop. // J. Biol. Chem. - 1961. - V. 236. - №6. - P. 1778-1779.

35. Рубин, А. Б. Биофизика в двух томах, т. 1. / А. Б. Рубин // 1999. - 448 с.

36. Poole, R. C. Transport of lactate and other monocarboxylates across mammalian plasma membranes. / R. C. Poole, A. P. Halestrap // Am. J. Physiol. - 1993. - V. 264. - №33. - P. C761-C782.

37. Halestrap A. P. Transport of pyruvate and lactate into human erythrocytes. / A. P. Halestrap // Biochem. J. - 1976. - V. 156. - P. 193-207.

38. Stein, W. D. Channels, carriers and pumps - an introduction to membrane transport. / W. D. Stein, T. Litman. // 2015. - 406 p.

39. Fleming A. Classics in infectious diseases: on the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae by Alexander Fleming, Reprinted from the British Journal of Experimental Pathology. / A. Fleming // Rev Infect Dis. - 1929. - 1980 Jan-Feb;2(1): 129-39.

40. Cohen, S. N. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. / S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, R. B. Helling. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1973. - V. 70. - №11. - P. 3240-3244.

41. Jaenisch, R. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. / R. Jaenisch, B. Mintz. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1974. - V. 71. - №4. P. 1250-1254.

42. Nielsen, J. Metabolic engineering. / J. Nielsen. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2001. - V. 55. - P. 263-283.

43. Krivoruchko, A. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. / A. Krivoruchko, V. Siewers, J. Nielsen. // Biotechnol. J. - 2011.

- V. 6. - P. 262-276.

44. Pontrelli, S. Escherichia coli as a host for metabolic engineering. / S. Pontrelli, T.-Y. Chiu, E. I. Lan, F. Y.-H. Chen, P. Chang. // Metabolic Engineering. - 2018. -V. 50. - P. 16-46.

45. Capell, T. Progress in plant metabolic engineering. / T. Capell, P. Christou. // Current opinion in biotechnology. - 2004. - V. 15. - №2. P. 148-154.

46. Lau, W. Key applications of plant metabolic engineering. / W. Lau, M. A. Fischbach, A. Osbourn, E. S. Sattely. // PLOS biology 2014. - V. 12. - №6. e1001879.

47. Rapoport, T. A. linear steady-state treatment of enzymatic chains. A mathematical model of glycolysis of human erythrocytes. / T. A. Rapoport, R. Heinrich, G. Jacobasch, S. A. Rapoport. // Eur. J. Biochem. - 1974. - V. 42. - P. 107120.

48. Rapoport, T. A. Mathematical analysis of multienzyme systems. I. Modelling of the glycolysis of human erythrocytes. / T. A. Rapoport, R. Heinrich. // BioSystems.

- 1975. - V. 7. - P. 120-129.

49. Rapoport, T. A. The regulatory principles of glycolysis in erythrocytes in vivo and in vitro. A minimal comprehensive model describing steady states, quasi-steady states and time-dependent processes. / T. A. Rapoport. // Eur. J. Biochem. - 1976. -V. 154. - P. 449-469.

50. Selkov, E. E. Stabilization of energy charge, generation of oscillations and multiple steady states in energy metabolism as a result of purely stochiometric regulation. / E. E. Selkov. // Eur. J. Biochem. - 1975. - V. 59. - P. 151-157.

51. Heinrich, R. А linear steady-state treatment of enzymatic chains. General properties, control and effector strength. / R. Heinrich, T. A. Rapoport. // Eur. J. Biochem. - 1974. - V. 42. - P. 89-95.

52. Martinov, M. V. Volume stabilization in human erythrocytes: combined effect of Ca2+-dependent potassium channels and adenylate metabolism. / M. V. Martinov, V. M. Vitvitsky, F. I. Ataullakhanov. // Biophysical chemistry. - 1999. - V. 80. - P. 199215.

53. Тихонов, А. Н. Системы дифференциальных уравнений, содержащие малые параметры при производных. / Тихонов, А. Н. // Математический сборник. - 1952. - V. 31. - №3. - P. 575-586.

54. Атауллаханов, А. И. 2,3-дифосфоглицератный шунт и стабилизация уровня ATP в эритроцитах млекопитающих. / А. И. Атауллаханов, Ф. И. Атауллаханов, В. М. Витвицкий, А. М. Жаботинский, А. В. Пичугин. // Биохимия. - 1985. -V. 50. - №6. - P. 1005-1011.

55. Savageau, M. A. Biochemical systems analysis. I. Some mathematical properties of the rate law for the component enzymatic reactions. / M. A. Savageau. // J. Theoret. Biol. - 1969. - V. 25. - P. 365-369.

56. Savageau, M. A. Biochemical systems analysis. II. The steady-state solutions for an n-pool system using a power-law approximation. / M. A. Savageau. // J. Theoret. Biol. - 1969. - V. 25. - P. 370-379.

57. Savageau, M. A. Biochemical systems analysis. III. Dynamic solutions using a power-law approximations. / M. A. Savageau. // J. Theoret. Biol. - 1970. - V. 26. -P. 215-226.

58. Jacobsson, E. Interaction of cell volume, membrane potential, and membrane transport parameters. / Jacobsson, E. // Am. J. Physiol. - 1980. - V. 238. - №7. -C196-C206.

59. Мороз, И. А. Математическая модель стабилизации объема эритроцитов. / И. А. Мороз, Ф. И. Атауллаханов, А. В. Пичугин, В. М. Витвицкий. // Биологические мембраны. - 1989. - V. 6. - №4. - P. 409-419.

60. Атауллаханов, Ф. И. Регуляция объема эритроцитов человека. Роль калиевых каналов, активируемых кальцием. / Ф. И. Атауллаханов, А. Б. Кляткина, В. М. Витвицкий, А. В. Пичугин. // Биологические мембраны. -1993. - V. 10. - №5. - P. 519-526.

61. Ataullakhanov, F. I. A possible role of adenylate metabolism in human erythrocytes. 2. Adenylate metabolism is able to improve the erythrocyte volume stabilization. / F. I. Ataullakhanov, S. V. Komarova, M. V. Martinov, V. M. Vitvitsky. // J. Theor. Biol. - 1996. - V. 183. - P. 307-316.

62. Koleva, L. Erythrocytes as carriers: from drug delivery to biosensors. / L. Koleva, E. Bovt, F. Ataullakhanov, I. Sinauridze. // Pharmaceutics. - 2020. - V. 12. - №3. - 276.

63. Bax, B. E. Erythrocytes as carriers of therapeutic enzymes. / B. E. Bax. // Pharmaceutics. - 2020. - V. 12. - №5. 435.

64. Kinosita, J. K. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. / J. K. Kinosita, T. Y Tsong. // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - V. 471. - №2. - P. 227-242.

65. Bruggemann, U. Low-oxygen-affinity red cells produced in a large-volume, continuous-flow electroporation system. / U. Bruggemann, E. C. Roux, J. Hannig, C. Nicolau. // Transfusion. - 1995. - V. 35. - №6. - P. 478-486.

66. Yamagata, K. Encapsulation of concentrated protein into erythrocyte porated by continuous-wave ultrasound. / K. Yamagata, E. Kawasaki, H. Kawarai, M. Iino. // Ultrasound in Medicine & Biology. - 2008. - V. 34. - №12. - P. 1924-1933.

67. Millan, C. G. Drug, enzyme and peptide delivery using erythrocytes as carriers. / C. G. Millan, M. L. S. Marinero, A. Z. Castaneda, J. M. Lanao. // Journal of controlled release. - 2004. - V. 95. - №1. - P. 27-49.

68. Pierige, F. Cell-based drug delivery. / F. Pierige, S. Serafini, L. Rossi, M. Magnani. // Advanced drug delivery reviews. - 2008. - V. 60. - №2. - P. 286-295.

69. Tonetti, M. Construction and characterization of adriamycin-loaded canine red blood cells as a potential slow delivery system. / M. Tonetti, B. Astroff, W. Satterfield, A. De Flora, U. Benatti, J. R. DeLoach. // Biotechnology and applied biochemistry. - 1990. - V. 12. - №6. - P. 621-629.

70. Skorokhod, O. Doxorubicin pharmacokinetics in lymphoma patients treated with doxorubicin-loaded eythrocytes. / O. Skorokhod, E. V. Kulikova, N. M. Galkina, P. V. Medvedev, E. E. Zybunova, V. M. Vitvitsky, F. I. Ataullakhanov, // Haematologica. - 2007. - V. 92. - №4. - P. 570-571.

71. D'ascenzo, M. Red blood cells as a glucocorticoids delivery system. / M. D'ascenzo, A. Antonelli, L. Chiarantini, U. Mancini, M. Magnani. // Erythrocytes as drug carriers in medicine. - 1997. - P. 81-88.

72. Goldsmith, J. C. A new treatment strategy for hemophilia B: Incorporation of factor IX into red cell ghosts. / J. C. Goldsmith, M. E. Roer, E. P. Orringer. // American Journal of Hematology. - 1979. - V. 7. - №2. - P. 119-125.

73. Sinauridze, E. I. A new drug form of blood coagulation factor IX: red blood cell-entrapped factor IX. / E. I. Sinauridze, T. A. Vuimo, E. V. Kulikova, I. I. Shmyrev, F. I. Ataullakhanov. // Medical Science Monitor. - 2010. - V. 16. - №10. - PI19-PI26.

74. DeLoach, J. R. Glutaraldehyde-treated carrier erythrocytes for organ targeting of methotrexate in dogs. / J. R. DeLoach, C. Barton. // American Journal of Veterinary Research. - 1981. - V. 42. - №11. - P. 1971-1974.

75. Mishra, P. Surface modified methotrexate loaded erythrocytes for enhanced macrophage uptake. / P. Mishra, N. K. Jain. // Journal of drug targeting. - 2000. - V. 8. - №4. - P. 217-224.

76. Antonelli, A. New strategies to prolong the in vivo life span of iron-based contrast agents for MRI / A. Antonelli, C. Sfara, S. Battistelli, B. Canonico, M. Arcangeletti, E. Manuali, M. Magnani. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - №10. e78542.

77. Zhang, K. Gd2O3 and GH combined with red blood cells to improve the sensitivity of contrast agents for cancer targeting MR imaging. / K. Zhang, Y Cao, Y Kuang, M. Liu, Y. Chen, Z. Wang, S. Hong, J. Wang, R. Pei. // Biomater. Sci. -2017. - V. 5. - №1. - P. 46-49.

78. Ritter, S. C. Encapsulation of FITC to monitor extracellular pH: a step towards the development of red blood cells as circulating blood analyte biosensors. / S. C. Ritter, M. A. Milanick, K. E. Meissner. // Biomedical optics express. - 2011. - V. 2. - №7. - P. 2012-2021.

79. Bustamante López, S. C. Characterization of carrier erythrocytes for biosensing applications. / S. C. Bustamante López, K. E. Meissner. // Journal of Biomedical Optics. - 2017. - V. 22. - №9. 091510-091510.

80. Elford, B. C. L-Glutamine influx in malaria-infected erythrocytes: a target for antimalarials? / B. C. Elford. // Parasitology Today. - 1986. - V. 2. - №11. - P. 309312.

81. Magnani, M. In vivo accelerated acetaldehyde metabolism using acetaldehyde dehydrogenase-loaded erythrocytes. / M. Magnani, M. Laguerre, L. Rossi, M. Bianchi, P. Ninfali, F. Mangani, C. Ropars, // Alcohol and Alcoholism. - 1990. - V. 25. - №6. - P. 627-637.

82. Lizano, C. In vitro study of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase encapsulated into human erythrocytes by an electroporation procedure. / C. Lizano, S. Sanz, J. Luque, M. Pinilla. // Biochim. Biophys. Acta. -1998. - V. 1425. - №2. - P. 328-336.

83. Meek, T. D. Kinetic mechanism of Escherichia coli glutamine synthetase. / T. D. Meek, J. J. Villafranca. // Biochemistry. - 1980. - V. 19. - №24. - P. 5513-5519.

84. Eisenberg, D. Structure-function relationships of glutamine synthetases. / D. Eisenberg, H. S. Gill, G. M. Pfluegl, S. H. Rotstein. // Biochim. Biophys. Acta. -2000. - V. 1477. - №1-2. - P. 122-145.

85. Krajewski, W. W. Crystal structures of mammalian glutamine synthetases illustrate substrate-induced conformational changes and provide opportunities for drug and herbicide design. / W. W. Krajewski, R. Collins, L. Holmberg-Schiavone, T. A. Jones, T. Karlberg, S. L. Mowbray. // Journal of molecular biology. - 2008.

- V. 375. - №1. - P. 217-228.

86. Yoshida, A. Enzymic properties of alanine dehydrogenase of Bacillus subtilis. / A.Yoshida, E. Freese. // Biochim. Biophys. Acta. - 1965. - V. 96. - №2. - P. 248262.

87. Grimshaw, C. E.; Cleland, W. W. Kinetic mechanism of Bacillus subtilis L-alanine dehydrogenase. / C. E. Grimshaw, W. W. Cleland. // Biochemistry. - 1981.

- V. 20. - №20. - P. 5650-5655.

88. Baker, P. J. Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. / P. J. Baker, Y. Sawa, H. Shibata, S. E. Sedelnikova, D. W. Rice. // Nature structural biology. - 1998 - V. 5. - №7. - P. 561567.

89. LeJohn, H. B. Glutamate dehydrogenases of Thiobacillus novellus: kinetic properties and a possible control mechanism. / H. B. LeJohn, I. Suzuki, J. A. Wright. // Journal of Biological Chemistry. - 1968. - V. 243. - 1. - P. 118-128.

90. Rife, J. E. Kinetic mechanism of glutamate dehydrogenase. / J. E. Rife, W. W. Cleland. // Biochemistry. - 1980. - V. 19. - №11. - P. 2321-2328.

91. Baker, P. J. Subunit assembly and active site location in the structure of glutamate dehydrogenase. / P. J. Baker, K. L. Britton, P. C. Engel, G. W. Farrants, K. S. Lilley, D. W. Rice, T. J. Stillman. // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. -1992. - V. 12. - №1. - P. 75-86.

92. Li, M. The structure and allosteric regulation of mammalian glutamate dehydrogenase. / M. Li, C. Li, A. Allen, C. A. Stanley, T. J. Smith. // Archives of biochemistry and biophysics. - 2012. - V. 519. - №2. - P. 69-80.

93. Bulos, B. Kinetics of beef heart glutamic-alanine transaminase. / B. Bulos, P. Handler. // Journal of Biological Chemistry. - 1965. - V. 240. - №28. - P. 3283-3294.

94. Duff, S. M. The enzymology of alanine aminotransferase (AlaAT) isoforms from Hordeum vulgare and other organisms, and the HvAlaAT crystal structure. / S. M. Duff, T. J. Rydel, A. L. McClerren, W. Zhang, J. Y. Li, E. J. Sturman, C. Halls, S. Chen, J. Zeng, J. Peng, C. N. Kretzler, A. Evdokimov. // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2012. - V. 528. - №1. - P. 90-101.

95. Wratten, C. C. Product inhibition studies on yeast and liver alcohol dehydrogenases. / C. C. Wratten, W. W. Cleland. // Biochemistry. - 1963. - V. 2. -№5. - P. 935-941.

96. TriviC, S. Structure and function of yeast alcohol dehydrogenase. / S. TriviC, V. Leskovac. // Journal of the Serbian Chemical Society. - 2000. - V. 65. - №4. - P. 207-227.

97. Baskar, R. S. Yeast Alcohol Dehydrogenase Structure and Catalysis. / R. S. Baskar, S. Ramaswamy. // 2014.

98. Hoog, J. O. Mammalian alcohol dehydrogenases-a comparative investigation at gene and protein levels. / J. O. Hoog, L. J. Ostberg. // Chemico-biological interactions. - 2011. - V. 191. - №1-3. - P. 2-7.

99. Dickinson, F. M. A study of the kinetics and mechanism of yeast alcohol dehydrogenase with a variety of substrates. / F. M. Dickinson, G. P. Monger. // Biochemical Journal. - 1973. - V. 131. - №2. - P. 261-270.

100. Ganzhorn, A. J. Kinetic characterization of yeast alcohol dehydrogenases. Amino acid residue 294 and substrate specificity. / A. J. Ganzhorn, D. W. Green, A. D. Hershey, R. M. Gould, B. V. Plapp. // Journal of Biological Chemistry. - 1987. - V. 262. - №8. - P. 3754-3761.

101. MacGibbon, A. K. Kinetics of sheep-liver cytoplasmic aldehyde dehydrogenase. / A. K. MacGibbon, L. F. Blackwell, P. D. Buckley. // European Journal of Biochemistry. - 1977. - V. 77. - №1. - P. 93-100.

102. Bostian, K. A. Kinetics and reaction mechanism of potassium-activated aldehyde dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. / K. A. Bostian, G. F. Betts. // Biochemical Journal. - 1978. - V. 173. - №3. - P. 787-798.

103. Shortall, K. Insights into aldehyde dehydrogenase enzymes: a structural perspective. / K. Shortall, A. Djeghader, E. Magner, T. Soulimane. // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2021. - V. 8. - 659550.

104. Bradbury, S. L. Ordered binding of substrates to yeast aldehyde dehydrogenase. / S. L. Bradbury, W. B. Jakoby. // Journal of Biological Chemistry. - 1971. - V. 246.

- №6. - P. 1834-1840.

105. McCarthy, A. D. Ox glutamate dehydrogenase. Comparison of the kinetic properties of native and proteolysed preparations. / A. D. McCarthy, K. F. Tipton. // Biochemical Journal. - 1985. - V. 230. - №1. - P. 95-99.

106. Bergmeyer, H. U. IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of enzymes: Part 3. IFCC method for alanine aminotransferase (L-alanine: 2-oxoglutarate aminotransferase, EC 2.6. 1.2). / H. U. Bergmeyer. // Clinica chimica acta. - 1980. - V. 105. - №1. - P. 147-154.

107. King, E. L. A schematic method of deriving the rate laws for enzyme-catalyzed reactions. / E. L. King, C. Altman. // The Journal of physical chemistry. 1956. - V. 60. - №10. - P. 1375-1378.

108. Gerber, G. Hexokinase of human erythrocytes: purification, kinetic model and its application to the conditions in the cell. / G. Gerber, H. Preissler, R. Heinrich, S. M. Rapoport. // European journal of biochemistry. - 1974. - V. 45. - №1. - P. 3952.

109. Klocke, R. A. Permeability of human erythrocytes to ammonia and weak acids. / R. A. Klocke, K. K. Andersson, H. H. Rotman, R. E. Forster. // American Journal of Physiology-Legacy Content. - 1972. - V. 222. - №4. - P. 1004-1013.

110. Ren, S. QSAR analysis of membrane permeability to organic compounds. / S. Ren, A. Das, E. Lien. // Journal of drug targeting. - 1996. - V. 4. - №2. - P. 103107.

111. Naccache, P. Patterns of nonelectrolyte permeability in human red blood cell membrane. / P. Naccache, R. I. Sha'afi. // The Journal of General Physiology. - 1973

- V. 62. - №6. - P. 714-736.

112. Kothe, K. Redox metabolism of glutathione in the red blood cell. / K. Kothe, C. Sachsenroder, J. G. Reich. // Acta Biologica et Medica Germanica. - 1975. - V. 34. - №2. - P. 203-228.

113. Whillier, S. Glutamine and a-ketoglutarate as glutamate sources for glutathione synthesis in human erythrocytes. / S. Whillier, B. Garcia, B. E. Chapman, P. W. Kuchel, J. E. Raftos. // The FEBS journal. - 2011. - V. 278. - №№17. - P. 3152-3163.

114. Sass, M. D. Utilization of alpha-ketoglutarate by red blood cells for glutathione synthesis. / M. D. Sass. // Nature. - 1963. - V. 200. - №4912. - P. 1209-1210.

115. Niihara, Y. Increased red cell glutamine availability in sickle cell anemia: demonstration of increased active transport, affinity, and increased glutamate level in intact red cells. / Y Niihara, C. R. Zerez, D. S. Akiyama, K. R. Tanaka. // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. - 1997. - V. 130. - №1. - P. 83-90.

116. Young, J. D. Amino acid transport in human and in sheep erythrocytes. / J. D. Young, S. E. Jones, J. C. Ellory. // Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. - 1980. - V. 209. - №1176. - P. 355-375.

117. MATLAB Version: 9.9.0 (R2020b); The MathWorks Inc.: Natick, MA, USA, 2020. Available online: https: //www. mathworks .com (accessed on 25 April 2023).

118. OriginLaB Version 9.8.0.200; OriginLab Corporation: One Roundhouse Plaza, Suite 303 Northampton, MA 01060 USA, 2020. Available online: https: //www. originlab. com

119. Olson, J. A. Kinetic and equilibrium studies on crystalline L-glutamic acid dehydrogenase. / J. A. Olson, C. B. Anfinsen. // Journal of Biological Chemistry. -1953. - V. 202. - №2. - P. 841-856.

120. Levintow, L. Reversibility of the enzymatic synthesis of glutamine. / L. Levintow, A. Meister. // Journal of Biological Chemistry. - 1954. - V. 209. - №1. -P. 265-280.

121. Protasov, E. Theoretical analysis of the built-in metabolic pathway effect on the metabolism of erythrocyte-bioreactors that neutralize ammonium. / E. Protasov, L. Koleva, E. Bovt, F. I. Ataullakhanov, E. Sinauridze. // Metabolites. - 2021. - V. 11. - №1. - 36.

122. Borsakova, D. V. Ways to increase the activity of glutamate dehydrogenase in erythrocyte-bioreactors for the ammonium removal. / D. V. Borsakova, E. S. Protasov, S. V. Nazarenko, Y. G. Alexandrovich, A. A. Butylin, F. I. Ataullakhanov, E. I. Sinauridze. // Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. - 2019. - V. 13. - P. 212-224.

123. Borsakova, D. V. Ammonium removal by erythrocyte-bioreactors based on glutamate dehydrogenase from Proteus sp. jointly with porcine heart alanine

aminotransferase. / D. V. Borsakova, L. D. Koleva, E. S. Protasov, F. I. Ataullakhanov, E. I. Sinauridze. // Scientific Reports. - 2022. - V. 12. - №№1. - 5437.

124. Protasov, E. Prediction of Oscillations in Glycolysis in Ethanol-Consuming Erythrocyte-Bioreactors. / E. Protasov, M. Martinov, E. Sinauridze, V. Vitvitsky, F. Ataullakhanov. // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - V. 24. -№12. - 10124.

125. Sel'Kov, E. E. Self-Oscillations in Glycolysis 1. A Simple Kinetic Model. / E. E. Sel'Kov. // European Journal of Biochemistry. - 1968. - V. 4. - №1. - P. 79-86.

126. Brechmann, P. Unbounded solutions of models for glycolysis. / P. Brechmann, A. D. Rendall. // Journal of mathematical biology. - 2021. - V. 82. - P. 1-23.

127. Andrés, V. Oscillatory synthesis of glucose 1, 6-bisphosphate and frequency modulation of glycolytic oscillations in skeletal muscle extracts. / V. Andrés, V. Schultz, K. Tornheim. // Journal of Biological Chemistry. - 1990. - V. 265. - №35.

- P. 21441-21447.

128. Gustavsson, A. K. Sustained glycolytic oscillations in individual isolated yeast cells. / A. K. Gustavsson, D. D. Van Niekerk, C. B. Adiels, F. B. Du Preez, M. Goksor, J. L. Snoep. // The FEBS journal. - 2012. - V. 279. - №16. - P. 2837-2847.

129. Weber, A. Partial synchronisation of glycolytic oscillations in yeast cell populations. / A. Weber, W. Zuschratter, M. J. Hauser. // Scientific Reports. - 2020.

- V. 10. - №1. - 19714.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность своему научному руководителю Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову и заведующему лабораторией физиологии и биофизики клетки ЦТП ФХФ РАН Елене Ивановне Синауридзе за всестороннюю помощь в выработке концепции работы и обсуждении ее результатов. Я благодарю бывших и действующих сотрудников лаборатории биофизики НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева - Дарью Валериевну Борсакову, Ларису Дмитриевну Колеву, Елизавету Андреевну Бовт, Никиту Сергеевича Кушнира, Анну Сергеевну Суворову, Виктора Марьяновича Витвицкого, и Михаила Вячеславовича Мартынова за плодотворную совместную работу над научными проектами, составившими основу настоящей диссертации. Также выражаю благодарность всему коллективу лаборатории биофизики НИМЦ ДГОИ им. Д. Рогачева и ЦТП ФХФ РАН.