Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Зиятдинов, Михаил Харисович

• Зиятдинов, Михаил Харисович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зиятдинов, Михаил Харисович

Оглавление

Список используемых сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи работы

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

1.4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

2. Обзор литературы

2.1. Происхождение углеродного скелета цистеина

2.2. Транспорт сульфата в клетку

2.3. Восстановление серы от степени окисления +6 до -2

2.4. Энергетические затраты на синтез углеродного скелета цистеина

2.5. Токсичность цистеина

2.6. Цистеин в качестве антиоксиданта

2.7. Регуляция биосинтеза цистеина

2.7.1. Регуляция экспрессия СуБ-регулона

2.7.2. Регуляция потока углерода от 3-фосфоглицерата до цистеина

2.8. Ферменты, катализирующие превращение серина в цистеин

3. Материалы и методы исследования

3.1. Бактериальные штаммы и среды

3.2. Конструирование штаммов

3.3. Определение активности глутатионредуктазы

3.4. Определение активности Э-сульфоцистеин редуктазы

3.5. Определение активности Ь-серин-О-ацетилтрансферазы

3.6. Компьютерное моделирование каталитического сайта Ь-серин-О-ацетилтрансферазы

3.7. Получение мутаций в гене суэЕ методом рандомизации

4. Результаты исследований и обсуждение

4.1. Получение и изучение мутантных вариантов серинацетилтрансферазы (САТ), устойчивых

к ингибированию цистеином

4.2. Изучение процессов транспорта предшественника цистеина, О-ацетилсерина

4.3. Изучение восстановления Б-сульфоцистеина до цистеина

клетками кишечной палочки

4.4. Изучение функции продукта гена уфЫ

5. Выводы

6. Список литературы

Список используемых сокращений

ФГД - 3-фосфоглицератдегидрогеназа; CAT - серинацетилтрансфераза

ОАСС - О-ацетилсеринсульфгидрилаза, или цистеинсинтаза ОАС - О-ацетилсерин NAC, NAS - N-ацетилсерин PEP - фосфоенолпируват

АТФ, АДФ, АМФ - аденозинтри-..., аденозинди-..аденозинмонофосфат Acetyl-CoA, СоА (CoASH) - ацетилкофермента А, кофермент А NADH, NAD+ - восстановленная и окисленная форма никодинамиддинуклеотида

NADPH, NADP+ - восстановленная и окисленная форма фосфата

никотинамиддинуклеотида

2-КГ - 2-кетоглутарат

РРР - пентозофосфатный путь метаболизма Сахаров ПЦР - полимеразная цепная реакция

Использовались общепринятые сокращенные названия антибиотиков, а также аминокислот как в свободном виде, так и находящихся в виде аминокислотных остатков в составе белков.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli»

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы.

Работа посвящена исследованию некоторых аспектов биосинтеза L-цистеина кишечной палочкой Escherichia coli К12. Аминокислота L-цистеин (далее цистеин) является одной из двух канонических аминокислот, содержащих в своем составе атом восстановленной серы (S " ), который включается в предшественник цистеина, О-ацетилсерин, превращая его в цистеин, а эта аминокислота уже служит донором серы для синтеза второй серусодержащей аминокислоты, L-метионина. Биосинтез цистеина, включая восстановление атома серы сульфат-иона до S" , осуществляют микроорганизмы и растения, тогда как животные и, в том числе человек, не способны к сульфат-редукции и нуждаются поэтому в том или ином источнике восстановленной серы. Такими источниками может быть и цистеин, и метионин, а также некоторые другие серусодержащие биологические молекулы.

Роль цистеина в составе белков уникальна в связи со свойствами тиоловой (-SH) функциональной группы. Окисляясь, она образует ковалентную связь с тиоловой группой другого остатка цистеина, находящегося в той же полипептидной цепи или в составе другой, образуя дисульфидный мостик. Наряду с разветвленными аминокислотами, метионином и тирозином, остатки цистеина в составе белков отличаются гидрофобностью и участвуют в гидрофобных взаимодействиях между белковыми молекулами, сообщая им волокнистую структуру. С этим связано обилие цистеина в белках типа кератина в волосе, перьях и когтях. Кроме структурной функции цистеиновые остатки часто входят в состав каталитических центров ферментов, поскольку тиоловая группа может служить нуклеофилом в различных биохимических реакциях.

Потребность в цистеине постоянно растет. По оценкам экспертов суммарная годовая продукция цистеина в мире составляет около 3,2 тыс тонн (45 млн долларов). Он используется в пищевой промышленности, например, в хлебопечении, улучшая качество выпечки. Его добавка к мясным продуктам усиливает характерный мясной аромат, который обусловлен реакцией между цистеином и сахарами. Эффективна добавка цистеина в корм овец для увеличения производства шерсти, которая очень богата этой аминокислотой. Интересно, что сейчас созданы трансгенные овцы, в геном которых введены гены, обеспечивающие эндогенный синтез цистеина. Применение цистеина в медицине обусловлено высокой реакционной способностью его тиоловой группы. Он применяется для детоксикации при отравлении тяжелыми металлами, образуя прочные связи с ними. Цистеин ускоряет метаболизацию уксусного альдегида, токсичного продукта окисления этанола в организме, ответственного за похмельный синдром. Производное цистеина 1чГ-ацетилцистеин широко используется в качестве лекарственного средства для борьбы с легочными явлениями, так как способствует разжижению мокроты, а также для детоксикации при некоторых отравлениях, что связывают с увеличением образования глутатиона, в состав которого входит цистеин.

К настоящему времени разработаны биотехнологические методы получения практически всех двадцати канонических аминокислот, входящих в состав белков, а также аминокислот, промежуточных продуктов биосинтеза этих аминокислот, таких как гомосерин, орнитин, цитруллин и др. Нерешенной остается . проблема биотехнологического получения серусодержащих аминокислот: цистеина и метионина. Это, видимо, связано с большой затратой биологической энергии для восстановления серы из ее основного источника, сульфата, а также с необычайно высокой токсичностью цистеина, который должны сверхпродуцировать клетки бактерий. Кроме того, ключевой фермент собственно биосинтеза цистеина, серин-О-ацетилтрансфераза, чрезвычайно чувствительна к ингибированию цистеином. При этом связывающий цистеин

сайт является одновременно сайтом связывания своего субстрата, серина. Поэтому существующие мутации, ведущие к повышению устойчивости к ингибированию цистеином, ухудшали каталитические свойства этого фермента. Решение указанных проблем позволит получить эффективные продуценты цистеина, а позднее и метионина, для синтеза которого цистеин является донором восстановленной серы.

В настоящее время цистеин получают в основном путем гидролиза перьев птиц и человеческих волос с последующим выделением из смеси продуктов гидролиза. Полученный таким способом цистеин не является достаточно приемлемым продуктом на мировом рынке в силу несоответствия религиозным и культурным традициям ряда народов. Некоторое количество цистеина получают путем микробиологической конверсией 2-амино-Д2-тиазолин-4-карбоновой кислоты, которую предварительно получают органическим синтезом. Возможно также, что цистеин получают и биосинтезом без использования его предшественников с помощью продуцирующих эту аминокислоту микроорганизмов, полученных транснациональной компанией "Вакер Хеми АГ", которой принадлежат патенты на соответствующий способ получения цистеина; есть также научные публикации, основанные на этих патентах [1, 2]. Этот способ основан на применение штаммов Escherichia coli, с мутацией в гене cysE, частично освобождающей соответствующий фермент от ретроингибирования цистеином. Кроме того, в штаммах супер-экспрессирован ген ydeD, кодирующий белок-экспортер цистеина, что снижает токсическое действие цистеина на клетки кишечной палочки.

Наша работа направлена на изучение некоторых аспектов биосинтеза цистеина кишечной палочки, результаты которой могут быть использованы для дальнейшего развития микробиологического метода получения цистеина ферментацией без использования каких-либо его предшественников.

1.2. Цели и задачи работы

1) Исследования, изложенные в настоящей диссертационной работе, направлены на изучение некоторых особенностей биосинтеза и метаболизма цистеина у кишечной палочки, имеющих практическое значения для создания эффективных бактериальных продуцентов этой аминокислоты и, в частности, на решение задачи десенсибилизации ключевого фермента биосинтеза цистеина серин-О-ацетилтрансферазы (CAT) к ингибированию цистеином. В известных штамма-продуцента цистеина эта задача решена лишь частично. Ее решение осложняется тем, что ингибиторная молекула цистеина отличается от молекулы субстрата, серина, лишь заменой атома кислорода на атом серы. Обе эти молекулы конкурируют за один и тот же центр связывания, образуя практически одинаковые водородные связи с аминокислотными остатками CAT. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

• На основании ранее опубликованной структуре CAT, содержащей цистеин в каталитическом центре, построить трехмерную компьютерную модель центра связывания серина, в который поместить серин.

• Сравнить трехмерные структуры центра, связанного с цистеином и серином, с целью определения тех аминокислотных остатков CAT, которые более важны для связывания цистеина.

• С помощью рандомизированного мутагенеза участков гена cysE (кодирующего CAT) изменить пространственное положение аминокислотных остатков, взаимодейтсвующих с цистеином , но не с серином.

• Отобрать мутанты с рандомизированными участками гена cysE и изучить каталитические свойства мутантных CAT, сравнив их со свойствами известных.

2) После получения мутантов по гену cysE с высокой степенью устойчивости к ингибированию цистеином выяснилось, что такие мутантны экскретируют не только цистеин, но и О-ацетилсерин (ОАС), продукт реакции, катализируемой мутантной CAT, что связано с недостаточностью

последующей реакции биосинтеза цистеина. Это вещество довольно быстро и необратимо изомеризуется с образованием N-ацетилсерина, который уже не используется клетками для синтеза цистеина. Таким образом, происходит потеря субстрата для образования цистеина. Представляло научный и практический интерес обнаружение транспортных систем, участвующих в поглощение ОАС клетками из внешней среды. В связи с этим решались следующие задачи:

• Индуцировать мутации, приводящие к неспособности усвоения ОАС.

• Используя плазмидные банки хромосомы E.coli, выявить плазмиды, комплементирующие эти мутации, и путем определения нуклеотидных последовательностей вставок в плазмиды идентифицировать гены, контролирующие процесс транспорта.

3) Целью нашей работы являлась изучение превращения одного из продуктов реакции последнего этапа биосинтеза цистеина, S-сульфоцистеина, в цистеин. Это вещество образуется вместо цистеина при использовании тиосульфата в качестве источника серы и может накаливаться в среде роста. Были поставлены следующие задачи:

• Определить, является ли процесс превращения S-сульфоцистеина в цистеин чисто химическим или зависимым от белковых факторов и идентифицировать их.

• Найти транспортные системы, проводящие S-сульфоцистеин из среды внутрь клеток.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

На основании компьютерного моделирования центра связывания CAT с конкурирующими лигандами (серин и цистеин) сделаны предсказания, касающиеся модификации первичной структуры этого центра. В соответствии с этими предсказаниями методом рандомизированного мутагенеза удалось отобрать мутантные формы CAT со сниженным сродством к ингибитору при

сохранении каталитической активности. Полученные мутации использовались для создания продуцентов цистеина, которые защищены российским и зарубежными патентами и нашли применение в промышленном производстве цистеина в Японии.

Изучен ранее не известный генетический контроль поглощения предшественника цистеина, О-ацетилсерина, клетками кишечной палочки. Показано участие ряда помп, предположительно относящихся к группе факторов множественной лекарственной устойчивости (МагС, УсЬЕ, УЬ^К и 8с18КС)Р) в транспорте О-ацетилсерина. Обнаружена также способность ранее известного транспортера олигопептидов Ус^Я транспортировать О-ацетилсерин.

Установлены белковые факторы, участвующие в восстановлении 8-сульфоцистеина до цистеина. Обнаружен ген уфЫ, кодирующий белок-импортер 8-сульфоцистеина. Полученные данные могут быть использованы при разработке способов микробиологического получения серусодержащих веществ.

На основе природного промотора гена п1рЭ сконструирован методом рандомизированного мутагенеза эффективный промотор для экспрессии генов, функция которых важна в ходе длительных процессов. Промотор нашел применение в данном и последующих исследованиях.

Апробация дисседтащ«!, состоялась 8 апреля 2013 года на заседании Ученого Совета ' «Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу : 117545, г. Москва, 1-й Дорожный пр., д.1

Диссертационная работа изложена на страницах и содержит 7 таблиц и 14 рисунков, а также 118 ссылок на научную литературу.

/

1.4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Kutukova ЕА, Livshits VA, Altman IP, Ptitsyn LR, Zyiatdinov MH, Tokmakova IL, Zakataeva NP. (2005) The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett. 579 (21):4629-34.

2) Kai Y, Kashiwagi T, Ishikawa K, Ziyatdinov MK, Redkina EI, Kiriukhin MY, Gusyatiner MM, Kobayashi S, Takagi H, Suzuki E. (2006). Engineering of Escherichia coli L-serine O-acetyltransferase on the basis of crystal structure: desensitization to feedback inhibition by L-cysteine. Protein Eng Des Sel. 2006, 19(4): 163-7.

3) Касиваги Т., Каи Ю., Исикава К., Сузуки Э., Такаги X., Зиятдинов М.Х., Редькина Е.И., Гусятинер М.М (2003). Мутантная серинацетилтрансфераза..., Патент России 2279477,

Патент США US7312058, Mutant serine acetyltransferase.

Европейский патент ЕР 1650296, Mutant serine acetyltransferase and process for producing L-cysteine.

4) Зиятдинов M.X., Самсонов B.B., Гусятинер М.М. (2009). Способ получения L-цистеина, L-цистина, S-сульфоцистеина или тиазолидинового производного L-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458982 (2012).

5) Зиятдинов М.Х., Самсонов В.В., Гусятинер М.М. (2010). Способ получения L-цистеина с использованием бактерий семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458981 (2012). Заявка на патент в США 20120237986А1

2. Обзор литературы 2.1. Происхождение углеродного скелета цистеина.

Для образования цистеина используется углеродный скелет серина, и суть превращения серина в цистеина сводится к замене гироксильной группы на сульфгидрильную, что протекает в две ферментативные стадии.

Серинацетилтрансфераза (CAT), 0-ацетилсерин(тиол)лиаза,

cysE cysK, cysM

Серии -+ О-ацетилсерин -► Цистеин

Acetyl-CoA СоА S"2 acetate

Вначале под действием продукта гена cysE, серинацетилтрасферазы (CAT), ацетильная группа ацетил-КоА переносится на углеродный скелет серина, образуя О-ацетилсерин (ОАС). Затем происходит замещение ацетильной группы ОАС на сульфгидрильную. Донором восстановленной серы S"2 служит продукт заключительной стадии восстановления сульфата (сульфат-редукция рассмотрена ниже) или присутствующий в клетке ионы HS" или S Эту стадию могут катализировать две изоферментные цистеинсинтазы А и В, кодируемые гена cysK и cysM (другие названия этих ферментов О-ацетилсерин-(тиол)-лиаза-А и -В или О-ацетилсеринсульфгидрилаза-А и -В, соответственноуу [3, 4, 5]. Причем, если продукт первого гена использует только серу S" в виде иона HS", то продукт гена cysM использует также и тиосульфат-ион, образуя в этом случае не цистеин, а другое серусодежащее производное цистеина, S-сульфоцистеин [6, 7]. Точный механизм превращения S-сульфоцистеина в цистеин не известен. По мнения Кредича он представляет

собой либо гидролиз с освобождением сульфата и образованием цистеина, либо восстановление глутатионом с образованием сульфита и цистеина [8]. Один из разделов нашей работы посвящен решению данного вопроса.

Есть данные о том, что CAT и О-ацетилсеринсульфгидилаза (ОАСС-А) образуют in vivo бифункциональный комплекс (CysE)6 х (CysK)2 [9, 10]. Этот комплекс диссоциирует при накоплении в клетках ОАС (подробнее об этом ниже), что является сигналом дефицита восстановленной серы. ОАС участвует и в другом регуляторном пути. Накапливаясь в клетке, ОАС спонтанно и необратимо изомеризуется при переносе ацетильной группы с кислорода на азот аминной группы, в результате образуется N-ацетилсерин (NAC). Этот процесс идет медленно при значении pH 7,6 (1% в мин) и 10 раз быстрее при pH 8.6 [11]. NAC усиливает экспрессию генов, контролирующих образование восстановленной серы (Cys-регулон, под контролем продукта регуляторного гена cysB). Показано, что ОАС также обладает этой способностью, однако гораздо в меньшей степени, чем NAC [12]. Очевидно, что регуляторная роль ОАС и NAC состоит в координировании скорости синтеза углеродного скелета цистеина и скорости восстановления серы из сульфата.

2.2. Транспорт сульфата в клетку

Наиболее важным из неорганических источников серы для большинства микроорганизмов являются сульфаты, в которых сера находится в своей высшей степени окисления +VI. При восстановлении серы до степени окисления -II (состояние сульфида) требуется приобретение 8 электронов от соответствующих восстановителей. Но вначале сульфат должен попасть в

л

клетку. Очевидно, заряженный ион S04 " не может проникнуть в клетку через мембрану путем диффузии. Такой процесс нуждается в энергии и требует специализированной транспортной системы. Гены, контролирующие транспорт сульфат-иона в кишечной палочки объединены в оперон cysPTWAM [13], экспрессия которого подвержена регуляции с участием продукта гена

cysB, которая присуща всем генам сульфатредукции и генам cysK и cysM, контролирующим заключительный этап биосинтеза цистеина из серина. Продукты генов оперона (их функции предсказаны на основании сходства белковых последовательностей с белками с установленными функциями):

• CysP - периплазматический связывающий сульфат белок;

• CysT (обозначается также CysU) - мембранный белок;

• CysW - второй мембранный белок;

• CysA - связывающий АТР белок;

• CysM - цистеинсинтаза В, упомянутая выше, не имеет отношения к транспорту сульфата.

В транспорте сульфат-иона участвует также еще один, помимо CysP, сульфат-связывающий белок, кодируемый геном sbp, который расположен в хромосоме вне оперона cysPTWAM [14]. Структурные данные об этом транспортере отсутствуют, но на основании косвенных данных считается, что структура транспортера предположительно следующая (Рис.1)

ssul fate/th ios ul fate

Рис. 1. Предполагаемое строение транспортера сульфата и тиосульфата у грам-отрицательных бактерий (по С. Пильщику и А. Пажевски [15]).

Предполагается, что между двумя частями транспортера образуется трансмембранный канал, по которому сульфат-ион (а также родственные ему

ионы, такие как тиосульфат-ион, селенат-ион и т.п.) проникают из внешней среды во внутриклеточное пространство (Рис.1). Роль ловушек для сульфат-иона из внешней среды выполняют две альтернативные субъединицы Spb и CysP. Показано, что они взаимозаменяемы, но мутации одновременно по обоим соответствующим генам полностью блокируют транспорт через данную транспортную систему. Все же считается, что субъединица CysP более эффективно связывает тиосульфат-ион, чем Spb. В целом, эти белки имеют перекрывающиеся функции [14, 15].

Показано, что эта транспортная система способна переносить также и молибдат-ион, но какая из субъединиц (sbp или CysP) участвует в этом процессе - неизвестно [16, 17]. Важно отметить, что транспорт сульфата энергозависимый (транспортер типа ABC) и нуждается как минимум в одном моле АТР на моль транспортируемого в клетку вещества.

2.3. Восстановление серы от степени окисления +6 до -2.

Вначале происходит подготовка к первому этапу окисления (активация сульфата), с участием АТР :

сульфат-ион + АТР = аденозин-5-фосфосульфат (APS) + Р-Р (1) Сульфатаденилилтрансфераза, катализирующая эту реакцию, состоит из двух неидентичных субъединиц [(CysD)(CysN)]4) и соответственно кодируется двумя генами cysD и cysN, входящими в оперон cysDNC [18, 19].

Следует отметить, что эта реакция термодинамически направлена не в сторону APS, а наоборот, - в направлении синтеза АТР, так как AGO гидролиза связи сульфата с фосфатом в составе APS (-19 Ккал/моль) значительно выше по абсолютной величине, чем соответсвующая величина гидролиза связи фосфат-фосфат в составе АТР (-10,7 Ккал/ моль). Константа равновесия этой реакции при физиологических условиях 5x10"9 [20]. В связи с необычно высокой потребностью в энергии для протекания реакции в направлении ассимиляции серы сама реакция и соответствующий фермент тщательно изучались в течение

последних двадцати лет. Возможность протекания этой реакции удалось объяснить [21]. Был обнаружен протяженный район большей субъединицы (CysN), имеющий сходство в аминокислотной последовательности с ферментами, связывающими и использующими GTP. Оказалось, что

л

действительно GTP участвует в этой реакции, что приводит к гидролизу одной связи Р-Р в его молекуле. Причем промежуточные стадии главной реакции переплетены со стадиями гидролиза GTP так, что отдельно эти реакции невозможны [22, 23, 24 ]. Таким образом, суммируя реакцию (1) с гидролизом GTP, получаем:

сульфат-ион + ATP + GTP = аденозин-5-фосфосульфат (APS) + Р-Р + GDP + Р (2). Возможность протекание этой реакции в указанном направлении зависит также и от активности клеточных пирофосфатаз, расщепляющих пирофосфат до двух молекул фосфорной кислоты, а этот процесс находится в зависимости от отношения внутриклеточных концентраций дифосфат/монофосфат. Очевидно также, что снижение концентрации другого продукта данной реакции, APS, под действием следующего фермента в пути сульфатредукции благоприятствует течению реакции.

На следующем этапе подготовки к восстановлению серы происходит фосфорилирование продукта первой реакции, APS, опять же за счет АТР с образованием фосфоаденозин-5-фосфосульфата (PAPS):

APS + ATP = PAPS + ADP (3) По всей видимости эта вторая реакция нужна лишь для того, чтобы способствовать протеканию первой реакции (образование APS), снижая концентрацию продукта реакции. Аденилсульфаткиназа, катализирующая реакцию (3) второго подготовительного ассимиляции серы, кодируется геном cysC, входящим в состав упомянутого выше оперона cysDNC. Аденилсульфаткиназа представлена в клетке гомодимером [CysC]2, но в дефосфолирированном состоянии образует тетрамер [17,26, 27]

Сера в высшей степени окисления в составе PAPS способна восстанавливаться до степени окисления +4, получая два электрона от восстановленной формы соответствующего фермента:

PAPS + red-CysH = S032" + аденозин-3,5-дифосфат (PAP) + ox-CysH (4) Эту реакцию катализирует PAPS-редуктаза [CysH]2, кодируемая геном cysH, находящимся в составе оперона cysJIH, в котором остальные гены контролируют следующий этап восстановления серы [28-31].

В ходе реакции происходит передача одного электрона от остатков цистеина от каждой из двух молекул восстановленной формы фермента CysH, в результате чего фермент переходит в окисленную форму и уже неспособен катализировать реакцию до его последующего восстановления. Окисленная форма CysH имеет удвоенную молекулярную массу по сравнению с восстановленной, что указывает на образование дисульфидного мостика между его субъединицами. В экспериментах in vitro показано, что окисленная форма 3-фосфоаденилсульфатредуктазы может быть восстановлена как тиоредоксинами Trxl и Тгх2, так и глутаредоскином Grxl. Остается все же не ясно, какой из этих пептидов используется in vivo [32].

Интересно, что фермент регулируется глутатионом: если создаются окислительные условия, то глутатион образует дисульфидный мостик с Cys239 этого фермента, блокируя ферментативную активность, а любой из известных глутаредоксинов способен восстановить ферментативную активность, т.е. разорвать этот мостик [33].

Наиболее вероятным переносчиком электронов на PAPS-редуктазу считается малый белок тиоредоксин, который, передав электроны, должен вновь их получить [32]. Этот процесс происходит с участием NADPH-зависимой тиоредоксинредуктазы (ген trxB). Если же этим переносчиком электронов является глутаредоксин, то возможно глутаредоксинредуктаза катализирует его восстановлением (соответствующий ген не аннотирован среди генов кишечной палочки). Известно однако, что восстановленный глутатион может

восстанавливать глутаредоксин, что катализируется глутатионредуктазой, ген gor для которой известен. Этот фермент также является NADPH-зависимым. Таким образом, каким бы ни был промежуточный транспортер электронов для реакции PAPS-редуктазы, исходным донором электронов оказывается NADPH. Пути переноса электронов для восстановления серы в составе PAPS могут быть представлены следующим образом:

1 е-

2 е-

2 е-

NADPH

->• глутатион

глутаредоксин

1 е-

CysH

CysH

или при участии тиоредоксина:

2 е-

NADPH -

Тиоредоксин

1 е-

CysH

CysH

л+6

4+6

Рис. 2. Возможные пути передачи электронов при восстановлении серы от степени окисления +У1 до +1У.

Побочным продуктом этого двух-электронного восстановления серы является PAP, дальнейшая судьба которого не вполне ясна. Логичным выглядел бы перенос 5-фосфата на какой-то акцептор, а образующийся при этом AMP мог бы регенерировать в АТР обычным путем. Однако, кишечная палочка не способна к такой реакции, вместо этого клетки просто удаляют лишний фосфат под действием РАР-фосфатазы, кодируемой геном cysQ [34]. Этот фермент ингибируется кальцием и литием, и является основной мишенью ингибирования роста кишечной палочки литием. Мутанты по гену cysQ нуждаются при росте на минимальной среде в цистеине или в сульфите [35]. Полагают, что это связано с накоплением PAP в клетке и с его ингибирующим действием на порождающий его фермент, блокируя синтез цистеина. Можно

предложить и иное объяснение. Так как CysQ обладает также и олигонуклеотидазной активностью [34], необходимой для роста кишечной палочки, то добавление в среду цистеина или сульфита вызывает репрессию синтеза ферментов Cys-регулона и в том числе PAPS-редуктазы, что снижает продукцию PAP.

С точки зрения энергетики процесса восстановления сульфат важно отметить, что АТР, который связывает сульфат в первой реакции пути восстановления серы, в конечной итоге превращается в AMP, теряя две макроэргические связи.

Завершающая стадия восстановления серы - это шестиэлектронное восстановление сульфита (степень окисление +4) до сульфида (степень окисления -2). Этот процесс проходит в один этап под действием сульфитредуктазы. Две субъединицы, одна из которых продукт гена cysJ, а вторая - cysl, образуют мультимерный гемофлавопротеиновый ферментативный комплекс [(CysJ)8] [(Cysl)] 4. Гены cysJ и cysl, входят, как уже указывалось, в состав оперона cysJIH.

Фермент катализирует NADPH-зависимое восстановление сульфита:

3 NADPH + S032' +5Н+ <=> 3 NADP+ + H2S + 3 Н20 (5) Большое количество исследований в период 1970 - 2000 годов было посвящено изучению этого фермента [36-40], в результате которых было показано следующее. Каждая из CysJ субъединиц связывает по одной молекуле FAD и FMN в качестве простетических групп, тогда как каждая субъединица Cysl содержит кластер Fe4S4, а также особый вид гемма, сирогем, который вначале был найден только в составе этого фермента, выделенного из кишечной палочки, а затем обнаружено его присутствие во многих ферментных системах различных организмов. Как оказалось, сирогем участвует в некоторых важных окислительно-восстановительных процессах [41]. FAD получает электроны от NADPH и передает их металлическим центрам

субъединицы Cysl, откуда они используются для восстановления сульфита [42].

С точки зрения энергетики при восстановление серы от сульфата (S+6) до сульфида (S") расходуется 4 молекулы NADPH, 2 молекулы АТР и одна молекула GTP. Учитывая тот факт, что одна из молекул АТР превращается в AMP с гидролизом двух макроэргических связей, и расход на их регенерацию эквивалентен расходованию двух молекул АТР, а также то, что для регенерации молекулы GDP требуется молекула АТР, получаем 4 молекулы АТР. Если принять во внимание расход АТР на транспорт сульфат-иона из окружающей среды внутрь клеток, то итоговая потребность в энергетических молекулах на атом восстановленной серы из сульфата составляет 4NADPH + 5 АТР.

2.4. Энергетические затраты на синтез углеродного скелета цистеина.

Рассмотрим затраты энергетических молекул (NADPH, NADH, АТР) на синтез углеродного скелета цистеина. На рис.3 показан путь превращения внеклеточной глюкозы в цистеин. Поглощенная клетками глюкоза превращается в гликолитическом пути в две молекулы 3-фосфоглицерата, которые далее выходят из пути гликолиза и превращаются сначала в две молекулы серина, а затем - в две молекулы цистеина.

На синтез двух молекулы цистеина (для удобства расчета, чтобы избежать дробных величин), помимо молекулы глюкозы, расходуются или образуются следующие молекулы:

Транспорт глюкозы (фосфоэнолтрансферазная система) - расходуется 1 молекула PEP с образованием пирувата. Регенерация PEP из пирувата теоретически возможна в клетках кишечной палочки с участием фермента РЕРсинтазы (ген pps), при этом расходуется молекула АТР, которая превращается в AMP, что эквивалентно расходу 2-х молекул АТР при их гидролизе до ADP.

В пентозофосфатный

ПУТЬ

zwf

Далее в гликолиз и

R пик п Кпрбгя

gpmA

Глюкоза (вне клетки)

РЕР

V

Pyruvate Глюкозо-6-фосфат

V

ATP

adp

Фруктозо -6- фосфат

V

Фруктозо -1,6 -дифосфат

V

Глицероальдегид -3-фосфат

nad+

<

nadh adp

АТР

V

1, З-Дифосфоглицерат

V

nad+

3 -Фосфоглицерат

pgi

pflcA vfkB

jbaA fbaB

gapA

Pgk

serA

V

nadh З-Фосфогидроксипируват

Glutamate

V

2-oxoglutarate фосфосерИН

Acetyl-CoA

V

L-серии

v

О-ацетилсерин

serC

serB cysE

cysK cysM

Acetate L-Цистеин

Рис. 3. Путь превращения внеклеточной глюкозы в углеродный скелет цистеина по пути гликолиза.

Гликолитическая часть пути, сериновый путь и собственно цистеиновый путь - вначале расходуется 1 молекула АТР, а затем из ADP путем субстратного

фосфорилирования образуются 2 молекулы АТР. В итоге синтез одной молекулы цистеина вызывает образование 1 молекулы АТР.

4 молекулы NAD+ восстанавливаются с образованием 4-х молекул NADH. Однако молекула глутаминовой кислоты передает свою аминогруппу, превращаясь в 2-оксоглутаровую кислоту. Для регенерации глутаминовой кислоты из 2-оксоглутаровой требуется как минимум 1 молекула NADPH в ходе глутаматдегидрогеназной реакции (GdhA), другой путь регенерации глутаминовой кислоты еще более расточительный (GlnA-GOGAT). Для синтеза 2-х молекул цистеина на регенерацию глутамата необходимо затратить 2 молекулы NADPH.

В ходе двух последних реакции собственно цистеинового пути потребляется молекула ацетил-КоА и освобождается молекулы КоА и ацетата. Для регенерации из них ацетил-КоА по пути ацетат - ацетилфосфат - ацетил-КоА требуется одна молекула АТР с образованием ADP (или 2 молекулы на две молекулы цистеина) В более эффективном пути регенерации ацетил-КоА также расходуется молекула АТР, но при этом гидролизуется не одна, а две фосфодиэфирных связи и образуется молекула AMP.

Таким образом, в ходе создания 2-х углеродных скелетов цистеина из глюкозы потребуется 2 + (-1) +2= 3 АТР. Образуется 4 молекулы NADH, но расходуются 2 молекулы NADPH.

На один углеродный скелет цистеина баланс следующий. Расходуется: 1,5 молекул АТР и 1 молекула NADPH; образуется : 2 молекулы NADH. С учетом расхода на сульфатредукцию получаем, что при использовании глюкозы в качестве источника углерода и энергии на синтез одной молекулы цистеина, помимо углерода глюкозы, потребуется 5NADPH + 6,5 АТР, но образуется 2NADH.

Учитывая возможность трансгидрогеназы пиридиновых нуклеотидов (ген sthA, второе названием udhA) регенерировать (восстанавливать) NADP+ до NADPH, используя NADH в качестве восстановителя, можно считать, что

на синтез молекулы цистеина расходуется 3 молекулы NADPH и 6,5 молекул АТР. Однако, надо понимать, что реальное соотношение субстратов и продуктов этой энергонезависимой реакции складывается не в пользу данного направлению реакции. Более вероятно энергозависимое превращение, катализируемое мембранной трансгидрогеназой PntAB [43, 44]. Эта реакция происходит с использованием мембранного потенциала, то есть, требует энергии дополнительного количества NADH для его восстановления. Можно также считать, что образующиеся 2 молекулы NADH передают свои электроны в дыхательную цепь, и происходит синтез АТР из ADP на клеточных мембранах АТР-синтазами. В этом случае потребность в энергетических молекулах следующая: 5NADPH + 2,5АТР.

Независимо от способа расчета ясно, что для синтеза цистеина часть глюкозы должна использоваться для снабжения энергетическими молекулами. Это может быть достигнуто двумя способами. Клетка может направить часть или весь пул глюкозо-6-фосфата в пентозофосфатный путь, где окисление углеводов происходит не за счет NAD+ как в гликолизе, а за счет NADP+ и образуется необходимый для синтеза цистеина NADPH. Второй путь генерации необходимых для синтеза цистеина энергетических молекул - это направление части пула гликолитического предшественника серина и цистеина, 3-фосфоглицерата, в путь гликолиза с последующим полным окислением в цикле трикарбоновых кислот, что сопровождается синтезом и АТР и NADPH.

Рассмотрим первую возможность. Очевидно, что при синтезе цистеина в виду дефицита NADPH какая-то часть глюкозо-6-фосфата поступает в пентозофосфатный путь (далее РРР). Для упрощения допустим, что весь синтезированный глюкозо-6-фосфат проходит РРР. Экспериментально этого можно добиться путем блокирования гена pgi, кодирующего изомеразу глюкоза-6-фосфата (рис. 4).

В окислительной части РРР молекула глюкозо-6-фосфата дважды окисляется с образованием 2-х молекул NADPH, но при этом теряет атом

Глюкоза вне клетки (С6)

И

Глюкозо-6-фосфат (С6)

Ц гМ

6-фосфоглюконолактон (С6)

И *»

6-фосфоглюконат (С6) 1}

МАЭРН +С02 Рибулозо-5-фосфат

^^ фе ^^ Ф'ДФ,В Ксилулоза-5-фосфат (С5) Рибозо-5-фосфат (С5)

мамв

Глииеооальпегил-3-(Ьос(Ьат ("СЗ) + Седогептулозо-7-сЬос<Ьат СС7) ГаМ, Га/Б

Эритрозо-4-фосфат (С4) +

РЕР

РуГИХ/Я^

ЫАОР+

ЫДОРН

дпб

Фруктозо-6-фосфат (С6)

V7

Глице'роальдегид-З-фосфат (СЗ)

шмв

Фруктозо-6-фосфат (С6)

АТР

АОР

р&А,р]кВ

V

Фруктозо-1,6-дифосфат (С6)

Ц /ЬаА^аВ.ф/А

Глицероальдегид-3-фосфат (СЗ)

эегА

МАРН <5^ С1и1ата1е

Асе1у1-СоА

1,3-Дифосфоглицерат

рек

3 -ФоссЬоглииеоат

Д

З-Фосфогидроксипируват (СЗ)

П ¡егС

З-Фосфосерин (СЗ)

а

Ь-Серин (СЗ) -

О-ацетилсерин (СЗ)

зегВ

сузЕ

леер

4

суз К, су

Ь-Цистеин (СЗ)

Рис. 4. Путь превращения внеклеточной глюкозы в цистеин по пентозофосфатному пути.

углерода в виде С02, превращаясь в пяти-углеродный сахар (рибулезо-5-фосфат). В неокислительной части РРР происходит обмен 2-х или 3-х углеродными частями молекул под действием, альдолаз и транскетолаз соответственно. На выходе этих взаимопревращений оказываются глицероальдегид-3 фосфат и фруктозо-6-фосфат, т.е. два метаболита гликолиза, которые далее окисляются в гликолизе до 3-фосфоглицерата, который поступает на синтез серина и затем цистеина. Можно считать, что из трех молекул глюкозо-6-фосфата образуются 2 молекулы фруктозо-6-фосфата и 1 молекула глицероальдегид-3-фосфата. Суммарное уравнение превращений в РРР можно записать так:

3 глюкозо-6-Р = глицероальдегид-3-Р + 2фруктозо-6-Р + бЫАВРН +ЗС02.

Отметим следующее. При гликолитическом превращении 3-х молекул глюкозо-6-фосфата может быть синтезировано 6 молекул цистеина, тогда как при блокировании гена - только 5. Синтезируется дополнительно 2 молекулы МАЭРН на одну молекулу глюкозо-6-фосфата. При обычном, регулируемым клеткой в соответствии с ее потребностями, синтезе цистеина будет происходить накопление NADPH и снижение концентрации ЫАОР+, и такие мутанты медленно растут на глюкозе. Их рост нормализуется при сверхэкспрессии гена бЛА^сИтА), кодирующим трансгидрогеназу (см. выше), с другой стороны, двойные мутанты р§1 бША полностью неспособны к росту на глюкозе и на других гликолитических сахарах [45]. Можно ожидать, что при сверхсинтезе цистеина, в котором потребляется большое количество ЫАОРН, рост мутантов по гена на глюкозе будет нормальным и без сверх-экспрессии гена БёЬА.

Рассчитаем энергетический баланс (образование и потребление энергетических молекул) при синтезе цистеина мутантом по гену pgi. Отметим, что для такого расчета необходимо использовать не менее 3-х молекул глюкозы, из которых на выходе из РРР после потери углерода в виде 3-х молекул С02 образуются 2 молекулы фруктозо-6-фосфата и 1 молекула

глицероальдегид-3-фосфата. Из трех молекул глюкозы синтезируется 5 молекул цистеина.

Путь до цистеина той молекулы глюкозы, из которой образуется глицероальдегид-3-фосфат сопровождается потреблением следующих молекул (ионов): PEP, глутамат, ацетил-КоА, S' . Как мы уже показали, это эквивалентно расходу 2АТР, NADPH, ATP, 4NADPH + 5АТР. Итог:

5NADPH +8АТР. Образуется: 2NADPH, 2NADH, 1 АТР. Итак, баланс на одну молекулу цистеина следующий: +2NADH - 3NADPH - 7АТР (плюс -образуется, минус расходуется).

Путь к цистеину молекулы глюкозы, которая в РРР образует фруктозо-6-фосфат, приводит к синтезу двух молекул цистеина и сопровождается потреблением следующих молекул (ионов): 1 PEP, 1 АТР, 2 глутамат, 2 ацетил-КоА, 2 S"2. Это эквивалентно расходу 2АТР, 1 АТР, 2NADPH, 2АТР, 8NADPH +10АТР. Итог: 10NADPH + 15АТР. Образуется: 2NADPH, 4NADH, 2АТР. Баланс: +4NADH-8NADPH-13 - АТР. Третья молекула глюкозы проделывает тот же путь, что и вторая молекула. Поэтому имеет тот же баланс: +4NADH-8NADPH-13ATP.

Суммируя энергетический баланс при синтезе 5-ти молекул цистеина из 3-х молекул глюкозы имеем: 2NADH - 3NADPH - 7АТР + 8NADH - 16NADPH -26АТР = 10 NADH - 19NADPH - 33АТР. В расчете на одну молекулу цистеина получаем: 2NADH - 3,8NADPH - 6,6 АТР

Если учитывать принятое в настоящее время мнение, что кишечная палочка способна энергией молекулы NADH генерировать синтез 2-х молекул АТР (из ADP), получаем соответственно для штамма дикого типа и мутанта по гену pgi соответственно:

5,0 NADPH + 2,5 АТР 3,8 NADPH + 2,6 АТР Проведенный анализ показывает, что введение мутации гена pgi снижает потребность синтеза цистеина в NADPH, но не полностью ее устраняет.

Недостающая часть энергетических молекул может быть получена из дополнительного количества глюкозы, которая, пройдя РРР и превратившись в гликолитический предшественник серина и цистеина, 3-фосфоглицерат, будет далее метаболизирована в поздних стадиях гликолиза и в виде ацетил-КоА окислено до С02 в цикле трикарбоновых кислот. Для примера, один моль глюкозы в указанном пути генерирует по нашим расчетам (в молях): 3,7 NADPH, 6,7 NADH, 3,3 АТР, 1,7 FADH. Этого достаточно для удовлетворения потребности в NADPH при синтезе одного моля цистеина из глюкозы при избыточном количестве остальных энергетических веществ.

2.5. Токсичность цистеина.

Цистеин несет сульфгидрильную (тиоловую) функциональную группу, и именно с ней связаны химические и биохимические свойства цистеина. Присутствие цистеина в цитоплазме или во внешней среде создает восстановительные условия, так как сульфгидрильная групп легко окисляется. При этом наиболее эффективно окисление происходит тогда, когда она ионизирована, утратив протон. Диссоциация протона происходит при нейтральных (физиологических) значениях рН, так как значение рК диссоциации органических тиолов около 8. В более кислых условиях восстановительная способность цистеина снижается. Видимо, наибольшее значение имеет реакция между двумя сульфгидрильными группами, приводящая к образованию дисульфидных мостиков:

R- SH + HS-R = R-S-S-R + 2Н+ + 2е Если SH-группы входят в состав цистеина, то образуется цистин, который легко выпадает в осадок в виду его низкой растворимости в нейтральных водных растворах. Эта реакция обычно происходит между остатками цистеина в составе белка как между цистеинами в одной цепи, так и между разными цепями. Однако для образования дисульфидных мостиков необходим акцептор электронов, окислитель, которым чаще всего является кислород,

присутствующий во внешней среде. Отметим, что окисление сульфгидрильных групп цистеиновых остатков в составе белков с образованием 8-8 мостиков -это нормальный этап правильной сборки белковых молекул, часть так называемого фолдинга белков.

Сульфгидрильная группа цистеина, являясь нуклеофилом, может образовывать химические связи с электронофильными группами множества биологических молекул. С этим свойством цистеина обычно связывают его токсичность в отношении бактерий.

Кроме того известна способность цистеина образовывать малорастворимые соединения с катионами многих металлов, среди которых есть и жизненно важные для бактерий, такие как ионы железа, марганца, цинка и т.д. Присутствие цистеина в среде роста удаляет эти необходимые микроэлементы из среды, а присутствие цистеина внутри клеток в повышенной концентрации препятствует нормальному синтезу металлопротеинов, а также может вызвать нарушение работы ранее синтезированных металлопротеинов, проникая в активные центра ферментов и образуя соединения с ионами металлов. Особенно серьезно должны страдать ферменты цепи переноса электронов, которые почти всегда содержат металлические кластеры и находятся в мембранах клеток, где они особенно доступны для внеклеточного цистеина.

Давно отмечена высокая чувствительность кишечной палочки к присутствию цистеина в среде. При низких его концентрациях эта аминокислота интенсивно и в первую очередь потребляется клетками, что объясняется экономическими «соображениями», в которых учитываются необычайно высокие затраты энергии на собственный синтез цистеина и параллельного восстановления серы из сульфата. Повышение концентрации цистеина приводит к остановке роста. Уже при концентрации цистеина в химически определенной среде 10 мМ происходит полная остановка роста [46].

При этом удается различить два механизма ингибирования. При более низких концентрациях цистеина ингибирование частично снимается добавлением в среду разветвленных аминокислот, но при повышении концентрации (выше 2 мМ) ингибирование уже не устраняется аминокислотами, что связывают с вмешательством цистеина в работу мембранных дыхательных белков. Производное цистеина (цистамин), которое не проникает в клетки, также ингибирует рост, но это ингибирование не снимается разветвленными аминокислотами.

Позднее Харрисом было показано, что наиболее чувствительный к цистеину биохимический процесс - это превращение треонина в предшественник изолейцина, 2-оксобутират (2-кетобутират), катализируемый

треониндеаминазой (треониндегидратазой) [47], чем и объясняется эффект снятия этого ингибирования при добавлении разветленных аминокислот. Механизм ингибирования цистеином треониндеаминазы так и остался неясным. Попытка связать это ингибирование со взаимодействием цистеина с пиридоксальфосфатом (кофактор треониндеаминазы) оказалась безрезультативной: добавление пиридоксальфосфата в реакционную смесь не влияло на скорость реакции. Остается также неясным механизм снятия ингибирования роста не только изолейцином, а также валином или лейцином, поскольку в их синтезе треониндеаминаза не участвует. Объяснение этому явлению можно найти в химических свойствах цистеина, выявленных Кредичем с соавторами ещё в 1973 году [48]. Изучая деградацию цистеина под действием очищенного препарата десульфурилазы, была выявлена странная стехиометрия этой реакции, в ходе которой образуется пируват, который и определяли на основе общеизвестного метода определения кетокислот с помощью 2,4-дифенилгидразина. Оказалось, что пируват (продукт реакции) неферментативно реагировал с цистеином, субстратом, и образовывалась 2-метил-2,4-тиазолидиндикарбоновая кислота, которая была выделена и идентифицирована. Предложена схема образования этого конъюгата через

промежуточную стадию 2-аминоакриловой кислоты с последующей конденсацией последней с цистеином с образованием тиогемикетоамина, который и замыкается в гетероцикл:

Н2Р-сн-соон

Образование конъюгатов цистеина и кетокислот было известно с 1937 года, позднее (1957 год) было показано, что при действии HgCb выпадает осадок, в котором находится осажденный ртутью цистеин, а в растворе остается пируват, способный реагировать с 2,4-дифенилгидразином. Разрушая этот конъюгат ионом ртути и освобождая тем самым продукт реакции, пируват, Кредичу с соавторами [48] удалось нормализовать стехиометрию десульфурилазной реакции.

Возвращаясь к работе Харриса [47], становится очевидной методическая ошибка определения активности треониндеаминазы в присутствии цистеина, сделанная в его работе. Продуктом реакции является 2-кетомасляная кислота, которая определялась с помощью 2,4-динитрофенилгидразина. По-видимому, как и в работе Кредича [48], происходило образование конъюгата цистеина, который добавлялся в реакционную смесь в качестве предполагаемого ингибитора, с 2-кетомасляной кислотой, которая, как и пируват, способна реагировать с цистеином. Позднее было показано, что реакции между цистеином и кетокислотами протекают быстро (в пределах 10 мин) при физиологических значениях рН (6,0 - 8,5), тогда как продукт реакции гидролизуется медленно (30% за час в оптимальных для этого условиях, рН 9). Очевидно, что в работе Харриса присутствовала методическая ошибка, которая и привела к ошибочным выводам о действии цистеина на треониндезаминазу.

Таким образом, ингибирование треониндезаминазы цистеином не является первичной мишенью действия цистеина на клетки кишечной палочки. Вместо этого мы полагаем, что первичным результатом ингибирующего действия цистеина является связывание им кетокислот в устойчивые конъюгаты и в том числе с образованием 2-метил-2,4-тиазолидиндикарбоната (если кетокислота -пируват). Так как углеродные скелеты разветвленных аминокислот происходит из пирувата (лейцин, изолейцин) или пирувата и 2-кетобутирата (изолейцин), то в первую очередь в присутствии цистеина страдает синтез этих аминокислот, и именно поэтому добавление их в среду ослабляет ингибирование роста цистеином. Может возникнуть вопрос, почему Харрис не обнаружил снятия цистеинового ингибирования Ь-аланином, предшественником которого является пируват. Дело в том, что источником аланина может быть не только пируват, но и сам добавляемый в среду роста цистеин, который деградирует до аланина под действием цистеиндесульфурилазы (ген ¿бсЗ).

2.6. Цистеин в качестве антиоксиданта.

Несмотря на высокую токсичность цистеина для роста бактерий, они все же используют его способность легко окисляться до цистина, тем самым снижая концентрацию наиболее опасных оксидантов, к которым относятся свободные радикалы кислорода, образующиеся при неполном восстановлении молекулярного кислорода. К ним относят супероксид-ион и перекись водорода. Супероксид ион О " становится менее опасным для клеток после действия супероксиддисмутаз (БоёА, 8оёВ, БоёС), что приводит к образованию менее токсичной перекиси водорода (одни изоформы действуют внутри клеток, другие - в периплазме):

02- + 2Н+ = Н202

Заканчивают детоксикацию кислородных радикалов каталазы (Ка1Е, Ка1С, АИрСБ - все они внутриклеточные), образуя из перекиси воду и кислород:

Н202 = 02 + Н202

Возникает вопрос, а как удаляется перекись, которая возникла в периплазме под действием периплазматической супероксиддисмутазы. Здесь на помощь приходит цистеин, который окисляясь до цистина, восстанавливает перекись водорода до воды [49]:

Н202 +2Я-8Н - 11-8-8-11+ Н20 (Я - остаток цистеина).

Известны несколько предположительных транспортера цистеина из клеток наружу УёеБ [2], УАК (ЕатВ) [50] , ТЫС [51 и только один из них (УёеЭ), будучи сверх-экспрессированым, повышал устойчивость к перекиси водорода [52]. Экспрессия гена уёеЭ возрастала на порядок после инкубации клеток в присутствии перекиси водорода. Таким образом, выброс цистеина в периплазму связан с присутсвием там перекиси водорода. При этом обнаруживается цистин, продукт окисления цистеина, вероятнее всего, перекисью водорода. Предполагается, что белок БНУ участвует в транспорте цистина обратно в клетку. По крайней мере, после делеции гена ШУ концентрация цистина в периплазме существенно возрастает, то есть он не поступает обратно в клетки. Эта система устойчивости к перекиси водорода (УёеО/РПУ) индуцируется присутствием перекиси в среде, а также присутствием цистеина внутри клеток. В то же время, известный тиоловый метаболит глутатион, который считается главным детоксикантом в случае оксидативного стресса, не участвует в детоксикации перекиси водорода у кишечной палочки.

В последнее время обнаружено еще одно антиоксидантное действие цистеина, в данном случае скорее косвенное [53]. Показано, что ряд ферментов, катализирующих образование сероводорода из предшественников метионина, важны для выживаемости клеток микроорганизмов и в том числе кишечной палочки при оксидативном стрессе, вызванным действием многих антибиотиков. Среди них нет ферментов, которые действуют непосредственно на цистеин, однако все они получают тиоловую группу от цистеина. Образующийся газ сероводород вероятно неферментативно восстанавливает кислород-содержащие радикалы, снимая оксидативный стресс.

2.7. Регуляция биосинтеза цистеина.

Регуляция биосинтеза цистеина сложная и многоуровневая. Цистеин крайне токсичен, а его синтез (восстановление серы) чрезвычайно энергозатратный. При его биосинтезе необходимо не только избегать излишнего синтеза цистеина, но и координировать скорость синтеза углеродного скелета (из серина) со скоростью синтеза восстановленной серы в виде сульфида. Цистеин с одной стороны является конечным продуктом биосинтеза, так как эта аминокислота непосредственно включается в белки, но с другой стороны он является хранителем и донором восстановленной серы для синтеза метионина, а также необходимых пептидов типа глутатиона. Важно, что цистеин является первичным веществом, в состав которого включается атом восстановленной серы.

В общих чертах можно выделить механизм индукции синтеза ферментов, кодируемых генами цистеинового регулона (Cys-регулон), а также ингибирование активности первого фермента собственно цистеинового пути -серинацетилтрансферы (CAT, ген cysE).

2.7.1. Регуляция экспрессия Сув-регулона.

Синтез ферментов, имеющих отношение к образованию цистеина, включая и сульфатредукцию, а также транспорт сульфат-иона и других серусодержащих веществ, индуцируется белком-регулятором CysB. Иногда по признаку подверженности к данному регулированию соответствующие гены включают в так называемый Cys-регулон. Низкомолекулярным триггерами (эффекторами), включающими CysB-регуляцию является не сам цистеин, а N-ацетилсерин (NAS). Уместно напомнить, что NAS образуется из непосредственного углеродного предшественника цистеина О-ацетилсерина, который присоединяя атом восстановленной серы ферментативно превращается далее в цистеин. При недостатке восстановленной серы О-ацетилсерин быстро и неферментативно

изомеризуется и образуется NAS. Отметим, что сам О-ацетилсерин тоже активирует белок cysB, но гораздо менее эффективно. Таким образом, образование NAS - это сигнал о относительно длительном (необходимо время для изомеризации) дефиците восстановленной серы при том, что поток углерода к серину и далее к цистеину находится в норме. Естественно, при низком потоке углерода в этом направлении данный сигнал не возникает, то есть накопление NAS - это информация для усиления продукции восстановленной серы в условиях нормального снабжения источником углрода. Известно, что соединения восстановленной серы ослабляют этот сигнал - это сульфид-ион, гидросульфид-ион и сероводород, а также тиосульфат-ион, что вполне логично с точки зрения экономии энергии [54-56].

Участвует ли цистеин в регуляции экспрессии генов, необходимых для его собственного синтеза? Непосредственного участия цистеина в качестве эффектора не обнаружено, но показано, что он является мощным аллостерическим ингибитором САТ, которая катализирует синтез О-ацетилсерина [3,7]. Блокирование синтеза О-ацетилсерина и, следовательно, NAS, останавливает индукционное действие белка CysB, без которого гены Cys-регулона не экспрессируют, что равносильно репрессии синтеза цистеиновых ферментов.

Известно, что при росте на сульфате, самом распространенном в земной коре источнике серы, экспрессия цистеиновых генов достигает 50% от своего максимума. При голодании по сере (т.е. появлении NAS в клетках) происходит дополнительная дерепрессия (индукция) по крайней мере 15 генов в 8 оперонах, включая сам ген cysB (пример авторегуляции) [55- 58]. Это гены, относящиеся к сульфатредукции и к усвоению органических источников серы. Интересно, что гены cysE и cysG (Рис. 5) не чувствительны к CysB регуляции, что, видимо, объясняется тем, что соответствующие ферменты нужны даже в условиях избытка серы, так как именно они производят сигнальные молекулы, о которых уже упоминалось.

При полном или почти полном отсутствии сульфат-иона в среде роста клетки кишечной палочки пытаются использовать органические источники окисленной серы - сульфонаты (R-C-S03H), происходит индукция соответсвующих генов (например, tauABCD и ssuEADCB). Для этого тоже нужна активированная форма CysB, но этого не достаточно. Требуется еще один регуляторный белок-активатор, СЫ, по структуре подобный белку CysB, для экспрессии которого также нужен активированный белок CysB [59, 60]. Как оказалось, СЫ, теряет свою активность индуктора под действием продукта первой реакции в пути восстановления сульфата аденозин-5-фосфосульфата (APS) [57]. Таким образом, усвоение серы и связанного с этим синтеза цистеина находится под действием двухуровневой регуляции генной активности: NAS активирует белок CysB, который запускает экспрессию генов сульфатредукции при росте на сульфате; при истощении запаса сульфата белок СЫ активирует гены, необходимые для усвоения сульфонатов.

Белок CysB относят к группу регуляторов транскрипции типа LysR. Тетрамерная форма белка CysB [61 ] связывается со специфическими сайтами в промоторах генов Cys-регулона [8,12, 62-64]. Таких сайтов может быть от 1 до 3-х в районе дистальнее -35 промоторов. Нуклеотидные последовательности сайтов связывания CysB имеют слабое сходство между собой, однако последовательность из 19 нуклеотидов левой половины частично зеркально симметрична последовательности в правой половине. Между этими симметричными последовательностями расстояние может быть различным. Как удалось выяснить в экспериментах in vitro, связывание белка CysB вызывает изгиб ДНК промотора на 100 градусов. Полагают, что это препятствует работе РНК-полимеразы. При добавление NAS угол изгиба уменьшается в два раза, и это активирует транскрипцию, то есть NAS вызывает изменения конформации белка, что и приводит к уменьшению угла изгиба ДНК. Отмечается также некоторый сдвиг места посадки белка: в присутствии NAS белок CysB защищает от ферментативного гидролиза несколько сдвинутую дальше от

старта транскрипции последовательность ДНК. Обнаружено также взаимодействие белка CysB с альфа-субъединицей РНК-полимеразы, что вероятно имеет значение для активации транскрипции. При использовании сайт-направленного мутагенеза удалось установить участки CysB, ответственные за связывания NAS, а также за связывание с ДНК и за взаимодействие с РНК-полимеразой [65]. Без помощи белка CysB и NAS гены цистеинового регулона не экспрессируются вообще, как это показали наши эксперименты (данные не приведены).

2.7.2. Регуляция потока углерода от 3-фосфоглицерата до цистеина

3-фосфоглицерат - эта точка ответвления гликолитического потока углерода в сторону серина и далее цистеина (рис. 5 ). Этот поток считается одним из главных в метаболизме бактерий, через который проходит около 15% углерода при росте на сахарах [66]. Серин, не только включается в белки, но его углеродный скелет является составной частью триптофана, а другая аминокислота, глицин, полностью состоит из двух атомов углерода серина. Глицин, в свою очередь, не только компонент белков, но и структурный элемент пуриновых нуклеотидов. Не меньший расход углерода обусловливается отщеплением одноуглеродных фрагментов при превращении серина в глицин (серинтрансгидроксиметилаза, ген glyA) а также при расщеплении самого глицина. Получаемые Cl- соединения идут на синтез компонентов ДНК (пурины, тимидин) и на ее метилирование, а также на синтеза метионина.

Что касается цистеина, то потребность в этой аминокислоте не ограничивается включением цистеина в состав белков. Являясь единственным акцептором восстановленной серы у бактерий и растений, он далее становится ее донором в синтезе метионина, сам при этом превращается в пируват, т.е.

Репрессия при

голодании у по азоту. N30 - белок

З-Фосфоглицерат

Активация экспрессии при

голодании по сере. СуБВ-белок

2-Кв

ею 2-Кй

Рг

<3

хегА

зегС

зегВ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Зиятдинов, Михаил Харисович

5. Выводы

1. С помощью компьютерного моделирования построена трехмерная структура активного центра серин-О-ацетилтрансферазы кишечной палочки, содержащего связанный в нем Ь-серин (субстрат фермента). Сравнение полученной структуры с аналогичной структурой, содержащей цистеин, показало важность пространственного положения Аэр92 для связывания цистеина. Сделан вывод о необходимости смещения положения Аэр92 путем случайного подбора (рандомизации) ближайших аминокислотных остатков для ослабления связывания цистеина (ингибитор).

2. Методом рандомизированного мутагенеза участка гена сузЕ, кодирующего соседние с Азр92 аминокислоты, получены мутации, вызывающие практически полную десенсибилизацию серин-О-ацетилтрансферазы к ингибированию цистеином без снижения каталитической активности.

3. Показано, что для импорта предшественника цистеина О-ацетилсерина клетками необходима активность ряда генов, кодирующих помпы предположительно относящиеся к группе факторов множественной лекарственной устойчивости (МагС, УсЬЕ, YhgN и Бс^К-С^Р). Продемонстрирована способность ранее известного транспортера олигопептидов Ус^Я транспортировать О-ацетилсерин.

4. Показано, что для превращения Б-сульфоцистеина, который образуется вместо цистеина при усвоении клетками тиосульфата в качестве источника серы, необходимы белки группы глутаредоксинов. Наибольшее значение имеет ОгхС, на долю которого приходится около 60% общей Э-сульфоцистеинредуцирующей активности.

5. Показано, что ген ydjN, кодирующий трансмембранный белок, необходим для импорта S-сульфоцистеина. YdjN участвует также в транспорте цистина, но не цистеина в клетки E.coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зиятдинов, Михаил Харисович, 2013 год

6. Список литературы

1. Leinfelder W., Heinrich P. (2001) Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine. United States patent 6,218,168.

2. Dassler T, Maier T, Winterhalter С, Böck A. Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol Microbiol. 2000, 36(5): 1101-12.

3. Kredich NM, Tomkins GM. The enzymic synthesis of L-cysteine in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 1966, 10; 241(21):4955-65.

4. Fimmel AL, Loughlin RE. Isolation and characterization of cysK mutants of Escherichia coli K12. J Gen Microbiol. 1977, 103(l):37-43.

5. Boronat A, Britton P, Jones-Mortimer MC, Kornberg HL, Lee LG, Murfitt D, Parra F. Location on the Escherichia coli genome of a gene specifying O-acetylserine (thiol)-lyase. J Gen Microbiol. 1984,130(3):673-85.

6. Maier Т., Semisynthetic production of unnatural L-alpha-amino acids by metabolic engineering of the cysteine-biosynthetic pathway. Nat Biotechnol. 2003, 21(4): 422-7.

7. Kredich N. M. 1987. Biosynthesis of cysteine, p. 419-428. In F. C. Neidhardt, J. L. Ingraham, К. B. Low, B. Magasanik, С. M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D. C.

8. Kredich M. The molecular basis for positive regulation of cys promoters in Salmonella typhimurium and Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992) 6(19), 2747-2753.

9. Denk D, Böck A. L-cysteine biosynthesis in Escherichia coli: nucleotide sequence and expression of the serine acetyltransferase (cysE) gene from the wild-type and a cysteine-excreting mutant. J Gen Microbiol. 1987,133(3):515-25/

10. Wigley DB, Derrick JP, Shaw WV. The serine acetyltransferase from Escherichia coli. Over-expression, purification and preliminary crystallographic analysis. FEBS Lett. 1990, 17;277(l-2):267-71.

11.Flavin M, Slaughter C. Synthesis of the succinic ester of homoserine, a new intermediate in the bacterial biosynthesis of methionine. Biochemistry. 1965,4(7): 1370-5.

12. Ostrowski J, Kredich NM. Molecular characterization of the cysJIH promoters of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: regulation by cysB protein and N-acetyl-L-serine. J Bacteriol. 1989, 171(l):130-40.

13.Hryniewics M, Sirko A, Palucha A, Bock A, Hulanicka D. Sulfate and thiosulfate transport in Escherichia coli Kl 2. Identification of gene encoding a novel protein involved in thiosulfate binding. J.Bacteriol., 1990, 172:3358-66.

14.Sirko A, Zatyka M, Sadowy E, Hulanicka D. Sulfate and thiosulfate transport in Escherichia coli K-12: evidence for a functional overlapping of sulfate- and thiosulfate-binding proteins. J Bacteriol. 1995, 177(14):4134-6

15.Pilsyk S, Paszewski A. Sulfate permeases - phylogenetic diversity of sulfate transport. Acta biochimica Polonica, 2009, 56(3): 375-384.

16. Aguilar-Barajas E, Díaz-Pérez C, Ramírez-Díaz MI, Riveros-Rosas H, Cervantes C. Bacterial transport of sulfate, molybdate, and related oxyanions. Biometals. 2011 Aug;24(4):687-707

17.Rosentel JK, Healy F, Maupin-Furlow JA, Lee JH, Shanmugam KT. Molybdate and regulation of mod (molybdate transport), fdhF, and hyc (formate hydrogenlyase) operons in Escherichia coli. J Bacteriol. 1995, 177(17):4857-64.

18.Leyh TS, Taylor JC, Markham GD.The sulfate activation locus of Escherichia coli K12: cloning, genetic, and enzymatic characterization. J Biol Chem. 1988, 263(5):2409-16.

19.. Leyh TS, Vogt TF, Suo Y The DNA sequence of the sulfate activation locus from Escherichia coli K-12.J Biol Chem. 1992, 267(15): 10405-10.

20.Robbins, P. W., and Lipmann, F. Enzymatic Synthesis of Adenosine-S-Phosphosulfate. 1958, J. Biol. Chem. 233,686-690.

21.Leyh TS, Suo Y. GTPase-mediated activation of ATP sulfurylase. J Biol Chem. 1992, 267(l):542-5.

22.Liu C, Martin E, Leyh TS. GTPase activation of ATP sulfurylase: the mechanism. Biochemistry. 1994 Mar l;33(8):2042-7.

23.Liu C, Suo Y, Leyh TS The energetic linkage of GTP hydrolysis and the synthesis of activated sulfate. Biochemistry. 1994, 33(23):7309-14

24.Sukal S, Leyh TS. Product release during the first turnover of the ATP sulfurylase-GTPase. Biochemistry. 2001, 40(49): 15009-16.

25.Sun M, Leyh TS. Channeling in sulfate activating complexes Biochemistry. 2006, 45(38): 11304-11

26.Satishchandran C, Markham GD. Adenosine-5' -phosphosulfate kinase from Escherichia coli K-12 J Biol Chem 1989;264:15012-15021

27.Satishchandran C, Hickman YN, Markham GD. Characterization of the phosphorylated enzyme intermediate formed in the adenosine 5'-phosphosulfate kinase reaction. Biochemistry. 1992, 31(47): 11684-8.

28,Ostrowski J, Wu JY, Rueger DC, h ,n;p. Characterization of the cysJIH regions of S. typhimurium and E. coli B. DNA sequences of cysl and cysH and a model for the siroheme-Fe4S4 active center of sulfite reductase hemoprotein based on amino acid homology with spinach nitrite reductase. J Biol Chem. 1989,264(26): 15726-37.

29.Berendt U, Haverkamp T, Prior A, Schwenn JD. Reaction mechanism of thioredoxin: 3'-phospho-adenylylsulfate reductase investigated by site-directed mutagenesis. Eur J Biochem. 1995, 233(l):347-56.

30.Krone FA, Westphal G, Schwenn JD. Characterisation of the gene cysH and of its product phospho-adenylylsulphate reductase from Escherichia coli. Mol Gen Genet. 1991, 225(2):314-9.

31.Savage H, Montoya G, Svensson C, Schwenn JD, Sinning I. Crystal structure of phosphoadenylyl sulphate (PAPS) reductase: a new family of adenine nucleotide alpha hydrolases. Structure. 1997;5(7):895-906.

32. J Lillig CH, Prior A, Schwenn JD h flp. New thioredoxins and glutaredoxins as electron donors of 3'-phosphoadenylylsulfate reductase. Biol Chem. 1999; 274(12):7695-8.

33.Lillig CH, Potamitou A, Schwenn JD h AP- Redox regulation of 3'-phosphoadenylylsulfate reductase from Escherichia coli by glutathione and glutaredoxins. J Biol Chem. 2003;278(25):22325-30

34.Mechold U, Ogryzko V, Ngo S, Danchin A. Oligoribonuclease is a common downstream target of lithium-induced pAp accumulation in Escherichia coli and human cells. Nucleic acids research, 2006, 34, 2364-2373

35.Neuwald AF, Krishnan BR, Brikun I h flp. cysQ, a gene needed for cysteine synthesis in Escherichia coli K-12 only during aerobic growth. J Bacteriol. 1992, 174(2):415-25.

36.R Siegel LM, Davis PS.Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphatesulfite reductase of enterobacteria. IV. The Escherichia coli hemoflavoprotein: subunit structure and dissociation into hemoprotein and flavoprotein components. J Biol Chem.l974;249(5):1587-98.

37.Siegel LM, Rueger DC, Barber MJ h flp., Escherichia coli sulfite reductase hemoprotein subunit. Prosthetic groups, catalytic parameters, and ligand complexes. J Biol Chem. 1982, 257(11):6343-50.

38.Covès J, Nivière V, Eschenbrenner M, Fontecave M. NADPH-sulfite reductase from Escherichia coli. A flavin reductase participating in the generation of the free radical of ribonucleotide reductase. J Biol Chem. 1993, 268(25): 18604-9

39.Coves J, Zeghouf M, Macherel D h ,n,p. Flavin mononucleotide-binding domain of the flavoprotein component of the sulfite reductase from Escherichia coli.Biochemistry. 1997, 36(19):5921-8.

40.Zeghouf M, Fontecave M, Macherei D, Coves J. The flavoprotein component of the Escherichia coli sulfite reductase: expression, purification, and spectral and catalytic properties of a monomeric form containing both the flavin adenine dinucleotide and the flavin mononucleotide cofactors. Biochemistry. 1998;37(17):6114-23.

41.B.C Tripathy, I.Sherameti, R. Oelmüller.. Siroheme. An essential component for life on earth. Plant Signal Behav. 2010, 5(1): 14-20

42.Gruez A, Pignol D, Zeghouf M, h ßp. Four crystal structures of the 60 kDa flavoprotein monomer of the sulfite reductase indicate a disordered flavodoxin-like module. J Mol Biol. 2000, 299(1): 199-212.

43.Canonaco F, Hess TA, Heri S, Wang T, Szyperski T, Sauer U. Metabolic flux response to phosphoglucose isomerase knock-out in Escherichia coli and impact of overexpression of the soluble transhydrogenase UdhA. FEMS Microbiol Lett. 2001, 204(2):247-52.

44.Sauer U, Canonaco F, Heri S, Perrenoud A, Fischer E. The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli. J Biol Chem. 2004, 279(8):6613-9.

45.Hansen, T., Schönheit, P. Escherichia coli phosphoglucose isomerase can be substituted by members of the PGI family, the PGI/PMI family, and the cPGI family. FEMS Microbiol. Lett. 2005, 250(l):49-53.

46.Kari C, Nagy Z, Koväcs P, Hernädi F. Mechanism of the growth inhibitory effect of cysteine on Escherichia coli. J Gen Microbiol. 1971, 68(3):349-56.

47. Harris C. Cysteine and growth inhibition of Escherichia coli: threonine deaminase as the target enzyme. J Bacteriol. 1981 February; 145(2): 1031— 1035.

48.Kredich NM, Foote LJ, Keenan BS. The stoichiometry and kinetics of the inducible cysteine desulfhydrase from Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 1973 ;248(17):6187-96.

49.Wk>dek L, Czubak J. Formation of 2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid from L-cysteine in rat tissues.. Acta Biochim Pol. 1984;31(3):279-88.

50.Franke I, Resch A, Dassler T h ^p. (2003). "YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and cysteine." J Bacteriol 185(4)

51.Wiriyathanawudhiwong N, Ohtsu I, Li ZD, Mori H, Takagi H. The outer membrane TolC is involved in cysteine tolerance and overproduction in Escherichia coli. 51.Appl Microbiol Biotechnol. 2009, 81(5):903-13

52.Ohtsu I, Wiriyathanawudhiwong N, Morigasaki S h £p. The L-cysteine/L-cystine shuttle system provides reducing equivalents to the periplasm in Escherichia coli. J Biol Chem. 2010, 285(23):81356.

53.Shatalin K, Shatalina E, Mironov A, Nudler E. H2S: a universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 2011, 334(6058):986-90.

54.Kredich NM, The molculr basis for positive regulation of cys promoters in S. tiphimurium and E.coli. 1992. Mol.Microbiol.6:2747-53.

55.Hryniewicz MM, Kredich NM. The cysP promoter of Salmonella typhimurium: characterization of two binding sites for CysB protein, studies of in vivo transcription initiation, and demonstration of the anti-inducer effects of thiosulfate..J Bacteriol. 1991 (18):5876-86.

56.Colyer TE, Kredich NM. In vitro characterization of constitutive CysB proteins from Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 1996, 21(2):247-56

57.Bykowski N, Ploeg J., Iwanicka-Nowicka R. The switch from inorganic to organic sulfur assimilation in E.coli: adenosine 5-phosphosulphate (APS) as a signalling molecule for sulphate excess. Mol Microbiol. 2002, 43:1347-58.

58.Gyaneshwar P, Paliy O, McAuliffe J, Popham DL, Jordan MI, Kustu S. Sulfur and nitrogen limitation in Escherichia coli K-12: specific homeostatic responses. J Bacteriol. 2005, 187(3): 1074-90

59.Iwanicka-Nowicka R, Hryniewicz MM . A new gene, cbl, encoding a member of the LysR family of transcriptional regulators belongs to Escherichia coli cys regulon.. Gene. 1995, 166(1): 11-7.

60.Iwanicka-Nowicka R, Kertesz MA, Leisinger T, Hryniewicz MM. Involvement of CysB and Cbl regulatory proteins in expression of the tauABCD operon and other sulfate starvation-inducible genes in Escherichia coli.van der Ploeg JR, J Bacteriol. 1997, Dec;179(24):7671-8.].

61. Shell MA. Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators. Ann.Rev Microbiol, 1994, 47: 597-626).

62.0strowski J, Kredich NM. In vitro interactions of CysB protein with the cysJIH promoter of Salmonella typhimurium: inhibitory effects of sulfide. J Bacteriol. 1990; 172(2):779-85.

63.Monroe RS, Ostrowski J, Hryniewicz MM, Kredich NM. In vitro interactions of CysB protein with the cysK and cysJIH promoter regions of Salmonella typhimurium.

64.J Bacteriol. 1990, 172(12):6919-29.

65.Ostrowski J, Kredich NM. Negative autoregulation of cysB in Salmonella typhimurium: in vitro interactions of CysB protein with the cysB promoter J Bacteriol. 1991 173(7):2212-8

66.Lochowska A, Iwanicka-Nowicka R, Plochocka D, Hryniewicz MM. . Functional dissection of the LysR-type CysB transcriptional regulator. Regions important for DNA binding, inducer response, oligomerization, and positive control. J Biol Chem. 2001, 276(3):2098-107

67.Pizer LI, Potochny ML. Nutritional and regulatory aspects of serine metabolism in E.coli. J Bacteriol. 1964 ,88:611-9.

68.Ninfa AJ, Atkinson MR. PII signal transduction proteins. Trends Microbiol. 2000 8(4): 172-9.

69.Blauwkamp TA, Ninfa AJ, Nac-mediated repression of the serA promoter of E.coli. Mol. Microbiol. 2002, 45:351-63.

70.Sugimoto E., Pizer LI, Mechanism of end product inhibition of serine biosynthesis. I. Purification and kinetics of phodphoglycerate dehydrogenase. 1968. J.Biol.Chem. 243 (9): 2081-89.

71.Sugimoto E., Pizer LI, Mechanism of end product inhibition of serine biosynthesis.il Optical studies of phosphoglycerate dehydrogenase. 1968, J.Biol.Chem. 243(9):2090-98.

72.Sugimoto E., Pizer LI, Mechanism of end product inhibition of serine biosynthesis.III. Physical and chemical properties of phosphoglycerate dehydrogenase. 1968. J.Biol. Chem. 243(9): 2099-2107

73.Sugimoto E., Pizer LI, Mechanism of end product inhibition of serine biosynthesis.IV. Subunit structure of phosphoglycerate dehydrogenase and stedy state kineticstudies of phosphoglycerate oxidation. 1974. J. Biol. Chem. 249(5): 1348-55.

74.Zhao G. Winkler ME. A Novel a-Ketoglutarate Reductase Activity of the serA-Encoded 3-Phosphoglycerate Dehydrogenase of Escherichia coli K-12mand Its Possible Implications for Humanm2-Hydroxyglutaric Aciduria. J. Bacteriol. 1996, 178: 232-239

75. Pizer LI. The pathway and control of serine biosynthesis in Escherichia coli. 1963. J.Biol.Chem. 238: 3934-3944.

76.Schuller D., Grant GA, Banaszak I. The allosteric ligand site in the Vmax-type cooperative enzyme phosphoglycerate dehydrogenase ,1995, Nat.Struct. Biol. 2, 69-76

77.Thompson JR, Bell JK, Bratt J, h Vmax regulation through domain and subunit changes. The active form of phosphoglycerate dehydrogenase. Biochemistry. 2005; 44(15):5763-73.

78.Grant GA The ACT domain: a small molecule binding domain and its role as a coomon regulatory element. 2006. J.Biol. Chem, 281(45):33825-29.

79.Grant GA, Xu X.I., Hu Z. Quantitative relationships of site to site interaction in Escherichia coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase revealed by asymmetric hybrid tetramers. 2004, J. Biol. Chem. 279, 13452-13460

80.Grant GA. Contrasting catalytic and allosteric mechanisms for phosphoglycerate dehydrogenases. Arch Biochem Biophys. 2012;519(2): 17585.

81.Grant GA, Xu X.I., Hu Z . Role of an interdomain Gly-Gly sequence at the regulatory-substrate domain interface in the regulation of Escherichia coli. D-3-phosphoglycerate dehydrogenase. Biochemistry. 2000 Jun 20;39(24):7316-9.

82.Dey S, Hu Z, Xu XL, h ¿jp. The effect of hinge mutations on effector binding and domain rotation in Escherichia coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase.! Biol Chem. 2007;282(25): 18418-26.

83.Cook PF, Wedding RT. Cysteine synthetase from Salmonella typhimurium LT-2. Aggregation, kinetic behavior, and effect of modifiers. J Biol Chem. 1978, 253(21):7874-9.).

84.Mino K, Hiraoka K, Imamura K h ap. Characteristics of serine acetyltransferase from Escherichia coli deleting different lengths of amino acid residues from the C-terminus. Biosci Biotechnol Biochem. 2000, 64(9): 1874-80.

85.Hindson YJ (2003). "Serine acetyltransferase of Escherichia coli: substrate specificity and feedback control by cysteine." Biochem J, 375:745-52

86.Pye VE, Tingey AP, Robson RL, Moody PC. The structure and mechanism of serine acetyltransferase from Escherichia coli. J Biol Chem. 2004, 24;279(39):40729-36.

87.Olsen LR, Huang B, Vetting MW, Roderick SL. Structure of serine acetyltransferase in complex with CoA and its cysteine feedback inhibitor. Biochemistry 2004, 43: 6013-19.

88.Kredich NM, Becker MA, Tomkins GM. Purification and characterization of cysteine synthetase, a bifunctional protein complex, from Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 1969, 244(9):2428-39.

89.Zare, H., Sangurdekar, D., Srivastava, P., Kaveh, M., and Khodursky, A. Reconstruction of Escherichia coli transcriptional regulatory networks via regulon-based associations. BMC Syst. Biol. 2009, 3, 39: 1 -12.

90. Wang T, Leyh TS. Three-stage assembly of the cysteine synthase complex from Escherichia coli. J Biol Chem. 2012;287(6):4360-7

91. Campanini B., Speroni F., Salsi E. n ^p. Interaction of serine acetyltransferase with O-acetylserine sulfhydrylase active site. Evidence from fluorescence spectroscopy. 2005, Protein Sci. 14, 2115-24.

92.Feldman-Salit A., Wirtz M., Hell R., Wade R. C. A mechanistic model of the cysteine synthase complex. J. Mol. Biol. 2009, 386, 37-59.

93. Mino K., Imamura K., Sakiyama T., Eisaki N., Matsuyama A., Nakanishi K. Increase in the stability of serine acetyltransferase from Escherichia coli against cold inactivation and proteolysis by forming a bienzyme complex. 2001. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 865-74.

94. Wang T, Leyh TS. Three-stage Assembly of the Cysteine Synthase Complex from Escherichia coli. 2012, J Biol Chem 287(6): 4360-67.

95.Huang B, Vetting MW, Roderick SL. The active site of O-acetylserine sulfhydrylase is the anchor point for bienzyme complex formation with serine acetyltransferase. J Bacteriol. 2005;187(9):3201-5.

96.Hirai MY, Fujiwara T, Awazuhara M h ^p. Global expression profiling of sulfur-starved Arabidopsis by DNA microarray reveals the role of O-acetyl-O-serine as a general regulator of gene expression in response to sulfur nutrition. Plant J. 2003, 33, 651-63.

97.Droux M, Ruffet ML, Douce R., Job D. Interactions between serine acetyltransferase and O-acetylserine (thiol) lyase in higher plants. Eur. J.Biochem.1998, 255:235-245.

98.Tanous C, Soutourina O, Raynal B h ffp. The CymR regulator in complex with the enzyme CysK controls cysteine metabolism in Bacillus subtilis. J Biol Chem. 2008; 283(51):35551-60

99. Wei J , Tang Q , Varlamova O , Roche C h ap. Cysteine Biosynthetic Enzymes Are the Pieces of a Metabolic Energy Pump. Biochemistry, 2002, 41 (26): 8493-98.

100. Salsi E, Campanini B, Bettati S и др. A two-step process controls the formation of the bienzyme cysteine synthase complex. J Biol Chem. 2010, 285(17):12813-22.

101. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, под редакцией J.F. Sambrook and D.W. Russell тома 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001,

102. Datsenko, KA, BL Wanner 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12):6640-5.

103. Doroshenko V, Airich L, Vitushkina M, и др. YddG from Escherichia coli promotes export of aromatic amino acids. FEMS Microbiol Lett. 2007, 275(2): 312-18.

104. Carlberg I, Mannervik B. Glutathione reductase Methods Enzymol. 1985;113:484-90.

105. Kushner SR, Nagaishi H, Clark AJ. Indirect suppression of recB and recC mutations by exonuclease I deficiency .Proc Natl Acad Sci USA. 1972, 69(6): 1366-70.

106. Nakamori S, Kobayashi SI, Kobayashi C, Takagi H. Overproduction of L-cysteine and L-cystine by Escherichia coli strains with a genetically altered serine acetyltransferase. Appl Environ Microbiol. 1998, 64(5): 1607-11

107. Takagi H, Awano N, Kobayashi S, и др. Overproduction of L-cysteine and L-cystine by expression of genes for feedback inhibition-insensitive serine acetyltransferase from Arabidopsis thaliana in Escherichia coli. 1999, 179(2):453-9

108. NojiM, Inoue K, Kimura N, Gouda A, Saito K. Isoform-dependent differences in feedback regulation and subcellular localization of serine acetyltransferase involved in cysteine biosynthesis from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 1998. 273(49):32739-45.

109. Cashel M, Gallant J. Two compounds implicated in the function of the RC gene of Escherichia coli. Nature. 1969: 221(5183):838-41.

110. Dennis PP. Influence of the stringent control system on the transcription of ribosomal ribonucleic acid and ribosomal protein genes in Escherichia coli. J Bacteriol. 1977:129(2):580-8.

111. Sussman AJ, Gilvarg C. Protein turnover in amino acid-starved strains of Escherichia coli K-12 differing in their ribonucleic acid control. J Biol Chem. 1969, 244(22):6304-6.

112. Richter D. Stringent factor from Escherichia coli directs ribosomal binding and release of uncharged tRNA. Proc Natl Acad Sei U S A. 1976, 73(3):707-l 1.

113. Daley DO, Rapp M, Granseth E, Melen K, Drew D, von Heijne G. Global topology analysis of the Escherichia coli inner membrane proteome. Science. 2005:308(5726): 1321-3.

114. McDermott PF, McMurry LM, Podglajen I h ,ztp. The marC gene of Escherichia coli is not involved in multiple antibiotic resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52(l):382-3. .

115. Shimada T, Yamamoto K, Ishihama A. Involvement of the leucine response transcription factor LeuO in regulation of the genes for sulfa drug efflux. J Bacteriol. 2009, 191(14):4562-71.

116. Weitz D, Harder D, Casagrande F, Fotiadis D, Obrdlik P, Kelety B, Daniel H. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. J Biol Chem. 2007 Feb 2;282(5):2832

117. Kutukova EA, Livshits VA, Altman IP, Ptitsyn LR, h ^p. The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett. 2005 Aug 29;579(21):4629-34.

118. Aslund F, Ehn B, Miranda-Vizuete A, h flp. Two additional glutaredoxins exist in Escherichia coli: glutaredoxin 3 is a hydrogen donor for

ribonucleotide reductase in a thioredoxin/glutaredoxin 1 double mutant. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(21):9813-7.