Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Тихонова, Анастасия Геннадьевна

• Тихонова, Анастасия Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тихонова, Анастасия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Морфология и физиология эритроцитов.

1.2. Преимущества, достигаемые при использовании эритроцитов-переносчиков.

1.3. Методы приготовления эритроцитов-переносчиков.

Гипоосмотический гемолиз.

Электропорация.

Эндоцитоз.

Увеличение проницаемости мембраны с помощью антибиотиков.

Ультразвук.

Включение» белков с помощью низкомолекулярного протамина.

Метод инкубации.

Направленная доставка.

1.4. Примеры использования нагруженных эритроцитов.1S

Эритроциты как переносчики аналогов нуклеотида.

Эритроциты как переносчики глюкокортикоидных аналогов.

Эритроциты как переносчики лекарственных веществ.

Эритроциты как переносчики белков.

1.5. Попытки использования эритроцитов-биореакторов для окисления этанола.

1.6. Метаболизм этанола.

Абсорбция, распределение и элиминация этанола.

Системы, метаболизирующие этанол.

Токсическое действие алкоголя и его метаболитов.

1.7. Сведения о ферментах, использованных в данной работе.

Алкогольдегидрогеназа.

Альдегиддегидрогеназа.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Исследование работы каскада ферментов вне клетки.

2.2.2. Математическая модель.

2.2.3. Приготовление суспензии эритроцитов человека.

2.2.4. Приготовление суспензии эритроцитов мыши.

2.2.5. Получение биореакторов на основе эритроцитов человека.

2.2.6. Получение биореакторов на основе эритроцитов мышей.

2.2.7. Приготовление лизатов эритроцитов.

2.2.8. Измерение активности ферментов.

2.2.9. Приготовление перхлорных экстрактов проб.

2.2.10. Измерения концентрации этанола и пирувата.

2.2.11. Измерение эритроцитарных индексов.

2.2.12. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов

2.2.13. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям.

2.2.14. Измерение снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов во время хранения.

2.2.15. Измерение степени гемолиза эритроцитов-биореакторов во время хранения.

2.2.16. Окраска эритроцитов мыши флуоресцеин-изотиоционатом и определение количества циркулирующих в кровяном русле флуоресцеин-изотиоционат-положительных клеток.

2.2.17. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Сравнение теоретических расчетов с экспериментальными данными.

3.2.Возможные причины, ограничивающие скорость окисления этанола эритроцитами-биореакторами в экспериментах in vitro.

3.2.1.0ценка содержания алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроцитах для эффективной работы биореактора по окислению этанола

3.2.2. Зависимость скорости окисления этанола от присутствия пирувата в среде.

3.2.3. Компенсация потерь НАД4" и НАДН.

3.3. Зависимость скорости убыли этанола от концентрации пирувата.

3.4. «Включение» ферментов в эритроциты.

3.5. Исследование качества полученных клеток.

3.5.1. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов, полученных методом одно-, двух- и трехступенчатого диализа.

3.5.2. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегдрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям.

3.5.3. Оценка активности «включенных» в эритроциты ферментов и гемолиз эритроцитов-биореакторов во время хранения.

3.5.4. Определение количества циркулирующих в кровяном русле мыши ФИТЦ-положительных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола»

Актуальность темы

Более 35 лет назад было показано, что эритроциты как носители могут успешно использоваться в клинической практике. Это возможно потому, что данные клетки отличаются некоторыми уникальными преимуществами по сравнению с другими системами доставки лекарств. Эритроциты являются не только натуральными, безопасными и доступными в препаративном количестве, но и способны к биодеградации, длительно циркулируют в крови (в среднем 120 дней [1]), снижают аллергические и иммунологические реакции на введение белковых препаратов в кровь. Существует ряд направлений в использовании эритроцитов-переносчиков, одно из которых состоит в том, что клетки рассматриваются не как пассивные переносчики, а как биореакторы. Это возможно за счет «включения» ферментов, которые в ряде случаев не содержатся в нативных эритроцитах, и благодаря тому, что субстраты и продукты реакций, катализируемых данными ферментами, достаточно хорошо проходят через мембрану эритроцита. Такие носители могли бы эффективно перерабатывать токсическое вещество непосредственно в кровотоке. Идея использовать эритроциты в качестве биореакторов была высказана около 30 лет назад [2-4] и доведена до применения в клинической практике на примере ряда ферментов (L-аспарагиназа, аденозиндеаминаза) [5,6]. В эритроциты был «включен» целый ряд ферментов, которые были предложены для терапии таких болезней и состояний как: острый лимфобластный лейкоз [3,5,7-11], лимфосаркома [3,5,7-11], болезнь Гоше [12,13], гипераммониемия [14-16], интоксикация метанолом [17] и др. Результаты ряда работ подтверждают, что нагруженные ферментами эритроциты удаляют из кровеносного русла токсические и повышенные концентрации различных соединений (таких как метанол и формальдегид при отравлении метанолом, глюкоза при диабете).

Эритроциты-биореакторы для снижения в крови концентрации этанола и ацетальдегида - главного токсического продукта метаболизма спирта, были предложены около 10 лет назад. С этой целью в эритроциты были «включены» два фермента: алкогольдегидрогеназа и альдегиддегидрогеназа. К сожалению, данная разработка как и многие другие не используются в клинике в настоящее время. Мы полагаем, что проблема может заключаться в неэффективной скорости работы биореакторов. В данной работе были изучены возможные причины, ограничивающие высокую скорость биореактора на примере окисления этанола.

Цель работы

Целью работы было выяснение причин ограничивающих скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами в условиях in vitro и преодоление этих ограничений с целью увеличения скорости окисления спирта в ацетат.

Задачи исследования

1. Исследование зависимости эффективности работы ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) от их количества и от доступности субстратов (пирувата, НАД', НАДН).

2. Выбор оптимальных условий для «включения» максимального количества ферментов в эритроциты.

3. Изучение влияния процедуры «загрузки» ферментов на функциональную полноценность клеток.

4. Оценка стабильности «включенных» в эритроциты ферментов в процессе хранения.

Научная новизна

В результате работы были выяснены причины, ограничивающие высокую эффективность эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, и найдены пути их преодоления. Были разработаны методы, позволяющие эффективно включать белки с достаточно большим молекулярным весом и получать «нагруженные» эритроциты близкие по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными эритроцитами. Был произведен сравнительный анализ биореакторов, полученных различными методами по нескольким характеристикам таким как: определение осмотической резистентности эритроцитов, распределение нагруженных эритроцитов по плотностям, измерение эритроцитарных индексов. Было показано, что метод одноступенчатого гипоосмотического диализа является предпочтительным по сравнению с двух- и трехступенчатым как по проценту «включения» ферментов, так и по жизнеспособности эритроцитов. Изучение эритроцитов во время хранения показало, что в течение 7 суток не происходит значительного снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов.

Практическая ценность работы

Полученные результаты важны для понимания причин, которые ограничивают скорость не только окисления этанола, но и иных субстратов в случае создания других эритроцитов-биореакторов, В данной работе было показано, что скорость работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов при отсутствии митохондриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.

Положения, выносимые на защиту

1. Одним из ограничителей эффективной работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола является пируват, поступление которого только за счет гликолиза недостаточно. В его присутствии скорость увеличивается в 17 раз.

2. Вторым ограничителем служит пул НАД4" и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность работы эритроцитов-биореакторов в 3 раза.

3. Разработаны методы «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека позволяющие получать высокий процент «включения» белков и клетки сходные по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными. Оптимальным методом «включения» ферментов является одноступенчатый метод диализа.

4. При хранении эритроцитов-биореакторов в течение 7 суток происходит снижение активности альдегиддегидрогеназы в 2 раза, тогда как активность алкогольдегидрогеназы снижается незначительно.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Тихонова, Анастасия Геннадьевна

выводы

1. Теоретический анализ показал, что низкая скорость окисления этанола эритроцитами лимитируется не концентрацией ферментов, а концентрациями низкомолекулярных субстратов. Существующие методы «включения» белковых препаратов эффективны и позволяют «включать» необходимые концентрации алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека.

2. Показано, что одной из главных причин, ограничивающих высокую скорость окисления этанола, является недостаток пирувата. В присутствии его избытка скорость окисления этанола возрастает в 17 раз.

3. Восстановление пула коферментов НАД+ и НАДН в эритроцитах позволяет увеличить скорость окисления этанола более чем в 3 раза.

4. Определены оптимальные условия «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека методом одноступенчатого гипотонического диализа.

БЛАГОДАРНОСТИ

За помощь в получении биореакторов на основе эритроцитов человека A.JI. Дербова. Благодарю и.о. руководителя и сотрудников Лаборатории метаболического моделирования и биоинформатики Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН за помощь в исследовании количества циркулирующих в кровяном русле мыши ФИТЦ-положительных клеток. За критическое прочтение манускрипта Ю.Г. Александрович, д.м.н. Л.И. Ершову, к.б.н. Е.С. Шурхину. Огромная благодарность научному руководителю д.б.н. Ф.И. Атауллаханову.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тихонова, Анастасия Геннадьевна, 2010 год

1. Гайтон АК, Холл ДжЭ. Медицинская физиология. Логосфера, 2008.

2. Adriaenssens К, Karcher D, Lowenthal A, Terheggen HG. Use of enzyme-loaded erythrocytes in in-vitro correction of arginase-deficient erythrocytes in familial hyperargininemia. Clin Chern 1976; 22: 323-326.

3. Updike SJ, Wakamiya RT, Lightfoot EN, Jr. Asparaginase entrapped in red blood cells: action and survival. Science 1976; 193: 681-683.

4. Ihler G, Lantzy A, Purpura J, Glew RH. Enzymatic degradation of uric acid by uricase-loaded human erythrocytes. J Clin Invest 1975; 56: 595-602.

5. Kravtzoff R, Desbois I, Lamagnere JP, Muh JP, Yalat C, Chassaigne M, Colombat P, Ropars C. Improved pharmacodynamics of L-asparaginase-loaded in human red blood cells. Eur J Clin Pharmacol 1996; 49: 465-470.

6. Bax BE, Bain MD, Fairbanks LD, Webster AD, Ind PW, Hershfield MS, Chalmers RA. A 9-yr evaluation of carrier erythrocyte encapsulated adenosine deaminase (ADA) therapy in a patient with adult-type ADA deficiency. Eur J Haematol 2007; 79: 338-348.

7. Updike SJ. Entrapment of L-asparaginase in red blood cells. A strategy to improve treatment of acute lymphoblastic leukemia. Bibl Haematol 1985; 6574.

8. Kravtzoff R, Desbois I, Doinel C, Colombat P, Lamagnere JP, Chassaigne M, Ropars C. Immunological response to L-asparaginase loaded into red blood cells. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 175-182.

9. Alpar HO, Lewis DA. Therapeutic efficacy of asparaginase encapsulated in intact erythrocytes. Biochem Pharmacol 1985; 34: 257-261.

10. Sinauridze EI, Vitvitsky VM, Pichugin AV, Zhabotinsky AM, Ataullakhanov FI. A new chemotherapeutic agent: L-asparaginase entrapped in red blood cells. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 203-206.

11. Kwon YM, Chung HS, Moon C, Yockman J, Park YJ, Gitlin SD, David AE, Yang VC. L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). J Control Release 2009.

12. Beutler E, Dale GL, Guinto DE, Kuhl W. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: preliminary clinical trial of a new enzyme preparation. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 4620-4623.

13. Bax BE, Bain MD, Ward CP, Fensom AH, Chalmers RA. The entrapment of mannose-terminated glucocerebrosidase (Alglucerase) in human carrier erythrocytes. Biochem Soc Trans 1996; 24: 44IS.

14. Sanz S, Lizano C, Luque J, Pinilla M. In vitro and in vivo study of glutamate dehydrogenase encapsulated into mouse erythrocytes by a hypotonic dialysis procedure. Life Sci 1999; 65: 2781-2789.

15. Venediktova N1, Kosenko EA, Kaminsky YG. Studies on ammocytes: development, metabolic characteristics, and detoxication of ammonium. Bull Exp Biol Med 2008; 146: 730-732.

16. Kosenko EA, Venediktova N1, Kudryavtsev AA, Ataullakhanov FI, Kaminsky YG, Felipo V, Montoliu C. Encapsulation of glutamine synthetase in mouse erythrocytes: a new procedure for ammonia detoxification. Biochem Cell Biol 2008; 86: 469-476.

17. Magnani M, Fazi A, Mangani F, Rossi L, Mancini U. Methanol detoxification by enzyme-loaded erythrocytes. Biotechnol ApplBiochem 1993; 18 ( Pt 3): 217-226.

18. Greer JP, Foerster J, Rodgers GM, Paraskevas F, Glader B, Arber DA, Means RT. Wintrobe's Clinical Hematology. Wolters Kluwer Health, 2008.

19. Lichtman MA, Beutler E, Seligsohn U, Kauchansky K, Kipps TJ. Williams Hematology. McGrew-Hill Medical, 2005.

20. Козинец ГИ, Шишканова ЗГ, Сарычева ТГ, Новодержкина ЮК, Дягилева OA, Проценко ДД. Нормальное кроветворение. In: Козинец ГИ (editor). Клетки крови и костного мозга. Москва: Медицинское информационное агенство, 2004; 23-57.

21. Исследование системы крови в клинической практике. Москва: Триада-Х, 1998.

22. Ihler GM. Erythrocyte carriers. Pharmacol Ther 1983; 20: 151-169.

23. Lewis DA, Alpar HO. Therapeutic possibilities of drugs encapsulated in erythrocytes. Int JPharm 1984; 22: 137-146.

24. Talwar N, Jain NK. Erythrocyte based delivery system of primaquine: in vitro characterization. JMicroencapsul 1992; 9: 357-364.

25. Bax BE, Bain MD, Talbot PJ, Parker-Williams EJ, Chalmers RA. Survival of human carrier erythrocytes in vivo. Clin Sci (Lond) 1999; 96: 171-178.

26. Eichler HG, Gasic S, Bauer K, Korn A, Bacher S. In vivo clearance of antibody-sensitized human drug carrier erythrocytes. Clin Pharmacol Ther 1986; 40: 300-303.

27. Pitt E, Johnson CM, Lewis DA, Jenner DA, Offord RE. Encapsulation of drugs in intact erythrocytes: an intravenous delivery system. Biochem Pharmacol 1983; 32: 3359-3368.

28. Seeman P, Cheng D, lies GH. Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. J Cell Biol 1973; 56: 519-527.

29. Ihler GM, Tsang HC. Hypotonic hemolysis methods for entrapment of agents in resealed erythrocytes. Methods Enzymol 1987; 149: 221-229.

30. Dale GL. High-efficiency entrapment of enzymes in resealed red cell ghosts by dialysis. Methods Enzymol 1987; 149: 229-234.

31. Ropars C, Avenard G, Chassaigne M. Large-scale entrapment of drugs into resealed red blood cells using a continuous-flow dialysis system. Methods Enzymol 1987; 149: 242-248.

32. Сарбаш ВИ, Тихонова АГ, Вуймо ТА, Дербов AJI, Александрович ЮГ, Бутылин АА, Витвицкий ВМ, Атауллаханов ФИ. Эритроциты носители лекарственных препаратов. Рос хим ж (Ж Рос хим об-ва им Д И Менделеева) 2007; LI: 143-149.

33. Hoffman JF, Eden М, Bedell RHS. The hemolytic volume of human erythrocytes. J Cell and Comp Physiol 1958; 51: 405-414.

34. Lieber MR, Steck TL. A description of the holes in human erythrocyte membrane ghosts. J Biol Chem 1982; 257: 11651-11659.

35. Lieber MR, Steck TL. Dynamics of the holes in human erythrocyte membrane ghosts. J Biol Chem 1982; 257: 11660-11666.

36. Seeman P. Transient holes in the erythrocyte membrane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponin and lysolecithin. J Cell Biol 1967; 32: 55-70.

37. Stewart GN. The conditions that underlie the peculiarities in the behaviour of the coloured blood-corpuscles to certain substances. J Physiol 1901; 26: 470496.

38. Stewart GN. The mechanism of haemolysis with special reference to the relations of electrolytes to cells. JPharm Exp Therap 1909; 1: 49-121.

39. Adair GS. The identity of haemoglobin in human beings. J Physiol 1921; 55: 332-338.

40. Bayliss LE. Reversible haemolysis. J Physiol 1924; 59: 48-60.

41. Hoffman JF. Physiological characteristics of human red blood cell ghosts. J Gen Physiol 1958; 42: 9-28.

42. Hanahan DJ, Ekholm JE, Luthra MG. Is lipid lost during preparation of erythrocyte membranes? Biochim Biophys Acta 1974; 363: 283-286.

43. Schrier SL, Zachowski A, Herve P, Kader JC, Devaux PF. Transmembrane redistribution of phospholipids of the human red cell membrane during hypotonic hemolysis. Biochim Biophys Acta 1992; 1105: 170-176.

44. Hoffman JF. The active transport of sodium by ghosts of human red blood cells. J Gen Physiol 1962; 45: 837-859.

45. Sprandel U. Temperature-induced shape transformation of carrier erythrocytes. Res Exp Med (Berl) 1990; 190:267-275.

46. Ihler GM, Glew RH, Schnure FW. Enzyme loading of erythrocytes. Proc Natl AcadSci USA 1973; 70: 2663-2666.

47. Rechsteiner MC. Uptake of proteins by red blood cells. Exp Cell Res 1975; 93: 487-492.

48. Humphreys JD, Ihler G. Enhanced stability of erythrocyte-entrapped glucocerebrosidase activity. J Lab Clin Med 1980; 96: 682-692.

49. Billah MM, Finean JB, Coleman R, Michell RH. Preparation of erythrocyte ghosts by a glycol-induced osmotic lysis under isoionic conditions. Biochim Biophys Acta 1976; 433: 54-62.

50. Sprandel U, Hubbard AR, Chalmers RA. In vitro studies on resealed erythrocyte ghosts as protein carriers. Res Exp Med (Berl) 1979; 175: 239-245.

51. Deloach J, Ihler G. A dialysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochim Biophys Acta 1977; 496: 136-145.

52. DeLoach JR, Harris RL, Ihler GM. An erythrocyte encapsulator dialyzer used in preparing large quantities of erythrocyte ghosts and encapsulation of a pesticide in erythrocyte ghosts. Anal Biochem 1980; 102: 220-227.

53. DeLoach JR. Dialysis method for entrapment of proteins into resealed red blood cells. Methods Enzymol 1987; 149: 235-242.

54. Small WC, Goldstein JH. The effect of the cryoprotectants, dimethylsulfoxide and glycerol on water transport in the human red blood cell. Biochim Biophys Acta 1982; 720: 81-86.

55. Mosca A, Paleari R, Russo V, Rosti E, Nano R, Boicelli A, Villa S, Zanella A. IHP entrapment into human erythrocytes: comparison between hypotonic dialysis and DMSO osmotic pulse. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 19-26.

56. Franco RS, Weiner M, Wagner K, Martelo О J. Incorporation of inositol hexaphosphate into red blood cells mediated by dimethyl sulfoxide. Life Sci 1983; 32: 2763-2768.

57. Franco RS, Wagner K, Weiner M, Martelo OJ. Preparation of low-affinity red cells with dimethylsulfoxide-mediated inositol hexaphosphate incorporation: hemoglobin and ATP recovery using a continuous-flow method. Am JHematol 1984; 17: 393-400.

58. Franco RS, Barker R, Novick S, Weiner M, Martelo О J. Effect of inositol hexaphosphate on the transient behavior of red cells following a DMSO-induced osmotic pulse. J Cell Physiol 1986; 129: 221-229.

59. Tsong TY. Electroporation of cell membranes. Biophys J 1991; 60: 297-306.

60. Kinosita K, Jr., Tsong TT. Hemolysis of human erythrocytes by transient electric field. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 1923-1927.

61. Kinosita K, Jr., Tsong TY. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim Biophys Acta 1977; 471: 227-242.

62. Kinosita К, Jr., Tsong TY. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature 1977; 268: 438-441.

63. Bliss JG, Harrison GI, Mourant JR, Powell KT, Weaver JC. Electroporation: the population distribution of macromolecular uptake and shape changes in red blood cells following a single 50 (is square wave pulse. Bioelectrochem Bioenerg 1988; 20: 57-71.

64. Chang DC, Reese TS. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy. Biophys J 1990; 58: 1-12.

65. Sowers AE, Lieber MR. Electropore diameters, lifetimes, numbers, and locations in individual erythrocyte ghosts. FEBSLett 1986; 205: 179-184.

66. Lizano C, Sanz S, Luque J, Pinilla M. In vitro study of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase encapsulated into human erythrocytes by an electroporation procedure. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 328-336.

67. Dong Q, Jin W. Monitoring diclofenac sodium in single human erythrocytes introduced by electroporation using capillary zone electrophoresis with electrochemical detection. Electrophoresis 2001; 22: 2786-2792.

68. Zeira M, Tosi PF, Mouneimne Y, Lazarte J, Sneed L, Volsky DJ, Nicolau C. Full-length CD4 electroinserted in the erythrocyte membrane as a long-lived inhibitor of infection by human immunodeficiency virus. Proc Natl Acad Sci U SA 1991; 88:4409-4413.

69. Schrier SL, Junga I, Krueger J, Johnson M. Requirements of drug-induced endocytosis by intact human erythrocytes. Blood Cells 1978; 4: 339-359.

70. Schrier SL, Zachowski A, Devaux PF. Mechanisms of amphipath-induced stomatocytosis in human erythrocytes. Blood 1992; 79: 782-786.

71. Ben-Bassat I, Bensch KG, Schrier SL. Drug-induced erythrocyte membrane internalization. J Clin Invest 1972; 51: 1833-1844.

72. Schrier SL. Drug-induced endocytosis and entrapment in red cells and ghosts. Methods Enzymol 1987; 149: 260-270.

73. Matovcik LM, Junga IG, Schrier SL. Drug-induced endocytosis of neonatal erythrocytes. Blood 1985; 65: 1056-1063.

74. Ginn FL, Hochstein P, Trump BF. Membrane alterations in hemolysis: Internalization of plasmalemma induced by primaquine. Science 1969; 164: 843-845.

75. Ihler MG. Entrapment of DNA and fluorescent compounds in erythrocyte carriers by endocytosis. Bibl Haematol 1985; 127-133.

76. Deuticke B, Kim M, Zollner C. The influence of amphotericin В on the permeability of mammalian erythrocytes to nonelectrolytes, anions and cations. Biochim Biophys Acta 1973; 318: 345-359.

77. Kitao T, Hattori K. Erythrocyte entrapment of daunomycin by amphotericin В without hemolysis. Cancer Res 1980; 40: 1351-1353.

78. Yamagata K, Kawasaki E, Kawarai H, lino M. Encapsulation of concentrated protein into erythrocyte porated by continuous-wave ultrasound. Ultrasound Med Biol 2008; 34: 1924-1933.

79. Tonetti M, Astroff B, Satterfield W, De FA, Benatti U, DeLoach JR. Construction and characterization of adriamycin-loaded canine red blood cells as a potential slow delivery system. Biotechnol Appl Biochem 1990; 12: 621629.

80. Ataullakhanov FI, Kulikova EV, Vitvitsky VM. Doxorubicin binding by humanerythrocytes. Advances in the Biosciences 1994; 92: 163-168.90

81. Атауллаханов ФИ, Баташева ТВ, Витвицкий ВМ. Влияние температуры, концентрации даунорубицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубицина эритроцитами человека. Антибиотики и химиотерапия 1994; 39: 9-10.

82. Вуймо ТА, Куликова ЕВ, Синауридзе ЕИ, Александрович ЮГ, Лисовская ИЛ, Юркевич AM, Атауллаханов ФИ. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона путем включения его в эритроциты. Молекулярная Медицина 2008; 37-43.

83. Magnani М, Rossi L, Brandi G, Schiavano GF, Montroni M, Piedimonte G. Targeting antiretroviral nucleoside analogues in phosphorylated form to macrophages: in vitro and in vivo studies. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6477-6481.

84. Chiarantini L, Rossi L, Fraternale A, Magnani M. Modulated red blood cell survival by membrane protein clustering. Mol Cell Biochem 1995; 144: 53-59.

85. Gourley DR. Human erythrocyte ghosts prepared to contain various metabolites. JAppl Physiol 1957; 10: 511-518.

86. Marsden NV, Ostling SG. Accumulation of dextran in human red cells after haemolysis. Nature 1959; 184(Suppl 10): 723-724.

87. Zimmermann U, Riemann F, Pilwat G. Enzyme loading of electrically homogeneous human red blood cell ghosts prepared by dielelctric breakdown. Biochim Biophys Acta 1976; 436: 460-474.

88. Magnani M, Giovine M, Fraternale A, Damonte G, Rossi L, Scarfi S, Benatti U, De FA. Red blood cells as a delivery system for AZT. DrugDeliv 1995; 2: 5761.

89. Ascenzo MD, Antonelli A, Chiarantini L, Mancini U, Magnani M. Red blood cells as glucocorticoids delivery system. In: Sprandel U, Way JL (editors). Erythrocytes as drug carriers in medicine. New York: Plenum Press, 1997; 8188.

90. Crinelli R, Antonelli A, Bianchi M, Gentilini L, Scaramucci S, Magnani M. Selective inhibition of NF-kB activation and TNF-alpha production in macrophages by red blood cell-mediated delivery of dexamethasone. Blood Cells MolDis 2000; 26: 211-222.92.