Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Давыдов-Синицын, Александр Петрович

• Давыдов-Синицын, Александр Петрович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Давыдов-Синицын, Александр Петрович

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПОНЯТИЕ О СТВОЛОВОЙ КЛЕТКЕ

Стволовые клетки кишечника млекопитающих

Эпителий кишечника млекопитающих

История исследований кишечного эпителия

Первые наблюдения стволовых клеток крипты

Молекулярные подходы к выявлению стволовых клеток

Воссоздание кишечного эпителия in vitro

Ниша стволовой клетки

Ниша стволовой клетки крипты

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ В КИШЕЧНОЙ КРИПТЕ

Wnt

Втр

PTEN/PI3K

Delta-Notch

Опухолевые стволовые клетки

Опухолеспецифические антигены

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа с клетками в культуре

Культивирование клеток

Пространственные клеточные культуры

Кальций-фосфатная трансфекция

Лентивирусная инфекция

Обработка антибиотиками и ганцикловиром in vitro

Построение кривых роста

Анализ сферообразования на низкоадгезивном субстрате

Получение пространственных колоний

РАБОТА С ЖИВОТНЫМИ, ОРГАНАМИ И ТКАНЯМИ

Экспериментальные животные

Получение подкожных опухолей

Получение опухолей во внутренних органах

Лечение ганцикловиром in vivo

Гистологические методы

3. Молекулярные и биохимические методы

Молекулярное клонирование

Выделение геномной ДНК

Выделение РНК и обратная транскрипция

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в реальном времени

Выделение белка и дот-гибридизация

Измерение люциферазной активности

Иммунофлюоресцентное окрашивание

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие белков Cdx и Ddx5 в клетках кишечного эпителия

Колокализация Cdx2 и Ddx5 в клетках СаСо-2 и эпителии кишечника

Влияние Cdx2 и Ddx5 на активность Wnt-сигнального пути

Пространственные культуры в коллагеновом гидрогеле

MIP101

Построение кривых роста

Иммуноокрашивание клеток MIP101

Проверка клеток MIP101 на экспрессию генов-маркеров

Активность промотора сукразы-изомальтазы в клетках MIP101

Опухолеобразование и метастазирование клеток MIP101

Формирование пространственных колоний

Кпоногенность клеток MIP101

Туморогенность MIP101

Активность Wnt-сигналинга в базовой и обогащенной популяции

Подавление РСК in vivo

ОТ-ПЦР в реальном времени на oct4

Возможные альтернативы Oct4 в стволовых клетках MIP101

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ОСК — опухолевые стволовые клетки

ОТ-ПЦР — обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

РСК — раковые стволовые клетки

СК — стволовые клетки

ЭСК — эмбриональные стволовые клетки

СВС-клетки — Crypt base columnar cells — столбчатые клетки основания крипты СЕА — Carcinoembryonic antigen — раково-эмбриональный антиген (СЕАСАМ5) CEAR — СЕА receptor — рецептор СЕА (hnRNPM)

НЕК — Human embryonic kidney cells — клетки эмбриональной почки человека

HBS — Hepes buffered saline — буферный раствор с Hepes

PBS — Phosphate buffered saline — фосфатный буферный раствор

PBST — PBS-Tween — PBS с добавлением 0.1 % Tween

+4-клетки — клетки крипты, расположенные в 4 клеточных диаметрах от её основания

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека»

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, которые уносят более 7,5 млн. жизней в год. Рак кишечника по частоте встречаемости занимает третье место в структуре онкологических заболеваний в России и в мире.

В настоящее время развивается концепция раковых стволовых клеток (РСК), согласно которой главную роль в развитии злокачественных новообразований играет небольшая субпопуляция раковых клеток, обладающая характеристиками стволовых клеток. Рядом авторов показано, что РСК отличаются от основной массы дифференцированных раковых клеток способностью к асимметричному делению, неограниченному самовоспроизведению и дифференцировке, меньшей скоростью пролиферации, высокой активностью репаративных систем, экспрессией некоторых маркеров стволовых клеток и длиной теломер [Bonnet, Dick, 1997; Jessup, Thomas, 1998; Al-Hajj et al., 2004; Xu et al., 2009]. Высокая устойчивость РСК к повреждающим воздействиям, в том числе к ионизирующему излучению и цитотоксическим веществам, позволяет им переживать радио- и химиотерапию и воссоздавать опухоль после лечения, сводя результаты лечения на нет. Дифференцирующиеся раковые клетки, в отличие от стволовых, активно размножаются, но при этом уменьшается их устойчивость к повреждающим воздействиям и теряется возможность неограниченного самовоспроизведения. Сходство РСК со здоровыми тканевыми стволовыми клетками позволяет предположить общность их происхождения. Накапливаются экспериментальные доказательства возможности злокачественной трансформации мультипотентных взрослых стволовых клеток и их более коммитированных потомков в раковые стволовые клетки [Huntly et al., 2004; Matsui et al., 2008; Zhu et al., 2009].

Изучение особенностей и возможности регулирования пролиферации РСК при возникновении различных видов рака — актуальнейшая задача современной молекулярной онкологии. Углубление наших знаний в области РСК будет способствовать разработке новых, более эффективных противоопухолевых препаратов, направленных против низкодифферен-цированных клеток, которые в сочетании с существующими хирургическими и медикаментозными подходами позволят бороться с раковой опухолью на всех уровнях её развития.

Настоящая работа посвящена проблеме раковых стволовых клеток на модели культивируемой линии колоректальной карциномы. Результаты работы подчёркивают общность раковых стволовых и эмбриональных стволовых клеток, важную роль

POU-доменных транскрипционных факторов в поддержании стволовых характеристик раковых клеток. Кроме этого, проиллюстрировано влияние клинического онкомаркера CEA (раково-эмбрионального антигена) на свойства опухолевых клеток, в том числе на стволовость.

Созданная в ходе настоящей работы клеточная культура с генетически сенсибилизированным стволовым компонентом является моделью для перспективных методов лечения рака, направленных на уничтожение стволовых клеток опухоли. Результаты работы, доказывающие активность экспрессии POU-доменных транскрипционных факторов именно в стволовом компоненте опухолевой популяции, характеризуют это семейство белков как маркер раковых стволовых клеток и потенциальную мишень для генетической терапии рака.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось создание опухолевой клеточной культуры, в которой возможно как накопление стволового компонента, так и его прицельное уничтожение, не затрагивающее дифференцированные опухолевые клетки, а также проверка гипотезы о значимости транскрипционного фактора Oct4 в обеспечении стволовых свойств раковых клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Внедрить в геном клеток линии MIP101 и её производных трансгенную конструкцию, несущую селективный маркер и ген чувствительности к антибиотику под контролем промотора Oct4 (т.н. суицидальная кассета).

2) Получить клеточные популяции, обогащенные по стволовому компоненту, за счёт активности суицидальной кассеты в раковых стволовых клетках.

3) Провести уничтожение раковых стволовых клеток в культуре путём обработки клеточной культуры предшественником цитотоксического препарата, который переходит в токсичную форму в клетках с активной суицидальной кассетой.

4) Оценить свойства полученных популяций, обогащенных по стволовым клеткам либо лишённых стволового компонента, в сравнении с исходными.

5) Осуществить подавление раковых стволовых клеток in vivo в развивающейся опухоли.

Обзор литературы

Понятие о стволовой клетке

Возникновение понятия «стволовая клетка» традиционно связывается с именем Александра Александровича Максимова, русского и американского гистолога. В своей работе по кроветворению от 1909 года "Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere" Максимов доказывает происхождение всех форменных элементов крови от одного клеточного типа, для которого вводит термин "Stammzelle". Необходимо пояснить, что немецкое слово "Stamm" означает не только «ствол», но и «племя, род, раса», то есть перевод «стволовая клетка» имеет альтернативы — например, «клетка-родоначальница».

Впоследствии кроветворные стволовые клетки (гемоцитобласты) становятся классическим примером стволовой клетки взрослого организма. Диаграмма возможных направлений развития такой клетки, содержащая множество разветвлений, напоминает дерево, в основании которого — «стволе» — находится собственно «клетка-родоначальница», отсюда и устоявшийся термин «стволовая клетка».

Любая стволовая клетка — эмбриональная, тканевая или индуцированная — обладает по меньшей мере двумя фундаментальными свойствами:

1) Способность к неограниченному самообновлению, то есть клеточное бессмертие.

2) Способность дифференцироваться, превращаться в тот или иной тип зрелых клеток.

Рядом авторов предлагались дополнительные свойства стволовых клеток:

3) Способность к асимметричному делению, при котором одна дочерняя клетка сохраняет свойства стволовой, а вторая уходит в созревание.

4) Способность стволовой клетки делать выбор между симметричным и асимметричным делением.

Свойство неограниченного самообновления является ключевым для стволовых клеток и отличает их от потомков — переходных клеток (иногда называемых полустволовыми клетками). Переходные клетки активно размножаются и в конечном итоге дифференцируются в те или иные зрелые клетки, однако их способности к размножению ограничены [Nayernia et al., 2004], и эти клетки существуют лишь непродолжительное время до окончательной дифференцировки. В то же время стволовые клетки должны сохраняться

на протяжении всей жизни организма, иначе невозможно объяснить постоянное обновление тканей (к примеру, кожи или кишечного эпителия).

Способность к бесконечному размножению является весьма нетипичной для клеток взрослого организма. Механизмы удвоения хромосом, предшествующего делению клетки, не позволяют копировать самые концы нитей ДНК, в результате чего после каждого удвоения хромосомы укорачиваются на несколько нуклеотидов. На концах хромосом располагаются участки некодирующей ДНК — теломеры, состоящие из многократно повторяющихся коротких последовательностей, поэтому укорочение хромосом до определённого предела происходит нечувствительно для клетки. После определённого числа делений, называемого пределом Хейфлика (Hayflick limit), укорочение хромосом достигает критического уровня и размножение клетки блокируется.

Очевидно, что должен существовать механизм восстановления теломер по крайней мере в некоторых типах клеток — в частности, в клетках полового пути, которые переходят из поколения в поколение, а также у одноклеточных организмов, размножающихся бесконечно. Именно у простейших — у инфузории Tetrahymena — в 1985 г. был описана теломераза— фермент, восстанавливающий концы теломер [Greider et al., 1985]. Теломераза у млекопитающих активно работает в эмбриональных клетках и клетках полового пути, в тканевых стволовых клетках и в отдельных типах зрелых клеток, способных размножаться, например, в активированных лимфоцитах.

Способность к дифференцировке в те или иные типы зрелых клеток является вторым неотъемлемым свойством стволовых клеток, позволяющим им выполнять свою функцию в организме. У разных типов стволовых клеток количество путей дифференцировки различается, и существует классификация стволовых клеток по этому признаку:

1) Тотипотентные стволовые клетки — способны давать начало любому клеточному типу всего организма на всех стадиях онтогенеза. У млекопитающих такими свойствами обладают клетки зародыша — бластомеры — на стадиях от одной до 16 клеток, после чего начинается формирование первой внезародышевой оболочки — трофобласта.

2) Плюрипотентные стволовые клетки — дифференцируются в любые ткани взрослого организма и зародыша, за исключением внезародышевых оболочек. Таковы эмбриональные стволовые клетки, составляющие внутреннюю клеточную массу бластоцисты — зародыша млекопитающих после формирования трофобласта.

3) Мультипотентные стволовые клетки — имеют ограниченное количество путей дифференцировки. К этому классу относится большинство тканевых стволовых клеток взрослого организма, которые дают начало нескольким типам клеток в пределах своей ткани.

4) Унипотентные стволовые клетки — имеют один путь дифференцировки, хотя и обладают способностью к неограниченному размножению. Типичный пример — сперматогониальные стволовые клетки.

С точки зрения как фундаментальной науки, так и практического применения, наибольший интерес вызывают клетки с максимальными возможностями дифференцировки. Тотипотентные клетки, тем не менее, остаются маловостребованными. Это связано со сложностью их поддержания, с ограниченным временем их существования в нормальном развитии, а также с тем, что они превосходят плюрипотентные клетки только лишь способностью дифференцироваться во внезародышевые оболочки, что мало востребовано и в науке, и в медицине. В то же время плюрипотентные клетки обладают всей полнотой возможностей в пределах собственно организма (в частности, взрослого), а задача их содержания в лабораторных условиях была решена намного раньше.

Что касается тканевых стволовых клеток — главным образом мультипотентных — то они представляют самый живой интерес с точки зрения тканевой биологии, а также медицины. Кроме того, лишь тканевые стволовые клетки продолжают существование на протяжении всей жизни организма.

Асимметричное деление довольно долго считалось неотъемлемым признаком стволовых клеток. В то же время очевидно, что количество стволовых клеток при строго асимметричном делении сохраняется постоянным, а поэтому такой подход не объясняет способность стволовых клеток восстанавливать свою численность после их массовой гибели.

В качестве компромиссного варианта обсуждалась способность стволовой клетки делать выбор между симметричным делением (самообновлением) и асимметричным делением под действием тех или иных регуляторных факторов. Существуют математические модели, которые вычисляют оптимальную стратегию симметричных и асимметричных делений при нормальном функционировании ткани либо при её восстановлении после сильного повреждения [Itzkovitz et al., 2012]. В последнем случае предлагается двухступенчатая модель ("Bang-bang"), при которой вначале происходит быстрое накопление стволовых клеток за счёт симметричного деления, а затем следует переход к асимметричному

делению и как следствие — формирование дифференцированных клеток с сохранением количества стволовых.

К настоящему времени по крайней мере для некоторых стволовых клеток доказано, что их деление происходит сугубо симметрично, и обе дочерние клетки обладают равными шансами как сохранить стволовые качества, так и уйти в созревание и дифференцировку [Зшррей е1 а1., 2010]. Выбор того или иного пути происходит под воздействием внешних факторов — ниши стволовых клеток, о которой будет рассказано далее.

Стволовые клетки кишечника млекопитающих

Эпителий кишечника уже много десятилетий вызывает интерес у клеточных и молекулярных биологов в контексте тканевого самообновления и биологии стволовых клеток. Во-первых, он является самой быстрообновляемой популяцией клеток в взрослом человеческом организме: клеточная выстилка тонкой кишки полностью сменяется за 4-5 суток. Во-вторых, для всех отделов кишечника на гистологическом уровне охарактеризован их стволовой компартмент — кишечные крипты, а также установлены основные молекулярные механизмы самообновления и дифференцировки клеток. Тем не менее, вопрос о конкретных стволовых клетках кишечной крипты до настоящего времени является предметом обсуждения.

Необходимо подчеркнуть, что когда речь идёт об открытии и описании стволовой клетки той или иной ткани, то предполагается, что найденный клеточный тип:

1) имеет чёткие морфологические и молекулярные признаки, позволяющие выделять его из остальных типов;

2) обладает способностью к самоподдержанию на протяжении существования данной ткани;

3) способен дифференцироваться в зрелые типы клеток данной ткани.

Именно в этом ключе необходимо рассматривать историю поисков стволовой клетки кишечной крипты.

Эпителий кишечника млекопитающих

Кишечник человека и других млекопитающих анатомически и функционально делится на два отдела: тонкая и толстая кишка. Тонкая кишка включает в себя двенадцатиперстную, тощую и подвздошную кишку, а толстая — слепую кишку с червеобразным придатком, восходящую, поперечную и нисходящую ободочную кишку, сигмовидную и прямую кишку.

В тонкой кишке происходят процессы расщепления и всасывания питательных веществ, тогда как в толстой — всасывание воды из непереваренных остатков.

Ключевой тканевый компонент кишечника — его слизистая оболочка, представляющая собой однослойный цилиндрический эпителий. В тонкой кишке слой эпителия образует многочисленные микроскопические пальцевидные выросты — ворсинки, служащие для увеличения поверхности кишки, а также впячивания — крипты Либеркюна, которые являются зонами активного размножения клеток (рис. 1.1, а). Толстая кишка имеет крипты, но лишена ворсинок (рис. 1.1,6).

тонкой (а) и толстой (б) кишки млекопитающих.

Цвета обозначают: зелёный — зрелые клетки поверхности и ворсинок; голубой — переходные клетки; синий — стволовые клетки (+4-позиция); красный — столбчатые клетки основания крипты; жёлтый — клетки Панета. [Яеуа, С1еуегз, 2005].

Базальная пластинка кишечного эпителия на всём своём протяжении находится в тесном контакте с мезенхимой собственной пластинки эпителия (lamina propria), заходящей в том числе и в ворсинки. Взаимодействие с мезенхимой играет важную роль в процессах гомеостаза кишечного эпителия.

Клеточный состав кишечного эпителия многообразен. Основу эпителия составляют каёмчатые энтероциты — терминально дифференцированные клетки, несущие многочисленные выросты-микроворсинки на апикальной поверхности и отвечающие за пристеночное пищеварение и всасывание веществ из просвета кишки. Второй тип зрелых пищеварительных клеток — бокаловидные клетки (goblet cells), имеющие сильно вакуолизованную цитоплазму; их функцией является секреция слизи, обволакивающей выстилку кишки. Помимо них, в выстилке ворсинок встречаются энтероэндокринные клетки, синтезирующие кишечные гормоны, и ряд более редких клеточных типов: щёточные (brush cells), хохлатые (tuft cells), везикулярные (caveolated cells), чашеобразные клетки (cup cells) [Barker et al., 2012]. Клетки Панета, заполняющие дно крипты, секретируют бактерицидные продукты — лизоцим и дефенсины. Наконец, микроскладчатые (microfold), или М-клетки находятся в специализированном эпителии, покрывающем Пейеровы бляшки — лимфоидные скопления, отвечающие за местный иммунитет. Считается, что М-клетки осуществляют презентацию антигенов [Clevers, 2013].

История исследований кишечного эпителия

Первые фундаментальные работы по микроскопии человеческого кишечника были выполнены на рубеже XVII—XVIII вв. В частности, описание ворсинок и крипт («кишечных желёзок») было впервые представлено в 1689 г. итальянским исследователем Марчелло Мальпиги (Marcello Malpighi) в труде "De structura glandularum conglobatarum consimiliumque partium epistolae", a затем подтверждено в работе Иоганна Конрада Бруннера (Johann Konrad Brunner) от 1715 г. "Glandula duodeni, seu pancreas secundarium detectum". Однако общепринятое ныне наименование кишечной крипты — крипта Либеркюна — связано с именем немецкого анатома Иоганна Натаниэля Либеркюна (Johann Nathanael Lieberkühn), издавшего свою работу по гистологии тонкой кишки человека "Dissertatio de fabrica et actione villorum intestinorum tenuium hominis" в 1745 г.

Иозеф Панет (Joseph Paneth), австрийский врач XIX в., в своей работе 1887 г. "Über die secernirenden Zellen des Dünndarm-Epithels" [см.: Clevers, 2013] приводит детальные зарисовки клеточного состава крипты и впервые высказывает предположение об общности

происхождения эпителия крипт и ворсинок. Необходимо отметить, что на рисунках Панета, изображающих дно крипты (рис. 1.2), помимо крупных секреторных клеток (впоследствии получивших имя самого Панета), видны небольшие, узкие клетки с вытянутым ядром, которые автор называет «тонкими клетками» ("schmale Zellen"). Повторное открытие этих клеток, а также осмысление их роли в жизнедеятельности кишечного эпителия состоялось лишь 80 лет спустя [Cheng, Leblond, 1974а].

Рис. 1.2. Оригинальный рисунок Й. Панета 1887 г., изображающий срез дна кишечной крипты.

s — «тонкие клетки» [Clevers, 2013].

Роль крипты как зоны размножения клеток была осознана к 1893 году, когда Джулио Биццодзеро (Giulio Bizzozero) показал, что клеточные деления в пределах эпителия наблюдаются исключительно внутри крипт, и предложил предложил функциональную связь между двумя компартментами — криптой и ворсинкой.

В 1947-48 гг. Леблон и Стивене (С.Р. Leblond, С.Е. Stevens) опубликовали данные по скорости и механизмам самообновления эпителия с применением методов химического ареста митоза. Они показали высокий темп обновления эпителия кишки, при котором время жизни одной клетки исчисляется несколькими сутками, а также предположили, что постулируемое ими массовое размножение клеток в крипте и их отток в ворсинки должны компенсироваться столь же массовым слущиванием зрелых клеток с вершин ворсинок, что и было подтверждено другими авторами в 1958-59 гг.

Из этих наблюдений логически следовало, что в районе основания крипты должны располагаться стволовые клетки кишечного эпителия, которые и обеспечивают постоянное восполнение клеточной популяции.

Первые наблюдения стволовых клеток крипты

Дальнейшие исследования группы Леблона [Cheng, Leblond, 1974а] показали, что основание крипты состоит не только из клеток Панета. Между ними обнаруживаются узкие, активно циклирующие клетки, получившие обозначение столбчатых клеток основания крипты (crypt base columnar cells, CBC cells). Фактически, это было переоткрытие «тонких клеток» Панета на новом техническом уровне (рис. 1.3).

Рис. 1.3. Столбчатые клетки основания крипты (СВС) между клетками Панета (Р)

[ЭйиуегБ, Оеуеге, 2012].

Мечение клеток кишечного эпителия с помощью 3Н-тимидина — радиоактивного нуклеотида, встраивающегося в ДНК при её удвоении — показало, что СВС-клетки активно синтезируют ДНК, в отличие от клеток Панета и всех типов клеток ворсинки. Через 12 часов

после прекращения добавления 3Н-тимидина меченые клетки обнаруживаются в основании ворсинки, а впоследствии и ещё выше, что свидетельствует о способности СВС-клеток к дифференцировке.

В ходе исследования ультраструктуры СВС-клеток выяснилось, что они обладают способностью к фагоцитозу гибнущих соседних клеток. В частности, в их цитоплазме обнаруживались фагосомы — вакуоли, содержащие фрагменты клеток Панета на разных стадиях распада, что не препятствовало функционированию и размножению самих СВС-клеток [Cheng, Leblond, 1974Ь]. Кроме того, в опытах по радиоактивному мечению клеток крипты выяснилось, что добавление метки приводит к гибели некоторых СВС-клеток, и их фрагменты обнаруживаются в вакуолях соседних клеток. Эти радиоактивные фагосомы были использованы для отслеживания дальнейшей судьбы СВС-клеток. Через 12-36 ч после обработки 3Н-тимидином радиоактивные фагосомы были обнаружены в различных типах зрелых клеток кишечного эпителия: в каёмчатых энтероцитах, бокаловидных и энтероэндокринных клетках, клетках Панета. Таким образом, было доказано, что СВС-клетки обладают способностью к дифференцировке во все основные типы клеток кишечного эпителия, то есть являются мультипотентными.

Альтернативной точки зрения на стволовые клетки крипты придерживалась группа британских исследователей во главе с Кристофером Поттеном (Christopher S. Potten). В 1977 г. Поттен публикует статью о клетках кишечной крипты, гиперчувствительных к радиации [Potten, 1977]. Эти клетки располагаются в боковой стенке крипты непосредственно над зоной клеток Панета (приблизительно 4 клетки от центра крипты, так называемая позиция +4) и не отличаются морфологически от соседних переходных клеток. Мечение этих клеток с помощью радиоактивного предшественника ДНК показало, что метка удерживается в одной и той же позиции по меньшей мере в течение 28 суток [Potten et al., 1978], хотя клетки при этом активно размножаются. Такой феномен мог быть объяснён тем, что при делении клеток одна из нитей ДНК, получившая метку, каждый раз уходит в ту из дочерних клеток, которая остаётся на прежнем месте. Опыты на других тканях, в частности, на эпителии языка мыши, показали аналогичные результаты. Исходя из этого, Поттен делает предположение о том, что стволовые клетки эпителия характеризуются направленной сегрегацией нитей ДНК. Схема удвоения ДНК предполагает, что одна из нитей является «бессмертной», то есть сохраняется неизменной в любом количестве клеточных делений, тогда как на её матрице каждый раз строятся новые нити. Представляется логичным, что стволовая клетка, способная выбирать между старой и новосинтезированной нитью ДНК,

удерживает «бессмертную нить», являющуюся эталонной, и таким образом страхует свой геном от ошибок, возникающих при удвоении ДНК. Возможен и другой вариант: из двух клеток, возникших при делении стволовой клетки, та, в которую попадает «бессмертная нить», остаётся стволовой, тогда как вторая уходит в дифференцировку.

Однако такого рода рассуждения ещё не являются доказательством стволовой природы клеток в позиции +4. Для этого требовалось 1) найти чёткие признаки этих клеток, отделяющие их от переходных, и 2) показать их способность к дифференцировке в зрелые клетки всех типов, присутствующих в эпителии кишки. Что касается способности к самоподдержанию, то результаты Поттена по долговечности +4-клеток могут считаться достаточными.

+4-клетки (Поттен):

- Удерживают метку за счёт асимметричного деления

- Активно пролиферируют

- Радиочувствительны

- Находятся в положении +4 (+1..+8)

СВС-клетки (Леблон):

- Не удерживают метку

- Активно пролиферируют

- Радиочувствительны

- Находятся в положении +1..+5

Рис. 1.4. Две точки зрения о стволовой клетке крипты [Barker et al., 2012].

Молекулярные подходы к выявлению стволовых клеток

Развитие молекулярной биологии и, в частности, появление методов клеточной сортировки при помощи антител к специфическим белками привели к тому, что едва ли не главной характеристикой клеточного типа становятся его молекулярные маркеры, то есть белки, присутствующие только на клетках данного типа.

Для СВС-клеток в 2007 г. был найден удачный молекулярный маркер — белок клеточной поверхности Lgr5 [Barker et al., 2007]. Группа исследователей под руководством Ханса Клеверса (Hans Clevers), выполнившая эту работу, впоследствии выходит в мировые лидеры по исследованиям кишечного эпителия.

Клевере и коллеги исходили из ранее опубликованных наблюдений о значимости клеточного сигнального пути Wnt в биологии крипты. Так, в частности, мутанты по гену транскрипционного фактора Tcf4/Tcf712 — ключевого исполнителя в Wnt-сигнальном пути — не могут сформировать нормальные крипты после рождения [Korinek et al., 1998]. Условная делеция ß-катенина — важного промежуточного звена сигнальной цепочки, либо трансгенная экспрессия Dickkopf-1, белка-антагониста этого сигнального пути ведут к исчезновению пролиферирующих крипт [Fevr et al., 2007; Kuhnert et al., 2004]. Наконец, злокачественная трансформация кишечного эпителия, являющаяся, по сути дела, нарушением нормального размножения его клеток, практически всегда затрагивает Wnt-путь [Korinek et al., 1997; Morin et al., 1997].

Из большого списка генов, контролируемых Wnt-сигналингом и активных в кишечной крипте, авторы выбрали Lgr5, поскольку его активность была привязана не к зрелым клеткам Панета и не к промежуточным пролиферирующим клеткам крипты, которые покидают её в течение двоих суток, а к столбчатым клеткам основания крипты (СВС-клеткам), которые ещё в 1974 г. были предложены на роль стволовых клеток кишечного эпителия.

Было показано, что СВС-клетки в своём большинстве экспрессируют маркер размножающихся клеток — Ki67, а некоторые из них содержат фосфорилированный гистон НЗ — маркер клеточного деления. Обработка кишечника бромдезоксиуридином — аналогом нуклеотида, встраивающимся в ДНК при её удвоении — показала, что за 4 часа по меньшей мере одна клетка в каждой крипте делится, а за 24 часа делятся практически все СВС-клетки.Так было доказано, что Lgr5-позитивные клетки основания крипты являются активно делящимися с периодом около 24 часов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Давыдов-Синицын, Александр Петрович, 2014 год

Список литературы

1. Лисковых М. А., Чуйкин И. А., Ранян А., СафинаД. А., Толкунова Е. II., Минина Ю. М., Жданова Н. С., Дыбан П.А., Маллинс Дж., Костылева Е. И., Чихиржина Е. В., Бадер М., Аленина Н., Томилин А.Н. 2011. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы: анализ условий репрограммирования и культивирования. Цитология. 53(12): 939-945.

2. Москалёва Е.Ю., Северин С.Е. 2009. Опухолевые стволовые клетки человека. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. М.: Медицина, 1 : 206-232.

3. Ницветов М.Б., Москалёва Е.Ю., Посыпанова Г.А., Макарова О.В., Степанов В.А., Рогов К.А., Коромыслова И.А., Караулов А.В., Северин С.Е., Северин Е.С. 2005. Изучение экспрессии рецептора АФП в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода. Иммунология. 26 : 122-125.

4. Al-Hajj М., Clarke M.F. 2004. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 : 7274-7282.

5. Al-Hajj M„ Wicha M.S., Benito-Hernandez A., Morrison S.J., Clarke M.F. 2003. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci U S A. 100 : 3983-3988.

6. Auclair B.A., Benoit Y.D., Rivard N.. Mishina Y., Perreault N. 2007. Bone morphogenetic protein signaling is essential for terminal differentiation of the intestinal secretory cell lineage. Gastroenterology. 133 : 887-896.

7. Barker N., Ridgway R.A., van Es J.H., van de Wetering M., Begthel H., van den Born M., Danenberg E., Clarke A.R., Sansom O.J., Clevers H. 2009. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 : 608-611.

8. Barker N., van Es J., Kuipers J., Kujala P., van den Born M., Cozijnsen M., Haegebarth A., Korving J., Begthel H., Peters P., Clevers H. 2007. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 : 1003-1007.

9. Barker N., van Oudenaarden A., Clevers H. 2012. Identifying the stem cell of the intestinal crypt: strategies and pitfalls. Cell Stem Cell. 11 : 452-460.

10. Bastide P., Dar ido С., Pannequin J., Kist R., Robine S., Marty-Double C., Bibeau F., Scherer G., Joubert D„ Hollande F„ Blache P., Jay P. 2007. Sox9 regulates cell proliferation

and is required for Paneth cell differentiation in the intestinal epithelium. J. Cell Biol. 178 : 635-648.

11. Batlle E., Henderson J.T., Beghtel II, van den Born MM., Sancho E., Huls G., MeeldijkJ., Robertson J., van de Wetering M, Paws on T., Clevers H. 2002. P-Catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. Ill : 251-263.

12. Bjerknes M., Cheng H. 1999. Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors. Gastroenterology. 116 :7-14.

13. Bjerknes M, Cheng H. 2005a. Gastrointestinal stem cells. II. Intestinal stem cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289 : G381-G387.

14. Bjerknes M„ Cheng H. 2005b. Re-examination of P-PTEN staining patterns in the intestinal crypt. Nat. Genet. 37 : 1016-1018.

15. Bonnet D., Dick J.E. 1997. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3. 730—737.

16. Brittan M., Wright N.A. 2002. Gastrointestinal stem cells. J. Pathol. 197 : 492-509.

17. Cao L, Gibson JD, Miyamoto S, Sail V, Verma R, Rosenberg DW, Nelson CE, Giardina C. 2011. Intestinal lineage commitment of embryonic stem cells. Differentiation. 81: 1-10.

18. Cheng H., Leblond C.P. 1974a. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. I. Columnar cell. Am. J. Anat. 141 : 461^79.

19. Cheng H., Leblond C.P. 1974b. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian theory of the origin of the four epithelial cell types. Am. J. Anat. 141 : 461-479.

20. Clevers H. 2013. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell 154 : 274-284.

21. Deng W„ Lin H. 1997. Spectrosomes and Fusomes Anchor Mitotic Spindles during Asymmetric Germ Cell Divisions and Facilitate the Formation of a Polarized Microtubule Array for Oocyte Specification in Drosophila. Devel. Biol. 189 : 79-94.

22. Cronwright G., Le Blanc K., Gotherstrom C., Darcy P., Ehnman M. Brodin B. 2005. Cancer/testis antigen expression in human mesenchymal stem cells: down-regulation of SSX

impairs cell migration and matrix metalloproteinase 2 expression. Cancer Res. 65 : 2207-2215.

23. Dalerba P., Dylla S.J., Park I.K., Liu R., Wang X., Cho R. W„ Hoey T., Gurney A., Huang E.H., Simeone D.M., Shelton A.A., Parmiani G„ Castelli C., Clarke M.F. 2007. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 : 10158-10163.

24. Dean M., Fojo T., Bates S. 2005. Tumour stem cells and drug resistance. Nat. Rev. Cancer. 5 : 275-284.

25. Duelli D., Lazebnik Y. 2007. Cell-to-cell fusion as a link between viruses and cancer. Nat. Rev. Cancer. 7 : 968-976.

26. Durand A., Donahue B., Peignon G., Letourneur F., Cagnard N.. Slomianny C., Perret C., Shroyer N.F., Romagnolo B. 2012. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Mathl (Atohl). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 : 8965-8970.

27. Farin H.F., van Es J.H., Clevers H. 2012. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology 143 : 1518-1529.

28. Fevr T., Robine S., Louvard D., Huelsken J. 2007. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol. Cell. Biol. 27 : 7551-7559.

29. Frank N. Y., Pendse S.S., Lapchak P.H., Margaryan A., Shlain D., Doeing C., Sayegh M.H., Frank M.H. 2003. Regulation of progenitor cell fusion by ABCB5 P-glycoprotein, a novel human ATP-binding cassette transporter. J. Biol. Chem. 278 : 47156^17165.

30. Garabedian E.M., Roberts L.J., McNevin M.S., Gordon J.I. 1997. Examining the role of Paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J. Biol. Chem. 272 :23729-23740.

31. Goodell M.A., Brose K., Paradis G., Conner A.S., Mulligan R.C. 1996. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183 : 1797-1806.

32. Greider C.W., Blackburn E.H. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43 : 405^413.

33. Guo R.J., Funakoshi S., Lee H.H., Kong J., Lynch J.P. 2010. The intestine-specific transcription factor Cdx2 inhibits beta-catenin/TCF transcriptional activity by disrupting the beta-catenin-TCF protein complex. Carcinogenesis. 31 : 159-166.

34. Haramis A.P., Begthel H., van den Born M., van Es J., Jonkheer S., Offerhaus G.J., Clevers H. 2004. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 : 1684-1686.

35. Hayashi H., Arao T., Togashi Y., Kato H., Fujita Y., De Velasco M.A., Kimura II., Matsumoto K., TanakaK., Okamoto I., Ito A., Yamada Y., Nakagawa K., Nishio K. 2009. The OCT4 pseudogene POU5F1B is amplified and promotes an aggressive phenotype in gastric cancer. Oncogene (epub) : doi:10.1038/onc.2013.547.

36. He X.C., Yin T., Grindley J.C., Tian Q., Sato T., Tao W.A., Dirisina R., Porter-Westpfahl K.S., Hembree M., Johnson T., Wiedemann L.M., Barrett T.A., Hood L., Wu H„ Li L. 2007. PTEN-deficient intestinal stem cells initiate intestinal polyposis. Nat. Genet. 39 : 189-198.

37. He X.C., Zhang J., Tong W.G., Tawfik O., Ross J., Scoville D.H., Tian Q., ZengX., He X, Wiedemann L.M., Mishina Y., Li L. 2004. BMP signaling inhibits intestinal stem cell self-renewal through suppression of Wnt-P-catenin signaling. Nat. Genet. 36 : 1117-1121.

38. Hirschmann-Jax C., Foster A.E., Wulf G.G., Nuchtern J.G., Jax T.W., Gobel U„ Goodell M.A., Brenner M.K. 2004. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 : 14228-14233.

39. Hobmayer B., Rentzsch F., Kuhn K., Happel C.M., von Laue C.C., Snyder P., Rothbacher U., Holstein T.W. 2000. Wnt signalling molecules act in axis formation in the diploblastic metazoan Hydra. Nature. 407 : 186-189.

40. Huang E.H., Hynes M.J., Zhang T., Ginestier C., Dontu G., Appelman II., Fields J.Z., Wicha M.S., Boman B.M. 2009. Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis. Cancer Res. 69 : 3382-3389.

41. HuntlyBJ., Shigematsu II., Deguchi K., Lee B.M., Mizuno S., Duclos N..Rowan R., Amaral S., CurleyD., Williams I.R., Akashi K., Gilliland D.G. 2004. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell. 6 : 587-596.

42. Itzkovitz S„ Blat I.C., Jacks T., Clevers H., van Oudenaarden A. 2012. Optimality in the Development of Intestinal Crypts. Cell. 148 : 608-619.

43. Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A. 1999. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 : 14482—14486.

44. Jessup J.M., Thomas P. 1998. CEA and metastasis: a facilitator of site-specific metastasis. In: Stanner C.P., editor. Cell adhesion and communication mediated by the CEA family: basic and clinical perspectives. New York: CRC Press; p. 195-222.

45. Jiang X., Tan J., Li J., Kivimae S., YangX., Zhuang L., Lee P.L., Chan M.T., Stanton L.W., Liu E.T., Cheyette B.N., Yu Q. 2008. DACT3 is an epigenetic regulator of Wnt/beta-catenin signaling in colorectal cancer and is a therapeutic target of histone modifications. Cancer Cell. 13 : 529-541.

46. Jubb A.M., Chalasani S., Frantz G.D., Smits R., Grabsch H.I., Kavi V., Maughan N.J., Hillan K.J., Quirke P., Koeppen H. 2006. Achaete-scute like 2 (ascl2) is a target of Wnt signalling and is upregulated in intestinal neoplasia. Oncogene. 25 : 3445-3457.

47. Kabarowski J.H, Witte O.N. 2000. Consequences of BCR-ABL expression within the hematopoietic stem cell in chronic myeloid leukemia. Stem Cells. 18 : 399^08.

48. Kalyana-Sundaram S., Kumar-Sinha C., Shankar S., Robinson D.R., Wu Y.M., Cao X., Asangani I.A., Kothari V., Prensner J.R., Lonigro R.J., Iyer M.K., Barrette T., Shanmugam A., Dhanasekaran S.M., Palanisamy N., Chinnaiyan A.M. 2012. Expressed pseudogenes in the transcriptional landscape of human cancers. Cell. 149 : 1622-1634.

49. Kang J., Shakya A., Tantin D. 2009. Stem cells, stress, metabolism and cancer: a drama in two Octs. Trends Biochem. Sci. 34 : 491-499.

50. Katz J P., Perreault N.. Goldstein B.G., Lee C.S., Labosky P.A., Yang V.W., Kaestner K.H. 2002. The zinc-finger transcription factor Klf4 is required for terminal differentiation of goblet cells in the colon. Development. 129 : 2619-2628.

51. Kim T.H., Escudero S., Shivdasani R.A. 2012. Intact function of Lgr5 receptor-expressing intestinal stem cells in the absence of Paneth cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 : 3932-3937.

52. Korinek V., Barker N., Moerer P., van Donselaar E., Huls G., Peters P.J., Clevers H. 1998. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19 : 379-383.

53. Korinek V., Barker N.. Morin P.J., van Wichen D., de Weger R., Kinzler K.W., Vogelstein B., Clevers H. 1997. Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma. Science. 275 : 1784-1787.

54. Kosinski C., Li VS., Chan A.S., Zhang J., Ho C., Tsui W.Y., Chan T.L., Mifflin R.C., Powell D.W., Yuen S.T., Leung S.Y., Chen X. 2007. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 : 15418-15423.

55. Kuhnert F., Davis C.R., Wang H.T., Chu P., Lee M., Yuan J., Nusse R., Kuo C.J. 2004. Essential requirement for Wnt signaling in proliferation of adult small intestine and colon revealed by adenoviral expression of Dickkopf-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101 : 266-271.

56. Lander A.D., Kimble J., Clevers //., Fuchs E., Montarras D., Buckingham M., Calof A.L., Trumpp A., Oskarsson T. 2012. What does the concept of the stem cell niche really mean today? BMC Biol. 10 : 19. doi: 10.1186/1741-7007-10-19.

57. LavoieJ.N., L'Allemain G,. Brunei A., Miiller R., Pouyssegur J. 1996. Cyclin D1 expression is regulated positively by the p42/p44MAPK and negatively by the p38/HOGMAPK pathway. J. Biol. Chem. 271 : 20608-20616.

58. Lewis A., Segditsas S., Deheragoda M„ Pollard P., Jejfery R., Nye E., Lockstone 11., Davis H., Stamp G., Poulsom R., Wright N., Tomlinson I. 2010. Severe polyposis in Apcl322T mice is associated with submaximal Wnt signalling and increased expression of the stem cell marker Lgr5. Gut. 59 : 1680—1686.

59. Liaw D., Marsh D.J., Li J., Dahia PL., Wang S.I., Zheng Z, Bose S., Call KM., Tsou H. C., Peacocke M., Eng C., Parsons R. 1997. Germline mutations of the PTEN gene in Cowden disease, an inherited breast and thyroid cancer syndrome. Nat. Genet. 16 : 64-67.

60. Lu X, Rang Y. 2009. Cell fusion as a hidden force in tumor progression. Cancer Res. 69 : 8536-8539.

61. MaddoxJ., Shakya A., South S., Shelton D., Andersen J.N., Chidester S., KangJ., Gligorich KM., Jones D.A., Spangrude G.J., Welm B.E., Tantin D. 2012. Transcription Factor Octl Is a Somatic and Cancer Stem Cell Determinant. PLOS Genetics 8 : el003048

62. Madison B.B., Braunstein K., Kuizon E., Portman K„ Qiao X.T., Gumucio D.L. 2005. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 : 279-289.

63. Matsui W., Wang Q., Barber JP., Brennan S., Smith B.D., Borrello L., McNiece I., Lin L., Ambinder R.F., Peacock C„ Watkins D.N., Huff C.A., Jones RJ. 2008. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance. Cancer Res. 68 : 190-197.

64. Mishina Y. 2003. Function of bone morphogenetic protein signaling during mouse development. Front. Biosci. 8 : d855-d869.

65. Montgomery R.K., Carlone D.L., Richmond C.A., Farilla L., Kranendonk M.E., Henderson D.E., Baffour-Awuah N.Y., Ambruzs D.M., Fogli L.K., Algra S., Breault D.T. 2011. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 : 179-184 .

66. Morin P.J., Sparks A.B., Korinek V., Barker N.. Clevers H., Vogelstein B., Kinzler K. W. 1997. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275 : 1787-1790.

67. Munoz J., Stange D.E., Schepers A.G., van de Wetering M., Koo B.K., Itzkovitz S., Volckmann R., Kung K.S., Koster J., Radulescu S., Myant K., Versteeg R., Sansom O.J., van Es J.H., Barker N.. van Oudenaarden A., Mohammed S., Heck A. J., Clevers H. 2012. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cell markers. Embo J. 31 : 3079-3091.

68. Nayernia K., Li M, Engel W. 2004. Spermatogonial stem cells. Methods Mol Biol. 253 : 105-120.

69. Nishisho I., Nakamura Y., Miyoshi Y, Miki Y., Ando H„ Horii A., Koyama K„ Utsunomiya J., Baba S., Hedge P. 1991. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253 : 665-669.

70. Panagopoulos I., Moller E., Collin A., Mertens F. 2008. The POU5F1P1 pseudogene encodes a putative protein similar to POU5F1 isoform 1. Oncol. Rep. 20 : 1029-1033.

71. Persad S., Troussard A.A., McPhee T.R., Mulholland D.J., Dedhar S. 2001. Tumor suppressor PTEN inhibits nuclear accumulation of P-catenin and T cell/ lymphoid enhancer factor 1-mediated transcriptional activation. J. Cell Biol. 153 : 1161—1174.

72. Pinto D., Gregorieff A., Begthel II, Clevers H. 2003. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17 : 1709-1713.

73. Podolsky D.K., Lynch-Devaney K., Stow J.L., Oates P., Murgue B., DeBeaumont M., Sands B.E., Mahida Y.R. 1993. Identification of human intestinal trefoil factor. Goblet cell-specific expression of a peptide targeted for apical secretion. J. Biol. Chem. 268 : 6694-6702.

74. Potten C.S. 1977. Extreme sensitivity of some intestinal crypt cells to X and gamma irradiation. Nature. 269 : 518-521.

75. Potten C.S., Hume W.J., Reid P., Cairns J. 1978. The segregation of DNA in epithelial stem cells. Cell. 15 : 899-906.

76. Powell A.E., Wang Y., Li Y., Poulin E.J., Means A.L., Washington M.K., Higginbotham J.N., Juchheim A., Prasad N., Levy S.E., Guo Y., Shyr Y, Aronow B.J., Haigis K.M., Franklin J.L., Coffey R.J. 2012. The pan-ErbB negative regulator, Lrigl, is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 : 146-158.

77. Reya T„ Clevers H. 2005. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434 : 843-850.

78. Roberts D.J. 2000. Molecular mechanisms of development of the gastrointestinal tract. Dev. Dyn.219: 109-120.

79. Rudolph K.L., Chang S., Lee H.W., Blasco M., Gottlieb G.J., Greider C., DePinho R.A. 1999. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96 : 701-712.

80. Sambrook J., Russell D.W. 2001. Molecular Cloning (3rd ed.). Cold Spring Harbour Laboratory Press.

81. Sangiorgi E., Capecchi M. 2008. Bmil is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat. Genet. 40: 915-920.

82. Sansom O.J., Reed K.R., Hayes A.J., Ireland II., Brinkmann II, Newton LP., Batlle E„ Simon-Assmann P., Clevers H., Nathke I.S., Clarke A.R., Winton D.J. 2004. Loss of Ape in vivo immediately perturbs Wnt signaling, differentiation, and migration. Genes Dev. 18 : 1385—1390.

83. Sato T„ Stange D.E., Ferrante M., Fries R.G.J, van Es J.H., van den Brink S., van Houdt V.J., Pronk A., van Gorp J., Siersema P.D., Clevers H. 2011a. Long-term Expansion of

Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 : 1762-1772.

84. Sato T., van Es J.H., Snippert H.J., Stange D.E., Vries R.G., van den Born M„ Barker N., Shroyer N.E, van de Wetering M., Clevers H. 2011b. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 : 415-418

85. Sato T., Vries R.G., SnippertH.J., van de Wetering M., Barker N., Stange D.E., van Es J.H., Abo A., Kujala P., Peters P.J., Clevers H. 2009. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459 : 262-265.

86. Schujers J., Clevers H. 2012. Adult mammalian stem cells: the role of Wnt, Lgr5 and R-spondins. EMBO J. 31 : 2685-2696.

87. Scoville D.H., Sato T.,HeX.C., LiL. 2008. Current view: intestinal stem cells and signaling. Gastroenterology. 134 : 849-864.

88. Seale P., Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A., Mansouri A., Gruss P., Rudnicki M.A. 2000. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 : 777-786.

89. Shakya A., Cooksey R., Cox J.E., Wang V, McClain D.A., Tantin D. 2009. Octl loss of function induces a coordinate metabolic shift that opposes tumorigenicity. Nat. Cell Biol. 11 :320-327.

90. Sneddon J.B., Zhen H.H., Montgomery K., van de Rijn M., Tward A.D., West R., Gladstone H., ChangH.Y., Morganroth G.S., Oro A.E., Brown P.O. 2006. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 : 14842-14847.

91. Snippert H.J., van der Flier L.G., Sato T., van Es J.H., van den Born M„ Kroon-Veenboer C., Barker N., Klein A.M., van Rheenen J., Simons B.D., Clevers H. 2010. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143 : 134-144.

92. Sparks A.B., Morin P.J., Vogelstein B., Kinzler K.W. 1998. Mutational analysis of the APC/beta-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer Res. 58 : 1130-1134.

93. Suo G„ Han J., WangX., Zhang J., Zhao Y., Dai J. 2005. Oct4 pseudogenes are transcribed in cancers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 337 : 1047-1051.

94. Suzuki H., Watkins D.N., Jair K.W., Schuebel K.E., Markowitz S.D., Chen W.D., Pretlow T.P., Yang B., Akiyama Y., Van Engeland M., Toyota M., Tokino T., Hinoda Y., Imai K, Herman J.G., Baylin S.B. 2004. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive Wnt signaling in colorectal cancer. Nat. Genet. 36 : 417-^122.

95. Szotek P.P., Pieretti-Vanmarcke R., Masiakos P.T., Dinulescu D.M., Connolly D., Foster R., Dombkowski D., Preffer F., Maclaughlin D.T., Donahoe P.K. 2006. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 : 11154-11159.

96. Takeda N„ Jain R., LeBoeuf M.R., Wang Q., Lu M.M., Epstein J.A. 2011. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 : 1420-1424.

97. Tantin D., Schild-Poulter C„ Wang V, Hache R.J., Sharp P.A. 2005. The octamer binding transcription factor Oct-1 is a stress sensor. Cancer Res. 65 : 10750-10758.

98. Tian H., Biehs B„ Warming S., Leong K.G., Rangell L., Klein O.D., de Sauvage F.J. 2011. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 :255-259.

99. Thomas P., Gangopadhyaya A., Steele G. Jr., Andrews C., Nakazato H., Oikawa S., Jessup J.M. 1995. The effect of transfection of the CEA gene on the metastatic behavior of the human colorectal cancer cell line MIP-101. Cancer Letters 92 : 59-66.

100. Traber P.G., Wu G.D., Wang W. 1992. Novel DNA-binding proteins regulate intestine-specific transcription of the sucrase-isomaltase gene. Molecular and cellular biology. 12:3614-3627.

101. Valkenburg K.C, Graveel C.R., Zylstra-Diegel C.R., Zhong Z„ Williams B.O. 2011. Wnt/p-catenin Signaling in Normal and Cancer Stem Cells. Cancers 3 : 2050-2079.

102. van der Flier L.G., van Gijn M.E., Hatzis P., Kujala P., Haegebarth A., Stange D.E., Begthel II., van den Born M., Guryev V., Oving I., van Es J.H., Barker N., Peters P.J., van de Wetering M., Clevers H. 2009. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell 136 : 903-912.

103. van de Wetering M., Sancho E., Verweij C., de Lau W., Oving I., Hurlstone A., van der Horn K, Batlle E., Coudreuse D., Haramis A.P., Tjon-Pon-Fong M., Moerer P., van den Born M., Soete G., Pals S., Eilers M„ Medema R., Clevers H. 2002. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. Ill : 241-250.

104. van Es J.H., Jay P., Gregoriejf A., van Gijn M.E., Jonkheer S., Hatzis P., Thiele A., van den Born M., Begthel II, Brabletz T„ Taketo M.M., Clevers H. 2005. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nat. Cell. Biol. 7 : 381-386.

105. van Es J.H., Sato T., van de Wetering M., Lyubimova A., Nee A.N., Gregoriejf A., Sasaki N.. Zeinstra L., van den Bom M., Korving J., Martens A.C., Barker N., van Oudenaarden A., Clevers H. 2012. D111+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 :1099-1104.

106. Veeman M.T., Axelrod J.D., Moon R.T. 2003. A second canon. Functions and mechanisms of beta-catenin-independent Wnt signaling. Dev. Cell. 5 : 367-377.

107. Vivanco I., Sawyers C.L. 2002. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat. Rev. Cancer. 2 : 489-501.

108. Waite K.A., Eng C. 2003. BMP2 exposure results in decreased PTEN gprotein degradation and increased PTEN levels. Hum. Mol. Genet. 12 : 679-684.

109. Yanagawa Y, ChenJ.C., Hsu L.C., Yoshida A. 1995. The transcriptional regulation of human aldehyde dehydrogenase I gene. The structural and functional analysis of the promoter. J. Biol. Chem. 270 : 17521-17527.

110. Yan K.S., Chia L.A., LiX., Ootani A., Su J., Lee J.Y., Su N., Luo Y., Heilshorn S.C., Amieva M.R., Sangiorgi E., Capecchi M.R., Kuo C.J. 2011. The intestinal stem cell markers Bmil and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 : 466-471.

111. Yeung T.M., Gandhi S.C., Wilding J.L, Muschel R., Bodmer W.F. 2010. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 : 3722—3727.

112. Xu Q., Yuan X., Tunici P., Liu G., Fan X., Xu M„ Hu J., Hwang J.Y., Farkas D.L., Black K.L., Yu J.S. 2009. Isolation of tumor stem-like cells from benign tumors. Br J Cancer, 101 : 303-311.

113. Zhu L„ Gibson P., Currle D.S., Tong Y, Richardson R.J., Bayazitov I.T., Poppleton H„ Zakharenko S., Ellison D.W., Gillbertson R.J. 2009. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457 : 603-607.