Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ибряшкина, Елена Михайловна

• Ибряшкина, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ибряшкина, Елена Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК

1.2. Классификация и номенклатура ферментов СРМ

1.3. Системы рестрикции-модификации типа И: их структурно-функциональная организация и биоразнообразие

1.4. Структурные особенности эндоиуклеаз рестрикции типа II в эволюционном аспекте

1.5. Механизмы взаимодействия эндонуклеаз типа II с ДНК

1.5.1. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II

1.5.2. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II

1.6. Система рестрикции-модификации Eco29kI и ее основные характеристики

1.7. Анализ структурной организации эндонуклеазы Eco29kI

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И МАТЕРИАЛЫ

2.1. Штаммы бактерий, бактериофаги и плазмидные вектора

2.2. Выделение и очистка ДНК

2.3. Клонирование гена эндонуклеазы Eco29kI-N6His

2.4. Сайт-специфический мутагенез in vitro

2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.6. Получение бактериальной массы

2.7. Экспрессия гена эндонуклеазы Eco29kI

2.8. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Eco29kI-N6His и её мутантных форм до гомогенного состояния в нативных условиях

2.9. Определение ферментативной активности эндонуклеазы

Eco29kI-N6His и её мутантных форм

2.10. Тестирование никазной (штриховой) активности мутантных форм эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

2.11. Ограниченный протеолиз Eco29kI

2.12. Электрофорез

2.12.1. Электрофорез белков в ПААГ

2.12.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.13. КД - спектроскопия

2.14. Анализ специфического узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI

2.15. Поляризационный флуоресцентный анализ

2.16. Анализ комплексообразования эндонуклеазы Eco29kI

2.17. Стехиометрический анализ (Метод Ферпосона)

2.18. Реакция гидролиза плазмидной ДНК

2.19. Реакция гидролиза модифицированного субстрата

2.20. Быстрые реакции Eco29kI 50 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности ДНК-белкового взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

3.2. Стехиометрия комплекса Eco29kI с ДНК

3.3. Каталитический механизм: кинетика расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Eco29kI

3.4. Мутационный анализ каталитического центра эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI»

Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и гешюй инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидпого обмена. К числу таких ферментов относятся эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов на ДНК и разрезать ее по определенным положениям.

Среди всех известных к настоящему времени эндонуклеаз рестрикции, наиболее популярными остаются эндонуклеазы рестрикции типа II. Благодаря высокой специфичности и относительно простой структуре, эндонуклеазы рестрикции типа II служат великолепными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий и эволюционных взаимосвязей среди разных групп белков.

К настоящему моменту рентгеиоструктурным анализом охарактеризовано 28 эндонуклеаз типа И. Вопреки отсутствию гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, рентгеиоструктурным анализом удалось выявить общий для эндонуклеаз рестрикции типа II структурный мотив PD.(D/E)XnK. Мотив PD.(D/E)XnK содержит аминокислотные остатки существенные для каталитической активности этих белков.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных по функциональным особенностям белков выявил наличие мотива PD.(D/E)XnK в белках, относящихся к другим классам. Тот факт, что разные ДНК-связывающие белки имеют общий структурный мотив, дает основание предполагать существование общего, хотя и далекого предка.

Интересным оказался тот факт, что среди эндонуклеаз рестрикции типа II существуют ферменты, имеющие в своей структуре консервативные мотивы неродственных фосфодиэстераз других классов и тем самым отличающиеся от типичных систем типа II семейства "PD.(D/E)XnK". Первым ферментом типа II, в структуре которого был обнаружен каталитический мотив нуклеазы Nuc семейства "PLD", была эндонуютеаза ВШ типа IIS. Позднее с использованием современных методов сравнительного анализа амииокислотиых последовательностей и структурного прогнозирования была обнаружена также гомология ряда ЭР типа II с "хоминг" - эндонуклеазами семейств "HNH" и "GIY-YIG". Так, в структуре ряда эндонуклеаз рестрикции типа II со слабо выраженным подобием (таких как, Sapl, Nspl, Kpnl, MboII) была отмечена консервативность повторяющихся Cys, которые характерны для большинства ферментов семейства "HNH".

А в последовательности эндонуклеазы Eco29kI выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG" и элементы вторичной структуры, идентифицированные экспериментально в "хоминг" - эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Наиболее консервативными аминокислотами в модуле "GIY-YIG" эндонуклеазы Eco29kI являются предположительно следующие аминокислотные остатки - тирозины в положениях 49 и 76, аргинины 86 и 104, глутаминовая кислота 142, аспарагин 154 и гистидин 108. Вполне логично предположить, что в обоих ферментах эти аминокислотные остатки выполняют одинаковые функции. По результатам рентгеноструктурного анализа N-концевого каталитического домена I-TevI была предложена модель пространственной организации каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI.

На основании этого представлялось интересным изучить структурные и биохимические характеристики Eco29kI в сравнительном аспекте с эндонуклеазами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами семейства "GIY-YIG".

Настоящая работа по теме диссертации посвящена изучению структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и сравнительному анализу свойств Eco29kI с эндонуклеазами типа II и классом "хоминг" — эндонуклеаз.

Для достижения поставленной в данной работе цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать ДНК-связывающие свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI;

2. Изучить механизм гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI;

3. Получить мутации в гене eco29kIR по ко донам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента;

4. Определить эффективность узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI в сравнении с нативным ферментом;

5. Изучить каталитические свойства мутантных форм Eco29kI;

6. Провести сравнительный анализ свойств эндонуклеазы Eco29kI с ферментами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами.

В настоящем исследовании впервые описаны ДНК-связывающие и каталитические свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа II. На основании полученных данных впервые предложена модель механизма гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI. С учетом ранее установленной в лаборатории Буйницкого Я.М. гомологии аминокислотной последовательности Eco29kI с "хоминг" - эндонуклеазой I-TevI и выявленным в структуре Eco29kI мотива "GIY-YIG", было высказано предположение о роли аминокислот, входящими в мотив "GIY-YIG", в формировании каталитического центра Eco29kI.

В работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены конструкции для продукции мутантов Eco29kI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в катализе (Y49, R104, Н108, Е142 и N154). Было изучено связывание и гидролиз ими ДНК. Показано, что остатки Y49, HI08 и Е142 являются критическими для катализа. Обнаружено, что при нарушении каталитических свойств эндонуклеазы Eco29kI мутантные формы белка сохраняют способность специфически связывать ДНК. На основании полученных данных было предположено, что центры связывания и катализа имеют разную структурную основу. Сравнение значений констант диссоциации нативного фермента и его мутантных форм выявило значительное снижение эффективности связывания последних. Возможно частичное перекрывание центров связывания и катализа или влияние пространственно соседствующих аминокислот друг на друга.

Проведен сравнительный анализ Eco29kI с эндонуклеазами типа II и "хоминг" -эндонуклеазой I-Tevl.

Полученные в ходе исследования результаты доказывают наличие структурного подобия каталитических центров эндонуклеазы Eco29kI и "хоминг" — эндонуклеаз семейства "GIY-YIG". К настоящему моменту эндонуклеаза рестрикции Eco29kI является единственным представителем ферментов типа II, которого можно отнести к ceMeftcTBy"GIY-YIG".

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ибряшкина, Елена Михайловна

выводы

1. Эндонуклеаза Eco29kI обладает Mg2+ - независимым специфическим узнаванием субстратной ДНК. Величина константы диссоциации равна 17 ± 7 нМ.

2. Мономеры Eco29kI димеризуются на субстрате, подобно эндонуклеазам типа IIS.

3. Для проявления каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI необходима одна копия последовательности узнавания на ДНК. Константа скорости гидролиза ДНК в условиях насыщения равна kobS=0.99 ± 0.06 s-l.

4. Аминокислотные остатки Y49, R104, Н108, Е142 и N154 участвуют в формировании каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI. Аминокислотные остатки Y49, HI 08 и Е142 являются критическими для гидролиза ДНК.

5. Биохимический и структурный анализы эндонуклеазы Eco29kI позволяют отнести этот фермент как к эндонуклеазам типа IIP, так и типа IIS. Каталитический центр эндонуклеазы Eco29kI имеет конформацию "хоминг" — эндонуклеаз семейства "GIY-YIG".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Спектр исследований эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа II был ограничен высокой степенью агрегации, с которой столкнулись мы в процессе выделения этого белка в препаративных количествах. Таким образом, не представлялось возможным изучение структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI рентгеноструктурным анализом.

Основываясь на биоииформационном анализе, выполненном с помощью компьютерного прогнозирования Я. Буйницким, в последовательности эндонуклеазы Eco29kI были выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG", идентифицированные экспериментально в "хоминг" — эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Теоретическая модель пространственной структуры каталитического центра Eco29kI была предложена по аналогии со структурой N-концевого каталитического домепа I-Tevl, полученной рентгеноструктурным анализом.

Замены предполагаемых каталитически значимых аминокислотных остатков в последовательности Eco29kI привели к сильным нарушениям каталитической активности мутантных белков - от частичной ее потери у мутантов по R104 и N154 аминокислотам, до полного отсутствия гидролиза ДНК у мутантных белков с заменами по Y49, HI08, El42 аминокислотам. Таким образом, аминокислотные остатки Y49, R104, Н108, Е142 и N154 участвуют в формировании каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI. А аминокислотные остатки Y49, Н108 и Е142 являются критическими для гидролиза ДНК.

Однако мутантные формы Eco29kI сохраняют способность специфически связывать ДНК, указывая на то, что мутагенез по консервативным аминокислотам не нарушает центра связывания фермента.

Впервые нами были получены экспериментальные доказательства того, что эндонуклеазы рестрикции типа II могут принадлежать к неродственному семейству "GIY-IYG" "хоминг"- эндонуклеаз и, тем самым, существенно отличаться от типичных представителей эндонуклеаз типа II семейства PD.(D/E)XnK.

Известно, что среди эндонуклеаз семейства "GIY-YIG" существует разнообразие олигомерных структур и механизмов гидролиза ДНК. Так, бактериальные нуклеазы семейства UvrC являются мономериыми мультидоменпыми белками, GIY-YIG и EndoV домены которых участвуют в процессе разрезания поврежденных цепей ДНК по обе стороны от повреждения (Рисунок 29А). В структуре мономерной "хоминг" -эндонуклеазы I-Tevl С- концевой домен отвечает за связывания с сайтом узнавания на

ДНК, а N-концевой домен - за гидролиз ДНК. Процесс гидролиза ДНК эндонуклеазой I-TevI

UvrC lllti В

I-Tevl l-Bmol

Eco29kl rz

4J

Рис. 29. Модели механизмов гидролиза эндонуклеаз семейства "GIY-YIG" (Ibryashkina Е.М. ct al, 2009). А - ДНК-репарирующий белок UvrC (выделен светлосерым цветом) и нуклеаза EndoV (выделена темно-серым цветом) используют каталитические домены для разрезания обоих цепей ДНК родственного сайта; Б -"хоминг" - эндонуклеазы I-Tevl и I-Bmol имеют один активный сайт, расположенный в домене "GIY-YIG" (обозначен светло-серым), и последовательно гидролизуют сначала нижнюю, затем верхнюю цепь ДНК; В - эндонуклеаза рестрикции Cfr42I является гомотетрамером, который одновременно связывает и разрезает две молекулы родственной ДНК; Г — эндонуклеаза Eco29kI, являясь в растворе мономером, димеризуется на родственной ДНК. начинается с разрезания нижней цепи сайта узнавая, после чего происходит искажение ДНК в сайте на 40° и последующий гидролиз верхней цепи ДНК (Рисунок 29Б). Эндонуклеаза Cfr42I семейства "GIY-YIG" характеризуется обязательной тетрамеризацией в процессе гидролиза ДНК (Рисунок 29В).

Нами было экспериментально показано, что эндонуклеаза Eco29kI, являясь в растворе мономером, в присутствии ДНК субстрата ассоциирует в димер с последующим гидролизом обоих цепей сайта узнавания 5'-CCGCGG- 3' (Рисунок 29Г). Обнаружено также, что для проявления каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI необходима одна копия последовательности узнавания на ДНК. Это свойство эндонуклеазы рестрикции Eco29kI, характерное для многих эндонуклеаз типа II, существенно рознит Eco29kI с ее ближайшим изошизомером Cfr42I, принадлежащим к семейству "GIY-YIG".

Таким образом, структурный и биохимические анализы эндонуклеазы Eco29kI позволяют отнести этот фермент как к эндонуклеазам типа IIP, так и типа IIS. Каталитический центр эндонуклеазы Eco29kI имеет конформацию "хоминг" -эндонуклеаз семейства "GIY-YIG".

Экспериментальные данные, полученные в ходе исследования, могут быть положены в основу доказательства эволюционного родства между разными классами фосфодиэстераз и позволяют предполагать дивергентный путь развития ферментов этого класса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ибряшкина, Елена Михайловна, 2009 год

1. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Лапцов В.А. Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. II Генетика. 1986. Т. 22. С. 2721-2727.

2. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методы молекулярной генетики и генной инженерии.-Новосибирск: Наука, сиб. отд-е. 1990. С. 14-25.

3. Ackers G.K., Johnson A.D. and Shea M.A. Quantitative model for gene regulation by lambda phage repressor // Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. Vol. 79. P. 1129-1133.

4. Aravind L., Makarova K.S. and Koonin E.V. Survey and summary: Holliday junction resolvases and related nucleases: identification of new families, phyletic distribution and evolutionary trajectories //Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28. P. 3417-3432.

5. Barkley M.D. Salt dependence of the kinetics of the lac repressor-operator interaction: role of nonopcrator deoxyribonucleic acid in the association reaction // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 3833-3842.

6. Belfort M. and Roberts R.J. Homing endonucleases: keeping the house in order // NAR. 1997. Vol. 25. N. 17. P. 3379-3388.

7. Bcrtani G. and Weigle J.J. Host-controlled variation in bacterial viruses // J.Bacteriol. 1953. Vol. 65. P. 113-121.

8. Bitinaite J., Wah D. A., Aggarwal A. K. and Schildkraut I. Fokl dimerization is required for DNA cleavage // Biochemistry. 1998. Vol. 95. P. 10570-10575.

9. Bujard H., Gentz R., Lanzer M., Stuber D., Miiller M., Ibrahimi I., Hauptle M.T., Dobberstein В. A T5 promotor based transcription-translation system for the analysis of proteins in vivo and in vitro. // Methods in Enzymology. 1987. V. 155. P. 416-433.

10. Bujnicki J.M. Understanding the evolution of restriction-modification systems: Clues from sequence and structure comparisons // Acta Biochim Pol. 2001. Vol. 4. P. 935-967.

11. Bujnicki J.M., Radlinska M. and Rychlewski L. Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed // Trends Biochem Sci. 2001. Vol. 26. P. 9-11.

12. Catto L.E., Bellamy S.R.W., Retter S.E. and Halford S.E. Dynamics and consequences of DNA looping by the Fokl restriction endonucleases // Nucleic Acids Research. 2008. Vol. 36(6). P. 2073-2081.

13. Chan S.H., Bao Y., Ciszak E., Laget S., Xu S.Y. Catalytic domain of restriction endonuclease Bmrl as a cleavage module for engineering endonucleases with novel substrate specificities // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 6238-6248.

14. Chevalier B.S. and Stoddard B.L. Homing cndonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29(18). P. 3757-3774.

15. Christ F., Schoettler S., Wende W., Steuer S., Pingoud A. and Pingoud V. The monomeric homing endonuclease Pl-Scel has two catalytic centres for cleavage of the two strands of its DNA substrate // EMBO J. 1999. Vol. 18(24). P. 6908-6916.

16. Connolly B.A. Assay of restriction endonucleases using oligonucleotides // From: Methods in Molecular Biology. 30: DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. Edited by: G. G. Kneale. 1994. P. 371-383.

17. Ehbrecht H.-J., Pingoud A., Urbanke C., Maass G. and Gualerzi C. Linear diffusion of restriction endonucleases on DNA // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 6160-6166.

18. Fiandt M., Hraedecna Z., Lozeron II.A., Szybalski W. The Bacteriophage Lambda. // Cold Spring Harbor Lab. New York. 1971.

19. Frednoff P., Lurz R., Luder G. and Pingoud A. Sau3Al, a monomeric type II restriction endonuclease that dimerizes on thereby induces DNA loops // J Biol Chem. 2001. Vol. 276(26). P. 23581-23588.

20. Galburt E.A. and Stoddard B.L. Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucleases // Biochemistry. 2002. Vol. 47. P. 13851-13860.

21. Gasiunas G., Sasnauskas G., Tamulaitis G., Urbanke C., Razaniene D., Siksnys V. Tetrameric restriction enzymes: expansion to the GIY-YIG nuclease family // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36(3). P. 938-949.

22. Groger R.K., Morrow D.M., Tykocinski M.L. Directional antisense and sense cDNA cloning using Epstein-Barr virus episomal expression vectors. // Gene. 1989. V. 81. P. 285-294

23. Huai Q., Colandene J.D., Chen Y., Luo F., Zhao Y., Topal M.D. and Ke H. Crystal structure of Nael an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase//The EMBO Journal. 2000. Vol. 19(12). P. 3110-3118.

24. Ibryashkina E.M., Sasnauskas G., Solonin A.S., Zakharova M.V. and Siksnys V. Oligomeric Structure Diversity within the GIY-YIG Nuclease Family // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 387. P. 10-16.

25. Jakubauskas A., Giedriene J., Bujnicki. J.M., Janulaitis A. Identification of a single HNH active site in type IIS restriction endonuclease Eco31I // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 370. P. 157-169.

26. Jo K., Topal M.D. DNA topoisomerase and recombinase activities in Nael restriction endonucleases // Science. 1995. Vol. 267. P. 1817-1820.

27. Jurica M.S. and Stoddard B.L. Homing endonucleases: structure, function and evolution // Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55. P. 1304-1326.

28. Kessler C. and Manta V. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (edition 3) // Gene. 1990. Vol. 92. P. 1-248.

29. Kim Y., Grable J. C., Love R., Green P.J. and Rosenberg J.M. Refinement of EcoRI endonuclease crystal structure: A revised protein chain tracing // Science. 1990. Vol. 249. P. 1307-1309.

30. Kirsanova O.V., Baskunov V.B., Gromova E.S. Type HE and IIF restriction endonucleases interacting with two recognition sites in DNA // Mol Biol (Mosk). 2004. Vol. 38(5). P. 886-900.

31. Kriukiene E., Lubiene J., Lagunavicius A., Lubys A. Mnll—The member of H-N-H subtype of Type IIS restriction endonucleases // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1751. P. 194-204.

32. Kruger D.H., Kupper D., Meisel A., Reuter M. and Schroeder C. The significance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genomes // FEMS Microbiol. Rev. 1995. Vol. 17. P. 177-184.

33. Modrich P. and Zabel D. EcoRI endonuclease. Physical and catalytic properties of the homogenous enzyme // J Biol Chem. 1976. Vol. 251(19). P. 5866-74.

34. Mucke M., Kruger D. H. and Reuter M. Diversity of Type II restriction endonucleases that require two DNA recognition sites // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31(21). P. 60796084.

35. Newman M., Lunnen K., Wilson G., Greci J., Schildkraut I. and Phillips S.E. Crystal structure of restriction endonuclease Bgll bound to its interrupted DNA recognition sequence // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 5466-5476.

36. Newman M., Strzelecka Т., Dorner L.F., Schildkraut I. and Aggarwal A.K. Structure of BamHI endonuclease bound to DNA: Partial folding and unfolding on DNA binding // Science. 1995. Vol. 269. P. 656-663.

37. Orlowski J. and Bujnicki J. M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on theoretical and experimental analyses // Nucleic Acids Research. 2008. Vol. 36 (11). P. 3552-3569.

38. Pertzev A.V., Kravetz A.N., Mayorov S.G., Zakharova M.V., Solonin A.S. Isolation of a strain overproducing endonuclease Eco29kI: purification and characterization of the homogeneous enzyme // Biochemistry (Mosc). 1997. Vol. 62(7). P. 732-741.

39. Pertzev A.V., Ruban N.M., Zakharova M.V., Beletzkaja I.V., Petrov S.I., Kravetz A.N., Solonin A.S. Eco29kl, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli II Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 1991.

40. Pingoud A. and Jeltsch A. Recognition and clcavage of DNA by type II restriction endonucleases // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 246. P. 1-22.

41. Pingoud A. and Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 18. P. 3705-3727.

42. Pommer A.J., Cal S., Keeble A.H., Walker D., Evans S.J., Kuhlmann U.C., Cooper A., Connolly B.A., Hemmings A.M. Mechanism and cleavage specificity of the H-N-H endonuclease colicin E9 // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 314. P. 735-749.

43. Roberts R.J. and Halford S.E. Type II restriction endonucleases. In:(Eds.) Nucleases // Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1992. P. 35-88.

44. Ruther U. A recA lacZ transformation host. // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 40874098.

45. Sambrook J., Frith E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual // Cold Spring Harbor Lab. Press. New York. 1989.

46. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. Vol. 74(12). P. 5463-5467.

47. Saravanan M., Bujnicki J.M., Cymerman I.A., Rao D.N. and Nagaraja V. Type II restriction endonuclease R.Kpnl is a member of the HNH nuclease superfamily // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 6129-6135.

48. Sasnauskas G., Halford S. E. and Siksnys V. How the Bfil restriction enzyme uses one active site to cut two DNA strands // PNAS. 2003. Vol. 11. P. 6410-6415.

49. Sasnauskas G., Jeltsch A., Pingoud A. and Siksnys V. Plasmid DNA cleavage by Muni restriction enzyme: single-turnover and steady-state kinetic analysis // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 4028-4036.

50. Shen B.W., Landthaler M., Shub D.A., Stoddard B.L. DNA binding and cleavage by the HNH homing endonuclease I-Hmul // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 342. P. 43-56.

51. Shibata Т., Ikava S., Kim C., Ando T. Sate specific deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains // J. Bacteriol. 1976. Vol. 128. P. 473-476.

52. Shimotsu H., Takahashi H., Saito H. Site-specific endonucleases in Streptomyces strains //Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44. P. 1665-1666.

53. Siksnys V., Skirgaila R., Sasnauskas G., Urbankc C., Cherny D., Grazulis S., Huber R. The CfrlOI restriction enzyme is functional as a tetramer // J Mol Biol. 1999. Vol. 291(5). P. 1105-18.

54. Sistla S. and Rao D.N. S-adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. Vol. 39. P. 1-19.

55. Soundararajan M., Chang Z., Morgan R. D., Heslop P. and Connolly B. A. DNA binding and recognition by the lis restriction endonuclease MboII // J Biol Chem. 2002. Vol. 277(2). P. 887-895.

56. Tamulaitis G., Sasnauskas G., Mucke M., Siksnys V. Simultaneous binding of three recognition sites is necessary for a concerted plasmid DNA cleavage by EcoRII restriction endonucleases // J Mol Biol. 2006. Vol. 358(2). P. 406-419.

57. Tamulaitis G., Solonin A.S., Siksnys V. Alternative arrangements of catalytic residues at the active sites of restriction enzymes // FEBS Letters. 2002. Vol. 518(1-3). P. 17-22.

58. Taylor J.D. and Halford S.E. The activity of the EcoRV restriction endonuclease is influenced by flanking DNA sequences both inside and outside the DNA-protein complex // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 90-97.

59. Terry B.J., Jack W.E. and Modrich P. Facilitated diffusion during catalysis by EcoRI endonuclease: nonspecific interactions in EcoRI catalysis // J. Biol. Chem., 1985. Vol. 260. P. 13130-13137.

60. Venclovas C., Timinskas A. and Siksnys V. Five-stranded beta-sheet sandwiched with two alpha-helices: a structural link between restriction endonucleases EcoRI and EcoRV // Proteins. 1994. Vol. 20. P. 279-282.

61. Wah D.A., Bitinaite J., Schildkraut I. and Aggarwal A.K. Structure of Fokl has implications for DNA cleavage // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 1056410569.

62. Wende W., Grindl W., Christ F., Pingoud A. and Pingoud V. Binding, bending and cleavage of DNA substrates by the homing endonuclease Pl-Scel // Nucleic Acids Research. 1996. Vol. 24 (21). P. 4123^132.

63. Werner W. E. Ferguson Plot Analysis of High Molecular Weight Glutenin Subunits by Capillary Electrophoresis // Cereal Chem. 1995. Vol. 72(3). P. 248-251.

64. Wilson G.G. and Murray N.E. Restriction and modification systems // Annu. Rev. Genet. 1991. Vol. 25. P. 585-627.

65. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga // Nucleic Acids Res. 1986. Vol. 14. P. 6017-6030.

66. Yoshioka K. KyPlot — a user-oriented tool for statistical data analysis and visualization // Comput. Stat. 2002. Vol. 17. P. 425-437.

67. Zakharova M.V., Pertzev A.V., Kravetz A.N., Beletskaya I.V., Shlyapnikov M.G. and Solonin A.S. Complete nucleotide of the Hsd plasmid pEC029 and identification of its functional regions // BBA. 1998. Vol. 1398. P. 106-112.

68. Zaremba M., Sasnauskas G., Urbanke C., Siksnys V. Conversion of the tctrameric restriction endonuclease Bse634I into a dimer: oligomeric structure-stability-function correlations // J Mol Biol. 2005. Vol. 348(2). P. 459-78.

69. Zaremba M., Sasnauskas G., Urbanke C., Siksnys V. Allosteric communication network in the tetrameric restriction endonuclease Bse634I // J Mol Biol. 2006. Vol. 363(4). P. 800-812.1. БЛАГОДАРНОСТИ

70. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю к.б.н. Марине Викторовне Захаровой за руководство, моральную поддержку и постоянную помощь при выполнении данной работы.

71. Особо благодарна зав. лабораторией «Молекулярной микробиологии» к.б.н. Александру Сергеевичу Солонину за ценные советы, критические замечания и помощь в написании диссертационной работы.

72. Я глубоко признательна всем сотрудникам нашей лаборатории за поддержку и помощь, оказанную мне в процессе выполнения экспериментов.

73. Выражаю большую благодарность д.м.н. Япушу Буйницкому (Институт молекулярной биологии, г. Варшава, Польша) за сравнительный анализ эндонуклеаз I-Tevl и Eco29kI и предоставленные компьютерные модели этих белков.

74. Я благодарю Еремина Сергея Александровича (МГУ) за предоставленную возможность повысить свою квалификацию на базе лаборатории «Биотехнологии» при МГУ и помощь в освоении новых методик.

75. Я признательна всем сотрудникам лаборатории «ДНК-белковых взаимодействий» института Биотехнологии (Вильнюс, Литва) за оказанную мне помощь в приобретении новых знаний и навыков в области кинетики взаимодействий.