Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Ледовских, Мария Владимировна

• Ледовских, Мария Владимировна
• кандидат фармацевтических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Ледовских, Мария Владимировна

Введение.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История открытия циклоспорина.

Циклоспорин А, химическое строение, свойства.

Механизм действия циклоспорина А

Фармакокинетика циклоспорина А.

Фармацевтический анализ субстанции и пероральных лекарственных форм циклоспорина А.

Строение пероральных лекарственных форм циклоспорина А. Характеристика новой пероральной лекарственной формы циклоспорина А Экорал («Айвэкс», Чешская Республика).

Фармакокинетические аспекты применения циклоспорина А. Циклоспорин как препарат «критичной дозы». Терапевтический лекарственный мониторинг циклоспорина.

Аналитические методы, используемые для мониторинга концентрации циклоспорина А в крови.

Перспектива использования дженериковых препаратов циклоспорина А.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА I. Разработка унифицированной методики ВЭЖХ-определения циклоспорина А и родственных соединений в лекарственных формах

1.1.Особенности анализа циклоспорина А с помощью ВЭЖХ.

1.2.Материалы и методы.

1.3.Результаты и их обсуждение.

1.4. Выводы

Глава П. Сравнительная оценка капсулированных препаратов циклоспорина А по показателю «Посторонние примеси»

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты и их обсуяадение.

2.3. Выводы.

Глава Ш. Изучение высвобождения циклоспорина A in vitro из капсулированных лекарственных форм

3.1. Материалы и методы.

3.2. Результаты и их обсуждение.

3.3. Выводы.

Глава IV. Определение размера частиц содержимого капсулированных препаратов циклоспорина А

4.1. Материалы и методы.

4.2. Результаты и их обсуждение.

4.3. Выводы.

Глава V. Изучение стабильности капсулированных лекарственных форм циклоспорина А

5.1. Материалы и методы.

5.2. Результаты и их обсуждение.

5.3. Выводы.

ГлаваУ1.0ценка эффективности проведения терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина по точке С2 у пациентов после аллогенной трансплантации почки

6.1. Материалы и методы.

6.2. Результаты и их обсуждение.

6.3. Выводы.

III. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг)»

Актуальность темы

Значительный прогресс в области трансплантологии, наблюдаемый в последние десятилетия, в первую очередь, связан с разработкой и введением в клиническую практику иммуносупрессивных препаратов, обеспечивших радикальное увеличение сроков выживаемости трансплантатов и пациентов и сделавших стандартной саму процедуру трансплантации. Циклоспорин А, циклический полипептид, способность которого селективно ингибировать Т-хелперную субпопуляцию лимфоцитов была открыта в 1972 г., вот уже на протяжении 20 лет является одним из наиболее важных звеньев иммуносупрессивной терапии при трансплантации органов и, несмотря на введение в практику новых иммунодепрессантов, остаётся препаратом выбора [Kahan, 1999].

В последние 10 лет актуальнейшей проблемой является введение в клиническую практику воспроизведённых (дженериковых) лекарственных форм циклоспорина А. На начало 2006 г. в Российской Федерации зарегистрировано 11 препаратов и 3 субстанции циклоспорина А отечественных и зарубежных производителей. Принимая во внимание противоречивость данных об эффективности и безопасности применения дженериков циклоспорина А, а также угрожающие жизни пациента последствия применения некачественного препарата, на этапе фармацевтической экспертизы крайне важно оценить фармацевтическую (in vitro) эквивалентность воспроизведённых препаратов циклоспорина А с учётом современных подходов к проведению подобных исследований и критериев оценки количественных результатов для последующего контроля эффективности воспроизведённых лекарственных средств и обоснования их целевого назначения. Эти результаты в совокупности с нормативными показателями качества могут быть полезными при выявлении контрафактной продукции на фармацевтическом рынке Российской Федерации.

Главной особенностью клинического применения препаратов циклоспорина А является необходимость проведения терапевтического лекарственного мониторинга (TJIM), подразумевающего контроль концентрации препарата в крови для обеспечения адекватной иммуносупрессии и сведения к минимуму возможных токсических реакций у каждого пациента [Shaw, 1999]. Наиболее информативным показателем общей экспозиции циклоспорина является площадь под кривой «концентрация - время» (Area Under Curve) - AUC0-12, однако использование данного параметра для регулярного контроля терапии представляется нереальным из-за большой трудоёмкости и высокой стоимости. Поэтому в течение долгого времени для мониторинга циклоспорина А использовалось значение С0 (trough concentration, predose concentration) - концентрация препарата в крови до приёма очередной дозы, т.е. минимальная концентрация, достигаемая между двумя приёмами препарата. Огромный опыт применения Со для контроля иммуносупрессивной терапии, однако, выявил существенные • недостатки данного показателя. Со не отражает вариабельность скорости и степени абсорбции, экспозиции циклоспорина, а также не является достоверным прогностическим фактором клинической эффективности [Johnston,2000]. В последние годы в качестве предпочтительного параметра для TJIM циклоспорина предложено использование точки С2 (концентрация циклоспорина в крови через 2 часа после перорального приёма). В связи с этим представляется актуальным оценка эффективности мониторирования иммуносупрессивной терапии циклоспорином А по показателю С2 у больных после аллогенной трансплантации почки.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось проведение сравнительного изучения капсулированных лекарственных форм циклоспорина А путём сопоставления уровня требований, методов стандартизации и стабильности препаратов различных фирм-производителей, а также оценка эффективности мониторирования терапии циклоспорином А у пациентов после аллогенной трансплантации почки.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести информационно-аналитические исследования по проблеме стандартизации препаратов циклоспорина А и их определению в биологических жидкостях при проведении терапевтического лекарственного мониторинга для обоснования выбора методов определения циклоспорина А в лекарственных формах и биологических жидкостях.

2. Провести экспериментальную оценку существующих методик определения циклоспорина А в лекарственных формах с применением метода ВЭЖХ и обосновать оптимальные условия определения циклоспорина А и родственных соединений.

3. Дать сравнительную оценку капсулированных лекарственных форм циклоспорина А, зарегистрированных в Российской Федерации, по показателю «Посторонние примеси».

4. Изучить высвобождение циклоспорина А из мягких желатиновых капсул в условиях теста «Растворение», на основании полеченных данных построить профили растворения.

5. Изучить изменение качества капсулированных лекарственных форм циклоспорина А при хранении.

6. Изучить в сравнительном аспекте мягкие желатиновые капсулы циклоспорина А различных производителей путём определения диаметра и распределения частиц по размерам.

7. Провести терапевтический лекарственный мониторинг циклоспорина А у пациентов после аллогенной трансплантации почки методом флуоресцентно-поляризационного иммунного анализа.

Научная новизна

На основании результатов информационно-аналитических и собственных экспериментальных исследований установлены оптимальные условия ВЭЖХ-определения циклоспорина А и родственных соединений в мягких желатиновых капсулах и разработана унифицированная методика, пригодная для стандартизации изучаемых препаратов.

Разработаны условия проведения испытания «Растворение» для капсулированных препаратов циклоспорина А, в условиях теста «Растворение» экспериментально изучено высвобождение циклоспорина А из мягких желатиновых капсул различных производителей относительно препарата сравнения Сандиммун Неорал, мягкие желатиновые капсулы, «Новартис Фарма», Швейцария. Получены профили растворения препаратов Сандиммун Неорал («Новартис Фарма»), Циклоспорин Гексал («Гексал»), Экорал (Айвэкс»), Циклопрен («Верофарм»). которые могут быть использованы при выборочном контроле лекарственного средства и для подтверждения постоянства состава и технологии производства в течение всего срока регистрации в Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

Разработана унифицированная методика ВЭЖХ-определения циклоспорина А и родственных соединений, предназначенная для оценки качества изучаемых препаратов по показателям «Содержание действующего вещества» и «Посторонние примеси».

Полученные данные о высвобождении циклоспорина А из капсулированных форм позволяют судить о фармацевтической эквивалентности препаратов-дженериков и могут быть использованы для решения вопроса о целесообразности их дальнейшего фармакокинетического исследования в условиях клиники.

Полученные профили растворения могут быть использованы при выборочном контроле лекарственного средства и для подтверждения постоянства состава и технологии производства в течение всего срока регистрации в Российской Федерации.

На основании результатов терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина А у больных после аллогенной трансплантации почки выявлена корреляция между ранним (в течение 7 суток после трансплантации) достижением уровня циклоспорина А в крови на второй час после приёма в пределах 1400 - 2000 нг/мл и снижением частоты острого отторжения трансплантата. Предложенная схема терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина А используется в Московском городском центре трансплантации почки.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М.Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № Госрегистрации 01.200.110545.

I. Обзор литературы История открытия циклоспорина.

В 1970 г. в рамках программы по скринингу новых антибиотиков были исследованы микроорганизмы образцов почвы из северной области Норвегии и ш.Висконсин (США).Один из выделенных fungus imperfecti, Tolipocladium inflatum, продуцировал несколько циклических полипептидов, названных позднее циклоспоринами, обладавших противогрибковыми свойствами [38]. В 1972 г. Jean-Francois Borel открыл способность циклоспорина ингибировать культуру лимфоцитов при отсутствии общего цитостатического эффекта. Предпринятое в дальнейшем детальное исследование показало, что циклоспорин в 300 раз активнее подавлял пролиферацию лимфоцитов селезёнки по сравнению с другими клеточными линиями. Эффект циклоспорина был чётко дифференцированным в отличие от цитостатических агентов и существовавших в то время иммунодепрессантов (кортикостероиды, азатиоприн, алкилирующие агенты, антилимфоцитарные глобулины). В первой публикации с результатами фармакологических исследований (1976 г.) подчёркивалось селективное действие циклоспорина на Т-хелперную субпопуляцию лимфоцитов, выраженное ингибирование продукции интерлейкина-2 и других лимфокинов [23]. Трансплантология давно ожидала появления иммуносупрессивного препарата с такими свойствами. Первые испытания циклоспорина при трансплантации сердца и почек на экспериментальных животных были проведены в Кембридже R.Calne, изучавшим в начале 60-х годов эффективность азатиоприна при трансплантации органов. Экспериментальные данные свидетельствовали, что циклоспорин — достаточно мощный и нетоксичный препарат. В 1982 г. циклоспорин был введён в протокол иммуносупрессии при трансплантации органов у человека, обеспечив радикальное увеличение сроков выживаемости трансплантатов и пациентов и сделав стандартной саму процедуру трансплантации. Это событие можно считать началом эры современной трансплантологии [37].

В настоящее время циклоспорин используется в иммуносупрессивной терапии при органной трансплантации, трансплантации костного мозга и в терапии некоторых аутоиммунных заболеваний. Несмотря на введение в практику новых иммунодепрессантов, циклоспорин до сих пор является агентом первой линии в клинической трансплантологии [103].

Циклоспорин А, химическое строение, свойства.

Молекулярная формула GjoHinNnOi^ Структурная формула

VH и

Н'^СН,

Н0 С---Н

СН сн3 /СИзн-с 4CHS сн, I

СН, СНз'СН CHj ! I T I I

H сн^ н сн3

СН,— N-C-CO-N-C — C-N-C — C0-N-C-C-N — СН,

L I* 5 : П 6 I 7 II 8 I

СН, „СОН^ НО Н О ' ч "v. I : : : 9°

СН-СН,—С з ! I

CHj «,-й 2 i н нп о 10 н в*-еИ|

ОС — С ~ N — СО — С — N - С — С — N — C-C-N-CO-C —Н

St 1 / -u II i 1 н''* i

Н СН," СН> Н ? СН, CHj Н сн СН,

L.J> СН' > \ / \ CHj CHj CHj CHj

Рис. I. Структурная формула циклоспорина А

Относительная молекулярная масса 1202,62 Химическое наименование:

R-/R*,R*- (Е)//- цикло (Ь-аланил-Б-аланил-Ы-метил-Ь-лейцил-Ы-метил-Ь-лейцил-Н-метил-Ь-валил-3-гидрокси-К,4-диметил-Ь-2~амино-6-октеноил-Ь-альфа-аминобутирил-Н-метилглицил-Ы-метил-Ь-лейцил-Ь-валил-Ы-метил-Ь-лейцил).

Циклоспорин А - циклический пептид, состоящий из 11 аминокислотных остатков, 7 из которых N-метилированы; 10 аминокислот алифатического ряда, а одна, в шестой позиции, производная треонина - 4-бутенил-4-метил-треонин (3-гидрокси-]ч[,4-диметил-Ь-2-амино-6-октеноевая кислота). Конформация молекулы характеризуется двумя структурными мотивами: антипараллельными бета-плоскостями, состоящими из аминокислотных остатков от 4-бутенил-4-метил-треонина (6) до метиллейцина (11), стабилизированными тремя внутрициклическими водородными связями, и петлёй от аланина (1) к метилвалину (5). Существует также внециклическая водородная связь между -NH группой D-аланина (2) и карбонильным кислородом И-метил-Ь-лейцина (11). Метилированная амидная связь между 9 и 10 аминокислотными остатками находится в цис-положении, все остальные - в транс-положении (рис. 1).

При исследовании строения молекулы циклоспорина А с помощью методов дифракции рентгеновских лучей и ядерного магнитного резонанса в неводных растворителях было обнаружено различие в конформации боковой цепи остатка 4-бутенил-4-метил-треонина (6). В кристаллическом состоянии эта цепь вовлечена в бета-складчатую структуру, т.е. загнута внутрь цикла, тогда как в апротонных растворителях она выступает из «тела» молекулы рис. 2) [123].

Рис.2. Молекулярные модели конформаций циклоспорина А в кристаллическом состоянии при исследовании с помощью рентгеновской кристаллографии (А) и в апротонном растворителе при исследовании с помощью ядерного магнитного резонанса (Б).

Если конформацию циклоспорина А в апротонном растворителе поместить в водную среду, молекула переходит в конформацию кристаллического состояния (рис.3).

Рис. 3, Молекулярная динамика циклоспорина А в водной среде

Исследования с помощью моноклональных антител показали, что именно в конформации кристаллического состояния, при которой боковая цепь остатка 4-бутенил-4-метил-треонина (6) «загнута» внутрь молекулы, циклоспорин А находится в биологических жидкостях [123].

Субстанция циклоспорина А представляет собой белые игольчатые кристаллы, растворимые в метаноле, этаноле, ацетоне, диэтиловом эфире, хлороформе; практически нерастворимы в воде и насыщенных углеводородах.

Циклоспорин А является одним из метаболитов, продуцируемых несовершенными грибами Tolypocladium inflatum. Другие циклоспорины (В, С, D, Е, F, G, Н, I), синтезируемые этими грибами, отличаются в своей структуре от циклоспорина А по строению углеводородного радикала в первом, пятом, седьмом и одиннадцатом аминокислотных остатках.

Механизм действия циклоспорина А.

Иммуносупрессивное действие циклоспорина А обусловлено подавлением секреции интерлейкина-2 и других лимфокинов активированными Т-лимфоцитами [110]. Основными клетками-мишенями для циклоспорина являются Т-хелперы-индукторы (CD4*). Циклоспорин А подавляет передачу митогенного сигнала от рецепторов антигенов на поверхности клеточной мембраны в ядро клетки, связываясь с соответствующими цитоплазматическими рецепторными белками (циклофиллины). Комплексы циклоспорина А и циклофиллина связывают кальциневрин и ингибируют его фосфатазную активность [79].

В норме кальциневрин, являющийся серин-треониновой фосфатазой, активируемой Са , дефосфорилирует цитоплазматическую субъединицу NF-АТ-с ядерного фактора активированных Т-лимфоцитов NF-AT, после чего субъединица NF-AT-c мигрирует в ядро, где соединяется с ядерной субъединицей NF-AT-n. В результате образуется активный транскрипционный фактор NF-AT, взаимодействующий с ДНК регуляторных участков гена ИЛ-2 и других цитокинов. После связывания с комплексом иммунофиллина и циклоспорина кальциневрин утрачивает свою дефосфорилирующую активность, в результате чего блокируется образование транскрипционного фактора NF-AT и вся дальнейшая цепь, включая de novo экспрессию ядерных регуляторных белков генов, кодирующих цитокины (ИЛ-2, ИЛ-3,ИЛ-4, ИФН-гамма), протоонкогены (Н-ras, c-myc) и рецепторы для цитокинов (ИЛ-2 рецептор) (рис.4 ) [44,119].

Atg + MHC TCR/C04 клеточная мембрана I повышение уровня Са2+

Т-ЛИМфОЦИТ вн</гриклеточный рецептор для циклоспорина кальмодулин ядерная мембрана ядро

Рис. 4 Механизм действия циклоспорина А

Atg - антиген Сп - кальцинейрин CsA - циклоспорин А IL2 - интерлейкин 2

МНС - главный комплекс гистосовместимости

NF AT - ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов

NF АТс - цитоплазматическая субъединица ядерного фактора активированных Т-лимфоцитов

NF АТп - ядерная субъединица ядерного фактора активированных Т-лимфоцитов

Р - макроэргический фосфат

TCR - антигенный рецептор Т-лимфоцита

ИЛ-2 - ключевой иммунорегулятор, контролирующий активацию лимфоцитов. ИЛ-2-стимуляция приводит к экспрессии высокоафинного ИЛ-2 рецептора на поверхности иммунных клеток и к высвобождению растворимой внеклеточной части L-цепи этого рецептора. Циклоспорин А характеризуется избирательностью иммуносупрессии, что отличает его от иммунодепрессантов неселективного действия [116]. Существует также предположение, что циклоспорин подавляет Т-клеточную активацию, стимулируя продукцию трансформирующего фактора роста-бета (TGF-b), цитокина, ингибирующего рост клетки и обладающего фиброгенными свойствами [55].

Блокируя активацию Т-хелперов-индукторов, циклоспорин А опосредованно ингибирует рост и деление цитотоксических и супрессорных Т-лимфоцитов, а также В-клеток. При этом препарат не подавляет распознавание антигена Т-клеточными рецепторами, не нарушает гемопоэз, фагоцитоз, хемотаксис. Циклоспорин А стал первым и, на сегодняшний день, наиболее безопасным и эффективным из используемых в настоящее время селективных иммунодепрессантов (FK506, микофенолят мофетил, рапамицин, моноклональные антитела) [5].

Фармакокинетика циклоспорина А.

Всасывание.

Всасывание циклоспорина А при пероральном приёме происходит медленно и часто не полностью, характеризуется значительной интра- и интериндивидуальной вариабельностью и в большой степени зависит от лекарственной формы [17]. Количество всосавшегося лекарственного вещества может варьировать от 5% у пациентов с печёночным трансплантатом до более 89% у некоторых пациентов с трансплантированной почкой [77,126]. Циклоспорин А всасывается, главным образом, в двенадцатиперстной и тонкой кишке, но в небольшой степени всасывание может происходить и в подвздошной, и толстой кишке. Пик концентрации циклоспорина А наблюдается на 1 — 6 часу после приёма препарата. У некоторых пациентов может наблюдаться двухпиковая кривая из-за усиления всасывания после еды или энтерогепатической циркуляции. Средняя биодоступность циклоспорина А составляет 30% [73]. Присутствие цитохрома Р 450 ЗА в стенке кишечника приводит к снижению биодоступности, поскольку циклоспорин А метаболизируется прежде, чем попадает в системную циркуляцию. Биодоступность циклоспорина А снижается при диарее и повышается при голодании. На всасывание препарата значительное влияние оказывает длина тонкого кишечника [18]. У детей по мере роста кишечника дозы циклоспорина А, необходимые для поддержания терапевтического уровня, снижаются. По данным Whington количество всосавшегося циклоспорина прямо пропорционально длине оставшегося тонкого кишечника (у детей, подвергшихся печёночной трансплантации, удаляется часть тонкого кишечника) при длине тонкого кишечника более 300 см. Если длина меньше 300 см, доза циклоспорина А, необходимая для достижения терапевтического уровня, возрастает логарифмически [124].

Всасывание циклоспорина А снижается при изменении кишечных функций, болезни Крона, недостаточной секреции желчи и хеморадиационном энтерите. Биодоступность циклоспорина А повышается при высоком уровне сывороточных триглицеридов и снижается при повышенном уровне гемоглобина [73 ].

Ещё одним фактором, влияющим на биодоступность циклоспорина А, является принимаемая пища. По мнению некоторых авторов, еда с высоким содержанием жира может индуцировать печеночные липазы, приводя к повышению концентрации циклоспорина в крови. Одновременное назначение циклоспорина And- альфа-токоферил-полиэтиленгликоля-100, водорастворимой формы витамина Е, значительно повышает биодоступность циклоспорина у детей при приёме внутрь [41].

Известно, что циклоспорин А и многие другие лекарственные вещества, абсорбируемые энтероцитами слизистой оболочки кишечника, затем выбрасываются в просвет кишечника с помощью антитранспортной системы Р-гликопротеина. Этот механизм может быть ингибирован другими JIB (верапамил, кетоконазол), а также жирными кислотами. Так, при одновременном приёме циклоспорина А и кетоконазола, являющегося ингибитором и цитохрома CYP3A4, и Р-гликопротеина, концентрация циклоспорина в крови повышается в 2 раза [128 ].

Распределение.

Циклоспорин А распределяется большей частью вне кровяного русла. В крови 33-47% циклоспорина находятся в плазме, 4-9% — в лимфоцитах, 5-12% — в гранулоцитах и 41-58% — в эритроцитах [73,87]. Связывание с белками плазмы (преимущественно липопротеинами) составляет примерно 90%.Молекулы циклоспорина А липофильны и поэтому накапливаются в жировой ткани. Концентрация циклоспорина А в печени, поджелудочной железе и почках выше, чем в плазме. Циклоспорин А также находят в ретикулоэндотелиальной и эндокринной системах. Он распределяется во многие органы и ткани организма и проникает в грудное молоко. Наибольшие концентрации циклоспорина находятся в жировых тканях и поджелудочной железе, однако высокие уровни могут быть также в почках, печени, селезёнке, костном мозге, сердце, аорте, коже, глазах и синовиальной жидкости [115].

Объём распределения циклоспорина А колеблется от 3,5 до 13 л/кг. Он несколько выше у женщин, чем у мужчин, что связано с большим содержанием жировой ткани.

Метаболизм.

В организме человека циклоспорин А практически полностью метаболизируется микросомальной ферментной системой цитохрома Р 450 III А печени, а также, в меньшей степени, желудочно-кишечного тракта и почек [115]. В первую фазу биотрансформации циклоспорина А происходит образование трёх первичных метаболитов: моногидроксилированных по положениям 1 и 9 производных AMI и АМ9 и N-деметилированного производного AM4N. Вторая группа первичных метаболитов образуется при последовательном окислении AMI, АМ9 и AM4N по положениям 1, 4, 6 и 9. Вторичные метаболиты представляют собой конъюгаты циклоспорина А и глюкуроновой или серной кислоты по гидроксильной группе J3-C положения шестой аминокислоты и по гидроксильным и карбоксильным группам первичных метаболитов [123].

В настоящее время идентифицировано 25 метаболитов циклоспорина А. Основными метаболитами, обнаруживаемыми у человека, являются AMI, АМ9 и AM4N. Они обладают иммуносупрессивной активностью, однако значительно более низкой, чем у исходного вещества; так, у наиболее активного метаболита AMI иммуносупрессивная активность составляет 1020% от активности циклоспорина [69,107]. Иммуносупрессивная активность • метаболитов снижается пропорционально возрастанию полярности. Распределение метаболитов циклоспорина А в тканях неравномерно: их количество в жировой ткани и поджелудочной железе значительно выше, чем в крови, а наибольшие концентрации обнаруживаются в печени и почках. Несмотря на то, что токсичность метаболитов циклоспорина А в эксперименте на животных была низкой, их роль в развитии гепатотоксичности и нейротоксичности, индуцируемых циклоспорином, у человека изучена недостаточно [36].

Выведение.

Клиренс циклоспорина А варьирует от 0,28 до 3,00 л/ч/кг. Основным путём выведения циклоспорина является желчная секреция, только 0,1 - 6% от введённой дозы выводится почками. Среднее время полувыведения после приёма внутрь колеблется от 8 до 18 часов [73]. Следует отметить, что у людей с нарушенной функцией почек или печени, у детей, пациентов пожилого возраста, а также пациентов, страдающих диабетом, время полувыведения циклоспорина А сокращается. Гемодиализ и плазмаферез не оказывают существенного влияния на клиренс циклоспорина [77 ].

Фармацевтический анализ субстанции и пероральных лекарственных форм циклоспорина А.

Циклоспорин А выпускается в виде концентрата для инъекций, раствора для приёма внутрь и мягких желатиновых капсул. В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы следующие лекарственные формы циклоспорина А: Циклоспорин раствор для приёма внутрь (масляный) 100 мг/мл (ОАО Фармакон, Россия и ЗАО Верофарм, Россия), Циклопрен капсулы 25, 50 и 100 мг (ЗАО Верофарм, Россия), Панимун Биорал капсулы 25, 50 и 100 мг и раствор для приёма внутрь 100 мг/мл (Panacea Biotec Ltd, Индия), Р-Иммун капсулы 25, 50 и 100 мг (Rusan Pharma Ltd, Индия), Сандиммун Неорал капсулы 25, 50 и 100 мг и раствор для приёма внутрь 100 мг/мл (Novartis Pharma AG, Швейцария), Веро-Циклоспорин капсулы 25,50 и 100 мг (Okasa Pharma Ltd, Индия), Имуспорин капсулы 25, 50 и 100 мг и раствор для приёма внутрь 100 мг/мл (Cipla Ltd, Индия), Циклоспорин Гексал капсулы 25,50 и 100 мг и раствор для приёма внутрь 100 мг/мл (Hexal AG, Германия), Экорал капсулы 25, 50 и 100 мг и раствор для приёма внутрь 100 мг/мл (IVАХ Pharmaceuticals s.r.o., Чешская Республика), Циклопрен концентрат для приготовления раствора для инфузий 50 мг/мл (ООО Лэнс-Фарм, Россия), Циклорал -ФС капсулы 25, 50 и 100 мг (ЗАО Фарм-Синтез, Россия). Также зарегистрированы субстанции циклоспорина фирм Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical, Китай, CKD Bio Corporation, Корея и Фарм-Синтез ЗАО,Россия.

В настоящее время монографии на субстанцию циклоспорина А (Cyclosporine, Ciclosporin) включены в ведущие зарубежные фармакопеи -Фармакопею США 27 издания (USP 27)[95], Европейскую Фармакопею 4 издания (Ph Eur IV) [40], Британскую Фармакопею 2004 г. (BP 2004) [27] и Японскую Фармакопею 14 издания (JP XIV) [57].

Согласно описанию, приводимому в Ph Eur IV, BP 2004 и JP XIV, циклоспорин А представляет собой белый порошок, легко растворимый в

19

95%-ном этаноле, метаноле, ацетоннтриле, диэтиловом эфире и хлороформе и практически нерастворимый в воде.

Для идентификации циклоспорина А в субстанции фармакопеями предложены два метода: высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детекцией (при этом время удерживания основного пика на хроматограмме исследуемого образца сравнивают со временем удерживания основного пика на хроматограмме стандартного образца) и ИК-спектроскопия (Ph Eur IV и BP 2004 предлагают сравнение спектра исследуемого образца со спектром фармакопейного стандартного образца, снятым в тех же условиях, a JP XIV - с рисунком стандартного ИК-спектра). Данный метод не включён в монографию Фармакопеи США 27 издания.

Следующие показатели, регламентирующие качество субстанции циклоспорина А, прозрачность и цветность раствора (в Ph Eur IV и BP 2004 -внешний вид раствора, «Appearance of solution»), оцениваются путём сравнения 10% раствора циклоспорина А в 95%-ном этаноле с эталонными растворами. Монографией Фармакопеи; США. определение данных показателей не предусмотрено.

Качество циклоспорина также регламентируется по показателям: удельное вращение ([а]20о -185 - -193°, тест отсутствует в монографии USP 27), тяжёлые металлы (не более 0,002%), потеря в массе при высушивании (не более 2,0% при 60° в течение; 3 часов), стерильность и бактериальные эндотоксины (тесты отсутствуют в монографиях USP 27 и JP XIV).

Показатель «Содержание действующего вещества» регламентирует содержание циклоспорина А в субстанции в количестве от 98,5% до 101,5% в пересчёте: на сухое вещество. Для количественного определения циклоспорина А все вышеуказанные фармакопеи предлагают метод ВЭЖХ с УФ-детекцией в следующих условиях: колонка 250 мм х 4 мм, наполнитель С18 3-5 мкм, подвижная фаза вода, ацетонитрил, трет-бутилметиловый эфир и фосфорная кислота в соотношении 520:430:50:1, вид .градиента — изократический, температура 80° С, скорость потока подвижной фазы 1,2 мл/мин, объём вводимой пробы 20 мкл, УФ-детекция при длине волны 210 нм.

Определение посторонних примесей в субстанции циклоспорина А проводится методом ВЭЖХ в приведённых выше условиях. Монографии фармакопей на субстанцию циклоспорина А лимитируют суммарное количество примесей (не более 1,5%), а также содержание каждой единичной неидентифицированной примеси (не более 0,7%). Ph Eur IV и BP 2004 также приводят перечень возможных примесей: циклоспорины В, С, D, Е, G, Н, L, Т, U, V, изоциклоспорин А и дигидроциклоспорин А (табл. 1 ).

Таблица1

Примеси циклоспорина А, нормируемые Ph Eur IV и BP 2004 [27,40]

Циклоспорин A (R=CH3) R г— Ala - о-А1а Meleu - MeLeu—MeVal-N' H CHa 1 4 5 Ус. L MeLeu -- Val — MeLeo—Medy - Abu A ] ti 7 JjH OH L CH3 Циклоспорин В (7 - L-Ala) Циклоспорин С (7 - L-Thr) Циклоспорин D (7 - L-Val) Циклоспорин E (5 - L-Val) Циклоспорин G (7 - (L-2-амино-пентаноил) Циклоспорин H (5 - D-MeVal) Циклоспорин L (R=H) Циклоспорин T (4 - L-Leu) Циклоспорин U (11 - L-Leu) Циклоспорин V (1 - L-Abu)

CH3 p- Ala - o-Ala MeLeu ■*■ MeLeu * MeVal-N ^H pH3 ^MeLeu—Val^MeLeu—MeGly^Abu-/ A ] OH I 1 CH3 Дигидроциклоспорин А

В настоящей работе проведено исследование мягких желатиновых капсул циклоспорина А следующих фирм-производителей: "Сандиммун Неорал" ("Новартис Фарма", Швейцария), Экорал («Айвэкс», Чешская Республика), «Циклоспорин Гексал» («Гексал», Германия), «Циклопрен» («Верофарм», РФ). Монография на данную лекарственную форму циклоспорина А представлена в USP 27 [95]. Для сопоставления требований к качеству пероральных лекарственных форм проведён анализ требований и аналитических методов, применяемых при оценке качества мягких желатиновых капсул циклоспорина А.

Идентификация циклоспорина А в капсулах проводится методом ВЭЖХ с УФ-детекцией (при этом время удерживания основного пика на хроматограмме исследуемого образца сравнивают со временем удерживания основного пика на хроматограмме стандартного образца). В Американской Фармакопее 23 и 24 изданий [96,97] для идентификации циклоспорина А в капсулах также предложен метод тонкослойной хроматографии на силикагеле: готовят растворы содержимого капсулы и стандарта циклоспорина А в смеси метанола и хлороформа (4:1), наносят по 10 мкл испытуемого и стандартного раствора на силикагелевую пластину, высушивают на воздухе и хроматографируют восходящим способом в подвижной фазе этилового спирта. Пластину высушивают и хроматографируют восходящим способом, подвижная фаза этилацетат, метилэтилкетон, вода и муравьиная кислота в соотношении 60:40:2:1. Пятна циклоспорина А проявляют следующим образом: сначала пластину сбрызгивают смесью 5 мл раствора А (340 мг висмута субнитрата в 20 мл 20% уксусной кислоты), 5 мл раствора Б (8г калия йодида в 20 мл воды), 20 мл ледяной уксусной кислоты и воды до 100 мл, затем" обрабатывают её раствором пероксида водорода. Циклоспорин А детектируется в виде коричневого пятна с значением Rf около 0,45. В USP27 данный метод для идентификации циклоспорина А не включён.

Следующий показатель, регламентирующий качество мягких желатиновых капсул циклоспорина А, - это растворение. Монография Американской Фармакопеи 27 издания в отношении теста «Растворение» вводит разграничение на капсулы циклоспорина, содержащие жидкость, и капсулы, содержащие порошок. Условия испытания и требования для капсул, содержащих жидкость, идентичны условиям испытания «Распадаемость» на приборе «Лопастная мешалка», регламентированным ГФ XI [2]. В качестве среды растворения используют воду, объём 500 мл, скорость вращения мешалки 50 об/мин. Испытание проводят на 6 капсулах, отмечают время, которое требуется для деформации капсулы с одновременным нарушением целостности оболочки с момента включения мешалки. Для всех 6 капсул это время не должно превышать 15 минут. Для капсул, содержащих порошок, данное испытание проводится на приборе «Лопастная мешалка» в среде растворения 0,1 н хлороводородной кислоты, содержащей 0,5% натрия лаурилсульфата. Через 90 минут отбирают пробу среды растворения и определяют высвободившийся циклоспорин А методом ВЭЖХ с УФ-детекцией в условиях: колонка колонка 250 мм х 4 мм, наполнитель С18 3-5 мкм, подвижная фаза вода, ацетонитрил, трет-бутилметиловый эфир и фосфорная кислота в соотношении 450:900:50:0,5, вид градиента — изократический, температура 80° С, скорость потока подвижной фазы 2 мл/мин, объём вводимой пробы 20 мкл, УФ-детекция при длине волны 210 нм. Требование данного испытания - в течение 90 минут должно высвободиться не менее 80% заявленного количества циклоспорина А в капсуле.

Также в капсулах циклоспорина А предусмотрено определение воды-(не более 3,5%).

Количественное определение циклоспорина А и посторонних примесей в капсулах проводится методом ВЭЖХ с УФ-детекцией. Особенности ВЭЖХ-определения циклоспорина и методики количественного определения по фармакопейным монографиям представлены в разделе

Экспериментальная часть». USP27 нормирует содержание действующего вещества в капсулах циклоспорина А 90 - 110% от заявленного количества. Американская Фармакопея 27 издания не регламентирует содержание примесей в желатиновых капсулах циклоспорина [95].

Таким образом, сравнительный анализ требований, предъявляемых к субстанции циклоспорина А и мягким желатиновым капсулам циклоспорина А, показал, что основным аналитическим методом при стандартизации препаратов циклоспорина А является ВЭЖХ с УФ-детекцией.

Строение пероральных лекарственных форм циклоспорина А. Характеристика новой пероральной лекарственной формы циклоспорина А Экорал («Айвэкс», Чешская Республика).

Все пероральные лекарственные формы (ЛФ) циклоспорина А представляют собой различные дисперсные системы более или менее сложного состава, включающие, наряду с действующим веществом, липофильные и гидрофильные растворители, ПАВ и другие вспомогательные вещества. В таблице 2 представлен состав мягких желатиновых капсул циклоспорина А четырёх производителей, принципиальным различием в строении лекарственной формы которых является размер , частиц, образующихся при разведении содержимого капсул водной средой.

После того, как в 90-е годы фирмой Новартис были созданы оригинальные микроэмульсия и микроэмульсионный преконцентрат Сандиммун Неорал, обеспечившие улучшенную биодоступность при приёме внутрь и продемонстрировавшие преимущества по клинической эффективности [120, 71, 78, 83, 76, 50], размер частиц действующего вещества в лекарственной форме стал рассматриваться как важнейший фактор, влияющий на биодоступность циклоспорина [56].

Для подтверждения роли размера частиц в биодоступности циклоспорина А был проведён ряд исследований [10,12,19,33,92]. Поскольку ЛФ обладает контролируемым распределением размеров частиц, независимым от условий приёма (разведения, времени смешивания и скорости и т.д.), изменить его можно только варьированием состава и соотношения индивидуальных вспомогательных веществ. В связи с этим, любые изменения в биодоступности скорее вызваны действием конкретного вспомогательного вещества, чем влиянием размера частиц ЛФ. В работе [121] авторы создали девять ЛФ циклоспорина А путём изменения одного и того же или сходных наполнителей, причём размер частиц варьировал от 10 до 500 нм.

Таблица 2

Состав мягких желатиновых капсул циклоспорина А

Наименование ингредиентов Сандиммун Неорал Экорал Циклоспорин Гексал Циклопрен

Содержимое капсулы

Активное вещество Циклоспорин А Циклоспорин А Циклоспорин А Циклоспорин А

Вспомогательные DL-a-токоферол DL-a-токоферол DL-a-токоферол DL-a-токоферол вещества

Пропиленгликоль Макрогола глицерил Макрогола Макрогола гидроксистеарат глицеролгидроксистеарат глицеролгидроксистеарат

Этанол абсолютный Этанол Этанол абсолютный Капмул МСМ (FDA 21

Codex of Fed.Register

184.1505)

Моно-,ди-, триглицериды Полиглицерил -3-олеат Полиэтиленгликоль 1000 масла сукцинат 1,2-пропиленгликоль

Пол иглицерил-10-олеат

Полиоксил 40 Полиэтиленгликоль 400 Лабрафил М 2125 CS гидрогенированное Вода очищенная касторовое масло

IV» 0\

Для оценки эффекта размера частиц на биодоступность, сравнивали среднюю площадь под кривой «концентрация — время» у ЛФ со статистически значимым различием в распределении частиц по размерам. Выяснилось, что биодоступность ЛФ, имеющих максимальный и минимальный размер частиц, не имела статистически значимой разницы. Следовательно, размер частиц не является ключевой характеристикой, влияющей на биодоступность, т.е. возможно создание ЛФ циклоспорина А с высокой биодоступностыо, которая не обязательно будет образовывать очень мелкие частицы, например, как в микроэмульсии (размер частиц меньше 200 нм).

Что же, если не размер частиц, может объяснить различия в абсорбции и биодоступности ЛФ циклоспорина? Одно из возможных объяснений состоит в величине фактической контактной поверхности частиц лекарственной формы и стенки кишечника. По мнению исследователей, причина высокой биодоступности некоторых ЛФ, образующих крупные частицы в растворе, лежит в деформационных и/или адгезивных свойствах таких частиц, которые способны обеспечивать большую эффективную контактную поверхность на эпителиальном слое, чем при их приближении к идеальной сферической форме [121].

Исследования в этом направлении привели к созданию новых пероральных ЛФ циклоспорина - Экорал раствор для внутреннего применения и Экорал мягкие желатиновые капсулы 25 мг, 50 мг и 100 мг, разработанных чешской фармацевтической компанией IVАХ - CR. Эти продукты представляют собой оригинальную запатентованную формулу, образующую микродисперсию в водной среде.

Микроскопическое исследование препаратов выявило особый характер частиц, которые могут находиться в постоянной деформации и образовывать несферические структуры (рис.5). Несмотря на то, что средний размер частиц превышает 1 микрон, все фармакокинетические параметры такой дисперсии увеличены, а вариабельность их снижена [11]. Способность поддерживать несферическую форму определяет гелеподобный характер таких частиц. ° 0 о noun. о 'о -■.■■ •:•:■•.•'.о- , ■■■ ■ "о ° т, " ^^ (1 ° а soa> ^^ • •. Л о ^ О .О . ' о-о: о . °° ° о О!. й

Q, ' -О. '•'.■ :. V. О о «Яр ° О^О

Рис. 5 . Эскиз микрофотографии гелсиодобных частиц циклоспорина А в водной срсдс.

Микродисперсные частицы; действуют как система доставки ЛВ^ которая приносит растворённый1 циклоспорин к месту всасываниям ЖКТ.

Благодаря гидрофильному гелеподобному характеру созданных микродисперсионных частиц система способна преодолеть кишечный слизистый слой, прикрепиться к кишечной стенке и обеспечить достаточный градиент концентрации активного? вещества, что приводит к повышению биодоступности [11].

До настоящего, времени все препараты циклоспорина А в виде капсул, включая Сандиммун и Сандиммун Неорал, при разбавлении в водной среде (например, в яблочном соке до приёма внутрь, в содержимом желудка после проглатывания) образовывали грубую эмульсию (размер капель 1 мкм -Сандиммун) и более тонкую гомогенную дисперсию с размером капель меньше 100 им - Сандиммун Неорал. Последняя вела себя как смешанная мицеллярная фаза- (поэтому и достигалась быстрая абсорбция), тогда как грубая эмульсия, получающаяся из Сандиммуна, нуждалась в дальнейшем эмульгировании до смешанных мицелл; с помощью желчных солей, только после этого масляные капли переваривались, и ЛВ ;высвобождалось. Большая биодоступность смешанной мицеллярной фазы по сравнению с классической эмульсионной фазой отражает возможность создания большей внутренней поверхности, которая обеспечивает лучший и более равномерный контакт частиц с растворённым активным веществом и стенки кишечника. Поэтому Сандиммун Неорал обладает улучшенным фармакокинетическим профилем и большей биодоступностью [50].

Вопреки тому, что частицы, образующиеся при диспергировании Экорала в водной среде, размером превышают 1 микрон и поэтому должны быть классифицированы как эмульсионные капли, биодоступность такой системы соответствует смешанной мицеллярной системе со значительно большей внутренней поверхностью. Диспергированные частиц Экорала способны оставаться в контакте со стенкой ЖКТ дольше благодаря их биоадгезивности.

Способность капель Экорала образовывать несферические частицы обусловлена уникальной комбинацией наполнителей. Благодаря их амфифильному характеру и отсутствию глицеридов частицы способны к ассоциации и созданию более или менее организованных супрамолекулярных ассоциатов (рис. 6) [II].

Рисб. Схематическое изображение супрамолекулярных ассоциатов циклоспорина и амфифильных наполнителей Экорала.

Таким образом, Экорал представляет собой новую систему доставки циклоспорина А к месту всасывания в ЖКТ. Несмотря на то, что размер частиц этой лекарственной формы на несколько порядков превышает частицы, образуемые Сандиммуном Неоралом, фармакокинетические

29 параметры её близки субмикронной эмульсии, что подтверждают данные исследования биоэквивалентности [11,42, 43,85,99].

Фармакокинетические аспекты клинического применения циклоспорина А

Циклоспорин как препарат «критичной дозы». Терапевтический лекарственный мониторинг циклоспорина.

Главная особенность клинического применения циклоспорина состоит в том, что он относится к группе препаратов «критичной дозы» (critical dose drug), для которых небольшие изменения в режиме дозирования и/или концентрации в крови могут приводить к существенному снижению терапевтического эффекта (при уменьшении дозы или концентрации) или развитию токсичности (при увеличении дозы или концентрации) [35,108]. В литературе также встречается термин «препарат узкого терапевтического индекса», однако он не вполне корректен в отношении циклоспорина [21]. Конечно, одной из главных фармакодинамических характеристик циклоспорина является его узкий терапевтический диапазон (т.е. токсическая концентрация близка к терапевтической). Следовательно, при неадекватном режиме дозирования даже небольшое повышение концентрации препарата в крови может привести к серьёзным нежелательным реакциям, таким как нефротоксичность и артериальная гипертензия, а снижение концентрации до субтерапевтической обусловит недостаточную иммуносупрессию и, как следствие, отторжение трансплантата [25]. Однако существуют и другие характеристики циклоспорина, определяющие его фармакокинетический профиль. Высокая вариабельность фармакокинетических параметров циклоспорина наблюдается не только у разных больных, но и у одного и того же пациента [66]. Интраиндивидуальная вариабельность биодоступности обусловливает необходимость корректирования дозы циклоспорина, причём дозу препарата выбирают с учётом массы тела пациента (мг/кг), лечение проводят при регулярном контроле концентрации в крови [25]. Одной из

30 причин вариабельной биодоступности циклоспорина считается его непредсказуемое всасывание в ЖКТ, обусловленное зависимостью от состояния ЖКТ, наличия или отсутствия в нём пищи, количества желчи в просвете кишки, времени после трансплантации, а также, возможно, от генетического полиморфизма CYP3A4, CYP3A5 и MDR-1 (Р-гликопротеина) [51,118]. И, наконец, биодоступность циклоспорина в значительной степени зависит от лекарственной формы [52].

Характеристика циклоспорина как препарата критичной дозы

Узкий терапевтический диапазон

Необходимость мониторинга концентрации препарата в крови

Высокая интер- и интраиндивидуальная вариабельность фармакокинетики ш Низкая или труднопредсказуемая всасываемость

Зависимость биодоступности от лекарственной формы

Зависимость дозировки от массы тела

Серьёзные или угрожающие жизни последствия превышения или занижения дозы

Таким образом, все вышеперечисленные свойства циклоспорина позволяют относить его к группе препаратов «критичной дозы», главным следствием чего является необходимость «индивидуализации» терапии с помощью терапевтического лекарственного мониторинга [21,109].

Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ) циклоспорина А подразумевает контроль концентрации препарата в крови для обеспечения адекватной иммуносупрессии и сведения к минимуму возможных токсических реакций у каждого пациента, то есть для «индивидуализации» терапии [84].

Наиболее информативным показателем общей экспозиции циклоспорина является площадь под кривой «концентрация — время» AUC0-12 [22,78,104]. Тем не менее, использование данного параметра для регулярного контроля терапии представляется нереальным из-за большой трудоёмкости и высокой стоимости. Поэтому в течение долгого времени для мониторинга циклоспорина использовалось значение Со (trough concentration, predose concentration) - концентрация препарата в крови до приёма очередной дозы, т.е. минимальная концентрация, достигаемая между двумя приёмами препарата. На основании такого подхода были предложены границы терапевтического диапазона циклоспорина (табл.3), однако необходимо отметить, что данные значения являются примерными, зависят от времени после трансплантации, функционирования органа, степени циклоспориновой токсичности, а также от аналитического метода, используемого для измерения концентрации [125 ].

Таблица 3 .

Примерные границы терапевтического диапазона циклоспорина А

ГРАНИЦЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ЦИКЛОСПОРИНА, НГ/МЛ

МЕТОД Почечный трансплантат Сердечный трансплантат Печёночный трансплантат

Индукционная терапия

ВЭЖХ1 150-225 250 - 325 225-300

МФПИА2 250-375 300-400 250-313

Поддерживающая терапия

ВЭЖХ 100-150 125-175 100-150 мФПИА 100-250 150-250 135-200

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография 2мФПИА - моноклональный флуоресцентно-поляризациониый иммунный анализ

Хотя мониторинг на основе Со до сих пор используется многими трансплантационными центрами, информативность его ставят под сомнение,

32 во-первых, плохая корреляция с AUC0.i2, во-вторых, невозможность адекватно прогнозировать неблагоприятные исходы и, в-третьих, зависимость целевой терапевтической концентрации от аналитического метода, используемого для мониторинга [58,81 ].

В последние годы внимание исследователей сосредоточено на изучении фармакокинетики циклоспорина в первые 4 часа после приёма, т.е. в период всасывания (absorbtion profiling). Установлено, что именно в этот период фармакокинетические параметры циклоспорина наиболее вариабельны, тогда как в течение оставшейся части интервала дозирования (4-12 часов) они остаются практически постоянными [58,127]. Клинические исследования по использованию единичных (Сг , Сз - концентрации на 2 и 3 час после приёма препарата) или множественных временных точек (AUC0-4, AUCo-6 - площади под кривой «концентрация - время» за 4 и 6 часов после приёма препарата) продемонстрировали их значительные преимущества в отношении прогнозирования неблагоприятных реакций, снижения частоты острых отторжений и улучшения выживаемости трансплантата. [14,16,80,81] В настоящее время предпочтительным для терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина является использование точки Сг- Доказано, что этот показатель тесно коррелирует с AUC0-12 , т.е. адекватно предсказывает экспозицию циклоспорина [20, 30, 31, 45, 74 ,77, 82], а также лучше отражает его иммуносупрессивное действие, т.к. установлено, что наибольшее ингибирование кальциневрина и продукции ИЛ-2 происходит именно в первые два часа после приёма препарата [48,113]. И наконец, существенным преимуществом использования точки С2, прежде всего, для лабораторий, занимающихся терапевтическим лекарственным мониторингом, является простота измерения (однократный забор крови) и отсутствие существенной зависимости уровня целевой концентрации циклоспорина от используемого метода анализа [31,75].

Аналитические методы, используемые для мониторинга концентрации циклоспорина А в крови

Терапевтический лекарственный мониторинг циклоспорина А обычно производится с использованием следующих методов: высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), радиоиммунного анализа (РИА) и флуоресцентно-поляризационного иммунного анализа (ФПИА) [9]. Метод ВЭЖХ считается референсным методом, поскольку обеспечивает абсолютную специфичность по отношению к циклоспорину А, так что присутствие метаболитов циклоспорина в образцах крови пациентов не влияет на результат анализа [24, 28, 29, 32, 34, 68, 72, 89, 93, 109, 112]. Однако технические сложности, связанные с ВЭЖХ, а также некоторые особенности хроматографического поведения циклоспорина (о чём будет сказано ниже) препятствуют широкому распространению данного метода для рутинного мониторинга. В настоящее время большинство лабораторий использует более простые в техническом исполнении модификации иммунных методов для определения концентрации циклоспорина в крови: радиоиммунный анализ (РИА), энзим-мультипликационный иммунный анализ (EMIT) и флуоресцентно-поляризационный иммунный анализ (ФПИА) [49, 53, 70, 94, 100, 102, 105, 117, 122, 129]. Все конкурентные методы иммуноанализов для определения биологически активных веществ (JIB, гормоны) основаны на принципе конкуренции между определяемым веществом в образце и меченым веществом (метка) за ограниченное число мест связывания антител, специфичных к определяемому веществу. Концентрация немеченого вещества из образца будет определяться из того, сколько меченого соединения (метки) может связаться со специфическими антителами. В качестве соединений, используемых для образования меток, выбирают такие, которые можно количественно измерить. Тип таких соединений для меток и характеризует различные типы иммуноанализов.

Радиоиммунные методы анализа (РИА) используют радиоактивные изотопы для мечения веществ. Разделение связанной и несвязанной фракции метки и определение радиоактивности в одной или обеих разделённых фракциях позволяет определить количество связавшейся метки[53]. Иммуноферментные методы анализа (ИФА) используют фермент, по активности которого определяют связывание метки с антителами. Путём определения ферментативной активности, по превращению субстрата, косвенно определяют связавшуюся метку [106]. Превращение субстрата (или образование продукта) может быть определено по изменению окраски, поглощения или флуоресценции. Эти превращения субстрата могут быть сопоставлены с концентрацией определяемого вещества путём построения калибровочной кривой. Другой тип иммуноферментного метода анализа состоит в мечении определяемого вещества субстратом вместо фермента. При связывании метки с антителами в этом случае субстрат становится недоступным для фермента в системе, так что только незначительное количество фермент-превращённого продукта образуется [70,94,129].

Иммунные методы можно разделить на две группы: специфические, измеряющие концентрацию циклоспорина А, и неспецифические, измеряющие циклоспорин А и фракции его метаболитов, находящиеся в крови пациентов [114]. Европейская Программа по внешней оценке качества методов для определения концентрации циклоспорина (External Quality Assessment Scheme for Cyclosporine Assay) показала, что уже 10 лет назад 91% результатов определения циклоспорина А в лабораториях-участниках Программы были получены с применением специфических методов - ВЭЖХ или специфических иммуноанализов, из них с помощью полностью автоматических техник (TDx (ФПИА) и энзим-мультипликационного иммунного анализа (EMIT)) - 73% всех результатов [130]. Концентрация циклоспорина А, измеренная методом моноклонального специфического иммуноанализа (TDx ФПИА, Cyclo-Trac РИА и EMIT) хорошо коррелирует с ВЭЖХ (г = 0.99-1.00); результаты, полученные с помощью EMIT, очень близки к ВЭЖХ, тогда как результаты RIA Cyclo-Trac и TDx слегка завышены (10-20%). Результаты неспецифических методов (TDx поликлональный и неспецифический Cyclo-Trac РИА) превышают результаты ВЭЖХ в 3 — 4 раза [130].

Таким образом, в настоящее время для терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина А рутинно используются полностью автоматизированные технологии на основе иммунных анализов.

Перспектива использования дженериковых препаратов циклоспорина А

Первая пероральная лекарственная форма циклоспорина А, Сандиммун, созданная компанией "Сандоз Фарма" (Швейцария), представляла собой суспензию действующего вещества в масле, не смешивающуюся с водой, и в полной мере обладала всеми характеристиками, присущими препаратам «критичной дозы» [76]. Всасывание циклоспорина А из лекарственной формы происходило в проксимальном отделе тонкого кишечника и в большой степени зависело от времени прохождения через-тонкий кишечник, состояния ЖКТ, присутствия пищи или желчи. Низкая и труднопредсказуемая абсорбция обусловливала высокую интер- и интраиндивидуальную вариабельность фармакокинетики, что мешало контролировать экспозицию препарата в организме и обеспечивать достаточную иммуносупрессию и минимальную токсичность. В клиническом отношении эти особенности приводили к увеличению количества эпизодов острого отторжения и значительному снижению однолетней выживаемости трансплантата [52].

Необходимость новой пероральной лекарственной формы циклоспорина А с улучшенной биодоступностью стала одной из главных проблем трансплантологии начала 90-х г.г. прошлого века. Биофармацевтические исследования, предпринятые фирмой Новартис Фарма (Швейцария) показали, что абсорбцию циклоспорина можно увеличить за счёт уменьшения размера частиц в эмульсии и улучшения его растворимости [56].

Создание оригинальной микроэмульсионной формы циклоспорина А Сандиммун Неорал (Новартис Фарма) стало настоящим .прорывом в клинической трансплантологии. Неорал обеспечил значительное увеличение биодоступности циклоспорина за счёт более быстрого и предсказуемого всасывания (средняя AUC на 20 — 50%, а Стах на 40 -106% выше при приёме Неорала), снижение вариабельности фармакокинетики, что, в свою очередь, привело к повышению эффективности и безопасности иммуносупрессии и достоверным улучшениям результатов лечения [50,52,120]. В настоящее время Неорал является «золотым стандартом» иммуносупрессивной терапии.

Споры об эффективности и безопасности применения воспроизведённых препаратов циклоспорина начались ещё до появления первого его дженерика [60,65]. Необходимость дженериков циклоспорина была обусловлена, главным образом, экономическим аспектом [67]. Дело в том, что существует реальная проблема неспособности пациентов оплачивать длительную (иногда и пожизненную) дорогостоящую иммуносупрессионную терапию, что может привести к отторжению трансплантата. Из-за более низкой стоимости разработки и конкуренции на рынке дженериковые препараты стоят значительно дешевле, чем оригинальные. Использование дженериков позволяет экономить значительные средства при эквивалентном терапевтическом эффекте, а также увеличить степень комплаентности пациентов иммуносупрессивной терапии [67].

Например, стоимость годового лечения Сандиммуном Неоралом взрослого пациента с трансплантантом солидного органа в 2,4 раза дороже, чем стоимость лечения воспроизведённым препаратом Циклоспорин Гексал («Гексал АГ», Германия).

Однако, многие клиницисты с большой осторожностью относятся к воспроизведённым препаратам циклоспорина. При решении вопроса о переводе пациента с оригинального препарата на дженерик или при назначении дженерика de novo врач должен быть абсолютно уверен, что воспроизведённая лекарственная форма эквивалентна оригинальной по фармакокинетическому профилю, а также не уступает ей по эффективности и безопасности, т.е. эквивалентна терапевтически [59,61,64,118]. С терапевтической эквивалентностью связана и проблема установления биоэквивалентности дженериков циклоспорина. Исследования биоэквивалентности проводят с участием здоровых добровольцев, при этом результаты автоматически экстраполируются на пациентов, подвергшихся трансплантации [59, 88]. Но в случае с реципиентами трансплантатов существует множество факторов, существенно влияющих на фармакокинетику циклоспорина, которые не учитываются при проведении подобных исследований (рис. 7) [18].

Рис.7 Факторы, влияющие на фармакокинетику циклоспорина у пациентов, перенесших трансплантацию.

Поэтому ключевым моментом является определение эквивалентности воспроизведённых препаратов циклоспорина у пациентов, перенёсших трансплантацию [61].

Интер- и интраиндивидуальная вариабельность фармакокинетики циклоспорина обусловили возникновение вопроса о необходимости использования расширенных критериев биоэквивалентности, включая изучение индивидуальной биоэквивалентности. Фармако-экономическая целесообразность использования критерия индивидуальной биоэквивалентности в настоящее время рассматривается FDA [18].

О важности серьёзного и всестороннего подхода к изучению эквивалентности дженериков циклоспорина свидетельствует следующий факт. Воспроизведённый препарат циклоспорина SangCya (SangStat Medical Corporation of Fremont, США) в виде раствора для приёма внутрь, прошедший все испытания и зарегистрированный в США в 1997 г., в 2000г. был отозван с рынка из-за того, что одновременный приём с яблочным соком (рекомендованный в аннотации) приводил к значительному снижению биодоступности по сравнению с оригинальным Сандиммуном Неоралом [91].

Ещё один аспект проблемы использования дженериков циклоспорина состоит в абсолютной противоречивости публикуемых в литературе данных по фармакокинетике и клинической эффективности воспроизведённых препаратов.

Так, данные клинических исследований, проводимых под эгидой компаний-разработчиков воспроизведённых препаратов, демонстрируют биологическую и терапевтическую эквивалентность дженериков циклоспорина, позволяющую безопасно переводить пациентов с оригинального препарата на дженерик, либо назначать дженерик de novo [3, 4, 11, 39, 42, 43, 83, 85, 86, 90, 99].

Однако, результаты исследований, спонсируемых производителем оригинального препарата, показывают его неоспоримые преимущества перед воспроизведёнными препаратами по эффективности и безопасности, доказывая, что замена Сандиммуна Неорала на дженерики может привести к непредсказуемым серьёзным последствиям, в том числе потере трансплантата [17,64,67,78]. Более того, разворачиваются рекламные кампании, подвергающие сомнению терапевтическую эффективность и безопасность дженериковых препаратов со ссылками на отсутствие широкого клинического опыта и исследований [6].

Так или иначе, в настоящее время дженерики циклоспорина А успешно применяются в иммуносупрессивной терапии в трансплантологии, а также для лечения аутоиммунных заболеваний и являются реальной альтернативой оригинальному препарату.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Ледовских, Мария Владимировна

выводы

1. Проведены информационно-аналитические исследования по проблеме стандартизации препаратов циклоспорина А и их определению в биологических жидкостях при проведении терапевтического лекарственного мониторинга для обоснования выбора методов определения циклоспорина А в лекарственных формах и биологических жидкостях.

2. Разработана методика ВЭЖХ-определения циклоспорина А и родственных соединений в капсулированных препаратах.

3. Методом ВЭЖХ проведено определение циклоспорина А и родственных соединений в мягких желатиновых капсулах четырёх производителей. Выявлена различная хроматографическая картина исследуемых препаратов циклоспорина А в отношении числа посторонних примесей и их количества.

4. В условиях теста «Растворение» изучено высвобождение циклоспорина А из мягких желатиновых капсул четырёх производителей и получены профили растворения относительно препарата сравнения «Сандиммун Неорал, мягкие желатиновые капсулы 25 мг».

5. На основании экспериментальных результатов рассчитаны коэффициенты подобия и различия для выбранных объектов, которые свидетельствуют о различии высвобождения действующего вещества из препаратов разных производителей при достижении сопоставимых значений показателей растворения в конечной точке исследования.

6. Установлено изменение во времени качества мягких желатиновых капсул циклоспорина А по показателям «Содержание действующего вещества», «Посторонние примеси» и «Растворение». Показано, что по истечении срока годности наблюдается уменьшение содержания циклоспорина А в среднем на 5,06%. При этом содержание примесей возрастает как суммарно, так и в отношении индивидуальных родственных соединений: циклоспорина Н, дигидроциклоспорина А, циклоспорина V, циклоспорина D и изоциклоспорина А. Установлено, что по истечении срока годности снижается показатель «Растворение» и изменяется профиль высвобождения циклоспорина А из капсулированных лекарственных форм.

7. Проведено определение диаметра и характера распределения частиц по размерам в мягких желатиновых капсулах циклоспорина А четырёх производителей. Выявлено различное строение эмульсий, образуемых препаратами циклоспорина А разных производителей в водной среде.

8. Проведён терапевтический лекарственный мониторинг циклоспорина А у 23 пациентов после аллогенной трансплантации почки в течение 50+3 дней после операции. Продемонстрирована эффективность использования точки Сг (концентрации циклоспорина А в крови через два часа после перорального приёма препарата) для мониторирования терапии с целью обеспечения адекватной иммуносупрессии и снижения токсичности циклоспорина А. Выявлена зависимость между ранним (в течение 7 суток после трансплантации) достижением уровня циклоспорина А в крови на второй час после приёма в пределах 1400 — 2000 нг/мл и снижением частоты острого отторжения трансплантата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Ледовских, Мария Владимировна, 2006 год

1. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Лутцева Т.Ю. Сравнительная оценка уровня требований к испытанию «Растворение»//Хим.-фарм. журнал.-2003.-Т.37.-№1.-С.39-45.

2. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2 / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989 - 400 с.

3. Денисова Н.А. Исследование эффективности и безопасности применения препарата «Консупрен» после аллогенной трансплантации почки// Дисс. кан. биол. наук. Москва, 2003. - 150 стр.

4. Денисова Н.А., Байкова В.Н., Филипцев П.Я., Сокольский А.С. Исследование новой рецептуры препарата «Консупрен» в капсулах при аллогенной трансплантации почки// Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2003. - №1. -с. 15-19.

5. Игнатова М.С., Курбанова Э.Г. Иммуносупрессивная терапия нефротического синдрома у детей. М.: Триада, 2003, 103 с.

6. Мешковский А.П. Место дженериков в лекарственном обеспечении// Фарматека. №3. - 2003.

7. Общая фармакопейная статья 42-0003-04 «Растворение», 2004.

8. Реброва О.Ю. Статистическая обработка медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Москва: «Медиа Сфера», 2002. - 315 с.

9. Andrews D.J., Cramb R. Cyclosporine: revisions in monitoring guidelines and review of current analytical methods// Ann. Clin. Biochem.- 2002. -Vol.39.-p.424-435.

10. Andrysek T. The role of particle size distribution in bioavailability of cyclosporine: Novel drug delivery system// Biomed. Papers. 2001. -Vol. 145.-p.5-10.

11. Andrysek Т., Masri M.A., Egorov A. et al. Equoral, new cyclosporine drug delivery system, versus Neoral: a bioequivalence study in healthy volunteers// Transplant. Proc. 2003. - Vol.35(l) - p.207 -209.

12. Andrysek Т., Pisarcik M. Bioavailability versus physical properties in cyclosporine-containing drug delivery systems. In Proceedings from Symposium on "Lipid and surfactant dispersed systems", Moscow. 1999. -p.187-188.

13. Atkinson K., Boland J., Britton K. et al.: Transplant. Proc. 1983. -Vol.15. -P. 2430-2433.

14. Barama A., Yilmaz S., Gough J. et al. Lower cyclosporine exposure increases the risk for sub-clinical rejection in renal transplant recipients// Transplantation. -2000. -Vol.69. -S225. -Abstract 431.

15. Barama A.A., Yilmaz S., Gough J. et al Lower cyclosporine exposure increases the risk for sub-clinical rejection in renal transplant recipients// Transplantation. 2000. -Vol.69 (S225). - Abstract 431.

16. Barbari A., Stephan A., Kamel G. Experience with new cyclosporine formulations: Consupren and Neoral in renal transplant patients// Transplant. Proc., 1997, Vol.29, P. 2941 -2944.

17. Barr W.H. Cyclosporine: The Case for Expanding Bioequivalence Criteria to Include Measures of Individual Bioequivalence in Relevant Population Subsets //Transplant. Proc. - 1999. -№31. (Suppl ЗА) - p. 25S-30S

18. Behrens D., Fricker R., Bodoky A. Comparison of cyclosporine A absorption from LCT and MCT solutions following intrajejunal administration in conscious dogs// J.Pharm. Sci. 1996. -Vol.85(6) - p. 665 -668.

19. Belitsky P., Levy G.A., Johnston A. Neoral absorption profiling: an evolution in effectiveness// Transplan. Proc. 2000. —Vol.32(suppl.3A). — p.45S-52S.

20. Benet L.Z. Relevance of pharmacokinetics in narrow therapeutic index drugs// Transplant. Proc. 1999. - Vol.31. - p. 1642-1644.

21. Borel J.F., Feurer C. Biological effects of cyclosporine A: A new antilymphocyte agent// Agents Actions. 1976. - Vol. 6. - p. 468-475.

22. Bowers L.D. Cyclosporine analysis by high-performance liquid chromatography: precision, accuracy and minimum detectable quantity// Transplant. Proc. 1990. - Vol.22(3). -p.l 150-1154.

23. Bowers L.D. Therapeutic monitoring for cyclosporine: difficulties in establishing a therapeutic window// Clin.Biochem. 1991. -Vol.24, -p.81-87.

24. Bowers L.D., Mathews S.E. Investigation of the mechanism of peak broadening observed in the high-performance liquid chromatographic analysis of cyclosporine// J. of Chromat. 1985. -Vol.333. - p.231-238.

25. British Pharmacopoeia. 2004.

26. Brozmanova H., Grundmann M., Jegorov A. HPLC method of cyclosporine and its two metabolites for TDM in patients//Ther.Drug Monit. 1999. — Vol.21(4). -p.484.

27. Cantarovich М., Besner J.G., Barkun J.S. et al. Two-hours cyclosporine level determination is the appropriate tool to monitor Neoral therapy// Clin. Transplant. 998. -Vol.12. -p.243-249.

28. Cantarovich M., Elstein E., de Varennes B. et al. Clinical benefit of Neoral dose monitoring with cyclosporine 2-hr post-dose levels compared with trough levels, in stable heart transplant patients// Transplantation. —1999. -Vol.68.-p.l839-1842.

29. Choice E., Masin D., Bally M.B. et al. Liposomal cyclosporine. Comparison of drug lipid carrier pharmacokinetics and biodistribution// Transplantation. 1995. — Vol.60(9). - p. 1006- 1011.

30. Christians U., Jacobsen W., Serkova N. A fast, automated and specific assay to quantify cyclosporine and macrolide immunosuppressants in blood using LC/LC-MSD// Ther.Drug'Monit. 1999. -Vol.21 (4). -p.446-450.

31. Colaizzi J.L., Lowenthal D.T. Critical therapeutic categories: combination to generic substitution?// Clin. Ther. 1986. -Vol.8, -p.370-379.

32. Copeland K.R., Yatskoff R.W. Immunosuppressive activity and toxicity of cyclosporine metabolites characterized by mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance// Transplant. Proc. 1990. -Vol. 22(3). - p. 1146 — 1149.

33. Current Immunosuppression: an update. — London: Royal Society of Medicine Press Ltd., 1997. 130p.

34. Cyclosporin A, Ed.V. Matha, Grada Publi., Prague, 1994, 159 p.

35. Duchin K. Comparative pharmacokinetics of Consupren, Sandimmun and Neoral in healhy subjects // Current immunosuppression: an update. -1997. -p.33-37.

36. European Pharmacopoeia 4th edition. 2002.

37. Foulds D., Goa K. Cyclosporine: A Review of its pharmacokinetic properties: and therapeutic use in immunoregulatory disorders// Drugs. -1993 . -Vol.45(6). p. 953 - 1040.

38. Granelli-Piperno A. Lymphokine gene expression in vivo is inhibited by cyclosporine All J. Exp. Med. 1990.-Vol. 171.-P. 533.

39. Guidance for industiy. Dissolution testing of immediate release solid oral dosage forms. Office of training and communication. Division of communications management, the drug information branch, HFD-210, 5600 Fishers Lane Rockville, MD 20857, 1997.

40. Guidance for industry. Immediate release solid oral dosage forms. Scale-up and postapproval changes: chemistry, manufacturing, and controls, in vitro dissolution testing, and in vivo bioequivalence documentation. Consumer

41. Affairs Branch, HFD-8, Center for drug evaluation and research (CDER), 7500 Standish Place, Rockville, MD 20855 1995.

42. Halloran P.F., Helms L.M.H., Kung L.et al. The temporal profile of calcineurin inhibition by cyclosporine in vivo// Transplantation. -1999. -Vol.68.-1356-1361.

43. Hamwi A., Veitl M., Manner G. Evaluation of four automated methods for determination of whole blood cyclosporine concentrations// Am J Clin Pathol. 1999. - Vol.112(3). -p.358-365.

44. Helderman J.H. Lessons from the Neoral global database for renal transplantation// Transplant. Proc. 1999. -Vol.31. - p. 1659 -1663.

45. Hesselink D.A., vanSchaik R.H.N., van der Heiden LP. et al. Genetic polymorphisms of the CYP3A4, CYP3A5 and MDR-1 genes and pharmacokinetics of the calcineurin inhibitors cyclosporine and tacrolimus//Clin. Pharm.Ther. 2004. Vol.76(4). -p.330-340.

46. Holt D.W., Johnston A. The impact of cyclosporine formulation on clinical outcomes// Transplant. Proc. 2000. -Vol.32. - p. 1552 -1555.

47. Holt D.W., Marsden J.T., Fashola Т.О.A. et al. Performance of the Sandoz radioimmunoassays for cyclosporine// Transplant. Proc. Vol. 22(3). -p.1155-1159.

48. Husek A. High-performance liquid chromatographic analysis of cyclosporin A and its oral solutions// J Chromatogr A. 1997. - Vol. 759(1-2). - p.217-224.

49. Hutchinson I. Mode of action immunosuppressive agents // Current immunosuppression: an update. -1997. p.25-33.

50. Japanese Pharmacopoeia XIV. 2001.

51. Johnston A., David O.J., Cooney G.F. Pharmacokinetic validation of neoral absorption profiling// Transplant Proc. 2000. - Vol.32(suppl.3A). -p.53S-56S.

52. Johnston A., Holt D.W. Bioequivalence criteria for cyclosporine// Transplant. Proc. 1999. - Vol.31.-p. 1649-1653.

53. Johnston A., Holt D.W. Generic substitution for cyclosporine: what should we be looking for in new formulations?// Transp. Proc. — 1998. -Vol.30. — p/1652-1653.

54. Johnston A., Keown P.A., Holt D.W. Simple bioequivalence criteria: are they relevant to critical dose drugs? Experience gained from cyclosporine// Ther. Drug Monit. 1997. - Vol.19, -p.375-381.

55. Jolley M.E. Fluorescence polarization immunoassay for the determination of therapeutic drug levels in human plasma// Journal of Analytical Toxicity. -1981.-Vol. 5.-P. 228-232.

56. Jolley M.E., Stroupe S.D., Wang C.J., et al. Fluorescence polarization immunoassay. An automated system// Clin Chem. — 1981. — Vol. 27. — P. 1575- 1579.

57. Kahan B.D. Considerations concerning generic formulations of immunosuppressive drugs// Transp. Proc. 1999. -Vol.31, -p. 1635-1641

58. Kahan B.D. Recommendation concerning the introduction of generic formulations of cyclosporine// Transp. Proc. 1999. -Vol.31, -p.1634.

59. Kahan B.D., Welsh M., Schoenberg L. et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic allograft rejection// Transplantation. -1996. -Vol.62, -p.599-606.

60. Kasiske et al. Payment for immunosuppression after organ transplantation: American Society of Transpklantation// JAMA. 2000. -Vol.283, -p.2445.

61. Keevil B. G., Tierney D.P., Cooper D. P. et al. Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for routine analysis of cyclosporin a over an extended concentration range// Clin.Chem. 2002. -Vol.48.- p.69-76.

62. Khoschsorur G., Auer Т., Lanzer G. et al. The determination of metabolite Ml 7 and its meaning for immunosuppressive cyclosporine therapy// Angiology. 1998. - V. 49. -No4. - p. 307-314.

63. Koshy Т., Egan K., Jenik B. et al. A cyclosporine immunoassay for the AxSYM system that correlates with HPLC// Ther. Drug Monit. 1997. -Vol.19(5). -p.563-566.

64. Kovarik J., Mueller E., Edgar A. et al. Clinical development of cyclosporine microemulsion in transplantation// Ther. Drug Monit. — 1996. -Vol. 18(4). -p. 429 -434.

65. Kumar M., Singhal S.K., Singh A. Development and validation of a stability indicating HPLC assay method for cyclosporine in cyclosporine oral solution USP // J. Pharm. Biomed. Anal. 2001. - Vol. 25. - No 1. - p.9 -14.

66. Lemaire M., Fahr A., Maurer G. Pharmacokinetics of cyclosporine: inter-and intra-individual variations and metabolic pathways// Transplant Proc, 1990, Vol.22(3), P.l 110-1112.

67. Leung C.B., Szeto C.C., Ho C.S. et al. Pharmacokinetic advantages of two-hours post-dose cyclosporine a level for the therapeutic drug monitoring in stable Chinese kidney transplants recipients// Nephrol. Clin.Pract. 2005. — Vol.99(3). -p.68-72.

68. Levi G.A. et al. Improved clinical outcomes for liver transplant recipients using cyclosporine blood level monitoring based on two-hour post-dose levels// Transplantation. -2002. -Vol.73, -p.953-959.

69. Levy G.A. Relationship of pharmacokinetics to clinical outcomes// Transplant. Proc. 1999. -Vol.31, -p.1654-1658.

70. Lindholm A. Factors, influencing the pharmacokinetics of cyclosporine in man// Ther. Drug Monit., 1991, Vol.13, P.465 -477.

71. Lindholm A., Kahan B.D. Influence of cyclosporine pharmacokinetics, trough concentration and AUC monitoring on outcome after kidney transplantation// Clin. Pharmacol. Ther. 1993. - Vol.54, -p. 205-218.

72. Lorber M.I., Paul К., Harding M.W. et al. Cyclophilin binding: A receptor-Mediated Approach to Monitoring Cyclosporine Immunosuppressive Activity Following Organ Transplantation //Transplant. Proc. 1990. - V. 22. -No3. (June) - p. 1240-1244

73. Mahalati K., Belitsky P., Kiberf B. et al. Absorption profiling a novel method for monitoring Neoral in kidney transplantation that reduces rejection and nephrotoxicity// Transplantation. -2000. -Vol.69. -SI 14. -Abstracts.

74. Mahalati K., Belitsky P., Sketris I. et al. Neoral monitoring by simplified sparse sampling area under the concentration-time curve// Transplantation. -1999. -Vol.68, -p.55-62.

75. Marcen R., Villafruela J.J., Pascual J. et al. Clinical outcomes and C2 cyclosporin monitoring in maintenance renal transplant recipients: 1 year follow-up study// Nephrol.Dial.Transplant. 2005. - Vol.20(4). -p.803-810.

76. Masri M.A., Barbari A., Stephan A. et al. Cyclosporine pharmacokinetics in stable renal transplant patients: effect of formulation Sandimmun versus Consupren versus Neoral// Transplant. Proc. 1996. -Vol.28(3). -p. 1318 — 1320.

77. Masri M.A., Dhavan V.S., Hayes K. Cyclosporine dosage according to pharmacokinetics profiles leads to better graft and patient survival rates and a decrease in cyclosporin consumption// Transplant. Proc. —1992. -Vol.22. -№4 -p.1718-1720.

78. Masri M.A., Haberal M., Rizvi A. et al. The pharmacokinetics of Equoral versus Neoral in stable renal transplant patients: a multinational multicenter study// Transplant. Proc. 2004. - Vol.36(l). -p. 80-83.

79. Mati I. Clinical trials with Consupren// Current immunosuppression: an update. -1997. -p.15-19.

80. Mauer G., Lemaire M. Biotransformation and distribution in blood of cyclosporine and its metabolites// Transplant.Proc. 1986. - Vol. 18. -p.35-38.

81. Meyer G.F. History and regulatory issues of generic drugs// Transp. Proc. -1999. — Vol.3l(Suppl.3A). -p.lOS-12S.

82. Murthy J.N., Yatscoff R.W., Soldin S.J. Cyclosporine metabolite cross-reactivity in different cyclosporine assays// Clin. Biochem. — 1998. V. 31. -No3. — p. 159-163.

83. Nationwide recall of Sangcya oral solution. FDA Talk Paper. Food and Drug Administration, U.S. Department of Health and Human Services,

84. Pesce A.J., Schroeder T.J., First M.R. An evaluation of cyclosporine monitoring by nonselective fluorescent polarization immunoassay// Transplant. Proc. 1990. -Vol. 22(3). -p.l 171-1174.

85. Pharmacopoeia of the United States. The National Formulary. USP XXVII.-2004.

86. Pharmacopoeia of the United States. The National Formulary. USP XXIV. -.

87. Pharmacopoeia of the United States. The National Formulary. USP XXIII. -1995.

88. Popelka S.R., Miller D.M., Holen J.T. and Kelso D.M. Fluorescence polarization immunoassay. Analizer for the rapid and precise measurementof fluorescence polarization using disposable cuvettes. Clin Chem. — 1981. — Vol. 27.-P. 1198-1201.

89. Rehulkova O. Pharmacokinetic conversion study of Equoral and Neoral in stable adult renal transplant recipients (Protocol No. 53/EQ/01/PK). Clinical Study Report, 2004, Data on file, IVAX Pharmaceuticals, Czech Republic.

90. Rosano T.J., Brooks C.A., Dybas M.T. et al. Selection of an optimal assay method for monitoring cyclosporine therapy// Transplant. Proc. -1990. Vol. 22(3). - p. 1125-1128.

91. Rosenthaler J, Keller H.P. Comment on cyclosporine assay techniques: an attempt for recommendations// Transp. Proc. — 1990. -Vol.22(3). p. 1160-1165.

92. Safarcik K., Brozmanova H., Bartos V. et al Comparison of three methods of cyclosporine A and its metabolites for TDM in the group of renal transplant patients// Ther. Drug Monit. 1999. - Vol.21(4). - p.484-489.

93. Sandimmun in transplantation. Practical guide. Basle: Sandoz Pharma Ltd., 1992.

94. Savoldi S., Maiorca R., Maderna M. et al. Low intrapatient variability of blood cyclosporine levels is correlated with excellent graft survival// Transplant. Proc. 1997. - Vol.29. - p.288-289.

95. Schutz E., Svinarov D., Shipkova M. Cyclosporin whole blood immunoassays (AxSYM, CEDIA, and Emit): a critical overview of performance characteristics and comparison with HPLC// Clin Chem. -1998. Vol.44(10). -p.2158-2164.

96. Sewing K.Fr., Christians U., Kohihaw K. et al. Biologic activity of cyclosporine metabolites// Transplant. Proc. — 1990. —Vol. 22(3). p. 1129 — 1134.

97. Shah V.P., Yacobi A., Barr W.H. et al. Evaluation of orally administered highly variable drugs and drug formulations// Pharm. Res. -1996.-Vol.13.-p. 1590-1594.

98. Shaw L.M, Holt D., Keown P. et al. Current opinions on therapeutic drug monitoring of immunosuppressive drugs// Clin. Therap. — 1999. -Vol.21(10). -p.1632-1652.

99. Shevach E.M. The effects of cyclosporine A on the immune system// Annu. Rev. Immunol, 1985, Vol.3, P. 397-423.

100. Shibata N., Ikuno Y., Tsubakimoto Y. et al. Adsorption and pharmacokinetics of cyclosporin A in relation to mode of infusion in bone marrow transplant patients// Bone Marrow Transp. 2000. -Vol.25. -p.633-638.

101. Simpson J., Zhang Q., Ozaeta P. A specific method for the measurement of cyclosporin A in human whole blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry// Ther. Drug Monit. 1998.-Vol.20(3). -p.294-300. •

102. Sindhi R., LaVia M.F., Paulling E. et al. Stimulated response of peripheral lymphocytes may distinguish cyclosporine effect in renal transplant recipients receiving a cyclosporine + rapamycin regimen// Transplantation. -2000. -Vol.69, -p.432-436.

103. Steimer W. Performance and specificity of monoclonal immunoassays for cyclosporine monitoring: how specific is specific?// Clin Chem. 1999. - Vol.45(3). -p.371-81.

104. Stuchlik M.: Metabolism of cyclosporine A. In: Cyklosporin A. Ed. V., Matha, Grada Publi., Prague, 1994, 159 p.

105. Suthanthiran M., Strom T.B. Immunoregulatory drugs: mechanistic basis for the use in organ transplantation// Ped. Nephrol, 1997, Vol.11, P. 651 -657.

106. Tjandra-Maga В., Verbesselt R., Farmocolgie A. Comparison of cyclosporine A measurement in whole blood by six different methods// J. Clin. Chem Clin Biochem. 1990. -Vol.28, -p.53-57.

107. Todd J.S. Substitution of NTI drugs: physicians must maintain control// J. Med. Assoc. Georgia. 1997. -Vol.86, -p.121-123.

108. Van Buren C.T., Kerman R., Agostino G. The cellular target of cyclosporine A action in humans // Surgery. 1982. - Vol.92, - p. 167-174.

109. Vathsala A., Lee W.T., Jakob E. Cyclosporine pharmacokinetic profiles in stable renal allograft recipients converting from Sandimmun to Neoral// Transplant. Proc. 1996. - Vol.28(3). - p. 1324 -1326.

110. Vrana A., Andrysek T. The effect of particle size on bioavailability in cyclosporine preparations based on submicron dispersions// Biomed. Papers. -2001.-Vol. 145(2).-p.9-15.

111. Wang P., Meucci V., Simpson E. et al. A monoclonal antibody fluorescent polarization immunoassay for cyclosporine// Transplant. Proc. — 1990. -Vol. 22(3). p. 1186-1189.

112. Wenger M.R. Structure of cyclosporine and its metabolites// Transplantation Proceedings, Vol 22, N3, 1990, pp 1104 1106

113. Whinghton P.F., Edmod J.C., Whinghton S.H. et al.:N.Engl. J.Med. -1990.- Vol.322.-p. 733.

114. Wong S. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants// Clinica Chimica Acta. 2001. - Vol.313(1,2). -p.241 -253.

115. Wrenshall L.E., Matas A.J. An increasing incidence of late acute rejection episodes in cadaver renal allograft recipients given azathioprine, cyclosporine and prednisone// Transplantation, 1990, Vol.50, P. 233 -237.

116. Yatscoff R. Pharmacodynamic aspects of monitoring cyclosporin // Current immunosuppression: an update. -1997. -p. 43-53.

117. Yee G.C. Pharmacokinetic interactions between cyclosporine and other drugs// Transplant. Proc.- 1990. -Vol.22(3) P.1203 -1207.

118. Zimmermann L., JucoT., Simpson I. et al. Comparison between CEDIA, TDx, EMIT and HPLC methods for cyclosporine A// Ther. Drug Monit. 1997. -Vol. 19(5).- p.604-608.

119. Zucchelli G.C., Pilo A., Chiesa M.R. Progress report of an external quality assassment scheme for cyclosporine assay// Ther. Drug Monit. -1996. -Vol. 18(3). -p.273-279.