Совершенствование лабораторной диагностики заболеваний, вызванных Haemophilus influenzae типа b, на основе иммуноферментного анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Спирихина, Любовь Вячеславовна

• Спирихина, Любовь Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Спирихина, Любовь Вячеславовна

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Hib-инфекция как проблема для здравоохранения.

1.1. Микробиологическая характеристика Haemophilus influenzae типа b (антигенная структура, факторы патогенности).

1.2. Методы лабораторной диагностики заболеваний, вызванных H.influenzae типа b.

1.3. Эпидемиология инвазивных форм Hib-инфекции.

1.4. Состояние проблемы Hib-инфекции в России на современном этапе.*.

Собственные исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы Haemophilus influenzae, использованные в работе.

2.1.2. Антигенные препараты.

2.1.3. Кроличьи антисыворотки.

2.1.4. Характеристика обследованных контингентов.

2.2. Методы.

2.2.1. Методы выделения и культивирования штаммов H.influenzae.

2.2.2. Методы изучения штаммов.

2.2.3. Методы выделения и изучения антигенных препаратов H.influenzae типа b.

2.2.4. Схема получения антисывороток.

2.2.5. Серологические и иммунохимические методы исследования.

2.2.6. Методы лабораторного обследования больных с заболеваниями органов дыхания.

2.2.7. Статистические методы.

Глава 3. Подбор штаммов-продуцентов и характеристика антигенных препаратов Н. influenzae типа b.

3.1. Характеристика штаммов H.influenzae.

3.2. Характеристика антигенных препаратов Hib.

Глава 4. Определение естественного уровня антител к

H.influenzae типа b среди здрового населения.

Глава 5. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики заболеваний, вызванных H.influenzae типа b.

5.1. Параметры тест-системы ИФА для выявления кап-сульного полисахаридного антигена H.influenzae типа b.

5.2. Параметры тест-системы ИФА для определения антител к H.influenzae типа b.

5.3. Критерии оценки положительного результата в ИФА.

Глава 6. Клиническая апробация разработанных тест-систем ИФА.

6.1. Определение диагностических параметров тест-систем ИФА.

6.2. Результаты тестирования биологических субстратов больных с инфекциями органов дыхания на антиген H.influenzae типа b.

6.3. Уровень и динамика анти-Hib антител в сыворотках крови больных с заболеваниями органов дыхания.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование лабораторной диагностики заболеваний, вызванных Haemophilus influenzae типа b, на основе иммуноферментного анализа»

За рубежом проблема инфекций, вызванных Haemophilus influenzae типа b (Hib), успешно решена с помощью специфической вакцинопрофилактики. Однако в России до настоящего времени вопросы диагностики и профилактики инвазивных форм Hib-инфекции остаются во многом нерешенными.

Инфекционные заболевания, вызываемые Hib, встречаются главным образом у детей в возрасте до 5 лет и характеризуются полиморфизмом клинических проявлений, таких как менингит, эпи-глотит, остеомиелит, септицемия, целлюлит, артрит, перикардит и др. Ведущей клинической формой является менингит (до 64%), а затем по частоте встречаемости следуют пневмония и эпиглотит (97,98,113).

Удельный вес той или иной нозологической формы Hib-ин-фекции варьирует в различных странах. В Европе у детей в возрасте до 5 лет уровень заболеваемости менингитами этой этиологии составлял 10-20 случаев на 100 тыс. населения (10,61), в США - 20-67 на 100 тыс. нас., в скандинавских странах -26-31 на 100 тыс. нас., в африканских странах - 100-300 на 100 тыс. нас., а среди детей американских эскимосов и аборигенов 150-450 на 100 тыс. нас.(71,110).

Летальный исход при Hib-менингите регистрировали от 2% в промышленно-развитых странах до - 25-37% в развивающихся, а число осложнений в результате перенесенного менингита отмечали в 9-36% случаев (43,52).

Данные по заболеваемости пневмонией Hib-этиологии также сильно отличались в зависимости от конкретного региона или страны и составляли, например, 2% от общего уровня бактериальной пневмонии во Франции и 21-30% в Израиле и Китае (60,110).

Начавшаяся с 1985 г. в некоторых странах вакцинопрофи-лактика этой инфекции привела к значительному медицинскому и экономическому эффекту. Так, заболеваемость инвазивными формами Hib-инфекции снизилась на 95-99% с одновременным исчезновением носительства возбудителя (40,45). Благодаря вакцино-профилактике достигнут также и значительный экономический эффект, так как затраты на лечение одного больного с учетом осложнений составляли 22-56 тыс. $ US, а на вакцинацию одного ребенка расходуется от 22 до 84 $ US. В результате прививочной компании экономическая "выгода" в США составила 96.6 млн.$ US, а в Великобритании 10.6 млн. $ US (56).

Отсутствие официальной регистрации болезней, вызываемых Haemophilus influenzae типа b в России, не дает представления о долевом участии этой патологии в детской инфекционной заболе

Чтобы выяснить актуальность ШЬ-инфекции для здравоохранения Российской Федерации в 1996-1997 гг. были проведены исследования по специально разработанной программе в нескольких регионах России. Установлено, что Шэ является одним из ведущих инфекционных агентов в этиологичесой структуре гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) у детей в возрасте до 5 лет. Долевое участие №Ь в структуре ГБМ колебалось в зависимости от региона и составляло 30-50%, достигая максимального значения в г. Санкт-Петербурге. Отмечено, что менингиты КЬ-этиологии имели тяжелое течение и характеризовались высокой частотой осложнений (42%), причем летальность достигала 13%. Педиатры Петерваемости. бурга столкнулись с проблемой лечения Hib-менингитов в связи с возросшей резистентностью возбудителя (у 90% выделенных штаммов) к широкому спектру антибиотиков (28).

На основании результатов, полученных при проведении этого исследования, были сделаны выводы об актуальности проблемы Hib-инфекции в России, поэтому следует считать вполне своевременным появление информационного письма Минздрава РФ за №2510/10099-97-32 от 30.12.97, разрешающего проведение специфической профилактики Hib-инфекции среди детей первого года жизни зарубежными вакцинами. Кроме того, в решении коллегии Минздрава РФ от 17 марта 1998 г. (протокол №9), о проекте Федеральной Целевой программы "Вакцинопрофилактика" на 1999-2000 годы и на период до 2005 года рекомендовано активизировать разработку отечественной вакцины против Haemophilus influenzae.

В ходе исследований было подтверждено, что ведущее значение в диагностике Hib-инфекции принадлежит лабораторным методам.

Наиболее надежным доказательством Hib-этиологии заболевания является выделение культуры возбудителя. Для этого необходимо проводить микробиологическое исследование не позднее, чем в 1-2 день от начала заболевания, желательно на высоте лихорадки. Однако, как показала практика, такое условие выполнялось лишь при заболеваниях, которые характеризовались острым, генерализ-ванным началом болезни.

Больные с инфекциями органов дыхания поступали в среднем на 5-7 сутки от начала заболевания и, как правило, после приема антибактериальных препаратов. Ввиду этого эффективность бактериологического метода составляла только 2%. Кроме того, необходимо учитывать, что микробиологическое исследование трудоемко и проводится в течение нескольких дней, что не удовлетворяет запросам клиники.

Серологические методы диагностики используют как при отрицательных результатах бактериологического обследования, так и на фоне лечения больного антибактериальными препаратами. Являясь методами ранней диагностики они позволяют выявлять в биологических жидкостях больного как антигены возбудителя, так и антитела.

Наиболее часто за рубежом диагностика заболеваний органов дыхания ЬПЬ-этиологии проводится комплексно с использованием как рутинных методов, например, ВИЭФ, ЛА - выявляющих антиген ШЬ, так и ИФА (54,85,148).

В тех странах, где проводились целенаправленные исследования по проблеме НШ-инфекции, на национальном уровне были согласованы критерии определения случая НПэ-заболевания, которые в зависимости от страны имели свои различия. Однако, при этом общими требованиями являлись: обязательное выделение культуры ШЬ или выявление ШЬ-антигенов в биологических жидкостях больного (17).

На территории России диагностика НП>инфекции на национальном уровне практически отсутствует, так как нет коммерреских отечественных тест-систем ИФА, позволяющих подтвердить ЫЬ-этиологию. Кроме этого, до настоящего времени не разработаны критерии определения случая ШЬ-заболевания.

Учитывая международный опыт, работа по определению критериев случая НШ-заболевания потребует совершенствования лабораторных методов диагностики этой инфекции. Использование тест-систем ИФА в практике здравоохранения поможет более детально определить роль Н1Ь как этиологического агента в структуре различных заболеваний, особенно не имеющих манифестных проявлений. Установление этиологии заболевания облегчает тактику врача в выборе этиотропной терапии, что оказывает благоприятное влияние на исход болезни.

Таким образом, социально-экономическая значимость инфекций, вызванных Нлпйиепгае типа Ь и необходимость разработки чувствительных методов ранней этиологической расшифровки этой инфекции определили цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: разработка тест-систем иммунофер-ментного анализа для диагностики заболеваний, вызванных Нлпйиепгае типа Ь.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1) отработать оптимальный вариант метода спиртового осаждения капсульного полисахарида Нлпйиепгае типа Ь;

2) определить естественный уровень анти-Н1Ь антител среди здорового населения;

3) разработать тест-систему иммуноферментного анализа для выявления капсульного антигена НлпАиепгае типа Ь;

4) разработать тест-систему иммуноферментного анализа для определения антител к капсульному полисахариду НлпАиепгае типа Ь;

5) оценить на клиническом материале диагностическую ценность разработанных тест-систем ИФА.

- 10

Научная новизна исследований

Установлена диагностическая ценность иммуноферментного анализа для выявления капсульного антигена H.influenzae типа b и определения антител к этому возбудителю у больных инфекциями органов дыхания.

Впервые определены оптимальные сроки проведения имму-но- ферментного анализа и диагностическая информативность различных биологических субстратов (кровь, моча, бронхиальный секрет) при исследовании их на капсульный антиген H.influenzae типа b при инфекциях органов дыхания.

Впервые на клиническом материале, полученном от больных инфекциями органов дыхания, показаны диагностические возможности иммуноферментного анализа по сравнению с общепринятыми лабораторными методами - бактериологией, латекс-агглютинацией, встречным иммуноэлектрофорезом ~;

Впервые проведено ограниченное серо-эпидемиологическое исследование по определению уровня антител к H.influenzae типа b у здоровых людей. Показано, что фоновый уровень анти-Hib антител зависел от возраста и территории проживания обследованных контингентов.

Практическая ценность работы

С помощью "сэндвич"-варианта иммуноферментного анализа можно выявлять капсульный антиген H.influenzae типа b в сыворотке крови и моче при инфекциях органов дыхания. При этом оптимальными сроками для выявления антигена с сыворотке крови являются первые 4 дня болезни, а в моче - начиная с 11 дня заболевания.

Гемофильную этиологию инфекций органов дыхания можно подтвердить ретроспективно на основании определения антител к H.influenzae типа b в парных сыворотках крови с помощью имму-ноферментного анализа.

Разработанные иммуноферментные тест-системы могут быть использованы как для подтверждения этиологии заболевания, так и для слежения за скрыто протекающим эпидемическим процессом гемофильной инфекции в рамках эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами.

Внедрение

Результаты, полученные в настоящем исследовании учтены при составлении следующих документов:

- Информационное письмо Минздрава РФ "О профилактике гемофильной инфекции" за №2510/10099-97-32 от 30.12.97.

- Приложение №3 "Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов" к Приказу МЗ РФ "О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" за №375 от 23.12.98.

- "Методические рекомендации по лабораторной диагностике H.influenzae типа b при гнойных бактериальных менингитах и респираторных заболеваниях" (переданы для утверждения в Минздрав РФ).

Обзор литературы ГЛАВА 1. Н1В-ИНФЕКЦИЯ КАК ПРОБЛЕМА ДЛЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Спирихина, Любовь Вячеславовна

выводы

1. Модифицированный метод спиртового осаждения кап-сульного полисахарида H.influenzae типа b позволяет получить им-мунохимимически активный и серологически специфичный антигенный препарат.

2. На основании данных серо-эпидемиологического исследования установлена зависимость "фонового" уровня антител к H.influenzae типа b от возраста обследованных и территории их проживания.

3. Установлены диагностические параметры разработанных тест-систем иммуноферментного анализа - "чувствительность" и "специфичность", которые составляли: 84,8% и 95.2% - для системы, выявляющей антиген Hib; 81.0% и 84.6% - при детекции анти-Hib антител.

4. Клинические испытания иммуноферментных тест-систем показали их более высокую информативность: по сравнению с латекс-агглютинацией и встречным иммуноэлектрофорезом при выявлении антигена H.influenzae диагностическая эффективность была выше в 2 и 5 раз соответственно и в 2 раза - при определении анти-Hib антител в реакции пассивной гемагглютинации.

5. При инфекциях органов дыхания наибольшую диагностическую ценность для раннего выявления капсульного антигена Hib имеют сыворотка крови и моча, при этом оптимальными сроками проведения серологических исследований являются для сыворотки крови - первые 4 дня, а мочи - после 11 дня болезни.

-132

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Спирихина, Любовь Вячеславовна, 1999 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Д.: Издательство медицинской литературы., 1962. С.174-176

2. Воронина Л.Г. Совершенствование лабораторной диагностики H.influenzae. // Автореф.дисс.к.м.н. Челябинск.-1990.-С.28

3. Воронина Л.Г. H.influenzae "b" и ее значение в патологии детей младшего возраста. // Уральское медицинское обозрение 2. 1997.-N17.-C.35-36

4. Вербов В.Н. Принцип твердофазного иммунофермент-ного анализа. // Сб.Твердофазный иммуноферментный анализ.-Ленинград-1988. -С.3-27

5. Горбачев E.H., Вербов В.Н., Артюхов А.И. Влияние физико-химических факторов на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа. // Сб.Твердофазный иммуноферментный анализ. Ленинград.- 1988.-С.76-80

6. Грачева A.M. Изучение поверхностных антигенов коклюшного и паракоклюшного микробов и использование их в реакции пассивной гемагглютинации. // Автореф.дисс.к.б.н. Москва.-1970

7. Грачева A.M. Обнаружение методом встречного имму-ноэлектрофореза антигенов в моче у больных гнойными менингитами. // Лаб.дело.-1983.-N9.-C. 12-14

8. Демина A.A., Покровский В.И., Девяткина Н.П. Иммунологическая структура населения против менингококка. // Журн.микробиол.-1979.-К10.-С.24-28- 133 —

9. Демина A.A. с соавт. Эпидемиология инвазивных форм заболеваний, обусловленные H.influenzae типа Ь. // Сб.трудов на-уч.конф."Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой H.influenzae тип Ь".-1998.-С.5-11

10. Демина A.A., Покровский В.И., Самсонова И.М. Заболеваемость, обусловленная Haemophilus influenzae типа b и вакцино-профилактика этой инфекции. // Журн.микробиол. -1996.-N.5.-C.99-104

11. И. Девяткина Н.П., Ильина Т.В., с соавт. Особенности заболеваемости гнойными менингитами, вызванными Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа b. // Журн.микробиол.-1990.-N. 1 .-С.45-49

12. Заргарян О.П. Гемофильная микрофлора носоглотки в норме и при острой респираторной патологии.//Автореф.дисс.к.м.н.-Киев.-1983.-С.24

13. Зубик Т.М., Лобзин Ю.В., Кочеровец В.И. Менингит Афанасьева-Пфейффера (инфлюенца-менингит) у взрослых. // Клин.медицина.-1983 .-N2.-С .66-71

14. Костинов М.П., Малеев В.В. Hib-инфекция: вопросы вакцинопрофилактики. // Москва-1998.-Изд."Медицина для всех"

15. Комиссаров A.JI. "Этиологическая структура внеболь-ничных пневмоний в г.Москве и лечение их ровамицином (спира-мицином)". // Автореф.дисс.к.м.н.-Москва.-1997

16. Королева И.С., Ильина Т.В., Мартынов Ю.В. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших болезней. // гг.Тамбов-Астрахань.-1994.-С.168-170

17. Красильников Л.П. Микробиологический словарь-справочник. // Минск.- Беларусь.- 1986.- С.351

18. Кузнецова Т.А. Оптимизация диагностической и терапевтической тактики при острой пневмонии у детей раннего возраста. // Автореф.дисс.д.м.н.- Москва. 1992.- С. 14

19. Лунева O.K. Значение палочки инфлюенцы и пневмококка при хронической бронхолегочной инфекции. // Журн.микробиол. 1971. - Nil.- С.65-69

20. Методические рекомендации по выделению и идентификации микробов рода Haemophilus. Москва.- 1979.- С. 18

21. Наймушина Н.Б. Клиническая оценка роли гемофиль-ной палочки в развитии острых заболеваний дыхательных путей у детей. // Автореф.дисс.к.м.н. Москва.- 1986

22. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. // "Медицина". Москва -1980. - С.305-307-135

23. Саркисова Ж.Ю. Восприимчивость детей к инфекции, вызванной Haemophilus influenzae типа b. // Автореф.дисс.к.м.н. -Москва.- 1997

24. Семина Н.А. с соавт. Параметры конструирования тест-систем для выявления менингококковых антител иммунофермент-ным методом.//Журн.микробиол. 1981.- N6.- С.67-71

25. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. // Биохимия. 1958.-т.23 - вып.5 - С.656

26. Храмова Н.И., Андреева З.М. Получение специфических неадсорбированных сывороток к H.influenzae для реакции агглютинации на стекле. // Журн.микробиол.-1975.-МЗ.-С.115-118

27. Чернохвостова Е.В. Местный иммунитет и микробные IgA-протеазы. //Журн.микробиол.- 1987.-N6.-C.104-111

28. Шапиро А.В. Микробиологическая диагностика и вопросы патогенеза острых пневмоний при гриппе. // Авто-реф.дисс.докт.мед.наук. 1988. - Киев.- 13634. Яфаев Р.Х., Усманов М.К., Дударева В.В. Эпидемиология менингококковой инфекции. // Ташкент-1989.-С.134

29. Abdilah Н., Poolman Т. Whole cell ELISA for typing Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies. // FEMS Microbiol.Lett.-1987.V.48.-P.367-370

30. Alford R.H. Transformation of human lymfocytes by Haemophilus influenzae somatic and polysaccharide antigens.//Proc. Soc.Exp.Biol.Hed.-1972.-V.141.-N.3-p.788-791

31. Anderson P.,Johnston R, Smith D. Human serum activities against Haemophilus influenzae type b.//J.Clin.Invest.-1973. -V.52-P.31-38

32. Anderson P., Smith D. Isolation of capsular polysaccharide from culture supernatant of Haemophilus influenzae type b. // Infect, and Immun.-1977.-V. 15.-P.472-477

33. Bahl R.Evalution of the national ARI control programme protocole in a hospital setting. // 6-th International congress for Infectious Diseases.-1994

34. Barbour V.L. et al. The impact of conjugate vaccine on carriage of Haemophilus influenzae type b.// J.Infect.Dis.-1995.-V. 171.-P.93-98

35. Barenkamp S.J., Granoff D.M., Pittman M. Outer membrane protein subtypes and biotypes of Haemophilus influenzae type b: relation between strains isolated in 1934-1954 and 1977-1980.//J.Infect.Dis.-1983.-Dec. V.148.-N.6.-P.1127-1128

36. Beaglehole R., Bonita R. Basic epidemiology. // WHO. -Geneva.-1993.-P. 143-144

37. Booy R. et al. Efficacy of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine PRP-T.//Lancet.-1994.-33(8919):362-366

38. Bradshaw M.W., Scheerson R. et al. Bacterial antigens cross-reactive with the capcule polysaccharide of Haemophilus influenzae type b. // Lancet-197l.-i: 1095-1097

39. Buckmire F. Identification and quantitation of capsular antigen in capsulated and noncapsulated strains of Haemophilus influenzae type b by crossed-immunoelectrophoresis. // J.Infect.and Immunol.-1976.-V.13.-N.16.-P. 1733-1742

40. Buman L., Leinonen M., Trollfors R. Use of serology to diagnose pneumoniae caused by noncapsulated Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis. // Infect.Dis.-1993.- V. 176.-P.220-222

41. Bunse R., Heinz. Caracterization of a monoclonal antibody to the capsule of Haemophilus influenzae type b, generated by in vitro immunization. // J.Immunol.Methods.-1994.-V.177.-P.89-99

42. Carlone G.,Thomas M. Rapid microphrocedure for isolating detergent-insoluble outer membrane proteins from Haemophilus species. //J.Clin.Microbiol.-1986.-V.24.-P.330-332

43. Coonrod J.D., and Rytel M.W. Determination of aethiology of bacterial meningitis by counterimmunoelectrophoresis. // Lancet. 1972.-i:l 154-1157

44. Casadevall A., Dobroszycki J., Small C. et al. Haemophilus influenzae type b bacteriemia in adults with AIDS and at risk for AIDS. // Amer.J.Med.-1992.-V.92.-N.6.-P.587-590

45. Clemens D.A., Booy et al. Comparison of the epidemiology and cost of Haemophilus influenzae type b disease in five western countries. // Ped. Infect. Dis.-1993.-V.12(5)-P. 362-367

46. Cochi S.L., Fleming D.W., Hightower A.W. et al. Primary invasive Haemophilus influenzae type b disease: a population-based assessment of risk factors. //J.Pediatr.- 1986. V.108.-P.887-896

47. Coonrod J.D., M.W.Rytel. detection of type-specific pneumococcal antigen by couterimmunoelectrophoresis. Methodology and immunologic propeties of pneumococcal antigen. // J.Lab.Clin.Med.-1973 .-V. 81 .-P.77-777

48. Dagan R. et al. Epidemiology of pediatric meningitis caused by Haemophilus influenzae type b, Streptoccocus pneumoniae and Neisseria meningitis in Israel: a 3-year nationwide prospective study. // J.Infect.Dis.-1994-V. 169.-P.912-916

49. EngvallE., Perlmann P. Enzyme-lynked immunosorbent assay. ELISA III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-immunoglobulin in antigen-coated tubes. // J.Immunol.-1972.-V.109.-P.129-135

50. Eldridge J.E., Sutcliffe M., Abbott J.D., Jones D.M. Serological grouping of meningococci and detection of antigen in cerebrospinal fluid by coagglutination. // Med.Lab.Sci. 1978.- V.35.-P.63-66

51. Fainstein V., Muster D.M., Cate T.R. Bacterial adherence to pharyngeal cell during viral infection. // J.Infect.Dis.-1980. -N.14L-P. 172-176

52. Feigin R.D., Wong M. et al. Countercurrent immunoelectro-phoresis of urine as well as of CSF and blood for diagnosis of bacterial meningitis. //J.Pediatrcs.-1976.-V.89. -N.5.-P.773-775

53. Flesher A., Insel A. Characterization of lipopolisaccharide of Haemophilus influenzae. // J.Infect.Dis.-1978. V.138.-P.719-730

54. Fiske C.H., Subbarow G. The colorimetrie determination of phosphorus. // J.Biol.Chem.-1925.-N.66.-P.375-400

55. Gervaix A., Suter S. Epidemiology of invasive Haemophilus influenzae type b infectious in Geneva, Switzerland, 1976 to 1989. // 5-th Eur.Congr.Clin.Microbiol. and Infect.Dis.-Oslo. 1991.-Sept.9-ll.-Abstr.-P.49

56. Gendrei D. Infectious a Haemophilus influenzae on zone tropicale. Infectious a Haemophilus en pudiatrie editer by Beaufils and al. // Arnette Paris.-1991.-P. 157-162

57. Glicman L. et al. Evalution of sérodiagnostic tests for visceral larva migrane. // Am.J.Trop.Med.Hyg.-1978.-V.27.- N.3.-P.492-498

58. Gomez E., Moore A. et al. The epidemiology of Haemophilus influenzae type b carriage among infants and young children in Santo Domingo, Dominican Republlic. // 8th Intern.Congr.Infect.Dis.-1998.-Abstr.-P.62

59. Gonzales G.F., Casado D.J. et al. Meningitis por Haemophilus influenzae: estudio de 28 casos. // An.esp.pediatr.-1990.-V.33.-N.5.-P.413-417

60. Gray B.M. ELISA methodology for polysaccharide antigen: protein coupling of polysaccharides for adsorption to plastic tubes. // J.Immunol.Methods.-1979.-V.28.-P. 187-192

61. Granoff D.M., Congeni B., Baker R. et al. Countercurrent Immunoelectrophoresis in the diagnosis of Haemophilus influenzae type b infection. //Am.J.Dis.Child.-1977.-V.131.-P1357- 1362

62. Grasset E. Sur l'endotoxine typhique obtenue par congelation répétée. // C.R.S.Biol.-1935.-118.-P.765-769-141 —

63. Greenfield S., Peter G., Howis V.M. et al. Acquisition of typospecific antibodies to Haemophilus influenzae type b. // J.Pediatr.-1972.-V.80.-N.2.-P.204-209

64. Hancock R., Reeves P. Lipopolysaccharide deficient, bacteriophage - reistant mutants of Escherichia coli K-12. // J.Bacteriol.-1976.-V.127.-N.1.-P.98-108

65. Hazlewood M., Nusrat R., Kumararatne D. et al. The acqusition of anti-pneumococcal capsular polysaccharide, Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies with age, in the U.K. // Clin.Exp.Immunol.-1993 .-V.93 .-P. 157-164

66. Hoban D., Witwicki E., Hammaond G. Bacterial antigen detection in cerebrospinal fluid of patients with meningitis. // Diagn.Infect.Dis.-1985.-V.3.-P.373-379

67. Heward A.J., Dunkin K.T., Williams H.M.,Musser J.M. Epidemiology of Haemophilus influenzae invasive disease in Wales. // 5th Eur.Congr.Clin.Microbiol.-Oslo.-1991. Sept.9-11.- Abstr.-P.157

68. Inzana T. Electrophoretic heterogeneity and interstrain variation of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae. // J.Infect.Dis.-1983.-N.144.-P.492-499

69. Istre G.R., Conner J.S., Broome C.V. et al. Risk factors for primary invasive Haemophilus influenzae disease: increased risk from day-care attendance and school-aged household members. // J.Pediatr.-1985.-V.106.-P. 190-195

70. Kaldor J.R., Aszucwies et al. Latex agglutination in diagnosis of bacterial infections withe special reference to patients with meningitis and septicemia. //Am.J.Clin.Pathol.-1977.-V.68.-P.284-289

71. Kayhty H., Makela P.H., Ruoslahti E. Radioimmunoassay of polysaccharide antigen of groups A and C meningococcal and-142

72. Haemophilus influenzae type b in cerebrospinal fluid. // J. Clin.Pathol.-1977.-Y.33.-P.831-833

73. Kayhty H., Jonsimies-Somer H., Peltola H., Makela H. Antibodi Response to Capsular Polysaccharides of Groups A and C Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae Type b during Bacteremic Disease.//J.Infect.Dis. 1981. - Jan. - V.143.-N.1.-P.32-41

74. Kayhty H., Peltola H., Karanko V., Makela P.H. The protective level of serum antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b.//J.Infect.Dis.-1983.-V. 147.-P.1100

75. Kim D., Gonzynski E., Milgrom F. Detections of antigen from gram negetive bacilli in urine of children with uritary tract infectious. //J.Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.- 1989. V.88.-P.427-433

76. Kimura A., Hansen E.J. Antigenic and phenotypic variations of Haemophilus influenzae type b lipopolisaccharide and their relationship to virulense. // Infect.Im- mun.-1986.-V.51.- P.69-79

77. Killian M. A toximic stadi of the genes Haemophilus with proposal of a new species.//J.Gen.Microbiol. 1976.-V.93.-N.9.-P.62

78. Kilpi T., Anitila M., Kallio M.J.T., Peltola H. Severity of childhood bacterial meningitis and duration of illness before diagnosis. // Lancet.-1991 .-N.8764.-P.406-409

79. Leidy G., Mahn F., Zamenhof S et al. Biochemical aspects of virulence of Haemophilus influenzae. // Ann.N.I. Acad. Sei.-1960.-V.88.-P.1195

80. Leinonen M., Frassch C.E. Class-specific antibody responce to group B Neisseria meningitidis capsular polysaccharide: Use of polylisine precoating in a enzyme-linked immunosorbent assay. // Infect.Immun.-1982.-V.38.-N.3.-P. 1203-1207- 143

81. Lefkovits I., Pernis B. Immunological Methods.-London.-1979 // üepeBOß.-M.-1981 .-C.428-432

82. Lee C.J., Robbins J. Characterization and mitogenic activity of Haemophilus influenzae type b capsular polisaccharide. // Immunol.cjmmunicat.-1978.-N.7(5).-P.503-518

83. Livartowskii A., Guyot C., Dabernat H., Reinert C. Epidemiologie des meningitiques a Haemophilus influenzae type b dans deux departements francais. // Bull.Epid.Hebd.-1988. N. 29. - P. 113-115

84. Livartowski A., Guyot C., Dabernat H. et al. Epidemiologie des infections non meningitiques a Haemophilus influenzae type b dans deux departements francais.//Bull. Epid. Hebd.- 1998.-N.30.-P.117-118

85. Lin C.C. et al. Bacterial meningitis in infant and children in Southern Taiwan: emphasis on Haemophilus influenzae type b infection. // J.Formos Med.Assoc.- 1993.-V.92.-P. 884-886

86. Lopez E.L. Epidemiology and treatment of meningitis in South America: impact of the Haemophilus influenzae b vaccine. // 8-th International Congress of Infect.Dis.-1998.-Boston.-Abstr.-P.117

87. Lowry O.H. et al. Protein measurement mith the Folin phenol reagent.//J.Biol.Chem.-1951 .-N. 193.-P,265-275

88. Mac Pherson C.F.C., Heidelberger H., Alexander H.F. et al. The specific polysaccharides of types a, b, c, d, and f Haemophilus influenzae. // J.Immunol.-1976.-V.52.-P.207

89. Molteni R.A. Epiglottitis: incedence of extraepiglottic infection. Report of 72 cases and a review of litera- ture. // Pediatrics.-1976.-V.58.-P.526-531

90. Moritsch H. Morphologische Veränderung von Haemophilus influenzae unter dem Einflub von Penicillin. //-144

91. Zbl.Bacteriol.Parositenkunde Infektion Skanku und Hyg.-1954.-V.161.-N. 6.-P.336-370

92. Moxon E.R., Vaughn K.A. The type b capsular polysaccharide as a virulence determinant of Haemophilus influenzae: studies using clinical isolates and laboratory transformants. // J.Infect.Dis.-1981 .-V. 143 .-P. 517-524

93. Moxon E.R. Immunology of Haemophilus influenzae infectious. // Immunol.Hum.Infect.Pt.J.-London.-l981.-P. 113-138

94. Murphy T., Dudas K., Mylotte J. et al. A subtyping system for nontypable Haemophilus influenzae based on outer membrsne protein. // J.Infect.Dis.-1983.-V. 147.-P.838-846

95. Murphy T., Clements J., Granoff D. Excretion of Haemophilus influenzae type b polisaccharide antigen in urine of healthy nasophoringeal carriers. // Pediatr. Research.-1989.-V.26.-N.5. -P.491-495

96. Myerowitz R.L., Michaels R.H. Mechanism of potentiation of experimental Haemophilus influenzae type b disease in infants rats by influenza A virus. // Lab.In- vest.-1981.-N.44.-P. 434-441

97. Oliver C. Epidemiologie de Haemophilus influenzae. // Immunol.Med.-l 991 .-V.8.-N.3 .-P. 130-135

98. Pittman M. Variation and type specificity in the bacterial species Haemophilus influenzae. //L.Exp.Med.-1931.-V.58.- P.471-492

99. Parke J.C., Schneerson R., Reimer M., Robbins J.B. et al. Clinical and immunologic responses to Haemophilus influenzae type b tetanus toxoid conjugate vaccine in infant injected at 3,5,7 and 18 mounth of age. //J.Pediatr.-1991.-N.118.-P. 184-190

100. Peltola H., Rod T.O., Jonsdottir K. et al. Life-Threatening Haemophilus influenzae infections in Scandinavia: A five country-145

101. Analysis of the incidence and the main clinical and bacteriologic characteristics. // Rev.Infect.Dis.-1990.-V. 12.- P.708-715

102. Petersen G.M., Silimper D.R., Rotter J.I. et al Genetic factors in Haemophilus influenzae type b susceptibility and antibody acquissition. // J.Pediatr.-1987.-V. 110.-P.228-233

103. Petersen G.M., Silimperi D.R., Scott E.M. et al.Uridine monophosphate kinase 3: a genetic marker for suscepti- bility to Haemophilus influenzae type b disease. // Lancet.-1985.-N.2. P.417-419

104. Peppier M.S., Frasch C.E. Protection against group B Neusseria meningitidis disease: Effect of serodroup B polysaccharide and polimyxin B on immunogenicity of serotype protein preparation. // Infect.Immun. 1982.-V.37.-N.1.-P.264-270

105. Rlienstra M.S., Scattergood E.M. Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides. // Merck and Co. N595722.-03.09.1991

106. Roberts M., StullT.L., Smith A.L. Comparative virulence of Haemophilus influenzae with a type b or type d capsule. // Infect.Immunol.-1981 .-V.32.-P.518-524

107. O'Reilly R.J., Anderson P., Ingram D.L. et al. Circulating poliribophosphate in Haemophilus influenzae type b meningitis. // J.Clin.Invest.-1975 .-V. 56.-P. 1012-1022

108. Robbins J., Parke J., Schneerson R. et al. Quantitative measurement of "natural" and immunization-induced Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide antibodies. // Pediatr.Res.-1973.-V.7.-P.103-110

109. Scolea L., Rosales S., Ogra P. Haemophilus influenzae type b infection in chilhood: history of bacteremia and antigenemia. // Infect, and Immun.-1985.-V.50.-N.3.-P.753-756.

110. Schlemm H., Yancovitz S. Haemophilus influenzae pneumoniae in young adults with AIDS, or risk of AIDS. // The American Journal of Medicine.-1989.-V.86.-P.l 1-14

111. Schreiber J., Barrus V., cates K. Functional characterization of human IgG, IgM, and IgA antibody directed to the capsule of Haemophilus influenzae type b. // J.Infect,Dis.-1986.-Y. 153.-N. 1 -P.8-16

112. Siber G.R. et al. Impaired antibody response to Haemophilus influenzae type b polysaccharide and low IgG and IgG concentrations in apaches children. // New England J. Of Medocone.-1990.-V.323.-N.20.-P. 1387-1392

113. Squarcione S., Pompa M.G., Alessandro D.D. et al. A national surveillance system for Hib meningitidis in Italy. // 8th Internat. Congr. Infect. Diseases.-1998.-P.63

114. Takala A.K., Eskola J., Lennonen H. et al. Reduction of oropharyngeal carriage of H.influenzae type b in children after immunization with Hib conjugate vaccine. // J.Infect. Dis.-1991.-V.l.-N.64.-P.982-985

115. Takala A.K., Meurman O., Kleemona M. et al. Preceding respiratory infection predisposing for primary and secondary invasive Haemophilus influenzae type b disease. // Pediatr. Infect. Dis.J.-1993.-V.12.-P.189-195

116. Takala A.K. et al. Disappearance of epiglottitis during large scale vaccinations with Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines among children in Finland. // The 11th meeting of the European Society for Paediatric Infect.Dis., ESPID-1993.

117. Taubitz I., Brandis H. A comparison between methods of identification and serotyping of encapsulated sprains of Haemophilus influenzae. // J.Zbl.Bakt.Hyg.-1988.-V. A. 270. P.83- 97

118. Tolan R.W., Munson R.S., Granoff D.M. Lipopolysac-charide gel profiles of Haemophilus influenzae type b are notstable epidemiological markers. // J.Clin. Microbiol.-1986.-V.24.-P. 223-227

119. Trollfors B., Lagergard T., Claesson B. et al. Characterization of the serum antibody response to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b in children with invasive infections. // J.Infect.Dis.-1992.- V.166.-N.6.-P.1335-1339

120. Turk D.S., May J.R. Haemophilus influenzae, its clinical importance. // London.- English Universities Press.-1967.-P.206-148

121. Ward J.I., Fräser D.W., Barff L.J., Plicalytis B.D. Haemophilus influenzae meningitis. A national study of secondary spread in household contacts. N.Engl. // J.med.-1979.-V.301. -P122-1260

122. Washington D.C. Manual of clinic microbiology.-1995.1. P. 1482