Состав и свойства биологически активных веществ Glycyrrhizae radices тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Халед Шади Мунир

• Халед Шади Мунир
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Халед Шади Мунир

Список сокращений и условных обозначений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Общая характеристика сырья корня солодки

1.1.1 Морфология корня солодки

Способы извлечения глицирризиновой кислоты из корня

1.2 13 солодки

1.3 Способы извлечения фенольных соединений из корня солодки

1.4 Способы извлечения углеводов из корня солодки

Физико-химические характеристики биологически активных

1.5 20 веществ корня солодки

Анализ биологически активных веществ корня

1.6 25 солодки

1.7 Биологические и фармакологические свойства веществ солодки

Биологическая активность глицирризиновой кислоты и её

1.7.1 28 производных

Биологическая активность фенольных соединений, выделенных

1.7.2 33 из корня солодки

Биологическая активность полисахаридов, выделенных из корня

1.7.3 37 солодки

Получение и применение лекарственных средств на основе

1.7.4 38 корня солодки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования и материалы, использованные в работе

2.1.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

2.1.2 Способ получения водно-аммиачного экстракта из сырья или

шрота корня солодки

Способ получения ацетонового экстракта из сырья или шрота

2.1.3 44 корня солодки

Способ получения этанольного экстракта из сырья или шрота

2.1.4 45 корня солодки

2.1.5 Определение углеводов в шроте

Разделение экстрактивных веществ этанольного экстракта из

2.1.6 47 шрота (фракции 2)

2.2 Общие методы анализа

2.2.1 Определение физико-химических показателей

2.2.2 Определение выхода экстрактивных веществ

2.2.3 Определение суммы углеводов антроновым методом

2.2.4 Определение простых сахаров

2.2.5 Определение пектина

2.2.6 Определение крахмала йодометрическим методом

2.2.7 Определение простых фенолов

2.2.8 Определение белков по методу Флореса

2.2.9 Определение аминокислот нингидриновым методом

2.2.10 Определение лигнина

2.2.11 Определение глицирризиновой кислоты

2.2.12 Определение флавоноидов

2.2.13 ИК спектроскопия

Качественный анализ объектов исследования методом

2.2.14 55 инструментальной тонкослойной хроматографии

2.2.15 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.2.16 Хромато-масс-спектрометрический анализ

2.2.17 Микроскопический анализ

2.2.18 Определение антиоксидантной активности

Определение антимикробной активности объектов

2.2.19 57 исследования

Определение антимутагенной активности объектов

2

исследования

2.2.21 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

3.2 Состав углеводов шрота корня солодки

Выбор растворителя для максимального извлечения

3.3 67 глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений

Подбор условий экстракции шрота корня солодки этанолом для 34 максимального извлечения из него глицирризиновой кислоты и 73 флавоноидных соединений

Фракционирование экстракта, полученного из измельченного

3.5 83 шрота 80 % раствором этанолом

Биологическая активность фракций, полученных при

3.6 94 разделении этанольного экстракта шрота

Исследование антимикробной активности объектов,

выделенных из шрота солодки

Исследование антимутагенной активности объектов,

выделенных из шрота* солодки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГК - глицирризиновая кислота Гк - глицирретовая кислота ТСХ - тонкослойная хроматография ГФ - Государственная Фармакопея БАВ - биологически активные вещества БАД - биологически активная добавка ЭВ - экстрактивные вещества

МСГК - моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты

АОА - антиоксидантная активность

Тпл - температура плавления

Адаж - длина волны максимальная

АЛТ - эндогенный фермент, аланинаминотрансфераза

АСТ - фермент белкового обмена, аспартатаминотрансфераза

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГХ/МС - газовая хроматография/ хромато-масс-спектрометрия

ИК - инфракрасная спектроскопия

п - количество данных, взятых для статистической обработки (ДФПГ) БРРИ - дифенилпикрилгидразил

1С50 - концентрация, необходимая для ингибирования 50 % ДФПГ радикала

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Состав и свойства биологически активных веществ Glycyrrhizae radices»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время на основе извлечений из корня солодки голой (Glycyrrhizae radices) фармацевтические предприятия выпускают препараты, терапевтическая эффективность которых обусловлена содержанием в них глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений, обладающих широким спектром биологической активности. Несмотря на широкий спектр исследований сырья корня солодки, остается не изученным шрот - отход переработки корня солодки, который в условиях производства не находит реализации. Поэтому исследование химического состава шрота корня солодки, разработка способов его экстракции, исследование количественного и качественного состава соединений, извлекаемых из него различными растворителями, является актуальным для создания на основе экстрактов из шрота новых эффективных лекарственных средств, которые будут обладать высокой активностью и специфичностью действия.

Степень разработанности темы исследования. Основной вклад в исследование биологически активных веществ корня солодки внесли работы Толстикова Г.А., Толстиковой Т.Г., Аммосова А.С., Литвиненко В.И., Ипатовой О.М., Денисовой С.Б. и др. Авторами изучен химический состав различных видов солодки, определены биологические и фармакологические свойства компонен-тов этого сырья, разработаны технологии различных лекарственных форм на его основе К настоящему времени не имеется литературных данных по комплексной переработке этого ценного лекарственного сырья, а также по системному исследованию химического состава биологически активных веществ шрота корня солодки - отхода фар-мацевтического производства. Известны публикации, в которых из шрота корня солодки предлагалось получать: экстракт, богатый слизистыми веществами, жиры и жироподобные вещества, питательную среду для культивирования дрожжей, удобрения, кормовую муку для животноводства, теплозвукоизоляционные плиты для строительства.

Цель работы. Исследование количественного содержания и качественного состава экстрактивных веществ шрота корня - отхода производства сиропа корня солодки, для определения перспектив его дальнейшей переработки в лекарственные средства.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Определить химический состав шрота корня солодки;

2. Разработать комплексный подход для определения количественного содержания и качественного состава тритерпеноидных, флаво-ноидных и сопутствующих им соединений в шроте корня солодки - отхода производства сиропа корня солодки, который заключается в:

- подборе экстрагентов для увеличения выхода терпеноидных и флавоноидных веществ из шрота корня солодки с наименьшим содержанием сопутствующих соединений в полученных экстрактах;

- подборе оптимальных условий экстракции шрота корня солодки, выбранным экстрагентом, для получения максимального выхода тер-пеноидных, стероидных и флавоноидных соединений;

- установлении состава биологически активных веществ этанольно-го экстракта шрота корня солодки, путем применения физических и химических методов по их разделению.

З.Определить антиоксидантную, антимикробную и антимутагенную активность фракций, полученных на основе этанольного экстракта из шрота корня солодки для дальнейшего создания на их основе БАД и лекарственных средств.

Научная новизна работы. Впервые исследован химический состав шрота корня солодки, в нем установлено высокое содержание глицирризиновой кислоты, фенольных и липофильных веществ, полисахаридов, в том числе галактоглюканов, крахмала, клетчатки и белка.

Впервые применен комплексный подход к исследованию биологически активных веществ шрота корня солодки, заключавшийся в оптимизации экстракции шрота с получением этанольного экстракта, разработаны физические

и химические методы по разделению биологически активных веществ этого экстракта, что позволило определить качественный состав и количественное содержание глицирризиновой кислоты, флавоноидных и сопутствующих им соединений в шроте корня солодки.

Впервые показано, что из шрота корня солодки могут быть выделены фракции, которые обладают высокой антиоксидантной, антимикробной и антимутагенной активностью.

Проведенное фракционирование этанольного экстракта из шрота позволило увеличить антиоксидантные, антимикробные свойства полученных фракций в 18,5, в 1,3 раз, по сравнению с исходным экстрактом.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представлено теоретическое обоснование усовершенствования методов по выделению, фракционированию и идентификации биологически активных веществ, извлекаемых из лекарственного растительного сырья на примере корня солодки.

Впервые показано, что шрот корня солодки можно использовать для получения тритерпеноидных, стероидных, флавоноидных соединений, галактоглюканов, пектинов, крахмала и клетчатки.

Впервые обоснована возможность применения этанольного экстракта, полученного из шрота и выделенных из него фракций, для получения субстанций и дальнейшей разработки на их основе лекарственных средств с антиоксидантными, антимикробными и антимутагенными свойствами.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы физико-химического анализа: инструментальная тонкослойная хроматография на лабораторном комплексе «CAMAG», высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хромато-масс-спектрометрия, ИК-спектроскопия и метод динамического светорассеивания. Статистическую обработку экспериментальных результатов проводили с использованием программы 6.0».

На защиту выносятся:

- результаты анализа химического состава шрота корня солодки;

- комплексный подход по определению количественного содержания и качественного состава тритерпеноидных, флавоноидных и сопутствующих им соединений в шроте корня солодки;

- антиоксидантная, антимикробная и антимутагенная активность фракции, полученных на основе этанольного экстракта из шрота корня солодки и практические рекомендации по использованию биологически активных веществ, обнаруженных в шроте корня солодки.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов работы обеспечена при применении современных методов анализа использованием стандартов. Полученные экспериментальные данные достоверны, обработаны с помощью программного обеспечения к аналитическим приборам (PERKINELMER «ТигЬоМавБ», СЛЫЛО <^тСа1в», Shimadzu «Labsolutюш»), а также с использованием программы 6.0».

Результаты работы докладывались и обсуждались на XIII, XIV и XV Международных конференциях молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2014г., 2015г., 2016 г.), XXV Всероссийской научно-технической конференции «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань, 2014г.), V Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых веществ и материалов» (Сыктывкар, 2012 г.).

Внедрение результатов исследования. Материалы, изложенные в диссертационной работе Халед Ш.М. используются в лабораторных практикумах бакалавров по направлению 19.03.02 «Продукты питания из растительного сырья», профиль «Технология детского и функционального питания» при изучении дисциплины - «Технология отрасли 2» («Технология продуктов функционального питания») и по направлению 19.03.01 «Биотехнология», профиль «Пищевая биотехнология» при изучении дисциплин - «Физико-химические методы анализа биологически активных веществ», «Химия биологически активных веществ»; магистров по направлению 19.04.01 «Биотехнология», профиль подготовки «Пищевая биотехнология» при изучении дисциплины - «Биотехнология функциональных продуктов питания».

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка, приложений. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков, 29 таблицы и 159 литературных источника.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Общая характеристика сырья солодки

Glycyrrhiza относится к семейству бобовых Fabaceace. Корень солодки, одно из самих древнейших лекарственных средств. В мире существует около 13 видов корня солодки. Наиболее распространены виды: солодка голая (Glycyrrhiza glabra), солодка уральская, (Glycyrrhiza uralensis Fisch) и солодка коржинского (Glycyrrhizae Korshinskyi Grig) [1,2]. Солодка голая самая популярная среди них, в её корнях содержится наибольшее количество биологически активных веществ (БАВ) [1,2,3]. Большинство видов солодки произрастают на территории Евразии.

Glycyrrhiza glabra L. - это многолетнее травянистое растение, с хорошо развитой корневой системой. Стебель прямостоячий, негусто коротко и растет до одного метра по высоты [4]. Пушистые листочки продолговато-яйцевидные, около 2-4 см длиной и 1-2,5 см шириной, снизу (и редко сверху) кора продольно морщинистая от коричневато-серой до темно-коричневой [5]. Соцветия -довольно рыхлые, кисти по своей длине короче листьев или несколько длиннее. Цветки - бобы плоские продолговатые до прямых длиной 1-3 см, шириной 6 мм, довольно густо усеянные железистыми шипиками, многосемянные, или двух-трехсемянные [4].

Как показано на рисунке 1.1, сырье в основном состоит из цилиндрических отрезков корней, немного сужающихся, иногда продольно-расщепленных, диаметром 1-5 см, длиной 15-40 см. Внешне, неочищенный корень фиолетово-коричневый. Очищенный корень желтоватого цвета, с грубыми поперечными бороздами, внутри с радиальным [4]. Корень имеет приторно сладкий вкус благодаря главному компоненту глицирризиновой кислоте (ГК), которая в 50 раз слаще, чем сахароза [5]. Запах тонкий, характерный.

Рисунок 1.1 - Внешний вид корней солодки

Корень солодки заготавливают в зависимости от природных условий с марта по ноябрь [6] на третьем и последующих годах жизни растения. Сначала сквашивают траву, затем плантажным плугом с тракторной тягой вспахивают корневую систему растения вниз до 1 м. В маленьких зарослях корни раскапывают ручным способом лопатами. При сборе урожая убирают только 5075 % общего запаса корней. Повторный сбор сырьевого материала на этом месте можно будет осуществить через 6-8 лет. После очистки корни складируют в копны на 24 часа на открытом пространстве [7]. При плохих погодных условиях их высушивают под навесом при хорошем проветривании или на сушилках при температуре не больше 50 °С. Подсушенный корень переправляют для последующей обработки на предприятия.

Качество корня солодки нормируется Государственной Фармакопей (ГФ): содержание экстрактивных веществ (ЭВ), извлекаемых 0,25 % раствором гидроксида аммония, должно быть не менее 25 %, влаги не более 14 %, золы не более 8 %, ГК - не ниже 6 % [8]. ГК является наиболее ценным извлекаемым веществом, однако в корне солодки содержатся и другие БАВ: до 5,0 % флавоноидов, углеводов до 34,0 %, белков - до 10,1 %, аминокислот до 12,71 %, в том числе аспарагина до 4,0 %, жиров и жироподобных веществ до 4,7 %, аскорбиновой кислоты до 3,1 % [3].

1.1.1 Морфология корня солодки

В поперечном срезе пробка корня солодки широкая, коричневая, состоит из многих слоев [4]. Под пробкой первичная кора, широкая, желтого цвета с длинными и сильно утолщенными волокнами, флоэма у очищенных корней частично удалена вместе с пробкой [5]. У первичной коры волокна довольно длинные, с небольшим отверстием и достаточно утолщенными стенками, целлюлозными с внутренней стороны и немного одеревеневшими с внешней стороны [4,8]. Вторичная кора широкая, желтого цвета, в ней хорошо видны сердцевинные лучи, состоящие из радиальных групп волокон шириной от 1 до 8 клеток, чередуются с лубом [4, 5, 9]. Как показано на рисунке 1.2, простые, округлые или яйцевидные зерна крахмала можно увидеть в паренхимных сердцевинных лучах и клетках коры, размером 2-12 мкм, редко до 20 мкм [5]. Ксилема желтая, хорошо видна, расходится лучами [4].

Древесина имеет сосуды разных диаметров от узкого до очень широкого, группы склеренхимных волокон с кристаллоносной паренхимой и обкладкой, которая содержит крахмал. При окрашивании раствором йода, паренхима и сердцевинные лучи, окрашиваются в синий цвет, сосуды желтые, луб остается сероватым, древесина и группы волокон коры оранжевые. Сердцевина имеется только в корневище, и она окрашивается в темно-желтый цвет [4, 5].

1.2 Способы извлечения глицирризиновой кислоты (ГК)

из корня солодки

Наиболее простым способом выделения ГК из корня солодки является экстракция водой. В литературе описано несколько методов экстракции ГК водой (экстракция с перемешиванием, кипячение) [10, 11], однако они не получили широкого распространения. Это связано с тем, что, несмотря на то, что выход ГК при использовании воды довольно высокий (4-6 %), проведение

Рисунок 1.2 - Микроскопия корней солодки голой [9]: 1 - многослойная пробка;

2 - запасающая паренхима; 3 - сердцевинные лучи; 4 - луб; 5 - лубяные волокна; 6 - сосуды древесины; 7 - крахмальные зерна; 8 - камбий; 9 -

кристаллы в паренхиме

экстракции требует длительного времени и высоких энергозатрат на поддержание необходимой температуры.

С целью увеличения выхода ГК, используются различные приёмы. Согласно литературным данным, для извлечения ГК могут быть использованы растворы гидроксида аммония, растворы щелочей, органические растворители и растворы кислот [10,11, 12-15].

Классической технологией экстракции ГК из корня солодки является использование водных растворов гидроксида аммония [12]. В работе [16] Тихомирова с коллегами провели подбор условий экстракции ГК раствором гидроксида аммония и показали, что экстракция корня солодки 1 % водным раствором гидроксида аммония в течение 60 мин при температуре 120 °С является оптимальной и позволяет извлечь ГК с выходом 7,3 %. Авторы указывают, что применение раствора гидроксида аммония позволяет перевести

трудно растворимую в воде смесь глицирризина в легко растворимую в воде моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты МСГК, что, в частности, и обеспечивает повышение выхода ГК.

В литературе также описаны способы экстракции БАВ из корня солодки с использованием растворов щелочи (№ОН). Так, Денисова в [13] сообщает, что 2-кратная экстракция ГК из корня солодки с использованием 0,5 % (№ОН), при продолжительности 1 час при 20-50 °С позволяет увеличить выход ГК до 17 %.

В работах [10, 14] была описана экстракция корня солодки с применением органических растворителей. Гаврилин с коллегами [14] провели экстракцию ГК из корня солодки 70 % водным раствором этилового спирта кипячением в течение 2 ч. Выход ГК составил только 3,64-6,93 %.

В работе [17] проведен подбор условий выделения ГК из корня солодки этанолом. Параметрами подбора условий являлись концентрация этанола и размер частиц сырья. Шестиступенчатая экстракция методом реперколяции с передвижкой извлечения через 1 ч была проведена при соотношении сырье: экстрагент 1:10 при температуре 40-50 °С. с использованием в качестве экстрагента 40, 45, 50, 60, 75, 80 и 90 % этанола и различным размером частиц сырья - 1-2, 2-3 и 3-5 мм. Максимальный выход ЭВ - 10,35±0,13 % от сырья и ГК- 15,10±0,20 % от ЭВ наблюдался при использовании 50 % этанола и размера частиц 3-5 мм.

Более широкий анализ влияния органических растворителей на выход ГК осуществлён в [10]. В данной работе была проведена экстракция сырья органическими растворителями: хлороформом, ацетонитрилом, метанолом и этанолом. Показано, что ГК извлекается только при использовании метанола или этанола. Содержание ГК в этанольном и метанольном экстрактах составляет 0,86 мг/г, что в 2,8 раз меньше, чем в водном экстракте, полученном при тех же условиях. При подборе температуры, времени и концентрации спиртового раствора для увеличения выхода ГК было установлено, что наилучшие результаты достигаются при проведении экстракции сырья 30 % водным раствором этанола при 50 °С в течение 60 мин. Однако содержание ГК в

полученным таким способом экстракте все равно не превышало его содержание в водном экстракте.

Помимо выделения ГК органическими растворителями, в литературе также описаны способы экстракции с применением растворов минеральных кислот в органических растворителях. В работе [1 5] описана трёхстадийная экстракция ГК из измельчённого корня солодки с применением 3 % ацетонового раствора азотной кислоты с общей продолжительностью 3 ч. Выход ГК, выделенного данным методом, составил 2,7 %.

Наряду с подбором экстрагента, перспективным способом увеличения выхода ГК является использование физических способов для интенсификации экстракции. В работе [18] проведено извлечение ГК из корня солодки двумя способами: экстракцией в микроволновой печи и ультразвуковой экстракцией. В обоих случаях в качестве экстрагента был использован 60 % раствор этанола с 1 % раствором гидроксида аммония. Перед проведением экстракции, сырьё измельчали в блендере до получения мелкозернистого порошка. В качестве контроля была выбрана реперколяция 80 % раствором этанола с предварительным увлажнением сырья 10 % раствором гидроксида аммония (выход ГК составил 6,36 %). Было установлено, что, извлечение ГК с применением микроволновой печи позволяет сократить время экстракции с 72 ч до 15 мин без уменьшения выхода ГК. В то же время, проведение ультразвуковой экстракции позволяет не только сократить её продолжительность до 10 мин, но и увеличить выход ГК на 34 %.

В работе [19] была проведена экстракция порошка корня солодки различными растворителями, и дистиллированной водой, с применением ультразвуковой ванны при частоте 50 кГц и температуре 45 °С с различным временем выдержки 45, 60 и 120 мин. Экстракты обрабатывали 0,01 % аммиаком с последующим концентрированием. После, провели обработку 70 % этанолом с образованием осадка. Показано, что максимальное количество ГК получено при экстракции корня солодки дистиллированной водой и метанолом при температуре 45 °С в течение 45 мин 36,46 ± 1,29 и 35,80±1,18 % от ЭВ

соответственно. Экстракция этиловым спиртом позволила извлечь 15,62±1,45 % от ЭВ ГК при тех же условиях.

В работе [20] было проведено получение МСГК «Глицирама» с наиболее высокой чистотой 87 %. Это достигается использованием для экстракции сырья 0,5-1 % раствором аммиака и получении МСГК кислоты путем повторной перекристаллизации 85 % этанолом. При этом выход ЭВ составил 7,50±1,18 % от сырья, ГК после осаждения: концентрированной кислотой - 3,38±0,73 % от сырья (44,92±3,88 % от ЭВ), триаммонийной соли 5,23±0,75 % от сырья, технической МСГК 2,59±0,20 % от сырья, очищенной МСГК 1,25±0,18 % от сырья.

1.3 Способы извлечения фенольных соединений из корня солодки

Для извлечения флавоноидов из корня солодки используют различные способы экстракции. В работе [13] авторы описывают предварительную обработку корня н-гексаном для того, чтобы удалить жиро-липидный комплекс соединений. Экстракции подвергли, предварительно измельченные и высушенные на лабораторной мельнице или на промышленной дробилке, корни солодки. После экстракции гексаном, сырье экстрагировали этиловым спиртом и ацетоном с перемешиванием при температуре 40-50 °С в течение 4 часов. Выход агликонов флавоноидов в полученном экстракте составил 4 %, а гликозидов флавоноидов 12-14 %.

В работе [21] была проведена экстракция измельчённого корня солодки 80% метанольным раствором путём перемешивания при температуре 25 °С, в течение 1 часа. При этом выход флавоноидов составляет 17,00 ± 0,09 мг/г.

Экстракция измельченного корня солодки голой в работе [22] была проведена водой и этанолом путём кипячения на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа, при температуре 50 °С. Содержание фенольных, в том числе флавоноидных соединений в этанольном экстракте составляет 9,2 и 6,8 % соответственно, а в водном экстракте - 4,8 и 2,3 %.

Авторами [23] была проведена экстракция порошка корня солодки водой в аппарате Сосклета при соотношении сырье: экстрагент 1:10 в течение 8 ч. Выход сухих веществ для водного экстракта составил 5,5 % от сырья, из которых на долю фенольных соединений приходиться 6,50±2,21 мг/г в пересчете на галловую кислоту, а на флавоноиды - 12,75±1,22 мг/г в пересчете на кверцетин. При этом экстракция порошка корня солодки 96 % этанолом дает возможность извлечь в 1,3 раза больше БАВ. Выход сухих веществ составил 7,3 %. Количество фенольных соединений в этанольном экстракте составило 47,41±3,61 мг/г в пересчете на галловую кислоту, а флавоноидов 17,47±1,40 мг/г в пересчете на кверцетин.

В работе [24, 25] при экстракции порошка корня солодки 96 % этанолом в соотношении сырье: экстрагент 1:10 при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 48 ч. содержание фенольных соединений составляет 4,05 мг/г сырья, из которых на долю флавоноидов приходиться 1,14 мг/г сырья. В полученном экстракте были идентифицированы: простые фенолы, протокатеховая, бензойная, п-кумаровая, феруловая, коричная кислоты и ванилин, флавонол, рутин, мирицетин, кверцетин и кемпферол, флавононовые гликозиды - апигенин.

Авторами [26] была проведена экстракция корня солодки 96 % этанолом (сырье: экстрагент 1:2, 2 ч, п=2) при кипячении с обратным холодильником с последующей обработкой органическими растворителями и водой. Показано, что экстракция гексаном позволяет выделить 134,79±5,89 мг/г в пересчете на галловую кислоту фенольных соединений, 45 % которых являются флавоноиды - 62,52±0,47 мг/г в пересчете на рутин. Последующая экстракция хлороформом дает возможность извлечь 121,86±4,00 мг/г фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, из которых 66,55±0,22 мг/г в пересчете на рутин приходиться на флавоноиды. Экстракция корня солодки дополнительно н-бутанолом позволяет получить 44,41±0,50 мг/г в пересчете на галловую кислоту фенольных соединений, из которых 42 % это флавоноиды 18,77±0,10 мг/г в пересчете на рутин. Дальнейшая обработка этилацетатом дает возможность

извлечь 163,50±5,31 мг/г фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, из которых на долю флавоноидов приходиться 60,29±0,81 мг/г в пересчете на рутин. Обработка водой позволяет выделить 8,91±0,43 мг/г в пересчете на галловую кислоту фенольных соединений, 40 % которых являются флавоноиды 3,60±0,09 мг/г в пересчете на рутин.

1.4 Способы извлечения углеводов из корня солодки

Из солодки голой в работе [13] были выделены моно- и олигосахариды экстрагированием 82 % этанолом (выход 15,0 %). Так же был проведен гидролиз корня солодки 2 н раствором Н2Б04 в течение 8 часов на кипящей водяной бане и определен моносахаридный состав полисахаридов корня (выход составил 3 %).

Авторами [27], проведен подбор условий экстракции полисахаридов 80 % этанолом и показано, что экстракция измельчённого корня солодки с размером частиц 0,25-0,5 мм, 80 % этанолом при соотношении (1:15) при комнатной температуре в течение 1 часа с применение ультразвукового воздействия (20 мин) позволяет извлечь полисахариды с выходом 4,82 %.

Присутствие полисахаридов, а также декстринов и растворимых крахмалов в корне солодки, авторы установили в работе [28]. Результаты, полученные при исследовании химического состава подземных органов солодки, которая произрастает в Таджикистане, показали высокое содержание суммы сахаров 11,80-23,30 %, в том числе сахарозы 7,0-16,70 %, редуцирующих сахаров 1,308,50 %.

Авторами [29], изучен углеводный состав брикетированного корня солодки. Количество легкогидролизуемых полисахаридов в нем составляет 18,60-21,70 %, труднорастворимых полисахаридов 21,90-26,50 %, пентозанов 13,60-14,80 %, минеральных элементов 11,50-14,70 %. Полисахариды далее были гидролизованы с выходом сахаров до 75 %.

Ряд работ посвящен изучению полисахаридов различных видов солодки. Три полисахарида, глицирризаны ЦЛ, ив и иС были выделены из корня

Glycyrrhiza uralensis, полисахариды глицирризан и глицирризан GA выделены из столона Glycyrrhiza glabra var glandulifera [13].

Содержание трудногидролизуемых полисахаридов в сырье солодки составляет 26,6 % от сухих веществ, а содержание легкогидролизуемых - в 1,43 раза, лигнина - в 1,24 раза меньше, то есть 18,6 и 21,4 % соответственно. Количество гексозных сахаров, найденных в гидролизате шрота корня солодки -64 % от суммы моносахаридов [30].

1.5 Физико-химические характеристики биологически активных веществ

корня солодки

Основными действующими веществами корня солодки являются глицирризиновая кислота, фенольные соединения и углеводы.

Глицирризиновая кислота: ГК обнаружена более чем в 10 разновидностях солодки, и находится в виде смешанных калиево-кальциево-магниевых солей [13,14]. Содержание ГК в корнях солодки варьируется в интервале 2-24% [13,17]. ГК представляет собой кристаллическое, бесцветное вещество, которое хорошо растворимо в этаноле и горячей воде, и практически не растворимо в холодной [5, 31, 32]. Температура плавления (Тпл) - ГК (220 °C). УФ-спектр глицирризиновой кислоты показывает, что максимальный пик ее поглощения находиться в области 254 нм. [33, 34]. Агликоном ГК является одноосновная глицирретиновая кислота с характерной для нее кетогруппой, которая находится в 11 положении. Ее сахаристая часть представляет собой 2 молекулы глюкуроновой кислоты [33]. (рисунок 1.3).

Рисунок 1.3 - Агликон и гликозидный остаток глицирризиновой кислоты

Фенольные вещества извлекаемые из корня солодки.

Простые фенольные соединения. В настоящее время из корня солодки выделены и идентифицированы следующие фенольные соединения: простые фенолы (фенол, резорцин, пирогаллол), фенолкарбоновые кислоты (протокатеховая, хлорогеновая, бензойная, галловая, салициловая, ванилиновая и кофейная), оксикоричные кислоты (феруловая кислота, коричная кислота, синаповая кислота) [23]. Простые фенольные соединения (фенол, резорцин, пирогаллол) это кристаллические, бесцветные, иногда слегка окрашенные вещества, со специфическим запахом, с температурой плавления (Тпл) 40,9-110 °С, обадают оптической активностью. В растениях они чаще встречаются в виде гликозидов, которые в свою очередь, хорошо растворимы в спирте, воде, ацетоне, но нерастворимы в хлороформе и эфире. Агликоны хорошо растворимы в бензоле, эфире, хлороформе и этилацетате, но слабо растворимы в воде. Простые фенолы имеют характерные спектры поглощения в УФ областях спектра. Фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, бензойная кислота и другие) представляют собой кристаллические вещества, растворимые в эфире,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Халед Шади Мунир, 2017 год

2.1 Объекты исследования и материалы, использованные в работе

Объектами исследования в работе являются:

1. Корень солодки, измельчённый. Производитель ОАО «Красногорсклексредства», 04.2016, серия 151115, г. Красногорск, мкр. Опалиха, ул. Мира, 25.

2. Корень солодки, измельчённый, производитель ОАО «Красногорсклексредства», 09.2014, серия 90914, г. Красногорск, мкр. Опалиха, ул. Мира, 25.

3. Шрот корня солодки - отход производства лекарственного средства «Сироп корня солодки» на ОАО «Татхимфармпрепараты». Дата выработки шрота 18.12.2012 г. Шрот высушен в соответствии с инструкцией по заготовке и сушке [119]. Шрот также измельчали с получением двух различающихся по морфологии фракций: 1 - преимущественно тонкие волокна, 2 - тонкодисперсный порошок с размером частиц менее 1 мм. Микроскопический анализ шрота и его фракций провели по методике, описанной в п. 2.2.17. Полученные результаты представлены на рисунке 3.5.

2.1.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

Определение влажности, зольности, содержания сырого протеина, сырой клетчатки и сырого жира в сырье, шроте и его фракциях проводили по методикам, описанных в п. 2.2.1. Протоколы анализа представлены в приложении А на рисунках А1, А2 и А3. Полученные данные приведены в таблице 3.1.

2.1.2 Способ получения водно-аммиачного экстракта из сырья или шрота

корня солодки

Сырье или шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм экстрагировали 0,25 % водным раствором гидроксида аммония [119] в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 ч. В экстрактах определяли содержание ЭВ, содержание ГК, углеводов, простых фенолов, белков по стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3, 2.2.7, 2.2.8 соответственно. Полученные результаты приведены в таблице 3.5. Анализ качественного состава водоаммиачного экстракта, в том числе количественное определение в них ГК, провели методом инструментальной ТСХ на лабораторном комплексе «СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14. Полученные хроматограммы экстрактов представлены на рисунке 3.2, результаты их обработки сведены в таблицах 3.5 и 3.6. Протоколы анализа приведены в приложении Б на рисунке Б1.

2.1.3 Способ получения ацетонового экстракта из сырья или шрота корня

солодки

Сырье или шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм экстрагировали ацетоном, подкисленным азотной кислотой [119] в соотношении 1:50 кипячением в течение 2 ч. Кратность экстракции 3 стадии, продолжительность стадии - 0,5 ч. В полученных экстрактах определяли содержание ЭВ, ГК, сумму углеводов, простых фенолов, простых сахаров, по стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3 2.2.7, 2.2.4 соответственно. Полученные результаты приведены в таблице 3.5. Анализ качественного состава экстракта, в том числе количественное определение в нём ГК, провели методом инструментальной ТСХ на лабораторном комплексе «СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14, Полученные хроматограммы

экстрактов представлены на рисунке 3.2, результаты их обработки сведены в таблицы 3.5 и 3.6. Протоколы анализа приведены в приложении Б на рисунке Б1.

2.1.4 Способ получения этанольного экстракта из сырья или шрота корня

солодки

Способ 1. Сырье и шрот корня солодки с размером частиц 2-7 мм экстрагировали 40 %, 70 %, 80 % и 96 % раствором этанола, при кипячении в соотношении 1:40 в течение 2 ч. Кратность экстракции - 1, 3 стадии. В полученных экстрактах определяли содержание ЭВ, ГК, углеводов и флавоноидов, по стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3 и 2.2.12 соответственно. Полученные результаты приведены в таблицах 3.7.

Способ 2. Шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм (фракция 2) экстрагировали 80 % раствором этанола кипячением в течение 1, 2 ч. Кратность экстракции - 1, 3 стадий. Использовали соотношения шрот: экстрагент - 1:40, 1:50, 1:60, 1:80, 1:100. В полученных экстрактах определяли содержание ЭВ по стандартным методикам, описанных в п. 2.2.2. Полученные результаты приведены в таблице 3.9.

Анализ качественного состава экстрактов, полученных способом 1 и 2, в том числе количественное определение в них ГК, провели методом инструментальной ТСХ на лабораторном комплексе «СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14, с использованием системы растворителей № 1, проявителя № 1. Полученные хроматограммы экстрактов представлены на рисунке 3.3 и 3.6. Протоколы анализа приведены в приложении Б на рисунках Б2 и Б3, результаты их обработки сведены в таблицы 3.8 и 3.12.

2.1.5 Определение углеводов в шроте

Навеску измельченного шрота массой 5 г переносили в круглодонную колбу, приливали 200 мл 80 % раствора этанола. Колбу соединяли с обратным

холодильником и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. В полученном экстракте (проба 1) определяли содержание ЭВ, сумму углеводов, простых сахаров, и проводили анализа состава углеводов методом ВЭЖХ по методикам согласно п. 2.2.2, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.15 соответственно. Данные приведены в таблице 3.2 и 3.3, и (в приложении В) на рисунках В1, В2 и В3.

Остаток шрота после спиртовой экстракции возвращали в колбу, приливали 50 мл дистиллированной воды. Колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали на водяной бане при температуре 45 °С в течение 1 ч. Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Полученный водный экстракт доводили до объема 100 мл дистиллированной водой (проба 2) и определяли в нем содержание ЭВ, сумму углеводов, простых сахаров, водорастворимого пектина и крахмала по методикам согласно п. 2.2.2, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5, 2.2.6 соответственно. Данные приведены в таблице 3.2.

Остаток шрота после отделения водного экстракта снова возвращали в круглодонную колбу, приливали 50 мл 0,05 н раствора соляной кислоты. Колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали при 80 °С в течение 30 мин. Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Остаток шрота возвращали в круглодонную колбу, наливали 30 мл 1 % раствора лимоннокислого аммония. Колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали на водяной бане в течение 1 ч. Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Полученные экстракты объединяли - проба 3. Определяли в ней содержание ЭВ, сумму углеводов, простых сахаров, пектина и крахмала по методикам согласно п. 2.2.2, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5 и 2.2.6 соответственно. Полученные результаты представлены в таблице 3.2.

При хранении пробы 3 в течение суток наблюдали выпадение осадка. Его отделяли путем фильтрования. Проведена качественная реакция осадка с раствором йода. Осадок исследован с помощью ИК-спектроскопии по методике, описанной в п. 2.2.13. ИК-спектр приведен на рисунке 3.1.

2.1.6 Разделение экстрактивных веществ этанольного экстракта

из шрота (фракции 2)

20 г шрота (фракция 2 с размером частиц менее 2 мм), экстрагировали 80 % этанолом при кипячении в течение 2 ч., соотношение фракция 2: экстрагент 1:40. Полученный этанольный экстракт концентрировали на роторном испарителе «IKA» до объёма 200 мл, с последующим центрифугированием, в течение 10 мин при 3000 об/мин. В результате получили фракцию I (супернантант 1,5478 г) и фракцию II (осадок 0,7971 г). Разделение полученных фракций проводили по схеме, представленной на рисунке 3.7.

Проведен качественный анализ полученных фракций при помощи инструментального метода тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария) по методике, описанной в п. 2.2.14. Для фракций VII, XI XIX, XIII и XXI использовали систему растворителей - 2, а для фракций XV, XXIII и VIII систему растворителей - 3. Для дериватизации использовали проявители - 1, 2, 3. Полученные хроматограммы фракций представлены на рисунках 3.9 и 3.10. Протоколы анализа приведены на рисунке Б4 (Приложение Б), а результаты их обработки сведены в таблицах Б5-Б12 (Приложение Б).

Оценку антиоксидантной активности исходного этанольного экстракта и фракций, полученных после их разделения, шрота (фракция 2) проводили с помощью реактива - 0,2 мМ раствором ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом), по методике, описанной в п. 2.2.18. Полученные результаты представлены в таблице 3.16 и в (приложении Г, таблица Г1 и рисунок Г1).

Состав веществ фракции VII анализировали методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС), по методике, описанной в п. 2.2.16. Полученные данные представлены в таблице 3.17 и на рисунке Д1 (Приложение Д).

Проведено определение антимикробной активности этанольного экстракта шрота, фракций VII иVIII по отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus по

методике, описанной в п. 2.2.19. Полученные результаты представлены в таблице 3.18 и на рисунке 3.11.

Проведено определение антимутагенной активности по тесту Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА 100 и Salmonella typhimurium ТА 98 фракций VIII и XXI по методике, описанной в п. 2.2.20. Полученные результаты представлены в таблице 3.19.

2.2 Общие методы анализа 2.2.1 Определение физико-химических показателей

Определение влажности, зольности, сырого протеина, сырой клетчатки и сырого жира (веществ, экстрагируемых петролейным эфиром) в объектах исследования проводили по [119, 120-124].

2.2.2 Определение экстрактивных веществ

Определение экстрактивных веществ в объекте исследования проводили по стандартной методике [119].

2.2.3 Определение суммы углеводов антроновым методом

Количественное определение углеводов в объекте исследования проводили антроновым методом [125].

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношениях 1:30 и к 1 мл этого раствора добавляли 3 мл антронового реактива. Содержимое пробирок перемешивали и ставили на кипящую водяную баню с температурой 95100 °С на 7 мин. Затем пробирки охлаждали до 20 °С и определяли оптическую плотность на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине волны равной

590 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам глюкозы (10-100 мкг/мл).

Содержание суммы углеводов в объектах исследования рассчитывали по уравнению

У=0,005Щ

где У - оптическая плотность,

X - концентрация суммы углеводов, мкг/мл.

2.2.4 Определение простых сахаров

Количественное определение простых сахаров в объекте исследования проводили йодометрическим методом [125].

По результатам титрования 0,01 н раствором тиосульфата натрия рассчитывали количество простых сахаров Х, %, по формуле

X = (Ах [248 - (а - Ъ)])/^хп*10000),

где X - количество восстанавливающих сахаров, %; А - общий объем исследуемого раствора, мл; V - объем исследуемого раствора, взятого для анализа, мл; а - объем 0,01 н раствора тиосульфата натрия, затраченного при титровании контрольного раствора, мл;

Ъ - объем 0,001 н раствора тиосульфата натрия, затраченного при титровании исследуемого раствора, мл; п - навеска исследуемого шрота, г;

[248 - (а - Ъ)] - количество инвертного сахара, соответствующее 1 мл 0,001 н раствора тиосульфата натрия, мкг;

10000 - коэффициент для перевода микрограммов в граммы и пересчета результата в проценты.

2.2.5 Определение пектина

Количественное определение пектина в объектах исследования проводили титриметрическом методом [126].

2.2.6 Определение крахмала йодометрическим методом

Количественное определение крахмала в объектах исследования осуществляли йодометрическим методом [125]. Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношениях 1:20 и к 10 мл этого раствора добавляли 1 мл раствора йода. Содержимое пробирок перемешивали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре «UNICO VV/VIS 2000» при длине волны 450 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам крахмала (10-50 мкг/мл). Содержание крахмала в объектах исследования рассчитывают по уравнению калибровочной кривой

Y=2,405^+0,0175,

где Y - оптическая плотность,

X - концентрация крахмала, мкг/мл.

2.2.7 Определение простых фенолов

Количественное определение простых фенолов в объекте исследования проводили фотометрическим методом с применением 4-аминоантипирина [127].

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10 и к 2,5 мл этого раствора прибавляли 2 мл 0,066 М раствора

гидроортофосфата натрия, одну каплю 2 % раствора 4-аминоантипирина и 0,5 мл 1 % раствора гексоцианоферрата (III) калия. Через 5 мин измеряли оптическую плотность на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине волны 500 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам фенола (1-10 мкг/мл). Содержание простых фенолов в объектах исследования рассчитывали по уравнению

Y=0,0598X+0,0009,

где Y - оптическая плотность,

X - концентрация простых фенолов, мкг/мл.

2.2.8 Определение белка по методу Флореса

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10. К 1 мл исследуемого раствора прибавляли 9 мл раствора бромфенолового синего [128], выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине волны 610 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам альбумина (0,01-0,08 мг/мл). Количественное определение содержания белков в объектах исследования рассчитывали по формуле

Y = 0,445X,

где Y - оптическая плотность,

X - концентрация белка, мг/мл.

2.2.9 Определение аминокислот нингидриновым методом

Метод основан на образовании окрашенного раствора в сине-фиолетовый цвет комплекса аминокислот с нингидрином [128]. В пробирку с 0,5 мл объекта

анализа (или контроля) приливают 0,5 мл ацетатного буфера (4 М, рН=5,5) и 1 мл 4 % раствора нингидрина в метилцеллюлозе. Тщательно перемешивали и помещали на 20 мин в кипящую водяную баню для развития окраски. Затем добавляли 5 мл 50 % раствора изопропанола, снова тщательно перемешивали. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм против контроля. Калибровочный график строили по растворам глицина (1-10 мкг/мл).

2.2.10 Определение лигнина

Определение содержания лигнина в объекте иследования проводили по [125]. Навеску измельченного сырья массой 0,5 г тщательно смешивали с 6 мл 37 % раствора формалина в стакане на 100 мл, прибавляли 6 мл 72 % раствора серной кислоты, затем 8 мл концентрированной серной кислоты и оставляли на 24 ч при периодическом помешивании. После этого к раствору добавляли 35 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа в соотношении 6:1 и после взбалтывания содержимое стакана медленно переливали в стакан на 600 мл, в котором было 400 мл воды. Хлороформ удаляли, нагревая на водяной бане 20 мин, и давали отстояться осадку в течении 24 ч. Лигнин собирали во взвешенный набитый стеклянной ватой стеклянный фильтр № 2. Далее, после промывки лигнина 5 % раствором соляной кислоты и водой, стеклянные тигли высушивали до постоянного веса при 105 °С и после охлаждения взвешивали. Содержание лигнина х, %, определяли по формуле

х=((в1-в) *100)/н,

где в - вес сухого (без осадка) тигля, г; в1 - вес тигля с сухим осадком, г; н - навеска, г.

2.2.11 Определение глицирризиновой кислоты

Количественное определение ГК в объектах исследования проводили гравиметрическим методом в сочетании с титрованием по ФС 42-2614-96 [118], а также методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «CAMAG» по следующей методике. На линию старта пластинки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А-УФ аппликатор автоматически наносит заданный объем объекта исследования и затем рядом 0,01 % раствора стандарта ГК (С30Н46О4, «ACROS ORGANICS», CAS 53956-04-0). Пластинку с нанесенными пробами помещают в автоматическую камеру для элюирования хроматограммы в системах растворителей: этилацетат - муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (15:1:1:2). В качестве проявителя применяли 10 % раствор H2SO4 в метаноле. Денсиметрическую обработку хроматограммы осуществляли при длине волны 254 нм до и после проявления. Содержание ГК рассчитывали по площади пятна на хроматограмме с применением градуировочного графика, построенного площади пятен, соответсвующих 0,05-0,10 мкг стандарта ГК.

2.2.12 Определение флавоноидов

Определение содержания флавоноидов в объектах исследования проводили спектрофотометрическим методом согласно [129]. Для этого готовили следующие растворы:

- раствор сравнения - 1 мл экстракт вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем 96 % этиловым спиртом до метки;

- опытный раствор - 1 мл экстракта вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл 2 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводили объем раствора до метки объем 96 % этиловым спиртом;

- раствор ликвиритигенина - 0,005 г (точная навеска) ликвиритигенина растворяли в мерной колбе вместимостью 10 мл в 2 мл 95 % спирта. Доводили объем раствора до метки 95 % спиртом и перемешивали (раствор А).

В мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл раствора А, добавляли 2 мл 2 % раствора алюминия хлорида и перемешивали (раствор Б). Параллельно готовили раствор сравнения без добавления алюминия хлорида. Срок годности растворов 1 месяц

Далее измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора Б ликвиритигенина на фоне раствора Б данного стандарта.

Таблица 2.1 - Данные оптической плотности раствора ликвиритигенина

Объект Разведение Б Бср

Раствор ливиритигенина 1:25 0,030 0,025

0,020

0,025

Содержание флавоноидов в пересчете на ликвиритигенин рассчитывали по формуле

^ Д*т0 «Р*!?^ 5*10 О

где Х - содержание флавоноидов в пересчете на ликвиритигенин, %;

D - оптическая плотность исследуемого раствора (Б) при длине волны 420

нм;

Do - оптическая плотность раствора ликвиритигенина (Б) при длине волны 420 нм;

m - масса сырья, г;

mo - масса ликвиритигенина г;

V- объем экстракта исследуемого объекта, мл;

Vo - объем раствора ликвиритигенина, мл;

Vl - объем экстракта объекта исследования, взятого на анализ, мл; V2 - объем раствора ликвиритигенина, взятого на анализ, мл;

2.2.13 ИК спектроскопия

ИК-спектры образцов снимали в таблетках с KBr на спектрофотометре «IRPrestige - 21» с Фурье преобразованием фирмы «Shimadzu» в области 4000-400 см-1.

2.2.14 Качественный анализ объектов исследования методом инструментальной тонкослойной хроматографии

Качественного анализ объектов исследования проводили методом инструментальной тонкослойной хроматографии (лабораторный комплекс «CAMAG») на пластинах «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А-УФ в следующих системах растворителей: 1 - этилацетат : муравьиная кислота : уксусная кислота : вода (15:1: 1: 2); 2 - гексан : ацетон (6:4); 3 - хлороформ : метанол : вода (26:14:3).

Применяли следующий проявители: 1 - 10 % раствор серной кислоты в метаноле; 2 - 3 % раствор хлорида алюминия в этаноле; 3 - 5 % раствор карбоната натрия. В качестве стандартов использовали растворы ГК и ликвиритигенина. Денсиметрическую обработку хроматограммы осуществляли при длине волны 254 нм, 354 нм и при видимом свете до и после проявления [130].

2.2.15 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Исследование ВЭЖХ углеводов в этанольном экстракте, осуществляли на ВЭЖХ-хроматографе серии LC-20 prominence «Shimadzu, Япония», колонка Zorbax «Agilent Technologies», длина 250 мм, диаметр 4,6 мм, с зернением 5 мкм; подвижная фаза: смесь ацетонитрил - вода в соотношении 85:15, скорость потока 1,8 мл/мин, температура колонки 35 °С. Рабочая длина волны 190 нм. В качестве стандартов использовались растворы рамнозы, ксилозы, арабинозы, фруктозы, маннозы, глюкозы, галактозы, сахарозы и мальтозы.

2.2.16 Хромато-масс-спектрометрический анализ

ГХ/МС-исследование проводилось на приборе «PEClarus 680 SQ-8». Температурная программа термостата. Начальная температура 100 °С - изотерма 5 минут. Нагрев со 100 °С до 280 °С со скоростью 4 °С/мин. Изотерма на 280 °С -10 минут. Температура инжектора - 280°С. Колонка ELITE-5MS: длина - 30 м; диаметр - 0,25 мм; толщина фазы - 0,25 мкм. Поток 1 мл/мин, деление потока 10 мл/мин, режим вакуумной компенсации. Параметры детектора: Температура источника 290 °С, температура трансферной линии 280 °С. Ионизация электронным ударом 70 эВ. Параметры детектирования: с 0 по 3 минуту выключенный источник. С 3 по 60 минуту включенный источник в режиме общего тока с 50 m/z по 500 m/z. Идентификацию компонентов проводили с использованием библиотеки масс-спектров NIST-11 [131].

2.2.17 Микроскопический анализ

Подготовку объектов осуществляли путем холодного размачивания [9]. Объекты выдерживали для набухания в воде в течение 1 ч, затем переносили в смесь глицерина со спиртом в соотношении 1:1 и настаивали в течение 5 сут. Размоченные объекты выравнивали скальпелем для придания соответствующего направления и затем приготавливали срезы при помощи бритвы. Сначала срезали более толстые, но цельные ломтики, затем делали срезы тонкие и более мелкие. Полученные срезы помещали на предметное стекло. Измельченные объекты после размачивания сразу наносили на предметные стекла и исследовали на видеомикроскопе «MC 100 (LDC)» при увеличениях 4х, 10х.

Для изучения химического состава объекта проводили качественные реакции с применением специфических реактивов [9]:

- раствор Люголя - крахмал окрашивается в синий цвет, а целлюлоза в желтый;

- 80 % раствор серной кислоты - клетки и ткани, содержащие ГК, окрашиваются в оранжево-красный цвет;

- 1 % раствор хлорида железа - клетки, ткани, содержащие флавоноиды, окрашиваются в черно-синий или черно-зеленый цвет.

2.2.18 Определение антиоксидантной активности

Определение антиоксидантной активности проводили с применением реактива 0,2 мМ раствором ДФПГ на многорежимном ридере «TECAN infinite M 200 Pro» микропланшетным методом [132,133].

Опытный раствор готовили, приливая к 100 мкл исследуемого раствора различных концентраций 100 мкл метанола и 100 мкл реактива ДФПГ. Контрольный образец содержал 100 мл метанола и 100 мкл реактива ДФПГ. Для вычета окраски самого исследуемого раствора готовили холостую пробу, которая состояла из 100 мкл исследуемого раствора различных концентраций и 100 мкл метанола. После проводили измерение оптической плотности при 517 нм во всех лунках микропланшета.

Процент ингибирования I (%) определяли по формуле

I = ((Ак - Ао)/Ак) х 100,

где Ак - разность между оптической плотности контрольного образца и оптической плотности метанола;

Ао - разность между оптической плотности опытного образца и оптической плотности холостой пробы

2.2.19 Определение антимикробной активности объектов исследования

Исследование проводили методом диффузии в агар с использованием дисков по отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus ATCC® 29213™.

Активацию культуры осуществляли согласно инструкции, указанной в её паспорте (приложение Е) [134]. На поверхность агаризованной среды Мюллера-Хинтона делали посев микробной культуры штрихом, укладывали стерильные бумажные диски, на которые наносили испытуемые растворы. Также, для сравнения полученных результатов использовали диски со стандартным образцом гентамицина. Чашки помещали в термостат и через 18 ч осматривали, отмечая зоны задержки роста микробной культуры.

2.2.20 Определение антимутагенной активности объектов исследования.

Исследование антимутагенной активности проводили методом Эймса на тестерных культурах Salmonella typhimurium ТА 100 и Salmonella typhimurium ТА 98 согласно [135].

Перед проведением анализа тестерную культуру активировали. Для этого её переносили в 5 мл LB-бульона, содержащего ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и инкубировали при 37 °С в течение 12-15 ч. Затем 5 мл полученной культуры переносили в 20 мл свежего LB-бульона с ампициллином (25 мкг/мл) и инкубировали с принудительной аэрацией при 37 °С в течение 2-2,5 ч. Полученную культуру центрифугировали, осадок ресуспендировали и использовали при проведении анализа.

Перед проведением анализа готовили растворы исследуемых препаратов в стерильной дистиллированной воде или диметилсульфоксиде.

Для проведения анализа в стерильные чашки Петри вносили агар с микродобавками биотина и гистидина, добавляли 0,1 мл бактериальной суспензии и 0,1 мл раствора исследуемого соединения. Чашки термостатировали при 37 °С. Учет результатов проводили по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности через 48 ч. инкубации. Сравнивали число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения и в негативном контроле по формулам:

Выживаемость = (число колоний в опыте/ число колоний в контроле) х100 %

Мутагенный потенциал = число Шз+ ревертантов в опытном вариатне / число

Шз+ ревертантов в негативном контроле

Антимутагенный эффект (%) = [1 - (Т - К)/(М- К)] *100 %, где М - число И1б+ ревертантов в положительном контроле;

Т - число И1б+ ревертантов в опытном варианте (в присутствии объекта исследования и мутагена);

К - число колоний И1б+ ревертантов в негативном контроле.

2.2.21 Статистическая обработка результатов

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения 6.0».

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

Сырье корня солодки экстрагируют водно-аммиачным раствором на ОАО «Татхимфармпрепараты» при получении сиропа корня солодки. Шрот, получаемый в ходе технологической переработки корня солодки, имеет высокую влажность, что ограничивает его дальнейшее использование. В связи с этим всю партию шрота корня солодки, полученную на ОАО «Татхимфармпрепараты», подвергали сушке при температуре (40±5) °С [136]. После высушивания для анализа была сформирована средняя проба шрота согласно требованиям [119]. Проведено определение БАВ в шроте в сравнении с исходным сырьем. Полученные результаты анализа приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1 - Химический состав сырья и шрота корня солодки (п=3-5, Р=0,95)

Массовая доля веществ Содержание, % в

Сырье Шроте

Глицирризиновой кислоты 6,80* 2,76±0,14

Веществ, экстрагируемых петролейным эфиром 1,40±0,02 1,66±0,11

Веществ, экстрагируемых диэтиловым эфиром 8,34±0,01 5,17±0,02

Веществ, экстрагируемых водно-аммиачным раствором 35,6* 22,9±0,40

Сырого протеина 12,33±0,95 12,36±0,94

Сырой клетчатки 24,56±0,12 31,69±0,08

Лигнина 21,4 [118] 11,64±0,73

Минеральных веществ 6,86* 3,49±0,02

Влаги 3,75±0,20 5,30±0,10

* - данные из протокола испытания корня солодки на ОАО «Татхимфармпрепараты» (приложение А)

Таким образом, установлено, что из шрота можно извлечь еще около 41 % глицирризиновой кислоты. Он богат веществами, экстрагируемыми

петролейным и диэтиловым эфиром, которые в основном представлены липофильными и простыми фенольными соединениями. Как из сырья, так и из шрота 0,25 % раствором аммиака извлекается в три раза больше веществ, чем органическими растворителями. Сырье и шрот богаты клетчаткой, лигнином и белками. Как видно из табличных данных, влажность и зольность шрота не превышают требований, установленных фармакопейной статьей на исходное лекарственное сырье [41].

Проведенные исследования показали, что классическая промышленная технология по переработке этого сырья не позволяет максимально извлекать из корня солодки экстрактивные вещества, в том числе глицирризиновую кислоту [136]. Показана возможность дополнительного извлечения из шрота биологически активных веществ для исследования его состава и количественного содержания, что позволит расширить спектр БАД и лекарственных средств на основе корня солодки.

3.2 Состав углеводов шрота корня солодки

Известно, что наибольшее количество биологически активных веществ корня солодки представлено углеводами. После экстракции сырья водно-аммиачным раствором в шроте должна увеличиваться доля углеводов, что продемонстрировано на примере клетчатки (таблица3.1).

Для извлечения углеводов шрот корня солодки последовательно обрабатывали: 80 % этанолом; дистиллированной водой; 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония [125]. Во всех полученных экстрактах определяли сумму углеводов, в том числе их отдельных групп. Результаты приведены в таблице 3.2.

Таблица 3.2 - Состав углеводов, извлекаемых последовательно из шрота корня солодки различными экстрагентами (п = 5, Р = 0,95)

Состав углеводов Содержание, % от шрота

Углеводы, извлекаемые 80 % этанолом:

- сумма углеводов 1,19±0,01

- простые углеводы 0,32±0,02

Углеводы, извлекаемые дистиллированной водой:

- сумма углеводов 2,76±0,15

- водорастворимый пектин 0,81±0,09

- крахмал 2,22±0,14

Углеводы, извлекаемые 0,05 н раствором соляной кислоты и

1 % раствором лимоннокислого аммония:

- сумма углеводов 8,55±1,12

- протопектин 0,82±0,01

- крахмал 8,05±0,01

Углеводы, извлекаемые 80 % этанолом. При экстракции шрота корня солодки 80 % этанолом в экстракт будут переходить главным образом простые углеводы [125]. Установлено, что сумма углеводов в этанольном экстракте составляет 1,19 % от шрота. При этом только 27 % от суммы обнаруженных углеводов приходится на долю простых углеводов. Их содержание в шроте почти в 50 раз меньше, чем в исходном сырье (16 % [28]). Остальные 73 % углеводов, извлекаемых из шрота 80 % этанолом, могут быть представлены, например, спирторастворимыми полисахаридами, которые ранее были обнаружены в корне солодки [137].

Известно, что сумма углеводов, полученная из этанольного экстракта корня солодки, обладает биологической активностью, проявляя выраженные противоязвенные и спазмолитические свойства [13]. Поэтому особый интерес представляло исследование качественного состава суммы углеводов, извлекаемых этанолом из шрота корня солодки. Для решения этой задачи был применен метод ВЭЖХ. Поскольку анализируемый экстракт содержит наряду с простыми сахарами и полисахариды, исследовали как исходный этанольный экстракт, так и гидролизат, полученный при его кипячении с 10 % раствором

соляной кислоты в течение 10 мин. В таблице 3.3 приведены результаты обработки их хроматограмм.

Таблица 3.3 - Результаты обработки хроматограмм этанольного экстракта из шрота корня и его гидролизата

Объект исследования Пик Время удерживания, мин Площадь пика, % Отнесение

1 5,484 1,1 -

Этанольный 2 5,867 0,3 фруктоза

3 6,516 0,5 глюкоза

экстракт из 4 10,277 45,8 -

шрота корня 5 11,558 11,3 сахароза

солодки 6 15,836 3,3 -

7 17,575 34,5 -

8 19,314 3,2 -

Гидролизат 1 4,839 0,1 арабиноза

этанольного 2 5,652 2,8 фруктоза

экстракта из 3 7,393* 43,9 глюкоза + галактоза

шрота корня 4 8,114 15,3 -

солодки 5 11,292 37,9 -

Примечание: *на хроматограмме глюкоза и галактоза выходят одним уширенным пиком, захватывая времена удерживания 6,5 мин и 7,4 мин.

Всего на хроматограмме этанольного экстракта из шрота корня солодки обнаружено 8 пиков. Из них 3 были отнесены к фруктозе, глюкозе и сахарозе, имеющих содержание 0,3 %, 0,5 % и 11,3 % от суммы обнаруженных углеводов соответственно. Известно, что эти углеводы являются основными в корне солодки, и содержание сахарозы всегда значительно выше составляющих ее моносахаридов [28]. В отличие от этанольного экстракта из сырья корня солодки, в котором преобладающим углеводом является сахароза (46 %) [13], в экстракте из шрота основными являются два неидентифицированных углевода с содержанием 45,8 % и 34,5 % соответственно. Первый пик с временем удерживания 10,277 мин можно отнести к дисахаридам, а второй, с временем удерживания 17,575 мин - к олигосахаридам.

На хроматограмме кислотного гидролизата этанольного экстракта из шрота по сравнению с исходным экстрактом исчезают пики с большими значениями времени удерживания (15,836, 17,575 и 19,314). При этом в гидролизате накапливается галактоза в сочетании с глюкозой до 43,9 %, фруктоза с 0,3 % до 2,8 %. Дополнительно в следовом количестве обнаруживается арабиноза. Также появляются два неидентифицированных углевода с временами удерживания 8,114 мин и 11,292 мин, суммарно занимающих около 53 % от суммы обнаруженных углеводов. Пик с временем удерживания 11,292 мин можно отнести к ди- или олигосахаридам, которые по-видимому образуются при гидролизе спирторастворимых полисахаридов или отделение гликозидных остатков флавоноидов и глицирризиновой кислоты, извлекаемых из шрота.

Результаты ВЭЖХ анализа этанольного экстракта из шрота подтверждают предположение, сделанное ранее по данным количественного определения в нем углеводов, что 80 % этанолом из шрота извлекаются преимущественно полисахариды. Главным образом они представлены галактоглюканами, поскольку в гидролизате значительно увеличивается количество галактозы и глюкозы. Также в анализируемом экстракте может содержаться олигосахарид -глюкофруктан, который ранее был обнаружен в корне солодки [138]. Например, полисахарид глицирризан UC, выделенный из корней солодки уральской, структурной единицей которого является арабино-3,6-галакто-глюкан проявляет выраженное иммуномодулирующее действие на уровне с препаратом «Зимозан» [139]. Глюкофруктан из Arctium lappa также обладает иммуномодулирующим и противокашлевым действием [139].

Следовательно, этанольный экстракт из шрота представляет значительный практический интерес для исследования его биологической активности.

Углеводы, извлекаемые дистиллированной водой. Показано, что сумма углеводов, извлекаемых водой из шрота корня солодки, составляет 2,76 % (таблица 3.2). В составе обнаруженных углеводов основную часть занимает крахмал - 80,4 %, а остальные 19,6 % приходятся на водорастворимый пектин.

Определена степень этерификации выделенного пектина и показано, что она составляет 2,32±0,41 %. Очень низкая степень этерификации пектина, выделенного из шрота корня солодки, обуславливает его фармакологическую ценность в качестве высокоэффективного сорбента.

Углеводы, извлекаемые 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония. Наибольшее количество углеводов - 8,55 % извлекается из шрота корня солодки с применением 0,05 н раствора соляной кислоты и 1 % раствора лимоннокислого аммония (таблица 3.2). Также, как и в водном экстракте в их составе преобладает крахмал - 94,1 % от суммы обнаруженных углеводов. При этом стоит отметить, что выход крахмала при последовательной обработке шрота 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония в 4 раза выше, чем при экстракции шрота водой [140]. По-видимому, это связано с особенностями анатомического строения корня солодки. Известно, что крахмал локализован в виде крахмальных зерен округлой или яйцевидной формы величиной 2-20 мкм во вторичной коре в сердцевинных лучах и паренхимных клетках, которые чередуются с лубом [5]. В процессе обработки шрота 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония происходит частичный гидролиз основного связывающего гликана луба -целлюлозы, что и обуславливает увеличение выхода крахмала.

Выход протопектина одинаков с выходом водорастворимого пектина, при этом степень его этерификации еще ниже - 0,86±0,05 % (таблица 3.2).

При осаждении протопектина этанолом, выпавший осадок не полностью растворялся в воде. Его отделили фильтрованием и высушили. Выход осадка составил 2,28 % от шрота. Положительная качественная реакция с йодом указывает, что полученный осадок представляет собой крахмал.

В ИК-спектре осадка присутствуют все характерные для крахмала полосы поглощения: 3400 см-1 (валентные колебания связанных ОН-групп), 2800-3000 см-1 (валентные колебания СН-групп), 1400-1450 см-1(деформационные колебания СН-групп), 1000-1100 см-1 (колебания скелета молекулы) [141].

(рисунок 3.1). Однако, наличие полосы поглощения 1629 см-1 (валентные колебания -С=О группы) указывают на наличие в анализируемом объекте наряду с крахмалом пектиновых веществ.

I

г»

Я

«ООО ЗГЬО 35 СО 3250 ЗСОО 2750 2900 2250 2000 1750 « 500 1250 1000 750 500

№доепитЬег от-1

Рисунок 3.1 - ИК-спектр осадка из экстракта шрота, полученного с применением 0,05 н раствора соляной кислоты и 1 % раствора лимоннокислого

аммония

Таким образом, показано, что фракция углеводов, извлекаемая из шрота корня солодки последовательной обработкой 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония, за счет содержания в ней как пектина, так и крахмала, обладает практической ценностью и может быть использована, например, в качестве эффективного сорбента или вспомогательных веществ в фармации.

Содержание структурных полисахаридов - гемицеллюлоз, целлюлозы и лигнина проведено по стандартной методике определения сырой клетчатки в растительных кормах. Показано, что общее содержание структурных полисахаридов в шроте корня солодки составляет 31,69±0,04 % (таблица 3.1). Эта группа углеводов может быть использована в качестве сорбентов и

источника пищевых волокон при разработке биологически активных добавок и лечебно-профилактического питания [142].

Установлено, что шрот корня солодки содержит: простые углеводы - 0,3 %, спирторастворимые полисахариды в виде галактоглюканов - около 0,8 %, пектиновые вещества - 1,6 %, крахмал - 10,3 %, структурные полисахариды -31,7 %.

На основе проведенных исследований предлагается использовать: пектиновые вещества, при разработке иммуномодуляторов, а также в качестве высокоэффективного сорбента, крахмал в фармацевтическом производстве в качестве наполнителя, структурные полисахариды, как высокоэффективный сорбент, в качестве источника пищевых волокон и для разработки новых биологически активных добавок.

3.3 Выбор растворителя для максимального извлечения глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений

В настоящее время фармацевтическая промышленность различных стран на основе глицирризиновой кислоты выпускает лекарственные средства «Глицирам» и «Фосфоглив» (Россия), «Туссилинар» (Польша), «StrongerNeo-MinophagenC» и «Glycyron» (Япония), «Compound Glycyrrhizin Capsule» (Китай) и др. На основе фракции флавоноидов разработаны лекарственные средства -«Флакарбин» и «Ликвиритон». Выход этих веществ при экстракции сырья корня солодки сильно изменяется в зависимости от используемого экстрагента. Кроме того, различается и состав сопутствующих соединений, извлекаемых наряду с целевыми компонентами. Исходя из анализа литературных данных [1, 13, 143], в работе были выбраны три наиболее часто используемых для экстракции корня солодки экстрагента и применены условия проведения этого процесса (таблица 3.4).

Таблица 3.4 - Условия экстракции различными экстрагентами сырья и шрота корня солодки

Экстрагент Условия экстракции

0,25 % раствор гидроксида аммония Соотношение сырье/шрот:экстрагент - 1:50, замачивание в течение 1 ч с последующим кипячением в течение 2 ч, кратность экстракции - 1 стадия [41]

Ацетон, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты Соотношение сырье/шрот:экстрагент - 1:50; кипячение в течение 0,5 ч, кратность экстракции - 3 стадии [144]

80 % этанол Соотношение сырье/шрот:экстрагент - 1:40; кипячение в течение 2 ч, кратность экстракции - 1 стадии [125]

В полученных экстрактах определили содержание экстрактивных веществ, в том числе отдельных классов биологически активных веществ [145].

Наибольший выход экстрактивных веществ, как из сырья, так и шрота корня солодки наблюдается при их экстракции ацетоном, подкисленным 3 % раствором азотной кислоты (таблица 3.5). При этом в анализируемых экстрактах содержится максимальное количество глицирризиновой кислоты. Согласно литературным данным [13], подкисленный ацетон используют для увеличения выхода глицирризиновой кислоты при экстракции корня солодки. Содержание глицирризиновой кислоты в экстракте из шрота в 4,5 раза ниже по сравнению с экстрактом из сырья (таблица 3.5), поскольку основная её часть уже была извлечена в ходе промышленной переработки корня солодки [145].

Наряду с глицирризиновой кислотой в ацетоновых экстрактах из сырья и шрота преобладают простые фенолы и углеводы (таблица 3.5). Стоит отметить, что простые углеводы, выделенные из корня солодки, обладают противоязвенным и спазмолитическим действием [13], а простые фенолы

проявляют выраженную антимикробную активность [146]. В связи с этим ацетоновый экстракт из шрота корня солодки представляет наибольший практический интерес, т.к. в его экстракте содержание простых фенолов и углеводов практически не уступает их содержанию в экстракте из исходного сырья.

При экстрагировании 0,25 % раствором гидроксида аммония и 80 % этанолом извлекается из сырья и шрота корня солодки практически одинаковое количество экстрактивных веществ, в том числе основных биологически активных компонентов - глицирризиновой кислоты и флавоноидов (таблица 3.5). Применены разные методы анализа углеводов в этих экстрактах. Показано, что содержание в них простых углеводов невелико. Использование же антронового метода позволило установить, что суммарное содержание углеводов в исследуемых экстрактах составляет 65-70 % от экстрактивных веществ. Это хорошо согласуется с ранее полученными результатами, описанными в предыдущей подглаве, что обнаруженные углеводы экстрактов представлены в основном полисахаридами.

В корнях солодки содержится до 30 % крахмала [13, 1], и он может извлекаться при водно-аммиачной экстракции. Поэтому было проведено определение крахмала в водно-аммиачных экстрактах из сырья и шрота корня солодки, и показано, что его содержание составляет 4,23 и 2,88 % соответственно. Также в анализируемых экстрактах из сырья и шрота показано наличие белков в количестве 0,34 и 0,15 % соответственно (таблица 3.5). Обнаруженные полимерные вещества являются балластными и затрудняют дальнейшую обработку полученных водно-аммиачных экстрактов. В связи с этим более перспективно для экстракции шрота в качестве экстрагента использовать 80 % этанол, т.к. полученные экстракты содержат меньшее количество сопутствующих соединений.

Для уточнения качественного состава экстрактивных веществ в экстрактах, полученных из сырья и шрота корня солодки с применением различных экстрагентов, была применена тонкослойная хроматография [145]. Исследование

проводили на лабораторном комплексе «САМАО» (Швейцария). Хроматограммы анализируемых экстрактов, полученных из сырья и шрота, в сравнении со стандартами - глицирризиновой кислотой (трек 1) и ликвиритигенином (трек 2), а также этанольным экстрактом из сырья корня солодки (трек 9) [130] приведены на рисунке 3.2.

■ I Ш ЧИШ7

Рисунок 3.2 - Хроматограмма экстрактов из сырья и шрота корня солодки, полученных с применением: 0,25 % раствора гидроксида аммония (трек 1 и 2); ацетона, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты (трек 3 и 4); 80 % этанола (трек 5 и 6), в видимом свете после дериватизации.

Таблица 3.5 - Количественный и качественный состав экстрактивных веществ, извлекаемых из сырья и шрота корня солодки различными экстрагентами (n = 3-5, P = 0,95)

Объект исследования Содержание, % сырья*/шрота

экстрактивные вещества глицирризиновая кислота*** простые фенолы флавоноиды простые углеводы крахмал сумма углеводов сумма белков

Экстрагент - 0,25 % раствор гидроксида аммония

Экстракт из сырья 21,70±1,81 7,14 0,04±0,01 3,37±0,13 0,18±0,02 4,23±0,22 14,59±0,38 0,34±0,02

Экстракт из шрота 10,11±1,84 0,82 0,01±0,01 0,43±0,04 0,10±0,01 2,88±0,22 6,83±0,59 0,15±0,04

Экстрагент - ацетон, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты

Экстракт из сырья 24,32±2,02 10,02 0,51±0,01 1,29±0,50 0,66±0,11 - -

Экстракт из шрота 21,51±1,77 2,22 0,43±0,08 0,22±0,03 0,51±0,03 - -

Экстрагент - 80 % этанол

Экстракт из сырья 26,74±1,99 8,07 0,32±0,01 3,83±0,06 0,13±0,01 - 17,87±0,60 26,74±1,99

Экстракт из шрота 9,13±0,64 1,03 0,24±0,03 0,45±0,03 0,10±0,01 - 6,47±0,46 9,13±0,64

* партия сырья 151115, производитель ОАО «Красногорсклексредства»

**- метод не может быть применим, т.к. дает завышенный результат вследствие побочной реакции между глицирризиновой кислотой и серной кислотой, входящей в состав антронового реактива

*** - количественное определение проведено инструментальной тонкослойной хроматографией

Согласно полученным данным, самое большое содержание фенольных соединений - ликвиритигенина, а также пятен с Я/ = 0,84 и выше наблюдается у спиртовых экстрактов из сырья и шрота (треки 5, 6). Анализ литературных данных по исследованию флавоноидов корня солодки (трек 9) [5], а также использование специфического окрашивающего реактива (раствор И2Б04 в метаноле) [147], позволяет отнести пятна с Я/ = 0,84 и выше к изофлавонам, в том числе к формононетину. На хроматограммах экстрактов, полученных с другими экстрагентами (треки 1-4), изофлавоны не обнаруживаются. Это может быть связано либо с плохой экстрагирующей способностью растворителей, либо с разрушением сложно организованных фенольных соединений.

Проведена денситометрическая обработка хроматограмм и ее результаты приведены в таблице 3.6.

Экстракты из шрота содержат меньшее количество соединений по сравнению с экстрактами из сырья. Наиболее богатый качественный состав фенольных соединений имеет этанольный экстракт из шрота. Всего в нем обнаружено 8 пиков, из них четыре отнесены к флавоноидам [145].

Проведенный качественный и количественный анализ фенольных соединений в экстрактах, полученных с применением наиболее часто используемых для экстракции корня солодки экстрагентов, подтверждает сделанный ранее вывод о том, что 80 % этанол является наиболее эффективным экстрагентом для извлечения флавоноидных соединений из шрота корня солодки.

Установлено, что для переработки шрота корня солодки перспективно использовать 80 % этанол. В полученном экстракте наблюдается высокое содержание глицирризиновой кислоты и флавоноидов - 1,03 и 0,45 % соответственно, и наименьшее количество сопутствующих соединений.

Таблица 3.6 - Количественный и качественный состав фенольных соединений, извлекаемых из сырья и шрота корня солодки различными экстрагентами (п = 3-

5, P = 0,95)

Объект исследования Экстрактивные вещества, % от сырья/шрота Фенольные соединения

количество пиков на хроматограмме отнесение % от сырья/ шрота

Экстрагент - 0,25 % раствор гидроксида аммония

Экстракт из сырья 17,13* 4 простые фенолы 0,04±0,01

6 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 3,37±0,13

Экстракт из шрота 7,08* 1 простые фенолы 0,01±0,01

1 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 0,43±0,04

Экстрагент - ацетон, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты

Экстракт из сырья 24,32 3 простые фенолы 0,51±0,01

10 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 1,29±0,50

Экстракт из шрота 21,51 4 простые фенолы 0,43±0,08

1 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 0,22±0,03

Экстрагент - 80 % этанол

Экстракт из сырья 26,74 4 простые фенолы 0,32±0,01

7 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 3,83±0,06

Экстракт из шрота 9,13 4 простые фенолы 0,24±0,03

4 флавоноиды в т.ч. ликвиритигенин 0,45±0,03

* сумма экстрактивных веществ, уменьшена на долю крахмала и долю белков

3.4 Подбор условий экстракции шрота корня солодки этанолом для максимального извлечения из него глицирризиновой кислоты и

флавоноидных соединений

Известно, что состав соединений, извлекаемых этанолом из корня солодки, главным образом зависит от его концентрации. Например, показано, что при

использовании 96 % этанола преимущественно извлекаются гидрофобные агликоны флавоноидов, а при снижении концентрации спирта в составе экстракта начинают преобладать гликозидные формы флавоноидов. Кроме того, эти экстракты содержат в качестве сопутствующих соединений - углеводы, в том числе полисахариды [13, 143].

Подбор концентрации спирта в экстрагенте. Проведена исчерпывающая экстракция шрота корня солодки при подобранных параметрах [125]: кипячение в течение 2 часов с этанолом различной концентрации в соотношении шрот: экстрагент 1:40. Показано, что независимо от концентрации этанола максимальный выход экстрактивных веществ из шрота достигается за 3 стадии. При этом, как видно из таблицы 3.7, наибольший выход экстрактивных веществ из шрота - около 15 %, наблюдается при его экстракции 40 % этанолом. При использовании в качестве экстрагента 70 %, 80 % и 96 % спирта выход экстрактивных веществ ниже на 8-37 %.

Таблица 3.7 - Содержание и состав экстрактивных веществ в этанольных экстрактах из шрота корня солодки (п=5, P=0,95)

Экстракт из шрота корня солодки: Содержание, % от шрота

экстрактивных веществ флавоноидов суммы углеводов глицирризиновой кислоты

40 % этанолом 15,06±0,21 0,50±0,07 9,93±0,21 0,35±0,02

70 % этанолом 11,98±0,11 0,38±0,04 5,31±0,16 0,86±0,01

80 % этанолом 13,88±0,21 0,70±0,03 5,65±0,06 0,91±0,02

96 % этанолом 9,42±0,12 0,32±0,05 3,14±0,29 0,51±0,03

Анализ состава экстрактивных веществ в полученных экстрактах показал, что с увеличением концентрации этанола в экстрагенте до 80 %, в них возрастает содержание флавоноидов в 1,8 раза и глицирризиновой кислоты в 2,6 раза, и при этом снижается содержание сопутствующих веществ, углеводов, в 1,8 раза [148].

На основании полученных данных, для экстракции шрота корня солодки целесообразным является применение в качестве экстрагента 80 % этанола, позволяющего извлечь максимальное количество флавоноидов и глицирризиновой кислоты.

Качественный состав этанольных экстрактов из шрота корня солодки проанализирован методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «СAMAG» (рисунок 3.3, таблица 3.8). Показано, что анализируемые экстракты, в независимости от концентрации этанола в экстрагенте, содержат до 14 соединений, в том числе ГК с Я/, равным 0,22-0,25 и ликвиритигенин с Я/, равным 0,83 по соотнесению с Я/ стандартов (трек 5 и 6 рисунок 3.3).

Соединения, обнаруженные на хроматограмме, по специфической окраске могут быть отнесены к разным классам флавоноидов [147]. Стоит отметить, что во всех экстрактах преобладает соединение с Я/= 0,92 отнесенное к изофлавону -формононетину [125]. Известно, что этот агликон обладает антиоксидантной, гиполипедимический, эстрогенной и другими видами биологической активности [1, 95].

1 2 3 4 5 6

Рисунок 3.3 - Хроматограмма экстрактов из шрота корня солодки, полученных при его исчерпывающей экстракции экстрагентом с концентрацией этанола: 40 % (трек 1); 70 % (трек 2); 80 % (трек 3); 96 % (трек 4) в видимом свете после

дериватизации

Таблица 3.8 - Качественный и количественный состав фенольных соединений в этанольных экстрактов из шрота корня солодки

Экстракт из шрота корня солодки Экстрактивные вещества, % от шрота Количество пиков на хроматограмме Отнесение % от шрота

1 2 3 4 5

10 Фенольные соединения 0,24

40 % этанолом 15,06±0,21 1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,24

8 Фенольные соединения 0,24

70 % этанолом 11,98±0,11 1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,12

Продолжение таблицы 3.8

1 2 3 4 5

8 Фенольные соединения 0,41

80 % этанолом 13,88±0,21 1 Ликвиритигенин 0,06

1 Формононетин 0,23

8 Фенольные соединения 0,18

96 % этанолом 9,42±0,12 1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,12

Как видно из данных таблицы 3.8, экстракция шрота 80 % этанолом позволяет получить максимальное количество флавоноидов. Следовательно, эту концентрацию экстрагента следует считать оптимальной для экстракции шрота с целью максимального извлечения из него флавоноидных соединений [148].

Подбор соотношения шрот:экстрагент. Исчерпывающая экстракция шрота корня солодки занимает 6 часов (3 стадии по 2 часа). Для сокращения продолжительности процесса проведена экстракция шрота при кипячении в течение 1 часа с 80 % этанолом и соотношении шрот: экстрагент - 1:40, 1:50, 1:60, 1:80, 1:100.

Показано, что наибольший выход экстрактивных веществ - 10,93 % наблюдается при использовании соотношения 1:100 (таблица 3.9). В сравнении с исчерпывающей экстракцией полученный выход экстрактивных веществ в 1,3 раза меньше. Это свидетельствует о том, что на увеличение выхода экстрактивных веществ влияет продолжительность экстракции шрота [148].

Таблица 3.9 - Выход экстрактивных веществ в экстрактах, полученных с применением одностадийной экстракции шрота 80 % этанолом, при изменении соотношения шрот: экстрагент (п=5, Р=0,95)

Условия экстракции Выход экстрактивных веществ, %

Соотношение шрот: экстрагент Продолжительность стадии, ч Количество стадии

Контроль 1:40 2 3 13,88±0,21

1:40 1 1 9,98±0,21

1:50 9,50±0,11

1:60 10,73±0,52

1:80 9,20±0,23

1:100 10,93±0,31

Выбор фракции шрота, имеющей в своем составе большее содержание глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений. Тритерпеноидные и флавоноидные соединения в корне солодки локализуются преимущественно в верхнем пробковом слое, и, соответственно, их значительная часть уже была извлечена в ходе промышленной переработки сырья. Часть этих соединений содержится в сердцевинных лучах корня [5]. Поэтому для повышения их доступности к извлечению проведено измельчение шрота. При просеивании были получены две фракции, сильно различающиеся по морфологии: фракция 1 - преимущественно тонкие волокна; фракция 2 - тонкодисперсный порошок с размером частиц менее 2 мм (рисунок 3.4).

Проведен микроскопический анализ [148], полученных фракций. По качественной реакции с 80 % раствором И2Б04 и 1 % раствором хлорида железа показано, что фракция 2 в большем количестве содержит глицирризиновую кислоту и флавоноиды (рисунок 3.5).

Рисунок 3.4 - Фракции, полученные при измельчении шрота корня солодки

Рисунок 3.5 - Микроскопия срезов шрота корня солодки и фракций,

полученных при его измельчении

Проведен количественный анализ основных компонентов шрота корня солодки и его фракций, полученных при измельчении (таблица 3.10).

Таблица 3.10 - Химический состав шрота корня солодки и фракций, полученных при его измельчении (п=3-5, р=0,95)

Массовая доля веществ Содержание, % в

Шроте Фракция 1 Фракция 2

Глицирризиновой кислоты 2,76±0,14 - -

Веществ, экстрагируемые петролейным эфиром 1,66±0,11 0,94±0,07 1,26±0,02

Сырого протеина 12,36±0,904 7,43±0,68 9,49±0,31

Сырая клетчатка 31,69±0,08 33,18±0,11 23,77±0,08

Минеральных веществ 3,49±0,02 4,84±0,23 3,90±0,39

По сравнению с исходным шротом полученная фракция 2 содержит на 0,32 % больше веществ, экстрагируемых петролейным эфиром (в том числе терпеноидные и стероидные соединения) и меньше балластных веществ - сырой клетчатки на 9,41 % и зольных веществ на 0,94 %. Следовательно, измельчение шрота с отбором фракции 2 позволит более эффективно извлекать из него целевые вещества, а фракцию 1 можно использовать в фармацевтической, пищевой и косметической промышленности, за счет высокого содержания в ней клетчатки.

Проведена исчерпывающая и одностадийная экстракция фракции 2 этанолом с концентрацией 80 % при соотношении фракция 2:экстрагент 1:40 и 1:100. Результаты анализа полученных экстрактов приведены в таблице 3.11.

Сравнение экстрактов фракции 2, полученных исчерпывающей экстракцией и одностадийной показывает, что последняя более эффективна для извлечения большего количества флавоноидов и глицирризиновой кислоты. При длительном температурном воздействии во время исчерпывающей экстракции фракции 2 по-видимому происходит разрушение части глицирризиновой кислоты, т.к. ее содержание в экстракте в 1,6 раза ниже, по сравнению с экстрактом, полученным одностадийной экстракцией фракции 2 (таблица 3.11).

Анализ качественного состава экстрактов фракции 2 методом инструментальной тонкослойной хроматографии показал, что в отличие от

экстрактов из шрота в них содержится меньший спектр фенольных веществ (рисунок 3.6, таблица 3.12).

Таблица 3.11 - Содержание и состав экстрактивных веществ в этанольных

экстрактах фракции 2 (п=5, Р=0,95)

Экстракт Содержание, % от фракции 2 шрота

фракции 2,

полученный экстрактивных флавоноидов суммы глицирризиновой

при веществ углеводов кислоты

соотношении

Исчерпывающая экстракция

1:40 14,00±0,21 0,23±0,03 3,90±0,06 0,56±0,01

1:100 14,09±0,22 0,24±0,01 6,06±0,31 0,46±0,03

Одностадийная экстракция

1:40 10,73±0,15 0,22±0,01 3,32±0,05 0,88±0,02

1:100 10,93±0,51 0,51±0,06 3,87±0,22 0,62±0,01

1 2 3 4

Рисунок 3.6 - Хроматограмма в видимом свете после дериватизации экстрактов из фракции 2 шрота корня солодки, полученных при одностадийной экстракции 80 % раствором при соотношении 1:40 (трек 1) и 1:100 (трек 2); исчерпывающей экстракцией 80 % раствором при соотношении 1:40 (трек 3) и 1:100 (трек 4); растворов стандартов - глицирризиновой кислоты (трек 5) и ликвиритигенина

(трек 6)

Таблица 3.12 - Качественный и количественный состав фенольных соединений в этанольных экстрактов из фракции 2 шрота корня солодки

Экстракт из фракции 2 Экстрактивные вещества, % от фракции 2 Количество пиков на хроматограмме Отнесение % от фракции 2

Одностадийная экстракция

80 % этанолом (1:40) 5 Фенольные соединения 0,35

10,73±0,11 1 Ликвиритигенин 0,16

1 Формононетин 0,40

80 % этанолом (1:100) 6 Фенольные соединения 0,54

10,93±0,51 1 Ликвиритигенин 0,10

1 Формононетин 0,30

Исчерпывающая экстракция

80 % этанолом (1:40) 6 Фенольные соединения 0,72

14,00±0,21 1 Ликвиритигенин 0,14

1 Формононетин 0,36

80 % этанолом (1:100) 6 Фенольные соединения 0,67

14,09±0,22 1 Ликвиритигенин 0,15

1 Формононетин 0,46

Сопоставляя результаты, по содержанию глицирризиновой кислоты и флавоноидов в этанольных экстрактах из шрота и полученной на его основе фракции 2, можно сделать вывод о том, что использование фракции 2 позволяет сократить время проведения экстракции в 6 раз, снизить расход экстрагента в 1,5-3,0 раза, и, соответственно, энергозатраты для извлечения целевых веществ из шрота корня солодки.

Таким образом, на основе полученных данных показано, что, для извлечения флавоноидов и глицирризиновой кислоты из шрота корня солодки эффективно проводить одностадийную экстракцию измельченного шрота (фракция 2) 80 % этанолом [148]. Для получения высокого выхода флавоноидов (0,51 % от шрота) целесообразно использовать соотношение измельченный шрот: экстрагент 1:100, а для высокого выхода глицирризиновой кислоты (0,88% от шрота) - соотношение 1:40 [148].

3.5 Фракционирование экстракта, полученного из измельченного шрота 80 % раствором этанола

Проведённые исследования показали, что этанольный экстракт из шрота содержит глицирризиновую кислоту, предположительно другие липофильные вещества, и широкий спектр фенольных соединений, представляющих интерес с точки зрения изучения их состава и определения биологической активности для разработки на их основе БАД и/или лекарственных средств.

Для определения состава веществ, содержащихся в шроте корня солодки, был выбран экстракт, полученный исчерпывающей экстракцией фракции 2 (далее шрот*) при соотношении шрот*:экстрагент 1:40, 80 % этанолом. Выбор этого экстракта обоснован высоким содержанием в нем экстрактивных веществ, в том числе липофильных (таблица 3.10).

Проведено разделение этанольного экстракта шрота* по разработанной схеме, приведенной на рисунке 3.7, по которой на первом этапе получены фракции, отличающиеся по полярности, путем концентрирования исходного экстракта. Проведение подкисления фракции I позволило разрушить сложно организованные комплексы органических соединений и разделить вещества по их кислотно-основным свойствам. На втором этапе разделение веществ фракций II, III (после нейтрализации) и IV проведено последовательной их обработкой органическими растворителями с возрастающей полярностью. Получены фракции, разделение которых позволило определить количество и состав в них липофильных и фенольных соединений.

Концентрирование исходного этанольного экстракта под вакуумом приводит к выделению из него осадка (фракция11 - 3,98 % от шрота). В осадке должны присутствовать липофильные соединения, простые фенолы и преимущественно агликоны флавоноидов. Для их разделения осадок последовательно обрабатывали органическими растворителями с возрастающей полярностью. Получены 4 фракции, в которых предположительно находятся:

липофильные соединения (фракция XVII - 0,05 %), простые фенолы (фракция XIX - 0,28 %), агликоны флавоноидов (фракции: XXI - 2,03 %, XXIII - 1,08 %).

Для разделения веществ фильтрата (фракция I), применили подкисление, при этом в осадок (фракция IV - 3,89 %) должны прийти глицирризиновая кислота и кислые полифенолы (фенолкарбоновые кислоты и их производные, флавоноиды, имеющие в своей структуре карбоксильные группы). Полученную фракцию последовательно обрабатывали органическими растворителями с возрастающей полярностью с получением 4 фракций. В них предположительно находятся: липофильные соединения (фракция IX - 0,04 %), фенолкарбоновые кислоты (фракция XI - 0,36 %), флавоноиды (фракции: XIII - 1,58 %, XV -1,09 %).

Во фракции III (4,78 % от шрота), должны оставаться сложно организованные полифенолы преимущественно их гликозидированные формы. Проведя нейтрализацию исследуемого объекта, и обработку его петролейным и диэтиловым эфирами отделены липофильные и простые фенольные соединения в фракции V - 0,21 % и VII - 0,27 %. Остаток, фракция VIII - 4,10 % может содержать как гликозидированные формы полифенолов, так и спирторастворимые углеводы (таблица 3.2).

Фракции V, IX и XVII исследованы с помощью инструментальной тонкослойной хроматографии на количественное содержание и качественный состав липофильных веществ (рисунок 3.8, таблица 3.13).

В целом, в этанольном экстракте содержится 0,3 % липофильных соединений из них до 28 % (0,07 % от шрота*) приходится на углеводороды, в том числе сквален, и около 18 % (0,05 % от шрота*) на стерины и их эфиры. Суммарно качественный состав липофильных веществ во фракциях представлен пятнадцатью соединениями, в том числе жирными кислотами 5,1 % (0,015 % от шрота*), триацилглицеридами 5,1 % (0,015 % от шрота*).

Рисунок 3.7 - Разделение этанольного экстракта шрота*

1 2 3 4 5 6

Рисунок 3.8 - Хроматограмма фракций IX (трек 1), XVII (трек 2), V (трек 3), растворов стандартов - ситостерола (трек 4), триолеина (трек 5) и олеиновой кислоты (трек 6) в видимом свете после дериватизации

Таблица 3.13 - Липофильные соединения этанольного экстракта из шрота*

Пик Содержание, % от веществ фракций