Скриннинг гетероциклических азотосодержащих соединенийкак потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат наук Шевкун, Наталия Александровна

• Шевкун, Наталия Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шевкун, Наталия Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Метаболизм полиаминов как лекарственная мишень

111 Химическое строение, функции и распространение полиаминов

112 Ферменты метаболизма и транспорт почиаминов

113 Метаболизм полиаминов при патологии

114 Подходы к направленному изменению метаболизма с помощью аналогов полиаминов

1.2 Компьютерное моделирование биологической активное ш27

12 1 Количественные корреляции структура-активность

12 2 Молекулярный докинг

1.3 Фотодинамическая терапия и фотосенсибилизаторы

13 1 Основные принципы фотодинамической терапии 47 13 2 Механизм действия и свойства ФС

13 3 Типы гибели клеток

1.4 Особенности транспорта микро- и макромолекул

14 1 Распределение микро-молекул в клетке и организме 59 14 2 Механизмы транспорта макромолекул 60 14 3 Фармакокинетика макромолекул

1.5 Создание конструкций для направленной доставки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Изучаемые соединения

2.2 Количественный анализ аминооксидазной активности в бесклеточной тест-системе

2.3 Количественный анализ пролиферации на клеточной модели

2.4 Оценка мембранной проницаемости

2.5 Количественные корреляции структура-активность

2.6 Молекулярный докинг

2.7 Тестирование системы направленной доставки молекул с помощью транспортеров

2 7 1 11 о пучение транспортеров и их конъюгатов с бактериохлорином

2 7 2 Сравнение фотоцитотоксической активности in vitro

2 73 Опредечение типа гибели клеток

2 7 4 Регистрация процессов перекисного окисления липидов in vitro

2 7 5 Опредечение внутриклеточной локализации Тр-1

2 7 6 Фотодинамическая терапия меланомы B16-F1 у мышей C57/Black

2 77 Фотодинамическая терапия эпидермоидной карциномы человека А-431 у мышей

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Прогнозирование биологической активности соединений123

3 11 Выбор веществ для тестирования 123 3 12 Молекулярный докинг с почиаминоксидазой

3.2 Влияние соединений на активность аминооксидаз in vitrol42

3.3 Построение классификационной модели по in sillico-in vitro

данным

3.4 Определение мембранной проницаемости

3.5 Скрининг антипролиферативной активности

3.6 Количественные корреляции структура-активность

3.7 Применение транспортеров для доставки лекарств

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Скриннинг гетероциклических азотосодержащих соединенийкак потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Полиамины (ПА) — это органические катионы. Они присутствуют практически во всех живых организмах и являются важнейшими регуляторами процессов клеточного роста, дифференцировки и апоптоза [144]. Нарушения в метаболизме этих молекул, приводящие к повышению уровня ПА и ускоренной пролиферации клеток, свойственны множеству патофизиологических состояний, в том числе раковым заболеваниям. Противоопухолевые агенты нормализуют обмен ПА в опухолевых клетках. Это доказывает важность обмена ПА как терапевтической мишени [104]. Возрастание количества ПА в клетке при канцерогенезе происходит преимущественно за счет снижения или практического подавления катаболизма ПА путем окислительного дезаминирования, а не в результате значительного возрастания [54]. Продукты окислительного дезаминирования ПА (аминоальдегиды и Н202) вызывают апоптоз и проявляют противораковое и антимикробное действие, ингибируют рост некоторых видов раковых клеток, бактерий и вирусов [68].

Одним из направлений в разработке противоопухолевых препаратов является поиск синтетических аналогов ПА, действующих на ключевые ферменты обмена таким образом, чтобы скорость распада превышала скорость синтеза, образовывались цитотоксические агенты и, в конечном итоге, замедлялась пролиферация.

Активные формы кислорода и свободные радикалы - основные поражающие клетку факторы катаболизма ПА - действуют в радиусе десятков им [31]. При этом лучшей мишенью для деструкции является ядерная ДНК [147]. Универсальность наличия ПА для всех клеток организма и локальность цитотоксической активности продуктов их распада диктуют необходимость направленной доставки молекул в раковые клетки.

При разработке новых лекарственных препаратов необходимо предварительно оценить свойства соединений по отношению к терапевтической мишени (рисунок 1), иметь возможность предсказать тип активности, исходя из структурных особенностей веществ, получить информацию для оптимизации заместителей и функциональных групп в рядах гетероциклических соединений [88]. Для этих целей широко применяются технологии биоинформатики и компьютерного моделирования, такие как количественные корреляции структура-активность (ККСА) и молекулярная стыковка т бШсо (докинг).

Методы молекулярного моделирования для предсказания свойств молекул

Механизм прямого действия на мишень

Эффективность Безопасность

Рисунок 1 - Схема проведения исследований при разработке лекарств.

Таким образом, поиск новых веществ-активаторов катаболизма ПА и специфическая доставка их в раковые клетки является актуальной и важной проблемой.

Цель работы

Цель исследования - провести скрининг синтетических гетероциклических азотсодержащих соединений как потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов, а также протестировать систему направленной доставки лекарств.

Задачи работы

1. In silico докинг тестируемых соединений с полиаминоксидазой.

2. Скрининг антипролиферативного действия изучаемых соединений на раковых клеточных линиях РС-3, MEL-7, MCF-7.

3. Разработка бесклеточной модельной системы из гомогената печени крыс для скрининга влияния тестируемых соединений на активность ди- и полиаминоксидаз.

4. Проведение расчета количественных корреляций структура-активность и определение наиболее значимых структурных дескрипторов.

5. Изучение влияния системы доставки фотосенсибилизаторов на механизм клеточной гибели in vitro.

6. Определение локализации транспортера в опухоли иммуногистохимическим методом.

7. Тестирование системы направленной доставки лекарственных веществ в ядра опухолевых клеток с помощью векторных транспортеров in vitro и in vivo.

Научная новизна работы Впервые проведено 3D компьютерное моделирование (докинг) связывания низкомолекулярных гетероциклических соединений оригинального синтеза с ферментом полиаминоксидазой, определены 5 ключевых аминокислотных остатков фермента, необходимых для встраивания лигандов. Впервые данные об активации и/или ингибированию распада ПА получены в системе из гомогената печени крыс для соединений группы азакраун-эфиров, бактериопурпурина и комплексов меди с производными анилина. Влияние производных анилина, диоксаборенинопиридина, азафлуорена на аминоксидазную активность подтверждено экспериментами в системе из гомогената печени крыс. Впервые проведены количественные корреляции топологических индексов с цитотоксическим действием для производных диоксаборенинопиридина, азафлуорена, азакраун-эфиров, бактериопурпурина и анилина, показана важность индекса Балабана для данного типа активности. Впервые с помощью фотодинамической терапии in vitro и in vivo была протестирована система направленной доставки лекарств в ядра опухолевых клеток с помощью векторных транспортеров, показана ее эффективность.

Практическая значимость работы

Внедрена в практику экспериментальных исследований для скрининга и адаптирована под 96-луночный формат плашек модификация методики тестирования соединений на активность ди- и полиаминоксидазы в бесклеточной модельной системе из гомогената печени крыс со спектрофотометрической детекцией. Внедрен алгоритм проведения компьютерного докинга лигандов с ПАО дрожжей в программе Molegro Virtual Docker, по результатам которого построена модель бинарного классификационного дерева, позволяющая предсказывать свойства соединений как потенциальных активаторов и ингибиторов ПАО. Полученные результаты исследований 5 различных химических классов формируют базу данных для совершенствования программного обеспечения расчетов ККСА при компьютерном моделировании химических структур с антипролиферативной активностью. Разработанные инструкции к компьютерным программам ChemDescript и Virtual Docker внедрены как пособия в учебный процесс на медицинском факультете Российского университета дружбы народов. Выявлены новые синтетические вещества с выраженной противоопухолевой активностью, которые рекомендованы для дальнейших доклинических исследований в области онкологии. На примере фотодинамической терапии показана эффективность подхода к разработке систем направленной доставки лекарств с помощью векторных транспортеров, которая повышает эффективность консервативной терапии в десятки раз. Результаты работы используются в лекции «Обмен полиаминов как терапевтическая мишень» в курсе «Медицинской энзимологии» для студентов по специальности «Лечебное дело».

Основные положения, выносимые на защиту 1. Эффективность системы направленной доставки терапевтических молекул подтверждена in vivo вследствие снижения вдвое скорости роста опухолей у мышей после фотодинамической терапии с применением векторных транспортеров.

2. а-МСГ-содержащий транспортер преимущественно локализуется в ядрах клеток меланомы после внутривенного введения мышам.

3. Включение ФС в состав конъюгата с транспортером изменяет преимущественный процесс гибели клеток с некротического на апоптотический.

4. Потенциальными противоопухолевыми агентами могут быть соединения: В1, В8; 2; Х9; Х13; Х14; Х17.

5. Ключевыми аминокислотными остатками для связывания гетероциклических азотсодержащих соединений с ПАО дрожжей, служат: His67, Tyr450, Hisl91, Trp 174, Gly487.

Связь исследований с научной программой Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и № 2.1.1./ 11377 «Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как системы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)".

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на 17 международных конгрессах и конференциях: VIII международная конференция "Научная индустрия европейского континента" (Чехия, 2013); VIII международная конференция "Достижения высшей школы" (Болгария, 2013); XV международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, РУДН 2013); V Международная научная конференция Science4Health (Москва, РУДН 2013); 38-ой Международный конгресс Федерации европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, Россия, 2013); XX Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта-Гурзуф,

Украина, 2012); IV Международная научная конференция Science4Health 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, РУДН, Россия, 2012); Congress on polyamines. Polyamines: biological and clinical perspectives. Istanbul, 2012); XIV Всемирный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, РУДН, Россия, 2012); 12-ый Международный конгресс по аминокислотам и белкам (Бейджинг, Китай, 2011); 2-ая Международная конференция по роли полиаминов и их аналогов в раковых и других заболеваниях (Рим-Тиволи, Италия, 2010); Международная конференция по полиаминам (Готемба, Япония, 2010); XVIII Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, Украина, 2010); конференция медицинского факультета РУДН "Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, Россия, 2010); Международная научно-практическая конференция "Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы" (Москва, Россия, 2010); X Международный конгресс «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, Россия, 2009); VII Международная научно-практическая конференция «Новейшие достижения европейской науки» (Болгария, 2011). На IV Международной научной конференции Science4Health (Москва, РУДН 2012) награждена дипломом за 1 -е место.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 38 печатные работы: 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 учебно-методических пособия и 32 публикаций в материалах международных и российских конференций.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК для размещения

материалов диссертации: 1. Сяткин С. П., Березов Т. Т., Неборак К. В., Федорончук Т. В., Шевкун Н. А., Левов А.Н., Сокуев Р. И., Сокуева Н. А. Прогнозирование антипролиферативных свойств производных анилинового ряда и диоксаборининопиридина путем оценки их влияния на скорость

окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 10. -С. 53- 56.

2. Сяткин С.П., Шевкун H.A., Свинарев В.И. Полиамины в аутопсийных образцах некоторых структур лимбической и ретикулярной формации мозга у больных шизофренией. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - М., 2010. -№1 - С. 36-41.

3. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун H.A., Сокуева H.A., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов полиаминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость синтеза полиаминов в тест-системах из тканей с повышенной пролиферацией. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. -М., 2010.-№3-С. 9-14.

4. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун H.A., Сокуева H.A., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на рост L-клеток в культуре ткани. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - М., 2010. - №4 - С. 26-31.

Материалы международных конференций

(приравниваются к опубликованным работам, отражающим основные научные результаты диссертации, согласно постановлению Правительства РФ № 475 от 20.06.11)

5. Шевкун H.A., Сяткин С.П., Демуров Е.А. Цитотоксическое действие модуляторов катаболизма полиаминов на клетки рака простаты. // Тезисы VIII международной конференции "Научная индустрия европейского континента" 2013, 27 ноября - 5декабря. - Чехия. - в печати.

6. Шевкун H.A., Сяткин С.П., Демуров Е.А. Фотодинамическая терапия меланомы у мышей с применением векторного транспортера и фотосенсибилизатора бактериохлоринового ряда. // Тезисы VIII

международной конференции "Достижения высшей школы" 2013, 17 ноября - 25 ноября. - Болгария. - в печати.

7. Шевкун Н.А., Варламов А.В., Сяткин С.П., Кутяков С.В. Применение компьютерных методов для дизайна противоопухолевых аналогов полиаминов. // Тезисы международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке" 2013, Москва. РУДН - 2013. - Т.2 - С.215-216.

8. Шевкун Н.А., Варламов А.В., Сяткин С.П., Кутяков С.В. Структурные особенности активации полиаминоксидазы производными анилина и азафлуорена. // Материалы V Международной конференции "Наука и здоровье" 2013, Москва. РУДН - С. 199.

9. Syatkin S, Shevkun N, Khlebnikov A. Structural aspects of Poly amine oxidase activation by azofluorene and aniline derivatives. FEBS Letters Supplement. 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology" 2013. - P. 214

10.Syatkin S., Neborak E., Shevkun N., Sokueva N., Sokuev R., Golomazova K., Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the amine oxidases in vitro as useful tools for prediction of their carcinogenic and antiproliferative properties. // Abstacts from the International Congress on Polyamines: biological and clinical perspectives. 2nd-7th September 2012, Istanbul, Turkey. - P. 221-223.

11.Syatkin S., Fedoronchuk Т., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Shevkun N.. Antitumor activity of activators of polyamine oxidative deamination during hepatocarcinogenesis. // Abstacts from the International Congress on Polyamines: biological and clinical perspectives. 2nd-7th September 2012, Istanbul, Turkey. -P. 225-226.

12.Shevkun N., Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Golomazova K, Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the aminooxidases in vitro // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 53.

13.Shevkun N, Fedoronchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R. Targeting polyamine catabolism in malignant hepatic tissue // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 54.

14.Сяткин С.П., Федорончук T.B., Шевкун H.A., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева H.A. Противоопухолевая активность активаторов окислительного дезаминирования полиаминов. //Труды XX Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", 5-14 июня, 2012, Гурзуф, Украина. - 2012. - Т.1 - С.98-99.

15.Шевкун Н., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р., Голомазова К., Федорончук Т.. Скрининг N-гетероциклических и анилиновых производных по влиянию на аминоксидазы in vitro. // Материалы IV Международной конференции Science4health: Клинические и теоретические аспекты современной медицины, 18-21 апреля, 2012, Москва. - М.:РУДН, 2012 -С.53-54.

16.Шевкун Н., Федорончук Т., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р.. Катаболизм полиаминов при карциногенезе печени как мишень для поиска новых противораковых соединений. // Материалы IV Международной конференции Science4health: . Клинические и теоретические аспекты современной медицины, 18-21 апреля, 2012, Москва. - М.:РУДН, 2012 -С.54-55.

17.Сунграпова Е. Ю., Урбан М.Н., Комиссарова ЕЛО., Шевкун H.A., Неборак Е.В.. Психотропные препараты как потенциальные противоопухолевые средства. // Материалы IV Международной конференции Science4health: Клинические и теоретические аспекты современной медицины, 18-21 апреля, 2012, Москва. - М.:РУДН, 2012 - С.74-75.

18.Комиссарова Е.Ю., Урбан М.Н., Сунграпова Е. Ю., Неборак Е.В., Шевкун H.A.. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена на обмен полиаминов в ткани регенерирующей печени. // Материалы IV Международной конференции Science4health: Клинические и теоретические

аспекты современной медицины, 18-21 апреля, 2012, Москва. - М.:РУДН, 2012 - С.75.

19.Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак Е.В., Соку ев Р.И., Сокуева Н.А. Активаторы окислительного дезаминирования полиаминов как потенциальные противоопухолевые агенты // Материалы XIV Международного конгресса «Здоровье и Образование в XXI веке», 14-17 ноября 2012, Москва. - Т. 2. - С. 91.

20.Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Активаторы окислительного дезаминирования как потенциальные противоопухолевые агенты // Scientific and educational journal: Материалы конференции «Health and education millenium»: 2012. РУДН. Москва. -M.: РУДН. 2012. - T. 14. - C. 58.

21.Shevkun N, Gulak P and Syatkin S. Molecular recombinant transporters for the selective delivery of photosensitizers into cancer cells. // Addendum to Abstacts presented at the 12th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins, Conference, lst-5th August 2011, Beijing, China. -Amino Acids. -2011.-V. 41.-P. 998.

22.Syatkin S, Shevkun N, Levov A, Golomazova K, Neborak E., Sokueva N, Sokuev R, Fedoronchuk T, and Ustinova E. Prediction of biological properties of some groups of heterocyclic derivatives by their effects on the polyamine oxidative deamination. // Addendum to Abstracts presented at the 12th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins, Conference, 1st-5th August 2011, Beijing, China. -Amino Acids. - 2011. - V. 41. - P. 1002.

23.Шевкун H.A., Сяткин С.П. Определение типа гибели раковых клеток при действии фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда. // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Новейшие достижения европейской науки» , 17-25 июня, 2011, София, Болгария. -2011. -Т.32 -С.76-79.

24.Syatkin S., Shevkun N., Levov A., Golomazova K., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Fedoronchuk Т., Ustinova E.. Prediction of carcinogenic and antiproliferative properties of benzimidazole, azofluorene, dioxaboreninopyridine and aniline derivatives by their effects on the polyamine oxidative deamination. // Abstacts from the 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, lst-6th December 2010, Tivoli (Rome), Italy.-P. 209-211.

25.Syatkin S., Shevkun N., Fedoronchuk Т., Neborak E., Sokueva N, Sokuev R., Ustinova E.. Activators of polyamine oxidative deamination as the potential antitumor agents. //Abstacts from the 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, llh-6th December 2010, Tivoli (Rome), Italy. - P. 213-214.

26.Syatkin S.P., Fedoronchuk T.V., Gridina N.Ya., Neborak E.A., Shevkun N.A., Sokueva N.A., Ustinova E.V., Sokuev R.I.. The influence of chemical polyamines analogs, decarboxylated ornithine and S-(adenosyl)-methionine on the polyamine synthesis velocity in test-systems from tissues with high proliferation. //Abstacts from the International Polyamine Conference, 14th-18th June 2010, Gotemba, Japan. - P. 102-103.

27.Syatkin S.P., Fedoronchuk T.V., Gridina N.Ya., Neborak E.A., Shevkun N.A., Sokueva N.A., Ustinova E.V., Sokuev R.I.. The influence of chemical analogs of decarboxylated ornithine and S-(adenosyl)-methionine on the growth of L-ccll tissue culture. //Abstacts from the International Polyamine Conference, 14lh-18lh June 2010, Gotemba, Japan. - P. 104-105.

28.Шевкун H.A., Гулак П.В., Сяткин С.П.. Модульные рекомбинантные транспортеры для селективной доставки фотосенсибилизаторов в раковые клетки. // Материалы Международной научно-практической конференции "Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы", 2-3 ноября 2010, Москва. -М., 2010. - С.48-50.

29.Сяткин С.П., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Неборак К.В., Шевкун H.A., Устинова Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева H.A.. Прогноз канцерогенных и антипролиферативных свойств производных диоксаборенинопиридина и анилина. // Труды XVIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", 31 мая-10 июня, 2010, Гурзуф, Украина. -2010. -Т.1 - С.60-62.

30.Неборак Е. В., Сокуев Р.И., Сокуева H.A. Устинова Е.В., Шевкун H.A.. Определение канцерогенных и канцеростатических свойств производных анилина путем оценки их влияния на скорость окислительного дезаминирования путресцина, спермидина и спермина. // Материалы II Международной студенческой конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 22-23 апреля 2010, Москва. - С. 59-60.

31.Шевкун H.A., Неборак Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева H.A., Устинова Е.В.. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей с применением модульных рекомбинантных транспортеров. // Материалы II Международной студенческой конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 22-23 апреля 2010, Москва. - С. 73.

32.Сокуева H.A. Устинова Е.В., Шевкун H.A., Сокуев Р.И.. Делеционное картирование 5'-регуляторной области гена Trithorax-like Drozophila Melanogaster. // Материалы II Международной студенческой конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 22-23 апреля 2010, Москва. - С. 77-78.

33.Устинова Е.В., Шевкун H.A., Неборак Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева H.A.. Разработка биотехнологического способа получения модифицированных нуклеозидов. // Материалы II Международной студенческой конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 22-23 апреля 2010, Москва. - С. 81-82.

34.Сокуев Р.И., Сокуева H.A. Устинова Е.В., Шевкун H.A., Неборак У.В.. Синтез фгорсо держащих производных (+)-у спиновой кислоты. // Материалы II Международной студенческой конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 22-23 апреля 2010, Москва. - С. 228.

35.Сяткин С.П., Шевкун H.A., Свинарев В.И. Полиамины в структурах лимбической и ретикулярной формации мозга у больных шизофренией. // Материалы X Международного конгресса «Здоровье и Образование в XXI веке», 9-12 декабря 2009, Москва. - С. 1216-1217.

36.Шевкун H.A., Гулак П.В.. Увеличение эффективности фотосенсибилизаторов in vitro и in vivo с помощью конъюгации с модульным рекомбинантным транспортером. // Тезисы первого студенческого симпозиума по биоинженерии. - М.: МГУ им. М.В.Ломоносова, 2006 г. - С.36-37.

Учебно-методические пособия

37.Попов П.И., Сяткин С.П., Шевкун H.A., Неборак Е.В., Сокуев Р.И., Федорончук Т.В. Инструкция по использованию программы «ChemicDescript» для проведения количественных корреляций «сгруктура-активность/структура-свойство»: Учебное пособие // М.: Изд-во РУДН. -2013.-32 С.

38. Сяткин С.П., Шевкун H.A., Хлебников А.И. Инструкция по использованию программы Molegro Virtual Docker для проведения молекулярного докинга лиганд- белок: Учебное пособие // М.: Изд-во РУДН. - 2013. - печать.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 194 страницах, содержит 19 таблиц, 40 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 14 российских и 138 зарубежных источника.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Метаболизм полиаминов как лекарственная мишень

1.1.1 Химическое строение, функции и распространение полиаминов

Полиамины (ПА) - это органические поликатионы, присутствующие

практически во всех живых организмах и являющиеся важнейшими регуляторами процессов клеточного роста, дифференцировки и гибели. К полиаминам традиционно относятся спермин (См) и спермидин (Сд). Путресцин (Пут), кадаверин и диаминопропан являются диаминами, но и их также причисляют к ПА (Рисунок 2). В настоящее время обнаружены и другие ПА с линейной и разветвленной структурой, которые являются производными спермина, спермидина и путресцина [105]. Метаболизм ПА существенно отличается у различных видов эукариот, растений, бактерий и простейших. В основном, у прокариотов наблюдаются более высокая концентрация Пут, чем Сд, и отсутствует См. Эукариоты, напротив, содержат меньше Пут, но гораздо больше Сд и См [148].

По универсальной классификации ПА относятся к обширной группе биологически активных аминов вместе с биогенными моноаминами, такими как серотонин, гистамин и триптамин [148]. При физиологическом рН ПА несут положительный заряд на каждом атоме азота, равномерно распределенный вдоль всей гибкой углеродной цепочки [144]. Это уникальное свойство позволяет ПА электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными макромолекулами в клетке. Большое влияние оказывают ПА и их аналоги на функции ДНК и РНК путем воздействия на элементы вторичной структуры и изменения сайтов связывания транскрипционных факторов [48]. При недостатке ПА происходит «расплетание» участков ДНК в нуклеосомах. При нейтральном рН ПА способствуют также формированию триплексов ДНК [145]. Таким образом, в клетках ПА участвуют в регуляции транскрипции генов и синтеза белка.

ПА связываются и с фосфолипидами мембран. Так, См и Сд увеличивают их жесткость, а также действуют как антиоксиданты, препятствуя перекисному окислению липидов. Показано участие ПА в регуляции многих мембранно-связанных ферментов и ионных каналов [122].

Рисунок 2 - Химические структуры основных полиаминов [101].

1.1.2 Ферменты метаболизма и транспорт полиаминов

Метаболизм полиаминов - спермидина, спермина и их предшественника

диамина путресцина, стал мишенью противоопухолевой терапии с тех пор, как было обнаружено, что эти естественные алкиламины, находящиеся во всех живых клетках, необходимы для роста, функционирования и жизнедеятельности

Name

Chemical formula

Diamlnopropane

Putmcine

Cadavenne

Norspcrmidini;

Spermidine

A i n l nop ropy I en d v en nc

Honmspercuidme

Norxpermirie

Thcrmospcrmine

Am i nope n ry I no rs pcrmi dine

Spermine

Bis(aminopropyl)«ndavcnnc

Ami nopropy Ihoinospermme

Canavalminc

Hotnospemune

Celdopcnl&mmc

AminopropybaoavaLnme

Bis(nminopropyOhomospi;nni(line

Bis(amitiobutyl)oorspcnmdinc

Лги l nob i ny lean u va I rn inc

ArninopropylhomGsperminc

Ilomopcntarnmc

A^-ammobutylhomospcrmine

Cnldohcxammc

Homocaldnhex amine

T h crnio h ux a m i nc

Homothcrmohe.xamine

A^maluic

/V-meihybgmatine

NH^CH^NH,

NH2(CHi).,MH2

NH2(CH2)5NH2

NH2Cai])3NH(CH])3NH3

NHjiCH^NHCCHîXtNH,

NH2(CH2)4NH(CH,)4NH,

NHï(CH2)jNH(CH2)jNHÏCH,),NHa

NH^CH2)JNH(CHI)4NH(CH2)4NH',

NH-.(CH-,)jNH(CHi)jNH(CHi)iNH1

NH^(CH2)jNH(CH2)4NH(CH,J,NH2

N H J(CHJ)JN H (CHj^N H(CI !•») ¡,NH

NH,(CHz)jNH(CH2)4NH(CH,);NH,

NH2(CHJ)4NH{CH,)jNH(CHJ),NH,

NHI{CH-)4NH(CH,)4NH(CH2)llNHj

NHjiCH^jN'HiCHjbNHfCH^NHtCHjîjNH,

NHî(CH2),NH(CHi>,NH(CH2)4NH(CH-,JîNH2

NH2(ai2)»NH(CH2)i,N»H(CH2)4NH(CHj)4NH,

N H2(CH2)4NH(CH, )3N H (C H,) Js< H(C H 2|, NiHÎ

NH2(CH2)4NH(CH,bNH(CH^),tNW(CH,)4NH,

NH2(CH,)3NH(CH2)4NHfCH2)4NH(CH2).NH,

NH,(CH,)„NH(CH1\1NH(Clf,)jNH(CH2)^NM'2

NH^CHj)jN((CH2)4N H 2)(CH2 )4 N H (CH2)4NH2

NH3(CH2)1NH(C1I->)3NH(CH'.)}NH(CH,),NH,(CH-,)1NH2

NH^CHjJjNHtCH^NHiCHOjNHiCH^NH^CH^NH.

NH2(CH,)3NH(CIIj)3NlI(Cn1)JNH(CH,)4NHT(Clb)JNH,

NH2(CH2)3NH(CH1bNH(CHl)4NH(CH2)iSNH;(CH,)JNHi

NH,C(NH)NH(CH2)4NH2

NH2C(NCH3)NH(CH:)4NH;

клеток [54]. Внутриклеточные концентрации полиаминов поддерживаются благодаря координированной и хорошо регулируемой взаимосвязи биосинтеза, транспорта и катаболизма на определенном уровне, специфичном для данного типа клеток [148].

Биосинтез полиаминов протекает в 6 реакций (Рисунок 3). Поскольку для каждой реакции возможно подобрать свой ингибитор, любая из них может быть потенциальным объектом для терапевтического вмешательства.

N11,

Ornithine

Nature Reviews \

Рисунок 3 - Схема синтеза и распада полиаминов [29].

Наиболее очевидными терапевтическими мишенями являются 2 декарбоксилазы, осуществляющие первый и второй этапы биосинтеза ПА. Ингибирование орнитиндекарбоксилазы (ОДК) предотвращает синтез трех полиаминов - путресцина, спермидина и незначительно, спермина, а аденозилметиониндекарбоксилазы (АМДК) только двух - спермидина и спермина [29]. Напротив, ингибирование спермидин и спермин синтаз мало влияет на клеточный рост [143].

Биосинтезу полиаминов, как мишени антипролиферативной терапии, долгое время уделялось большое внимание. Тем не менее, по мере того, как появлялись сведения о важной роли внутриклеточного катаболизма полиаминов в поддержании их концентрации, формировании ответа на действие лекарственных средств и клеточной жизнедеятельности, внимание к обмену полиаминов стало в равной степени фокусироваться как на биосинтезе, так и на катаболизме [ 100].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шевкун, Наталия Александровна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волков C.B., Кутяков C.B., Левов А.Н., Полякова Е.И., Ань Ле Туан Солдатова С.А., Терентьев П.Б., Солдатенков А.Т. Превращение 3-'

бензоил-1-метил-4-фенил-у-пиперидола под действием ариламинов и арилгидразинов. Синтез 3-ариламИно-1-оксо-1-ФенилпРопа„ов „ ! 3-.ди^илпиразолов^их фрагменту .од элек1ронньм ударом - ^

- 2007. - № 4. _ с 544_554

2- Геннис Р.Б. Биомембрань,: Молекулярная структура „ функции. - M ■ Мир, 1997. - с. 396-453.

3. голомазова К.А. Антипролиферативн.е и антиопухолевые свойства синтетических аналогов полиаминов: автореферат дисс. канд. биол наук // М. : РУДН, 70_

4- Кудпнова Н. В., Березов Т. Т. Фотодинамическая терапия: поиск идеального фотосенсибилизатора // Биомед„ц„нская химия. - 2009 № 55(5).-с. 558-69.

s. Лебедева О.В., Угарова H.H., Березин И.Д._Кинет-И.чеекое-изУчеНие-

реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии

пероксидазы из хрена // Биохимия. - 1977. - т. 42, №8. - с. 137213 79.

6. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов // Российский химический _

1998. - №5. - с. 23-36.

™ИРОНОВ А Ф" Гр™ М А- Ципровский А.Г., Сегеневич А В Дзарданов Д.В., Головин К.В., Цыганков A.A., Шим Я.К.. Новь.1

Фотосенсибилизаторы бактериохлоринового ряда для Фотодинамической терапии рака // Б„оорганическая химм _ 20Q3 т.29, №2. - с. 214-221.

S. Розенкранц Л.А., Лунин В.Г., СерГ„е„ко О.В., Гилязова ДГ

Воро„ина О.Л Яне Д.Л., Кофнер А.Л., Шумя„Цева М.Л., Миро!: А.Ф., Соболев A.C. Направленная в„утриклеточная ДеиствУющих лекарств: специфическая

фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомь, // Генетик, - 2003 №39.- с. 259-268.

Соболев A.C., РозенкРанц A.A., Гилязова Д.Г. Подход, к направленной вНутриклеточной доставке фотосенсиби ^

Увеличения их эффективности и придания клеточной специфично! // Биофизика. - 2004. - № 49 (2) . - с. 351-379.

Ю .Сяткин С.П. Поли амины и лизосомь, как система опосредованной

Реляции химическими веществами процессов_стеточиой_ пролиферации и опухолевого роста: автоРеф. докт. д„сс. „ м, РУДИ,

п™,,в?' Бет тт-метаболизм п°лиа—В

тканях // Вестник Академии медицинских наук СССР - 1982 Т Я с. 10-21. ' " "

12. Сяткин С.П., БеРезов Т.Т. Окислительное дезаМини„е поли^аминов в гепатомах с различной скорость«, роста // Вопр мед химии. - 1979. - Т. 25, №5,- с. 611-617.

13.Сяткин С.П., Березов Т.Т., Гридина Н.Я. и дР. Полиамины как биохимические маРкеРы антипролиферативного действия ингибиторов Ферментов биосинтеза полиаминов и пУтресцина а кУльтУРе L-клеток // Ьопр. мед. химии. - 1991,- Т.37.- №6,- с. 77-81

И. Сяткин СП., Верезов Т.Т., Фролов В.А., Голомазова К.А., Левов А Н Шевченко A.A., ФедорончУк Т.В. Прогноз канцерогенных и'

—onyxes cbohctb npo„3bo№BIX 6eH3HMHfla3ojia „ a3a<£jiyopeHa // BecTHHK Py№. - 2007. - № 6. - c. 70-73.

IS.Adachi M. S„ Torres , M„ Fitzpatrick P. F. Mechanistic studies of the

IT r yami: °XidaS£ ^^ " ' — specificity,

77 Biochemist- - 2oi°- - * «*«>. - P. 10440:

.6 A« E., Toninello A., Vianello F., Stevanato R. Do mammaIian amine ox.dases and the mitochondria, po.yamtne transporter have similar P=,n structures? „ Springer-Verlag. - 20„. DOI ,0, 007,00726-0:

17-Akh,y„i„a T„ Jang D., Rosenkranz A., Statsyuk N„ Baiashova I., Toth G

_Pavo I.,_Naroditsky—B—Sobolev—A—___-_

lnra, t- . ' °leV A" Adenoviruses energize with nuclcar

localization signals to enhance nurlpcir /-JqI.%----- i

,. . " noviruses synergize with nuclear

oca zahon stgnals to enhance nuclear dehvet, and photodynamic action

o mternahz.ble conjugates containing chlorin e6 // Int. J. Cancer - 1999 81. — p. 734-740. ""

-8. Alvarez-Figueroa M. ,, Pessoa-Mahana C. D„ Palavecino-GonzAlez M P

^ ^ membra"e CPAMP^

^ Sk'n) °f with potential can„ablno,d activity and their

re atton with the biopharmaceutics classification system (BCS) // AAPS

PharmSc,Tech. - 2011.-№ 12 (2) p. 573.578.

Arisan E.D., Obakan P., Coker-C«rkan A., Calcahrmi A., Agostinelh E Unsal CDK inhibitors induce mitochondrra-med.ated apoptosiJ

through the activation of polyam.ne catabolic pathway in LNCaP, DU145 and PC3 prostate cancer ceils // Curr Pharm Des. - 2013. May 16 - in print

20. Basu K S„ Pellarin M„ Feuerstein B. o, Shirahata A., Same.ma K„ Deen D; F Marton L.J. Jnteraction of a polyamine analogue, l^-bis-iethyla-mino)-5,10, 15-triazanonadecane (BE-4-4-4-4), with DNA and effect on

grow* s„vival and polyamine ,evels in seven human brain //Cancer Res. - 1993. - №53. - p. 3948-3955.

21.Basu H.S., Marton L.,, Pellari„ M„ Deen D. p, McManjs , § ^ £ Bergeron R. ,, Feuerstein B. G. Design and testing of ^ polyamine analogues // Cancer Res. - 1994._ № 54. - p. 6210-6214

22. Baumann A d,,el„pm,M| 0|. ^ Pharmacokinetics. Current Drug Metabolism. - 2006. - №7. - p. 15.2U

23-Baxter L„ Hui Zhu T„ Mackensen D. G„ Bu.ter W. F Jain R v Biodistribution of monoclona, antibodies: scale.up ftom _ sm8 a ph io,ogica„y based pharmacokinetic ^ /y ^ ™

1995.- №55.-p. 4611-4622. 2"47Bernacki R.J., Oberman E. J., Seweryniak K. E., Atwood A. Bergeron R

Ki rr, I rclinicaI ant,tumor——

" y norsPermine administered by multipIe injection or

continuous infusion//C,in Cancer Res.995.p 847.857

25.Bjelakovic G„ Kocic G., Pavlovic n Nikolic 1 ■ , _

' Sokolovic D Effects of for _ '-™kolie-J—Stojanovic~I—Jevtovic T., Dolv • " f f0'1C aC'd P^yamine concentrations and

PC yamine oxidase activity in regenerating rat liver // Pteridines. - 2003 №14,- p. 109-113.

26 MTbT F" Selamnia M" RObert V" M'Rabet-Touil H.. Dure P-„ Me tabohsm of L-arginine through polyam,ne and nitric oxide syn^

Pathways m proliferative or differentiated human coion carcinoma ce.is „ Biochimica et Biophysica Acta. - l995. -№1268. -p. 255-262.

27. Boik c„ Newman R. A. Structure-activity modeis of ora, Cearance

— 1 LD50: 3 " fOT Pr°miSing >' Pharmacology. - 2008. - №8. _p. 12.

28.BrancaIeon L., Moseley H. Laser and non-laser light sources for Photodynamic therapy // Laser Med. Science. - 2002. - №17. - p. 173.186.

29. Casero R.A., Marton L.J. Targeting p0,yamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases // Nat Rev Drug Discov 2007. - №6(5) - p. 373-90.

30. Casero R.A., Wostera P. \|.. Reee,,, advances in the development of polyam.ne analogues as antitumor agents // J Med Chem - 2009 -№52(15).-p. 4551^1573.

31. Casero RA Jr, Wang Y, Stewart TM, Devereux W, Hacker A Wang Y Smith R, Woster PM. The role of polyamine catabolism in anti-turnout drug response // Biochem Soc Trans. - 2003. - №(2). - p. 361-365.

32.Cervelli M„ Amendoia R„ Pontieelli F„ Mariottini P.. Spermine oxidase-ten years after // Amino Acids. - 2011. - №42(2-3). - p. 441-450.

33.Cervelli M„ Bellavia G„ Fratini E„ Amendola R. et al. Spermine oxidase (SMO) activity in breast tumor tissues and biochemical analysis of the

anticancer spermine anaLQgUes-BENSpm-and-ePE-NSpm-//-BMC-Cancer -

O A1 A \r,. 1 ^ ---

2010.-№10.-p. 555.

34. Cho H.J., Kim B.J., Kim H.D., Kang H.S., Kim C.R. Inhibition of myoblast differentiation by polyamine depletion with methylglyoxal Bis(guanylhydrazone) // J. Biochem. Mol. Biol. - 1995 - - n 191-196. P'

35. Davidson N.E., Hahm H A., McCloskey D E, Woster P. M„ Casero Jr R A Clinical aspects of cell death in breast cancer: the polyamine pathway as a

new target for treatment//Endocrine-Related Cancer. - 1999 - jyb6 - n

69-73. ~ ' P'

36. Davis A.M., Teague S.J., Kleywegt G.J. Application and limitations of X-ray crystallographic data in structure-based ligand and drug design // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2003. - №42. - p. 2718-2736.

37. Deng W., Jiang X., Mei Y., Sun J., Ma R„ Liu X., Sun H., Tian H„ Sun X.. Role of ornithine decarboxylase in breast cancer // Acta Biochim Biophys Sin. -2008. -№40(3). - p. 235-243.

38. Derycke A.S.L., de Witte P.A.M. Liposomes for photodynamic therapy // Adv. Drug Delivery Rev. - 2004. - №18(56).-p. 17-30.

39. Dolmans D.E., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2003. - №3. - p. 380-387.

40. Dongen G., Vissei_G.,_^rouenraets—M-—Photosensiti-zer-antibody-

conjugates for detection and therapy of cancer // Adv. Drug Delivery Rev. -2004,- №56.-p. 31-52.

41. Dougherty T. J.,. An update on photodynamic therapy applications // J Clin Laser Med Surg. - 2002. - №20(1). - p. 3-7.

42.Drummen G., van Liebergen L., Op den Kamp J., Post J.. Cll-BODIPY(581/591), an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (micro)spectroscopic characterization and validation of methodology // Free Radic Biol Med. - 2002. - №33(4). - p. 473.490.

43.Edwards M.L., Prakash N.J., Stemench D.M., Sunkara S.P., Bitonti A.J., Davis G.F., Dumont J.A., Bey P. Polyamine analogues with antitumor activity//J. Med. Chem. - 1990. - №33. - p. 1369-1375.

44. Eloranta T.O., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Hyrvonen T. Aminooxy analogs of spermidine as inhibitors of spermine synthase and substrates of hepatic polyamine acetylating activity // J. Biochem. - 1990. - №108. - p. 593-598.

45.Emanuela B, Minarini A, Tumiatti V, Milelli A, Lunelli M, Pegoraro M, Rizzoli V, Di Paolo ML. Synthetic polyamines as potential amine oxidase inhibitors: a preliminary study // Amino Acids. - 2012. - №42(2-3). - p. 913-928.

46. Faller B. Artificial membrane assays to assess permeability // Current Drug Metabolism. - 2008. - №9. - p. 886-892.

47. Feig M., Onufriev A., Lee M.S., Im W., Case D.A., Brooks C.L. Performance comparison of generalized born and Poisson methods in the calculation of electrostatic solvation energies for protein structures // J. Comput. Chem. - 2004. - №25(2). - p. 265-284.

48. Feuerstein B. G., Williams L. D., Morton L. J. Implications and concepts of polyamine-nucleic acid interactions // J. Cell. Biochem. - 1991. - №46. - p. 37-47.

49. Fogel-Petrovic M, Shappell NW, Bergeron RJ, Porter CW. Polyamine and polyamine analog regulation of spermidine/spermine N1- acetyltransferase in MALME-3M human melanoma cells // J. Biol,_Chem. - 7.0.02 №277(42). - p. 39867-39872.

50. Fortuna A, Alves G, Soares-da-Silva P, Falcao A. Optimization of a parallel artificial membrane permeability assay for the fast and simultaneous prediction of human intestinal absorption and plasma protein binding of drug candidates: application to dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide derivatives //J Pharm Sci. -2012. -№101(2). - p. 530-540.

51.Friesner RA, Banks JL, Murphy RB, Halgren TA, Klicic JJ, Mainz DT, Repasky MP, Knoll EH, Shelley M, Perry JK, Shaw DE, Francis P, Shenkin PS. Glide: a new approach for rapid, accurate docking and scoring. 1. Method and assessment of docking accuracy // J Med Chem. - 2004. -№47(7). - p. 1739-1749.

52.Fukuchi J, Hiipakka RA, Kokontis JM, Nishimura K, Igarashi K, Liao S. TATA-binding protein-associated factor 7 regulates polyamine transport activity and polyamine analog-induced apoptosis // Biochem Pharmacol. -1994.-№48(8).-p. 1611-1618.

53. Gao S., Yan R., Cao M., Yang W., WangS., Chen F. Effects of copper on growth, antioxidant enzymes and phenylalanine ammonia-lyase activities in Jatropha curcas L. seedling // Plant and Soil Enviroment. - 2008. -№54(3). - p. 117-122.

54.Gerner E.W., Meyskens Jr. F.L. Polyamines and cancer: old molecules, new understanding // Nature reviews, Cancer. —2004. - №14. - p. 781-792.

55. Ghoda L., Basu H.S., Porter C.W., Marton L.J., Coffino P. The role of ornithine decarboxylase suppression and polyamine depletion in the antiproliferative activity of polyamine analogs // Mol. Pharmacol. - 1992. -№ 42. - p. 302-306.

56. Gilyazova DG, Rosenkranz AA, Gulak PV, Lunin VG, Sergienko OV, Khramtsov YV. Timofevev KN.Grin MA, Mironov AF, Rubin AR, Georgiev GP, Sobolev AS. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. - 2006. - №66(21). - p. 10534-10540.

57. Given JA, Gilson MK. A hierarchical method for generating low-energy conformers of a protein-ligand complex // Proteins. — 1998. — №33(4). — p. 475-495.

58.Goel A., Madan A.K. Structure-activity study on antiulcer agents using Wiener's topological index and molecular connectivity index // J. Chem. Inf. Comput. Sci. - 1995. -№35(3). - p. 504-509.

59. Ha HC, Woster PM, Yager JD, Casero RA Jr. The role of polyamine catabolism in polyamine analogue-induced programmed cell death // Proc Natl Acad Sei USA.- 1997. - №94(21). - p. 11557-11562.

60. Häkkinen MR, Hyvönen MT, Auriola S, Casero RA Jr, Vepsäläinen J, Khomutov AR, Alhonen L, Keinänen TA.. Metabolism of N-alkylated spermine analogues by polyamine and spermine oxidases // Amino Acids. -2010. -№38(2). - p. 369-381.

61.Halperin I., Ma B., Wolfson H., Nussinov R.. Principles of Docking: An Overviewof Search Algorithms and a Guide to Scoring Functions // Proteins: Structure, Function, and Genetics. - 2002. - №47. - p. 409-443.

62. Han Y, Ren YS, Cao CY, Ren DM, Zhou YQ, Wang YL.. Highly expressed Nl-acetylpolyamine oxidase detoxifies polyamine analogue N1-cyclopropylmethyl-Nl 1-ethylnorspermine in human lung cancer cell line A549 // Chin Med J. - 2009. - №22(12). - p. 1394-1399.

63. Hernández-Covarrubias C, Vilchis-Reyes MA, Yépez-Mulia L, Sánchez. Díaz R, Navarrete-Vázquez G, Hernández-Campos A, Castillo R,

Hernández-Luis F. Exploring the interplay of physicochemical properties, membrane permeability and giardicidal activity of some benzimidazole derivatives//Eur J Med Chem. -2012. -№52. - p. 193-204.

64.Hetényi C, van der Spoel D. Efficient docking of peptides to proteins without prior knowledge of the binding site // Protein Sei. — 2002. — №11(7). - p. 1729-1737.

65.Hibasami H., Tsukada T., Shirakawa S., Nanta T., Inagaki M., Naka-shima K. Dioxopiperazine derivative potentiaties antitumor effect of methylgly-oxal bis- (cyclopentylamidinohydrasone) on human and mouse leukemia cells // Anticancer Res. - 1994. - №14. - p.561-565.

66. Hu Q-N., Liang Y-Z., Fa K-T. The Matrix expression, topological index and atomic attribute of molecular topological structure // J of Data Science. -2003. -№1. - p. 361-389.

67. Huang R, Southall N, Cho MH, Xia M, Inglese J, Austin CP. Characterization of diversity in toxicity mechanism using in vitro cytotoxicity assays in quantitative high throughput screening // Chem Res Toxicol. - 2008. - №21(3). - p. 659-667.

68.Huang Y, Pledgie A, Rubin E, Marton LJ, Woster PM, Sukumar S, Casero RA Jr, Davidson NE.. Role of p53/p21(Wafl/Cipl) in the regulation of polyamine analogue-induced growth inhibition and cell death in human breast cancer cells // Cancer Biol Ther. - 2005. - №4(9). - p. 1006-1013.

697Huebner S., Xiao C.-Y., Jans D.A. The protein kinase CK2 site (Serlll/112) enhances recognition of the SV40 large T-antigen nuclear localization sequence by importin // J. Biol.Chem. — 1997. — №272. — p. 17191-17195.

70.Hyvonen _MT, Keinanen TA, Khomutov M, Simonian A, Weisell J, Kochetkov SN, Vepsalainen J, Alhonen L, Khomutov AR. The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism // J. Med. Chem. - 2011. - №54. - p. 4611-4618.

71.Ignatenko N.A, Gerner E.W., Besselsen D.G. Defining the role of polyamines in colon carcinogenesis using mouse models // J Carcinog. — 2011. -№10. -p. 10.

72. Jain R. K. Delivery of molecular and cellular medicine to solid tumors // J of controlled release. - 1998. - №53. - p. 49-67.

73. Joseph-McCarthy D. Computational approaches to structure-based ligand design//Pharmacol Ther. - 1999. - №84(2). - p. 179-191.

74.Juweid M , Neumann R , Paik C. Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: direct experimental evidence for a binding site barrier//Cancer Res. - 1992. - №52. - p. 5144-5153.

75. Kadina AP, Khlebnikov AF, Novikov MS, Pérez PJ, Yufit DS. Intramolecular cycloaddition of azomethine ylides, from imines of O-acylsalicylicaldehyde and ethyl diazoacetate,to ester carbonyl-experimental and DFT computationalstudy // Org Biomol Chem. - 2012. - №10(29). - p. 5582-5591.

76.Kavekos M. Site specific therapy: an integrative approach to treating melanoma // Med Hypotheses. - 2005. - №64(6) - pi097-1099.

77. Kee K., Vujcic S., Merali S., Diegelman P., Kisiel N., Powell C. T., Kramer D. L., Porter C.W. Metabolic and antiproliferative consequences of activated polyamine catabolism in LNCaP prostate carcinoma cells // J. of The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. — 1997. -№272.-p. 18746-18751.

-7-8-Keho.e_CA.-Eaughnan MS. Gilmore WS. Coulter JS, Howard AN, Strain JJ. Plasma diamine oxidase activity is greater in copper-adequate than copper-marginal or copper-deficient rats // J Nutr. — 2000. —№130(1). — p. 30-33.

79. Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Quinn MT.. Structure-activity relationship analysis of N-benzoylpyrazoles for elastase inhibitoryactivity:a simplified approach using atom pair descriptors // Bioorg Med Chem. - 2008. - №16(6). - p. 2791-2802.

80. Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Domina NG, Kirpotina LN, Quinn MT..Improved quantitative structure-activity relationship models to predict antioxidant activityof flavonoids in chemical, enzymatic, and cellular systems // Bioorg Med Chem. - 2007. - №15(4). - p. 1749-1770.

81. Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Kirpotina LN, Brive L, Dahlgren C, Jutila MA, Quinn MT.. Molecular docking of 2-(benzimidazol-2-ylthio)-N-phenylacetamide-derived small-molecule agonists of human formyl peptide receptor 1 //JMolModel. - 2012. - №8(6). - p. 2831-2843.

82.Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Kirpotina LN, Quinn MT.. Computational structure-activity relationship analysis of non-peptide inducers of macrophage tumor necrosis factor-alpha production // Bioorg Med Chem. — 2008.-№16(20).-p. 9302-9312.

83.Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Quinn MT.. Computational structure-activity relationship analysis of small-molecule agonists forhuman formyl peptide receptors // Eur J Med Chem. - 2010. - №45(11). - p. 5406-5419.

84.Khomutov A.R., Eloranta T.O., Persson L., Porter C.W., Dzavakhia V.G., Khonutov R.M. Chemical regulation of polyamine biosynthesis in cell cultures by polyfunctional O-substituted hydroxylamines // Enzymes dependent on pyridoxal phosphate and other carbonyl compounds as

cofactors, Ed. T. Fukui, H. Kagamiyama, K. Soda, H. Wada. - 1990. - p.

___

85.Kim YJ, Kim EA, Chung ML, Im C.. Cytotoxic activity and three-dimensional quantitative structure activity relationship of 2-aryl-l,8-naphthyridin-4-ones // Korean J Physiol Pharmacol. — 2009. — №13(6). — p. 511-516.

86. Kirpotina LN, Khlebnikov AI, Schepetkin IA, Ye RD, Rabiet MJ, Jutila MA, Quinn MT.. Identification of novel small-molecule agonists for human formyl peptide receptors and pharmacophore models of their recognition//Mol. Pharmacol. - 2010. - №77(2). - p. 159-170.

87.Kojima T., Tanaka T., Kawamori T., Hara A., Mori H. Chemopreventive effects of dietary D,L-a-difluoromethylornithine, an ornithine decarboxy-

184

lase inhibitor, on initiation and postinitiation stage of diethylnitrosamine-induced rat hepatocarcinogenesis // Cancer Res. - 1993. - №53. - p. 39033907.

88. Kortagere S, Lill M, Kerrigan J. Role of computational methods in pharmaceutical sciences // Methods Mol Biol. - 2012. - №929. - p. 21-48.

89. Kramer D.L, Miller JT, Bergeron RJ, Khomutov R, Khomutov A, Porter CW. Regulation of polyamine transport by polyamines and polyamine analogs // J. Biol. Chem. - 2004. - №79. - p. 27050-27058.

90.Kuo WL, Das D, Ziyad S, Bhattacharya S, Gibb WJ, Heiser LM, Sadanandam A, Fontenay GV, Hu Z, Wang NJ, Bayani N, Feiler HS, Neve RM, Wyrobek AJ, Spellman PT, Marton LJ, Gray JW. A systems analysis of the chemosensitivity of breast cancer cells to the polyamine analogue PG-11047 // BMC Med. - 2009. - №14(7). - p. 77.

91. Lam M., Oleinick N., Neiminen A.-L.. Photodynamic therapy-induced apoptosis in epidermoid carcinoma cells // J. Biol.Chem. - 2001. - №276. -

_p._ 47379-47386._

92. Lengauer T., Rarey M. Computational methods for biomolecular docking // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1996. -№6(3). - p. 402-406.

93.Leung SS, Mijalkovic J, Borrelli K, Jacobson MP. Testing physical models of passive membrane permeation // J Chem Inf Model. - 2012. - №52(6). -p. 1621-1636.

94. Liao C, Sitzmann M, Pugliese A, Nicklaus MC. Software and resources for computational medicinal chemistry // Future Med Chem. - 2011. - №3(8). - p. 1057-1085.

95.Loh W-Y.. Classification and regression trees // Wiley interdisciplinary reviews: data mining and knowledge discovery. — 2011. — №1. - p. 492510.

96.Lopez-Lazaro, M., and Akiyama, M. Flavonoids as anticancer agents: structure-activity relathionship study // Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents. - 2002. - №2. - p. 691-714.

97. Lu Y.,Yang J., Sega E.. Issues Related to Targeted Delivery of Proteins and Peptides // The AAPS J. - 2006. - №8 (3). - p. 466-478.

98.Mahmood I., Green M. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations in the development of therapeutic proteins // Clin Pharmacokinet. - 2005. - №44(4). - p. 331-347.

99. Maiale SJ, Marina M, Sánchez DH, Pieckenstain FL, Ruiz OA. In vitro and in vivo inhibition of plant polyamine oxidase activity by polyamine analogues // Phytochemistry. - 2008. - №69(14). - p. 2552-2558.

100.Mandal S, Mandal A, Johansson HE, Orjalo AV, Park MH. Depletion of cellular polyamines, spermidine and-spermine~caus"es—a-total-arrest-in-translation and growth in mammalian cells // Proc Natl Acad Sci US A.-2013.- №110(6).- p. 2169-2174.

101.Marton LJ, Pegg AE. Polyamines as targets for therapeutic intervention // Annu Rev Pharmacol Toxicol. — 1995. -№35. — p. 55-91.

102.Mattaj I.W., Englmeier L. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - №67. - p. 265-306.

103.McCloskey D. E., Woster P. M., Casero, Jr R. A. et al.. Effects of the polyamine analogues Nl-Ethyl-Nl l-((cyclopropyl)methyl)-4,8-diazaundecane and N1—Ethyl-Nl l-((cycloheptyl)methyl)-4,8-

diazaundecane in human prostate cancer cells // Clin Cancer Res. - 2000. - №6. - p. 17-23.

104.Minois N, Carmona-Gutierrez D, Madeo F. Polyamines in aging and disease.//Aging. - 2011. - №3(8). - p. 716-732.

105.Mohan V., Gibbs A. C., Cummings M.D., Jaeger E. P., DesJarlais R.L.. Docking: successes and challenges // Current Pharmaceutical Design. —

2005.- №11.- p. 323-333.

106.Molegro virtual docker. MVD2006.1.5 // User manual - Molegro Inc. —

2006.

107.Muth A, Kamel J, Kaur N, Shicora AC, Ayene IS, Gilmour SK, Phanstiel _O_4.th__Dev-elapment__of_paly_amine_ttransport_ligands—with—impro.ved-

metabolic stability and selectivity against specific human cancers // J Med Chem. - 2013. - №56(14).- p. 5818-5828.

108.Nagoshi S, Tomiya T, Sato Y, Oka Y, Ogata I, Fujiwara K. Stimulation of putrescine production by epidermal growth factor in rat liver after partial

-hep"ate~ctomy7/_Hep~atolo~gy~ 1~99~1t~= №1~4(5~)~= pr901~905~-

109.Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Gol^b J. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy // Acta Biochimica Polonica. - 2005. - №52(2). - p. 339-352.

110.Nyman E. S., Hynninen P. H. Research advances in the use of tetrapyrrolic photosensitizers for photodynamic therapy // J-Photochem-Photobiol-B. -2004. -№73(1-2). - p. 1-28.

11 l.Ohno M., Fornerod M., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport: the last 200 nanometrers // Cell. - 1998. - №92. - p. 327-336.

112.01einick N., Evans H. The photobiology of photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms.// Radiat Res. - 1998. — №150(5 Suppl). -p. 146-156.

113.Palavan-Unsal N, Aloglu-Senturk SM, Arsan D. The function of poliamine metabolism in prostate cancer // Exp Oncol. 2006. - №28(3). -p. 178-186.

114. Palmer AJ, Wallace HM. The polyamine transport system as a target for anticancer drug development // Amino Acids. — 2010. — №38(2). — p. 415422.

115.Palyi I, Kremmer T, Kalnay A, Turi G, Mihalik R, Bencsik K, Boldizsar M.. Effects of methylacetylenic putrescine, an ornithine decarboxylase inhibitor and potential novel anticancer agent, on human and mouse cancer cell lines//Anticancer Drugs. - 1999. - №10(1).-p. 103-111.

116.Pavlov V, Rodilla V, Kong Thoo Lin P.. Growth, morphological and biochemical changes in oxa-spermine derivative-treated MCF-7 human breast cancer cells // Life Sci. - 2002. - №71(10). - p. 1161-1173._

117.Pearse B.M.F., Smith C.J., Owen D.J. Clathrin - coat construction in endocytosis // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2000. - №10. - p. 220-228.

118.Pietila M, Alhonen L, Halmekyto M, Kanter P, Janne J, Porter CW. Activation of polyamine catabolism profoundly alters tissue polyamine pools and affects hair growth and female fertility in transgenic mice overexpressing spermidine/spermine Nl-acetytransferase // Biol. Chem. — 1993.-№268.-p. 19118-19125.

119.Pledgie A, Huang Y, Hacker A, Zhang Z, Woster PM, Davidson NE, Casero RA Jr. Spermine oxidase SMO(PAOhl), Not Nl-acetylpolyamine oxidase PAO, is the primary source of cytotoxic H202 in polyamine

analogue-treated human breast cancer cell lines // J Biol Chem. - 2005. -№280(48). - p. 39843-39851.

120.Pledgie-Tracy A, Billam M, Hacker A, Sobolewski MD, Woster PM, Zhang Z, Casero RA, Davidson NE.. The role of the polyamine catabolic enzymes SSAT and SMO in the synergistic effects of standard chemotherapeutic agents with a polyamine analogue in human breast cancer cell lines // Cancer Chemother Pharmacol. - 2010. - №65(6). — p. 1067-1081.

121.Pozzi M. H., Gawandi V., Fitzpatrick P. F.. Mechanistic studies of para-substituted N,N'-dibenzyl-l,4-diaminobutanes as Substrates for a mammalian polyamine oxidase // Biochemistry. — 2009. — №48(51). — p.

-7=1-2-3 0-5-1-2-3-1-3--

122.Rajeeve Y, Pearce W, Cascante M, Vanhaesebroeck B, Cutillas PR. Polyamine production is downstream and upstream of oncogenic PI3K signalling and contributes to tumour cell growth // Biochem J. — 2013. — №450(3) . - p. 619-628.

123.Rasanen T-L, Alhonen L, Sinervirta R, Keinanen T, Herzig K-H, Suppola S, Khomutov AR., Vepsalainen J, Janne J.A. Polyamine analogue prevents acute pancreatitis and restores early liver regeneration in transgenic rats with activated polyamine catabolism // J. Biol. Chem. — 2005. — №235. — p. 36978-36982.

124.Reider A, Wendland B. Endocytic adaptors—social networking at the plasma membrane// J Cell Sci. - 2011. - №124(Pt 10) . - p. 1613-1622.

125.Rosenkranz A., Lunin V., Gulak P., Sergienko O., Shumiantseva M., Voronina O., Gilyazova D., John A., Kofner A., Mironov A., Jans D., Sobolev A. Recombinant modular transporters for cell-specific nuclear

delivery of locally acting drugs enhance photosensitizer activity // FASEB J. - 2003. - №17. - p. 1121-1123.

126. Sakharov D.V., Elstak E.D.R., Chernyak B., Wirtz K.W.A.. Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with oxidation-sensitiv probe CI 1-BODIPY581/591 // FEBS Letters. - 2005. -№579. - p. 12551260.

127.Sebela M, Tylichova M, Pec P.. Inhibition of diamine oxidases and polyamine oxidases by diamine-based compounds // J Neural Transm. — 2007. - №114(6) . - p. 793-798.

128.Seiler N.. Pharmacological aspects of cytotoxic polyamine analogs and derivatives for cancer therapy // Pharmacol Ther. — 2005. — №107(1) . — p. 99-119. "

129. Shan Y, Kim ET, Eastwood MP, Dror RO, Seeliger MA, Shaw DE. Flow does a drug molecule find its target binding site? // J Am Chem Soc. — 2011. - №133(24) . - p. 9181-9183.

liSOrSharmari"WM7~van—Lier_JE7^11"en~CM7^argete~d_photoliynamic therapy via receptor mediated delivery systems // Adv Drug Deliv Rev. — 2004. — №56(1). - p. 53-76.

131.Shoichet BK, McGovern SL, Wei B, Irwin JJ. Lead discovery using molecular docking // Curr Opin Chem Biol. - 2002. - №6(4). - p. 439446.

132.Sobolev A.S., Jans D.A., Rosenkranz A.A. Targeted intracellular delivery of photosensitizers // J. Progress in Bioph. & Mol. Biol. - 2000. - №73. -p. 51 -90.

133.Sonawane N. D. , Francis C. Szoka, Jr., and A. S. Verkman Chloride Accumulation and Swelling in Endosomes Enhances DNA Transfer by

Polyamine-DNA Polyplexes 11 J. Biol. Chem. - 2002. - №277. - p. 2532325328.

134. Soulet D., Gagnon B., Rivest S., Audette M., Poulin R. A Fluorescent Probe of Polyamine Transport Accumulates into Intracellular Acidic Vesicles via a Two-step Mechanism // Biochem J. - 2002. - №367 (Pt 2). -p. 347-357.

135.Stoffler D., Fahrenkrog B., Aebi U. The nuclear pore complex: from molecular architecture to functional dynamics // Curr. Opin. Cell Biol. -1999. -№11. -p. 391-401.

136. Syatkin S.P., Fedorontchuk T.V., Lidack M.Yu., Berezov T.T. Effect of synthetic polyamine analoge on polyamine metabolism in cell-free system of regenerating rat liver // Modern Enzymology: Problems and Trends. Ed. B.I.Kurganov, S.N.Kochetkov and V.I.Tishkov. — Nova Science Publishers, Inc., N.Y., USA, 1994. - p. 747-751.

137. Taylor R.D., Jewsbury P.J., Essex J.W. A review of protein-small

_ molecule docking methods // J. Comput. Aided Mol. Pes. - 2002. - №16. -

p. 151-166.

138.Thomas T, Balabhadrapathruni S, Gallo MA, Thomas TJ.. Development of polyamine analogs as cancer therapeutic agents // Oncol Res. - 2002. — №13(3). -p. 123-135.

139.Thomsen R, Christensen MH. MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking // J Med Chem. - 2006. - №49(11) . - p. 3315-3321.

140. Van den Munckhof RJ, Denyn M, Tigchelaar-Gutter W, Schipper RG, Verhofstad AA, Van Noorden CJ, Frederiks WM. In situ substrate specificity and ultrastructural localization of polyamine oxidase activity in

unfixed rat tissues // J Histochem Cytochem. - 1995. - №43(11). - p. 1155-1162.

141. Van Nostrum C. Polymeric micelles to deliver photosensitizers for photodynamic therapy // Adv. Drug Delivery Rev. - 2004. - №56. - p. 916.

142. Völgyi G, Vizserälek G, Takäcs-Noväk K, Avdeef A, Tarn KY.. Predicting the exposure and antibacterial activity of fluoroquinolones based on physicochemical properties // Eur J Pharm Sei. - 2012. - №47(1). - p. 21-27.

143. Wallace H. M., Fräser A.V. Inhibitors of polyamine metabolism: Review article // Amino Acids. - 2004. - №26. - p. 353-365.

144. Wallace IT. M., Fräser A.V., Hughes A.. A perspective of polyamine metabolism // Biochem. J. - 2003. - №376. - p. 1-14

145.Wallace H.M, Fräser AV. Polyamine analogues as anticancer drugs // Biochem Soc Trans. - 2003. - №31(2). - p.393-396.

146. Weisell J, ITyvönen MT, Häkkinen MR, Grigorenko NA, Pietilä M, Lampinen A, Kochetkov SN, Alhonen L, Vepsäläinen J, Keinänen TA, KhomutovAR..Synthesis and biological characterization of novel charge-deficient spermine analogues //J Med Chem. -2010. -№53(15). - p. 5738 -5748.

147.Wiseman IT. Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role of inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J. - 1996. -№313. - p. 17-29

148. Yatin M. Polyamines in living organisms // Journal of Cell and Molecular Biology. - 2002. -№1. - p. 57-67.

149. Yoo JO, 1-Ia KS. New insights into the mechanisms for photodynamic therapy-induced cancer cell death I I Int Rev Cell Mol Biol. - 2012. -№295. - p. 139-174.

150. Yraola F, Zorzano A, Albericio F, Royo M.. Structure-activity relationships of SSAO/VAP-1 arylalkylamine-based substrates // ChemMedChem. - 2009. - №4(4). - p. 495-503.

151.Zahedi K, Huttinger F, Morrison R, Murray-Stewart T, Casero RA, Strauss KI. Polyamine catabolism is enhanced after traumatic brain injury // J Neurotrauma. - 2010. - №27(3). - p. 515-25.

152.Zong W-X., Thompson C. Necrotic death as a cell fate // Genes & Development. - 2006.- №20.- p. 1-15.

БЛАГОДАРНОСТИ

❖ Выражаю особую признательность и благодарность Сяткину С. П. (д.б.н., профессор) и Демурову Е.А. (д.мл., профессор) - за последовательное и опытное руководство на всех этапах диссертационной работы, неоценимую помощь в планировании научной деятельности.

❖ Варламову А. В. (д.х.н.), Солдатенкову А. Т. (д.х.н.), Левову А. II. (к.х.н.), Грину"М~А."Хд.х.н.), Кутякову С. В. - за синтез и предоставление химических соединений для тестирования, а также ценные рекоммендации.

♦> Хлебникову А. И. (д.х.н.) - за организацию и содействие в проведении компьютерного моделирования (докинга с полиаминоксидазой).

♦> Заведующему лабораторией молекулярной генетитки внутриклеточного транспорта ИБГ РАН Соболеву А. С. (д.б.н., профессор) и сотрудникам Гулаку П. В. (к.б.н.), Розенкранцу А. А. (к.б.н.) за предоставленную возможность работать с МРТ, ценные советы, участие в обсуждении возникавших вопросов и преодолении трудностей.

❖ Попову П. И. (к.б.н.) - за консультации по ККСА.

❖ Неборак Е. В. (к.б.н.), Голомазовой К. А. (к.б.н.), Федорончук Т. В. (к.б.н.), ЦайтлеруТГА. (к.б.н.) - за взаимопомощь и обмен опытом.

Отдельное спасибо за плодотворное сотрудничество моим голландским коллегам из Университета г. Утрехт: Др. Дмитрию Всеволодовичу Сахарову за огранизацию и содействие в проведении экспериментов in vitro, Dr. Raymond Schiffelers за активное участие и помощь в проведении экспериментов на бестимусных мышах.