Синтез и исследование фармакологической активности новых ингибиторов фактора Ха тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Церковникова Наталья Андреевна

• Церковникова Наталья Андреевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Церковникова Наталья Андреевна

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Существующие классы антикоагулянтов

1.2. Оптимизация hit to lead

1.3. Прямое ингибирование фактора Ха как механизм действия новых антикоагулянтов

1.4. Ингибиторы фактора Xa

1.5. Ингибиторы на основе пиразолопиридинона

1.6. Ингибиторы на основе оксазолидинона

1.7. Ингибиторы на основе пирролидина и азетидина

1.8. Ингибиторы фактора Ха на основе пептидов

1.9. Ароматические эфиры на основе амидина

1.10. Ингибиторы на основе пирролидинона

1.11. Ингибиторы на основе триазола

1.12. Ингибиторы на основе сахаридов

1.13. Ингибиторы на основе оксодиазолов

1.14. Выбор лучшего антикоагулянта

1.15. Перспективы разработки новых антикоагулянтов

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Поиск новых антикоагулянтов, структурных аналогов DD217

2.2. Поиск новых антикоагулянтов, метаболитов DD217

2.3. Синтез новых антикоагулянтов - метаболитов DD217

2.4. Изучение фармакологической активности новых антикоагулянтов

2.4.1. Влияние на ПВ и амидолитическую активность в плазме крыс, обезьян и человека

2.4.2. Определение специфичности субстанции DD217 по отношению к основным ферментам системы свертывания крови и трипсину in vitro

2.4.3. Изучение фармакодинамических параметров субстанции DD217 при внутрижелудочном введении крысам

2.4.4. Изучение специфической фармакологической активности субстанции DD217 при внутрижелудочном введении на модели венозного тромбоза по Wessler S. у крыс

2.4.5. Результаты дополнительного исследования сравнительной активности метаболита

2.5. Изучение прямой ингибирующей активности веществ in vitro по отношению к фактору Ха

2.6. Исследование влияния препарата на некоторые рецепторы, определяющие лекарственную зависимость

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. In silico исследования

3.2. Изучение прямой ингибиторной активности веществ in vitro по

отношению к фактору Ха

3.3. Определение анти-Ха амидолитической активности плазмы

3.4. Определение ПВ in vitro в присутствии исследуемых веществ

3.5. Определение специфичности субстанции DD217 по отношению к основным ферментам системы свертывания крови и трипсину in vitro

3.6. Изучение фармакодинамических параметров субстанции DD217 при

внутрижелудочном введении крысам

3.7. Изучение специфической фармакологической активности субстанции

DD217 при внутрижелудочном введении на модели венозного тромбоза по Wessler S. у крыс

3.8. Прогнозирование возможных метаболитов DD217 в микросомах

печени человека

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Расчетная часть (in silico)

4.1.1. Этап 1 исследования SAR. Вариация R1, R2 и R6

4.1.2. Этап 2 исследования SAR. Вариация R3 и R4

4.1.3. Этап 3 исследования SAR. Вариация R7

4.2. Химическая часть

4.2.1. Синтез 5-хлор-Ы-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-[(4-{метил(метиламино)-карбонил}амино)бензоиламино]бензамида (115)

4.2.2. Синтез №(5-хлорпиридин-2-ил)-5-метил-2-[(4-[метил(метиламино)карбонил)амино]бензоиламино]бензамида (117)

4.2.3. Синтез 5-хлор-Ы-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил)амино]бензоил}амино)бензамида (216)

4.2.4. Синтез №(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил)амино]бензоил }амино)-5-метилбензамида (217)

4.2.5. Синтез №(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил)амино]бензоил}амино)-5-метоксибензамида (301)

4.2.6. Синтез №(2-{[(5-хлорпиридин-2-ил)амино]карбонил}-4-метилфенил)-4-[этанимидоил(метил)амино]-2-фторбензамида (302)

4.2.7. Синтез №(4-хлор-2-{[(5-хлорпиридин-2-ил)амино]карбонил} фенил)-4-[этанимидоил(метил)амино]-2-фторбензамида (303)

4.2.8. Синтез №(4-хлорфенил-2-({4-[этанимидоил(метил)амино] бензоил}амино)-5-метилбензамида (304)

4.2.9. Синтез №(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил) аминобензоил]амино}5-фторбензамида (306)

4.2.10. Синтез N-(2-{[ 5-хлорпиридин-2-ил)амино]карбонил}-4-(метилфенил)-4-[этанимидоил(метил)амино]-2-метоксибензамида (307)

4.2.11. Синтез К-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил) амино]бензоил}амино)бензамида (310)

4.2.12. Синтез К-(4-хлорфенил)-5-метил-2-[(4-{метил[(метиламино)карбонил]амино}бензоил)амино]бензамида (311)

4.2.13. Синтез 5-метил-2-[(4-{метил[(метиламино)карбонил] амино}бензоил)амино]-Ы-(4-метилфенил)бензамида (312)

4.2.14. Синтез К-(5-хлорпиридин-2-ил)-5-метокси-2-[(4-{метил[(метиламино)карбонил]амино}бензоил)амино]бензамида

(313 )

4.2.15. Синтез К-(5-хлорпиридин-2-ил)-5-фтор-2-[(4-{метил[(метиламино)карбонил]амино}бензоил)амино]бензамида

(314 )

4.2.16. Синтез К-(2-{[(5-хлорпиридин-2-ил)амино]карбонил}-4-метилфенил)-2-фтор-4{метил(метиламино)карбонил]амино} бензамида (315)

4.2.17. Синтез К-(2-{[(5-хлорпиридин-2-ил)амино]карбонил}-4-метилфенил)-2-метокси-4- {метил(метиламино)карбонил]амино} -бензамида (316)

4.2.18. Синтез К-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-[(4-{метил[(метиламино)карбонил]амино}бензоил)амино]бензамида (317)

4.2.19. Синтез К-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-[(4-этанимидоил(метил-амино)фенилкарбонил)амино]-4-гидрокси-5-метилбензамида (I)

4.3. Биологическая часть

4.3.1. Изучение специфической фармакологической активности лекарственной субстанции DD217 (крысы - однократный прием)

4.3.1.1. Обоснование доз

4.3.1.2.Выбор и условия содержания животных

4.3.1.3. Способ и процедура введения

4.3.1.4. Забор крови для анализов

4.3.1.5.Изучение фармакодинамических параметров субстанции DD217 при внутрижелудочном введении крысам

4.3.1.6. Изучение специфической фармакологической активности субстанции DD217 при внутрижелудочном введении на модели венозного тромбоза по Wessler S. у крыс

4.3.2. Изучение сравнительной активности метаболита и ВЭ217 по отношению к фактору Ха (для фактора Ха человека и крысы)

4.3.2.1. Подготовка реагентов и субстратов

4.3.2.2. Условия проведения реакций связывания с рецепторами и с ионными каналами

4.3.3. Анализ данных

4.3.4. Статистическая обработка результатов эксперимента

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Сердечно-сосудистая система представляет собой совокупность органов, обеспечивающих непрерывную циркуляцию крови в организме. Данная система состоит из сердца - мышечного органа, приводящего кровь в движение и сосудистой системы - комплекса трубчатых образований, по которому циркулирует кровь. Сердечно-сосудистая система поддерживает гомеостаз и нормальное функционирование организма за счет транспорта необходимых для жизни веществ и газов к тканям и органам, а также доставки продуктов жизнедеятельности клеток к органам, выводящим их из организма. Нормальной работе сосудистой системы способствует свертывающая система крови, сохраняющая кровь в жидком состоянии при физиологической норме, и формирующая сгустки крови при различных повреждениях сосудов, предотвращая кровопотерю и гибель организма. Нарушения в работе свертывающей системы приводят к образованию тромбов как в венозных и артериальных сосудах, так и в сердце [1].

Длительное время тромб может быть плотно прикреплен к стенке сосуда, однако высокая скорость и турбулентный ток крови, повышенное артериальное давление и физическое напряжение способствуют отрыву тромба и эмболии сосудов различных органов. Наиболее распространенными заболеваниями, развивающимися в результате тромбоэмболии, являются: ишемический инсульт головного мозга, возникающий в результате обтурации артериальных сосудов головного мозга; инфаркт миокарда при закупорке коронарной артерии, питающей сердце; тромбоэмболия легочной артерии. Для предотвращения тромбообразования используют различные антикоагулянтные лекарственные средства [2].

Антикоагулянты - это терапевтические препараты, применяемые как для профилактики тромбообразования, так и для лечения, так как препятствуют образованию нитей фибрина, их полимеризации и, соответственно, приводят к прекращению роста уже образованного тромба.

Антикоагулянтные препараты используют для профилактики осложнений при таких заболевания, как: атеросклероз коронарных и церебральных артерий, тяжелой сердечной и дыхательной недостаточности, а также при митральном стенозе ревматической этиологии. Кроме того, антикоагулянты широко используются в хирургии для предупреждений образования тромбов не только во время операций, но и в раннем и позднем послеоперационном периоде [3,4].

На протяжении длительного времени единственным классом доступных пероральных антикоагулянтов были антагонисты витамина К, такие как: варфарин, фенилин, неодикумарин и тд. Однако, несмотря на доказанную эффективность, данные препараты обладают рядом недостатков, требующих постоянного мониторинга состояния пациентов, а именно: взаимодействие с различными лекарственными средствами и пищевыми продуктами, узкое терапевтическое окно, серьезные побочные эффекты, в том числе кровотечения [5-7]. Эти недостатки мотивировали разработку других пероральных антикоагулянтов, не являющихся антагонистами витамина К и обладающими различными механизмами действия [8]. Многочисленные исследования в данной области показали, что одной из наиболее привлекательных мишеней для создания новых антитромботических препаратов является фактор Стюарта-Прауэра (ФХа). ФХа - фактор свертывания крови X представляет собой белок у-глобулин, профермент. Фактор Стюарта-Прауэра является как частью внешнего, так и внутреннего пути образования протромбиназы, превращающей протромбин в тромбин. Тромбин (фактор свертывания II), в свою очередь, превращает растворимый фибриноген в нерастворимый фибрин - основу тромба [9].

Современные антикоагулянтные препараты должны отвечать следующим требованиям: иметь низкую токсичность и узкий спектр побочных действий, обладать высокой антитромботической эффективностью и низким уровнем риска развития спонтанных кровотечений - главного осложнения антитромботической терапии.

Одним из возможных подходов к снижению риска развития кровотечения может быть поиск биологически активных веществ с высоким сродством и избирательностью действия к белкам, участвующим в гемокоагуляции, это позволило бы использовать низкие дозы препарата и, соответственно, снизило риск развития кровотечения. Еще одним критерием при разработке эффективного антитромботического препарата является создание лекарственного средства для перорального применения.

Ранее авторами патента EA015918 [120] был описан ряд структур, потенциально ингибирующих ФХа. В результате нескольких исследований, часть которых описана в настоящей работе, выбрана молекула N-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4- [этанимидоил(метил)амино]бензоил }амино)-5-метилбензамида гидрохлорид с условным названием DD217. В настоящий момент лекарственный препара с действующим веществом на основе DD217 находится на этапе клинических исследований 2-й и 3-й фазы с перспективой регистрации, как лекарственное средство по одному из стандартных показаний, общепринятому для класса пероральных антикоагулянтов прямого действия.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования являются ингибиторы фактора свертывания Ха:

1) 18 веществ, производных DD217, синтезированные в процессе hit-to-lead оптимизации (список приведен в главе 3).

2) Метаболит DD217: №(5-хлорпиридин-2-ил)-2-[(4-этанимидоил (метиламино)фенилкарбонил)амино]-4-гидрокси-5-метилбензамид (I). Предмет исследования - виртуальный поиск и численное предсказание

активности потенциальных структур, ограниченных защитой патентом EA015918 [120], с последующим синтезом некоторых из предсказанных молекул с целью определения специфической in vitro и in vivo фармакологической активности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и исследование фармакологической активности новых ингибиторов фактора Ха»

Цель работы

Оптимизация структуры соединения-лидера (DD217) с целью повышения его активности и селективности и использование для этих целей аналогов, созданных по принципу трехмерного фармакофорного подобия с использованием моделирования SAR. Оптимизация структуры химических веществ с целью улучшения их комплексных физико-химических, фармакокинетических и фармакодинамических характеристик. Биологическое и физиологическое (in vitro и in vivo) тестирование полученных соединений на предмет изучения особенностей их взаимодействия с ФХа. Исследование ингибирующей активности соединения-лидера (DD217) и его метаболита, как потенциальных лекарственных средств, относящихся к классу новых оральных антикоагулянтов.

Задачи, решенные в ходе достижения цели

1. Поиск и предсказание 263 структур, которые продемонстрировали энергию связывания (оценка AutoDock) большую или равную, чем вычисленная энергия для структуры DD217.

2. Синтез и изучение ингибирующей способности 18 веществ-кандидатов на лекарство-антикоагулянт, прямой ингибитор ФХа. Выбор соединения-лидера.

3. Изучение специфической фармакологической активности перорального

антикоагулянта DD217 на различных моделях in vitro, in vivo и ex vivo.

4. Поиск, дизайн и синтез метаболитов DD217.

5. Изучение специфической фармакологической активности метаболита DD217 in vitro.

Научная новизна

Впервые проведен виртуальный скрининг структурных аналогов N-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил)амино]бензоил}-амино)-5-метилбензамида (DD217) на пространстве молекул, ограниченных формулой Маркуша из п.1 патента EA015918, с использованием подхода SAR для

обнаружения биологически активных веществ с заданными свойствами. Число потенциальных кандидатов удалось уменьшить с 1013 до 263 структур.

Впервые синтезированы, охарактеризованы физико-химическими методами 18 амидов различного строения, из которых 9 мочевин и 9 амидинов и изучена их биологическая активность in vitro и in vivo.

Впервые спрогнозирована структура возможных метаболитов DD217, один из которых затем был синтезирован и охарактеризован физико-химическими методами и изучена его биологическая активность in vitro.

Впервые изучена ингибирующая способность полученных производных по отношению к фактору Ха. Впервые показано, что метаболиты DD217 обладают антикоагулянтными свойствами и могут представлять интерес, как потенциальные лекарства-антикоагулянты. Впервые исследована специфическая фармакологическая активность DD217 и доказано, что это вещество является лекарством-антикоагулянтом.

По результатам данной работы получен патент Евразийской патентной организации [10].

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимизация (химическая модификация) структуры новых антикоагулянтов на основе поиска структурных аналогов N-(5-хлорпиридин-2-ил)-2-({4-[этанимидоил(метил)амино]бензоил}амино)-5-метилбензамида (DD217) среди подобных диамидов.

2. Синтез структурных аналогов DD217 и определение их биологической антивности in vitro. Выбор наилучшей молекулы по нескольким параметрам, в том числе, по результатам экспериментов in vivo.

3. Поиск новых антикоагулянтов на основе прогнозирования метаболитов DD217

4. Синтез метаболита DD217 и определение его биологической антивности in vitro.

5. Изучение специфической фармакологической активности вещества DD217.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведено моделирование структуры новых антикоагулянтов на основе диамидов.

Создана база данных низкомолекулярных антикоагулянтов на основе диамидов, что позволяет прогнозировать механизм действия этих соединений, а также использовать полученные данные для скрининга новых антикоагулятов среди коммерчески доступных низкомолекулярных соединений.

На основе тестирования in vitro в ряду теоретически смоделированных амидинов и мочевин определены биологически активные структурные аналоги антикоагулянта DD217. Антикоагулирующая активность некоторых синтезированных соединений изучена in vivo и сравнивается с активностью DD217.

Синтезирован метаболит DD217 и изучена специфическая фармакологическая активность в сравнении с DD217 и Ривароксабаном, (известным антикоагулянтом компании Байер).

На основе экспериментальных данных по изучению специфической фармакологической активности DD217 сделан вывод о перспективности этого вещества, как кандидата в лекарство-антикоагулянт и необходимости его дальнейших испытаний.

Степень достоверности результатов

Строение всех полученных соединений было подтверждено широким спектром современных физико-химических методов анализа, включающих спектроскопию ядерного магнитного резонанса, масс-спектроскопию высокого разрешения. Биологическая активность полученных соединений измерялась согласно стандартным протоколам и подтверждается статистически значимой воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных в ходе работы.

Апробация результатов

Основные материалы диссертации были представлены в виде тезисов на следующих конференциях: «5 Международный форум антикоагулянтной + антиагрегантной терапии (ФАКТр1ш2020)» (Москва, 19-21 марта 2020); I Международная научно-практическая конференции «Медико-биологические и нутрициологические аспекты здоровьесберегающих технологий» (Кемерово, 27 ноября 2020).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК и индексируемых Scopus и Web of Science, а также тезисы 2 докладов на конференциях 2020 года, получен патент ЕАПО.

Личный вклад автора

В основу диссертационной работы положены результаты, полученные лично автором или при его непосредственном участии в период с 2015 по 2021 гг. Автор лично провела сбор и систематизацию литературных данных, лично выполнила синтез 1 9 диамидов, лично проводила эксперименты на животных (крысы) с целью получения биологических образцов. Автор принимала непосредственное участие в постановке задач, проведении биологических экспериментов, в частности изучала влияние исследуемых соединений на протромбиновое время (ПВ), на международное нормализованное отношение (МНО) in vivo и in vitro. Также автор лично занималась подготовкой статей и тезисов докладов к публикации, участвовала в научных конференциях.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав (литературный обзор, материалы и методы, обсуждение результатов, экспериментальная часть), выводов, списка сокращений, списка использованной литературы, приложения. Материал изложен на 161 странице, содержит 18 таблиц, 58 рисунков, приложения. Список литературы включает 175 ссылки.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Существующие классы антикоагулянтов

Лекарственные препараты, влияющие на функцию гемостаза, делятся на две большие группы — противотромботические и гемостатические. Противотромботические средства можно разделить на ингибиторы агрегации тромбоцитов (антиагреганты), антикоагулянты, тромболитические (фибринолитические) средства и средства, влияющие на реологические свойства крови [11].

Механизм действия антиагрегатов направлен на блокирование рецепторов на поверхности тромбоцитов. Прежде всего в процессе свертывания крови происходит активация особых белков, которые высвобождаются при повреждении тканевых факторов [12]. В ответ на это тромбоциты выделяют химические вещества, приводящие к склеиванию тромбоцитов и появлению тромбов. Антиагреганты, влияя на эти биохимические реакции, ингибируют их и предотвращают склеивание тромбоцитов и образование тромбов. Тромбы, образованные тромбоцитами -это первичная и наиболее быстрая реакция сердечно-сосудистой системы на повреждение кровеносных сосудов [12]. Тромбы, образованные тромбоцитами, достаточно слабы и легко разрушаются. Полимеризация фибриногена, растворенного в крови - это механизм упрочнения тромбов, когда тромбоцитовые сгустки переплетаются фибриновыми нитями. Лекарственные препараты класса антикоагулянтов воздействуют различными способами на образование фибрина [13].

С момента открытия гепарина в 1914 году применение антикоагулянтов значительно продвинуло профилактику и лечение опасных для жизни тромбоэмболических осложнений. В настоящее время рекомендуют краткосрочное или долгосрочное применение этих препаратов при широком спектре показаний, включая профилактику венозной тромбоэмболии (ВТЭ), проявляющейся тромбозом глубоких вен или тромбоэмболией легочной артерии (ТЭЛА) — у пациентов с острыми медицинскими заболеваниями или

перенесших серьезную ортопедическую или общую хирургию, а также для немедленного лечения и долгосрочной вторичной профилактики [14].

В зависимости от места образования сгустка тромбоэмболия может иметь артериальное или венозное происхождение [14]. Артериальный тромбоз, вызванный разрывом богатой тромбоцитами атеросклеротической бляшки, является ведущей причиной инфаркта миокарда (ИМ) и инсульта. Венозная тромбоэмболия (ВТЭ), включая тромбоз глубоких вен (ТГВ), вызывается отложением богатого фибрином сгустка в крупных венах ног, и когда этот сгусток отрывается, он может попасть в легочную артерию, блокируя кровоток, состояние, известное как легочная эмболия (ТЭЛА). Эти тромботические заболевания представляют серьезную угрозу для жизни человека из-за увеличения заболеваемости и смертности.

Антикоагулянтная терапия также рекомендуется для длительной профилактики ишемического инсульта у пациентов с фибрилляцией предсердий (ФП) и профилактики повторного инфаркта миокарда у пациентов с острыми коронарными синдромами, такими как нестабильная стенокардия или нестелеврированный инфаркт миокарда [15].

Ежегодно в странах Европейского Союза (ЕС) регистрируется более миллиона случаев ВТЭ и почти 6 миллионов случаев фибрилляции предсердий, вызывающих полмиллиона смертей, в то время как почти такое же количество послеоперационных случаев ВТЭ и инсульта, ставших причиной почти 0,3 миллиона жертв, ежегодно регистрируется в США [15-17].

В настоящее время доступные варианты антикоагулянтной терапии включают лечение нефракционированным гепарином (НФГ), низкомолекулярным гепарином (НМГ), антагонистами витамина К (АВК, включая варфарин), синтетическим пентасахаридом фондапаринукс (Арикстра), прямыми пероральными ингибиторами тромбина (дабигатран) и прямыми пероральными ингибиторами фактора Xa (ривароксабан, апиксабан, эдоксабан, бетриксабан) [17]. Многие из этих препаратов доказали свою эффективность в лечении и снижении риска тромбоэмболических

заболеваний, но они связаны со значительными недостатками, которые ограничивают их применение в клинических условиях. НФГ, НМГ и фондапаринукс вводятся парентерально, что делает их неудобными и дорогостоящими для длительного применения, особенно за пределами стационара, где могут потребоваться визиты к медицинскому работнику или, если пациенты не хотят или не могут самостоятельно вводить их, визиты медработника к ним [17].

Терапевтическое окно, профиль выведения и многочисленные пищевые и лекарственные взаимодействия требуют частого, неудобного и дорогостоящего мониторинга и корректировки дозы, чтобы гарантировать, что антикоагулянтная терапия препаратами класса АВК остается в пределах терапевтического диапазона [18]. АВК сложны в применении, т.к. характер терапии варфарином во многом обусловлен сложным механизмом действия данного препарата, не соблюдением режима приема. Эксперты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) выделяют 5 причин, влияющих на соблюдение схемы приема препаратов пациентами - низкая доступность и отсутствие преемственности медицинской организации; социально-экономические факторы - низкий уровень образования, отсутствие социальной поддержки; причина, связанная с заболеванием - бессимптомное течение заболевания, психические расстройства, депрессии; причины, связанные с пациентом: физические проблемы (например, плохое зрение), когнитивные расстройства: такие как нарушение памяти, молодой возраст; причины, связанные с терапией: побочные эффекты, сложная схема применения, связанная с постоянным контролем МНО [16].

В результате необходимо признать, что терапия АВК в условиях реального социума затруднена из-за необходимости поддерживать ее в терапевтическом диапазоне и часть пациентов подвергаются из-за этого повышенному риску возникновения тромбоэмболических событий или кровотечений [19].

Таким образом, существует реальная неудовлетворенная клиническая потребность в новых пероральных антикоагулянтах без необходимости частого мониторинга и коррекции дозы [20]. Эта потребность становится более насущной благодаря увеличению числа людей, имеющих факторы риска тромбоэмболических осложнений (в результате быстрого старения населения), а также тенденция к сокращению сроков пребывания в стационаре и ранней выписке пациентов после серьезных оперативных процедур.

В течение последнего десятилетия некоторые новые антикоагулянты, нацеленные на тромбин или фактор Ха (ФХа), были одобрены для лечения различных тромбоэмболических показаний [20]. Среди них:

• первые активные прямые ингибиторы тромбина (ПИТ): ксимелагатран AstraZeneca), пролекарство мелагатрана (в настоящее время снято с продажи из-за гепатотоксичности) и этексилат дабигатрана (Boehringer Ingelheim)

• прямые ингибиторы ФХа, такие как ривароксабан (Bayer Healthcare), апиксабан (Bristol-Myers Squibb) и эдоксабан (Daiich-Sankyo), а много позже - бетриксабан и проходящий клинические испытания Дарексабан [21,22].

Все эти соединения обладают приемлемыми уровнями пероральной биодоступности и предсказуемой фармакокинетикой, но все же имеют общий недостаток - способность вызывать кровотечения. Доступность ограниченного количества антидотов для традиционных антикоагулянтов в случае передозировки или чрезвычайной ситуации также является серьезной проблемой [23]. Следовательно, поиск идеального антикоагулянта все еще продолжается.

1.2. Оптимизация hit to lead

Первый шаг в проекте открытия лекарств включает в себя идентификацию соединений, которые обычно проявляют слабое или умеренное сродство к биологической мишени [24-26]. Эти первичные

попадания обычно обнаруживаются либо с помощью высокопроизводительного скрининга (ВПС) - больших коллекций разнообразных молекул средней сложности, либо с использованием технологии на основе фрагментов, в которой рассматриваются небольшие химические библиотеки низкомолекулярных фрагментов [27,28].

В настоящее время общеиспользуемый подход к разработке новых биологически-активных молекул, объединенный понятием Fragment-Based Drug Discovery (использование фрагментарного подхода) (FBDD), начиная с фазы оптимизации hit соединения из ВТС, может быть достаточно капризным с учетом необходимости сохранения при этом разумной молекулярной массы [29]. Несмотря на это, т.к. FBDD подходы могут охватывать большее химическое пространство на этапе оптимизации, это приводит к структурной новизне и более высокой вероятности успеха. За последнее десятилетие появилось все больше успешных сообщений, и более 30 соединений, полученных из фрагментов, в настоящее время находятся в клиничиских исследованиях или зарегистрированы [30-33]. Этап улучшения молекулы с получением наиболее подходяшей для последущих испытаний молекулы называется hit-to-lead оптимизацией, а сама молекула называется Lead.

Типичный процесс hit-to-lead включает в себя химические модификации вокруг проверенного попадания, чтобы оптимизировать его сродство к цели, чтобы стать Lead-соединением. Эти этапы оптимизации могут быть завершены путем использования стратегии проб и ошибок. При этом обычно требуется несколько циклов, чтобы достичь подходящего сродства [35,36].

Кроме того, могут быть предпочтительными и другие характеристики, такие как улучшение физико-химических свойств соединений и обеспечение или поддержание определенной степени селективности по отношению к другим нежелательным для связывания белкам-мишеням. На практике успешная hit-to-lead оптимизация может улучшить константу связывания на несколько порядков. Однако, из-за многочисленных параметров, которые

необходимо учитывать, процесс hit-to-lead также может быть неудачным, трудоемким и очень дорогим [37,38].

Средства компьютерного моделирования в настоящее время широко используют на всех стадиях процесса разработки лекарств [34]. В частности, для преодоления узких мест в процессе hit-to-lead были разработаны различные компьютерные подходы [39-41]. Используемые методы можно подразделить на две большие категории: с использованием пространственной структуры мишени (structure based) и на основании активности известных лигандов (ligand based). Например, методы на основе лигандов, такие как количественная структура - отношение активности (QSAR) может быть использовано для оптимизации ряда соединений путем использования имеющихся экспериментальных данных и расчетных дескрипторов [42,43,51].

Наиболее интуитивный подход к оптимизации молекул с помощью FBDD - использование in silico подхода, когда для улучшения сродства разрабатываемой молекулы к белку-цели исходное соединение увеличивают (Growing) путем добавления химических фрагментов, способных создавать новые связи с сохранением первоначально установленных связываний (рисунок 1). Также в рамках FBDD используют две дополнительные стратегии поиска H2L, а именно связывание (Linking) и слияние (Merging), которые помогают в создании похожих молекул, кандидатов на hit-to-lead (рисунки 2,3) [44]. В отличие от концепции Growing, где требуется один фрагмент, Linking и Merging состоят в ковалентной сборке двух неперекрывающихся фрагментов либо непосредственно, либо через спейсер переменной длины [45]. Стратегии Linking и Merging используются реже, чем Growing, т.к. являются более сложными, поскольку они требуют двух попаданий и сохранения их первоначальной ориентации после слияния в одно соединение. Однако, когда эти строгие критерии подтверждены, Linking и Merging могут привести к выдающимся улучшениям в константе связывания разрабатываемой молекулы к белку-цели [46,47].

На практике эти два подхода, в первую очередь, применимы к фрагментам, поскольку слияние или соединение двух соединений с умеренной или высокой молекулярной массой приведет к образованию молекул, которые слишком велики для использования в качестве лекарств.

Рисунок 1 - Пример разработки ингибиторов фосфодиэстеразы (ФДЭ) [48]

Рисунок 2 - Пример связывания, ведущий к открытию активатора пируваткиназы (PKM2) [49]

Рисунок 3 - Пример слияния на пути к разработке низкомолекулярных ингибиторов транскрипционного репрессорного белка Mycobacterium tuberculosis (эфира) [50]

Вычислительные методы, способные решать стратегии Growing, Linking и Merging, представляют основной интерес на этапе hit-to-lead [44,45,47]. Лучшие молекулы, которые предполагают синтезировать, выбираются в списке лучших хитов с помощью функции подсчета очков.

Критическим моментом является определение того, как справиться с созданием новых ковалентных связей, образованных в результате виртуального поиска и hit-to-lead оптимизации. Первая попытка создания разумных структур была предпринята методами RECAP [52,53] или BRICS [54].

Виртуальные фрагменты с дополнительными заместителями впоследствии могут быть объединены для создания новых виртуальных соединений. Однако нет никакой оценки относительно стоимости и возможности их синтеза, поскольку ни правила органической химии, ни наличие билдинг-блоков (BBS) не использовались во время данного процесса. Такой подход приводит либо к длительным последующим усилиям по разработке путей синтеза, что, в любом случае, не обязательно приводит к получению фактических соединений. Следовательно, крайне важно рассмотреть вопрос о возможности синтеза практически генерируемых соединений в контексте перспективных проектов по разработке лекарств [54].

1.3. Прямое ингибирование фактора Ха как механизм действия новых

антикоагулянтов

Каскад свертывания крови (рисунок 4) - это последовательный процесс, который включает взаимодействие и активацию различных сериновых протеаз в лавинообразной манере, что приводит к образованию тромбина. В схеме на рисунке 4 показаны два пути в каскаде свертывания, инициируемые либо через контактную активацию (внутренний путь), либо через высвобождаемый в месте травмы тканевый фактор (внешний путь) [21].

Рисунок 4 - Каскад свертывания крови

Инициирование коагуляции из-за повреждения сосудов любым из путей приводит к активации ФX в ФXa. На поверхности фосфолипида ФXa образует комплекс протромбиназы с ФVa в присутствии ионов кальция и превращает протромбин в тромбин [22]. Тромбин инициирует активацию тромбоцитов и превращает фибриноген в фибрин, основной компонент тромба или сгустка. В схеме на рисунке 4 показана обратная цепная реакция, в соответствии с которой тромбин увеличивает собственную генерацию, активируя FXI в FXIa, который дополнительно активирует FXa, что приводит к распространению

тромбина. Каждая молекула FXa ответственна за образование -1000 молекул тромбина [16,23].

Целью лекарств, кандидатов на антикоагулянты могут быть различные факторы свертывания, участвующие в каскаде, но из-за максимально активной роли в каскаде свертывания крови ФХа и тромбина (фактор IIa) именно они являются двумя наиболее широко исследуемыми мишенями для разработки новых антикоагулянтов [55-57].

Рисунок 5 - Активный сайт фактора Ха [9]

На рисунке 5 показана часть белка ФХа, ответственная за протекание реакции превращения ФП в тромбин (ФПа). Таким образом, ставится задача найти молекулу, способную максимально эффективно помешать ФХа участвовать в этом процессе и располагающуюся внутри этого кармана (сайта) связвания белка ФХа. Согласно системе номенклатуры Шехтера и Бергера, аминокислоты субстрата от Оконца до места, где начинается карман связывания, называются P4-P3-P2-P1, а соответствующие аминокислоты на сайте связывания фермента - S4-S3-S2-S1 [58]. Большинство прямых ингибиторов ФХа принимают L- или У-образную ориентацию для связывания

CI

с активным центром фермента. ФХа (также известный как фактор Стюарта-Проуэра), трипсиноподобная сериновая протеаза, состоит из тяжелой цепи из 254 аминокислот и легкой цепи из 142 аминокислот, соединенных дисульфидной связью [58]. Он состоит из каталитического домена двух антипараллельных Р-листов, имеющих каталитическую триаду и сайт связывания субстрата. Каталитическая триада образована остатками His57, Asp102 и Ser195, тогда как сайт связывания определяется субъединицами S1, S2, S3 и S4 с окружающими остатками. Сайт S1 является глубоким и в основном гидрофобным по своей природе, на дне которого расположены остатки боковой цепи Asp189 и Туг228. Остаток Asp189 активно участвует в ионных взаимодействиях и взаимодействиях водородных связей с положительно заряженным остатком аргинина Р1 субстрата. В отличие от других сериновых протеаз, S2-карман блокируется остатком Туг99 и доступен только для небольших фрагментов, в то время как $3--карман, известный как эфирный сайт, состоит из остатка Glu192 [59,60]. $4 представляет собой очень глубокий и сильно гидрофобный ароматический бокс, состоящий из аминокислотных остатков Туг99, Phe174 и Тгр215. Карбонильные группы различных аминокислот в кармане $4 фермента образуют электроотрицательную полость, называемую «катионным отверстием», на задней стороне ароматического бокса. Сайты связывания $1 и $4 широко используются различными исследовательскими группами для разработки селективных ингибиторов ФXa [61]. Из-за своего центрального положения, то есть точки соединения как внутренних, так и внешних путей, ФХа стал потенциальной мишенью для антикоагулянтной терапии [62].

На этом основании в последнее десятилетие были проведены обширные исследования в области малых молекул, перорально активных, прямых ингибиторов фактора Ха.

1.4. Ингибиторы фактора Ха

По сравнению с ингибированием тромбина, ингибирование ФХа является более эффективным способом контроля тромбогенеза благодаря своей способности ингибировать образование новых молекул тромбина. ФХа поддерживает минимальный уровень тромбина, который необходим для первичного гемостаза, и снижает склонность к кровотечениям [63]. Следовательно, ингибирование ФXa является лучшей идеей для разработки новых антикоагулянтов [64]. Пригодность ФXa в качестве ключевой мишени для антикоагулянтной терапии была подтверждена доклиническими исследованиями с использованием антистазина и клещевого антикоагулянтного пептида (КАП), которые были впервые заявлены как природные ингибиторы ФХа [65]. Клинические испытания с фондапаринуксом также подтвердили роль ФXa в качестве подходящей мишени при тромбозе [66]. Хотя ФXa имеет много общего с другими сериновыми протеазами, между ФXa и тромбином или трипсином существуют достаточные структурные различия, открывающие возможности структурного проектирования прямых ингибиторов ФXa. Селективность по-прежнему остается основным вопросом для разработки прямых ингибиторов ФХа, поскольку другие трипсиноподобные сериновые протеазы также активно участвуют в каскаде коагуляции [67].

Первоначальные усилия по разработке ингибиторов ФXa были сосредоточены на низкомолекулярных ингибиторах, главным образом амидинового и неамидинового типов. Рентгеноструктурный анализ показал, что амидиновая группа связывается с Asp189 в кармане S1 через солевой мостик, в то время как неамидины взаимодействуют через непрямой режим "хлорсвязывания" с остатком Tyr228, проявляющий сильные ван-дер-ваальсовые взаимодействия с Asp189 в кармане S2 [59]. Высокая основность и гидрофильность амидиновой группы привели к изучению проблем биодоступности, которые побудили исследователей к использованию

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Церковникова Наталья Андреевна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bisacchi, G.S. Anticoagulants, antithrombotics and hemostatics.// Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery. Abraham D.J.,Ed. Wiley & Sons. V. -Princeton. - 2003. - Vol. 3. - p.283-338.

2. Gomez-Outes A., Suarez-Gea M.L., Lecumberri R., TerleiraFernandez A., Vargas-Castrillon E. Direct acting oral anticoagulants.// Pharmacology, indications, management and future perspectives. Eur. J. Haemat. - 2015. - Vol.95. - p. 389404.

3. Д.Н.Емельянов В.С.Сергеев Антикоагулянты в кардиологической практике.// Лекарственный вестник. - 2013. - №3(51). - т.7. - с.20-27.

4. Diener H.C., Halperin J.L., Fox K., Hankey G.J. Stroke prevention with rivaroxaban in higher-risk populations with atrial fibrillation. // Intl. J. Clin. Pract/ -2015.- Vol.69(7).- p.743-756.

5. American Heart Association, Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. American Heart Association. Dallas, TX. - 2016. - Circulation. - 2016. - Vol.133. - p. 38-360.

6. Raskob, G. Thrombosis: A major contributor to the global disease burden.// J. Thromb. Heamost. - 2014. - Vol.12. - p.1580-1590.

7. Ansell J., Hirsh J., Hylek E., Jacobson A., Crowther M., Palareti G. The Pharmacology and management of vitamin K antagonists.// Chest, -2004. - Vol.126(3). - p.204-233.

8. Yeh C.H., Fredenburgh J.C., Weitz J.I. Oral direct factor Xa inhibitors. // Circ. Res.-2012. - Vol.111. - p.1069-1078.

9. Pinto D.J., Smallheer J.M., Cheney D.L., Knabb R.M.; Wexler R.R. Factor Xa inhibitors: Next generation antithrombotic agents.// J. Med. Chem. - 2010. - Vol. 53. - p. 6243-6274.

10. Тарасов Д.Н.. Товбин Д.Г., Церковникова Н.А. Савченко А.Ю. Новые амидины - ингибиторы фактора Ха. Патент ЕАПО №032764. - 31.07.2019.

11. Diener, H. C., Aisenberg, J., Ansell, J., Atar, D., Breithardt, G., Eikelboom, J., Lip, G. Y Choosing a particular oral anticoagulant and dose for stroke prevention in individual patients with non-valvular atrial fibrillation: part 2.//European heart journal.-2017.- Vol. 38(12). - p. 860-868.

12. American Heart Association, Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. American Heart Association. Dallas, TX, 2015. - Circulation. - 2016. - Vol.133. - p. 292-324.

13. Raskob, G. E., Spyropoulos, A. C., Cohen, A. T., Weitz, J. I., Ageno, W., De Sanctis, Y., Barnathan, E. S. Association between asymptomatic proximal deep vein thrombosis and mortality in acutely ill medical patients.// Journal of the American Heart Association/ - 2021. - Vol. 10(5). - e019459.

14. Khatib, R., Ludwikowska, M., Witt, D. M., Ansell, J., Clark, N. P., Holbrook, A., Nieuwlaat, R. Vitamin K for reversal of excessive vitamin K antagonist anticoagulation: a systematic review and meta-analysis.// Blood advances. - 2019. -Vol. 3(5). - p.789-796.

15. Мохаммед Джамал, Бузунова Т.Н., Спирова С.Р., Максимова Е.В., Воробьева Н.А. Антикоагулянтные кабинеты как решение проблемы приверженности терапии тромбоэмболических осложнений. / Сборник тезисов 3-го международного Форума АнтиКоагулянтной и антиагрегантной Терапии, 22-24 марта 2018, Москва - М. - Изд-во ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. - 2018. - с. 58.

16. Fredenburgh, J. C., Weitz, J. I. Factor XI as a target for new anticoagulants.// Hamostaseologie. - 2021. - Vol.41(02). - p.104-110.

17. Mekaj, Y.H. Mekaj, A.Y., Duci, S.B., Miftari, E.I. New oral anticoagulants: Their advantages and disadvantages compared with vitamin K antagonists in the prev ention and treatment of patients with thromboembolic events..// Therap. Clin. Risk Man. - 2015. - Vol.11. - p. 967-977.

18. Perez A., Eraso L.H., Merli, G.J. Implications of new anticoagulants in primary practice. Intl.// J. Clin. Pract. - 2013. - Vol.67(2). - p.139-156.

19. Harder S., Graff J. Novel oral anticoagulants: Clinical pharmacology, indications and practical considerations.// Eur. J. Clin. Pharmacol. - 2013. - Vol.69. - p. 1617-1633.

20. Eriksson B.I., Quinlan D.J., Weitz J.I. Comparative pharmacodynamics and pharmacokinetics of oral direct thrombin and factor Xa inhibitors in development.// Clin. Pharmacokinet. - 2009. - Vol.48. - p.1-22.

21. Furie B., Furie B.C. The molecular basis of blood coagulation.// Cell. - 1988. - Vol.53. - p. 505-518.

22. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: Initiation, maintenance and regulation.// Biochemistry. - 1991. - Vol.30. - p. 1036310370.

23. Turpie A.G. Oral, direct factor Xa inhibitors in development for the prevention and treatment of thromboembolic diseases.// Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2007. - Vol.27. - p. 1238-1247.

24. V. Erakovic Haber, R. Spaventi Discovery and Development of Novel Drugs// Prog. Mol. Subcell. Biol. - 2017. - Vol.55 (91). - p.104.

25. J. P. Hughes, S. Rees, S. B. Kalindjian, K. L. Philpott Principles of early drug discovery. Br. // J. Pharmacol. - 2011.-Vol.162. - p. 1239-1249.

26. B. Munos, Lessons from 60 years of pharmaceutical innovation. //Nat. Rev. Drug Discovery. - 2009. - Vol.8. - p. 959-968.

27. J. P. Renaud, M. A. Delsuc, Biophysical techniques for ligand screening and drug design. // Curr. Opin. Pharmacol. - 2009. - Vol. 9. - p. 622- 628.

28. R. Macarron, M. N. Banks, D. Bojanic, D. J. Burns, D. A. Cirovic, T. Garyantes, D. V. Green, R. P. Hertzberg, W. P. Janzen, J. W. Paslay, U. Schopfer, G. S. Sittampalam. Impact of high-throughput screening in biomedical research // Nat. Rev. Drug Discovery. - 2011. -Vol.10. - p.188-195.

29. R. Lahana, How many leads from HTS? // Drug Discovery Today. -.1999. -Vol. 4. - p. 447-448.

30. C. W. Murray, D. C. Rees, The rise of fragment-based drug discovery //Nat. Chem. - 2009. - Vol.1. - p. 187-192.

31. P. J. Hajduk, J. Greer, A decade of fragment-based drug design: strategic advances and lessons learned // Nat. Rev. Drug Discovery. - 2007. - Vol. 6. -p.211-219.

32. D. A. Erlanson, S. W. Fesik, R. E. Hubbard, W. Jahnke, H. Jhoti, Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery // Nat. Rev. Drug Discovery. -2016. - Vol.15. - p. 605-619.

33. M. J. Harner, A. O. Frank, S. W. Fesik, Fragment-based drug discovery using NMR spectroscopy// J. Biomol. NMR/ - 2013. - Vol.56. - p. 65-75.

34. A Jamaiyar , W Wan , D M Janota , M K Enrick , W M Chilian , L Yin The versatility and paradox of GDF 11 // Pharmacol Ther. - 2017. -Vol.175. - p. 2834.

35. R. Deprez-Poulain, B. Deprez, Curr. Facts, figures and trends in lead generation // Top. Med. Chem. - 2004. - Vol. 4. - p.569-580.

36. R. Poulain, D. Horvath, B. Bonnet, C. Eckoff, B. Chapelain, M. C. Bodinier, B. Deprez, From hit to lead. Analyzing structure-profile relationships // J. Med. Chem. - 2001. - Vol. 44. - p. 3391-3401.

37. A. Alanine, M. Nettekoven, E. Roberts, A. W. Thomas, Comb. Lead generation--enhancing the success of drug discovery by investing in the hit to lead process // Chem. High Throughput Screening. - 2003. - Vol.6 (51). - p.66.

38. K. H. Bleicher, H. J. Bfhm, K. Mller, A. I. Alanine, Hit and lead generation: beyond high-throughput screening // Nat. Rev. Drug Discovery. - 2003. - Vol. 2. -p. 369-378.

39. G. Sliwoski, S. Kothiwale, J. Meiler, E. W. Lowe, Pharmacol. Computational methods in drug discovery // Rev. - 201. - Vol. 66. - p. 334-395.

40. W. L. Jorgensen, Efficient drug lead discovery and optimization // Acc. Chem. Res.- 2009. -Vol.42. - p. 724-733.

41. W. Yu, A. D. MacKerell, Computer-Aided Drug Design Methods // Methods Mol. Biol. - 2017. - Vol.1520. - p. 85-106.

42. T. Wang, M. B. Wu, J. P. Lin, L. R. Yang, Quantitative structure-activity relationship: promising advances in drug discovery platforms // Expert Opin. Drug Discovery. - 2015. - Vol.10. - p. 1283-1300.

43. T. Wang, M. B. Wu, R. H. Zhang, Z. J. Chen, C. Hua, J. P. Lin, L. R. Yang, Curr. Advances in Computational Structure-Based Drug Design and Application in Drug Discovery // Top. Med. Chem. - 2016. - Vol.16. - p.901-916.

44. R. J. Bienstock, Computational methods for fragment-based ligand design: growing and linking // Methods Mol. Biol. - 2015. - Vo1.1289. - p.119-135.

45. L. Hoffer, J. P. Renaud, D. Horvath, Fragment-based drug design: computational & experimental state of the art // Comb. Chem. High Throughput Screening. - 2011. - Vol.14. - p. 500-520.

46. V. Borsi, V. Calderone, M. Fragai, C. Luchinat, N. Sarti Entropic contribution to the linking coefficient in fragment based drug design: a case study // J. Med. Chem. - 2010. - Vol.53. - p. 4285-4289.

47. J. J. Barker, O. Barker, S. M. Courtney et all Discovery of a novel Hsp90 inhibitor by fragment linking // ChemMedChem. - 2010. -Vol. 5. - p. 1697-1700.

48. G. L. Card, L. Blasdel, B. P. England et all A family of phosphodiesterase inhibitors discovered by cocrystallography and scaffold-based drug design // Nat. Biotechnol.- 2005. - Vol. 23. - p. 201-207.

49. Y. Matsui, I. Yasumatsu, T. Asahi et all Discovery and structure-guided fragment-linking of 4-(2,3-dichlorobenzoyl)-1-methyl-pyrrole-2-carboxamide as a pyruvate kinase M2 activator // Bioorg. Med. Chem. - 2017. - Vol.25. - p. 3540-3546.

50. P. O. Nikiforov, S. Surade, M. Blaszczyk et all A fragment merging approach towards the development of small molecule inhibitors of Mycobacterium tuberculosis EthR for use as ethionamide boosters // Org. Biomol. Chem. - 2016. -Vol.14. - p. 2318-2326.

51. Artem Cherkasov , Eugene N Muratov, Denis Fourches, Alexandre Varnek et all. QSAR modeling: where have you been? Where are you going to? // J.Med. Chem. - 2014. - Vol. 57(12). - P. 4977-5010.

52. X. Q. Lewell, D. B. Judd, S. P. Watson, M. M. Hann RECAP--retrosynthetic combinatorial analysis procedure: a powerful new technique for identifying privileged molecular fragments with useful applications in combinatorial chemistry // J. Chem. Inf. Model. - 1998. - Vol. 38. - p. 511-522.

53. P. Schneider, G. Schneider, De Novo Design at the Edge of Chaos // J. Med. Chem. - 2016. - Vol. 59. - p. 4077-4086.

54. G. Schneider, U. Fechner, Computer-based de novo design of drug-like molecules // Nat. Rev. Drug Discovery. - 2005. - Vol.4. - p. 649- 663.

55. Mackman N. Triggers, targets and treatments for thrombosis./ Nature. - 2008. - Vol.451. - p. 914-918.

56. Hauel N.H., Nar H., Priepke H., Ries U., Stassen J., Wienen W. Structure-based design of novel potent nonpeptide thrombin inhibitor. // J. Med. Chem. - 2002. - Vol.45 - p.1757-1766.

57. Mehta A.Y., Jin Y., Desai U.R. An update on recent patents on thrombin inhibitors (2010-2013).// Exp. Opin. Ther. Pat. - 2014. -Vol.24. - p.47-67.

58. Straub A., Roehrig S., Hillisch A. Oral, direct thrombin and factor Xa inhibitors: The replacement for warfarin, leeches and pig intestine.// Angew. Chem. Intl. Ed. - 2011. - Vol.50. - p. 4574-4590.

59. Bhunia S.S., Roy K.K., Saxena A.K. Profiling the structural determinants for the selectivity of representative factor-Xa and thrombin inhibitors using combined ligand-based and structurebased approaches. //J. Chem. Inf. Model. - 2011. - Vol.51. - p. 1966-1985.

60. Lee Y., Player M.R. Development in factor Xa inhibitors for the treatment of thromboembolic disorders.// Med. Res. Rev. - 2011. - Vol.31(2). - p. 202-283.

61. Qingqing Du, Yan Qian, Xiaojun Yao & Weiwei Xue Elucidating the tight-binding mechanism of two oral anticoagulants to factor Xa by using induced-fit docking and molecular dynamics simulation // Received 14 Jan 2019. - p. 625633. doi.org/10.1080/07391102.2019.1583605.

62. Guo, L., Ma S. Advances in inhibitors of FXa.// Curr. Drug Targets. - 2015. - Vol. 16. - p. 1207-1232.

63. Kontogiorgis C.A., Hadjipavlou-Litina D. Current trends in quantitative structure -activity relationships on FXa inhibitors: Evaluation and comparative analysis. // Med. Res. Rev. - 2004. - Vol. 24(6). - p. 687-747.

64. Ansell J. Factor Xa or thrombin: Is factor Xa a better target?//J. Thromb. Heamost. - 2007. - Vol.5. - p. 60-64.

65. Vlasuk G.P. Comparison of the in vivo anticoagulant properties of standard heparin and the highly selective factor Xa inhibitors antistasin and tick anticoagulant peptide (TAP) in a rabbit model of venous thrombosis.// Thromb. Haemost. - 1991. - Vol.65. - p. 257-262.

66. Yusuf S. Comparison of fondaparinux and enoxaparin in acute coronary syndromes.// N. Engl. J. Med. - 2006. - Vol.354. - p. 1464-1476.

67. Patel N.R., Patel D.V., Murumkar P.R., Yadav M.R. Contemporary developments in the discovery of selective factor Xa inhibitors: A review.// Eur. J. Med. Chem. - 2016/ - Vol. 121. - p. 671-698.

68. Liang G., Bowen J.P. Development of trypsin-like serine protease inhibitors as therapeutic agents: Opportunities, challenges, and their unique structure-based rationales.// Curr. Top. Med. Chem. -2016/ - Vol.16. - p. 1506-1529.

69. Dempfl e C.E., Borggrefe M. Do we need thrombin generation assays for monitoring anticoagulation? // Thromb. Haemost.- 2008. - Vol.100(2). - p.179— 180.

70. Perzborn E., Roehrig S., Straub A. et all. The discovery and development of rivaroxaban, an oral, direct factor Xa inhibitor.// Nat. Rev. Drug Discov. - 2011. -Vol.10. - p. 61-75.

71. Bauer K.A., Hawkins D.W., Peters P.C et al. Fondaparinux, a synthetic pentasaccharide: The first in a new class of antithrombotic agents-the selective factor Xa inhibitors.// Cardiovasc. Drug Rev. - 2002. - Vol.20. - p.37-52.

72. Hata, K., Kimura, T., Tsuzuki, S. et all Safety of fondaparinux or prevention of postoperative venous thromboembolism in urological malignancy: A prospective randomized clinical trial. Intl. J. Urol., 2016, 23(11), 1- 6.

73. Trujillo, T.; Dobesh, P.P. Clinical use of rivaroxaban: Pharmacokinetic and pharmacodynamic rationale for dosing regimens in different indications. Drugs, 2014, 74, 1587-1603.

74. Furugohri T., Isobe K., Honda Y., Kamisato-Matsumoto C., Sugiyama N., Nagahara T., et al. DU-176b, a potent and orally active factor Xa inhibitor: in vitro and in vivo pharmacological profi les. // J. Thromb. Haemost. - 2008. - Vol.6(9). - p. 1542—1549.

75. Kunugiza, Y., Nakamura, Y., Mikami, K., & Suzuki, S. Warfarin-related recurrent knee haemarthrosis treated with arterial embolisation and intra-articular injection of tranexamic acid. // BMJ Case Reports. - 2015. https://sci-hub.do/10.1136/bcr-2015-210203 .

76. Parasrampuria D.A., Truitt K.E. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of edoxaban, a non-Vitamin K antagonist oral anticoagulant that inhibits clotting factor Xa. //Clin. Pharmacokinet. - 2016. - Vol.55. - p. 641-655.

77. Morris, G. M., Huey, R., Lindstrom, W., Sanner, M. F., Belew, R. K., Goodsell, D. S., & Olson, A. J. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility..// Journal of Computational Chemistry -2009. - Vol.30(16). - p. 2785-2791.

78. Amadeus Investigators; Bousser M.G., Bouthier J., Buller H.R., Cohen A.T., Crijns H., et al. Comparison of idraparinux with vitamin K antagonist for prevention of thromboembolism in patients with atrial fi brillation: a randomized, open-label, non-inferiority trial.// Lancet. - 2008. - Vol. 371(9609. - p. 315—321.

79. Arepally G.M., Ortel T.L. Changing practice of anticoagulation: Will target-specific anticoagulants replace warfarin?// Ann. Rev. Med. - 2015. -Vol.66. - p.241-253.

80. Lasseur R., Longin-Sauvageon C., Videmann B et all Warfarin resistance in a French strain of rats.// J. Biochem. Mol. Tox. - 2005. - Vol.19. - p. 379-385.

81. https://w-mlawgroup.com/2018/02/12/7-most-dangerous-prescription-drugs/

82. Eriksson B.I., Quinlan D.J. Eikelboom J.W. Novel oral factor Xa and thrombin inhibitors in the management of thromboembolism.// Ann. Rev. Med.

- 2011, - Vol.62. - p.41-57.

83. Leko M., Naitoh S., Yoshida M., Takahashi N. Profiles of direct oral anticoagulants and clinical usage-dosage and dose regimen differences.// J. Inten. Care. - 2016. - Vol.4. - p.19.

84. www.thrombosisadviser.com/factor-Xa-inhibitors

85. Esmon C.T. Targeting factor Xa and thrombin: Impact on coagulation and beyond.// Thromb. Haemost. - 2014. - Vol.111. - p.625-633.

86. Palladino M., Merli G., Thomson L. Evaluation of the oral direct factor Xa inhibitor-betrixaban.// Exp. Opin. Investig. Drugs. - 2013. - Vol.22(10) -p. 1-8.

87. Yeh C.H., Hogg K., Weitz J.I. Overview of the new oral anticoagulants: Opportunities and challenges.// Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2015. - Vol.35.

- p.1056-1065.

88. Byon W., Garonzik S., Boyd, R. A., & Frost, C. E. Apixaban: A Clinical Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Review.// Clinical Pharmacokinetics. -2019 - Vol.58.- №10. - p.1265-1279.

89. Camporese G., Simioni P., Di Micco P et all Edoxaban for the Long-Term Therapy of Venous Thromboembolism: Should the Criteria for Dose Reduction be Revised?/ Clinical and Translational Science. - 2020. - Vol.14. - №1. - p.335-342.

90. Sarich T. C., Peters G., Berkowitz S. D et all Rivaroxaban: a novel oral anticoagulant for the prevention and treatment of several thrombosis-mediated conditions.// Annals of the New York Academy of Sciences. - 2013. - Vol.1291. -№ 1. - p. 42-55.

91. Lekura J., & Kalus J. S. Overview of betrixaban and its role in clinical practice. American Journal of Health-System Pharmacy. - 2018. - Vol.75. - №215. -p.1095-1102.

92. Greig S. L., & Garnock-Jones K. P. Apixaban: A Review in Venous Thromboembolism.// Drugs. - 2016. - Vol.6. - № 15. - p.1493-1504.

93. Quan M.L., Lam P.Y., Han Q. et all Discovery of 1-(3'-aminobenzisoxazol-5'-yl)-3 trifluoromethyl-N- [2-fluoro-4-[(2'-dimethylaminomethyl)imidazol-1-yl]phenyl]-1Hpyrazole-5-carboxyamide hydrochloride (Razaxaban), a highly potent, selective and orally bioavailable factor Xa inhibitor.// J. Med. Chem. - 2005.

- Vol.48. - p. 1729-1744.

94. Mantha S., Ansell J. Indirect comparison of dabigatran, rivaroxaban, apixaban and edoxaban for the treatment of acute venous thromboembolism.// J. Thromb. Thrombol. - 2015. - Vol.39. - p .155-165.

95. Pinto D.J., Orwat M.J., Koch S., Rossi K.A., et all Discoveryof 1-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-(4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxamide (Apixaban, BMS-562247), a highly potent, selective, efficacious, and orally bioavailable inhibitor of blood coagulation factor Xa.// J.Med. Chem. - 2007. - Vol.50. - p. 5339-5356.

96. Vladiskovic C. Apixaban preparation process. W.O. Patent 168,364. - December 13. - 2012.

97. Bhirud S.B. Process for the preparation and purification of apixaban. W.O. Patent 111,954. - July 24. - 2014.

98. Jayachandra, S. Process for the preparation of apixaban. W.O. Patent 162,551 - October 29. - 2015.

99. Singh, S. Process for the preparation of apixaban and intermediates thereof. W.O. Patent 067,308. - May 6. - 2016.

100. Jianyan X., Hejun L,. Dong Q. Pyrazol[3,4-C]pyridine derivative, preparation method and use in medicine thereof. W.O. Patent 044,107. - March 27.

- 2014.

101. Yonggang W. 4,5-dihydro-pyrazolo[3,4-c]pyrid-2-ones, preparation method and application thereof. W.O. Patent 169,845/ - October 23. - 2014.

102. Yonggang W. 4,5-dihydro-pyrazolo[3,4-c]pyrid-2-one spiro derivative, preparation method and use thereof. W.O. Patent 051,713. - April 16. - 2015.

103. Yonggang W., Guanpeng Q., Song W. Substituted 4,5-dihydro pyrazolo[3,4-c]pyridine-2-one spirocyclic derivative and use thereof. W.O. Patent 081,901. - June 11. - 2015.

104. Zhaozhang D., Guanghua L., Shuhui C., Xiaobing Y. Hydrazine compound as blood coagulation factor Xa inhibitor. W.O. Patent 176,625. -November 26. - 2015.

105. Roehrig S., Straub A., Pohlmann J., Lampe T., Pernerstorfer J., Schlemmer K.H., Reinemer P., Perzborn E. Discovery of the novel antithrombotic agent, 5-Chloro-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)thiophene-2-carboxamide (BAY 59-7939): An oral, direct factor Xa inhibitor// J. Med. Chem. - 2005/ - Vol.48. - p. 5900-5908.

106. Binhua L.V., Chengwei L.I., Benwen C. Substituted oxazolidinone compound and pharmaceutical composition comprising the compound and use thereof. W.O. Patent 029,333. - February 27. - 2014.

107. Yushe Y., Tao X., Shi D. et all Oxazolidone ompound, preparation method and application thereof. W.O.Patent 110,971. - July 24. - 2014.

108. Renlong G. Benzoxazoleoxazine ketone compound as blood coagulation factor Xa inhibitor. W.O. Patent 043,364. - April 2. - 2015.

109. Herold P. Trypsin-like serine protease inhibitors, their preparation and use as selective inhibitors of the clotting factors IIa and Xa. W.O. Patent 083,436. - June 28. - 2012.

110. Steinmetzer, T.; Saupe, S.M. Serine protease inhibitors. W.O. Patent, 004,678, January 12, 2012.

111. Saupe S.M., Steinmetzer T. Cyclic tripeptide mimetics as plasmin inhibitors. W.O. Patent. - 004,845. - January 10. - 2013.

112. Matsumoto K. Imine derivative. W.O. Patent 031,930. - March 7. -2013.

113. Alet N., Altenburger J.M. Sulfonylaminopyrrolidinone derivatives, their preparation and their therapeutic application. E.P. Patent 2,606,893. - June 26. - 2013.

114. Short K.M.. Pham S.M., Williams D.C. Dual inhibitor compounds and methods of use thereof. W.O. Patent 049,591. - April 4. - 2013.

115. Rao P.S., Burkart T. Advances in oral anticoagulation therapy. - What's in the pipeline.// Blood Rev. - 2017. - Vol. 31(4). - p. 205-211.

116. Cohen A.T. Cohen, Harrington R.A., Goldhaber S.Z. et all Extended thromboprophylaxis with betrixaban in acutely ill medical patients.// N. Eng. J. Med.

- 2016. - Vol.375 - p.534-544.

117. Кужим А.А. Антикоагулянтная активность сульфатов пектина, инулина и целлюлозы/ автореферат дис. к.б.н. - 14.03.06.

118. Ling Qin, Meijia He, Yajing Yang et all Anticoagulant-active sulfated arabinogalactan from Chaetomorpha linum: Structural characterization and action on coagulation factors// Carbohydr Polym. - 2020. - Vol.15. p. 242.

119. Vishwanathan B. Iyer, Gurupadayya B.M, Bharathkumar Inturi et all Synthesis of 1,3,4-Oxadiazoles as promising anticoagulant agents// PSC Advances

- 2016. - V.29.- p. 3345-3350.

120. Товбин Д.Г., Тарасов Д.Н., Малахов Д.В Описание изобретения к евразийскому патенту 015918 «Уретаны, мочевины, амиды и родственные ингибиторы FXa», дата публикации и выдачи 2011.12.30.

121. Dmitry N. Tarasov, Dmitry G. Tovbin, Dmitry V. Malakhov, Natalia A. Tserkovnikova et all. The Development of New Factor Xa Inhibitors Based on Amide Synthesis. // Cur. Drug Disc. Technologies/. - 2018. -Vol.15.- p.335-350.

122. Yana Vinogradova, Carol Coupland,, Trevor Hill, Julia Hippisley-Cox. Risks and benefits of direct oral anticoagulants versus warfarin in a real world setting: cohort study in primary care. / BMJ. - 2018 - p.362.

123. Hirayama F, Koshio H, Ishihara T. Discovery of N-[2-Hydroxy-6-(4-methoxybenzamido)phenyl]-4-(4-methyl-1,4-diazepan-1 -yl)benzamide (Darexaban, YM150) as a Potent and Orally Available Factor Xa Inhibitor.// J. Med Chem. - 2011. - Vol.54. - p. 8051-8055.

124. Bayer Healthcare AG, Mueck W., Lensing A.W et all Oral Rivaroxaban for the Treatment of Symptomatic Pulmonary Embolism // Clin Pharmacokinet. - 2011. - Oct. - V. 50(10). - p. 675

125. https://x-medica.ru/uploads/articles/item 6305/distillyator-melag-meladest-65 pasport-2.pdf

126. http://www.mosfarm. su

127. http://www.renam.ru

128. http://www.chromogenix.com

129. http:// www.haemtech.co

130. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / Под редакцией А.Н. Миронова. - Ч.1.- М. - Гриф и К. - 2012. - Стр. 468.

131. Эконометрика. Учебник / Под ред. Елисеевой И. И. — 2-е изд. — М.: Финансы и статистика, 2006. — 576 с.

132. http://www.niiepit.com/

133. http: //www. sanofi.ru

134. http://www.merlinmedical.net

135. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / Под редакцией А.Н. Миронова. - Ч.1. - М. - Гриф и К. - 2012. - Стр. 22.

136. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / Под редакцией А.Н. Миронова. - Ч.1.- М. - Гриф и К. - 2012. - Стр. 467.

137. Wessler S, Reimer S. М., Sheps М. С. Biological assay of a thrombosis inducing activity in human serum // J. Арр1. Physiol. — 1959. — Vo1. 4(9). — p. 943-946.

138. Lipinski C, Lombardo F, Dominy B, Feeney P. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings // Adv Drug Deliv Rev. - 2001. -Vol.46. - p. 3-26.

139. Tarasov D, Tovbin D. How sophisticated should a scoring function be to ensure successful docking, scoring and virtual screening? // J. Mol Model. - 2009.

- Vol.15. - p. 329-41.

140. Becattini C, Vedovati MC, Agnelli G. Old and new oral anticoagulants for venous thromboembolism and atrial fibrillation // Thromb Res.- 2012. - Mar. -V. 129(3). - р. 392-400.

141. Byon, W., Garonzik, S., Boyd, R. A., & Frost, C. E. (2019). Apixaban: A Clinical Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Review.// Clinical Pharmacokinetics.- 2019. - doi:10.1007/s40262-019-00775-z

142. Pauling L. The Nature of the chemical bond / 3rd Ed. cornell university Press.

- Ithaca United States. - 1960.

143. Mousa S.A. In vivo models for the evaluation of antithrombotics and thrombolytics // Methods Mol Biol. - 2010. - Vol.663. - p. 29-107.

144. ГОСТ Р 51849-2001 Р.5 Продукция комбикормовая. Информация для потребителя. Общие требования.

145. https://www.virbac.com

146. Barrett Y, Wang Z, Frost C, Shenker A. Clinical laboratory measurement of direct factor Xa inhibitors: anti-Xa assay is preferable to prothrombin time assay // Thromb Haemost. - 2010. - Vol.104. - p. 1263-1271.

147. Harenberg J, Kramer R, Giese C, Marx S, Weiss C, Wehling M. Determination of rivaroxaban by different factor Xa specific chromogenic substrate assays: reduction of interassay variability // J. Thromb Thrombolysis. - 2011. - Vol. 32. - p. 267-271.

148. Samama M,M, Contant G, Spiro T.E. et all. Evaluation of the prothrombin time for measuring rivaroxaban plasma concentrations using calibrators and ontrols: results of a multicenter field trial // Clin Appl Thromb Hemost. - 2012. - Vol.18. -p. 150-158.

149. Franchini M, Mannucci P. New anticoagulants for treatment of venous thromboembolism // Eur. J. Intern. Med. - 2012. - Vol. 23. - p. 692-695.

150. Mackman N. Triggers, targets and treatments for thrombosis //Nature. -2008.

- Vol.451. - p. 914-918.

151. Sharif, N.A., Kelly C.R. Mclaughlin Human Trabecular Meshwork Cells Express Functional Serotonin-2A (5HT2A)// Receptors: Role in IOP Reduction.-2006.- Vol.47.- p.4001-4010.

152. Childers, S.R. et al. Opiate receptor binding affected differentially by opiates and opioid peptides // Eur. J. Pharmacol. - 1979. - Vol. 55. - №1.- p. 11-18.

153. Pasternak, G.W. et al. Selective enhancement of [3H]opiate agonist binding by divalent cations // Mol. Pharmacol. - 1975. - Vol. 11. - p. 340-351.

154. Liu, Y.F., Civelli O., Zhou Q Y, Albert P R. Cholera toxin-sensitive 3',5'-cyclic adenosine monophosphate and calcium signals of the human dopamine-D1 receptor: selective potentiation by protein kinase // Mol. Endocrinol. - 1992. - Vol.6.

- № 11. - p.1815-1824.

155. Zhou, O.Y. et al. Cloning and expression of human and rat D1 dopamine receptors.// Nature. - 1990. - Vol.347. - p.76-80.

156. Brea, J. et al. Evidence for distinct antagonist-revealed functional states of 5-hydroxytryptamine(2A) receptor homodimers // Mol Pharmacol. - 1990/ - Vol.75. -N6. -p.1380-1391.

157. Javitt, D.C. and Zukin, S.R. Interaction of [3H]MK-801 with multiple states of the N-methyl-D-aspartate receptor complex of rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1989. - Vol.86(2). - p.740-744.

158. Reynolds I.J., Murphy S.N., Miller R.J. 3H-labeled MK-801 binding to the excitatory amino acid receptor complex from rat brain is enhanced by glycine.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1987. - Vol.84(7). - p.7744-7748.

159. Shank, R.P. Ion and temperature effects on the binding of gamma amino-butirat to the receptors and the high affinity trsnsport system // J. Neurochem. - 1990

- Vol.54(6). - p. 2007-15.

160. Cheng Y. and Prusoff W.H., Relationship between the inhibition constant (K0 and the concentration of inhibitor which causes 50% inhibition (IC50) of an enzymatic reaction // Biochem. Pharmacol. - 1973. - Vol.22. - p.3099-3108.

161. Бейли Н. Статистические методы в биологии. - М. - Мир. - 1963. -Методическое пособие по использованию программы STATISTICA при обработке данных биологических исследований. Мастицкий С. Э. / Сергей Мастицкий. - Минск. - РУП Институт рыбного хозяйства. - 2009. - 79 с.

162. Perzborn E, Strassburger J, Wilmen A. et all. In vitro and in vivo studies of the novel antithrombotic agent BAY 59-7939—an oral, direct Factor Xa inhibitor. // J Thromb Haemost - 2005 - Vol.3. - p. 514-521.

163. Dmitry G. Tovbin, Dmitry N. Tarasov, Dmitry V. Malakhov, Natalia A. Tserkovnikova. The development of new low-molecular-weight factor Xa inhibitors that are potential anticoagulants// Current Drug Discovery Technologies. - Vol.18. - 2021. - doi: 10.2174/1568009621666210224104940.

164. Dmitry Tovbin, Dmitry Tarasov. Method of determination of protein ligand binding and of the most probable ligand pose in protein binding site. US Patent Appl. No.12/594,845; Priority to PCT/RU2007/000168 2007-04-12; Publication of US20100112724A1 2010-05-06.

165. Dmitry Tovbin, Dmitry Tarasov. Method for selecting potential medicinal compounds. US Patent Appl. No. 12/159,632; Priority to PCT/RU2006/000015 2006-01-20; Publication of US20090012767A1 2009-01-08.

166. L. Pauling The Nature of the Chemical Bond, 3rd. ed.- Cornell University Press. - 1960.

167. Penglie Zhang,Wenrong Huang, Discovery of betrixaban (PRT054021), N-(5-chloropyridin-2-yl)-2-(4-(N,N-dimethylcarbamimidoyl)benzamido)-5-methoxybenzamide, a highly potent, selective, and orally efficacious factor Xa inhibitor // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2009. - Vol. 19. - №8. -p. 2179-2185.

168. Gaillard Т. Evaluation of AutoDock and AutoDock Vina on the CASF-2013 Benchmark //J. Chem. Inf. Model. - 2018. - Vol. 58. - № 8 . - p. 1697-1706.

169. Qingqing Du, Qian Y, Xiaojun Yao Elucidating the tight-binding mechanism of two oral anticoagulants to factor Xa by using induced-fit docking and molecular dynamics simulation // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. - 2020. - Vol.38(2). - p. 625-633.

170. Michael Harder, Dr. Bernd KuhnProf. Efficient Stacking on Protein Amide Fragments// ChemMedChem. - 2013. - Vol.8(3). - p.397-404.

171. Dr. Robert Abel, Dr. Noeris K. Salam Contribution of Explicit Solvent Effects to the Binding Affinity of Small-Molecule Inhibitors in Blood Coagulation Factor Serine Proteases ChemMedChem. - 2011. - Vol.6(6). - p.1049-1066.

172. David Weininger SMILES, a chemical language and information system. Introduction to methodology and encoding rules. // Journal of Chemical Information and Computer Sciences . - Vol.28(1). - p. 31-36.

173. R Core Team (2017). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL.

- https : //www.R-proj ect. org/

174. Noel M O'Boyle, Michael Banck, Craig A James, Chris Morley Open Babel An open chemical toolbox // J. Cheminform. - 2011. - Vol.3. - p. 33.

175. Free, S. M., & Wilson, J. W. (1964). A Mathematical Contribution to Structure-Activity Studies. //Journal of Medicinal Chemistryro - 1964. - Vol.7(4).

- p. 395-399.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Таблица 1 - Калибровочные данные для раствора гемоглобина крысиной крови в воде. Количество измерений п=6.

Сгемоглобина, г/л О, у.е.

0,004578 0,0379 ± 0,0004

0,009155 0,0401 ± 0,0004

0,018311 0,0441 ± 0,0004

0,036621 0,0543 ± 0,0004

0,073242 0,0609 ± 0,0004

0,146484 0,0770 ± 0,0004

0,292969 0,1138 ± 0,0004

0,585938 0,2845 ± 0,0004

1,171875 0,5328 ± 0,0004

2,34375 0,7121 ± 0,0004

4,6875 0,9363 ± 0,0004

Таблица 2 - Изменение оптической плотности от времени в реакции расщепления 827б5 белком Фактор Ха (X = 405 нм). Точность измерения

±0.0002.

Время, с СбБ217, мкМ/мл Сривароксабан, мкМ/мл

0 200 400 800 1600 0 200 400 800 1600

О, у.е.

0 0.6240 0.7940 0.5940 0.7948 0.5430 0.5004 0.7148 0.5153 0.6049 0.6097

900 0.6684 0.8255 0.6167 0.8088 0.5504 0.5427 0.7427 0.5354 0.6192 0.6174

1800 0.7111 0.8557 0.6385 0.8216 0.5569 0.5821 0.7678 0.5545 0.6324 0.6247

2700 0.7515 0.8845 0.6593 0.8337 0.5627 0.6187 0.7922 0.5723 0.6447 0.6310

3600 0.7904 0.9121 0.6792 0.8446 0.5683 0.6529 0.8140 0.5886 0.6558 0.6377

4500 0.8275 0.9385 0.6982 0.8558 0.5729 0.6839 0.8343 0.6037 0.6671 0.6435

5400 0.8630 0.9637 0.7163 0.8651 0.5784 0.7143 0.8531 0.6183 0.6767 0.6490

6300 0.8969 0.9877 0.7337 0.8745 0.5827 0.7415 0.8715 0.6316 0.6862 0.6534

7200 0.9295 1.0108 0.7503 0.8826 0.5864 0.7671 0.8884 0.6440 0.6951 0.6580

8100 0.9604 1.0328 0.7662 0.8902 0.5912 0.7909 0.9036 0.6557 0.7023 0.6623

9000 0.9900 1.0538 0.7813 0.8976 0.5940 0.8127 0.9181 0.6659 0.7101 0.6663

9900 1.0183 1.0739 0.7959 0.9044 0.5978 0.8332 0.9315 0.6760 0.7168 0.6701

10800 1.0454 1.0932 0.8097 0.9106 0.6012 0.8527 0.9432 0.6853 0.7241 0.6734

11700 1.0713 1.1116 0.8230 0.9170 0.6038 0.8709 0.9549 0.6938 0.7298 0.6766

12600 1.0961 1.1291 0.8357 0.9216 0.6064 0.8876 0.9660 0.7027 0.7356 0.6794

13500 1.1198 1.1459 0.8478 0.9266 0.6086 0.9028 0.9758 0.7099 0.7404 0.6831

14400 1.1424 1.1620 0.8593 0.9316 0.6119 0.9169 0.9847 0.7166 0.7452 0.6849

15300 1.1640 1.1774 0.8704 0.9358 0.6136 0.9302 0.9935 0.7232 0.7500 0.6881

16200 1.1847 1.1920 0.8810 0.9403 0.6158 0.9426 1.0024 0.7288 0.7543 0.6903

17100 1.2045 1.2061 0.8911 0.9440 0.6176 0.9549 1.0096 0.7348 0.7579 0.6921

18000 1.2234 1.2195 0.9008 0.9475 0.6196 0.9653 1.0162 0.7399 0.7615 0.6939

18900 1.2414 1.2323 0.9101 0.9512 0.6210 0.9751 1.0233 0.7449 0.7650 0.6953

19800 1.2587 1.2446 0.9189 0.9542 0.6228 0.9846 1.0286 0.7497 0.7683 0.6971

20700 1.2752 1.2563 0.9273 0.9569 0.6236 0.9934 1.0344 0.7535 0.7706 0.6994

21600 1.2910 1.2675 0.9354 0.9590 0.6252 1.0018 1.0394 0.7575 0.7738 0.7009

22500 1.3061 1.2782 0.9432 0.9615 0.6268 1.0094 1.0449 0.7615 0.7758 0.7017

23400 1.3205 1.2885 0.9505 0.9644 0.6274 1.0160 1.0490 0.7644 0.7785 0.7030

24300 1.3343 1.2983 0.9576 0.9663 0.6287 1.0226 1.0530 0.7675 0.7802 0.7046

25200 1.3475 1.3076 0.9644 0.9686 0.6292 1.0286 1.0572 0.7706 0.7825 0.7054

26100 1.3601 1.3166 0.9708 0.9705 0.6304 1.0348 1.0608 0.7739 0.7847 0.7061

V, 10-4 D/сек 0.49 0.35 0.25 0.15 0.08 0.47 0.31 0.22 0.16 0.09

Таблица 3 - Зависимость ПВ в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro для субстанции DD217.

Человечес кая плазма CDD217 в плазме, мкМ

0,0 0,05 0,075 0,10 0,125

ПВ, с

14,5 14,8 19,2 28,3 34,7

14,2 14,3 22,6 30,1 47,5

14,5 13,6 17,4 16,6 33,2

14,1 12,6 26,8 17,5 43,6

14 17,7 27,2 26,5 40,7

14,1 14,6 25,5 30,8 38,6

Обезьянья плазма CDD217 в плазме, мкМ

0,0 0,2 0,3 0,4 0,5

ПВ, с

14,5 14,8 19,2 28,3 34,7

14,2 14,3 22,6 30,1 47,5

14,5 13,6 17,4 16,6 33,2

14,1 12,6 26,8 17,5 43,6

14 17,7 27,2 26,5 40,7

14,1 14,6 25,5 30,8 38,6

Крысиная плазма Cdd217 в плазме, мкМ

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

ПВ, с

19,4 31,5 36,5 37,5 36,2 52,5

23,1 31,6 36 37,3 36,9 54,7

23,4 31,8 35,8 39 35,6 52,3

22,9 32,7 38,9 37,6 35,8 53,6

21,9 32,5 33,2 36,5 48,3 56,5

21,1 31,4 33,6 36,3 36,5 54,5

Таблица 4 - Зависимость ПВ в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro для субстанции Ривароксабан.

Плазма Сривароксабан в плазме, МкМ

0 0,1 0,25 0,5 1

ПВ, с

Человека 16,2 18,1 20,1 23,4 34,4

15,1 17,8 24,7 21,4 31,7

16,9 17,4 18 23,6 35,1

16,7 17,2 18,1 22,7 35,8

14,1 17,5 17,9 27 36,4

15,6 17,6 17,3 27,4 34,1

Обезьян 30,0 34,4 39,2 78,3 186,2

27,0 32,4 34,5 86,1 181,5

30,5 33,1 38 116,4 211,6

29,1 35,3 44,3 93,8 180,7

28,8 41,9 47,3 83,9 182,4

28,6 51,3 51,4 95,4 136,8

29,3 42,7 61,9 94 144,8

Крыс Сривароксабан в плазме, мкМ

0 0,2 0,5 1 2 4

ПВ, с

24,5 28,5 29,3 37,6 47,6 91,8

19,7 26,7 29,7 33,2 44,6 68,2

20,9 26,7 27 31,4 46,6 74,5

23,2 28 26,3 34,9 56,2 80,7

22 28,6 29,8 34,1 50,5 79

22,4 27,7 28,3 41,4 43,6 76,3

22,3 26,5 29,4 36 41,9 91,3

Таблица 5 - Амидолитическая активность в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro при добавлении фраксипарина (фраксипарин для подкожных

введений 2850 МЕ/ 0,3 мл (Санофи, Авентис).

Человечес кая плазма Сфраксипарина в плазме, МЕ/мл

0,0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0

D, у.е.

0,6745 0,4553 0,3363 0,283 0,1423 0,0634

0,6088 0,4685 0,3378 0,2131 0,1861 0,0669

0,6069 0,4285 0,3199 0,2954 0,128 0,057

0,6358 0,4462 0,3308 0,283 0,1002 0,0636

0,636 0,4914 0,2977 0,2664 0,1538 0,0662

0,7081 0,5676 0,3431 0,2634 0,1409 0,0907

0,6356 0,5017 0,3236 0,3212 0,1817 0,0684

0,6419 0,4828 0,2916 0,3022 0,2085 0,0707

Обезьянья плазма Сфраксипарина в плазме, МЕ/мл

0,0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0

D, у.е.

0,6488 0,5506 0,4132 0,3123 0,1237 0,0414

0,6088 0,4985 0,4595 0,3311 0,1221 0,1184

0,6548 0,523 0,3567 0,3366 0,1688 0,0575

0,657 0,598 0,4018 0,2741 0,1754 0,117

0,6268 0,5906 0,4179 0,3139 0,1546 0,0799

0,5552 0,5812 0,3513 0,3867 0,1492 0,1076

0,6547 0,6551 0,3461 0,3093 0,161 0,1016

0,6278 0,5453 0,4307 0,3032 0,1552 0,1327

Крысиная плазма Сфраксипарина в плазме, МЕ/мл

0,0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0

D, у.е.

0,4375 0,301 0,1194 0,0775 0,0164 0,0286

0,449 0,3284 0,2062 0,0792 0,0198 0,0272

0,4397 0,3292 0,1937 0,0921 0,0196 0,0413

0,4615 0,4464 0,2058 0,0864 0,0282 0,0273

0,4808 0,3532 0,2311 0,0926 0,0215 0,0301

0,4454 0,3357 0,205 0,1271 0,0215 0,0645

0,4724 0,4079 0,1593 0,1848 0,0408 0,0654

0,4842 0,3904 0,2345 0,0982 0,0324

Таблица 6 - Амидолитическая активность в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro при добавлении субстанции DD217. Изменения оптической плотности.

CDD217, мкМ

0,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0

D, у.е.

0,685 0,5515 0,6325 0,5292 0,586 0,4733

0,6939 0,6956 0,704 0,6678 0,2801

Человеческая плазма 0,7061 0,6803 0,6008 0,693 0,6303

0,6238 0,6315 0,5727 0,6341 0,3697

0,6979 0,6769 0,6978 0,6873 0,6984 0,4368

0,689 0,58 0,6129 0,6898 0,5606 0,3951

0,6947 0,6023 0,7686 0,7555 0,6448 0,4274

0,6346 0,6438 0,726 0,6955 0,6402 0,4873

CDD217, мкМ

0,0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0

D, у.е.

Обезьянья плазма 0,5931 0,4861 0,5412 0,4419 0,2825 0,0435

0,5095 0,4196 0,4678 0,4863 0,3078 0,0389

0,5942 0,4964 0,5672 0,3629 0,3882 0,0452

0,611 0,4426 0,4951 0,5672 0,0443

0,4946 0,4453 0,4468 0,4535 0,3212 0,0531

0,5646 0,5121 0,5046 0,539 0,2837 0,0432

0,5241 0,468 0,4817 0,5534 0,3587 0,0499

0,5546 0,4825 0,4682 0,4848 0,3343 0,0456

Крысиная плазма CDD217, мкМ

0,0 0,25 0,5 1,0 2,5 5,0

D, у.е.

0,5236 0,6052 0,5714 0,5879 0,2303 0,0459

0,5115 0,5969 0,5748 0,5931 0,2517 0,0433

0,598 0,6388 0,5938 0,5918 0,044

0,5444 0,6011 0,5662 0,615 0,0557 0,0402

0,5277 0,6038 0,5815 0,6061 0,2425 0,0465

0,6092 0,6224 0,6162 0,605 0,2586 0,0458

0,5194 0,6073 0,6038 0,529 0,255 0,048

0,4842 0,3904 0,2345 0,0982 0,0324

Таблица 7 - Амидолитическая активность в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro при добавлении субстанции Ривароксабан. Изменения оптической плотности.

Человеческая плазма СРивороксабан, мкМ

0 0,2 0,5 1 2 4

D, у.е.

0,7495 0,7066 0,6392 0,7138 0,5817 -0,0819

0,6636 0,7195 0,7421 0,6229 0,5851 0,1331

0,7602 0,7191 0,6339 0,6579 0,5936 0,1432

0,7646 0,7514 0,6572 0,7001 0,4757 0,123

0,7767 0,7218 0,6259 0,7332 0,6002 0,1335

0,7121 0,7663 0,6579 0,4761 0,6401 0,1674

0,759 0,7537 0,6513 0,7049 0,5588 0,109

0,7446 0,7807 0,6699 0,7265 0,6073 0,1512

СРивороксабан, мкМ

0 0,2 0,5 1 2 4

D, у.е.

0,6554 0,6921 0,7013 0,6565 0,4697 0,4701

0,6371 0,7736 0,7251 0,6291 0,5379 0,2946

Обезьянья плазма 0,6627 0,765 0,6755 0,7529 0,6239 0,4479

0,718 0,5929 0,7029 0,7738 0,6165 0,4685

0,7832 0,7837 0,7491 0,7658 0,593 0,3785

0,7961 0,8021 0,72 0,7721 0,487 0,4933

0,7747 0,8117 0,7761 0,7325 0,3888 0,4621

0,6603 0,8061 0,7763 0,7393 0,7031 0,5163

СРивороксабан, мкМ

0 0,2 0,5 1 2 4

D, у.е.

0,4957 0,4762 0,5144 0,3413 0,2196

0,5857 0,6645 0,573 0,5554 0,4662 0,3374

Крысиная плазма 0,5817 0,6247 0,5819 0,5665 0,4943 0,3286

0,5647 0,5981 0,5887 0,5295 0,548 0,3345

0,55 0,5992 0,6036 0,5719 0,4925 0,318

0,5873 0,5513 0,6097 0,5815 0,4925 0,3252

0,5864 0,624 0,5156 0,5976 0,4836 0,3166

0,5238 0,5735 0,4481 0,3001

Таблица 8 - Амидолитическая активность в плазме человека, крысы и обезьяны in vitro при добавлении субстанции DD217 (Анти-фактор Ха активность, ЕД/мл), полученная с помощью калибровочных кривых (таблицы 5 и 6).

Сээ217 в плазме, мкМ