Синаптонемный комплекс как индикатор хромосомной изменчивости тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук в форме науч. докл. Коломией, Оксана Леонидовна

• Коломией, Оксана Леонидовна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Коломией, Оксана Леонидовна

Актуальность проблемы. Синалсис гомологичных хромосом — ключевое событие профазы I мейоза, обеспечивающее кроссинговер и формирование хиазм. Не менее важным событием профазы 1 мейоза являртла ТТАГ>ИИ0|ТГГМР уплитллг* — ппптталл ииллатптто xivttott т> imnnT-TAUTQ

V Л Ч//1 ^WXlXXMliVllV rt^VAUWVAU llp'J^VVVj AJXJ. VWlÚfillU JJIWIU/J, IWvjyjlVlllW цию, сегрегацию гомологов и последующее сбалансированное распределение генетического материала в гаметах.

Синапсис, рекомбинация и десинаисис хромосом — процессы, связанные с функционированием синаптонемного комплекса (СК) — специфической структуры, располагающейся между двумя гомологичными хромосомами в профазе I мейоза.

СК был открыт Moses (1956). Первоначально методом исследования СК был электронно-микроскопический анализ и реконструкция ультратонких срезов, выявивший больше сходства, чем различий, в структуре СК у представителей весьма отдаленных систематических групп. СК обнаружены у представителей всех царств зукариот: животных, растений и грибов (Moses, 1958; von Wettsíein et al., 1984). Эволюционная консервативность СК подтверждена данными биохимических и им-муноцитохимических исследований (Moens, 1992; Sato et. al., 1995).

В совокупности накопленные сведения позволяют рассматривать СК как древнейшее прогрессивное морфофизиологическое приобретение, возникшее на заре эволюции зукариот и сохранившее свое значение во всех систематических группах зукариот от простейших, появившихся в протерозое, до современных форм млекопитающих, появившихся в кайнозое.

В 1973 г. Counce & Meyer предложили новый метод анализа мейоти-ческих хромосом в профазе I мейоза, заключающийся в распластывании мейотических хромосом на поверхности гипотонического раствора • с последующим контрастированием и анализом поведения осевых элементов хромосом и СК. СК является своеобразным скелетом мейоти-ческого бивалента, поэтому конфигурация осевых элементов, приобретающих роль боковых элементов в структуре СК, служит парадигмой поведения гомологов'*на стадии профазы I мейоза. На основе метода, сложенного Counce & Meyer, удается проследить все детали фор-'рования осевых элементов, начало их физического сближения и си-сиса на стадии зиготены, синапсис и его коррекцию у гетерозигот ? хромосомным перестройкам на стадии пахитены и динамику деси-усиса хромосом на стадии диплотены.

Структурные изменения хромосом играют важную роль в мёйоти-•постмейотических процессах. Многочисленные данные свиде-твуют о том, что события, определяющие эволюцию кариотипа, ты с презиготической селекцией (Демин и др., 1978). На основе за СК в распластанных препаратах были сделаны фундаменталь-"крытия современной цитогенетики: открыто явление синаптической пригонки у гетерозигот по инверсиям и дупликациям (Moses & Poorman, 1984) и явление ареста и селекции клеток на стадии пахите-ны (Forejt et al., 1981), вскрыты причины нарушения гаметогенеза на стадии профазы I у анеуплоидов и отдаленных гибридов. Получены данные, позволяющие прогнозировать влияние гетерозиготности по хромлрпмным ттр.пргтппйнгам вгя Л1^птиттт.млгтч. nf.irnsc.tra vühhtuuv тл

----•. ~, - —. r ~--------------------М--г„. ~ —------- — —, . i- ^ тений (Navarro et al., 1981; Chandley, 1982; Федотова и др., 1991), доказана зависимость интерференции кроссинговера от непрерывности СК в биваленте (Moeiis, 1985; Бородин. 1992; Горлов. 1993; Maguire. 1996).

Формирование СК находится под контролем генов мейоза. Анализ СК растений позволил во многих случаях точно идентифицировать истинную природу мутаций, имеющих одинаковый или близкий фенотипический эффект (Федотова, 1988; Гребенникова, Голубовская, 1991 и др.).

В последние годы возрос интерес к биохимии и молекулярной организации С К (Rose et al., 1990; Dobson et al., 1994; Mocns, 1994;* Heyting, 1996). Однако при всем обилии данных о молекулярной организации СК вопрос о закономерностях реорганизации и роли отдельных структурных компонентов СК в процессе синапсиса хромосом остается неясным, а судьба осевых элементов хромосом на стадии поздней диплотены практически не обсуждалась: признанным оставалось представление об их деструкции (Holm, 1986).

Успехи, достигнутые цитогенетикой на основе анализа СК, свидетельствуют о перспективности использования этого метода для изучения хромосомной изменчивости, механизмов дифференциального воспроизведения генотипов и эволюции кариотипов. Этот метод нашел применение для решения актуальных проблем генетической безопасности (Allen et al., 1982).

Описанный круг проблем определил цели и задачи настоящей работы.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследование закономерностей синапсиса хромосом в профазе 1 мейоза и выявление таких деталей структуры и поведения осевых элементов хромосом и СК, которые могут служить маркерами хромосомной изменчивости и свидетельствовать о презиготической селекции и нарушении фертильности. Кроме того, были проведены иммуноцито-химкческие исследования, целью которых было выяснение вопросов о структурной организации С К, динамике изменения структурных компонентов СК в течение профазы I мейоза и эволюционной консервативности структурн ых компонентов С К.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем. 1. Исследовать закономерности синапсиса хромосом у гетерозигот по хромосомным транслокациям, в том числе у гетерозигот по микроаберрациям.

2. Проанализировать взаимосвязи между изменчивостью хромосом, особенностями синапсиса хромосом, плодовитостью и процессами видообразования на основе исследования СК у гибридов разно-хромосомных форм слепушонок вида Ei'lobius tancrei рода Ellobius (Rodentia, Mammalia).

3. Провести сравнительный анализ структуры и поведения СК половых хромосом в профазе I мейоза у представителей трех видов слепушонок рода Ellobius, проанализировать возможные пути эволюции ТТОТТОВЬПГ ХПОМОСОМ В Г7ТЮЛÎ1, Л,'! \ этого ооца.

4. Исследовать закономерности формирования осевых элементов и СК В-хромосом к поовести анализ озспределения В-хромосом на разных стадиях профазы I мейоза у лесной мыши Apodemus peninsulae (Muridae, Rodentia).

5. Исследовать действие различных мутагенных факторов, в том числе химических мутагенов, являющихся ингибиторами структурно-функциональных компонентов СК и хроматина, на структуру хромосом и СК.

6. Проанализировать эффективность выявления хромосомных аберраций с помощью электронно-микроскопического анализа СК на стадиях зиготены-диплотены у самцов домовой мыши (Mus muscuhis), подверженных действию радиационного облучения, и сравнить их с возможностями анализа хромосомных аберраций на стадиях диа-кинеза-метафазы I.

7. Исследовать особенности формирования СК у мужчин с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза неясной этиологии, установить стадию и, по возможности, причины нарушения сперматогенеза.

В. Проанализировать закономерности поведения осевых элементов хромосом и СК у асинаптических и десинаптических мутантов ржи Secale cereaîe.

9. Исследовать формирование аутоиммунных антител против антигенов структурных компонентов СК у интактных самцов мыши и после сингенной иммунизации самцов мыши антигенами СК.

10. Исследовать распределение антигенов RecA-подобных белков в ядрах сперматоцитов у самцов млекопитающих, принадлежащих к разным таксономическим группам млекопитающих.

Научная новизна. Получены и интерпретированы новые данные о закономерностях синапсиса хромосом в мейозе. Выявлена динамика становления структуры СК-мультивалентов у грызунов, гетерозиготных по робертсоновским, реципрокным и нереципрокным транслокациям; выявлена задержка формирования осевого элемента хромосом в зоне транслокаций на стадиях зиготены и ранней пахитены, приводящая к отставанию синапсиса хромосом в районах транслокаций и формированию псевдобивалентов и тривалентов. Описаны детали реституции транспонированных хромосом на стадии поздней пахитены.

Впервые описана картина синапсиса хромосом у гибридов разно-хромосомных форм слепушонок Е. 1апст, гетерозиготных по разному числу Шз-метацентриков. Впервые обнаружено явление формирования цепочек СК-тривалентов, соединенных друг с другом на счет гетероло-гичного синапсиса между короткими (С-гетерохроматиновыми) плечами акроцентриков. дЗу'^Нйд ^хруГчлууи ¿1 ^ИИсиГС!!^ л]Х5МиСиГ*1 у С и Г»1аДТрСл шш^й слепушонок рода ЕИоЫш, характеризующегося уникальной дивергенцией половых хромосом: Е. /шсосарПт (XX — у самок, ХУ — у самцов), Е. Ыезсет (КО — у обоих полов) и Е. ¡апсш (XX — у обоих полов). Особенности синапсиса половых хромосом позволили предположить, что дивергенция хромосомного механизма определения пола берет качало от общего предка рода с обычными для грызунов формулами (XX — у самок, ХУ — у самцов).

Обнаружено, что уникальные половые хромосомы (XX) у самцов Е. 1апсге1 формируют в профазе I мейоза нетипичный для самцов других видов млекопитающих закрытый половой бивалент. Сделано заключение, что гомозиготность дистальных районов XX хромосом, приводящая к формированию закрытого полового бивалента, служит эволюци-онно-адаптивным приспособлением, которое способствует прохождению профазы 1 мейоза у гетерозигот по множественным КЬ-трансло-кациям у Е. ¡апсгек поддержание в природе робертсоновского веера с 2п = 54 до 2п = 32; скрещивание между собой отдаленных форм этого надвида и может служить объяснением неучастия половых хромосом в формировании ЯЬ-метацентриков.

Установлено, что В-хромосомы у самцов восточно-азиатской мыши Аробетш решши1ае на стадии пахитены формируют уни-, би- и муль-тиваленты, которые ассоциируют с половым (Х,У) бивалентом, что, однако, не препятствует формированию полового пузырька и не вызывает ареста клеток на стадии пахитены. Впервые описано явление увеличения числа В-хромосом в процессе профазы I мейоза.

При анализе СК у стерильных самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям в Т-локусе хромосомы 17 пары, показана неслучайность ассоциации аутосомного бивалента с ХУ-бивалентом и арест сперматогенеза на стадии пахитены.

Впервые выявлена модификация боковых элементов СК на стадии диплотены: показано, что в участках, визуализированных до сих пор как бреши в структуре СК, происходит трансформация боковых элементов в длинные тонкие осевые элементы, поддающиеся контрастированию только кислым раствором Аз>ТО3 и, формирующие в материнских клетках пыльцы спирали, а в сперматоцитах мыши вытянутые волнистые оси.

Впервые описан блок десинапсиса хромосом у человека. Блок деси-напсиса хромосом экспериментально воспроизведен у самцов мышей путем введения им ингибиторов ДНК-топоизомеразы II.

На основании собственных иммуноцитохимических исследований СК на разных стадиях профазы I мейоза и данных литературы сделано ПрСДГЗОЛОЖСКЙС О МОДйфйКйЦЙК МОЛб^ЛЯрНОЙ ОрГйНйЗиЦИК СК к хроматина при переходе клеток от стадии пахитен ы к стадии диплотены. В частности, нами впервые выявлено уменьшение 11есА-подобных антигене р. в яцоах от стадии летттотекы к стадии пяхитены и отсутствие их на стадии диплотены.

Практическая ценность работы. Разработаны критерии идентификаций структурных перестроек хромосом на ранних стадиях профазы 1 мейоза на основе анализа конфигурации СК и возможного вклада аберрантных конфигураций СК и их ассоциаций с половым (XV) бивалентом в нарушение фертильности самцов животных.

Метод анализа СК использован для диагностики причин мужского бесплодия. При исследовании СК мужчин с нарушением сперматогенеза и нормальным кариотипом (46 ХУ) у разных пациентов обнаружено блокирование мейоза на разных стадиях: от лептотены до диплотены. Показана связь между развитием аутоиммунного процесса и нарушением синапсиса хромосом. Описанные случаи позволяют предполагать наличие асинаптической и десинаптической мутаций, а также микроаберраций в генотипах отдельных пациентов.

Показано, что эффективность метода выявления структурных перестроек хромосом на основе СК в 2 и более раз превосходит эффективность анализа перестроек на стадиях диакинеза-метафазы Г. Проанализированы причины различий результатов, полученных этими методами.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983, 1985, 1987, 1990), II Международном конгрессе по клеточной биологии (Токио, 1984), II Европейском конгрессе по клеточной биохимии (Будапешт, 1986), IV Всесоюзном конгрессе Териологического общества (Москва, 1986), V съезде ВОГИС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987), XVI Международном генетическом конгрессе (Торонто, 1988), Всесоюзном совещании по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990), на конференции сексопатологов (Харьков, 1990), IV Всесоюзном съезде урологов (Москва, 1990), III Съезде Всесоюзного общества медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), Конференции по радиационной генетике (Обнинск, 1990), Международном симпозиуме "Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологаческих исследованиях (Москва, 1992), Всероссийской конференции "Функциональная морфология клетки" (Санкт-Петербург, 1993, 1996), на семинарах Института общей генетики РАН.

Объем и структура работы. В представляемом докладе обобщены данные 49 работ, опубликованных в журналах Доклады АН СССР, Генетика, Онтогенез, Цитология, Известия АН MCCP, Chromosoma, Cytogenetics and Ceil Genetics, Mutation Research, Genetica (Netherlands), Genome, Theoretical and Applied Genetics и других отечественных и зарубежных изданиях в 1983 1997 гг. В тексте доклада ссылки на данные из списка опубликованных работ обозначены цифрами в косых скобках.

Все экспериментальные данные, касающиеся электронно-микроскопического анализа О К, с вето - и электронно-микроскопического км-муноцитохимического анализа антигенов СК, получены автором лично. Скрещивания животных, анализ их плодовитости и исследование хромосом на стадии диакинеза-метафазы I животных проведены соавторами исследований.

Автор выражает глубокую благодарность соавторам исследований и исследователям, принимавшим участие в обсуждении полученных результатов и предоставивших материал для исследования: Ю.Ф. Богданову, Н.Н. Воронцову, Е.Я. Гречаниной, Л.Ф.Курило, Е.А. Ляпуновой, Ю.М. Борисову, М.Д. Померанцевой, В.А. Шевченко, И.Ю. Баклушин-ской, Т.Э. Борбйеву, Г.Г. Горач, С.Я. Дадашеву, Е.И. Каликинской, О.И. Карповой, Е.Ф. Лосевой,Т.Ф. Мазуровой, Т.В. Пащенко, Л.Д. Сафроно-вой, Т.В. Сухачевой, Ю.С. Федотовой.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1. Материалом электронно-микроскопического исследования СК служили:

• самцы слепушонок Е. fuscocapillus; Е. talpinus; Е. lutescens;

• самцы разнохромосомных форм слепушонок Е. tancrei с 2п=54 и

2п—34 к Fj (2п=44) от скрещивания этих форм;

• самцы с 2п = 49 F, гибриды от скрещивания форм 2n=50 х 2п=48;

• самцы Fj от скрещивания слепушонок, отличающихся по одной паре хромосом: с 2п=51 от скрещивания Е. alaicus 2n=52 х 2n=50 Е. tancrei и гибридов Fj 211=33 от скрещивания двух форм Е. tancrei 2n=34 X 2п=32;

• девять гибридов F2 от свободного скрещивания внутри Fp а также в результате возвратного скрещивания гибридов Ft с родительскими формами. Все представители рода Ellobius отловлены из природных популяций, скрещены, и кариотипированы проф. Н. Н. Воронцовым, к.б.н. ЕА. Ляпуновой и к.б.н. И.Ю. Баклушинской (ИБР РАН);

•мцы восточно-азиатской мыши, отловленные в 15 км к-з. от Красноярска (самцы № 1-6), и на Алтае пос. Артыбаш (самцы № 7, 8). Животные предоставлены для исследования и кариотипированы д .б.н. Ю.М. Борисовым (НПО "Енисей", Красноярск) и к.б.н. Т.Э. Борби-евым.

• самцы мыши, дигетерозиготные по мутациям в Т-локусе хромосомы

17 пары г5/^"'', гРз-уг18), предоставленные для исследования к.б.н. Л.Д. Сафроновой (ИПЭЭ РАН).

• самцы лабораторной мыши, экспонированные в период эмбриогенеза в районе ЧАЭС в течение 22 сут. (с 9.У1.-1.УИ.1988) и самцы мыши из потомства Рр полученные от скрещивания облученных самцов мышей с иеоблученными самками и отобранные для исследования СК после выявления у них снижения плодовитости. Исследование клеток на стадии метафазы I и анализ плодовитости проведены д.б.н. М,Д. Помеоакцевой и к.б.н^ Е,И. Кзлики некой (ИОГен РАНУ

• самцы лабораторной мыши после введения неоаквасепта препарата, предназначенного для обеззараживания питьевой воды;

• самцы лабораторной мыши после введения вдриамицина и препарата Ут-26, являющихся ингибиторами ДНК-топоизомеразы II;

• биоптаты семенников и эякуляты, полученные от 36 мужчин с нормальным кариотипом и нарушением фертильности. Предварительный спермиолошческий анализ проведен проф. Л.Ф.Курило с сотр. (МГНЦ РАН);

• мейотические мутанты ржи (ву1, 8уЗ, &у9), предоставленные для исследования д.б.н. С.П. Соснихиной (С.-Пб. ГУ).

• препаративно выделенные СК самцов мыши.

2. Проведено электронно-микроскопическое иммуноцитохимическое исследование локализации антигенов КесА-подобных белков в распластанных ядрах сперматоцитов и светомикроскопическое иммуноцитохимическое исследование аутоантиел против антигенов С К. Антитела против антигенов КесА-подобных белков получены и предоставлены д.б.н. В.И. Башкировым и к.б.н. Е.Ф. Лосевой (ИБГ РАН). Антитела против антигенов СК получены к.б.н. С.Я. Дадашевым (ИОГен РАН.

Использованные и разработанные нами методы подробно описаны в работах, список которых приведен ниже.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Половые хромосомы самцов млекопитающих

Представление о деталях поведения половых хромосом в профазе I мейоза важно для понимания механизмов определения пола у каждого конкретного вида животных и для уточнения систематико-эволюцион-ных взаимоотношений близких видов животных /2, 10—12, 19, 29, 34/. Известно, что в отдельных систематических группах изменчивость ге-терохромосом сыграла важную роль в эволюции кариотипов (УогоМвоу е1 а1., 1980; Борисов, 1992).

Совокупность деталей поведения половых (X, У) хромосом в профазе! мейоза у самцов: время начала и конца синапсиса; симметричность и асимметричность синапсиса X и У хромосом; локализация точек инициации синапсйса; характеристика ассоциации осей половых хромосом в поздней пахитене-диплотене может служить основой для вдентификации участков эффективного (приводящею к кроссинговеру) и неэффективного синапсйса. Ассоциация половых хромосом X и Y в зиготене-диллотене носит видоспецифический характер, вместе с тем общий сценарий процесса формирования полового пузырька в целом повторяется (Ashley <х ¡.«oses, 1980; Sharp, 1982; Haie & Greenbaum, 1986; Ахвердян, 1993). Детали поведения осевых элементов половых хромосом служат основой идентификации стадии зиготены-днплстены у самцов млекопитающих.

У большинства видов инициация синапсиса между X и Y хромосомами осуществляется с прителомерных участков хромосом и распространяется интерстициально, однако у Peromyscus «itkensis и Cricetulus mjgratorius Pallas описана интерстициальная инициация синапсиса (Hale & Greenbaum, 1986; Ахвердян, 1993).

По типу ассоциации X и У хромосом в профазе I мейоза млекопитающих можно условно разделить на две основные группы. К первой группе относятся млекопитающие, у которых синапсис между X и Y хромосомами не происходит. Их ассоциация ограничивается локализацией X и Y хромосом внутри полового пузырька, как это описано, у некоторых сумчатых млекопитающих (Sharp, 1982) и полевок рода Microtus, у таких видов электронно-плотный материал, окружающий X и Y хромосомы определяет их коориентащпо лишь частично: у полевок на стадии метафазы I обнаружены униваленты половых хромосом (Бородин и др. 1991). У других видов ассоциация X и Y хромосом выражается конфигурацией конец-в-конец, например, у самцов Psammomus obesas (Ashley, Moses, 1980).

Ко второй группе относятся млекопитающие, у которых синапсис X и Y хромосом на стадии пахитены приводит к формированию СК (рис .1). У некоторых видов, в частности у Peromescus sikensis в зоне СК между псевдоаутосомными фрагментами X и Y хромосом формируется хиазма (Hale & Greenbaum, 1986).

Точное представление о деталях поведения половых хромосом у конкретного вида млекопитающих существенны для точной идентификации изменений структуры и поведения половых хромосом при различных экспериментальных воздействиях. Исследования поведения половых хромосом в профазе I у гетерозигот по хромосомным аберрациям приобрели особое значение в связи с открытием явления пахитенного ареста.

Пахитенный арест /2, 6, 8, 17, 21, 39, 42-44, 47-49/. У самцов млекопитающих и мужчин с нарушением фертильности, обусловленной гетерозиготностью по хромосомным аберрациям, наблюдается ассоциация гетероморфных би- и мультивалентов с X хромосомой (Lifschytz & Lindsley, 1972; Forejt et al., 1977; 1981 Forejt 1984). Такая ассоциация сопряжена с "неплановой" активацией (неактивной в норме) X хромосомы, выражающейся в транскрипции трех энзимов, гены которых локализованы на X хромосоме (Hota & Chandley, 1982). Акти ' / " Рис. 1 Тотальный пре

4 парат СК самца мыши. * ' ' Стадия поздней пахи

-.■/ у ' тены. 19СКаугосоми половые хромосомы (ХУ) формируют половой пузырек. Хромо-центры отмечены звездочками. ' вация X хромосомы морфологически выражается в утолщении участка осевого элемента X хромосомы, ассоциирующего с осями гетероморф-ных би- и мультивалентов. Ассоциация X хромосомы с аутосомами приводит к "заякориванию" полового бивалента среди аутосом, и в конечном итоге блокирует формирование полового пузырька.

Сперматоциты, в которых половой пузырек не формируется, дегенерируют (КюЫег е1 а1., 1989). При обозначении этого явления принято использовать утвердившийся в литературе термин "пахитенный арест".

При исследовании стерильных гибридов самцов мышей, гетерозиготных по двум инверсиям, обнаружен высокий уровень ассоциаций ауто-сомных бивалентов с половым бивалентом, а при гистологическом исследовании отсутствие сперматоцитов II порядка, сперматид и спермиев. Таким образом, явление пахитенного ареста было обнаружено и у гетерози-шт по внугрихромосомным аберрациям (СЬапШеу, 1982).

Пахитенный арест играет значительную роль в процессе хромосомного видообразования, снижении фертильности мужчин и самцов млекопитающих, гетерозиготных по хромосомным аберрациям.

В последующих разделах будут рассмотрены собственные данные, свидетельствующие о том, что механизм пахитенного ареста у самцов млекопитающих со стандартным типом определения пола носит более универсальный характер: селекция сперматоцитов 1 порядка посредством этого механизма может осуществляться и при нарушениях синапсиса аутосом, обусловленных не только гетерозиготностью по хромосомным аберрациям. Вопрос о реализации механизма пахитенного ареста у гетерозигот по внугрихромосомным микроаберрациям долгое время оставался открытым.

Пахитенный арест у самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям /10/. Нами предпринято электронно-микроскопическое исследование С К трех стерильных самцов мыши, дигетерозиготных по мутациям в Т-локусе (t12/tw18; а; twp-a/tw18) хромосомы 17 пары. При сек-венировании ДНК у t-мутантов обнаружены две неперекрывающиеся микроинверсии размером 2 тпн (Fox et al., 1985).

Никаких нарушений в структуре СК 17 пары хромосом не обнаружено. Вместе с тем, в 73% клеток выявлена ассоциация СК бивалента 17 ' пары хромосом с половым бивалентом или его локализация вблизи полового бивалента. Была показана неслучайность этих событий (Р<0,001). Обнаружены клетки, дегенерирующие на стадии поздней пахитсны-диплотены. Таким обоазом. впервые пои анализе СК обнапужены пои-знаки пахитенного ареста у стерильных самцов мыши, гетерозиготных по микроаберрациям.

Половые хромосомы слепушонок рода Ellobius /19/

Электронно-микроскопиче-ски были исследованы тотальные препараты СК трех видов слепушонок рода Ellobius, характеризующегося уникальной для млекопитающих дивергенцией половых хромосом.

Афганская слепушонка Е. fuscocapillus, 2п=36 характеризуется обычной для млекопитающих мужской гетерогаметностью (XY) и женской гомогаметностъю (XX) (Vorontzov et. al., 1980).

Горная слепушонка Е. lutescens вид, ранее считавшийся конспецифич-ным с Е. fuscocapillus, имеет уникальный для млекопитающих кариотип с нечетным числом хромосом у обоих полов 2n=17, ХО (Mattey, 1953). Относительная длина 9-й непарной, самой короткой хромосомы и характер распределения G-полос по ее длине свидетельствуют о ее принадлежности к Х-хромосоме (Matthey, 1953; Wolf et al., 1979; Vorontsov et al., 1980; Djalali et al., 1986; Vogel et al., 1988).

Восточная слепушонка E. tancrei, надвид, для которого описан робер-тсоновский веер хромосомных форм, а половые хромосомы XX идентичны у самцов и самок всех кариоморф как по длине, так и по распределению G-полос (Lyapunova & Vorontsov, 1978; Ляпунова и др., 1984).

Приступая к анализу СК у представителей трех видов рода Ellobius, мы полагали получить ответы на следующие вопросы. Имееются ли какие либо особенности поведения половых хромосом X и Y у самцов Е. fuscocapillus, атипичные для самцов млекопитающих? Каким образом осуществляется синапсис изоморфных по G- и С-окраске половых хромосом XX у самцов Е. tancrei? Каков сценарий поведения полового бивалента у самцов Е\ tancrei? Формирует ли унивалент X хромосомы Е. lutescens ассоциации с аугосомами и формирует ли X унивалент половой пузырек?

Половые хромосомы (XY) самцов Ellobius fuscocapillus /19/. Оси X и у хромосом у самцов Е. fuscocapillus удается идентифицировать, начиная со стадии средней зиготены, когда они пересекаются в одной точке. Осевой элемент Y хромосомы окрашен интенсивнее осей остальных хромосом. Эта особенность ультраструктуры Y хромосомы сохраняется на протяжении зиготены и пахитены. В конце ранней иахите-ны в синапсис включается 100% длины оси У хромосомы и около 40% X хромосомы. Более интенсивное окрашивание оси У хромосомы в составе СК позволяет говорить о формировании так называемого асимметричного — неэффективного (не приводящего к формированию хиазмы) синансиса половых хромосом (То$ер11& СИ^апсПеу, 1984' Зо1ар & КасЬ, 1984). Об отсутствии хиазмы свидетельствует и преждевременный десинапсис осевых элементов X И У хромосом уже на стадиях поздней пахитены-диплотены. На этих стадиях половые хромосомы выселялись на периферию ядра, утолщенные осевые элементы X и У хромосом лежали на расстоянии 1-3 мкм. Электронно-плотный материал вокруг половых хромосом не выражек (рис.2а).

Половой бивалент (XX) самцов ЕНоШиэ Ыпсге'1 /1, 4, 5, 19, 33/. У двух кариоморф слепушонок Е. 1апсге1 с разными числами хромосом 2п=54 и 2п=34 и гибридов между ними детали ультраструктуры и пове-дсния осси полового бивалента идентичны. Половой бивалент легко идентифицируется, начиная со стадии поздней зиготены, когда синапсис аутосом еще не завершен. Оси полового бивалента, для которых характерна идентичность О-полос (Ьуаршюуа & УогоЩвоу, 1978), синаптируют в соответствии с их идентичностью: кинетохоры этих хромосом располагаются в формирующемся СК друг против друга. Синапсис между осями XX хромосом осуществляется с обоих концов бивалента, что приводит к формированию закрытого полового бивалента. Однако в центральной части полового бивалента, начиная с момента его формирования и вплоть до диплотены, сохраняется обширная зона асинапсиса. Ультраструктура боковых элементов С К XX бивалента в зоне синапсиса идентична структуре СК аутосомных бивалентов. В зоне асинапсиса осевой элемент одной из хромосом имеет целостную непрерывную структуру, а второй прерывист, и на нем постепенно формируется ядрышкоподобное тельце (рис. 2Ь).

Начиная со стадии средней пахитены, половой бивалент, который и на более ранних стадиях пахитены располагался обособленно по отношению к аутосомным бивалентам, постепенно формирует половой пузырек, который занимает место на периферии клетки. Вокруг него формируется облачко электронно-плотного материала. Короткие участки СК с одного или двух концов полового бивалента сохраняются и на стадии диплотены, а асинаптирующие участки осей половых хромосом удлиняются, переплетаются и формируют клубок.

Таким образом, XX хромосомы Е. 1апсгел, изоморфные по величине и рисунку распределения С- и О-полос, не синаптируют полностью, как это описано для самок млекопитающих, а осевые элементы этих хромосом проявляют признаки не только морфологических, но и

Риг* 7 Половые ХООМОСОМЫ СйМЦОВ СЛТСИуПТОНО^ й — н?^* менный десинапсис X и У хромосом у Е1. /иясосарШш; Ь - закрытый половой (XX) бивалент Е1. Iапсгек с — половой унивалент (ХО) Е1. Ыехсепа. функциональных различий, и наконец, в отличие от самок млеко пи-тющих, половые XX хромосомы самцов демонстрируют мужской тип поведения полового бивалента — формируют половой пузырек, который локализуется на периферии ядра уже на стадиях поздней зиготе-ны-ранней пахитены.

Половой унивалент (X, 0) самцов ЕИоЫив ¡Шеэсепз /19/. В тотальных препаратах СК сперматоцитов Е. к^евсеш половой унивалент — осевой элемент самой короткой непарной 9-й X хромосомы обосабливается и легко идентифицируется, начиная со стадии ранней пахитены, по относительной длине и дифференцировке структуры его оси: ось полового унивалента утолщена и формирует мелкие шпильки. На стадии пахитены ось полового унивалента постепенно утолщается и приобретает О-, С-, У-образную конфигурацию, унивалент выселяется на периферию ядра, вокруг оси X хромосомы формируется зона электронно-плотного материала. Таким образом, унивалент X хромосомы формирует половой пузырек. На стадии поздней пахитены-ран-ней диплотены ось унивалента имеет дву-, трех- или четырехнитчатую структуру (Рис. 2 с).

Эволюция половых хромосом слепушонок рода ЕИоЫиз /19/. Систематически род Е11оЫш единственный из ныне живущих родов трибы Е11оЫш подсемейства Мкмойпае. Диплоидные числа хромосом 2п=54—56 свойственны многим представителям других триб МкжЛшае. Однако все Мсгойш и НЬпш характеризуются стандартным типом гетерохромосом (XX, ХУ). Преемственность аутосом у Е. 1а1ртт (2я=КР=54) и высоко-хромосомной кариоморфы Е. 1апст (2п=54, №=56) позволяет предположить, что аутосомный набор этих форм претерпел незначительные изменения на пути эволюции кариотипа от общих предков всех МгскЛцц. Однако на пути эволюции к современному комплексу Е, 1а1ртш ~Е. 1апст, половые хромосомы претерпели загадочные трансформации к типу (XX, XX).

Трансформация кариотипа в этой филогенетической линии служит примером мозаичности эволюции — сохранение анцестрального типа аутосом при преобразовании половых хромосом (Ьуарипоуа л а!., 1980).

Наиболее вероятной представляется версия, согласно которой, изоморфизм половых хромосом возник у предков Е. íalpinus—E. tancrei как новообразование.

Бесспорная систематическая близость представителей подрода Afgano-mys Е. fuscocapillus и Е. lutescens позволяет предположить, что резкое снижение числа аутосом могло произоити в результате множественных хромосомных транслокаций. В пределах надвида Е. tancrei от формы с 2п=54 путем множественных Rb-транслокаций возникла форма с 2п:=34. Подобная взрывная эволюция аутосом представляется вероятной и у предков Е. lutescens (Vorontsov & Lyapunova, 1984).

Е. fuscocapillus в отличие от предыдущей группы сохранил предко-вый тип половых хромосом, испытав при этом множественные перестройки аутосом на пути от 54 к 36-хромосомному кариотипу (Vorontsov et al., 1980).

Абсолютная и относительная длина половых хромосом X и Y у самцов слепушонок Е. fuscocapillus, а также рисунок G-сегментов позволяют отнести их к стандартному типу половых хромосом, согласно классификации Pathak & Stock (1974); Lyapunova & Vorontsov, 1978; Vorontsov et al., 1980.

Однако в поведении половых хромосом самцов Е. fuscocapillus в профазе I мейоза отмечен ряд черт, атипичных для млекопитающих, а именно: отсутствие хиазмы между X и Y хромосомами, формирование унивалентов половых хромосом уже на стадии диплотеньт и отсутствие электронно-плотного материала вокруг половых хромосом. Перечисленные особенности поведения X и Y хромосом в профазе I мейоза могут служить причиной неправильного расхождения X и Y хромосом на стадии анафазы I.

Е. fuscocapillus является единственным из трех ныне живущих видов рода Ellobras, сохранившим предковый тип определения пола. В связи с этим логичным представляется предположение о том, что Е. fuscocapillus унаследовал от общего предка и специфичные для него особенности поведения половых хромосом. Тогда одним из объяснений уникальной дивергенции механизмов определения пола в пределах рода Ellobius может служить высокая вероятность ошибок в расхождении хромосом у общего предка трех видов этого рода. Такие ошибки могли приводить к повышенной частоте формирования гамет 00, Х0 и зигот Х0 и XX и в конечном итоге утрате Y хромосомы предками Е. tancrei и Е. lutescens.

Особый интерес представлял вопрос о том, присутствуют ли в ка-риотипах Е. lutescens и Е. tancrei Y хромосома или ее фрагмент? Castro-Sierra & Wolf (1968) предполагали возможнеть транслокации У хромосомы или ее фрагмента на другие хромосомы у Е. lutescens, как это описано у некоторых млекопитающих (Ohno, 1990; Fredga, 1994). Однако нам не удалось обнаружить Y хромосому или ее фрагмент у Е. lutescens.

Позднее с помощью метода геномной блотинг-гибридизации было установлено, что ген Sry, локализованный в Y-хромосоме и детерминирующий формирование тестикул, присутствует в генотипах самцов Е. fuscocapillus и самцов всех до сих пор исследованных видов млекопитающих, и отсутствует в генотипах самцов Е. lutescens и Е. tancrei (Just et al., 1995)! Эти данные в совокупности с данными, полученными нами, позволяют предполагать, что Е. fiiscocapiUus унаследовал Y-хромосому и стандартный тип определения пола от предков, возможно, обладающих теми же специфическими особенностями поведения полового бивалента, что и Е. fuscocapillus. которые могли способствовать утоате У хромосомы.

У предков Е. lutescens и Е- tancrei утрата Y хромосомы, компенсировалась приобретением новых механизмов определения пола. Вероятность значительных различий между формами определения пола Е. lutescens и Е. tancrei подтверждается следующими фактами и рассуждениями.

1. White (1954) предположил, что утрата Y хромосомы у предков Е. lutescens связана с заменой хромосомного определения пола генным: приобретением X хромосомой самцов маскулинизирующего /М/, а X-хромосомой самок феминизирующего /А/ факторов. Согласно гипотезе White, зиготическая смертность (зигот ОО и XX) у Е. lutescens должна составлять 50%.

2. Позже при анализе природных популяций Е. lutescens было установлено, что зиготическая смертность у слепушонок этого вида составляет 60%, что, по мнению авторов, является результатом суммирования приблизительно 10% стандартной эмбриональной смертности и 50% генетически детерминированной смертности зигот (Lyapimova et al., 1975), что соответствует предположению, выдвинутому White (1954).

3. У Е. tancrei зиготы XX жизнеспособны, а эмбриональная смертность стандартна, и составляет около 10%. У самцов наблюдаются различия в поведении половых хромосом в профазе 1 мейоза, что позволяет предполагать генетическую неравноценность этих изоморфных хромосом.

4. Особенности поведения XX половых хромосом у Е. tancrei и сохранение этого типа половых хромосом у всех изученных кариоморф этого надвида дают основание для предположения о том, что утрата одной из X хромосом представляет собой маловероятное событие. Таким образом, возможность существенных различных форм определения пола у Е. tancrei и Е. lutescens представляется реальной, а дивергенция типов определения пола у представителей рода Ellobius может быть представлена следующей схемой:

Наличие факторов, способствующих географической изоляции, усло

Е. fuscocapillus (XX; XY) -Е. tancrei-E. talpinus (XX; XX) ~~~ Е. lutescens (Х0; ХО) вия высокой сейсмической активности, характерные для мест обитания слепушонок рода EUobius, и строго подземный образ жизни, наряду с переходом на генный механизм регуляции полоопределения могли способствовать закреплению новых нетипичных для млекопитающих типов определения пола у Е. tancrei и Е. lutescens (Vorontsov & Lyapunova, 1984).

Поведение XX бивалента в профазе I мейозэ у самцов разнохромосом-ных форм Е. tancrei с 2п=54 и 2п=34 также имеет рад специфических особенностей. Наличие зоны асинапсиса в средней части полового бивалента и ядръгажоттодобной структуры на оси одной из X хромосом свицеггельствуют о различии в функциональной активности этих изоморфных по картине распределения G- и С-полос половых хромосом, что отличает их от изоморфных (XX) хромосом самок мыши, исследованных Speed (1986).

Наибольший интерес в отношении эволюции надвида Е. tancrei представляют формирование закрытого полового бивалента, локализация отчетливо выраженного полового пузырька на периферии ядра, сохранение структуры осевых элементов и фрагментов С К даже на стадии поздней дкплотены, что может свидетельствовать о формировании хиазмы, а возможно и двух хиазм. По-видимому, перечисленные здесь элементы структуры и поведения половых хромосом определяют коо-риентацию хромосом в метафазе I и правильное расхождение половых хромосом в анафазе I у самцов Е. tancrei. Кроме того, отсутствие контакта XX хромосом с аутосомами в мейозе у самцов может служить одним из возможных объяснений того, что у надвида, демонстрирующего робертсоновский веер именно (и только) половые хромосомы не вовлекаются в процесс Rb-слияний.

В связи с вышесказанным сохранение уникального типа определения пола у представителей всех популяций полного робертсоновского веера Е.tancrei с 2п=54 до 211=34 представляется вполне объяснимым.

Резюме. Анализ СК слепушонок рода Ellobius подтвердил отсутствие Y хромосомы (или её фрагмента) у Е. tancrei ( XX. XX) и Е. lutescens (XQ, ХО) и дал основания для предположения о том, что в основе дивергенции половых хромосом у представителей этого рода лежит утрата Y хромосомы у общего предка видов Е. tañere, и Е. lutescens и формирование у них новых неизвестных механизмов определения пола.

Очевидно, что окончательный ответ на вопрос о механизмах определения пола слепушонок Е. tancrei и Е. lutescens может быть получек с помощью методов молекулярной генетики.

II. СК У ВИДОВ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ КАРИОТИПА

СК разнохромосомных форм Е. tancrei/I, 4, 5, 29, 33/.Слепушонки группы Е. tancrei представляют собой уникальную модель для исследования процессов микроэволюции, протекающих в популяциях.

Изучен робертсоновский веер форм слепушонок группы Е. Шпсгег с диплоидными числами от 2п~54 до 2п=32 при неизменном числе плеч КР=56 из долины рек Вахш-Сурхоб (Памиро-Алай) (Ляпунова, Воронцов, 1978; Ьуарипоуа е1 аЗ., 1980, 1984; Баклушинская, Ляпунова, 1990; Баклушинская, 1992). Показана возможность получения гибридов

-т. г/ч-.тттпт /тх лщпттттот/мтттп /ттлгг гт/ч ¿чучтгт чттл» л 7 тттх/-» ттхг ■«•-гул-» * V 1 ггтлчтпгу уиипаллц^шш^л НУ ЧЛ/^ШШОШ)1 ам^л) -г ХУШ^! ххл гибридов Р1 отмечено снижение плодовитости (Ляпунова, 1983), в связи с этим одной из целей исследования СК гибридов был анализ при

Первоначально были изучены препараты СК исходных форм слепушонок: четырех самцов с 2п=54, N["=56 (2 метацентрика и 52 акроцен-трика) и четырех самцов с 2п=34, НР=56 (22 метацентрика и 12 акро-центриков). На стадии зиготены у самцов 2п=54 синапсис хромсом начинается с притсломерн ых участков хромосом и последовательно распространяется по направлению к центромере. У самцов 2п~34 синапсис метацентриков также распространяется с прителомсрных концов хромосом по направлению к центромерному участку, однако в зоне центромер наблюдалось запаздывание формирования осевых элементов хромосом и СК по сравнению с формированием СК акроцентриков (рис. 3).

На стадии средней пахитены в тотальных препаратах СК у формы с 2п=54 обнаружено двадцать шесть аутосомных СК-бивалентов и половой бивалент; у формы с 2п=34 шестнадцать СК-бивалентов и половой бивалент. Детали морфологии и поведения полового бивалента (XX) описаны в главе 1.

Гибриды ЕИоЬшз йпсге), гетерозиготные по ЯЬ-транслокациям /1,

4, 5, 19, 33/. В кариотипе всех 4 гибридов 2«=44, ЫР=56 обнаружены 12 метацентриков и 32 акроцентрика. Длинные плечи 20 акроцентриков идентичны по С-сегментам плечам 10 метацентриков. Кроме того, в кариотипе обнаружено семь пар гомологичных хромосом: одна пара метацентриков и шесть пар акроцентриков, в число последних входит и пара половых (XX) хромосом. Таким образом, были получены дан

Рис. 3 Запаздывание синапсиса прин«^ центромерных участков (*) осевых элементов Юэ-метацентриков у слепушонки Е1.1апсге1 (2п=34). пью, позволившие ожидать, что в распластанных ядрах на стадии па-хитены будут обнаружены 10 СК-тривалентов и 6 СК-бивалентов XX — половой бивалент.

Однако на стадии ранней пахитены в тотальных препаратах CK у гибридов Fj обнаружено шесть типичных аутосомных бивалентов, половой бивалент (XX) и только три полностью сформированных закрытых СК-тривалента (на стадии поздней зиготены обнаруживался лишь один закрытый СК-тривалент) (рис. 4а,Ь).

Такой тип формирования СК-тривалентов мы назвали "быстрым". Всегда наблюдалась цис-конфигурация кинетохоров акроцентриков по отношению к кинетохору метацентрика: расположение коротких плеч и кинетохоров акроцентриков по одну сторону от кинетохора и оси метацентрика. Цис-конфигурация кинетохоров в структуре тривалентов обеспечивает правильную коориентацию гомологов в метафазе I и их расхождения в анафазе I (Moses et al., 1979).

Второй тип формирования СК-тривалентов — "медленный". К этому типу отнесены СК-триваленты, которые на стадии ранней пахитены остаются открытыми. В большинстве случаев на распластанных препаратах CK слепушонок открытые СК-триваленты представлены двумя фрагментами — "псевдобивалентами", так как хроматин распластанных хромосом не контрастируется серебром, а в прицентромерной области растянутого осевого элемента иногда вплоть до стадии поздней пахитены сохраняется брешь (рис. 4a-f, 5а). Позднее прицентромерный участок осевого элемента метацентрика достраивается, короткие плечи акроцентриков синаптируют, и формирование СК-тривалента завершается. Вопрос о причине и генетическом значении запаздывания синапсиса хромосом и у гетерозигот по хромосомным транслокациям будет рассмотрен в разделе V]."

Медленные СК-триваленты могут объединяться в цепочки, в таком случае между короткими С-гетерохроматиновыми плечами акроцентриков, входящих в состав соседних открытых СК-тривалентов, формируются короткие участки CK. Длинные плечи акроцентриков формируют CK с плечами метацентриков, как и в обычном триваленте. Как и в открытых СК-тривалентах асинаптированные прицентромерные области сильно растянутых метацентриков недоформированы, и в этих областях осевых элементов видны бреши (рис. 4g, 5а).

Количество СК-тривалентов, объединенных в цепочки, увеличивается от стадии зиготены к ранней пахитене и постепенно снижается на стадиях средней пахитены-диплотены, а число закрытых тривалентов растет. Однако полная коррекция синапсиса, приводящая к формированию 10 свободных закрытых СК-тривалентов, выявлена лишь в 4 из 130 исследованных клеток только у одного гибрида, что коррелирует с результатами анализа плодовитости гибридов. По данным Баклуш и некой, среднее число потомков в помете у слепушонок с 2п=54 составля

Рис. 4 Ранняя пахитена £ (апсге! (2п=44): а,Ь — "быстрый" СК-триваленг, А — акроцентрик, М — КЬ-метацентрик; с-Г — этапы формирования "медленных" СК-тривалентов, прозрачная стрелка указывает на бреши в структуре осевых элементов; £ — цепочка из двух медленных СК-тривалентов. ла 2,3710.22, у слепушонок с 2я=34 — 2,23±0,13. При скрещивании между собой этих кариоморф среднее число потомков (2 «=44) в помете составляло 1,67+0,33. А в результате 10 попыток скрещиваний гибридов (44x44), в 1% был получен лишь один потомок. Причиной снижения плодовитости может служить формирование хиазм в участках си-напсиса между акроцентриками, принадлежащими разным тривален-там, приводящее к неправильному расхождению хромосом в анафазе I и II и формированию несбалансированных гамет.

У гибридов с 2п=49 ( Р1 от скрещивания форм 2п=48 х 2п=50) также формируются цепочки СК-тривалентов, однако на стадии поздней пахитены происходит коррекция синапсиса, приводящая к формированию пяти тривалентов и шестнадцати аутосомных бивалентов и полового бивалента.

Гибриды от скрещивания форм, отличающихся по одной паре хромосом /15/. Были исследованы гибриды с 2п-~33 (Г, от скрещивания двух кариоморф Е. 1апст с 2п-34х2п-32) и 2п=51 (Р, от скрещивания Е. аШсш, 2п=52х2п=50 Е. (апсга"). В тотальных препаратах С К у гибрида (2п=33) обнаружено 14 аутосомных бивалентов, половой бивалент и один "быстрый" СК-тривалент. Такая картина соответствует ожидае ( ■ Чч4 ф

5 \ Т ь

Я* ■■■ ■•<>' х

О' . \ • ! . Гг^л,

Рис. 5 Цепочки СК-тривалентов: а — цепочка из пяти СК-тривалентов и один свободный, открытый, "медаенный" СК-тривалент (А6, М6, Аб') ХХ-половой бивалент; Ь — схема цепочки, состоящей из двух СК-тривалентов (обозначения теже, что на рис. 4). мым результатам: в наборе 34-хромосомных слепушонок содержится 11 пар Шэ-метацентриков и 6 пар акроцентриков, а у 32-хромосомных 12 пар КЬ-метацентриков и 4 пары акроцентриков. В наборе 32-хромосом-ной формы имеется помимо тех же 11 пар КЬ-метацентриков, что и у 34-хромосомной формы еще одна пара КЬ-метацентриков: М!1Г В соответствии с ожидаемым в тотальных препаратах СК гибридов с 2п=33 было обнаружено 15 бивалентов и один СК-тривалент. Плодовитость этого гибрида не снижена по сравнению с плодовитостью родительских форм (Ляпунова и др., 1990).

У гибрида с 2п=51 отмечено снижение плодовитости почти в 2 раза по сравнению с плодовитостью родительских форм, что хорошо коррелирует с данными анализа СК. У таких гибридов обнаружены цепочки, состоящие из четырех хромосом, в которых отчетливо идентифицируются два ИЬ-метацентрика и два акроцентрика. Одно плечо каждого из КЬ-метацентриков синаптирует с плечом другого Ш> - метацентри -ка, а второе плечо каждого КЬ-метацентрика с гомологичным ему длинным плечом акроцентрика (рис. 6). В наборе Е. а1акш (2п ~ 52) и наборе слепушонок из Войдары обнаружена пара КЬ-метацентриков (ЕС5), идентичных по О-сегментам. Однако, согласно номенклатуре хромосом слепушонок, в группу Е входят 4 пары хромосом, практически не отличающиеся по О-окраске (Ляпунова и др., 1990).

Рис. 6 Гибрид слепушонки 2п—51. Цепочка хромосом, состоящая из двух мета-центриков (М1 и М2), гомологичных по одному из плеч, и двух акроцентриков (А1 и А,), гомологичных вторым плечам метацентриков. Звездочка обозначает СК. между короткими плечами акроцентриков.

Географическая разобщенность родительских форм и картина синапс иса хромосом в профазе I мейоза у гибридов позволяют предположить, что процесс КЬ-слияния в разных частях ареала слепушонок шел независимо, создавая различные комбинации. Очевидно, что Е-хромо-сомы в этих Ш>-метацентриках разные, чем и объясняется формирование тетравалента.

Гибриды, полученные от свободного скрещивания разнохромосом-ных форм слепушонок /15, ЗЗ/.Нами было предпринято исследование СК гибридов, полученных от свободного скрещивания гибридов Р1 раз-нохромосомных форм слепушонок между собой и возвратного скрещивания гибридов Б. с родительскими формами. В этих экспериментах была воспроизведена модель свободного скрещивания слепушонок в природной популяции гибридов, живущей в долине реки Сурхоб (9 гибридов с 211=44; 2п=46; 2п=48; 2п=49; 2п=50).

У всех самцов во всех сперматоцитах на стадии пахитены обнаружены цепочки хромосом, объединяющие от 5 до 12 хромосом. Число хромосом в цепочках не всегда было кратно трем, следовательно, в состав цепочек включены не только триваленты (один метацентрик и два ак-роцентрика), но и непарные хромосомы, присутствие которых в кари-отипе у гибридов Р2 может быть результатом формирования несбалансированных гамет у гибридных родительских форм. У таких гибридов идентификация элементов в цепочках удается с трудом из-за множественного интерлокинга и брешей в структуре осей хромосом. У гибридов Р, в составе цепочек обнаруживались как СК-триваленты, так и С К-тетраваленты.

Половой бивалент у самцов этого вида в отличие от самцов других видов млекопитающих, формирует в профазе I закрытый половой бивалент. У гибридов Ft и F2 иногда обнаруживался открытый (с одного конца) половой бивалент. Однако ассоциации полового бивалента с аутосомами обнаруживались в единичных клетках гидридов. Таким образом, механизм пахитенного ареста не играет значительной роли в снижении плодовитости самцов Е. tancrei.

В-хромосомы восточно-азиатской мыши Apoa'emus peninsuiae (Rodentia, Mammalia) /12, 16, 43/

Вид A. peninsuiae характеризуется вариабельностью no частотам различных вариантов В хромосом (В-Хр): (2и=48+0—24 В-Хр). Для каждой популяции A. peninsuiae характерно определенное оптимальное число В-Хр. Хромосомы основного набора A. peninsuiae представлены нисходящим по величине рядом акроцентриков, их число постоянно и равно 2«=48 (Krai, 1971; Бекасова, Воронцов, 1975; Раджабли, Борисов, 1979; Борисов, 1980, 1986; 1990, 1991, 1992; Волобуев, 1980; Картавцева и др., 1990). Самой крупной в наборе является X хромосома. Yхромосома представляет собой мелкий акроцентрик (Бекасова, Воронцов, 1975). Система В-Хр образует гетерогенную группу как по размерам, так и по морфологии. Борисовым (1986) в системе В-Хр A. peninsuiae условно выделены 5 классов добавочных хромосом.

Нами предпринят электронно-микроскопический анализ структуры и поведения В- и А-Хр в профазе I мейоза у 8 самцов A. peninsuiae.

В тотальных препаратах СК на стадии пахитены выявлены 23 ауто-сомных бивалента и половой гетероморфный бивалент (X, Y). Морфо логия и поведение СК аутосом и полового бивалента (Х,У) типичны для большинства представителей отряда Rodentia.

Единственная особенность в структуре аутосомных бивалентов заключалась в присутствии между боковыми элементами некоторых А-Хр крупных интенсивно окрашенных округлых телец, диаметр которых превышал ширину центрального пространства СК, что приводило к формированию четкообразных расширений СК в зоне их расположения. Такие вздутия обнаруживались только на стадии ранней пахитены. Природа их не ясна. Они крупнее рекомбинационных узелков и не описаны у других объектов.

В кариотипах исследованных нами самцов A. peninsuiae обнаружена межклеточная и межиндивидуальная вариабельность числа В-Хр (в пределах от 1 до 12) на клетку. Выявлены вариации конфигураций не только у разных особей, но и в различных клетках одной особи. Длина осевых элементов В-Хр варьировала от 0,7 до 5 мкм. Условно выделены три класса осевых элементов В-Хр: короткие до 2 мкм, средние 2-3 мкм и длинные свыше 3 мкм. Осевые элементы В-Хр в профазе 1мейоза представлены преимущественно унивалентами, реже би- и мультивалентами. Короткие униваленты и биваленты имеют С- или V-образную форму. По-видимому, такая форма унивалентов обусловлена тем, что теломеры

В-Хр связаны с ядерной мембраной. Осевые элементы унивалентов В-Хр утолщены или окрашены более интенсивно чем боковые элементы CK А-Хр. Характерной чертой большинства би-, и мультивалентов В-Хр был неполный синапсис осевых элементов и формирование лишь коротких фрагментов CK. Боковые элементы полностью синаптированных коротких 5к- к тривалеятов В-Хр утолщены или многонитчаты {рис, 7).

В-Хр формировали скопления. Во всех клетках на стадиях средней и поздней пахитены уни- и мультиваленты группировались вблизи, тело-меоных концов X и "У хоомосом. Даже ш>и ассоциации осевых элементов X хромосомы и В-Хр. Половой бивалент располагался на периферии ядра и формировал половой пузырек (Рис. 7а), Аналогичную картину описали Switonski et al. (1987) у самцов серебристой лисицы Vulpes fuhus.

Известно, что арест клеток на стадии пахитены сопряжен с "заяко-риванием" полового бивалента среди аутосомных хромосом. У А. реп insu(ае при постоянно обнаруживаемой ассоциации В-Хр и ХУ бивалента "заякоривание" XY-бивалента не происходит, однако исключить влияние таких ассоциаций на плодовитость может только специальное исследование. В литературе неоднократно сообщалось о том, что наличие В-Хр в кариотипе оказывает влияние на ход процессов, протекающих в мейозе: синапсис А-Хр, количество и локализацию хиазм, а также фертильность особей (Muntzing, 1956; Прокофьева-БелыЪвская, 1986; Борисов, 1992; Jones & Rees, 1983). Показано, что число В-Хр варьирует не только в пределах вида или популяции, но и в разных тканях и клетках одной особи (Борисов, 1980, 1990, 1992 и др.). Нами установлено, что в клетках генеративной линии количество В-Хр значительно увеличено по сравнению с клетками костного мозга.

Явление премейотической аккумуляции В-Хр в генеративных тканях ранее было описано у представителей других видов животных и растений при анализе кариотипов на стадиях диакинеза-метафазы I (Nur, 1969; Волобуев, Раджабли, 1976 и др.). Первое предположение, которое возникает в связи с аккумуляцией В-Хр в генеративных клетках, это вероятность элиминации В-Хр в процессе митотических делений соматических клеток. Однако у А. peninsulae клеточные клоны, лишенные В-Хр очень редки (Борисов, 1992; Бекасова, 1984). По данным Jones & Raes(1982) в процессе I и II мейотических делений происходит элиминация большого числа унивалентов В-Хр. По нашим данным, униваленты В-Хр составляют большинство на стадии профазы I мейо-за. Раджабли и др. (1978) рассматривали премейотическую аккумуляцию в качестве эволюционно закрепленного генетического механизма поддержания оптимального для каждой популяции числа В-Хр, повышающих вероятность сохранения их в ряду поколений. В связи с эт им возник вопрос: постоянно ли число В-Хр на протяжении профазы I мейоза? Данные такого исследования у самцов приведены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, нами обнаружена выраженная тенденция

Рис. 7a — ассоциация B-Xp (В) и полового (X, Y) бивалента, формирующего половой пузырек в ядре сперматоцита Apodemus peninsulae; b,c,d — уни-, би-, три- и мультиваленты В-Хр; f — расслоение осевых элементов В-бивалента. к увеличению числа В-Хр по мере продвижения клеток от стадии зиго-тены к стадии поздней пахитены. Возможно, что эта тенденция обусловлена асинхронностью процесса формирования осевых элементов В-Хр. Более смелым и требующим дополнительного исследования является предположение о наличии механизма формирования de novo В-Хр в течение профазы 1 мейоза. В двух препаратах распластанных ядер спер-матоцитов на стадии пахитены нами были обнаружены зоны электронно-плотного материала, в области которого располагались множественные структуры, морфологически соответствующие осевым элементам хромосом, длина которых достигала лишь 0,2 мкм. Такие структуры ке описаны в литературе и ни разу не обнаружены ни у одного из исследованных нами других объектов.

Резюме. Полученные результаты демонстрируют возможности анализа QK для исследования проблем хромосомного видообразования, в частности, для анализа механизмов репродуктивной изоляции. Анализ СК позволил выявить детали синапсиса хромосом у самцов Е. tancrei, гетерозиготных по разному числу Rb-транслокаций, и объяснить их роль в формировании цепочек СК-тривалентов у гибридов по десяти и пяти Rb-транслокациям; описать коррекцию гетерологичного синапсиса, приводящего к высвобождению СК-тривалентов из цепочек на стадии диплотены. Полученные данные, коррелируют с результатами исследования уровня репродуктивной изоляции различных форм слепушонок.

Впервые выявлено увеличение числа В-Хр при продвижении клеток от стадии зиготен ы к стадии диплотены у A. peninsulae.

Невыраженность механизма пахитенного ареста, по-видимому, обес

Тябл. 1. Распределение В-хромоеом в сперматоцитах на разных стадиях профазы I мейоза у 4 самцов А. рвптви/ав.

Ма Стадия пр. 1 Количество В-хромосом на клетку (1 - 11) кик 8В эе/кик п/'п мейоза 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ТО и

1. Зиготена 1 2 « « 1 2 1 8 44 6.

Р.-с. пах. 2 % 2 •) 4 3 1 14 9? 6.

Позд. пах. 1 1 2 1 & 36 /

2. Зиготена 1 1 2 7 3.

Р.'С. пах. Позд. пах. г 4 3 4 2 16 88 5.

1 1 1 3 12 4.

3. Зиготена 1 1 2 5 2.

Р.-с. пах. т 1 3 3 о 3 4 1 13 131 6.

Позд. пах. 1 2 1 2 1 3 10 70 7.

4. Зиготена 1 1 3 1 б 17 2.

Р.-с. пах. 4 4 4 г 9 41 4.

Позд. пах. 1 3 1 5 24 4.

КИК - количество исследованных клеток.

38 - сумме В-хромосом во всех клетках на данной стадии.

ЗВ/КИК - среднее число 8-хромосом на клетку на каждой стадии. псчивает прохождение профазы 1 мейоза у самцов, (несмотря на наличие зон асинапсиса В-Хр у А. репшиШе и аутосом у гибридов Е. Шпст), и таким образом, способствует поддержанию хромосомного полиморфизма в популяциях этих видов.

III. ИССЛЕДОВАНИЕ СК У ЖИВОТНЫХ, ПОДВЕРЖЕННЫХ ДЕЙСТВИЮ МУТАГЕННЫХ ФАКТОРОВ

Метод электронно-микроскопического анализа СК используется для выявления и оценки действия физических и химических мутагенных факторов на хромосомы клеток сперматогенного ряда, а также в практике контроля на генетическую безопасность медицинских препаратов. Особое значение анализ С К приобретает, когда речь идет о бесплодии, вызванном действием медикаментозных препаратов на хромосомы. Некоторые препараты, в частности многие противоопухолевые препараты, вызывают длительное нарушение сперматогенеза у мужчин (СисЬпа ег а1., 1983). При анализе СК самцов мышей после введения адриами-цина выявлены хромосомные аберрации и аномалии СК (А11еп е1 а!., 1988).

Исследование СК самцов мышей, облученных в период эмбриогенеза /21, 39/.Самки и самцы лабораторных мышей (СВАхС57ВЬ) экспонировались в 10-километровой зоне ЧАЭС в течение 22 суток в июне 1988 г. В результате совместного содержания от них получено потомство. Среди 74 самцов выявлены 4 самца с пониженной плодовитостью.

Анализ хромосом на стадиях диакинеза метафазы 1 выявил гетерози-готность по реципрокным транслокациям животных с пониженной плодовитостью. Электронно-микроскопический анализ СК на стадиях зиго-тены-диплотены обнаружил аберрантные конфигурации СК. Частота выявления хромосомных аберраций при анализе СК превышала частоту выявления их при анализе хромосом на стадиях диакинеза-метафазы 1 в среднем в 1,8 раза (таблица 2), что совпадает с данными Сайгой & Вгескоп (1983), полученными при анализе СК облученных хомячков.

Динамика формирования СК-тетравалентов у гетерозигот по рецип-"окным абеп^ациям. При реципрокных транслокациях сформированные СК-тетраваленты выявляются в препаратах, начиная со стадии средней или поздней пахитены (рис.8). На стадиях зиготены и ранней пахнтены в структуре осей, формирующих тетраваленты, в области точек разрывов сохраняются обширные зоны асинапсиса. В структуре асинаптированных участков осевых элементов имеются пробелы — бреши. Поэтому на этих стадиях профазы I СК-тетраваленты представлены четырьмя псевдобивалентами (рие.8а). По мере достраивания осевых элементов, тетрава-ленты представлены псевдотривалентом и двумя псевдобивалентами (на этапе, когда полностью сформировалась одна ось из четырех формирующих СК-тетравалент), либо двумя ложными С К-тривалентами (сформировались осевые элементы двух из четырех хромосом), либо псешюпен-тавалентом (не достроен осевой элемент одной из четырех хромосом). В течение средней пахитены происходит достраивание всех осевых элементов тетравалента и к поздней пахитене завершается синапсис осевых элементов и формируется закрытый СК-тетравалент (рис.8с!-е).

Табл. 2. Относительное количество клеток, несущих аберрантные конфигурации хромосом (а.к.х.) на стадиях зиготены - диллотены и диакинеза - метафазы I. самца Относительное количество клеток, содержащих а.к.х. 8 профазе 1 мейоза Масса семенников, иг Смертность эмбрионов

1, Зиготвна -диплотена 2. Диакинвз -метафаэа ! Превышение 1 над

14 21/26* (84.5%) 43% х 4.8 >1.7 раза 191 83.0%

42 21/22 (96.3%) 57% ± 4.9 >1.7 раза 184 51.8%

68 20/23 (88.9%) 61% ±4.9 >1.4 раза 158 40.0%

70 17/17 (100%) 43% ± 4.6 >2.3 раза 171 45.2% В знаменателе указано общее число исследованных /слеток.

В 13% клеток у самца №68 и 19,2% клеток у самца №14 на стадии поздней пахитеиы-ранней диплотены СК-тетраваленты не обнаруживались, однако в таких клетках можно было наблюдать два аутосомных бивалента У-образной формы, точки перегибов которых были обращены навстречу друг другу (рис.80- Отсутствие тетравалента и взаиморасположение таких бивалентов позволяет предположить возможность реституции структуры аберрантных хромосом, в случае, если в структуре тетравалента пересекались в одной точке и повторно транслоцировались обе аберантные хромосомы. Однако не исключено формирование четырех перестроенных хромосом, если пересекались и транспонировались две нормальные хромосомы тетравалента (рис.

§—Г). Динамика описанных событий отражена в таблицах 3 и 4. по рсципрокной транслокации: а — п. зиготена, четыре псевдобивалента, бреши (стрелки) вруктуре четырех осевых элементов хромосом тетраваяента; b — р. пахитена, два псевдотривалента, бреши вруктуре двух осевых элементов;— пахитена псевдопентавалент, брешь вруктуре одного осевого элемента; d — п. пахитена, все оси СК-тетравалентаормированы; е —ормированный СК-тетравалентпересечением двух осей; f — п. пахитена, два V-образных бивалента; g — две нормальные и две аберрантные хромосомы; h — реституция транслоцированных хромосом; i — пересечение, разрывы и обмен между нормальными хромосомами тетравалента.

В тотальных препаратах CK самца № 168 кроме межхромосомных аберраций на стадиях зиготены-ранней пахитены в структуре одного из ауто-сомных бивалентов выявлена инверсионная петля (рис. 9).

Отсутствие инверсионных петель, начиная со стадии средней пахитены, в большинстве ядер явлется результатом действия механизма синаптической пригонки (Moses et al., 1982): на стадиях зиготены-ран-ней пахитены происходит строго гомологичный синапсис, что приводит к формированию инверсионной петли в структуре CK бивалента, далее наступает дее и напсис хромосом в зоне инверсии. На стадии средней пахитены осуществляется негомологичный синапсис, приводящий к формированию внешне нормального СК-бивалента, а выявление

TaSa. 3. Распределение конфигураций хромосом по подстадиям профазы I мейоза у самца №14.

Характер аберрантных конфигураций хромосом Подстадии профазы I мейоза

П.З. Р.П. С.П. П.П. Р.Д.

Четыре ложных г.м. бивалента

Два ложных триваяента

Один тетравалвнт

Отсутствие 8.к.х.

Итгггг. рй

Обозначения: г. и. - гетвроморфный бивалент, а.к.х. - аберрантные конфигурации хромосом. Подстадии профазы I майоэа: П,3. - поздняя зиготена, Р.П. - ранняя пахитена, СЛ. - средняя пахитена, П.П. • поздняя пахитена, Р.Д. - ранняя дкплотена.

Табл. 4. Распределение конфигураций CK хромосом по подстадиям профазы I мейоза у самца N'=68.

Хараствр аберрантных Подстадии профазы 1 мейоза конфигураций хромосом П.З. Р.П. С.П. П.П. Р.Д.

Четыре "ложных" г.м. бивалента

Два "ложных" СК-тривалента

Один СК-татравалент !

Отсутствие а.к.х.

Итого (23 клетки) 1 4 S инверсионном петли в клетке на стадии поздней пахитены может свидетельствовать о наличии хиазмы в участке инверсионной петли (Chandley, 1982). Признаки синаптической пригонки не выявлены нами при анализе CK в материнских клетках пыльцы растения ржи, гетерозиготного по парацентрической инверсии /18/, что совпадает с данными Anderson et al. (1994), полученными при анализе CK кукурузы, гетерозиготной по инверсии.

В сперматоцитах самца №170 обнаружены сложные, часто неподдающиеся расшифровке аберрантные конфигурации хромосом. В структуре СК-тетравалента выявлена инверсионная петля. У этого самца на стадии поздней пахитены помимо СК-тетравалента обнаруживались гетеромор-фные биваленты, что свидетельствует о гетсрози готности этого самца и по нереципрокным транслокациям. Именно у этого животного отмечено jtßß* :

Рис 9 Инверсионная петля в структуре аутосомного бивалента самца мыши № 68. значительное увеличение числа клеток на стадии поздней пахитены, большое число дегенерирующих сперматоцитов и незначительное число клеток, достигающих стадии диплотены. Снижение плодовитости у изученных нами самцов хорошо коррелирует с частотой ассоциаций осей полового бивалента с осями аутосомных би- и мультивалентов. Помимо презйгсткческой селекции в результате ареста клеток ка стадии пахитены, причиной снижения плодовитости является продукция несбалансированных гамет и высокий уровень эмбриональной смертности.

ТТг)ттлвл|1 f^TiP-Я TTAUT пл ^tifirrrv v'TTA'Tg^y Jjr.f.i^ITIiXiflVPT С. riPQi.ili i.inriifiAлогически нормальных СК (таблица 5), что позволяет предположить возможность гетегюзиготности по микроабепрациям, не выявляемых даже элекгрои и о- микроскопически. У самца No 170 ассоциаций полового бивалента наиболее часто наблюдалась с осями гетероморфных бивалентов, что обусловливало частое "заякоривание" полового бивалента в центральной части ядер и аресту клеток на стадии поздней пахитены. На этой стадии обнаруживались дегенерирующие клетки.

Закрытые тетраваленты редко ассоциируют с половым бивалентом. По мнению Boer et ai. (1986), именно это обстоятельство обусловливает лишь незначительное снижение плодовитости самцов, гетерозиготных по реципрокным транслокациям. Снижение плодовитости у исследованных нами животных может быть обусловлено не только гетерози-готностью по реципрокным транслокациям, но и наличием у них нере-ципрокных аберраций, в том числе и микроаберраций.

Транслокации у исследованных самцов могли возникнуть лишь на самых ранних стадиях развития (на пронуклеарной стадии зиготы или несколько позже) или передаться от родителей, в половых клетках которых они могли быть индуцированы до оплодотворения (Померанцева, Рамайя, 1990).

Анализ СК в потомстве облученных самцов мышей /6. 8, 34, 37/. В потомстве Fj от скрещивания 24 облученных (в дозе 5 Гр у-излучения) самцов с интактными самками было получено 94 самца. Среди них выявлено 7 стерильных самцов и 4 самца с пониженной плодовитостью (табл. 6).

Табл. 5, Ассоциация осей полового {X, У) бивалента с осями аутосомных хромосом. самца Доля (%) клеток, а которых оси полового (X, Y) бивалента ассоциируют с СК аутосом

Нормального бивалента Гетероморфных бк- и тетразалентов Итого*

14 5 (19.2%) S (18.2%) 10/26 (38.4%)

42 7 (31.8%) 4(18.2%) j 11/22 (50%)

68 5 (21.7%) 3 (13.1%) 8/23 (34.8%)

70 i 1 (5.9%) 7 (41.4%) 8/17 (47.1%) Относительно общего числа исследованных клеток.

Здесь рассмотрены результаты исследования С К у 6 стерильных самцов и 3 самцов с пониженной плодовитостью (табл. 6). У двух самцов удалось получить лишь единичные препараты СК.

Как следует из таблицы 6, у самцов из потомства облученных самцов, на стадии пахитены-диплотены удалось выявить приблизительно в 2 раза больше клеток с хромосомными аберрациями, чем на стадиях диакинеза-метафазы I. У 9 из 10 самцов с нарушением фертильности при анализе СК обнаружены конфигурации СК, позволяющие идентифицировать реципоокные, нереципрокные, робеотсоновскую и X-аутосомную транслокации. У стерильных самцов и самцов с пониженной плодовитостью ассоциации осей полового бивалента с осями аберрантных хромосом наблюдается в 34—100% клеток.

У самцов, гетерозиготных по нереципрокным транслокациям, районы осевых элементов, не имеющие гомологичного фрагмента хромосом в аберрантной конфигурации СК, асинаптированы, а асинаптиро-ванные районы резко утолщены и всегда ассоциируют с утолщенным осевым элементом Х-хромосомы. Это наиболее яркое морфологическое проявление событий, приводящих к аресту сперматоцктов на стадии пахитены (рис. 10).

Табл. 6. Относительное количество клеток с хромосомными аберрациями на стадии пахитены и диакинвза - метафазы I.

NS • Характеристика ХА Количество исследованных клеток (% клеток с а.х.) Количество аутосомной ного Пахитенэ Диакинез -метафаза I ассоциацией ' ■- (%)

Группа 1: Стерильней« самцы

1. Нбрэцмпрокнвя трансяокэция 44 (100%) 64 (59.5%) 65%

2. Робертсоновская транслокация 10 (100%) кя. не оби. 100%

3. Транслокация + деления 30 (100%) кл. не оби. 69.2%

5. Нереципрокная транслокация 40 (95%) 72 (60%) 54%

30. Х-аутосомная транслокация 15 (47%) 29 (0%) 47%

25. Асинапсис X и Y хромосом 4-0 (25%) 100 (0%) 0%

Группа 2: Самцы с пониженной плодовитостью

17. Реципрокная транслокация 31 (SO.3%) 100 (53%) 26.3%

19. Реципрокная транслокация 17 (84%) 100 (48%) 47%

10. Мозаицизм по рецмпрокной транслокации 19 (15.7%) 73 (1.4%) 36.8%

У стерильного самца № 125 транслокациониые конфигурации хромосом не выявлены. Однако у этого самца в 25% клеток обнаружен асинапсис половых хромосом, что коррелирует с результатами Evans (1969), согласно которым асинапсис половых хромосом приводит к нарушению фертильности самцов.

Анализ СК самцов мышей после длительного введения неоаква-септа /23/. Неоаквасепт (НА) препарат, применяемый для обеззараживания индивидуальных запасов питьевой воды. Действующим веществом препарата является натриевая соль дихлоризодиануровой кислоты (38,8%), принадлежащая к группе органохлоринов. ноблокаторами, вызывающими серьезные поражения эндокринной и генеративной систем человека, значительно повышают риск рождения ребенка с врожденными пороками развития (СоШогя е1 а!. 1996У Со'Ьогп е! а1., сделана попытка анализа причин глобального снижения количества еперматоцитов (в среднем в два раза) и резкое повышение процента терато- и некроспермии у мужчин из разных регионов мира за период жизни последних двух генераций человека. Одной из основных причин названного явления авторы считают широкое использование органохлоринов в быту.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синаптонемный комплекс как индикатор хромосомной изменчивости»

Тринадцать самцов были разделены на пять групп:

1 группа — контроль-самцы № 1, 2, забитые вместе с самцами 2 группы.

2 группа самцы № 3, 4, забитые на 7 сутки после одноразового введения МПД НА 912 мг/кг.

3 группа — чистый контроль самцы № 5—7, в возрасте самцов 4 и 5 групп.

4 группа — самцы № 8—10, получавшие ежедневно перорально по одной норме расхода (Щ) НА 2 мг/кг в течение 4 мес.

5 группа — самцы № 11—13, получавшие ежедневно перорально по 3 нормы расхода (3 14) — б мг/кг в течение 4 мес.

Рис. 10 Открытый СК-тетравалент в ядре самца, гетерозиготного по нере-ципрокной транслокации. Асинапти-рующие фрагменты осевых элементов утолщены и ассоциируют (звездочки) с осью Х-Хромосомы (X).

Рис. 11 Шесть типов нарушений в структуре и поведении аутосомных и половых хромосом у самцов мыши, получавших неоаквасепт в разных дозах: а — ассоциация X-хромосомы (X) с аутосомным (А) бивалентом (I тип); b — уни-валекты аутосомных (А) и половых хромосом - (II тип); с — кольцевые униваленты половых (X и Y) хромосом (III тип); d — отсутствие Y-хро.мосомы (IV тип); е — ассоциация Х-хромосомы с гетероморфным бивалентом (V тип); f — атипичная дегенерация СК (VI тип).

Шесть типов нарушений в структуре и поведении С К приведены на рис.11. А их распределение у самцов разных групп показано на рис.12.

Асиналеис половых хромосом, а это нарушение отмечено даже у самцов, получавших НА в норме расхода, по мнению ряда авторов, может приводить к анеуплоидии гамет и снижению фертильности самцов (Evans et al., 1969; Haldane, 1990 и др.). Однако, Men et al.(1988), Liang et al.,(1986) не обнаружили корреляцию между формированием увивалентов на стадии М I и анеушоидией, индуцированной химическими мутагенами, на стадии М П.

Наиболее значительные нарушение в структуре С К обнаружены после однократного введения максимально переносимой дозы (МИД) НА.

Нами выявлены нарушения синапсиса как половых, так и аутосомных хромосом, появление клеток с кариотипом 39, ХО, увеличение клеток, в которых половой бивалент ассоциирует с аутосомным и бивалентами при длительном введении НА даже в норме расхода и увеличение числа поврежденных клеток при трехкратном превышении нормы расхода.

Формирование гетероморфных бивалентов даже в незначительном количестве клеток у двух из трех самцов, получавших по три нормы расхода НА, свидетельствует о способности НА в дозах, превышающих

80 70 605040 30" 20-U> о i «п kü ' m m i IV v¡

Рис. 12 Распределение шести типов нарушений в структуре и поведении СК в ядрах сперматоцитов тринадцати самцов (1-13). Характеристика типов нарушений (I-VI) см. рис. 11. норму расхода, индуцировать нереципрокные хромосомные аберрации.

Полученные результаты дают основание для вывода о том, что НА действует не только на мейотические, но и на премейотические клетки, и что существует риск появления генетических дефектов в потомстве особей, длительно получавших неоаквасепт и повышении генетического риска при превышении доз, соответствующих норме расхода.

Резюме. Наши наблюдения подтверждают эффективность анализа СК для тестирования мутагенного действия химических агентов и радиационного облучения на генеративные клетки млекопитющих.

Параллельное исследование действия мутагенных факторов на клетки сперматогенного ряда на стадиях зиготены-диплотены и диакинеза-М1, свидетельствует не только о преимуществах метода электронно-микроскопического анализа СК, но и о целесообразности проведения параллельного с вето- и электронно-микроскопического исследования. Анализ СК у самцов, облученных в период эмбриогенеза, и у самцов — потомков облученных отцов позволил проследить динамику синапсиса хромосом, выявить различные композиции осевых элементов на пути формирования мультивалентов хромосом и возможной реституции транслоцированных хромосом при реципрокных транслокациях.

Анализ поведения осевых элементов хромосом в динамике представляется весьма существенным. Так, например, наличие гетсромор-фных бивалентов на стадии ранней пахитены может свидетельствовать о гетерозиготности по нереципрокной транслокации, по Rb-транслокации и реципрокной транслокации, но лишь анализ динамики синапсиса осевых элементов хромосом вплоть до стадий поздней пахитсны-диплотены позволяет определить истинную природу перестройки. Представление о возможной реституции транслоцированных хромосом коррелирует с тем, что на стадиях зиготены-диплотены аберрантные хромосомы выявляются в 94,8%, а на стадиях диакинеза-Ml в 55% клеток.

Только на электронно-микроскопическом уровне удалось идентифицировать инверсионные петли и гетероморфные биваленты. Возможность определения характера транслокации и ее роли в снижении плодовитости самцов также являются преимуществом метода анализа СК.

У семи самцов крыс, перенесших семидневный полет на биоепут-нике "Космос-1667" не выявлено никаких аномалий структуры С К, что совпадает с отсутствием нарушения в весе, структуре семенников

IÍ П^'ТПОГУУКТХ?íbyHSTTTlíIT f*í5"VíTTQT5 /11 !

IV. ПАТОЛОГИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА И СНИЖЕНИЕ ФЕРТИЛЬНОСТИ У МУЖЧИН С НОРМАЛЬНЫМ КАРИОТИПОМ (46, XY) /17, 30, 42, 44, 48, 49/

Выяснение причин нарушения сперматогенеза у лиц с нормальным кариотипом, как правило, является сложной задачей. Более чем у 50% лиц с мужским бесплодием причина нарушения сперматогенеза либо не установлена, либо определена частично (Hudson el al., 1986; Тер-Аванесов и др., 1988; Курило, 19В9, 1996). Патология сперматогенеза вплоть до полного блока на уровне сперматогон иев может быть обусловлена нарушениями эндокринной, нервной и иммунной систем, являться следствием травмы, инфекции, стресса, анатомических нарушений в яичках (Peppercll et al., 1986; Chrstie, 1986). Известно, что воздействие ряда химических факторов, в том числе ряда медикаментозных средств, может приводить к нарушению синапсиса хромосом (Alien et al., 1988).

Значительную роль в патологии сперматогенеза играют хромосомные перестройки. Использование методов дифференциального окрашивания хромосом лимфоцитов периферической крови позволяет выявить нарушения кариотипа у 2,2-20% пациентов, обратившихся по поводу бесплодия (Templado et ai., 1980; Kumar et al., 1986). Аналогичное исследование мейотических клеток позволяет обнаружить хромосомные нарушения еще у 2% больных, у которых хромосомные нарушения затрагивают линию половых клеток (Борджадзе, Прокофьева-Бельговская, 1971; Templado et al., 1980; Jagiello & Fang, 1982; Курило, 1993, 1995).

Среди мужчин с азооспермией 1/8 часть составляют пациенты со сфоргиированной de novo делецией (500 kb) Y хромосомы, в районе Yq, в котором идентифицирован ген DAS (Delected in Azoospermia). У мужчин нуль-мутация гена DAS выражается в разной степени поражения сперматогенеза: в просвете канальцев семенника обнаруживаются только клетки Сертоли, а иногда слерматогонии и сперматоциты I на стадии профазы I мейоза (Eberhait et al., 1996).

Сложнейшими для установления причин бесплодия являются случаи нарушения сперматогенеза у лиц с нормальным (46, ХУ) кариотипом как соматических, так и генеративных клеток. По данным Vidal et al. (1982), в 31%-случаев синагпгические аномалии в мейозе могут быть выявлены только при исследовании СК. Этот метод широко внедрен в практику медико-генетических центров США, Англии, Испании и Канады (Solan, 1980; Chandley, 1979, 1984, Boer & Searle, 1980; Navarro et al., 1981; Templado et al., 1984; Rosenmaim et al., 1985; Speed, 1985; Vidal et al., 1986).

Самостоятельную группу аномалий, приводящих к аресту клеток на разных стадиях сперматогенеза, представляют собой некоторые генные мутации, У мышей носителей нуль-мугации m/M, в иммуноблоте зарегистрировано полное отсутствие тестис-специфического белка MLH 1. Арест сперматогенеза у таких мутантов происходит на стадии пахитены. Никаких нарушений синопсиса хромосом при анализе СК не выявлено. Далее наступает апоптоз клеток, однако единичные клетки доходят до стадии спер-матид (Edelman et al., 1996).

Электронно-микроскопический анализ СК мужчин. Для электронно-микроскопического исследования СК была отобрана группа пациентов с нормальным кариотипом соматических клеток (46, XY), нормальным фенотипом, половым развитием и нарушениями сперматогенеза неясной этиологии. Пациенты были направлены на биопсию после предварительного эндокринологического и урологического исследования. Параллельно с исследованием СК у некоторых пациентов проведено гистологическое исследование тестикулярной ткани. Л.Ф. Курило с сотрудниками у большинства пациентов провели количественный карио-логический анализ незрелых половых клеток (КА НПК) биоптатов и/ или эякулятов. Биоптаты яичек были получены от 16 пациентов: от 6 пациентов с тяжелой формой олигозооспермии и от 10 пациентов с азооспермией: у 2 из 10 пациентов с азооспермией установлена непроходимость семявыносящих путей. У остальных пациентов патологии протоков не выявлено, однако процесс сперматогенеза блокирован на разных стадиях. Электронно-микроскопический анализ СК в распластанных ядрах клеток биоптатов позволяет разделить пациентов по характеру отмеченных у них нарушений на 5 групп.

Группа 1. Полное отсутствие клеток сперматогенного ряда. У двух пациентов (А.Н. и Р.А.) при анализе спермограмм диагностирована азооспермия. Фенотип в норме, за исключением гипоплазии яичек. Уровень гормонов в пределах нормы. Признаки аутоиммунного процесса отсутствуют. При гистологическом исследовании тестикулярной ткани в просвете семенных канальцев обнаружены только клетки Сертоли. Сперма-тоциты не выявлены. Причина блока сперматогенеза не установлена.

Группа 2. Арест сперматоцитов на стадиях лептотены-зиготены. У двух пациентов (JI.K. к Д.А.) диагностирована азооспермия; у двух (C.B. и П.А.) ол игозооспермия. В результате КА НПК у этих пациентов выявлены единичные клетки на стадии пахитены, однако в распластанных ядрах обнаруживались лишь тонкие фрагменты осевых элементов хромосом, характерные для ранней лептотены, или "пустые ядра" (рис.13 а,Ь). Арест клеток на стадиях лептотены-зигогены описан ранее Vidal et al. (1982). Причина нарушения формирования СК не ясна. Вероятны нарушения ДНК-белковых взаимодействий, сопряженных с формированием СК.

Группа 3. Арест на стадии пахитены. У 4 пациентов этой группы при анализе эякулята диагностирована азооспермия, у 2 пациентов олиго -зооспермия. У всех пациентов этой группы отмечено повышение количества клеток, в которых наблюдается ассоциация СК аутосомных бивалентов с осями половых хромосом /гпах — 53,8%\ зз.якорив?шке полового бивалента и дегенерация клеток на стадии пахитены-диплотены. В норме доля клеток с такими ассоциациями у мужчин не превышает 4% (Chandley ct al., 1986). Впервые на отсутствие полового пузырька в сперматоцитах I порядка у мужчин с пониженной фертильностью обратили внимание Hulten et al. (1974). Вторым характерным признаком пахитенного ареста у- пациентов является смещение влево формулы распределения количества клеток по подстадиям пахитены от П-0 до П-5 по сравнению с нормой (табл. 7). Стадию пахитены у мужчин принято подразделять на 6 под стадий, различающихся по конфигурации осевых элементов У и X хромосом.

Значительное увеличение числа клеток на стадии П-2 и снижение на стадии П-5 свидетельствует о выраженном, но неполном блоке сперматогенеза на стадии П-2. У всех пациентов этой группы наряду с дегенерирующими клетками на стадии пахитены обнаружены клетки на стадии диплотены, а по результатам КА НПК клетки на стадиях MI и MII и сперматиды, а у пациентов с олигозооспермисй обнаружены также сперматозоиды. В деталях формирования СК и патологии сперматогенеза у пациентов этой группы обнаружен ряд различий, позволяющих разделить пациентов этой группы на две подгруппы.

• Частичный асинапсис хромосом на стадии пахитены. К этой группе отнесены два пациента (В.К. и А.К.) с азооспермией.

У пациента В.К. в 34.5% клеток на стадии пахитены выявлен частичный асинапсис боковых элементов СК, отмеченный не во всех, а в одном-шести СК-бивалентах. Иногда асинапсис захватывал до 2/3 длины бивалента. Частично асинаптирующие биваленты вступали в ассоциацию с половым бивалентом, и в 17,2% клеток происходило "заякори-вание" полового бивалента (рис. 13с,и). Асинапсис наблюдали лишь в 1/3 клеток на стадии пахитены. При гистологическом исследовании тес-тикулярной ткани у В.К. обнаружены признаки аутоиммунного процесса, причина развития которого не установлена.

Пациент А. К. перенес травму яичка, следствием которой явилось развитие аутоиммунного орхита с выраженным гипогонадизмом. При анализе С К на стадии пахитены также обнаружен частичный асинапсис осевых элементов гомологов одного или двух бивалентов. Обнаружены единичные дегенерирующие клетки на стадиях пахитсны-диплотсны. у >* f ;SI,

Г ^ .

Рис. 13 Ультраструктура рас пластанных ядер сперматоцитов I порядка пациентов с нормальным кариатидам и нарушениями сперматогенеза, а — "пустое ядро", b — фрагменты осевых элементов хромосом, с — частичный асинапсис хромосом, d — ассоциация полового (X, Y) бивалента с частично асинагггированным ауто-сомным бивалентом, е — бактерии в ядре сперматоцита I, f — ассоциация полового бивалента с нормальным аугосомным бивалентом, g — атипично вытянутый тонкий CK у пациента с блоком процесса десинапсиса хромосом.

Однако азооспермия у обоих пациентов обусловлена развитием аутоиммунного процесса, приводящего к непроходимости семенных протоков. Таким образом, нами впервые описано сочетание аутоиммунного процесса в яичках с частичным асинапсисом хромосом в профазе I мейоза.

В ядрах обоих пациентов униваленты обнаружены уже на стадиях поздней пахитены-диплотены, что позволяет говорить об олигохиазма-тическом характере нарушения синапсиса этого типа.

• Ассоциация полового бивалента с нормальным бивалентом. У двух пациентов (H.A. и Г.Б.) при анализе эякулята диагностирована азооспермия, у М.Б. олигозооспермия. У пациента К.В. обнаружена олиго- и тератозооспермия (53%), при анализе кариотипа лимфоцитов выявлена ломкость хромосомы 22 пары — аномалия, обычно не приводящая к нарушению фертильности. В препаратах СК отмечена высокая частота ассоциаций аугосомных бивалентов с половым бивалентом (29,8%), причем в ассоциацию вступали биваленты не только 22 пары хромосом. Как следует из анализа данных, приведенных в таблице 7, у К. О количество клеток на подстадии П-5 пахитены было снижено, наблюдался частичный блок сперматогенеза.

Аналогичная каотина тэаспоеделения клеток по подстяттиям пахитены наблюдалась и у М.Б. (олигозооспермия). Мы предполагаем, что возможной причиной ареста клеток на стадии пахитены у этих пациентов служило наличие микроаберраций, не выявляемых даже элсктронно-микроскопически, единственным проявлением которых служил высокий процент ассоциаций аугосомных СК бивалентов с ХУ бивалентом. Аналогичная картина описана нами у стерильных самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям.

• Явление пахитенного ареста у бактерионосителей. У двух пациентов с азооспермией (Н.А. и Г.Б.) в распластанных ядрах сперматоцитов среди СК обнаружены бактерии (рис. 13е,Г). При предварительном бактериологическом исследовании инфицирование не было выявлено. Таким образом, метод анализа СК демонстрирует дополнительные возможности для выявления инфекционного процесса в ткани яичек. Возможно, что наличие бактерий в сперматоцитах может служить провоцирующим фактором для развития аутоиммунного процесса. Гистологическое исследование у данных пациентов не проведено. В результате КА НПК биоптатов у пациентов этой группы обнаружено нерасхождение хромосом в М I и М II и окончательный арест сперматогенеза на уровне сперматид.

Табл. 7. Распределение клеток по подстадиям пахитены Г)-0 - П-5 у мужчин с нормальной и сниженной фертильностыо

Пациент Количество исследованных »слеток Подстадии пахитены

П-0 П-1 П-2 п-з ' П-4 ! П-5

Норма' 86 100% 2 2.3% 17 19.8% 16 18.6% 5 5.8% 17 29 19.8% 33.7%

A.K" 36 100% 5 13.9% 5 13.9% 15 41.6% 3 8.4% -г 4 4 11.1% 11.1%

В.К.~ 29 100% 10 34.5% 2 6.9% 34.5% 5 10.3% 2 2 6.9% 6.9%

К.В." 67 100% 2 3% 4 6% 30 44.8% 9 13.4% 17 5 25.4% 7.4%

Норма* - распределение сперматоцитов в норме по Solan (1980). " - Пациенты группы 3.

Обнаружение бактерий в ядрах сперматоцитов в сочетании с высоким процентом ассоциаций полового бивалента с аутосомным бивалентом и азооспермией или тяжелой формой олигозооспермии позволяет предположить, что у инфицированных пациентов арест на стадии пахитены осуществляется посредством того же механизма, что и селекция клеток у гетерозигот по хромосомным аберрациям.

Группа 4. Блок процесса десинапсиса хромосом на стадии дипло-тены. Пациент К.А. (олигозооспермия). В распластанных ядрах на стадиях зиготены-пахитекы в структуре и поведении С К отклонений от кормы не обнаружено, хотя количество клеток на этих стадиях невелико. На стадиях поздней пахитены-диплотены наблюдается растяжение СК-бивалентов (в среднем в 1.7 паза), неравномерное окрзл-иваяне СК но длине бивалента, сужение центрального пространства СК, деконден-сация хроматина, нерасхождение боковых элементов хромосом (рис.13§) и дегенерация клеток. Стадия дишютекы установлена по структуре полового бивалента.

Группа 5. Арест на стадии сперматид. Пациент Ч А., азооспермия.По результатам КА НПК установлен арест сперматогенеза на стадии сперматид. При КА НПК обнаружено необычное количественное соотношение клеточных форм: лептотена — 3, иахитена — 3, диялотена — 2, спермато-циты II — 11 и сперматид ы — 54. Удалось получить лишь единичные препараты СК, в которых не выявлено никаких отклонений от нормы.

Анализ препаратов СК, полученных из клеток эякулята. Помимо исследований СК в сперматоцитах биоптатов мы предприняли попытку получения препаратов СК из эякулятов двенадцати пациентов с олиго-зооспермией. У пяти из двенадцати пациентов сперматоциты 1 порядка не обнаружены.

У трех пациентов (С А, Т.К. и К.М.) распластанные вдра выглядели "пустыми", содержали фрагменты структур, морфологически сходных с формирующимися осевыми элементами хромосом на стадии лептотены. У пациента (1Ы.И.) среди нормальных СК обнаружен аутосомный СК с асинаптическим участком, который ассоциировал с половым бивалентом.

Клетки на стадии пахитены могут отсутствовать в препаратах, приготовленных из клеток эякулята, у пациентов с блоком сперматогенеза до стадии пахитены, однако они практически недоступны для исследования и у мужчин с нормальным сперматогенезом: в норме незрелые половые клетки составляют всего 4,2% от общего количества клеток эякулята, из них лишь 0,15±0,08% приходится на клетки на стадии пахитены. Однако при аресте сперматогенеза на стадии пахитены количество клеток этого типа в эякуляте может достигать 50% (Джтархава. 1991). В этом случае взятие биопсии целесообразно заменить исследованием СК из эякулята.

Некоторые варианты патологии СК выявляются только в препаратах СК, полученных из клеток эякулята. У двух пациентов (Б.А. и В.Е.) все клетки на стадиях пахитены-диплотены выглядели дегенерирующими; у одного пациента (Г.М.) в двух из семи обнаруженных клеток на стадии пахитены содержалось лишь 12 и 10 С К-бивалентов. Эти находки, по-видимому, обусловлены тем, что в эякулят поступают мертвые клетки, претерпевшие несвойственные клеткам этой стадии, выделение из синцития и продвижение по семявыносяшим путям.

Резюме. При анализе СК у пациентов с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза нами описаны случаи ареста сперматогене )>1 т.п 1 V./.V ^TV, mrfTV (1!\/.1\'1*>1 , T ! 11. Г ; I—> ■ ".1 A ,1.1 Í, Т., Г,, I ■*« . . ,4 "f" '".^r --, . t , T > > , I

Ml. J3CCX О S .¡^i í 1 .'l/v JLipW^tivJUA 1 .4 . 1 iltt . í l-'I.-V .i^il iV7 J ; I AJ1 - J í 11 Vil ^ ны проявляется в полной или частичной потере способности к формированию осевых элементов хромосом и СК. Мы полагаем, что такие наnvîHOHH':] MOrVT п;ЛТ!. ппоЯВЛекием мут- ? ! LÍ м генов OTBPiXCTBC^HbXK 3£1 гЪ.о"мирование белков осевых элементов и СК, а возможно, и нарушением процесса конденсации хромосом и ДНК-белковых взаимодействий.

Наиболее часто (в 19,4% случаев) наблюдался арест на стадии пахи-тены. Неожиданным оказалось обнаружение ареста клеток на стадии па-хитены, обусловленного ассоциацией полового бивалента с частично асинаптирукяцими хромосомами у пациентов с аутоиммунным орхитом.

Испанские исследователи Templado et al. (1981), Navarro et al. (1981) и Vidal et ai. (1982) также описали несколько случаев частичного аеинапси-са отдельных бивалентов у пациентов, страдающих бесплодием, и отметили повышение количества клеток, в которых половой пузырек не формировался. Navarro et al. (1981) выявили данное нарушение синапсиса у нескольких членов одной семьи и предположили наличие в генотипе таких пациентов асинаптической мейотической мутации, приводящей к утрате части точек инициации спаривания. Нарушение синапсиса хромосом на стадии пахитены снижает число хиазм и приводит к формированию унивалентов в M I. В исследованном нами материале униваленты обнаруживались уже на стадии диплотены, что подтверждает представление о том, что частичный асинапсис на стадии пахитены приводит к снижению частоты хиазм. Поэтому факт обнаружения асинаптических и десинаптических нарушений, а также формирование нерегулярной структуры СК может служить основанием для отвода рекомендации оплодотворения ооцитов незрелыми половыми клетками из-за высокого риска возникновения анеуплоидии гамет и потомства.

У двух, исследованных нами пациентов с частичным асинапсисом хромосом обнаружен аутоиммунный орхит. В норме клетки сперматоген-ного ряда и иммунная система изолированы друг от друга гематотести-кулярным барьером. При травме яичка развитие аутоиммунного орхита обусловлено нарушением целостности гематотестикулярного барьера.

Из данных литературы известно, что пахитена является самой уязвимой стадией дифференцировки клеток сперматогенного ряда. Известно также, что аутоиммунный процесс в яичке способен вызвать весь спектр патологии сперматогенеза вплоть до постепенного слущивания всех клеток сперматогенного ряда и сохранения в просвете канальцев лишь измененных клеток Сертоли (Раицина, Ниловский, 1967; Broun et al., 1963; Давыдова, 1972; Райпина, 1985 и др. ). В связи с этим представляется возможным, что нарушение синапсиса у пациентов А. К. и В.К. обусловлено наличием аутоиммунного процесса. Важно, что и в этом случае все этапы пахитенного ареста протекают по единой для самцов млекопитающих схеме.

Нами впервые описаны два случая бактерионосительства, при котором бактерии обнаружены только при исследовании СК в ядрах спер-матоцитов. У этих пациентов обнаружено нерасхождение хромосом в анафазе I и II и окончательный арест клеток на стадии сперматид. Эти два случая весьма показательны в отношении связи между инфекционным процессом в гениталиях и нерасхождением хромосом в мейозе. В литературе имеются данные, статистически подтверждающие связь между воспалительными процессами гениталий, нерасхождением хромосом в анафазе I и II и повышением риска рождения ребенка с синдромом Дауна (Маркарян и др., 1990).

Впервые описан блок десинапсиса хромосом на стадии диплотены, при котором наблюдалась деконденсация хромосом и нерасхождение их на стадии диплотены.

Данные, приведенные в настоящем разделе, свидетельствуют о блоке сперматогенеза как на премейотических, так и на постмейотических стадиях сперматогенеза. Причиной ареста могут служить не только аберрации хромосом, но, возможно, и генные мутации, инфекционный и аутоиммунный процессы в тестикулах. Очевидно, что процессу формирования сперматозоидов сопутствует многоэтапная последовательная презиготическая селекция клеток, которая осуществляется с помощью независимых и свойственных определенной стадии сперматогенеза механизмов ареста клеток.

V. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Образование аутоантител против антигенов СК при сингенной иммунизации самцов мышей /26, 27, 37, 46/. Завершение формирования гематотестикулярного барьера совпадает с течением стадий зиготены-пахитены первой волны сперматогенеза и, следовательно, появлением в онтогенезе самцов антигенов СК (Beigman & Deirichs, 1983).

В серии работ, посвященных методам препаративного выделения СК и молекулярных компонентов СК, нами была показана сохранность ультраструктурных компонентов СК на стадии пахитены после весьма жестких процедур выделения (рис.14). Асинаптированные и десинапти-рованные осевые элементы не обнаружены среди СК /3, 32, 35/.

При сингенной иммунизации самцам мышей вводили препаративно выделенные СК мыши. Полученные афинноочищенные антитела реагировали с антигенами СК на стадиях поздней зиготены и пахитены (при разведении сывороток 1:200). Полученные антитела не реагировали с хромосомами митотических клеток костного мозга мыши. При обработке препаратов СК ДНКазой свечение СК становилось более четким (рис.15).

Рис. 14 Препаративно выделенный СК. Отчетливо идентифицируются боковые элементы (БЭ), центральный элемент балки (стрелка).

Таким образом, был решен вопрос о специфичности антигенов С К на стадии пахитены.

Спонтанные аутоантитела против антигенов СК /27/. В сыворотках новорожденных и 5-дневных самцов мыши аутоантитела против антигенов СК не обнаружены. Сыворотки 19-дневных преиммунизированных самцов содержали аутоантитела против антигенов СК в титрах 1:50— 1:80; 30-дневных 1:80-1:100.

Характерной чертой полового созревания самцов млекопитающих является совпадение двух важнейших морфофизиологических событий: начало первой волны сперматогенеза и формирование эффективного гематотестикулярнохо барьера.

По нашим наблюдениям, первая волна сперматогенеза у мышей характеризуется множеством ошибок синапсиса хромосом, проявляющихся в сохранении зон асинапсиса, формировании СК-мультивалентов и ассоциации асинаптических участков осевых элементов аутосом с половым бивалентом. Нарушения синапсиса хромосом в сперматоцитах первой волны сперматогенеза описаны и у хомячков (Ош^аЦ а а!., 1987).

Гибель части сперматоцитов первой волны и незрелость гематотес-тикулярного барьера делают возможным проникновение Т-лимфоцитов в канальцы семенника. Возможно, этим и объясняется накопление аутоантител против антигенов СК у молодых самцов.

В качестве вторичных антител нами использованы только афинноочи-щенные антитела против мыши, человека и кролика или белок А, конъюгированные с ФИТЦ или коллоидным золотом. Во всех контрольных экспериментах, поставленных с целью выяснения специфичности первичных и вторичных сывороток, получены отрицательные результаты.

Локализация ЯесА-подобных белков в ядрах сперматоцитов 1 мыши /25, 28/. В последние годы все большее значение придается роли СК в осуществлении процесса рекомбинации гомологичных хромосом

Maguire, 1995; Heyting, 1996), в связи с чем интенсивно исследуется вопрос о молекулярных компонентах мейотической клетки, участвующих в рекомбинации и их связи с

СЪГ ЦоИ^ЛЛАЛ nAnPTTAX^TTDtirTlk i О ОТ/ЛИ i vx\.< л.л^л-лiwuivv iivjyviivxs.! jriujiixjiivi и ч/ivm отношении представляется исследование RecA-подобных белков.

RecA-(юлок впервые вьтяелен из /' coli и известен как белок, ответственный за бактериальную рекомбинацию. В дальнейшем несколько групп RecA-подобных белков были обнаружены у грибов, растений и млекопитающих (Jachymezyket aJ.1981; Friedbeig, 1988; Terasawa et al., 1995; Haaf et al., 1995; Ashley, 1995).

Одним из подходов к решению вопроса о связи между С К и RecA-подобными белками является иммуноцитохимческое исследование локализации антигенов этих белков.

Нами впервые проведено свето- и электронно-микроскопическое исследование локализации RecA-подобных белков в ядрах распластанных сперматоцитов I мыши. В качестве первичных антител использованы афинноочищенные поликлональные антитела fgG кролика против RecA-белков, выделенных из E.coli. Идентификация антител в препаратах распластанных СК мыши проведена с помощью обработки препаратов белком А, конъюгированным с коллоидным золотом.

На стадии прелептотены-зиготены выявлено интенсивное связывание антител против RecA-подобных белков с фибриллами хроматина на всем пространстве ядра (рис. 16а). Интенсивное связывание антител против RecA-подобных белков с петлями хроматина на стадии лептотены-зиготены, вероятно, обусловлено их ролью в поиске гомологов, ком-пакгазации хроматина и инициации синапсиса хромосом. Эти функции RecA-подобных белков выявлены при исследовании ранних стадий мей-оза у мутантов базидиомицет. У radii мутантов, выявлен блок мейоза, которому предшествовало нарушение компактизации и синапсиса хромосом (Rainesh & Zolan, 1995).

На стадиях зиготены-пахитены антитела против RecA-подобных белков также связываются с фибриллами хроматина, немногочисленные гранулы связаны с боковыми элементами СК.

В центральном пространстве СК антигены RecA-подобных белков локализуются в связи со структурами, морфологически соответствующими рекомбинационным узелкам (рис. 16Ь). Последнее коррелирует с

Рис. 15 Свечение СК самца мыши. Первичные антитела получены при сикгенной иммунизации самцов мышеи препаративно выделенными СК мыши.

Щ8Ш5 шя mm

ШШШ

HÉI тт0Я/Ш

4Mt

Шятт-j" i -»

••-ÉL rp

5Э

Рис. 16 Локализация антигенов RecA-подобных белков: а — прелептотена. Гранулы золота связаны с фибриллами хроматина на всем пространстве ядра; b — СК на стадии пахите ны, гранулы золота связаны с хроматином, боковыми элементами (БЭ) и лежат в центральном пространстве СК. представлениями о ведущей роли RecA-подобных белков в рекомбинации эукариот (Rose et al., 1990; Bishop, 1994; Sato, 1995). Поданным Rose et al. (1990), у гомозиготных мутантов дрожжей rad50 процесс рекомбинации блокирован. Кроме того, получены данные, о том, что Rad51 (RecA-подобный белок эукариот) является структурным компонентом ранних и поздних рекомбинационных узелков и участвует на стадии зи-готены в инициации синапсиса, контроле гомологии синаптирующих участков хромосом, а на стадии пахитены в реципрокной рекомбинации (Terasawa et al., 1995; Haaf et al., 1995; Ashley, 1995; Anderson, 1996).

На стадии диплотены электронно-микроскопически гранулы золота не обнаружены. Однако при светомикроскопическом исследовании на стадии диплотены отмечено свечение теломер и сохранившихся фрагментов СК. По данным Dobson et al. (1994) белок Rad51 колокализуется с белком COR1 в области кинетохоров вплоть до М I и, по-видимому, играет роль в удержании сестринских хроматид.

Наши данные коррелируют с данными светомикроскопического исследования антигенов белка Rad51 в сперматоцитах мыши (Ashley et al., 1995).

На препаратах, обработанных ДНКазой, гранулы золота выявляются вблизи СК и в связи с боковыми элементами СК. Рекомбинационные узелки не выявляются, что соответствует данным об их чувствительности к обработке ДНКазой (Debus, 1978). Распределение и концентрация гранул золота на препаратах, исследованных нами, сходна с картиной распределения антигенов ДНК, связанных с СК после обработки препаратов СК ДНКазой (Nin et al., 1993). Это сходство и интенсивное связывание антител против RecA-подобных белков с фибриллами хроматина на стадии лептотены, позволяют предположить, что на препаратах, обработанных ДНКазой, гранулы золота выявляют антигены RscA-подобных белков, связанные со специфическими участками ДНК, которые ассоциированы с СК и не поддаются обработке ДНКазой. <

Установлена тестис-специфичность RecA-подобных белков: в гистологических препаратах ни одной из соматических тканей мыши антигены RecA-подобных белков не обнаружены, и выявлены только в препаратах тестикуд. Sato et ai. (1995) обнаружили экспрессию гена RecA-подобного белка (гомологичного белку DMC1 сахаромицет) — MmLiml5 только в клетках тестикулярной ткани и не выявили ее в тканях мозга, печени, селезенки, почки и сердца мыши.

Консервативность молекулярных компонентов СК. Нами установлено, что аутоантитела против антигенов С К мыши реагируют с антигенами СК крысы и лошади, а сыворотки, полученные от человека, и кролика, дают положительную реакцию с антигенами СК мыши. Антитела кролика против антигенов RecA-подобных белков дают положительную реакцию с хроматином и СК быка, крысы, кролика, сверчка и ржи. Приведенные данные свидетельствуют о консервативности молекулярных компонентов СК - древнейшей структуры мейотичсского ядра, возникшей на заре эволюции эукариот. Эти данные коррелируют с данными других исследователей, в частности Ashley et al. (1995) выявили антигены белка Rad51 в сперматоцитах мыши и кур с помощью антител кролика против антигенов белка человека Hs Rad51.

VI. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И ДЕГРАДАЦИИ СК

Лептотена. На стадии лептотены-зиготены мейотические хромосомы у многих видов животных и растений образуют фигуру букета и сохраняют так называемую RABL-ориентацию, при которой центромеры ориентированы на одном, а теломеры на другом полюсе ядра, и возвращаются к такой ориентации на стадии телофазы 1 (Rabí, 1885; Rhodes, 1961; Fussell, 1987).

Синапсис хромосом начинается с коориентации гомологов. Фиксация хромосом на внутренней поверхности ядерной оболочки и их движение по генетически предопределенным траекториям в значительной мере определяет координацию процессов синапсиса и сегрегации хромосом в пространстве и во времени (Moens, 1973; Moses, 1977; Solari, 1977; Fussell, 1987; Чадов, 1990).

Очевидно, что для успешного синапсиса хромосом существенным является не только коориентация гомологов, но и одинаковая степень компактизации гомологичных хромосом, выравнивание их длины, приведение точек инициации синапсиса гомологичных хромосом в положение противостояния. Эти функции осуществляются с участием осевого элемента хромосом. Формирование осевого элемента начинается на стадии лептотены, как правило, с теломерных концов хромосом.

Зигстенг. У млекопитающих скнапсис хромосом ка стадии зиготены начинается, как правило, с теломерных концов и распространяется последовательно по направлению к центромерному участку хромосом. Быстрое продвижение синапсиса вызывает дополнительную инициацию синапсиса между спаренными гомологами. Такой характер синапсиса обеспечивает механизм положительной рекомбинационной интерференции (Мозеб, 1985; ОоЬбоп, 1994). Синапсис начинается до завершения формирования осевого элемента по всей длине хромосомы, однако синапсис происходит только в тех участках, где осевые элементы хромосом уже сформированы. У растений, в том числе исследованных нами злаков (ржи, пшеницы и ячменя), синапсис хромосом носит пунктирный характер (НавепказврГ, 1984 и др.).

У гетерозигот по хромосомным транслокациям синапсис хромосом задерживается иногда до стадии поздней пахитены.

У асинаптических мутантов ржи и ,уу9 синапсис хромосом на стадии зиготены-пахитены не наступает, однако теломеры унивален-тов расходятся к противоположным полюсам ядра, что характерно для хромосом нормальных растений, переходящих на стадию пахитены.

Пахитена. Согласно гипотезе СйапсНеу (1986) существует прямая зависимость между очередностью, с которой К-, (3-й С-сегменты вступают в 8-фазу, и очередностью и эффективностью синапсиса между участками соответствующих сегментов на стадии профазы I. По мнению СЬадсИеу, наличие брешей на стадии пахитены в участках СК, соответствующих С-сегментам, свидетельствует о неэффективности синапсиса. Однако, по нашим данным, бреши в структуре СК гомологичных хромосом являются артефактом, обнаруживаются только при контрастировании ^N0. при значениях рН, близких к нейтральному и не выявляются при контрастировании СК кислым (рН=3,5~4,5) раствором А§!403. Вместе с тем, выявленная нами зависимость уровня контрастирования различных сегментов С К от значения рН контрастирующего раствора, хотя и подтверждает непрерывность СК по всей длине бивалента, тем не менее, согласуется с представлением о неоднородности структуры СК.

Пахитенный арест. Выше мы рассмотрели вопрос о механизме пахитен-нош ареста. Нами впервые обнаружены признаки пахитенного ареста у самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям, а также у мужчин с нормальным кариотипом и аугоимунным процессом в яичке и у бактерионосителей. Механизм включения пахитенного ареста у этих групп пациентов не ясен. Представляет интерес факт включения механизма одного типа презилотяческого отбора как при нарушении синапсиса осевых элементов, так и при нормальном формировании СК на стадии пахитены.

Нарушения процесса синапсиса хромосом на стадии пахитены у гетерозигот по хромосомным транслокациям /1, 5, 4, 21/.У гетерозигот по Шэ-транслокациям, реципрокным и нереципрокным транслокациям выявлена задержка синапсиса транслоцированных хромосом с нормальными хромосомами. В области транслокаций в структуре асинапти-роващшх участков осевых элементов хромосом обнаружены бреши. Задержка синапсиса обнаружена при формировании бивалентов КЪ-мега-центриков у слепушонок с 2«=34, гомозиготных по Ш)-транслокациям.

У гетерозигот по КЪ-транслокациям в синапсис вступают три хромосомы: два акроцентрика и один метацентрик. Прицентромерные те-ломеры акроцентрика связаны с ядерной мембраной, а центромера метацентрика не связана. Степень растяжения и конденсации хроматина ИЪ-метацентрика зависит от удаленности точек прикрепления тело-мер -метацентрика друг от друга и от того, как ориентированы короткие плечи гомологичных ему акроцентриков относительно друг друга и центромеры метацентрика.

Формирование СК-тривалента всегда начинается с прителомерных концов метацентрика. Короткие плечи акроцентриков не имеют гомологов и, если на стадии букета они развернуты по разные стороны от п р и центро мерного участка метацентрика, то происходит растяжение метацентрика, тормозящее конденсацию хроматина. На препаратах СК в этой области осевых элементов метацентрика выявляется брешь. Таким образом, как и на стадии лептотены, проявляется зависимость между уровнем конденсации хроматина и формированием осевого элемента хромосом.

У слепушонок, гетерозиготных по множественным ЯЬ-транслокаци-ям, бреши в структуре осевых элементов и запаздывание синапсиса отмечено не во всех СК-тривалентах одной клетки, что является еще одним подтверждением того, что запаздывание синапсиса хромосом у гетерозигот обусловлено нарушением коориентации хромосом, нарушением пространственных связей между ними.

Случайное физическое сближение коротких плеч акроцентриков соседних открытых тривалентов приводит к формированию СК между ними. Таким образом образуются цепочки тривалентов. Формирование цепочек хромосом приводит к интерлокингу хромосом, что вызывает дополнительное растяжение хромосом. У слепушонок, гетерозиготных по множественным Из-транслокациям, полная коррекция синапсиса происходит только на стадии поздней пахитены и лишь в единичных клетках. Формирование третьего плеча СК-тривалента также обусловлено физическим сближением коротких плеч акроцентриков и наличием в них блоков С-гетерохроматина.

В процессе формирования СК-тетравалента у гетерозигот по рецип-рокным и нереципрокным транслокациям, каждая из четырех синап-тирующих хромосом, фиксированных на ядерной оболочке, также испытывает неестественное растяжение, что на стадии поздней зиготе-ны-ранней пахитены приводит к формированию брешей в структуре гырех хромосом тетравалекта. Последнее обусловливает формирование псевдобивалентов и псевдотривалентов СК. Поэтому для идентификации истинной природы хромосомных транслокаций в препаратах СК необходимо точно идентифицировать стадии профазы1 мейоза и найти клетки, в которых завершен симапсис гете-роморфных хромосом.

Описанные нами нарушения синапсиса хромосом в зоне транслокаций наглядно демонстрируют разобщение различных частей синапти-рующих хромосом у гетерозигот по транслокациям, что, по данным Moens (1985), Бородина (1992), Reed et ai. (1992), Maguire (1995) и Heyting (1996) приводит к нарушению интерференции кроссинговера и, как правило, увеличению частоты хиазм в неперестроенных районах хромосом. Важнейшим представляется выявление задержки синапсиса хромосом в прицентромерной области бивалентов двух гомологичных Rb-метацентриков у слепушонок (2п=34). Эти наблюдения свидетельствуют о связи между эволюцией хромосом и их коориентацией в профазе I мейоза и могут служить одним из объяснений причин существования районов хромосом, в которых рекомбинация ограничена (Высоцкая, 1993).

Блок процесса десинапсиса хромосом /33/. В главе, посвященной мужскому бесплодию, описаны детали поведения СК при блоке процесса десинапсиса хромосом. При этой патологии мейоза половой пузырек формируется и половые хромосомы принимают конфигурацию, характерную для стадии диплотены, однако растянутые аутосомы не десинаптируют.

Аналогичную картину мы наблюдали при анализе СК у самцов мышей после введения Vm26 ингибитора ДНК-топоизомеразы II. ДНК-топоизомераза II является структурным компонентом скефолда мито-тических хромосом и осевых (боковых) элементов мейотических хромосом (Earnshaw et al., 1985; Moens & Earnshaw, 1989). ДНК-топоизоме-раза II регулирует процесс рекомбинации и конденсации хроматина и ответственна за процесс сегрегации сестринских хроматид в митозе и хромосом в мейозе (Holm et al., 1985; Szostak et al.,1983; Moens, 1990). Rose et al. (1990) показали, что у мутантов дрожжей тор2/тор2 нарушен процесс расхождения хромосом в А1.

Таким образом, нами выявлен еще один тип ареста клеток в профазе I мейоза млекопитающих, протекающий без "заякоривания" полового бивалента арест клеток на границе между стадиями пахитены и диплотены.

Диплотена-диахинез. Исследование ультратонких срезов ядер спер-матоцитов на стадии диплотены показало, что осевые элементы хромосом фрагментируются и деградируют на стадии поздней диплотены, а короткие участки СК сохраняются в зоне хиазм (Soiari, 1970). Позднее иммуноцитохимически было обнаружено, что распределение си-наптическего антигена Syiil (SCP1) соответствует распределению хиазм в бивалентах (Dobson et ai., 1994). Эти данные подтвердили представление о том, что обеспечение стабильности хиазм — одна из. важнейших Функций С К. сохраняющая свое значение до оасхождекия гомологов и играющая роль в правильном распределении генетического материала между гаметами (Reed et а], 1992; Maguire,1995; Heyting, 1996). Вопрос о судьбе структурных компонентов осевых элементов хромосом после диплотены долгое время оставался открытым.

Диплотена в материнских клетках пыльцы ржи Seca/e ceríaie /14, 41/. При обычном способе контрастирования СК ржи и других злаков AgNO, (при рН=7) нами на стадии диплотены обнаружено, что отталкивание боковых элементов хромосом выражено слабо, центральное пространство СК неравномерно расширено, боковые элементы теряют упругость и формируют шпильки и утолщения, СК фрагментированы. Постепенно количество и длина фрагментов СК и разделяющих их брешей увеличивается, создавая впечатление полной деструкции структурных компонентов СК на стадиях поздней диплотены-диакинеза (рис.17а).

Однако при контрастировании препаратов СК ржи кислым (рН =4) раствором AgNO, нам удалось обнаружить не дегенерацию, а модификацию боковых элементов СК на стадии диплотены. Оказалось, что в участках СК, в которых при обычном способе контрастирования обнаруживались бреши, боковые (осевые) элементы вытягиваются, тонкие нити формируют петли и постепенно укладываются в спирали с шагом около 4 микрон. Существенным представляется обнаружение вилок расщепления в зоне которых осевой элемент разделяется на две более тонкие нити (pnc.l7d).

В течение поздней диплотены-диакинеза весь материал осевых элементов постепенно вовлекается в процесс выпетливания и формирования спиралей (рис. 17с). На сближенных участках спиралей формируются парные симметричные утолщения концы таких утолщенных фрагментов сближаются и формируют замкнутые структуры. В единичных препаратах вблизи теломерных участков хромосом обнаружены небольшие клубки нитей. Возможно, что такие клубки представляют собой остатки дегенерирующих осевых элементов (рис. 17е).

Осевые элементы хромосом асинаптического мутантов ржи /14/. В ядрах асинаптического мутанта ржи sy9 вытягивание осевых элементов хромосом и формирование спиралей наступают уже на стадии, соответствующей пахитене. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что мутант sy9 принадлежит к числу истинных асинаптических мутантов: на

-ч

ЦГ ь С ч г

• • - • / Л

Ъч Ъ / С е

Рис. 17 Диплотена в клетках ржи: а — окрашивание СК при рН=7, фрагментация СК, звездочка в области бреши в структуре СК; Ь—е — окрашивание СК при рН=4: Ь — выпетливание осевою элемента в области бреши (звездочка); с1 — выпетливание и раздвоение осевого элемента (стрелка); с — с парализация осевых элементов на стадии поздней диллотены; е — концентрация остатков осевого элемента в области теломер хромосом. стадии профазы I в клетках этого мутанта СК не формируются, а на стадии М I обнаруживаются 14 унивалентов. Таким образом, осевые элементы хромосом на стадии, соответствующей пахитене, асинаптирова-ны, а вытягивание и спирализация осевых элементов не сдерживаются пунктирным десинапсисом.

Диплотена-диакинез в сперматоцитах мыши /16, 41/.При контрастировании СК раствором А§МО, с рН=7 на стадии ранней диплотены у самцов мыши наблюдается десинапсис боковых элементов СК, тело-мерные концы которых утолщены. Связь между осевыми элементами гомологичных хромосом сохраняется в зоне хиазм. На стадии поздней диплотены наблюдается вытягивание в длину, фрагментация и деградация осевых элементов хромосом (рис. 18а).

В результате окрашивания С К млекопитающих кислым раствором AgN03 (рН=4~5,5) на стадиях поздней диплотены-диакинеза нами обнаружены тонкие волнистые непрерывные осевые элементы хромосом. На этой стадии интенсивно окрашиваются электронно-плотные теломерные зоны осевых элементов (рис.18Ь—d). Оси половых хромосом неравномерно утолщены и у некоторых объектов наблюдается расслоение осевых элементов на две, три и четыре субъединицы (рис.18е).

Преемственность между осевыми элементами хромосом и корами сестринских ХООМЗТИИ- Потту^скнь^ *iY?н 'it!;;Mr crxtттртр:ттт^лт^уууг о том, что на стадии диплотены происходит не деградация осевых элементов хромосом, а модификация их структурной организации. Позднее Bobso'n et al. (1994) показали, что коровый белок Corl, являющийся структурным компонентом осевого элемента хромосом, а далее бокового элемента С К, выявляется вдоль оси гомологичных хромосом вплоть до метафазы I. В зонах центромер белок Corl сохраняется вплоть до анафазы II. По мнению Moens & Spyropoulos (1995), Corl обеспечивает иммобилизацию сестринских хроматид вплоть до момента их расхождения на стадии анафазы II.

По нашим данным при переходе от диплотены к диакинезу модификация структурной организации осевых элементов хромосом приводит к декомпакгизации осевых элементов. Вероятно, в процессе десинапсиса хромосом удаляются не только молекулярные компоненты центрального элемента СК, но и часть молекулярных компонентов осевых элементов хромосом. В связи с этим интересны данные Schmekel et al. (1996) о том, что один из трех доменов основного синапгического белка SCP1 С-терминальный домен, способный присоединяться к ДНК, локализован в глубине бокового элемента СК; М-домен тянется в центральное пространство, а N -домен является частью центрального элемента СК. Удаление белка SCP1 на стадии диплотены приводит к десинапсису боковых элементов СК, а так как С-домен этого белка локализуется внутри бокового элемента, то возможно, его удаление ослабляет связь бокового элемента с ДНК и способствует декомпакгизации как ДНК, так и собственно осевого элемента, чем и обусловливается его модификация.

Выше описана динамика таких мейотических белков, как Rec-A-подобные белки и ДНК-топоизомераза II. О существовании различий в антигенной структуре СК и неспаренного осевого элемента свидетельствуют и связывание аутоантител только с СК, и выявленная нами различная чувствительность опорных структур хромосом на стадиях пахитены-диакинеза к контрастированию при значениях рН, близких к нейтральному.

Данные, полученные нами относительно структурной модификации осевых элементов хромосом на стадиях диплотены-диакинеза, нашли подтверждение в работах других исследователей.

Stack (1991) обнаружил спирализованные коры (оси) в мейотичес

Рис. 18 Диплотена мыши: а — контрастирование при рН~7, фрагментация осевых элементов (ОЭ); Ь~е - контрастирование при рН=4, осевые элементы непрерывны, нерегулярно утолщены, ё-серповидные структуры; е — расслоение осевых элементов половых хромосом. ких хромосомах лилии под световым микроскопом и соотнес их с обнаруженными нами спирализованными осями.

При использовании стандартного способа контрастирования СК кузнечика СНонЫрриа ]исипйт на стадии ранней диплотены обнаружена фрагментация СК. На стадии диакинеза в каждой хромосоме обнаружена ось, в некоторых участках которой отчетливо идентифицируется расслоение на две нити, более того, на стадии прометафазы I в зоне хиазмы обнаружены четыре оси, две из которых пересекаются (Rufas et al., 1992). Аналогичные данные получены и в отношении динамики осевых структур хромосом и хроматид в профазе I мейоза в сперматоцитах ящерицы Sceloporusgrammics (Reed et al., 1992).

На основании собственных данных и данных литературы, в том числе опубликованных нами, Rafas et al. предложили новую модель организации мейотяческой хромосомы. Модель предполагает существование единого принципа организации хроматина митотической и мейо-тической хромосом, заключающегося в связи радиальных петель хроматина с осями хроматид. На стадии лептотены происходит объединение коров сестринских хроматид, которые по мере компакгазацин хроматика спирально скручиваются и формируют единый компактный осевой элемент, располагающийся на периферии каждого гомолога. Ассоциированные оси служат каркасом для специфических компонентов боковых элементов. Боковые элементы соединены друг с другом посредством поперечных балок центрального пространства С К. На стадии диплотены специфические компоненты С К высвобождаются, чем и объясняется исчезновение СК. Последующая компактизация хромосом позволяет идентифицировать сближенные хроматидные оси, начиная со стадии поздней диплотены.

В целом модель, предложенная Rufas et al., адекватно отражает изменчивость и преемственность осевых элементов мейотических хромосом: осевых элементов хромосом, боковых элементов СК и осей сестринских хроматид. Однако собственные данные и данные литературы последних лет требуют пересмотра некоторых деталей этой модели.

• Осевые элементы не исчезают на стадии диплотены: они просто не поддаются контрастированию при нейтральных значениях рН.

• Спираяизация осевых структур мейотических хромосом наблюдается, как это обнаружили Nokkaio & Nokkalo (1985), только при фиксации препаратов хромосом на стекле, а именно так и происходит фиксация препаратов распластанных препаратов хромосом. В ядрах ржи в зоне выпетливания и вилок раздвоения осевого элемента на две субъединицы спираяизация тонких нитей не отмечена.

• Представляется сомнительным перемещение осей хроматид с периферии в центр хромосомы. Наиболее реальным представляется наличие скрепок, которые удерживают петли хроматина по одну сторону от осевого элемента, начиная со стадии лептотены. Вероятно, удаление скрепок на стадии диплотены позволяет петлям хроматина расположиться по обе стороны от осевого элемента хромосомы.

• В модели не отражены данные о многонитчатости боковых элементов СК. Эти данные учтены в модели Mazo & Gil-Alberdi (1986). Согласно модели Mazo & Gil-Alberdi, боковой элемент СК объединяет две оси сестринских хроматид, состоящие из нескольких субъединиц, связанных сетью тонких нитей. Мы также наблюдали расслоение осевого элемента половых хромосом на несколько субъединиц в спермато-цитах двух видов слепушонок, мыши, крысы и осевых элементов В-Хр.

Особый интерес представляют данные, касающиеся генетической регуляции процесса модификации осевого элемента и роли этого процесса для последующего расхождения хромосом, формирования полноценных гамет и фертильностк организмов, полученные при исследовании мейотических мутантов. У мей-мутанта кукурузы pral (prophase 1 arrest), у которого мейоз блокируется на стадии профазы I, обнаружена модификация осевых элементов СК, характерной чертой которой является их расслоение: первоначально на две, а далее на несколько субъедкниц (Гребенникова, Голубовская, 1991).

Резюме. В последнем обобщающем разделе работы предпринята попытка описания динамики формирования и деградации СК в профазе 1 мейоза в норме и при патологии мейоза. Очевидно, что детали структуры и поведения осевых элементов хромосом и СК, динамика формирования и деградации СК и даже детали модификации осевых элементов хромосом на стадиях диплотены-диаккнеза имеют самостоятельное диагностическое значение.

Иммуноцитохимические исследования значительно расширили представления о структурной организации СК и дали дополнительные возможности для исследования природы мейотических мутаций Вместе с тем, вопрос о роли и значении этой загадочной структуры в мейозе, онто- и филогенезе эукариот остается предметом живейшей дискуссии, динамику и основное наполнение которой отражают даже названия опубликованных в последние годы обзоров "Is the Synaptonemal Complex a Disjanction Machine?" (Maquire, 1995) и "The Synaptonemal Complex the chaperone of crossing over" (Hasenkampf, 1996). выводы

1. Метод электронно-микроскопического анализа СК на стадиях зиготе-ны-диплотены позволяет выявлять в 2 раза больше хромосомных аберраций, чем светомикроскопический анализ хромосом на стадии метафазы I.

2. Преимущества исследования мейоза на стадиях зиготены-диплоте-ны у гетерозигот по хромосомным перестройкам и у мейотических мутантов состоят в следующем:

V/ Г'Я&ДМПК ; ^ У ГРТРНГ! ^ ГС:'Г!!! '.V оп и№Яглпин папа. , у ^ ^. — . - - — . с.: ^., 1 ^ ••-•• . . . ,.», . - ■ ^ • >•. . стройкам, происходит арест клеток на стадии пахитены. Такие клетки не доступны для анализа на стадии метафазы !; б) у облученных самцов, гетерозиготных по реципрокным транслокациям, на стадиях поздней пахитены-диплотены некоторые тет-раваленты распадаются на два У-образных бивалента, вследствие разрыва-соединения в точках пересечения двух синаптирующих хромосом. Такие транслокации не учитываются при количественной оценке мутагенного эффекта на стадии метафазы I; в) у млекопитающих, гетерозиготных по инверсиям, на стадии поздней пахитены, вследствие действия механизма синаптическй пригонки, происходит сглаживание инверсионных петель, и инверсии не выявляются на стадии метафазы I; г) впервые у стерильных самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям в Т-локусе хромосом 17 пары обнаружены случаи ассоциации Х-хромосомы с морфологически нормальным аутосомным бивалентом, что позволяет рассматривать Х-аутосомную ассоциацию как косвенное указание на наличие микроаберраций в аутосо-ме; д) как у асинаптических, так и у десинаптических мутантов растений на стадии метафазы I выявляются униваленты хромосом. Установить истинный характер мейотической мутации: асинаптической (например, и ву9 у веса1е сепа1е) или десинаптической (яуЗ) удается только при анализе СК на стадиях зиготены-диплотены.

3. Выявлены общие закономерности синапсиса хромосом у гетерозигот по реципрокным, нереципрокным и ЯЬ-транслокациям: нарушение коо-риентации хромосом; растяжение хромосом между точками их прикрепления к ядерной оболочке; запаздывание формирования осевого элемента и СК в зонах транслокаций, приводящее к формированию псевдобивалентов и псевдотривалентов СК; коррекция синапсиса гетероморфных хромосом на стадии поздней пахитены.

4. Исследованы СК различных кариоморф слепушонок £. Залоге/ и гибридов Р1 между ними, гетерозиготных по разному числу ЯЬ-транслока-ций. Выявлены следующие закономерности синапсиса хромосом у гетерозигот по ЯЬ — транслокациям: а) у гибридов 2п=33 на стадии ранней пахитены обнаружены 15 бивалентов и один закрытый тривалент, что коррелирует с данными о минимальной репродуктивной изоляции кариоморф с 2п=32 и 2п=34; б) у гибридов 2п=51, на стадии пахитены обнаружен тетравалент, сформированный двумя РЬ-метацентриками, гомологичными только по одному из плеч, и двумя акроцектрикам, что коррелирует с высоким уровнем репродуктивной изоляции родительских форм этих гибридов: Е. а/а/'сив (2п=52) и Е. ¿а/?гетерологичных СК между ними. На стадии поздней пахитены такие цепочки лишь в единичных клетках распадаются на свободные триваленты, что коррелирует с высоким уровнем репродуктивной изоляции их родительских форм: с 2п=50 и 2п=48, а также с 2п=54и 2=34; г) у гибридов Р2 в состав цепочек могут включаться триваленты, тетраваленты и непарные хромосомы; д) у самцов £. tancre\, половой бивалент (X, X) выселяется на периферию клетки уже на стадиях зиготены— ранней пахитены; у гибридов ассоциация полового бивалента с осями асинаптических осевых элементов обнаружена лишь в единичных клетках.

5. У самцов Аробетиэ репти1ае в профазе! мейоза В-хромосомы формируют уни-, би- и мультиваленты. Впервые обнаружено увеличение В-хро-мосом при продвижении клеток от стадии зиготены к стадии диплотены.

Показано, что ассоциация В-хромосом с половым бивалентом не вызывает "заякоривания" полового бивалента и не препятствует формированию полового пузырька.

6. Отсутствие пахитенного ареста у самцов двух видов — Е. 1апсге1 и А. ретпзЫае, по-видимому, служит зволюционно-адаптивным приспособлением, способствующим прохождению профазы I мейоза и поддержанию хромосомного полиморфизма у этих видов.

7. Исследованы СК у самцов трех видов рода Е11оЬш$. Проанализированы возможные пути эволюции половых хромосом внутри этого рода: а) показано, что у самцов Е. ШсосарШиэ между половыми хромосомами X и У не формируется хиазма, они десинаптируют преждевременно и формируют униваленты уже на стадии диплотены. Эти особенности поведения половых хромосом могут приводить к формированию гамет, несбалансированных по половым хромосомам; б) выдвинуто предположение, что перечисленные особенности поведения половых хромосом унаследованы Е. ШсосарШив от общего предка всех ныне живущих видов рода ЕНоЫиэ и, что они могли служить причиной утраты У хромосомы предком видов Е. tancrei и Е. Ыезсепз', в) анализ СК подтвердил отсутствие У хромосомы (или её фрагмента) у Е. Iапсге/ (XX, XX) и Е. ¡меэсепз (ХО, ХО); г) утрата У хромосомы компенсировалась формированием новых кеизвестных) механизмов определения пола у £. '¿зпсге: и £. ¡Шеэсепз, что подтверждается данными других исследователей об отсутствии гена Эгу в генотипах самцов Е. 1апсге'1 и Е. Мезсепз.

3. Результаты, полученные при анализе СК, расширяют представление о механизмах презиготической селекции кариотипов в профазе 1 мейоза, её влиянии-на.фертильность самцов и роли в эволюции кариотипов. 8. У мужнин с нормальным кариотипом (46,ХУ) и нарушениями фер-тильности ранее неясной этиологии выявлены специфические аномалии структуры СК, которые приводят к нарушению сперматогенеза на разных стадиях профазы I мейоза: а) полное отсутствие клеток сперматогенного ряда; б) формирование лишь коротких фрагментов осевых элементов в так называемых "пустых ядрах" или коротких фрагментов СК у пациентов с блоком сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены; в) частичный асинапсис осевых элементов хромосом и ассоциа-, ция асинаптированных осевых элементов с половым бивалентом у пациентов с блоком сперматогенеза на стадии пахитены; г) ассоциация полового бивалента с нормальными СК и блок сперматогенеза на стадии пахитены; д) блок процесса десинапсиса хромосом и дегенерация клеток на стадии диплотены.

10. Блок десинапсиса хромосом впервые воспроизведен экспериментально путем введения самцам мышей ингибиторов ДНК-топоизомеразы И, что подтверждает участие этого фермента в процессе десинапсиса хромсосом.

11 Опровергнуто представление о деструкции структурных компонентов осевых элементов хромосом на стадии диплотены. Впервые выявлена модификация осевых элементов хромосом на стадии диплотены-диакинеза в материнских клетках пыльцы ржи и сперматоцитах мыши.

12. Впервые проведено сравнительное иммуноцитохимическое электронно-микроскопическое исследование локализации антигенов ЯесА-подобных белков в ядрах сперматоцитов мыши. Показано, что антипены ЯесА-подобных белков связаны с хроматином, СК и рекомбинационными узелками, последнее коррелирует с участием ИесА-подобных белков в рекомбинации.

Подтверадена консервативность антигенов ИесА-подобных белков в пределах класса млекопитающих.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах и сборниках трудов

1. Коломиец О.Л., Ляпунова Е.А., Мазурова Т.Ф., Якипа И.Ю., Богданов

Ю.Ф. Различные пути формирования СК-тривалентов у габридов, несущих робертсоновские транслокации. В сб.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М. Наука., 1985. С. 72—84.

2. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Кариотипирование на основе синаптонемных комплексов и применение этого метода в цитогенетике. Генетика. 1985. Т. 21. № 15. С. 793-802.

3. Горач Г.Г., Сафронов В.В., Коломиец О.Л., Дадашев С.Я., Богданов Ю.Ф.

Биохимический и ультраструктурный анализ синаптонемных комплексов в сперматоцитах млекопитающих. Цитология. 1985. Т. 27. №12. С.1347—1351.

4. Коломиец О.Л., Ляпунова Е.А., Мазурова Т.Ф., Янина И.Ю., Богданов

Ю.Ф. Участие гетерохроматина в формировании цепочек синаптонем-ных комплексов у животных, гетерозиготных по робертсоновским транслокациям. Генетика. 1986. Т. 22. №6. С. 273-283.

5. Bogdanov Yu F., Kolomiets O.L., Lyapunova E.A., Yanina I.Yu., Mazurova T.F.

Synaptonemal complexes and chromosomes chaînes in the rodent Ellobius talpinus heterozygous for Robertsonian translocations. Chromosoma. 1986. V. 94. P. 94-102.

6. Kalikinskaya E.I., Kolomiets O.L., Shevchenko V.A., Bogdanov Yu.F. Chromosomai aberrations in F1 from irradiated male mice studied by their synaptonemal complexes. Mutation Research. 1986. V.174. P.59-65.

7. Желтко H.B., Клименко B.B. Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф., Анализ тотальных препаратов синаптонемных комплексов тутового шелкопряда. Известия АН МСССР. 1986. №2. С. 70-73.

8. Каликинская Е.И., Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л., Шевченко В.А. Анализ хромосомных перестроек на основе синаптонемных комплексов у потомков мышей, облученных 1-лучами. Генетика. 1986. Т. 22. №7. С. 1119—1126.

9. Тимофеева Л.П., Коломиец О.Л., Воронцова Н.И., Богданов Ю.Ф. Электронномикроскопическое исследование синаптонемных комплексов мягкой пшеницы. Инициация синапсиса. Цитология. 1987. Т. 29, №2. С. 145—151.

10. Сафронова Л.Д., Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф., Сафронов В.А., Мазурова Т.Ф. Ассоциация между синаптонемными комплексами полового и ауго-сомных бивалентов у самцов мышей как возможная причина их стерильности. Генетика. 1988. Т. 24. №7. С. 1187-1198.

11. Денисова Л.А., Тихонова Г.П., Апанасенко З.И., Иванова Ю.В., Коломиец О.Л., Мазурова Т.Ф. Исследование репродуктивной функции самцов крыс после полета на биоспутнике "Космос-1667". Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1988. Т. 22. №6. С. 58—63.

12. Koíomieís O.L., Borbiev Т.Е., Safronova L.D., Borisov Yu.M., Bogdanov Yu.F.

Synaptonemal complex analysis of B-chromosomes behaviour in meiotic prophase 1 in the East-Asiatic mouse Apodemus peninsulae (Muridae, Rodentia). Cytogenet. Cell Genet. 1988. V.48. №3. P. 183-187.

13. Федотова Ю.С., Коломиец OJL, Богданов Ю.Ф. Электронно-микроскопический анализ профазы мейоза I у ржи с нарушением синапсиса хромосом. Генетика. 1989. Т. 25. >fc3. Р. 462-468.

14. Fedotovä Yu.S., Kolomiets O.L., Bogdanov Yu.F. Synaptonemal complex transformations in rve microsporocvtes at dioiotene stase of meiosis. Genome. 1989. V.32. №5. P. 816-823.

15. Ляпунова E. А., Баклушинская И.В., Колом йен О .Л., Мазурова Т.Ф. Анализ плодовитости гибридов разнохромосомных форм слепушонок над-вида Eilobius tancrei, отличающихся по одной паре робертсоновских транс-локалокаций. Докл. АН СССР. 1990. Т. 310. №3. С. 721-723.

16. Борбиев Т.Э., Коломиец О.Л., Борисов Ю.М., Сафронова Л.Д., Богданов

Ю.Ф. Синаптонемные комплексы А- и B-хромосом сперматоцитов Восточно-Азиатской мыши Apodemus peninsulae. Цитология. 1990. Т. 32. №2. С. 193-198.

17. Гречанина Е.А., Коломиец О.Л., Кочубей С.И., Курило Л.Ф. О роли отцов в отягощенных семьях. В кн.: Актуальные аспекты диагностики, организации лечебного процесса и реабилитации больных с сексуальными расстройствами. Харьков. 1990. С. 312—314.

18. Федотова Ю.С., Коломиец О.Л., Гаджиева С.А. Электронно-микроскопический анализ тотальных препаратов синаптонемных комплексов растений ржи, гетерозиготных по парацентрической инверсии. Цитология. 1991. Т. 33. №9-С. 3-11.

19. Kolomiets O.L., Vorontsov N.N., Lyapunova Е.А., Mazurova T. F. Ultrastructure, meiotic behaviour, and evolution of sex chromosomes of the genus Eilobius. Genetica (Netherlands). 1991. V. 847. №3. P. 179-189.

20. Федотова Ю.С., Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф. Ультраструктурный анализ профазы 1 мейоза у синаптического мутанта sy-3>. Генетика. 1992. Т. 28. №3. С. 120-127.

21. Коломиец О.Л., Мазурова Т.Ф., Померанцева М.Д., Чехович A.B., Богданов Ю.Ф. Электронно-микроскопический анализ синаптонемных комплексов самцов лабораторных мышей, экспонированных в период эмбриогенеза в районе Чернобыльской АЭС. Генетика. 1992. Т. 28. №9. С.49—57.

22. Sosnichina S.P.,.-Fedotovä Yu.S., Smirnov V.G., Mikhailova E.I., Kolomiets O.L.,

Bogdanov Yu.F. Meiotic mutations of rye Seca/e сег/а/е L. Synaptic mutant sy-1. Theor App. Genet. 1992. V. 84. P.974-985.

23. Коломиец О.Л., Мазурова Т.Ф., Богданов Ю.Ф., Богуш Т.А., Мальцев

M.B. Анализ структуры и поведения синаптонемных комплексов самцов мыши после длительного введения неоаквассггга. Генетика. 1993. Т. 29. №12. С. 46-55.

24. Дадашев С.Я., Богданов Ю.Ф., Горач Г.Г., Коломиец О.Л., Карпова О.И.

Препаративный метод выделения синаптонемных комплексов из спер-матоцитов млекопитающих. Цитология. 1993. Т. 35. №6-7. С. 30—36.

25. Башкирок В.И., Лосева Е.Ф., Григорьев В.Г., Коломиец О.Л. Антитела к

КесА-белку Escherichia coli выявляют два ядерных белка, реагирующих с коровыми структурами мейотических хромосом. Генетика. 1993. Т. 29. № 12. С. 1953-1968.

26. Дадашев С.Я., Горач Г.Г., Коломиец ОЛ. Образование аугоантител против антигенов сикаптонемного комплекса при сингенной иммунизации самцов мыши Mus mœcuîis. Онтогенез. 1994. Т. 25. №3. С. 47-54.

27. Дадашев С.Я., Горач Г.Г., Коломиец О.Л., Федотова Ю.С. Исследование динамики формирования спонтанных аутоантител к синаптонемному комплексу у самцов мыши. Онтогенез. 1995. Т. 26. №5. С. 384-389.

28. Лосева Е.Ф., Коломиец О.Л., Ильинская Л.Е., Бащкиров В.И. Локализация RecA-подобных белков на препаратах распластанных сперматоцитов 1 порядка мыши. Генетика 1996: Т. 32. №4. С. 523-531.

29. Богданов Ю.Ф., Гришаева Т.М., Коломиец О Л., Федотова Ю.С. Цитогенетические закономерности синапсиса мейотических хромосом у животных и растений. Генетика. 1996. Т. 32 №11. С. 1474-1493.

30. Курило Л.Ф., Коломиец О.Л., Шелейко Л.В., Остроумова Л.В., Мхитарова Е.В. О необходимости определения уровня нарушения сперматогенеза и генетического обследования при тяжелых формах мужского бесплодия. Проблемы репродукции. 1997. В печати,

31. Сухачева Т.В., Коломиец О.Л., Лосева Е.Ф. Анализ структуры и поведения синаптонемных комплексов после одноразового введения кампто-тецина ингибитора ДНК-топоизомеразы 1. Бюллетень экспер. биологии и медицины. 1998. Т.25. №1. С. 84-88

Тезисы, доклады и сообщения

32. Bogdanov Vu. F., Gorach G.G., Safronov V.V., Kolomiets O.L., Dadashev S.Ya.

Biochemical and ultrastructural analysis of synaptonemal complexes of mamalian spermatocytes. 3 Intern. Congress "Cell Biology". Tokyo, Acad. Press. 1984. P. 56.

33. Ляпунова E.A., Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф., Янина И.Ю., Мазурова

Т.Ф. Цитологический механизм снижения плодовитости у гибридов раз-нохромосомных форм. Тез. 4'Всесоюзн. Конгр. Териол. Общества. М. 1986. С. 76-77.

34. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л., Каликинская Е.И., Мазурова Т.Ф., Ляпунова Е.А. Электронно-микроскопический анализ хромосомных аберраций у животных с нарушенной фертильностью. Там же. С. 8—9.

35. Горач Г.Г., Дадашев С.Я., Коломиец О.Л., Яроцкий C.B., Богданов Ю.Ф.

Молекулярная организация синаптонемных комплексов. Там же. С. 16.

36. Федотова Ю.С., Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф. Электронно-микроскопическое исследование растений ржи, характеризующихся нарушением синапсиса хромосом. Там же. С. 54—55.

37. Bogdanov Yu.F., KaliMnskaya E.I., Koloniiets O.L., Shcvcheriko V.A. Rearranged synaptonemal complexes in the offspring of irradiated male mice as a tool for ontogenetic study. 8-th International Congress of Radiation Research, Edinburgh. Abs. paît D. P. 229.

38. Fedotova Yu.F., Kolomiets O.L., Bogdanov Yu.F. Electron microscope analysis of moiftfin nrnnhaco in nio n-iiifonfe? Ah'ît XVI iflti^rr! Г^ЛГ!Г!Г C^pnfii il IVIU.IV. Ы1 W.I IUUU III Ы«,1ЫЫыи I j Ч/ II lutui 1ЬО . I IU Л. Y I I I St-t^l I I - WVl >U>. V6I I Wl I

39. Коломиец О.Л. Закономерности проявления хромосомных аберраций в гаэосЬазе I мейоза. выявляемых пои анализе синаптонемных комплексов ш Известия СО АН СССР. 1990. Вып. 2. С. 24.

40. Коломиец О.Л., Борисов Ю.М, Борбиев Т.Э., Сафронова Л.Д., Богданов

Ю.Ф. Поведение В-хромосом в профазе I мейоза у Восточно-Азиатской мыши. Электронно-микроскопический анализ СК. Там же. С. 4.

41. Коломиец О.Л., Федотова Ю.С., Мазурова Т.Ф., Богданов Ю.Ф. Диплотена. Новые представления о динамике поведения осевых элементов хромосом. Тамже. С. 9.

42. Коломиец О.Л., Богданов Ю.Ф., Мазурова Т.Ф., Гречанина Е.Я., Курило

Л.Ф. Анализ тотальных препаратов СК у мужчин, страдающих бесплодием. Тез. 3 Съезда ВОМГ, Алма-Ата. 1990. С. 207-208.

43. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Мейоз как фильтр хромосомных аберраций. Тамже. С. 516.

44. Джгаркава Н.А., Коломиец ОЛ., Любашевская И.А, Курило Л.Ф., Гречанина Е.А. Цитогенетические подходы к обследованию лиц с мужским бесплодием. Тез. IV Всесоюзн. съезда урологов. М. 1990. С. 510.

45. Коломиец О.Л. Экспериментально индуцированные структурно-функциональные изменения синаптонемных комплексов у самцов мышей. Тез. Всесоюзн. Совещания "Функц. морф, клетки" С.-Пб. Цитология. 1991. Т. 33.

46. Дадашев С.Я., Горач Г.Г., Коломиец ОЛ. Иммуноцитохимическое исследование молекулярных компонентов синаптонемных комплексов. Тамже. С. 67.

47. Коломиец О.Л. Перспективы использования электронно-микроскопического анализа синаптонемных комплексов мейотических хромосом в ци-тогенетических исследованиях. Тез. Межд. симп." Лаб. животные в мед. биол. и биотехн. исследованиях." М. 1992. С. 47.

48. Курило Л.Ф., Коломиец О.Л. Структура хромосомной патологии среди пациентов с нарушением репродуктивной системы. Тез. докл. 1 Всероссийского съезда мед. генетиков. 1994. Т. 1. С. 85—86.

49. Kurilo L.F., Schapoval S., Dubinscia VP., Schileiko L.B., Levina L., Mchitarova

E.B., Kolomiets O.L., Abakumova N. Mitotic and Meiotic Chromosome Study in infertile males with spermatogenesis disturbance. Tes. of International of Europien Society of Human Genetics. 26-th Annual Meeting. Soc. Med. Genetics. France, Paris. 1994. 1-5 June. P. 126.

1968. V. 30. Suppl. 1. P. 132.

9. С 77.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. На стадии пахитены у гетерозигот по хромосомным перестройкам происходит задержка формирования осевых элементов хромосом мультивалентов, что приводит к формированию ложных конфигураций СК.

2. На стадии поздней пахитены происходит коррекция синапсиса и может происходить рестетуция транслоцированных хромосом.

3. Презиготическая селекция клеток у гетерозигот по хромосомным перестройкам, в том числе по микроаберрациям, и у особей с частичным асинапсисом хромосом обусловлена ассоциацией асинаптических участков хромосом с половым бивалентом, которая препятствует формированию полового пузырька и останавливает дифференцировку сперматоцитов на стадии пахитены.

4. Нормальное формирование полового пузырька у самцов Е. (апсге!, гетерозиготных по множественным ЯЬ-транслокациям, и у А. репши1ае с асинаптическими В-хромосомами способствует поддержанию хромосомной изменчивости у этих видов.

5. Нарушение сперматогенеза у мужчин с нормальным кариотипом может быть обусловлено нарушением формирования осевых элементов хромосом, СК, а также блоком десинапсиеа хромосом в профазе 1 мейоза.

6. На стадии поздней диплотены происходит модификация, а не деградация структуры осевых элементов хромосом.

Хроматида 1 Хроматида 2

Хроматида з Хроматида 4

Термины, использованные в работе

Рекомбинационный узелок I боока центрального т интерфаза леггтотена зиготена диплотена - диакинез время последовательность событий при синапсисе и десинапсисе хромосом