Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физико-химических и функциональных свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.24, кандидат биологических наук Матвеева, Анжелика Рафиковна

• Матвеева, Анжелика Рафиковна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Матвеева, Анжелика Рафиковна

Список сокращений

Введение

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Свойства и классификация протеолитических ферментов

1.1.1 Сериновые протеиназы

1.1.2 Аспартильные протеиназы

1.1.3 Металлопротеиназы

1.1.4 Цистеиновые протеиназы

1.2 Влияние условий культивирования на секрецию протеаз

1.3 Грибы рода Colletotrichum 19 , , 1.3.1 Антракноз, вызываемый представителями рода Colletotrichum

1.3.2 Микогербицидная активность некоторых видов рода Colletotrichum

1.4 Роль секретируемых протеаз патогенных грибов в инфекционном процессе

1.4.1 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у животных и человека

1.4.2 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у растений.

1.5 Использование протеаз

1.6 Выделение протеаз

Глава 2 Материалы и методы

Глава 3 Результаты и обсуждение

3.1 Изучение роста колоний грибов Fusarium и С. gloeosporioides на твердых средах и в погруженной культуре

3.1.1 Изучение роста колоний Fusarium на твердых средах

3.1.1.1 Рост изолятов F.sporotrichioides на твердых средах

3.1.1.2 Рост изолятов F.heterosporum на твердых средах

3.1.1.3 Рост изолятов F.oxysporum на твердых средах

3.1.1.4 Рост изолятов F.culmorum на твердых средах.

3.1.2 Изучение роста колоний С. gloeosporioides на твердых средах.

3.1.3 Изучение роста колоний Fusarium и С. gloeosporioides при погруженном культивировании

3.2 Изучение секреции внеклеточной протеолитической активности в погруженной культуре у изолятов Fusarium и С. gloeosporioides

3.3 Сравнение патогенности грибов рода Fusarium и уровня внеклеточной протеолитической активности

3.4 Выделение, очистка и характеристика свойств наиболее представленных ферментов изученных грибов

3.4.1 Выделение протеиназы С. gloeosporioides из культуральной жидкости

3.4.2 Выделение ферментов F.oxysporum из культуральной жидкости 84 Выводы 90 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин ДЦС (SDS) - додецилсульфат натрия

Е-64 - L-транс эпоксисукцинил-лейциламидо (4-гуанидино) бутан

MKT- морфолого-культуральный тип

ПААГ - полиакриламидный гель

TJIXK (TLCK) -тозил-Ь-л изин хлорметил кетон

ТФХК (ТРСК) - тозил-Ь-фенилаланин хлорметилкетон

ТНБС - тринитробензолсульфокислота

ФМСФ (PMSF) - фенилметилсульфонилфторид

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT - дитиотреитол

ABZ-Ala-Ala-Leu-pNa - о-аминобензоил-аланил- аланил-лейцин-я-нитроаниалид

Ac-Leu-pNa - 1Ч-ацетил-Ь-лейцил-я -нитроанилид

ВТЕЕ - М-бензоил-Ь-тирозин этилвый эфир

Bz-Arg-pNa -N -бензоил-БЬ-аргинин-я-нитроанилид

Cp-Phe-pNa - М-(3-карбокси-пропионил)-Ь-фенилаланил-п-нитроанилид

DFP - диизопропилфторфосфат

IAA - йодацетамид

Glp-Ala-Ala-Leu-pNa - пироглютамил-аланил- аланил-лейцин-я-нитроаниалид

Glp-Phe-pNa - пироглютамил-фенилаланин-я-нитроанилид

L-Leu-pNa - L-лейцил-я-нитроанилид

L-Tyr-pNa - - L-тирозил-я-нитроанилид

ММР-матриксная металлопротеиназа рСМВ - w-хлормеркурийбензоат

Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa -N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил-я-нитроанилид Z-Ala-Phe-Arg-pNa - N-карбобензокси-аланил- фенилаланил -аргинин-я-нитроанилид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физико-химических и функциональных свойств»

Актуальность темы. Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом и межорганном уровнях. В фундаментальных исследованиях они используются для изучения первичной структуры белков и пептидов, кинетики и специфичности ферментативных реакций, строения активных центров. В коммерческих целях применяются в легкой и пищевой промышленности, в медицине и фармакологии (Мосолов, 1971; Rao et al., 1998). Среди внеклеточных протеолитических ферментов микроорганизмов особое место занимают протеиназы, обладающие высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью, что предполагает их высокий терапевтический эффект при лечении тромбоэмболии (Батомункуева, Егоров, 2001; Peng et al., 2005). С участием грибных протеаз можно разрабатывать различные способы рециклизации отходов, оберегая окружающую среду. Из-за высокой ферментативной активности ферменты микроорганизмов предпочтительнее при разложении природных соединений (Мюллер, Лёффлер, 1995).

Возрастающий интерес к секретируемым протеазам грибов обусловлен также их участием в разнообразных формах патогенеза (St. Leger, 1995; Rhodes, 1995; Larcher et al., 1992). Ферменты могут участвовать в грибной инвазии, растворяя участки кутикулы насекомых, состоящей на 70% из белка (Ferron, 1978). Клинические исследования больных кератитом, вызываемым грибами, как Aspergillus fumigatus Fresen, Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, Fusarium solani (Mart.) Sacc., Pénicillium citreoviride Biourge, показали, что в роговице глаза, в тканях, сыворотке испытуемых увеличивается как количество грибного мицелия, так и количество металлопротеиназ ММР-8 и ММР-9 (Dong et al., 2005; Rohini et al., 2007). Следует также отметить работы по изучению роли секретируемых протеаз А. fiimigatus в патогенезе аспергиллеза человека, в которых было показано, что штаммы, продуцирующие сериновую протеиназу субтилизинового типа, более патогенны для животных, чем непродуцирующие штаммы (Павлюкова и др., 1998). Однако функциональная роль протеиназ в этом процессе до конца, не выяснена. Предполагается, что протеазы могут участвовать в комплексе с другими ферментами в проникновении патогена внутрь растения-хозяина и обеспечивать его питание (Мосолов, Валуева, 2006), либо быть ответственными за регуляцию других ферментов, синтезируемых организмом. Возможно, грибные протеазы непосредственно участвуют в патогенном процессе через взаимодействие со «сторожевым» белком или продуктом гена устойчивости (Biezen, Jones, 1999; Дьяков, 2005).

Цель работы: Сравнительное изучение физико-химичских, биохимических и функциональных свойств внеклеточных протеаз некоторых мицелиальных грибов Задачи:

1. Сравнение спектров внеклеточных протеаз на примере различающихся по патогенности мицелиальных грибов родов Fusarium Link и Colletotrichum Corda

2. Выделение и очистка секретируемых протеаз данных грибов

3. Характеристика наиболее представленных (основных) протеаз Fusarium> и Colletotrichum.

Научная новизна и практическая значимость. Проведена работа по подбору жидких сред с целью наибольшего выхода внеклеточной протеолитической активности ферментов у различных мицелиальных грибов. При погруженном культивировании видов Fusarium и Colletotrichum на средах с различными добавками показано, что сусло и казеин в большей степени индуцируют секрецию внеклеточных протеаз.

Впервые из культуральной жидкости гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc выделена сериновая протеиназа субтилизинового типа. Разработан метод получения данного фермента. В результате ряда последовательных стадий внеклеточная протеиназа С. gloeosporioides была очищена до гомогенного состояния, исследованы её физико-химические свойства, а также влияние белковых ингибиторов растительного и животного происхождения на очищенный препарат секретируемой протеиназы.

Впервые проведено сравнение уровня патогенности с внеклеточной протеолитической активностью у 15 изолятов Fusarium, принадлежащих к 4 видам. Показано, что у сильных фитопатогенов преобладает трипсиноподобная активность.Выделены и идентифицированы протеазы, секретируемые Fusarium oxysporum Schlecht. Показано, что они относятся к сериновым протеазам семейств субтилизина и химотрипсина. Были охарактеризованы некоторые их физико-химические свойства.

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов защиты растений от фитопатогенов, для диагностики патогенных микроорганизмов и получения растений, трансформированных генами ингибиторов протеаз, с повышенной устойчивостью к патогенам.

Заключение диссертации по теме «Микология», Матвеева, Анжелика Рафиковна

ВЫВОДЫ

1. Показано как для Fusarium, так и для С. gloeosporioides, что наличие белковых добавок в среде не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной ¡средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов. Как на твердой среде, так и при глубинном культивировании модифицированная среда Чапека с казеином обеспечивает грибы всеми необходимыми компонентами для эффективного роста.

2. Идентифицирована и очищена до гомогенного состояния основная протеиназа гриба-возбудителя антракноза С. gloeosporioides. Степень очистки составляет 203 раза и выход 5%.

3. Исследованы физико-химические свойства и субстратная специфичность данной протеиназы. На основании данных ингибиторного анализа и субстратной специфичности сделан вывод, что исследуемая протеиназа относится к сериновым протеазам и принадлежит семейству субтилизина.

4. Обнаружено, что уровень продукции внеклеточных протеиназ Fusarium зависит от степени патогенности гриба. У сильных фитопатогенов Fusarium значительно преобладает трипсиноподобная активность. Специфичность ее действия, время появления и наличие могут указывать на особую ее роль в процессе патогенеза.

5. Выделены и охарактеризованы секретируемые ферменты из F.oxysporum. Показано, что эти ферменты относятся к сериновым протеазам семейств химотрипсина и субтилизина.

Выражаю благодарность моим научным руководителям: Якову Ефимовичу Дунаевскому и Галине Алексеевне Беляковой за помощь в подготовке диссертационной работы и осмыслении результатов; Биланенко Елене Николаевне за помощь при определении принадлежности гриба Colletotrichum gloeosporioides\ всем сотрудникам кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ за поддержку и понимание; профессору Михаилу Андреевичу Белозерскому из отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского за помощь и поддержку в проведении исследований; Мейчик Наталье Робертовне с кафедры физиологии растений за предоставленные клеточные стенки растений; ВНИИфитопатологии и, в частности, Самохиной Илоне,Коваленко Елизавете Дмитриевне, Коломиец Тамаре Михайловне за предоставленные штаммы Fusarium.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Матвеева, Анжелика Рафиковна, 2008 год

1. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1991. - 504 с.

2. Астапович Н.И., Ермолицкий В.Н. Факторы, определяющие образование кислой протеазы микромицетом Aspergillus foetidus II Микология и фитопатология, 1987, 4, 318-322.

3. Барсукова Т.Н., Гарибова Л.В., Иванов А.И. Эколого-биологическая характеристика Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. // Микология и фитопатология, 1989, 23, 1, 14-19.

4. Батомункуева Б. П., Егоров Н. С. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, 70, 5, 602-606.

5. Батомункуева Б. П., Егоров Н. С. Изучение препаратов внеклеточных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 1 dNl // Микробиология, 2002, 71, 1,56-58.

6. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. Киев: Наукова думка, 1985.- 150 с.

7. Бенкен И.И., Мосолов В. В., Федуркина Н. В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология, 1976, 10, 3, 198-201.

8. Блиева Р. К., Сафуани Ж. Е., Искакбаева Ж.А. Влияние различных источников азота и углерода на биосинтез протеолитических ферментов у культуры Aspergillus awamori 21/96 // Прикладная биохимия и микробиология, 2003, 39, 2, 213-216.

9. Валуева Т. А., Кладницкая Г. В., Ильинская Л. И., Герасимова Н. Г., Озерецковская О. Л., Мосолов В.В. Ингибиторы химотрипсина в клубнях картофеля, инфицированных возбудителем фитофтороза // Биоорганическая химия, 1998, 24, 5, 346-349.

10. Воробьев Г.И.Гл. ред.; Ред.кол.: Анучин H.A., Атрохин В.Г., Виноградов В.Н. и др., Лесная энциклопедия: В 2-х т. М.: Советская энциклопедия, 1985.-563 с.

11. Воскобойникова Н.Е., Дунаевский Я.Е., Белозерский М. А. Ингибитор металлопротеиназы из покоящихся семян гречихи // Биохимия, 1990, 55, 5, 839-847.

12. Гребешова Р. Н., Сальседо-Торрес Л. Э., Идальго М. А. Сериновая протеаза Bacillus subtilis R // Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35, 2, 150-154.

13. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения. Дис. д-ра биол. наук. Л., 1991.

14. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е. Б., Белякова Г. А., Белозерский М. А. Анионные ингибиторы трипсина из покоящихся семян гречихи: выделение, специфичность действия и влияние на рост микромицетов // Биохимия, 1994, 59, 7, 990-996.

15. Дунаевский Я. Е., Белякова Г. А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеаз грибами A.alternata и F. oxysporum //Микробиология, 1995, 64, 3, 327-330.

16. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Внеклеточные протеазы микромицета Ая/гегия/а //Биохимия, 1996, 61, 1904-1910.

17. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов // Микробиология, 1999, 68, 3, 324-329.

18. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Секретируемые ферменты мицелиальных грибов: регуляция секреции и очистка внеклеточной протеиназы Trichoderma harzianum //Биохимия, 2000, 65, 6, 848-853.

19. Дунаевский Я.Е., Дун Чжан, Матвеева А.Р., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Деградация белковых субстратов ксилотрофными базидиомицетами // Микробиология, 2006а, 75, 1, 46-51.

20. Дьяков Ю.Т. На пути к общей теории иммунитета // Журнал общей биологии, 2005, 66, 6, 451-458.

21. Егоров Н.С., Лория Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз, ред., Имшенецкого A.A., М.: Наука, 1979, с. 146-244.

22. Ильина А. В., Татаринова Н. Ю., Тихонов В. Е., Варламов В. П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii II Прикладная биохимия и микробиология, 2000, 36, 2, 173-177.

23. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. 2-е изд., перераб.и доп.- М.: Наука, 1974, 352с.

24. Кладницкая Г.В., Валуева Т. А., Ермолова Н. В., Ильинская Л. И., Герасимова Н.Г., Мосолов В. В. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителями фитофтороза // Физиология растений, 1996, 43, 5, 701-706.

25. Ландау Н.С., Егоров Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойства протеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima II Микробиология, 1996, 65, 1,43-47.

26. Лобарева Л.С., Степанов В.М. Карбоксильные протеиназы плесневых грибов // Успехи биологической химии.- М.: Наука, 1978, 19, 83-105.

27. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Биоорганическая химия, 1994, 20, 134-142.

28. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971, 414 с.

29. Мосолов В.В., Григорьева JL И., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов и их ингибиторов в защите растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, 37,2, 131-140.

30. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов во взаимодействии растений с фитопатогенными микроорганизмами // Биохимия, 2006, 71,8, 1034-1042.

31. Мюллер Э., Леффлер В. Микология.- М.: Мир, 1995, 343 с.

32. Овсянкина A.B., Коваленко Е.Д. Рекомендации по оценке и отбору исходного материала для создания сортов ржи, устойчивых к корневым гнилям.- М., 2004. 24 с.

33. Павлюкова Е.Б., Белозерский М. А., Дунаевский Я.Е. Внеклеточные протеолитические ферменты мицелиальных грибов // Биохимия, 1998, 63, 8, 10591089.

34. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 4-е изд., перераб. и доп. -М.: Агропромиздат, 1989.-480 с.

35. Поляков В. А., Римарева JI.B., Оверченко М. Б., Трифонова В. В. Сравнительная характеристика ферментных препаратов протеолитического действия по степени гидролиза микробного белка // Прикладная биохимия и микробиология, 2000, 36, 3, 299-302.

36. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.- М.: Мир, 1987, 117 с.

37. Римарева JI.B., Оверченко М. Б., Серба Е. М., Трифонова В. В. Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов // Прикладная биохимия и микробиология, 1997, 33, 1, 43-48.

38. Рудаков О. Л., Изв. АН Кирг. ССР, 1960, 2, 7, 51—55,

39. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов // Биоорганическая химия, 1994, 20, 5, 475-484.

40. Сапунова JI. И., Лобанок А. Г., Михайлова Р. В. /Условия синтеза пектиназ и протеаз грибом Aspergillus alliaceus и получение комплексного препарата мацерирующего действия // Прикладная биохимия и микробиология, 1997,33 , 3, 292-295.

41. Степанов В.М. Эволюция структура и функции протеолитических ферментов // "Химия протеолитических ферментов". Материалы всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Вильнюс, 15-17мая 1973, 7-11.

42. Степанов В.М. Тез. Докл. 2-го Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов, Углич, 1979, 3, 3.

43. Abang М. М., Winter S., Mignouna Н. D., Green К. R., Asiedu R. Molecular taxonomic, epidemiological and population genetic approaches to understanding yam anthracnose disease // African Journal of Biotechnology, 2003, 2, 12, 486-496.

44. Ballinger M.D. Subtilisin // Handbook of proteolytic enzymes. Eds. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. London: Academic Press. Electronic version on PC CD-ROM., 1998.

45. Barrett A.J. The many forms and functions of cellular proteinases // Proceedings of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1980, 39, 1, 9-14.

46. Barrett A.J. An introduction to the proteinases // Proteinase inhibitors. Eds. Barrett A.J., Salvesen. Elsevier Science Publishers, 1986, 3-22.

47. Bayart J. D., Pallas B. Tolerance of yam anthracnose to benzimidazoles: Results of the first study conducted in Guadeloupe // Phytoma, 1994, 461, 37-40.

48. Bowers R. C. Commercialization of Collego: An industrialist's view // Weed Sci., 1986, 34 (Suppl.), 24-25.

49. Boyette C.D. Host range and virulence of Colletotrichum truncation, a potential mycoherbicide for hemp sesbania (Sesbania exaltata) // Plant Dis., 1991, 75, 62-64.

50. Boyette C. D., Hoagland R.E., and Weaver M.A. Biocontrol efficacy of Colletotrichum truncatum for hemp sesbania {Sesbania exaltata) is enhanced with unrefined corn oil and surfactant // Weed Biology and Management, 2007,7 ,1 ,70-76.

51. Brennan J. M., Fagan B., van Maanen A., Cooke B. M., Doohan F. M. Studies on in vitro growth and pathogenicity of european fusarium fungi // Eur. J. of Plant Pathol., 2003, 109, 6, 557-587.

52. Cabrera M. G., Galmarini M. R., Flachsland E. Colletotrichum gloeosporioides, pathogen of orchids in the northeast of Argentina // Manejo Integrado de Plagas y Agroecologia, 2003, 68,57-61

53. Carlile A.J., Bindschedler, L.V., Bailey A.M., Bowyer P., Clarkson J.M. and Cooper R.M. Characterization of SNP1, a Cell Wall-Degrading Trypsin, Produced During Infection by Stagonospora nodorum // Mol. Plant-Microbe Interact, 2000, 13, 5, 538-550.

54. Daroda L., Hahn K., Pashkoulov D., Benvenuto E. Molecular characterization and in planta detection of Fusarium moniliforme endopolygalacturonase isoforms // Physiol, and Mol. Plant Pathol., 2001, 59, 6, 317-325.

55. Davis, B. J. Disc electrophoresis II method and application to human serum proteins // Ann. New York Acad. Sci., 1964, 121, 404-427.

56. Dodd J.C., Estrada A.B., Matcham J., Jeffries P. and Jeger M.J. The effect of climatic factors on Colletotrichum gloeosporioides, causal agent of mango anthracnose, in the Philippines // Plant Pathol., 1991, 40, 4, 568-575.

57. Dong, X., Shi W., Zeng Q., Xie, L. Roles of adherence and matrix metalloproteases in growth patterns of fungal pathogens in cornea // Curr. Eye Res., 2005, 30, 8, 613-620.

58. Eberling W., Hennich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. Proteinase K from Tritirachium album (Linber) de Hoog // Eur. J. Biochem., 1974, 47, 1, 91-97.

59. Erlanger B. F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys., 1961, 95, 271-278.

60. Facchine I., and De Barros M.N. Production of extracellular enzymes by Nomuraea rileyi (Farlow) Samson // Rev. Microbiol., 1991, 22, 17-20.

61. Fernandes-Lahore H.M., Auday R.M., Fraile E.R., Biscoglio de Jimenez Bonino M., Pirpignani L., Machalinsky C., Cascone O. Purification of an acid proteinase from mesophilic Mucor sp., solid-state cultures // J. Peptide Res., 1999, 53, 6, 599-605.

62. Ferron P. Biological control of insect pests by entomogenous fungi // Ann. Rev. Enthomol., 1978,23,409-442.

63. Foucher B., Chappell J. B., McGivan, D. The effects of acetylcolletotrichinon the mitochondrial respiratory chain // Biochem. J., 1974, 138, 3, 415-423.

64. Freeman S., Rodriguez R.J. Genetic conversion of a fungal plant pathogen to a nonpathogenic, endophytic mutualist // Science, 1993; 260, 5104, 75-78.

65. Freeman S., Shalve Z., Katan J. Survival in soil of Colletotrichum acutatum and C. gloeosporiodes pathogenic on strawberry // Plant Disease, 2002, 86, 9, 965-970

66. Freeman S. Management, survival strategies and host range of Colletotrichum acutatum on strawberry // HortScience, 2008, 43, 66-68.

67. Gabriel B.P., Enzymatic activities of some entomophthorous fungi // J. Invert. Pathol., 1968, 11,70-81.

68. Gohbara M., Kosuge Y., Yamasaki S., Kimura Y., Suzuki A., Tamura S. Isolation, structures and biological activities of colletotrichins, phytotoxic substances from Colletotrichum nicotianae II Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 1037-1043.

69. Graham, J.E.S., Sodec, J., and Hoffman, T. Rhizopus Acid Proteinases (Rhizopus-pepsins): Properties and Homology with other Acid Proteinases // Can. J. Biochem., 1973, 51, 6, 789796.

70. Grove, J. F., Speake R. N., Ward, G. Metabolic products of Colletotrichum capsici: Isolation and characterization of acetylcolletotrichin and colletodiol // J. Chem. Soc. (C), 1966, 230234.

71. Habeeb A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid // Anal. Biochem., 1966, 14, 328-336.

72. Howard C. M., Maas J. L., Chandler C. K., and Albregts E. E. Anthracnose of strawberry caused by the Colletotrichum complex in Florida // Plant Dis., 1992, 76, 976-981.

73. Ievleva, E.V., Revina, T.A., Kudryavtseva, N.N., Sof'in, A.V. and Valueva, T.A. Extracellular proteinases from the phytopathogenic fungus Fusarium culmorum/l Applied Biochemistry and Mycrobiology, 2005, 42, 3, 298-303.

74. Ismail R., Salech S., Abdel-Fattah A. //Production of proteases by fungi // Microbios Letters, 1990, 43,81-85.

75. Jackson M.A., Bothast R. J. Carbon concentration and carbon to nitrogen ratio influence submerged culture conidiation by the potential bioherbicide Colletotrichum truncatum NRRL 13737 // Appl. and Environ. Microbiol., 1990, 56, 11, 3435-3438.

76. Jackson M. A., Schisler D. A. The composition and attributes of Colletotrichum truncatum spores are altered by the nutritional environment // Appl. and Environ. Microbiol, 1992, 58, 7, 2260-2265.

77. Jarai G., and Buxton F.P. Nitrogen, carbon and pH regulation of extracellular acidic protease of Aspergillus niger// Curr. Genet., 1994, 26, 3, 238-244.

78. Jelev Z.J., Bobev S.G., Minz D., Maymon M. and Freeman, S. First report of anthracnose fruit rot caused by Colletotrichum acutatum on pepper and tomato in Bulgaria. Plant Dis., 2008, 92, 1, 172.

79. Joshi L., St Leger R.J., Bidochka M.J. Cloning of a cuticle-degrading protease from the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana II FEMS Microbiol. Lett., 1995, 125, 211217.

80. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. Production, regulation and release of extracellular proteinase activity in basidiomycete fungi // Trans. Br.mycol. Soc., 1987, 88, 2, 221-227.

81. Kollatukudy P.E., Lee P.E., Rogers L.M., Zimmerman P., Ceselski S., Fox B., Stein B., and Copelan E.A. Evidence for possible involvement of an elastolytic serine protease in aspergillosis // Infection and Immunity, 1993, 61, 6, 2357-2368.

82. Kothary M.H., Chase T.Jr., and Macmillan J.D. Corellation of elastase production by some strains of Aspergillus fumigatus with ability to cause pulmonary invasive aspergillosis in mice // Infection and Immunity, 1984, 43, 1, 320-325.

83. Kucera M. J. Proteases from the fungus Metarhizium anisopliae toxic for Galleria mellonella larvae // J. Invertebr. Pathology, 1980, 35, 304-310.

84. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970, 227, 5259, 680-685.

85. Larcher G., Bouchara J.-P., Annaix V., Symoens F., Chabasse D., and Tronchin G. Purification and characterization of a fibrinogenolytic serine proteinase from Aspergillus fumigatus culture filtrate // FEBS letters, 1992, 308, 1, 65-69.

86. Larcher G., Cimon B., Symoens F., Tronchin G., Chabasse D., Bouchara J.-P. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum //Biochem. J., 1996, 315, 119-126.

87. Luo Y., TeBeest D. O. Infection components of wild-type and mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f.sp. aeschynomene on northern jointvetch // Plant Disease, 1997,81,4, 404-409.

88. Luo Y., TeBeest D. O. Behavior of a wild-type and two mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene on northern jointvetch in the field // Plant Disease, 1998,82,4, 374-379.

89. Luo Y., TeBeest D. O. Effect of temperature and dew period on infection of northern jointvetch by wild-type and mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene II Biological Control, 1999, 14, 1, 1-6.

90. Maccheroni WJr., Araujo W.L.,Azevedo L.J. Ambient pH regulated enzyme secretion in endophytic and pathogenic isolates of the fungal genus Colletotrichum // Scienta Agricola, 2004,61,3, 298-302.

91. Malathrakis N. E., Kapetanakis G. E., and Linardakis D. C. Brown root rot of tomato and its control in Crete // Ann. Appl. Biol., 1983, 102, 251.

92. McDonald K. An overview of protease specifity and catalytic mechanisms: aspects related to nomenclature and classification // The Histochemical journal, 1985, 17, 7, 773-785.

93. McHenry J.Z., Christeller J.T., Slade E.A., Laing W.A. The major exstracellular proteinases of the silverleaf fungus Chondrostereum purpureum, are metalloproteases // Plant Pathol., 1996, 45, 3, 552-563.

94. Monod M., Fatih A., Jaton-Ogey L., Paris S., and Latge J.-P. The secreted proteases of pathogenic species of Aspergillus and their possible role in virulence // Can. J. Bot., 1995, 73, (Suppl 1), 1081-1086.

95. Mosolov V. V., Loginova M. D., Malova E. L., Benken I.I. Specific inhibitor of Colletotrichum lindemuthianum protease from Kidney bean (Phaseolus vulgaris) seeds // Planta, 1979, 144, 3 , 265-269.

96. Movahedi S., and Heale J.B. Purification and characterisation of an aspartic proteinase secreted by Botrytis cinerea Pers. ex Fries in cuticle and infected carrots // Physiol. Mol. Plant Pathol., 1990, 36, 303-324.

97. Nasuno S., Electrophoretic studies of alkaline proteinases from strains of Aspergillus flavus group //Agric. Biol.Chem, 1972, 36, 684-689.

98. Ning-Yuan Su, Chia Jung Yu, Hong-Der Shen, Fu-Ming Pan, Lu-Ping Chow. Pen c 1, a novel enzymic allergen protein from Penicillium citrinum // Eur. J. Biochem., 261, 1, 115123.

99. Olivieri F.P., Maldonado S., Tonon C.V., Casalongue C.A. Hydrolytic activities of Fusarium solani and Fusarium solani f. sp. eumartii associated with the infection process of potato tubers // J.of Phytopathol., 2004, 152, 6, 337-344.

100. Pekkarinen A. I., Longstaff C., Jones B.L. Kinetics of the inhibition of fusarium serine proteinase by barley (Hordeum vulgare L.) inhibitors // J. Agric. Food Chem., 2007, 55, 7, 2736-2742.

101. Peng Y., Yang X., and Zhang Y. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 2, 126-132.

102. Pichova I., Pavlickova L., Dostal J., Hruskova-Heidingsfeldova O., Weber J., Ruml T., Soucek M. Secreted aspartic proteases of Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae // Eur. J. Biochem., 2001, 268, 9, 2669-2677.

103. Ramesh M.V., Kolattukudy P.E. Disruption of the serine proteinase gene (sep) in Aspergillus flavus leads to a compensatory increase in the expression of a metalloproteinase gene (mep20) //J. Bacterid., 1996, 178, 13, 3899-3907.

104. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., and Deshpande V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62, 3,. 597-635.

105. Redman R.S., Freeman S., Clifton D. R., Morrel J., Brown G., Rodriguez R.J. Biochemical analysis of plant protection afforded by a nonpathogenic endophytic mutant of Colletotrichum magna //Plant Physiol., 1999, 119, 2, 795-804.

106. Redman, R.S., and Rodriguez, R. J. Characterization and isolation of an extracellular serine protease from the tomato pathogen Colletotrichum coccodes, and it's role in pathogenicity // Mycol. Res., 2002, 106, 12,1427-1434.

107. Rhodes J.C., Bode, R.B., and McKuan-Kirsch, C.M. Elastase production in clinical isolates of Aspergillus II Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1988, 10, 3, 165-170.

108. Rhodes J.C., Aspergillus proteinases and their interactions with host tissues // Can.J.Bot., 1995, 73, (Suppl.l), SI 126-1131.

109. Rohini, G., Murugeswari, P., Prajna, N.V., Lalitham P., Muthukkaruppan, V. Matrix metalloproteases (MMP-8, MMP-9) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2) in patients with fungal keratits // Cornea, 2007, 26, 2, 207-211.

110. Schisler D. A., Jackson M. A., Bothast R.J. Influence of nutrition during conidiation of Colletotrichum truncatum on conidial germination and efficacy in inciting disease on Sesbania exaltata II Phytopathol., 1991, 81, 587-590.

111. Shevchik, V. E., Boccara M., Vedel R., and Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Processing of the pectate lyase Pell by extracellular proteases of Erwinia chrysanthemi 3937 // Mol. Microbiol., 1998,29, 6, 1459-1469.

112. Shimizu S., Tsuchianti Y., and Matsumoto T. Purification and properties of an extracellular protease from Beauveria bassiana II J.Seric. Sci. Spn., 1992, 61, 421-428

113. Smith R.J., Pekrul S., and Grula E.A. Requirement for sequential enzymatic activities for penetration of the integument of the corn earworm (Heliothis zed) II J. Invert Pathol., 1981, 38, 335-344.

114. Sreedhar L., Kobayashi Y.D., Bunting T.E., Bradley H. I., Belanger F. C. Fungal proteinase expression in the interaction of the plant pathogen Magnaporthe poae with its host // Gene, 1999, 235, 1-2, 121-129.

115. St. Leger R.J., Charnley A.K., Cooper R.M. Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi:synthesis in culture on cuticle // J. Invert. Pathol., 1986, 48,. 85-95.

116. St Leger R.J., Bidochka M.J., Roberts D.W. Isoforms of the cuticle-degrading Prl proteinase and production of metalloproteinase by Metarhizium anisopliae // Arch. Biochem. Biophys., 1994,313, 1, 1-7.

117. St Leger R.J. The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insects // Can. J. Bot., 1995, 73, (Suppl.l), SI 119-1125.

118. Sutton, B. C. The Coelomycetes. Fungi imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1980, 696 p.

119. Templeton G.E. Potential for developing and marketing mycoherbicides // Proc. First Int. Weed Control Cong. J.H. Combellack, KJ. Levick, J. Parsons and R.G. Richardson (eds.)-Weed Sci. Soc. Victoria, Inc. Melbourne, Australia, 1992, 1, 264-268.

120. Transfiguración J.C., Lee B.H., Park S.Y. and Van der Voort F.R. Purification and characterization of a carboxypeptidase Y from Kluyveromyces fragilis JSB95 // Journal of Dairy Science, 1998, 81, 3, 647-654.

121. Tunlid A., Rosen S., Ek B., and Rask L. Purification and characterisation of an extracellular serine protease from the nematode de-trapping fungus Arthrobotrys oligospora II Microbiology, 1994, 140, 7, 1687-1695.

122. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T. Purification and characterization of fibrinolitic alkaline protease from Fusarium sp. BLB // Appl. Microbiol Biotechnol., 2007, 74, 2,331-338.

123. Wang R. Current status and perspectives of biological weed control in China // Chinese J. Biol. Contr., 1986, 1, 173-77.

124. Xu J., Baldwin D., Kindrachuk C., Hegedus D.D. Serine proteses and metalloproteases associated with pathogenesis but not host specificity in the Entomophthoralean fungus Zoophthora radicans II Can. J. Microbiol., 2006, 52, 6, 550-559.

125. Yu X., Hallett S. G., Sheppard J., and Watson A.K. Effects of carbon concentration and carbon to nitrogen ratio on growth and sporulation of Colletotrichum coccodes in a cyclone column bioreactor// J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1998, 20, 6, 333-338.