Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз в реконструированных ансамблях белков и в экстрактах клеток и ядер тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Лебедева, Наталья Александровна

• Лебедева, Наталья Александровна
• кандидат химических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат химических наук Лебедева, Наталья Александровна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ б

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Методы высокоселективной модификации ДНК-связывающих ферментов в реконструированных системах и экстрактах

1.1. Классическая аффинная модификация

1.2. Фотоаффинная модификация

1.3. Каталитически компетентное мечение

1.4. Каталитически компетентное мечение инициирующего комплекса РНК-полимеразы Escherichia coli

1.5. Каталитически компетентное мечение ДНК-полимераз

1.6. Фотомодификация с переносом энергии

1.7. Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств

1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов

1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Введение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида

2.2.2. Подготовка ДНК-дуплекса к синтезу ДНК, катализируемому ДНК-полгшеразами

2.2.3. Электрофорез по Леммли

2.2.4. Количественная обработка гелей

2.2.5. Выделение рекомбинантнойДНК-полимеразы Tte

2.2.6. Синтез ДНК, катализируемыйДНК-полимеразой/3 илиДНК-полимеразои Tte

2.2.7. Определение кинетических параметров

2.2.8. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA

2.2.9. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз

2.2.10. Условия УФ-облучения

2.2.11. Оценка эффективности и селективности модификации ДНК-полимераз

2.2.12. Выделение ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота

2.2.13. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ядерного экстракта

2.2.14. Фотоаффинная модификация белков ядерного (клеточного) экстракта

2.2.15. Иммуноанализ антителами против белков репарации

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНК-полимераз

3.1.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов dNTP

3.1.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В

3.1.3. Влияние природных dNTP на фотосенсибилизированную модификацию ДНК-полимеразы Tte

3.1.4. Селективная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPА

3.1.5. Селективная модификация ДНК-полимеразы а-праймазы 3.2. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов

3.2.1. Субстратные свойства FAB-4-ddUTP

3.2.2. Влияние структуры матрицы на эффективность модификации ДНК-полимеразы Р

3.2.3. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модификации ДНК-полимеразы (

3.2.4. Фотоаффинное мечение ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях 10-кратного избытка реакционноспособного праймера

3.3. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффинной модификации с использованием различных фотореагентов

3.3.1. Структуры ДНК и фотореагентов, использованных в работе

3.3.2. Синтез фотореакционноспособных интермедиатов репарации оснований

3.3.3. Фотомодификация белков ядерного экстракта

3.4. Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте

3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНК-структур

3.4.2. Сравнение набора продуктов модификации в клеточном и ядерном экстрактах

3.4.3. Относительная селективность и эффективность модификации ДНКф полгшеразы fie ядерном экстракте

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз в реконструированных ансамблях белков и в экстрактах клеток и ядер»

Важнейшим направлением биохимии и молекулярной биологии является изучение ансамблей белков, а не только их отдельно взятых компонентов. В последнее время появилось представление о протеомах, обеспечивающих жизненно важные функции клеток и целых организмов, и возникло специальное направление их исследования. Например, протеомными ансамблями являются комплексы белков, обеспечивающие репликацию и репарацию ДНК. Центральную роль в осуществлении обоих процессов играют матричные ферменты - ДНК-полимеразы. В клетках высших эукариот основную роль в репликации и репарации ДНК играют ДНК-полимеразы а, 5, 8 и ДНК-полимераза р. В последние годы у эукариот открыты новые ДНК-полимеразы X, ц и i, что делает особенно актуальным идентификацию ДНК-полимераз в ансамблях репликации и репарации. ДНК-полимеразы осуществляют специализированные функции в тесном взаимодействии с множеством других ферментов и факторов, таких как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и другие белковые факторы. Проблема состоит в понимании механизма действия и координации этих ферментов и факторов в процессах репликации и репарации ДНК. Несмотря на значительные усилия, направленные на изучение репликации и репарации ДНК эукариот, детальный механизм белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий, а также их динамика до сих пор остаются невыясненными.

Как известно, рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс и другие физические методы исследования наиболее информативны и эффективны для изучения отдельных белков и некоторых простых комплексов. Например, метод рентгеноструктурного анализа (РСА) предоставляет наиболее детальную информацию о структуре отдельных биополимеров и их комплексов с лигандами. Однако этот метод обладает существенными недостатками: во-первых, он пока малопригоден для изучения сложных многокомпонентных комплексов из-за трудностей получения кристаллов таких структур. Кроме того, РСА не дает представления о динамике взаимодействия компонентов комплекса. И, наконец, всегда остается сомнение, применимы ли данные, полученные для кристаллов, к комплексам в растворе и, тем более, in vivo.

Методом сайт-направленного мутагенеза можно получать информацию о функции конкретной аминокислоты или же о значении фрагментов полипептидной цепи в функционировании белка. В то же время мутантные формы белков могут иметь изменённую третичную структуру и, как следствие, измененные функции по сравнению с природными, что создает проблему в интерпретации полученных результатов. Кроме того, применение данного подхода пока ограничено при изучении многокомпонентных структур и процессов in vivo.

На протяжении многих лет метод аффинной модификации широко используется для изучения молекулярной организации белковых комплексов, таких как системы репликации и репарации ДНК, а также транскрипции и трансляции. Метод основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание их ферментом. Этот подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером с последующим ковалентным присоединением аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр или находящимся в непосредственной близости от него. Эффективность этого подхода проявляется в наибольшей степени при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур.

Для успешного применения аффинной модификации в изучении многокомпонентных систем в том числе для идентификации определенных белков в клеточных и ядерных экстрактах необходимо повышение селективности и эффективности данного метода. Одним из путей решения этой задачи является фотосенсибилизированная модификация, основанная на использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов. Особый интерес представляет создание и применение новых реагентов для повышения селективности и эффективности модификации ДНК-полимераз и других белков, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК, в многокомпонентных системах, таких как клеточные и ядерные экстракты. Усовершенствование этого подхода, безусловно, актуально для получения достаточных количеств меченых белков с целью их последующей идентификации.

Целью данной работы являлось совершенствование метода высокоселективной и эффективной модификации ДНК-полимераз, основанного на использовании фотохимической сенсибилизации, в реконструированных системах на примере ДНК-полимеразы р, ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии факторов репликации ДНК, а также идентификации ДНК-полимераз этим методом в клеточных и ядерных экстрактах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: • повышение селективности модификации различных ДНК-полимераз в присутствии других ДНК-связывающих белков; подбор оптимальных структур реагентов и сенсибилизаторов для создания новых, наиболее эффективных пар фотореагент - сенсибилизатор; увеличение эффективности модификации ДНК-полимераз в условиях избытка реагента; фотосенсибилизированная модификация каталитических субъединиц ДНК-полимераз в многокомпонентных системах, таких как ДНК-полимераза а-праймаза, клеточный экстракт фибробластов мыши и ядерный экстракт семенников крупного рогатого скота.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Лебедева, Наталья Александровна

выводы

1). Проведена селективная модификация ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов, состоящей из фотореакционноспособного праймера и аналога dNTP, несущего сенсибилизатор.

Бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет селективно модифицировать каталитическую субъединицу четырехсубъединичной ДНК-полимеразы а-праймазы, в то время как прямая модификация приводит к мечению трех субъединиц этого фермента. Впервые с помощью бинарной системы фотореагентов проведена высокоселективная аффинная модификация термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии репликативного белка А.

2). Впервые показано, что использование бинарной системы фотоаффинных реагентов позволяет повысить эффективность модификации ДНК-полимераз по сравнению с прямым мечением фермента фотореакционноспособным праймером.

Наибольшая эффективность фотопришивки наблюдается при использовании в качестве фотореагента ДНК-праймера, несущего на З'-конце остаток FAB-4-dUMP, а в качестве сенсибилизатора - Pyr-6-dUTP. В условиях 10-кратного избытка праймера по отношению к ферменту такая бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет достичь 30%-ого уровня мечения ДНК-полимеразы р, что в ~2 раза выше уровня прямого мечения, достигаемого в более жестких условиях (>.=334-365 нм).

3). Продемонстрирована возможность селективной модификации ДНК-полимераз в клеточном и ядерном экстрактах с применением бинарной системы фотоаффинных реагентов.

При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов в экстрактах клеток и ядер наблюдается повышение интенсивности модификации ДНК-полимеразы р, тогда как в условиях прямого мечения фотореакционноспособные ДНК - интермедиаты эксцизионной репарации оснований ковалентно присоединялись к ДНК-полимеразе р, флэп-эндонуклезе-1, АР-эндонуклеазе-1 и поли-(АБР-рибозо)-полимеразе-1. Таким образом, с помощью предлагаемого подхода, ДНК-полимераза Р выявлена как ключевой фермент в инициации ресинтеза ДНК в длиннозаплаточной репарации оснований.

4). Предложена новая пара реагент — сенсибилизатор для модификации ДНК-полимераз.

Впервые в качестве фотореагента в бинарной системе был использован аналог dUTP. содержащий 4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридильную группу (FAP-8-dUTP), а в качестве сенсибилизатора — аналог dUTP, содержащий пиренильную группу (Pyr-6-dUTP), что позволило повысить эффективность модификации ДНК-полимеразы р в экстрактах клеток и ядер.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Лебедева, Наталья Александровна, 2003 год

1. Diffley J.F.X. Affinity labeling the DNA polymerase alpha complex. Identification of subunits containing the DNA polymerase active site and an important regulatory nucleotide-bindingsite // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 19126-19131.

2. Basu A., Modak M.J. Identification and amino acid sequence of the deoxynucleoside triphosphate binding site in Escherichia coli DNA polymerase I. II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 1704-1709.

3. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5 '-phospate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: Identification of lysine-635 as an essential residue for the processive mode of DNA synthesis. II Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

4. Pandey V.N., Modak M.J. Affinity labeling of Escherichia coli DNA polymerase I by 5 '-fluorosulfonylbenzoyladenozine. Identification of the domain essential for polymerization and Arg-682 as the site of reactivity. H J. Biol. Chem. V. 263. P. 6068-6073.

5. Knorre D.G., Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Protein-nucleic interaction in reaction catalysed with DNA polymerases. 11 Biochimie. 1988. V. 70. P. 655-661.

6. Невинский Г.А., Доронин C.B., Лаврик О.И. ДНК-полимераза I Е. coli: зависимость от праймер-матричного комплекса инактивации фермента имидазолидами дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. // Биополимеры и клетка. 1985. Т. 1. № 5. С. 247253.

7. Doronin S.V., Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Podust V.N. The efficiency of dNTP complex formation with human placenta DNA polymerase a as demonstrated by affinity modification. IIFEBS Lett. 1987. V. 216. P. 221-224.

8. Захаренко A.JI. // Диссертация на соискание степени кандидата химических наук.

9. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Исследование взаимодействая репликативного белка А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP Н Биоорган, химия. 1998. Т. 65. С.160-163.

10. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the З'-end of nascent DNA II FEBS Lett. 1999. V. 450. P. 131-134.

11. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. Polarity of human replication protein A binding to DNA И Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 373-379.

12. Колпащиков Д.М., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Репликативный белок А связывает одноцепочечную ДНК полярно II Доклады академии наук. 2000. Т. 372. С. 824-826.

13. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Исследование взаимодействия репликативного фактора А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов ТТР II Биохимия. 2000. Т. 65. С. 194-198.

14. Wold M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism II Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.1. J"

15. Lee S.H., Pan Z.Q., Kwong A.D., Burgers P.M., Hurwitz J. Synthesis of DNA by DNA polymerase epsilon in vitro //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 22707-22717.

16. Tsurimoto Т., Stillman B. Multiple replication factors augment DNA synthesis by the two eukaryotic DNA polymerases, alpha and delta // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3883-3889.

17. Blackwell L.J., Borowiec J.A. Human replication protein A binds single-stranded DNA in two distinct complexes И Mol. Cell Biol. 1994. V. 14 P. 3993-4001.

18. Blackwell L.J., Borowiec J.A., Masrangelo I.A. Single-stranded-DNA binding alters human replication protein A structure and facilitates interaction with DNA-dependent protein kinase II Mol. Cell Biol. 1996. V. 16 P. 4798-4807.

19. Bullock P.A. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro II Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 32. P. 503-568.

20. Kolpashchikov D.M., Hughes P., Favre A., Baldacci G., Lavrik O.I. Localization of the large subunit of replication factor С near the 5' end of DNA primers. II J. Mol. Recognit. 2001. V. 14. P. 239-244.

21. Mossi R., Keller R.C., Ferrari E., Hubscher U. DNA polymerase switching: II. Replication factor С abrogates primer synthesis by DNA polymerase alpha at critical length. II J. Mol. Biol. 2000. V. 295. P. 803-814.

22. Doerhoefer S, Windisch C, Angerer B, Lavrik OI, Lee BS, Holler E. The DNA-polymerase inhibiting activity of poly(beta-l-malic acid) in nuclear extract during the cell cycle of Physarum polycephalum. II Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 1253-1258.

23. Persinger J., Bartolomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffinity labeling // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33039-33046.

24. Zlotkin Т., Kaufmann G., Jiang Y., Lee M.Y.W.T., Uitto L., Syvaoja J., Dornreiter I., Fanning E., Nethanel T. DNA polymerase epsilon may be dispensable for SV40- but not cellular-DNA replication I IEMBO J. 1996. V. 15. P. 2298-2305.

25. Mass G., Nethanel Т., Kaufmann G. The middle subunit of replication protein A contacts growing RNA-DNA primers in replicating simian virus 40 chromosomes II Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 6399-6407.

26. Mass G., Nethanel Т., Lavrik O.I., Wold M.S., Kaufmann G. Replication protein A modulates its interface with the primed DNA template during RNA-DNA primer elongation in replicating SV40 chromosomes II Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3892-3899.

27. Lavrik O.I., Prasad R„ Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoaffinity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.

28. Rando R.R. Chemistry and enzymology ofkcat inhibitors I I Science. 1974. V. 185. P. 320324.

29. Phillips A.T. Differential labeling: a general technique for selective modification of binding sites. II Methods of Enzymol. 1977. V. 46. P. 59-69.

30. Radzicka A. and Wolfenden R. Transition state and multisubstrate analog inhibitors II Methods of Enzymol. 1995. V. 249. P. 284-312.

31. Rando R. Mechanism-based irreversible enzyme inhibitors. 11 Methods of Enzymol. 1977. V. 46. P. 28-41.

32. Grachev M.A., Kolocheva T.I., Lukhtanov E.A., Mustaev A.A. Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. Highly selective affinity labelling by analogues of initiating substrates // Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 113-121.

33. Severinov K., Fenyo D., Severinova E., Mustaev A., Chait B.T., Goldfarb A., Darst S.A. The sigma subunit conserved region 3 is part of "5'-face" of active center of Escherichia coli RNA polymerase. II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 20826-20828.

34. Kashlev M., Lee J., Zalenskaya K., Nikiforov V., Goldfarb A. Blocking of the initiation-to-elongation transition by a transdominant RNA polymerase mutation. // Science. 1990. V. 248. P. 1006-1009.

35. Mustaev A., Kashlev M., Zaychikov E., Grachev M., Goldfarb A. Active center rearrangement in RNA polymerase initiation complex II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19185-19187.

36. Severinov K., Mustaev A., Severinova E., Kozlov M., Darst S.A., Goldfarb A. The beta subunit Rif-cluster I is only angstroms away from the active center of Escherichia coli RNA polymerase И J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 29428-29432.

37. Severinov K., Mustaev A., Kashlev M., Borukhov S., Nikiforov V., Goldfarb A. Dissection of the beta subunit in the Escherichia coli RNA polymerase into domains by proteolytic cleavage II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12813-12819.

38. Schuster G.B., Platz M.S. Photochemistry of phenyl azides // Advances in photochem. 1992. V. 17. P. 69-143.

39. Doronin S.V„ Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffmity labeling of DNA polymerase alpha DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog II FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 31-33.

40. Doronin S. V., Dobrikov M. I., Buckle M., Roux P., Buc H., Lavrik О. I. Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs H FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202.

41. Foiani М., Lindner A.J., Hartmann G.R., Lucchini G., Plevani P. Affinity labeling of the active center and ribonucleoside triphosphate binding site of yeast DNA primase II J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2189- 2194.

42. Лаврик О.И., Захаренко А.Л., Прасад P., Власов B.A., Богачев B.C., Фавр A. dNTP, ковалентно присоединенные к ДНК-полимеразам через основание, активны в реакциях нуклеотидильного переноса II Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 621-628.

43. Goeldner М.Р., Hirth C.G. Specific photoaffinity labeling induced by energy transfer: application to irreversible inhibition of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1980. V. 77. P. 6439-6442.

44. Kotzyba-Hibert F., Lagenbuch-Cachat J., Jaganathen J., Goeldner M., Hirth C. Aryldiazonium salts as photoaffinity labels of the nicotinic acetylcholine receptor PCP binding site IIFEBS Lett. 1985. V. 182. P. 297-301.

45. Peng L., Alcaraz M.L., Klotz P., Kotzyba-Hibert F., Goeldner M. Photochemical labeling of membrane-associated and channel-forming domains of proteins directed by energy transfer H FEBS Lett. 1994. V. 346. P. 127-131.

46. Schalk I., Ehret-Sabatier L., Bouet F., Goeldner M., Hirth C. Trp279 is involved in the binding of quaternary ammonium at the peripheral site of Torpedo marmorata acetylcholinesterase II Eur. J. Biochem. 1994. V. 219. P. 155-159.

47. Langenbuch-Cachat J., Bon C., Mulle C., Goeldner M., Hirth C., Changeux J.P. Photoaffinity labeling of the acetylcholine binding sites on the nicotinic receptor by an aryldiazonium derivative //Biochemistry. 1988. V. 27. P. 2337-2345.

48. Raviv Y., Salomon Y., Gitler C., Bercovici T. Selective labeling of proteins in biological systems by photosensitization of 5-iodonaphthalene-l -azide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 6103-6107.

49. Riordan J.R., Deuchars К., Kartner N., Alon N., Trent J., Ling V. Amplification of P-glycoprotein genes in multidrug-resistant mammalian cell lines II Nature. 1985. V. 316. P. 817-819.

50. Raviv Y., Pollard H.B., Bruggemann E.P., Pastan I., Gottesman M.M. Photosensitized labeling of a functional multidrug transporter in living drug-resistant tumor cells II J. Biol. Cheme. 1990. V. 265. P. 3975-3980.

51. Bercovici Т., Gitler C. 5-125I.Iodonaphthyl azide, a reagent to determine the penetration ofproteins into the lipid bilayer of biological membranes II Biochemistry. 1978. V. 17. P. 1484-1489.

52. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates II Antisense Nucleic Acid Drug. Dev. 1997. V. 7. P. 309-317.щ

53. Захаренко A.JL, Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И., Менендес-Ариас Л. Исследование dNTP-связывающего участка обратной транскриптазы ВИЧ-1 с помощью фотореакционноспособных аналогов dNTP И Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1227-1237.

54. Huang H., Chopra R., Verdine G. L., Harrison S. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance 11 Science. 1998. V. 282. P. 1669-1675.

55. Драчкова И.А., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Захаренко А.Л., Шишкин Г.В.,

56. Назаркина Ж.К., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Исследование взаимодействия флэпэндонуклеазы-1 с репликативным белком А с использованием фотоактивных интермедиатов репарации ДНК // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1136-1146.

57. Lebedeva N.A., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. АР endonuclease 1 has no biologically significant 3'-5'-exonuclease activity // Biochem. Biophys. Res. Com. 2003. V. 300, P. 182-187.

58. Суханова M.B., Ходырева C.H., Прасад P., Вилсон С.Г., Лаврик О.И. TIonu(ADP-рибоза)-полимераза-1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой /3// Биохимия. 2003. в печати.

59. Henricksen L.A., Umbricht С.В., Wold M.S. Recombinant replication protein A: expression, complex formation, and functional characterization II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P.11121-11132.

60. Ямщиков В.Ф., В кн. Методы молекулярной генетики и генной инженерии, (под ред. Салганика Р.И.) // Наука. Москва. 1990. С. 112-114.

61. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

62. Grimm E, Arbuthnot P. Rapid purification of recombinant Taq DNA polymerase by freezing and high temperature thawing of bacterial expression cultures // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4518-4519.

63. Речкунова Н.И., Акишев А.Г., Лебедева H.A., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus thermophilus В35: выделение и изучение свойств //Биохимия. 1998. Т. 63. С.1490-1495.

64. Prasad R., Lavrik O.I., Kim S.J., Kedar P., Yang X.P., Vande Berg B.J., Wilson S.H. DNA polymerase beta -mediated long patch base excision repair. Poly(ADP-ribose)polymerase

65. Sawaya M.R., Prasad R., Wilson S.H., Kraut J., Pelletier H. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism. И Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11205-11215.

66. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции /I Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

67. Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 11 Kluwer Academic. New York. 1999. P. 13-14.

68. Сафронов И.В. Конструирование фотоаффинных реагентов для исследования комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот. Производныеd)NTP, несущие перфторазидоарилъные группы II Дис. к-та хим. наук. НИБХ СО РАН, 1999. С. 60-70.

69. Favre A., Saintome С., Fourrey J.-L., Clivio P., Lauga P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. // J. Photochem. Photobiol. B:Biol. 1998. V. 42. P. 109-124.

70. Pelletier H., Sawaya M.R., Wolfe W., Wilson S.H., Kraut J. Crystal structure of human DNA polymerase p complexed with DNA: implications for catalytic mechanism, processivity and fidelity 11 Biochemistry. 1996. V. 35. P. 12742-12761.

71. Wold M. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism //Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.

72. Collins K.L., Russo A.A.R., Tseng B.Y., Kelly T.J. The role of the 70 kDa subunit of human DNA polymerase alpha in DNA replication // EMBO J. 1993. V. 12. P. 4555-4566.

73. Kaguni L.S., Rossignol J.-M., Conaway G.R., Banks G.R., Lehman I.R. Association of DNA primase with the beta/gamma subunits of DNA polymerase alpha from Drosophila melanogaster embryos // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9037-9039.

74. Tseng B.Y., Ahlem C.N. DNA primase from mouse cells. Purification and partial characterization // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9845-9849.

75. Lehman I.R., Kaguni L.S. DNA polymerase alpha И J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 42654267.

76. Copeland W.C., Wang T.S.F. Enzymatic characterization of the individual mammalian primase subunits reveals a biphasic mechanism for initiation of DNA replication // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. 26179-26189.

77. Nasheuer H.-P., Grosse F. DNA polymerase alpha-primase from calf thymus. Determination of the polypeptide responsible for primase activity // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 8981

78. Santocanale С., Foiani M., Luchini G., Plevani P. The isolated 48,000-dalton subunit of yeast DNA primase is sufficient for RNA primer synthesis И J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1343-1348.

79. Schneider A., Smith R.W.P., Kautz A.R., Weisshart K., Grosse F., Nasheuer H.-P. Primase activity of human DNA polymerase alpha-primase. Divalent cations stabilize the enzyme activity of the p48 subunit // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21608-21615.

80. Wang T.S. Eukaryotic DNA polymerases U Annu. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 513-552.

81. Wilson S.H. Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta H Mutat. Res. 1998. V. 407. P. 203-215.

82. Srivastava D.K., Berg B.J., Prasad R., Molina J.T., Beard W.A., Tomkinson A.E., Wilson S.H. Mammalian abasic site base excision repair. Identification of the reaction sequence and rate-determining steps // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21203-21209.

83. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. 1993. V. 362. P. 709-715.

84. Demple В., Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology II Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 915-948.

85. Wilson III D.M., Thompson L.H. Life without DNA repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 12754-12757.

86. Biade S., Sobol R.W., Wilson S.H., Matsumoto Y. Impairment of proliferating cell nuclear antigen-dependent apurinic/apyrimidinic site repair on linear DNA II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 898-902.

87. Dianov G.L., Prasad R., Wilson S.H., Bohr V.A. Role of DNA polymerase beta in the excision step of long patch mammalian base excision repair II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 13741-13743.

88. Matsumoto Y., Kim K., Hurwitz J., Gary R., Levin D.S., Tomkinson A.E., Park M.S. Reconstitution of proliferating cell nuclear antigen-dependent repair of1. БЛАГОДАРНОСТИ

89. Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям Лаврик Ольге Ивановне и Речкуновой Надежде Ивановне за помощь в написании диссертационной работы, за обсуждение постановки экспериментов, а также просто за их человечность.

90. Особая благодарность Буневой Валентине Николаевне и Моор Нине Александровне за внимательное прочтение работы, ценные советы и замечания.

91. Автор глубоко благодарен Ученому совету Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, который смог понять и оценить данную работу.