Анализ взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами методами ограниченного протеолитического расщепления и аффинной модификации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Пестряков, Павел Ефимович

• Пестряков, Павел Ефимович
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Пестряков, Павел Ефимович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ SSB-БЕЛКОБ В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА ДНК.

1.1. СТРОЕНИЕ SSB-БЕЛКОБ.

1.1.1. ГОМОТЕТРАМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ.

1.1.2. ГОМОДИМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ.

1.1.3. ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ, РЕПЛИКАТИВНЫЙ БЕЛОК А.

1.1.4. SSB-БЕЛКИ ДРУГОГО СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ.

1.2. ОСОБЕННОСТИ ДОМЕННОЙ СТРУКТУРЫ SSB-БЕЛКОБ И МЕХАНИЗМ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК.

1.2.1. ОВ-ДОМЕН - ОСНОВА СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ SSB-БЕЛКОБ.

1.2.2. ДРУГИЕ ДОМЕНЫ SSB-БЕЛКОБ.

1.2.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ SSB-БЕЛКОБ С ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК.

1.3. УЧАСТИЕ SSB-БЕЛКОБ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ.

1.3.1. SSB-БЕЛКИ В ПРОЦЕССАХ РЕПЛИКАЦИИ, РЕПАРАЦИИ И РЕКОМБИНАЦИИ ДНК.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. МАТЕРИ АЛЫ.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. АРХИТЕКТУРА КОМПЛЕКСОВ RPA С МОДЕЛЬНЫМИ ДНК.

3.1.1. ОСОБЕННОСТИ КОНФОРМАЦИИ RPA В ЕГО КОМПЛЕКСАХ С ДНК (ПО

ДАННЫМ МЕТОДА ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ).

3.1.2. ОРИЕНТИРОВАННОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ СУБЪЕДИНИЦ RPA В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ЕГО КОМПЛЕКСОВ С ДНК (ПО ДАННЫМ МЕТОДА ФОТОАФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ).

3.1.3. КООРДИНАЦИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДОМЕНОВ RPA С ЧАСТИЧНЫМИ ДНК-ДУПЛЕКСАМИ (ПО ДАННЫМ МЕТОДА ФОТОАФФИННОЙ

МОДИФИКАЦИИ).

3.2. РОЛЬ МАЛЫХ СУБЪЕДИНИЦ RPA В СОСТАВЕ ГЕТЕРОТРИМЕРА.

3.2.1. СТРУКТУРНАЯ РОЛЬ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14.

3.2.2. УЧАСТИЕ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14 В ПРОЦЕССЕ СВЯЗЫВАНИЯ ДНК.

3.2.3. РОЛЬ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14 В ПРОЦЕССЕ РЕПЛИКАЦИИ ДНК.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами методами ограниченного протеолитического расщепления и аффинной модификации»

Исследование механизмов хранения и реализации генетической информации является одной из важнейших фундаментальных задач современной биохимии и молекулярной биологии. На данный момент значительный прогресс достигнут в изучении строения и свойств ДНК-полимераз, играющих ключевую роль в этих процессах, однако свои специализированные функции в репликации и репарации ДНК у эукариот ДНК-полимеразы осуществляют в тесном взаимодействии с другими ферментами и белковыми факторами, такими как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и др. Системы репликации и репарации ДНК в настоящее время следует рассматривать как взаимосогласованные функциональные ансамбли белков. Таким образом, важным направлением является изучение белков и факторов репликации и репарации ДНК, которые осуществляют регулирующую и координирующую функции в этих ансамблях.

Объектом нашего исследования является эукариотический SSB-белок -репликативный белок А, являющийся ключевым фактором метаболизма ДНК, участвующим в репликации, репарации и рекомбинации ДНК. В процессах репликации и репарации RPA, с одной стороны, стабилизирует структуры ДНК, содержащие одноцепочечные участки, а с другой, координирует взаимодействие других белковых факторов с ДНК. Динамичная природа взаимодействий RPA с ДНК и белками-партнерами обусловлена особенностями структуры гетеротримера RPA, состоящего из субъединиц р70, р32 и р 14, в которых различают сразу несколько доменов, потенциально способных взаимодействовать с нуклеиновой кислотой. Взаимодействие RPA с ДНК сопровождается формированием нескольких типов комплексов, которые отличаются расположением и ориентацией белка относительно ДНК, при этом переход одного типа комплекса в другой происходит на стадиях ферментативных превращений ДНК. Таким образом, изучение разных типов взаимодействия RPA со структурами ДНК, участвующими в репликации и репарации, вносит неоценимый вклад в исследование путей регуляции и координации этих процессов и является, безусловно, актуальной задачей. К настоящему моменту достаточно хорошо исследованы комплексы RPA с одноцепочечной ДНК, однако взаимодействие RPA с частичными ДНК-дуплексами с выступающим 5'-одноцепочечным участком, которые имитируют субстраты ДНК-полимераз, изучено в гораздо меньшей степени. Остается открытым ряд вопросов о механизме формирования образующихся комплексов, координации ДНК-связывающей активности разных доменов и, наконец, функциональной роли доменов и субъединиц белка, не отвечающих за высокоаффинное взаимодействие с ДНК-субстратом. Таким образом, исследование "архитектуры" комплексов ЯРА с частичными ДНК-дуплексами, а также механизма их формирования представляет значительный интерес и является актуальным.

Физические методы исследования отдельных белков и комплексов белков с лигандами, такие как рентгеноструктурный анализ (РСА) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), зарекомендовали себя в качестве наиболее информативных подходов. В то же время каждый из этих методов имеет свои ограничения. Например, метод рентгепоструктурггого анализа не всегда применим из-за проблем при кристаллизации сложных биологических комплексов. Кроме того, РСА, как правило, не дает представлений о динамике взаимодействия белков с лигандом. Метод ЯМР является достаточно дорогим в связи с необходимостью использовать большие количества исследуемого биополимера, кроме того, существуют очень жесткие ограничения на размер изучаемого объекта. В связи с этим, одним из наиболее приемлемых подходов является метод фотоаффинной модификации.

Метод фотоаффинной модификации основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание его ферментом. Подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером и последующее ковалентное присоединение аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр белка или находящимся в непосредственной близости от активного центра. Полученные структурные данные позволяют сделать вывод о расположении и организации участков связывания субстратов в молекуле биополимера. Подход наиболее эффективен при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур. Комбинация фотоаффинной модификации с другими биохимическими подходами, такими как метод ограниченного протеолитического расщепления, а также метод сайт-направленного мутагенеза, позволяет эффективно изучать механизмы междоменного и межсубъединичного взаимодействия в белках и их комплексах с лигандами. Использование широкого спектра фотоаффинных реагентов, обладающих самой различной эффективностью и селективностью модификации биополимера, открывает возможности исследования комплексов различной структуры и сложности. Данный подход позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белка с лигандом, являющиеся промежуточными в динамичных процессах репликации и репарации ДНК.

Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК.

В ходе исследования планировалось решить следующие задачи.

• Методами фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления изучить структурную организацию ("архитектуру") комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, то есть расположение и ориентацию субъединиц и доменов белка относительно ДНК.

• С использованием мутантных форм белка, лишенных некоторых доменов, исследовать механизмы образования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, определить роль отдельных доменов репликативного белка А и изучить взаимодействие этих доменов.

• С использованием мутантных форм RPA с определенным субъединичным составом выяснить роль отдельных субъединиц RPA во взаимодействии с ДНК и поддержании его функциональной активности в модельной системе репликации SV-40.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Пестряков, Павел Ефимович

выводы

1. Изучено расположение субъединиц репликативного белка А (ИРА) в его комплексах, образованных с одноцепочечпой ДНК.

• Показано, что в комплексах, образованных по типу КРАЗО, субъединицы гетеротримера 11РА ориентированы в направлении от 5'- к З'-концу. С помощью метода фотоаффшшого мечения установлено, что 5'-концевой и центральный участки одноцепочечного олигонуклеотида непосредственно контактируют с субъединицей р70, а З'-концевой участок - с субъединицей р32.

• Впервые выявлены контакты субъединицы р!4 репликативного белка А с одноцепочечной ДНК.

2. С помощью методов фотоаффинной модификации и ограниченного иротеолитического расщепления исследованы особенности формирования комплексов 11РА с частичными ДНК-дуплексами, несущими 5'-выступающий одноцепочечный участок.

• Показано, что если размер одноцепочечного участка ДНК-дуплекса больше пяти, но меньше девяти нуклеотидных звеньев, связывание происходит с доменами А и В субъединицы р70, а ДНК-связывающий домен р70С контактирует с одноцепочечным участком, если его длина превышает шестнадцать нуклеотидных звеньев.

• Установлено, что субъединица р32 расположена вблизи 3'-конца праймера и не взаимодействует с одноцепочечным участком ДНК-дуплекса.

3. Изучена роль отдельных доменов КРА в механизме образования его комплексов с частичными ДНК-дуплексами, содержащими 5'-выступающий одноцепочечный участок.

• Показано, что домены р70ШТ>, р32Ь1, р32СТО не оказывают влияния на ориентированное связывание гетеротримера КРА с ДНК.

• Установлено, что белок, состоящий из ДНК-связывающих доменов р70С и р320, а также субъединицы р14, способен связывать частичные ДНК-дуплексы. При этом домен р70С контактирует с одноцепочечным участком вблизи его перехода в двуцепочечный, а домен р32Э - с З'-концом праймера, что соответствует ориентации этих ДНК-связывающих доменов в составе полного гетеротримера КРА.

4. Исследована роль малых субъединиц ЯРА во взаимодействии с ДНК и поддержании функциональной активности ЯРА в модельной системе репликации БУ-40.

• Показано, что мутантная форма 11РА, в составе которой отсутствует субъединица р14 или р32, сохраняет ДНК-связывающую активность и способность взаимодействовать с Т-антигеном и ДНК-полимеразой-а-праймазой.

• Установлено, что 11РА, лишенный субъединицы р14, способен связывать одноцепочечную ДНК, но в его комплексах с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации ДНК, субъединица р32 не контактирует с областью перехода одноцепочечного участка ДНК в двуцепочечный.

• Показано, что для проявления функциональной активности ЯРА на стадиях инициации синтеза РНК-праймера и его элонгации требуется присутствие всех трех субъединиц гетеротримера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итогом настоящей работы явилось исследование механизмов взаимодействия репликативного белка А с ДНК и белковыми партнерами в процессах репликации ДНК. В первой части работы получены принципиально новые результаты в области исследования архитектуры комплексов RPA как с одноцепочечпыми олигонуклеотидами, так и с модельными ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК на этапе ресинтеза. Общность в архитектуре комплексов RPA с этими двумя видами ДНК заключается в том, что ДНК-связывающие домены большой субъединицы р70 вносят определяющий вклад во взаимодействие с одноцепочечным участком ДНК, тем самым, обеспечивая необходимое сродство белка к ДНК-структуре. Для обоих типов связывания характерна "полярная" ориентация субъединиц RPA относительно ДНК, которую определяет специфическая укладка субъединиц р70 и р32. Основное отличие комплексов RPA с одноцепочечной ДНК и частичными ДНК-дуплексами заключается в положении субъединицы р32. Если в случае оцДНК эта субъсдиница непосредственно взаимодействует с одноцепочечным участком, то в комплексах RPA с ДНК-дуплексами она размещается в районе перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную.

В ходе исследования, направленного на изучение роли доменов RPA в связывании модельных ДНК-структур, были получены данные, позволившие пролить свет на механизм образования комплексов RPA с ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты процессов репликации и репарации ДНК. Было обнаружено, что в связывание рассмотренных форм ДНК вовлечены домены р70А, р70В, р70С и p32D RPA. Домены р70А и р70В связывают одноцепочечные участки ДНК-структур. В комплексах RPA с протяженной оцДНК домены р70С и p32D также могут находиться в контакте с оцДНК, однако при взаимодействии с частичными ДНК-дуплексами эти домены оказываются расположены в области перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную. В таких комплексах домен р70С занимает место на одноцепочечном участке, a p32D непосредственно контактирует с З'-концом праймера. Наличие тандема основных ДНК-связывающих доменов р70А и р70В не является необходимым для специфического b ориентированного взаимодействия RPA с частичными ДНК-дуплексами. Показано, что домены p70N, p32N, р32С RPA не принимают участия в процессе связывания с ДНК.

Особый интерес представляют результаты исследования роли малых субъединиц белка, которая долгое время оставалась неясной. В настоящей работе показано, что для достижения наибольшей ДНК-связывающей активности RPA требуется наличие в белке всех трех субъединиц. Более того, для формирования комплекса RPA с ДНК-дуплексами, в котором субъединица р32 специфически ориентирована относительно области перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечиую, необходимо участие малой субъединицы р14. В отсутствие этой субъединицы способность RPA к "полярной" укладке на ДНК теряется. В работе впервые обнаружены непосредственные контакты субъединицы р14 с ДНК, что позволяет говорить о существовании ранее не описанного способа связывания белка с ДНК, который может играть важную роль в динамическом процессе взаимодействия RPA с ДНК.

Очевидно, что полученные результаты отражают лишь часть существующих функциональных связей между субъединицами RPA. Несомненно, что в процессах метаболизма ДНК, таких как репликация и репарация, кроме взаимодействия RPA с ДНК-субстратом принципиальное значение имеют и белок-белковые взаимодействия. Поэтому во второй части работы был проведен анализ роли субъединиц RPA в процессе репликации ДНК в модельной системе SV-40. Партнерами RPA в этом процессе являются ключевые белки процесса инициации репликации - вирусный Т-антиген, представляющий собой геликазу, и ДНК-полимераза-а-праймаза, осуществляющая синтез РНК-праймера и его элонгацию на начальном этапе репликации. Отсутствие в RPA субъединиц р14 и р32, как вместе, так и порознь, кардинально не влияет на способность белка поддерживать стадию Т-антиген-зависимого расплетания двуцепочечной ДНК. В то же время, мутантные формы RPA, лишенные субъединицы р32 и/или р 14, ие способны обеспечивать синтез РНК-праймера и его элонгацию - стадий, катализируемых ДНК-полимеразой-а-праймазой. На данном этапе можно предположить, что отсутствие малых субъединиц мешает образованию продуктивного тройного комплекса pol-a-prim^HK-cyôcTpa^RPA. В формировании такого комплекса особую роль должны играть белок-белковые взаимодействия р32 и р70 с pol-a-prim и участие этих субъединиц, а также р14 в ориентированной укладке RPA на ДНК-субстрат. С потерей "полярности" в укладке субъединиц белок теряет свою способность поддерживать синтез и элонгацию РНК-праймера. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выполнения RPA его роли в репликации ДНК нужна не только ДНК-связывающая активность отдельных субъединиц, но и необходима координированная работа полного гетеротримера.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Пестряков, Павел Ефимович, 2007 год

1. Wold M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.

2. Lohman T.M., Ferrari M.E. Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple

3. DNA-binding modes and cooperativities // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 527-570.

4. Cha T.A., Alberts B.M. The bacteriophage T4 DNA replication fork. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P. 12220-12225.

5. Kim Y.T., Richardson C.C. Bacteriophage T7 gene 2.5 protein: an essential protein for DNAreplication//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 V. 90. P. 10173-10177.

6. Perales C., Cava F„ Meijer W.J.J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at hightemperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein // Nucleic Acids Res. V. 31. P. 6473-6380.

7. Chase J.W, Williams K.R. Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication//Annu. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 103-136.

8. Zou Y., Liu Y., Wu X., Shell S.M. Functions of human replication protein A (RPA): from DNAreplication to DNA damage and stress responses // J. Cell. Physiol. 2006. V. 208. P. 267-273.

9. Kelly T.J., Simancek P., Brush G.S. Identification and characterization of a single-stranded

10. DNA-binding protein from the archaeon Methanococcus jannaschii // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. V. 95. P. 14634-14639.

11. Philipova D., Mullen J.R., Maniar H.S., Lu J., Gu C., Brill S.J. A hierarchy of SSB protomersin replication protein A // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 2222-2233.

12. Genschel J., Litz L., Thole H„ Roemling U., Urbanke C. Isolation, sequencing and overproduction of the single-stranded DNA binding protein from Pseudomonas aeruginosa PAO // Gene. 1996. V. 182. P. 137-143.

13. Purnapatre K., Varshney U. Cloning, over-expression and biochemical characterization of the single-stranded DNA binding protein from Mycobacterium tuberculosis // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 591-598.

14. Sancar A., Williams K, Chase J., Rupp W. Sequences of the ssb gene and protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. V. 78. P. 4274-4278.

15. Weiner J.H., Bertsch L.L., Kornberg A. The deoxyribonucleic acid unwinding protein of Escherichia coli. Properties and functions in replication. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 1972-1980.

16. Yang C„ Curth U., Urbanke C„ Kang C.-H. Crystal structure of human mitochondrial single-stranded DNA binding protein at 2.4 A resolution // Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4. P. 153-157.

17. Curth U., Urbanke C., Greipel J., Gerberding H., Tiranti V., Zeviani M. Single-stranded-DNA-binding proteins from human mitochondria and Escherichia coli have analogous physicochemical properties // Eur. J. Biochem. 1994. V. 221. P. 435-443.

18. Eggington J.M., Haruta N., Wood E.A., Cox MM. The single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans // BMC Microbiol. 2004. V. 4. P. 2.

19. Witte G., Urbanke C., Curth U. Single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans: a biophysical characterization //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 1662-1670.

20. Robbins J.B., McKinney M.C., Guzman C.E., Sriratana B„ Fitz-Gibbon S., Ha T., Cann I.K The euryarchaeota, nature's medium for engineering of single-stranded DNA-binding proteins // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 15325-15339.

21. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard T., Chothia C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 536-540.

22. Iftode C„ Daniely Y., Borowiec J.A. Replication protein A (RPA): the eukaryotic SSB // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 34. P. 141-180.

23. Bochkarev A., Pfuetzner R.A., Edwards A.M., Frappier L. Structure of the single-stranded-DNA-binding domain of replication protein A bound to DNA // Nature. 1997. V. 385. P. 176-181.

24. Bochkareva E., Korolev S., Lees-Miller S.P., Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA // EMBO J. 2002. V. 21. P.1855-1863.

25. Lin Y., Robbins J.B., Nyannor E.K., Chen Y.H., Cann I.K. A CCCH zinc finger conserved in a replication protein a homolog found in diverse Euryarchaeotes // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 7881-7889.

26. Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M., Bochkarev A. The RPA32 subunit of human replication protein A contains a single-stranded DNA-binding domain // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3932-3936.

27. Mer G., Bochkarev A., Gupta R„ Bochkareva £., Frappier L., Ingles C.J., Edwards A.M., Chazin W.J. Structural basis for the recognition of DNA repair proteins UNG2, XPA, and RAD52 by replication factor RPA // Cell. 2000. V. 103. P. 449-456.

28. Bochkarev A., Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M. The crystal structure of the complex of replication protein A subunits RPA32 and RPA 14 reveals a mechanism for single-stranded DNA binding // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4498-4504.

29. Chedin F„ Seitz E.M., Kowalczykowski S.C. Novel homologs of replication protein A in archaea: implications for the evolution of ssDNA-binding proteins // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23. P. 273-277.

30. Kerrl.D., Wadsworth R.I., Cubeddu L„ Blankenfeldl W., Naismith J.H., White M.F. Insights into ssDNA recognition by the OB fold from a structural and thermodynamic study of Sulfolobus SSB protein //EMBO J. 2003. V.22. P. 2561-2570.

31. Wadsworth R.I., White M.F. Identification and properties of the crenarchaeal single-stranded DNA binding protein from Sulfolobus solfataricus //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 914920.

32. Theobald D.L., Milton-Fry R.M., Wuttke D.S. Nucleic acid recognition by OB-fold proteins // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003. V. 32. P. 115-133.

33. Singleton M.R., Scaife S„ Wigley D.B. Structural analysis of DNA replication fork reversal by RecG // Cell. 2001. V. 107. P. 79-89.

34. Mitton-Fry R.M., Anderson E.M., Hughes T.R., Lundblad F., Wuttke D.S. Conserved structure for single-stranded telomeric DNA recognition // Science. 2002. V. 296 P. 145-147.

35. Bochkarev A., Bochkareva E. From RPA to BRCA2: lessons from single-stranded DNA binding by the OB-fold // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. V. 14. P. 36-42.

36. Raghunathan S„ Kozlov A.G., Lohman T.M., Waksman G. Structure of the DNA binding domain of E. coli SSB bound to ssDNA // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 648-652.

37. Bycroft M., Hubbard T.J.P., Proctor M., Freund S.M.V., Murzin A.G. The solution structure of the SI RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold // 1997. Cell. V. 88. P. 235-242.

38. Shamoo Y., Friedman A.M., Parsons M.R., Königsberg W.H., Staitz T.A. Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA-binding protein (T4 gp32) complexed to DNA // Nature. 1995. V. 376. P. 362-366.

39. Antson A.A. Single-stranded RNA-binding proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. P. 87-94.

40. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 235-242.

41. Carter A.P., Clemons W.M. Jr., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Hartsch T., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit//Science. 2001. V. 291. P. 498-501.

42. Bochkareva E., Belegu V., Korolev S., Bochkarev A. Structure of the major single-stranded DNA-binding domain of replication protein A suggests a dynamic mechanism for DNA binding //EMBO J. 2001. V. 20. P. 612-618.

43. Bogden C.E., Fass D., Bergman N„ Nichols M.D., Berger J.M. The structural basis for terminator recognition by the Rho transcription termination factor // Mol. Cell. 1999. V. 3. P. 487-493.

44. Peersen O.B., Ruggles J.A., Schullz S.C. Dimeric structure of the Oxytricha nova telomere end-binding protein a-subunit bound to ssDNA //Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9. P. 182-187.

45. Savvides S.N., Raghunathan S., Futterer K., KozlovA.G., Lohman T.M., Waksman G. The C-terminal domain of full-length E. coli SSB is disordered even when bound to DNA // Protein Sci.2004.V. 13. P. 1942-1947.

46. Grishin N. V. Treble clef finger a functionally diverse zinc-binding structural motif // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 1703-1714.

47. Matthews J. M„ Sunde M. Zinc fingers folds for many occasions // IUBMB Life. 2002. V. 54. P.351-355.

48. Krishna S. S., Majumdar I., Grishin N. V. Structural classification of zinc fingers: survey and summary // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 532-550.

49. Lachenmann M. J., Ladbury J. E„ Dong J., Huang K., Carey P., Weiss M. A. Why zinc fingers prefer zinc: ligand-field symmetry and the hidden thermodynamics of metal ion selectivity // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 13910-13925.

50. Park J.S., Wang M., Park S.J., Lee S.H. Zinc finger of replication protein A, a non-DNA binding element, regulates its DNA binding activity through redox // J. Biol. Cliem. 1999. V. 274. P. 29075-29080.

51. Kelman Z., Pietrokovski S., Hunvitz J. Isolation and characterization of a split B-type DNA polymerase from the archaeon Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28751-28761.

52. Komori K,. Ishino Y. Replication protein A in Pyrococcus furiosus is involved in homologous DNA recombination // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25654-25660.

53. Bochkareva E., Korolev S., Bochkarev A. The role for zinc in replication protein A // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 27332-27338.

54. Bujalowski W., Overman L.B., Lohman T.M. Binding mode transitions of Escherichia coli single strand binding protein-single-stranded DNA complexes. Cation, anion, pH, and binding density effects // J. Biol. Chem. 1988. V. 163. P. 4629-4640.

55. Kozlov A.G., Lohman T.M. Kinetic mechanism of direct transfer of Escherichia coli SSB tetramers between single-stranded DNA molecules // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 1161111627.

56. Bastin-Shanower S.A., and Brill S.J. Functional analysis of the four DNA binding domains of replication protein A. The role of RPA2 in ssDNA binding // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 36446-36453.

57. Treuner K., Ramsperger U., Knippers R.J. Replication protein A induces the unwinding of long double-stranded DNA regions // Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 104-112.

58. Blackwell L.J., Borowiec J.A., Masrangelo I.A. Single-stranded-DNA binding alters human replication protein A structure and facilitates interaction with DNA-dependent protein kinase// Mol. Cell. Biol. 1996. V.16. P.4798-807.

59. Lohman T.M., Overman L.B. Two binding modes in Escherichia coli single strand binding protein-single stranded DNA complexes. Modulation by NaCl concentration // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3594-3603.

60. Gomes X. V., Henrichen L.A., Wold M.S. Proteolytic mapping of human replication protein A: evidence for multiple structural domains and a conformational change upon interaction with single-stranded DNA // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5586-5595.

61. Kim C„ Wold M.S. Recombinant human replication protein A binds to polynucleotides with low cooperativity // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 2058-2064.

62. Lohman T.M., Bujalowski W. Effects of base composition on the negative cooperativity and binding mode transitions of Escherichia coli SSB-single-stranded DNA complexes // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 6167-6176.

63. Davey M.J., O'DonnellM. Mechanisms of DNA replication // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000.1. V. 4. P. 581-586.

64. Stauffer M.E., Chazin W.J. Structural mechanisms of DNA replication, repair, and recombination//J. Biol. Chem. 2004.V. 279. P. 30915-30918.

65. Kur J., Olszewski M„ Dlugolecka A., Filipkowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) sources and applications in molecular biology // Acta Biochim. Pol. 2005. V. 52. P. 569-574.

66. Yuzhakov A., Kelman Z, Hunvitz J., O'Donnell M. Multiple competition reactions for RPA order the assembly of the DNA polymerase delta holoenzyme // EMBO J. 1999. V. 18. P. 6189-6199.

67. Maga G., Stucki M., Spadari S., Hubscher U. DNA polymerase switching: I. Replication factor С displaces DNA polymerase alpha prior to PCNA loading // J. Mol. Biol. 2000. V. 295.P.791-801.

68. Carty M.P., Levine A.S., and Dixon K. HeLa ccll single-stranded DNA-binding protein increases the accuracy of DNA synthesis by DNA polymerase alpha in vitro // Mutat. Res. 1992. V. 274 P. 29-34.

69. Maga G., Frouin I., Spadari S., Hubscher U. Replication protein A as a "fidelity clamp" for DNA polymerase alpha. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 18235-18242.

70. Cann I.K., Ishino S., Yuasa M., Daiyasu H., Toh H., Ishino Y. Biochemical analysis of replication factor С from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // J. Bacterid. 2001. V. 183. P. 2614-2623.

71. Benkovic S.J., Valentine A.M., Salinas F. Replisome-mediated DNA replication // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 181-208.

72. Хлиманков Д.Ю., Речкунова H.A., Лаврик О.И. Репликативный комплекс эукариот: изучение структуры и функции методом аффинной модификации // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 311-327.

73. Essers J., Houtsmuller A.B., van Veelen L., Paulusma C., Nigg A.L., Pastink A., Vermeiden W., Hoeijmakers J.H., Kanaar R. Nuclear dynamics of RAD52 group homologous recombination proteins in response to DNA damage // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2030-2037.

74. Riedl Т., Hanaoka F., Egly J.M. The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA // EMBO J. 2003. V. 22. P. 5293-5303.

75. Arunkumar A.I., Stauffer M.E., Bochkareva E., Bochkarev A., Chazin W.J. Independent and coordinated functions of replication protein A tandem high affinity single-stranded DNA binding domains // J. Biol. Chem. 2003. V. 17. P. 41077-41082.

76. Carlini L., Curth U., Kindler В., Urbanke C., Porter R. D. Identification of amino acids stabilizing the tetramerization of the single stranded DNA binding protein from Escherichia coli // FEBS Lett. 1998. V. 430. P. 197-200.

77. Weisshart K., Taneja P., Fanning E. The replication protein A binding site in simian virus 40 (SV40) T antigen and its role in the initial steps of SV40 DNA replication // J. Virol. 1998. V. 72. P. 9771-9781.

78. Golub E.I., Gupta R.C., Haaf Т., Wold M.S., Radding C.M. Interaction of human rad51 recombination protein with single-stranded DNA binding protein, RPA // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5388-5393.

79. He Z, Brinton B.T., Greenblatt J., Hassell J.A., Ingles C.J. The transactivator proteins VP 16 and GAL4 bind replication factor A // Cell. 1993. V. 73. P. 1223-1232.

80. Gajiwala K.S., BurleyS.K. Winged helix proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. P. 110-116.

81. Braun K.A., Lao Y., He Z., Ingles C.J., Wold M.S. Role of protein-protein interactions in the function of replication protein A (RPA): RPA modulates the activity of DNA polymerase alpha by multiple mechanisms // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8443-8454.

82. Stauffer M.E., Chazin W.J. Physical interaction between replication protein A and Rad51 promotes exchange on single-stranded DNA J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 25638-25645.

83. Лаврик О.И., Захарепко A.JI., Прасад P., Власов B.A., Богачев B.C., Фавр A. dNTP, ковалентно присоединенные к ДНК-полимеразам через основание, активны в реакциях нуклеотидильного переноса // Молекулярная биология. 1998. Т. 32. С. 621-628.

84. Колпащиков Д.М., Захаренко A.JI., Дежуров С.В., Речкуиова Н.И., Ходырева С.Н., Дектерев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. Новые реагенты для аффинной модификации Tte-ДНК-полимеразы//Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. С. 129-136.

85. Wlassoff W.A., Kimara M., Ishihama A.J. Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe RNA polymerase II. Location of the catalytic sites // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5104-5113.

86. Dornreiter I., Hoss A., Arthur A. K., Fanning E. SV40 T antigen binds directly to the large subunit of purified DNA polymerase alpha // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3329-3336.

87. Stadlbauer F., Brueckner A., Rehfuess C., Eckerskorn C., Lottspeich F., Forster V., Tseng, B.Y., Nasheuer H.P. DNA replication in vitro by recombinant DNA-polymerase-alpha-primase//Eur. J. Biochem. 1994. V. 222. P. 781-793.

88. Strausfeld U„ Richter A. Simultaneous purification of DNA topoisomerasc I and II from eukaryotic cells // Prep. Biochem. 1989. V. 19. P. 3748.

89. Kenny М.К., Schlegel П., Furneaux Н., Hurwitz J. The role of human single-stranded DNA binding protein and its individual subunits in simian virus 40 DNA replication // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 7693-7700.

90. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the 3'. end of nascent DNA//FEBS Lett. 1999. V. 450. P. 131-134.

91. TanejaP., GuJ., PengR., Carrick R„ Uchiumi F., Ott R.D., Gustafson E„ Podust V.N., and Fanning E. A Dominant-negative Mutant of Human DNA Helicase В Blocks the Onset of Chromosomal DNA Replication Hi. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 40853-40861.

92. Henricksen L.A., Umbricht С.В., Wold M.S. Recombinant replication protein A: expression, complex formation, and functional characterization // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 11 Hill 132.

93. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

94. Swain M., Ross N.W. A silver stain protocol for proteins yielding high resolution and transparent background in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1995. V. 16. P. 948-951.

95. Hennig L. WinPep software // BioTechniques. 1999. V. 26. P. 1170-1172.

96. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular cloning: A laboratory Manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y. 1989.

97. Mitina R.L., Doronin S.V., Dobrikov M.I., Tabaladze D.R., Levina A.S., Lavrik O.I. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Affinity labeling of the primer binding site // FEBS Lett. 1992. V. 312. P. 249-251.

98. Doronin S. V., Dobrikov М.1., Buckle M„ Roux P., Вис Ы, Lavrik O.l. Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs // FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202.

99. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of DNA polymerase alpha DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog // FEBS Lett. 1992. V.313. P. 31-33.

100. Лаврик О.И., Хлгшапков Д.Ю., Ходырева С.Н. Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 563-572.

101. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.А., Лаврик О.И. Репликативный комплекс эукариот: изучение структуры и функции методом аффинной модификации // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 311-327.

102. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication andDNA repair//Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

103. Назаркина Ж.К., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1613-1622.

104. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие)// М.: Наука. 1981. С. 56-59.

105. Lavrik O.I., Kolpashchikov D.M., Nasheuer Н.Р., Weissharl К, Favre A. Alternative conformations of human replication protein A are detected by crosslinks with primers carrying a photoreactive group at the 3'-end // FEBS Lett. 1998. V. 441. P. 186-190.

106. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.l. Polarity of human replication protein A binding to DNA // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. 373-379.

107. Mass G., Nelhanel Т., Kaufmann G. The middle subunit of replication protein A contacts growing RNA-DNA primers in replicating simian virus 40 chromosomes // Mol. Cell. Biol. 1998. V.18.P. 6399-6407.

108. Mass G., Nethanel Т., Lavrik O.l., Wold M.S., Kaufmann, G. Replication protein A modulates its interface with the primed DNA template during RNA-DNA primer elongation in replicating SV40 chromosomes // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3892-3899.

109. Favre A., Saintome C„ Fourrey J.L., Clivio P., Laugaa P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions // J. Photochem .Photobiol. B. 1998. V. 42. P. 109-124.

110. Brill S.J., Stillman B. Replication factor-A from Saccharomyces cerevisiae is encoded by three essential genes coordinately expressed at S phase // Genes Dev. 1991. V. 5. P. . 589— 1600.

111. Heyer W.-D., Rao M.R.S., Erdile L.F., Kelly T.J., Kolodner R.D. An essential Saccharomyces cerevisiae single-stranded DNA binding protein is homologous to the large subunit of human RPA //EMBO J. 1990. V. 9. P. 2321-2329.

112. Kneissl M., Putter V., Szalay A.A., Gritmmi F. Interaction and assembly of murine pre-replicative complex proteins in yeast and mouse cells // J. Mol. Biol. 2003. V. 327. P. 111128.

113. Walter J., Newport J. Initiation of eukaryotic DNA replication: origin unwinding and sequential chromatin association of Cdc45, RPA, and DNA polymerase alpha // Mol. Cell. 2000. V. 5. P. 617-627.

114. Nuss J.E., Alter G.M. Denaturation of replication protein A reveals an alternative conformation with intact domain structure and oligonucleotide binding activity // Protein Sci. 2004. V. 13. P. 1365-1378.

115. Lin Y.L., Chen C., Keshav K.F., Winchester E., Dutta A. Dissection of functional domains of the human DNA replication protein complex replication protein A // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P.17190-17198.

116. Wyka I.M., Dhar K., Binz S.K., Wold M.S. Replication protein A interactions with DNA: differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 12909-12918.

117. Wobbe C.R., Weissbach L., Borowiec J.A., Dean F.B., Murakami Y., Bullock P., Hunvitz J. Replication of simian virus 40 origin-containing DNA in vitro with purified proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. V. 84. P. 1834-1838.

118. Wold M.S., Kelly T.J. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. P. 2523-2527.

119. Brill S.J., Stillman B. Yeast replication factor-A functions in the unwinding of the SV40 origin of DNA replication//Nature. 1989. V. 342. P. 92-95.