Роль PDLIM4/RIL в процессе развития рака молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Кравченко Дмитрий Сергеевич

  • Кравченко Дмитрий Сергеевич
  • кандидат науккандидат наук
  • 2017, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
  • Специальность ВАК РФ03.01.03
  • Количество страниц 111
Кравченко Дмитрий Сергеевич. Роль PDLIM4/RIL в процессе развития рака молочной железы: дис. кандидат наук: 03.01.03 - Молекулярная биология. ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук. 2017. 111 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Кравченко Дмитрий Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость исследования

Степень достоверности и апробация диссертации

Публикации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Тезисы докладов на конференциях

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ген RIL

1.2. RIL как представитель PDZ/LIM-доменных белков

1.2.1 Особенности PDZ-доменов и PDZ-доменных белков

1.2.2. Особенности LIM-доменов и LIM-доменных белков

1.3. Репертуар взаимодействий белка RIL

1.4. Взаимосвязь RIL с процессами злокачественной трансформации клеток

1.4.1. Корреляция уровня экспрессии RIL со статусом рецепторов прогестерона и эстрогена

1.4.2. Корреляция уровня экспрессии RIL со степенью дифференцировки клеток опухоли

1.4.3. Корреляция уровня экспрессии RIL с другими параметрами РМЖ

1.4.4. Корреляция уровня экспрессии RIL с подтипом РМЖ в рамках модели РСК

1.4.5 Значение c-Src и RIL в развитии и характеристике рака молочной железы

1.5. Экспрессия c-Src как клиническая характеристика рака молочной железы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Работа с культурами эукариотических клеток

2

2.1.1. Клеточные линии, использованные в работе

2.1.2. Условия культивирования

2.1.3. Пересев адгезионных культур

2.1.4. Замораживание и размораживание эукариотических клеток

2.1.5. Оценка скорости пролиферации клеток

2.1.6. Оценка миграционной активности клеток

2.2. Молекулярно-биологические методы

2.2.1. Выделение тотальной РНК из клеток

2.2.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе

2.2.3. Электрофоретическое разделение РНК/ДНК в агарозном геле

2.2.4. Обратная транскрипция

2.2.5 Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

2.3. Работа с плазмидной ДНК и клонирование

2.3.1. Получение химически компетентных клеток Е.еоН

2.3.2. Трансформация химически компетентных клеток Е.еоН

2.3.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК

2.3.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.3.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей

2.3.6. Лигирование ДНК

2.3.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе

2.3.8. Трансфекция

2.3.9. Упаковка лентивирусных частиц

2.3.10. Очистка вирионов и трансдукция

2.4. Методы выделения и анализа белков

2.4.1. Анализ содержания белков в исследуемых клетках методом Вестерн-блоттинг

2.4.2. Определение активности киназы с^гс

2.4.3. Иммунофлуоресцентный анализ

2.5. Селекция модифицированных аптамеров к CD47 методом Cell-SELEX

2.5.1 Случайные ДНК-библиотеки и праймеры

2.5.2 Процедура SELEX на клетках

3

2.5.3 Определение связывающей способности одноцепочечных ДНК-аптамеров обогащенного пула после каждого раунда

2.5.4 Селекция клонов и секвенирование

2.5.5 Сравнение последовательностей и анализ вторичных структур аптамеров

2.5.6 Результаты проведения раундов селекции

2.6. Статистический анализ полученных данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ уровня экспрессии МЬ в ряду линий рака молочной железы

3.2. Подавление и повышение экспрессии МЬ в ряду линий РМЖ

3.3. Анализ миграционной активности МЬ (+) и МЬ (-) линий РМЖ

3.4. Анализ гипотезы РВЫМ4-опосредованной инактивации Бге киназ

3.5. Секвенирование транскриптомов трансгенных линий и анализ полученных результатов

3.6. Анализ взаимосвязи МЬ с моделью СБ-74 - опосредованного развития РМЖ

3.7. Анализ корреляции экспрессии МЬ с СБ44 и СБ47

3.8. Анализ внутриклеточной локализации МЬ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммудефицита человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотрейтол

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, проведенная на матрице, полученной

при обратной транскрипции

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

СЯЭ - сигнал ядерного экспорта

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация

AF (AlexaFluor) - общее название флюоресцентных красителей, разработанных компанией Molecular Probes

ATCC - American Type Culture Collection - американская коллекция типовых культур: клеточных линий, штаммов и другой микробиологической продукции. ALP (a-actinin associated LIM domain protein) - а-актинин-ассоциированный LIM-доменный белок

CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa) - карбокси-терминальный

CMV (promotor of cytomegalovirus early gene) - промотор раннего гена

цитомегаловируса

CRP - cysteine-rich protein

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) - ростовая среда Игла,

модифицированная Дульбекко

DMSO (dimethyl sulfoxide) - диметил сульфоксид

EGFR (от epidermal growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста

FHL - four-and-a-half LIM protein

GFP (green fluorescent protein) - зеленый флуоресцентный белок HRP (от horseradish peroxidase) - пероксидаза хрена LB - среда Луриа-Бертани

LIM - структурный белковый домен, названный по первым буквам генов lin-11,

isl-1 и mec-3, кодирующих белки, у которых он был впервые описан

LIM-доменный белок массой 36 кДа

LMO7 - LIM domain only protein

LTR (long terminal repeat) - длинный концевой повтор

M-MLV (от Moloney murine leukemia virus) - вирус Молони лейкоза мышей

NFkB - ядерный фактор каппа Б (от nuclear factor кВ)

PDLIM (от PDZ and LIM protein)

PDZ - структурный белковый домен, названный по первым буквам белков PSD95,

DlgA и ZO-1, у которых он был впервые описан

PTP (от protein tyrosine phosphatase) - тирозиновая фосфатаза

RIL (reversion induced LIM gene/protein)

RISC (от RNA-induced silencing complex) - РНК-индуцированный комплекс, осуществляющий сайленсинг SDS - додецилсульфат натрия

shPHK - короткая шпилечная РНК, используемая для РНК-интерференции (от англ. short hairpin)

siPHK- короткая интерферирующая РНК (от англ. short interfering)

SPF - параметр, отражающий долю клеток, находящихся в S-фазе клеточного

цикла (от англ. S-phase fraction)

TGFP - трансформирующий фактор роста в (от англ. transforming growth factor в)

6

TNM - tumor, nodus, metastasis: международная классификация стадий злокачественных новообразований.

TRIP6 - (thyroid hormone receptor interacting protein 6 - белок, взаимодействующий с рецептором тиреоидного гормона)

VSV-G (от vescular stomatitit virus G protein) - оболочечный белок G вируса везикулярного стоматита, часто используется для псевдотипирования рекомбинантных вирусных частиц

ZASP (от Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein) - альтернативно сплайсированный PDZ-белок Z-диска

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная биология», 03.01.03 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль PDLIM4/RIL в процессе развития рака молочной железы»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

На сегодняшний день рак молочной железы (РМЖ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний в мире. По оценкам Американского онкологического общества раком молочной железы на протяжении жизни заболевает каждая восьмая женщина; ежегодно от РМЖ умирает более 40000 человек [1, 2]. К 2012 году количество людей, страдающих от РМЖ, превысило 8 миллионов человек, при этом процент заболеваемости в большинстве стран продолжает неуклонно возрастать (см. рисунок 1) [3].

Проведение анализа |

1 | ----- 1 у/ ^ 1 / 1 1 1 Заболеваемость

1 --- 1 1 1 Смертность

19"! 1975 19"9 1983 198' 1991 1995 1999 2003 2007 2011

Год

|_г~

Рисунок 1. Динамика изменения заболеваемости и смертности от РМЖ в Великобритании; приведены данные из расчета встречаемости на 100000 человек

[4]

Крайне неблагоприятной оказывается ситуация в России: анализ тенденций

смертности от РМЖ в группе пациентов от 45 до 74 лет показывает, что в то

время как во многих западноевропейских странах отмечается устойчивое

снижение летальности РМЖ, в странах Восточной Европы, кроме Болгарии и

Румынии, - относительная стабилизация с признаками незначительного роста, в

России, впрочем, как и в Беларуси и на Украине, наблюдается

8

непрекращающийся рост смертности [5, 6]. Несмотря на многочисленные исследования в области разработки рациональных скрининговых программ по выявлению рака молочной железы на ранних этапах формирования, процентное соотношение пациентов с Ш-1У стадиями заболевания среди первичных больных РМЖ в России остается недопустимо высоким и составляет более 40% [6]. Таким образом, РМЖ становится одной из самых распространенных причин смертности среди женщин и наиболее часто диагностируемым у женщин видом рака как в России, так и во всем мире (в 140 и 184 стран) [6, 7].

Несмотря на глобальный характер этого заболевания многие аспекты этиологии и патогенеза рака молочной железы остаются неясными. Сложность изучения РМЖ обуславливается неоднородностью этой болезни, объединяющей группу гистологически и биохимически гетерогенных опухолей, различающихся по инвазивности, клиническому течению и чувствительности к различным терапевтическим методам [8-10].

Развитие рака молочной железы представляет собой многоэтапный процесс, подразумевающий постепенное накопление в клетках ряда генетических и эпигенетических нарушений, в конечном итоге приводящих к анаплазии, приобретению клетками способности к активной пролиферации, внедрению в окружающие ткани и формированию вторичных очагов опухолевого роста [11]. Существенные перестройки в фенотипе, метаболизме и ключевых внутриклеточных процессах, возникающие в ходе ракового перерождения, контролируются целым рядом сигнальных каскадов, приводящих к значительным изменениям транскриптома клетки за счет подавления и активации экспрессии многочисленных белков-мишеней [12, 13]. Непрерывно увеличивающийся объем данных свидетельствует о том, что развитие каждого из многочисленных типов опухолей характеризуется альтернативными сигнальными каскадами, в разной степени меняющими транскрипционный профиль клетки [14, 15]. В связи с этим большой интерес представляет поиск молекулярных маркеров, ассоциированных с процессами злокачественной трансформации. Одним из генов, принимающих

участие в процессе малигнизации клеток, является ген ШЪ.

9

RIL (reversion-induced LIM-domain containing), впоследствии получивший название PDLIM4, был впервые описан в 1995 году, как кандидат на роль онкосупрессора [16]. У человека ген PDLIM4/RIL локализован на 5-й хромосоме в области 5q31.1, часто делетируемой в ряду злокачественных заболеваний [17]. Помимо делеций, ген RIL может подвергаться эпигенетической супрессии, часто обнаруживаемой при злокачественной трансформации клеток [18-21]. Особую роль RIL может играть при развитии рака молочной железы (РМЖ): ряд данных косвенно указывает на корреляцию отдельных клинических параметров этого заболевания, таких как размер, плоидность или степень дифференцировки клеток, с нарушениями экспрессии RIL [21]. Несмотря на имеющиеся доказательства взаимосвязи данного гена с этим и другими типами рака, процессы развития опухолей, в которых он принимает участие остаются неизвестными. На изучение RIL-зависимых молекулярных механизмов формирования рака молочной железы и были направлены представленные исследования.

Цели и задачи исследования

Основной целью проводимого исследования было изучение роли PDLIM4/RIL в процессе развития рака молочной железы.

Поставленные задачи

1. Провести анализ уровня экспрессии RIL в клетках различных линий РМЖ.

2. Оценить влияние уровня экспрессии RIL на морфологические и функциональные особенности клеток опухолей молочной железы.

3. Провести оценку модели RIL-опосредованной инактивации тирозинкиназы с-Src в клетках различных линий РМЖ.

4. Получить панель линий РМЖ с искусственно подавленным и повышенным уровнем экспрессии RIL.

5. Провести анализ влияния подавления и повышения уровня экспрессии МЬ на изменение транскриптома клеток РМЖ.

6. Исследовать анализ взаимосвязи МЬ с моделью СБ-74 опосредованного развития РМЖ.

7. Проверить корреляцию уровня внутриклеточного МЬ с интенсивностью экспрессии маркеров стволовых клеток СБ44 и СБ47.

8. Оценить внутриклеточную локализацию МЬ в клетках различных линий РМЖ.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В работе проведен системный анализ участия МЬ в процессе развития рака молочной железы. Показана высокая гетерогенность линий РМЖ по уровню экспрессии МЬ. В ходе изучения теории МЬ-опосредованной инактивации тирозиновой киназы с-Бге проведена оценка корреляции уровня экспрессии МЬ с активностью с-Бге в клетках отдельных линий РМЖ. Получен ряд линий РМЖ с искусственно подавленной и повышенной экспрессией МЬ. Проведен анализ влияния нарушения уровня МЬ на изменение транскриптома клеток РМЖ. Выявлен ряд генов, демонстрирующих прямую и обратную корреляцию с уровнем экспрессии МЬ. Предложена и частично подтверждена модель взаимосвязи МЬ с СБ-74 опосредованной концепцией развития РМЖ, объясняющая взаимосвязь повышения уровня экспрессии МЬ с увеличением злокачественности клеток. Впервые обнаружена ядерная локализация МЬ в ряду линий РМЖ.

Степень достоверности и апробация диссертации

Достоверность представленных результатов обеспечена использованием в работе комплекса методических подходов: современных высокочувствительных

молекулярно-биологических, биохимических и иммунологических методов исследования, тщательным учетом и подробной оценкой результатов с использованием адекватных методов статистической обработки данных.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции Наука Будущего (20-23 сентября 2016, Казань), на XI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (16-19 марта 2016, Москва), на международной конференции Будущее Биомедицины (2-7 сентября, Владивосток) и совместном коллоквиуме Группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки и Лаборатории пролиферации клеток в Институте Молекулярной Биологии имени В.А.Энгельгардта (май 2017).

Публикации

По материалам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах, а также 3 публикации в материалах научных конференций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. D.S. Kravchenko, Y.N. Lezhnin, J.E. Kravchenko, S.P. Chumakov, E.I. Frolova. 2017. Studying interrelation of PDLIM4 with the model of CD74-mediated development of breast cancer. OnLine Journal of Biological Sciences 2017

2. D.S. Kravchenko, Y.N. Lezhnin, J.E. Kravchenko, S.P. Chumakov, E. I. Frolova. 2016. Study of Molecular Mechanisms of PDLIM4/RIL in Promotion of the Development of Breast Cancer. Biology and Medicine (Aligarh) 2016, 8(2): BM-175-16, 6 pages.

3. D.S. Kravchenko, E.I. Frolova, J.I. Kravchenko, S.P. Chumakov. 2016. Role of PDLIM4 and c-Src in Breast Cancer Progression. Molekuliarnaia biologiia 50(1):69-79, January 2016

4. D.S. Kravchenko, Y.N. Lezhnin, E.I. Frolova, 2015. Analysis of PDLIM4 Expression in Different Subtypes of Breast Cancer. Biosci Biotech Res Asia 2015;12(3)

5. Y.N. Lezhnin, А. Y. Khristenichenko, D.S. Kravchenko, J.E. Kravchenko, S.P. Chumakov, E.I. Frolova et al. 2016 Systematic Comparison of the Capability of Modified Nucleoside Triphosphates to Act as a Substrate for Thermostable DNA Polymerases during PCR. Biol Med (Aligarh) 8(1): BM-164-16, 5 pages.

6. Kravchenko Y. E, Chumakov S. P, Frolova E. I, Lezhnin Y. N, Kravchenko D. S. Lentivirus-Based System for Fast Expression and Purification of Recombinant Proteins and its Implementation for Production of Human CD44 Extracellular Part. Biosci Biotechnol Res Asia 2015;12(3)

Тезисы докладов на конференциях

1. Kravchenko D.S., 2016. The role of PDLIM4/RIL gene in the development of breast cancer. International scientific conference Science of the future, 20-23 September 2016, Kazan, Russia

2. Грошева А.И., Кравченко Д. С. 2016. Изучение роли гена PDLIM4/RIL в развитии рака молочной железы. XI Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых, 16-19 марта 2016, Москва, Россия

3. Kravchenko D.S., Kravchenko Y.E., Chumakov S.P., Cumakov P.M., 2015. The role of PDLIM4/RIL gene in the development of breast cancer. Future of Biomedicine Conference 2015, 2-7 September 2015, Vladivostok, Russia

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ген RIL

Белок Я1Ь, также известный как РЭЬ1М4, кодируется эволюционно консервативным одноименным геном, у человека локализованным на пятой хромосоме в области 5д31.1.

Рисунок 2. Схема геномной и хромосомной локализации гена RIL

Изучение RIL началось в 1995 году, когда в ходе поиска генов, ответственных за поддержание нормального (неопухолевого) роста клеток методом вычитающего клонирования были идентифицированы гены, экспрессия которых оказывалась подавленной в H-ras трансформированных фибробластах крысы по сравнению с их фенотипическими ревертантами, а также с исходной клеточной линией. Неизвестный ранее ген, кодирующей LIM-домен-содержащий белок, получил название RIL (от reversion-induced LIM gene).

1.2. RIL как представитель PDZ/LIM-доменных белков

RIL входит в состав семейства ALP/Enigma, которое, в свою очередь, подразделяется на подсемейства ALP (RIL, ALP, Clp-36/Elfin и Mystique) и Enigma (включает Enigma/LMP, Enigma Homolog и Cypher/Zasp). Оба подсемейства объединяет сходство доменной организации: белки APL (от а-actinin associated LIM protein) млекопитающих характеризуются присутствием одного амино-концевого PDZ-домена и одного LIM-домена на карбоксильном конце; в состав белков Enigma входят один PDZ и три LIM-домена на N- и С-концах, соответственно [22].

Филогенетический анализ семейства ALP/Enigma свидетельствует об эволюционном родстве ALP и Enigma подгрупп [22, 23]. Гипотетической предковой формой, впоследствии положившей начало обоим подсемействам, был ген, напоминающий ген eat-1, обнаруживаемый у свободноживущей нематоды (Caenorhabditis elegans) или же ген tungus дрозофилы обыкновенной (Drosophila melanogaster). Указанные гены имеют сходную организацию, кодируя одни PDZ-домен и четыре LIM-домена (см. рисунок 3) [22]. Филогенетический анализ позволяет прийти к выводу, что в ходе эволюции предковый ген претерпел ряд мутаций, которые способствовали утрате экзонов, кодирующих либо первый LIM-домен, либо три последних, что, в свою очередь, привело к возникновению подсемейств Enigma и ALP, соответственно [24]. Дополнительным подтверждением этой теории служит попарное распределение генов подсемейств ALP и Enigma на хромосомах: ALP картируется в локусе 4q35 недалеко от ENH (4q22), CLP-36 (10q22-26.3) рядом с Cypher/ZASP (10q22.3-23.4), а RIL (5q31.1) локализован на 5-й хромосоме вместе с Enigma (5q35.3) [25]. Подсемейство Enigma, однако, эволюционно возникло несколько раньше и обнаруживается уже у хордовых, в то время как гены подсемейства Alp описаны только у позвоночных [24].

Fungi Plants

Metazoa

Chordata

3

с

ju к

0 <y to .bo

15

1 s

s3 ==

5)

S Si

a

¿5 ^

I

a

I

"a с

IS II

•с к

a «J ^ <J

ь

CO

I

г .3

Vertebrata

u S

s -5 5

§> e

5 J

I t

^

о о

c Л

ч; Q

to s —.

2 s

a

a. £

a г

I .60

e b

a &>

to <

а .2

^ S

•2 §

5

t to

г

I §

а as

S.

«4

•a g

to 3

S

й a

to

Ï О

S

о

■ — ■ — sj а

GG Q^O^

LM07

LM07

ALP, ELF, MYS, RIL

EN, ENH, ZASP

EAT-1, TUNGUS LIMK

1 1

1 1

1 1

1 1

2 2

1 1

11111

5 4 4 4 4

3 3 3 3 3

2 2 2 2 2

Рисунок 3. Доменная организация и встречаемость PDZ/LIM генов у представителей различных таксономических групп; синим цветом обозначены PDZ-домены, желтым - LIM, черным и красным - киназный и калпонин-гомологичный домены, соответственно [24]

Стоит отметить, что объединение PDZ и LIM-доменов в одном белке оказывается характерно не только для членов семейства ALP/Enigma, но и для LIM-киназ (показаны на рисунке 3), а также для белка LMO7 (LIM domain only protein 7). Наблюдаемый феномен является результатом конвергенции и, несомненно, должен иметь важное функционально значение, обеспечивая многочисленные функции PDZ/LIM-доменных белков [26].

1.2.1 Особенности PDZ-доменов и PDZ-доменных белков

РБ7-домены представляют собой высококонсервативные структуры из 80100 аминокислот, формирующих 6 антипараллельных в-складок и две а-спирали, свернутые в глобулу (структура показа на Рисунке 4).

Рисунок 4. Схема строения PDZ-домена белка PSD-95 [27]

Первоначально PDZ-домен был идентифицирован в результате анализа сходных структурных мотивов трех белков: белка постсинаптической плотности PSD95/SAP90, опухолевого супрессора дрозофилы discs large DlgA и белка, участвующего в поддержании клеточной полярности zonula occludens ZO-1; название домена представляет собой акроним, образованный первыми буквами названий этих белков. Обнаруживаемые у бактерий, дрожжей, растений и представителей царства животных, PDZ-домены служат наиболее распространенным типом структурных мотивов, обеспечивающих межбелковые взаимодействия [28].

Спектр взаимодействий PDZ-доменов достаточно широк: они способны связываться со спектрин-подобными мотивами, анкириновыми повторами, LIM-доменами и фосфолипидами [29]. Наиболее распространенным лигандом для PDZ-доменов служат короткие пептидные мотивы, имеющие на конце карбоксильную группу или же стабилизированные в-поворотом [30]. Наличие подобных структур в составе некоторых PDZ-доменных белков обеспечивает возможность их гетеро- и олигомеризации [31].

Широкий спектр взаимодействий PDZ-доменов позволяет PDZ-белкам

выступать в роли скаффолд-адаптеров, обеспечивающих формирование

мультикомпонентных комплексов, включающих белки, связанные с мембраной

17

клетки, цитоплазматические сигнальные молекулы и белки цитоскелета [30]. Способность взаимодействовать с а-актинином, паладином и ß-тропомиозином позволяет PDZ-белкам также обеспечивать колокализацию цитоплазматических белков с цитоскелетом, способствуя поддержанию архитектуры клетки [32].

1.2.2. Особенности LIM-доменов и LIM-доменных белков

LIM-домен (аббревиатура образована из первых букв названий белков lin-11, Isl-1 и mec-3, в составе которых он был впервые обнаружен) представляет собой высококонсервативную последовательность примерно из 55 аминокислотных остатков (консенсусная последовательность - C-X2-C-X16-23-H-X2C-X2-C-X2-C-Xi6- 2iC-X2-(C/H/D), где X - любая аминокислота), включающую в себя особым образом локализованные остатки цистеина и гистидина, определяющие связывание двух ионов цинка и формирование двух тандемно расположенных цинковых пальцев [33, 34].

LIM домен 1 LIM домен 2

Рисунок 5. Схема организации LIM-доменов [33]

Подобно PDZ-доменам, LIM-домены обычно выступают в роли

связывающих модулей, вовлеченных в формирование мультибелковых

комплексов у представителей различных таксономических групп от бактерий и

дрожжей до животных [34]. Несмотря на общее сходство организации доменов

этого типа, аминокислотный состав и длина формирующих их

18

последовательностей может варьировать, что позволяет различным LIM-доменам в составе одного белка с высокой специфичностью взаимодействовать с альтернативными лигандами. Эта особенность дает возможность LIM-доменным белкам участвовать в формировании сложных мультибелковых комплексов и играть важную роль в разноплановых биологических процессах [34].

Спектр функций LIM-доменных белков очень широк: они принимают участие в поддержании структуры и динамики актиновых филаментов, развитии нервной системы, контроле интегрин-зависимой адгезии и подвижности клеток, регуляции тканеспецифичной экспрессии генов, внутриклеточном сигналинге, процессах дифференцировки клеток на ранних этапах эмбриогенеза, в развитии рака и метастазировании [35]. Одной из особенностей LIM-доменных белков является их способность модулировать активность белков-мишеней, различные алгоритмы воздействия на которые показаны на Рисунке 6.

Рисунок 6. Варианты ЫМ-опосредованной модуляции активности белков;

а - способность ЫМ-доменных белков выступать в роли скаффолд-адаптеров, организующих взаимодействие нескольких белков-партнеров, приводящее к их активации; б - изменение активности белков-мишеней за счет их конкурентного вытеснения из комплексов с другими белками; в - изменение пространственной конфигурации белка, приводящее к его активации/инактивации; г - способность

LIM белков изменять внутриклеточную локализацию белков партнеров, тем самым способствуя/препятствуя выполнению ими своих функций [33]

Одной из наименее изученной функций LIM-доменных белков является их способность к перемещению между компартментами клетки [33]. Среди LIM белков, ассоциированных с цитоскелетом и первоначально описанных в качестве цитоплазматических молекул, многие, к примеру, зиксин, FHL, CRP или ряд членов ALP семейства впоследствии были обнаружены в ядре клетки [22, 33]. В то время как в составе некоторых из них, к примеру зиксина или FHL2, были обнаружены сигналы ядерного экспорта и импорта, механизмы перемещения остальных оказываются до сих пор не изученными.

Хорошо известно, что внутриклеточная локализация белка во многом определяет его функционирование. Было показано, что LIM белки способны изменять локализацию своих партнеров, транспортируя их в различные компартменты клетки. Способность LIM белков перемещаться между ядром и цитоплазмой позволяет им, в частности, контролировать активность факторов транскрипции и принимать участие в механизмах регуляции экспрессии генов. Двойная локализация LIM белков позволяет также осуществлять контроль их собственной активности: белки, выполняющие роль ядерных факторов, могут быть инактивированы перемещением в цитоплазму, в то время как внутриядерный транспорт цитоплазматических LIM-доменных белков позволяет изолировать их от цитоплазматических мишеней [22, 33].

1.3. Репертуар взаимодействий белка RIL

Начало функциональному изучению RIL было положено с момента выявления его взаимодействия с протеинтирозинфосфатазой мыши PTP-BL. Было показано, что С-концевой участок RIL способен связываться с PDZ-доменом PTP-BL; в стабилизации образующегося комплекса также оказался задействован LIM-домен RIL. В ходе проведенного исследования была показана возможность in vitro и in vivo фосфорилирования LIM-домена RIL по остатку тирозина У274 и его

in vitro дефосфорилирования фосфатазным доменом PTP-BL [36, 37]. Полученные данные в дальнейшем легли в основу концепции RIL-зависимой инактивации с-Src, в рамках которой RIL, взаимодействуя с протеинфосфатазой PTP-BL человека, способствует дефосфорилированию с-Src и переходу ее в неактивное состояние (более подробно этот процесс описан в следующих разделах) [38].

Следующим идентифицированным белком, ассоциированным с RIL, оказался TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6) - 476-аминокислотный белок из семейства зиксина. Было установлено, что взаимодействие происходит между PDZ-доменом RIL и LIM-доменами TRIP. Интересно, что также, как и RIL, TRIP способен взаимодействовать с PTP-BL фосфатазой: в клетках линии A431 для всех трех белков даже была показана колокализация в субмембранной области, богатой фибриллярным актином [37, 39].

Важным результатом исследования взаимодействия RIL и TRIP6 стало обнаружение возможности гомодимеризации RIL. Было показано, что аналогично связыванию LIM-домена TRIP6, PDZ-домен RIL способен взаимодействовать с собственным LIM-доменом [37].

Наиболее хорошо изученной функцией RIL является его участие в регуляции структуры и динамики актинового цитоскелета. Аналогично другим представителям семейства ALP/Enigma, к примеру, белкам ALP и CLP-36, RIL посредством своего PDZ-домена может взаимодействовать с а-актинином, тем самым облегчая его связывание с актиновыми филаментами. Взаимодействие с а-актинином позволяет RIL принимать участие в таких процессах как стабилизация Z-дисков поперечнополосатых мышц, поддержание структуры фокальных контактов, а также формирование актиновых стресс-фибрилл [40, 41].

Еще одной функцией RIL, связанной с а-актинином, является его участие в транспорте и правильной локализации AMPA-рецепторов в нейронах мозга. АМРА-рецептор — ионотропный рецептор глутамата, который передаёт быстрые

возбуждающие сигналы в синапсах нервной системы позвоночных [42]. Одна из субъединиц глутаматного рецептора 01иЯ-Л может взаимодействовать с Ь1М-доменом МЬ, который, взаимодействуя с а-актинином посредством РБ7-домена, обеспечивает заякоривание рецепторов на мембране клетки. Было установлено, что гиперэкспрессия этого белка в нейронах первичной культуры гиппокампа приводит к значительному обогащению глутаматных рецепторов в области синапсов и усилению ЛМРЛ-зависимых синаптических токов [43].

1.4. Взаимосвязь ШЬ с процессами злокачественной трансформации клеток

С момента идентификации гена МЬ в качестве потенциального онкосупрессора в 1995 году был накоплен ряд данных, свидетельствующих о нарушениях его экспрессии на генетическом и эпигенетическом уровнях в опухолях различных типов [17, 19-21]. Особую роль МЬ может играть при развитии рака молочной железы: ряд данных косвенно указывает на корреляцию некоторых клинических параметров этого заболевания, таких как размер, плоидность или степень дифференцировки клеток, с нарушениями экспрессии МЬ. Несмотря на имеющиеся доказательства взаимосвязи нарушений экспрессии данного гена с этим и другими типами рака, механизмы развития опухолей, в которых принимает участие МЬ, остаются неизвестными.

На начальном этапе исследования участия МЬ в процессах канцерогенеза представлялось возможным проанализировать имеющиеся на сегодняшний день данные о взаимосвязи нарушений экспрессии МЬ с клиническими параметрами РМЖ, такими как статус гормональных рецепторов, тип опухоли, индекс плоидности, количество клеток в Б-фазе и других.

1.4.1. Корреляция уровня экспрессии ШЬ со статусом рецепторов

прогестерона и эстрогена

Статус ЕЯ используется в клинической практике с 1970-х годов как для предсказания реакции РМЖ на гормональную терапию, так и для оценки вероятности рецидива и составления долгосрочного прогноза развития заболевания. Приблизительно 80% опухолей молочной железы оказываются ЕЯ-положительными [44].

Экспрессия гена рецептора прогестерона регулируется уровнем эстрогена, таким образом, его уровень используется в качестве индикатора нормального функционирования эстроген-зависимых сигнальных каскадов. Приблизительно 40% ЕЯ-положительных опухолей являются РЯ-негативными.

Информация о наличии рецепторов прогестерона и эстрогена в клетках опухоли является важнейшим фактором, определяющим чувствительность рака к эндокринной терапии. Ее целью является предотвращение связывания эстрогена и прогестерона, стимулирующих прогрессию роста опухоли, с их рецепторами. Этот эффект может достигаться при помощи препаратов, избирательно блокирующих гормональные рецепторы и препятствующих связыванию с ними гормонов (тамоксифен) или же благодаря понижению уровня гормонов в тканях (ингибиторы ароматазы) [45].

На изучение корреляции уровня метилирования гена Я1Ь со статусом рецепторов прогестерона и эстрогена был направлен ряд исследований, посвященных молекулярным механизмам развития РМЖ [19, 21, 46]. В большинстве проведенных работ подобная корреляция прослеживается: повышенный уровень метилирования Я1Ь оказывается сопряжен с утратой гормональных рецепторов, и наоборот, в рецептор-положительных типах опухолей, в среднем, наблюдался более низкий уровень метилирования Я1Ь [19, 21, 46]. Эти данные позволяют предположить, что метилирование гена Я1Ь будет более характерно для трижды негативных (базальноподобного и клаудин-дефицитного) и НБЯ2-положительных подтипов РМЖ, нежели для люминальных

23

А и В подтипов. Дать более точную оценку корреляции субтипа опухоли с уровнем экспрессии Я1Ь сложно, так как на сегодняшний день не выявлено взаимосвязи уровня метилирования МЬ с экспрессией ИБК2 - третьего основного классификационного биомаркера.

1.4.2. Корреляция уровня экспрессии ШЬ со степенью

дифференцировки клеток опухоли

Еще одной характеристикой опухоли служит процент ее клеток, находящихся в Б-фазе клеточного цикла. Количество клеток в Б-фазе коррелирует со скоростью роста опухоли: чем больше таких клеток, тем быстрее они делятся, и тем интенсивнее, соответственно, растет и развивается опухоль. Высокий процент клеток в Б-фазе часто оказывается ассоциирован с такими параметрами как большой размер опухоли, вероятное поражение лимфатических узлов, невысокая степень дифференцировки клеток и отсутствие стероидных рецепторов опухоли [47, 48]. По данным ряда авторов, процент клеток в Б-фазе клеточного цикла является прогностическим фактором для общей и безрецидивной выживаемости, уступающим по значимости только статусу лимфатических узлов [49, 50]. Большинство авторов считают высокий процент клеток опухоли в Б-фазе достоверным фактором плохого прогноза, существенно снижающим выживаемость пациентов [47, 48, 50-52].

Было показано, что количество клеток опухоли в Б-фазе коррелирует с уровнем метилирования МЬ: пониженный уровень метилирования МЬ был обнаружен в опухолях с невысоким содержанием клеток в Б-фазе клеточного цикла [21]. Эти данные согласуются с исследованиями по корреляции экспрессии МЬ со степенью дифференцировки клеток опухолей - уровень метилирования МЬ был повышен в слабодифференцированных опухолях [19]. Таким образом, можно предположить, что низкий уровень метилирования ЯТЬ будет

соответствовать медленно растущим опухолям молочной железы и коррелировать с более благоприятным прогнозом.

Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная биология», 03.01.03 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кравченко Дмитрий Сергеевич, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. DeSantis, С., et al., Breast cancer statistics, 2013. CA Cancer J Clin, 2014. 64(1): p. 52-62.

2. DeSantis, C.E., et al., Breast cancer statistics, 2015: Convergence of incidence rates between black and white women. CA Cancer J Clin, 2016. 66(1): p. 31-42.

3. Breast cancer by the numbers. P T, 2014. 39(3): p. 213-4.

4. Quinn, M. and E. Allen, Changes in incidence of and mortality from breast cancer in England and Wales since introduction of screening. United Kingdom Association of Cancer Registries. BMJ, 1995. 311(7017): p. 13915.

5. М.И. Давыдова, Е.М.А., Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2014. 19(2).

6. Е.А. Кваша, Т.Л.Х., Статистико-демографический анализ смертности от рака молочной железы в России. Вопросы статистики, 2006. 8: p. 25-33.

7. Bray, F., et al., Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008. Int J Cancer, 2013. 132(5): p. 1133-45.

8. Polyak, K., Heterogeneity in breast cancer. J Clin Invest, 2011. 121(10): p. 3786-8.

9. Ellsworth, R.E., et al., Molecular heterogeneity in breast cancer: State of the science and implications for patient care. Semin Cell Dev Biol, 2017. 64: p. 65-72.

10. Beca, F. and K. Polyak, Intratumor Heterogeneity in Breast Cancer. Adv Exp Med Biol, 2016. 882: p. 169-89.

11. Stratton, M.R., P.J. Campbell, and P.A. Futreal, The cancer genome. Nature, 2009. 458(7239): p. 719-24.

12. Engin, H.B., J.F. Kreisberg, and H. Carter, Structure-Based Analysis Reveals Cancer Missense Mutations Target Protein Interaction Interfaces. PLoS One, 2016. 11(4): p. e0152929.

13. Zhu, P., et al., Identification of Potential Drug Targets in Cancer Signaling Pathways using Stochastic Logical Models. Sci Rep, 2016. 6: p. 23078.

14. Inic, Z., et al., Difference between Luminal A and Luminal B Subtypes According to Ki-67, Tumor Size, and Progesterone Receptor Negativity Providing Prognostic Information. Clin Med Insights Oncol, 2014. 8: p. 107-11.

15. Lin, A., et al., The LINK-A lncRNA activates normoxic HIFlalpha signalling in triple-negative breast cancer. Nat Cell Biol, 2016. 18(2): p. 213-24.

16. Kiess, M., et al., Expression of ril, a novel LIM domain gene, is down-regulated in Hras-transformed cells and restored in phenotypic revertants. Oncogene, 1995. 10(1): p. 61-8.

17. Bashirova, A.A., et al., The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts. Gene, 1998. 210(2): p. 239-45.

18. Boumber, Y.A., et al., RIL, a LIM gene on 5q31, is silenced by methylation in cancer and sensitizes cancer cells to apoptosis. Cancer Res, 2007. 67(5): p. 1997-2005.

19. Feng, W., et al., Tumor suppressor genes are frequently methylated in lymph node metastases of breast cancers. BMC Cancer, 2010. 10: p. 378.

20. Vanaja, D.K., et al., PDLIM4 repression by hypermethylation as a potential biomarker for prostate cancer. Clin Cancer Res, 2006. 12(4): p. 1128-36.

21. Xu, J., et al., Methylation of HIN-1, RASSF1A, RIL and CDH13 in breast

cancer is associated with clinical characteristics, but only RASSF1A

methylation is associated with outcome. BMC Cancer, 2012. 12: p. 243.

102

22. Krcmery, J., et al., Nucleocytoplasmic functions of the PDZ-LIM protein family: new insights into organ development. Bioessays, 2010. 32(2): p. 1008.

23. Koch, B.J., J.F. Ryan, and A.D. Baxevanis, The diversification of the LIM superclass at the base of the metazoa increased subcellular complexity and promoted multicellular specialization. PLoS One, 2012. 7(3): p. e33261.

24. Te Velthuis, A.J., et al., Insights into the molecular evolution of the PDZ/LIM family and identification of a novel conserved protein motif. PLoS One, 2007. 2(2): p. e189.

25. McKeown, C.R., H.F. Han, and M.C. Beckerle, Molecular characterization of the Caenorhabditis elegans ALP/Enigma gene alp-1. Dev Dyn, 2006. 235(2): p. 530-8.

26. Dias, K., et al., Claudin-Low Breast Cancer; Clinical & Pathological Characteristics. PLoS One, 2017. 12(1): p. e0168669.

27. Doyle, D.A., et al., Crystal structures of a complexed and peptide-free membrane protein-binding domain: molecular basis of peptide recognition by PDZ. Cell, 1996. 85(7): p. 1067-76.

28. Jelen, F., et al., PDZ domains - common players in the cell signaling. Acta Biochim Pol, 2003. 50(4): p. 985-1017.

29. Lee, H.J. and J.J. Zheng, PDZ domains and their binding partners: structure, specificity, and modification. Cell Commun Signal, 2010. 8: p. 8.

30. Giallourakis, C., et al., A molecular-properties-based approach to understanding PDZ domain proteins and PDZ ligands. Genome Res, 2006. 16(8): p. 1056-72.

31. Kedlaya, R.H., et al., TRP1 interacting PDZ-domain protein GIPC forms oligomers and is localized to intracellular vesicles in human melanocytes. Arch Biochem Biophys, 2006. 454(2): p. 160-9.

32. Romero, G., M. von Zastrow, and P.A. Friedman, Role of PDZ proteins in regulating trafficking, signaling, and function of GPCRs: means, motif, and opportunity. Adv Pharmacol, 2011. 62: p. 279-314.

103

33. Kadrmas, J.L. and M.C. Beckerle, The LIM domain: from the cytoskeleton to the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004. 5(11): p. 920-31.

34. Khurana, T., B. Khurana, and A.A. Noegel, LIM proteins: association with the actin cytoskeleton. Protoplasma, 2002. 219(1-2): p. 1-12.

35. Matthews, J.M., et al., LIM-domain-only proteins in cancer. Nat Rev Cancer, 2013. 13(2): p. 111-22.

36. Cuppen, E., et al., PDZ motifs in PTP-BL and RIL bind to internal protein segments in the LIM domain protein RIL. Mol Biol Cell, 1998. 9(3): p. 67183.

37. Cuppen, E., et al., The zyxin-related protein TRIP6 interacts with PDZ motifs in the adaptor protein RIL and the protein tyrosine phosphatase PTP-BL. Eur J Cell Biol, 2000. 79(4): p. 283-93.

38. Zhang, Y., et al., Reversion-induced LIM interaction with Src reveals a novel Src inactivation cycle. J Cell Biol, 2009. 184(6): p. 785-92.

39. Gur'ianova, O.A., et al., [Down-regulation of TRIP6 expression induces actin cytoskeleton rearrangements in human carcinoma cell lines]. Mol Biol (Mosk), 2005. 39(5): p. 905-9.

40. Vallenius, T., K. Luukko, and T.P. Makela, CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4. J Biol Chem, 2000. 275(15): p. 11100-5.

41. Pomies, P., T. Macalma, and M.C. Beckerle, Purification and characterization of an alpha-actinin-binding PDZ-LIM protein that is up-regulated during muscle differentiation. J Biol Chem, 1999. 274(41): p. 29242-50.

42. Henley, J.M. and K.A. Wilkinson, AMPA receptor trafficking and the mechanisms underlying synaptic plasticity and cognitive aging. Dialogues Clin Neurosci, 2013. 15(1): p. 11-27.

43. Schulz, T.W., et al., Actin/alpha-actinin-dependent transport of AMPA receptors in dendritic spines: role of the PDZ-LIM protein RIL. J Neurosci, 2004. 24(39): p. 8584-94.

44. Vuong, D., et al., Molecular classification of breast cancer. Virchows Arch, 2014. 465(1): p. 1-14.

45. Burstein, H.J., et al., Adjuvant endocrine therapy for women with hormone receptor-positive breast cancer: american society of clinical oncology clinical practice guideline focused update. J Clin Oncol, 2014. 32(21): p. 2255-69.

46. Feng, W., et al., Correlation between CpG methylation profiles and hormone receptor status in breast cancers. Breast Cancer Res, 2007. 9(4): p. R57.

47. Ermiah, E., et al., Prognostic value of proliferation markers: immunohistochemical ki-67 expression and cytometric s-phase fraction of women with breast cancer in libya. J Cancer, 2012. 3: p. 421-31.

48. Wenger, C.R. and G.M. Clark, S-phase fraction and breast cancer--a decade of experience. Breast Cancer Res Treat, 1998. 51(3): p. 255-65.

49. Largillier, R., et al., Prognostic factors in 1,038 women with metastatic breast cancer. Ann Oncol, 2008. 19(12): p. 2012-9.

50. Camplejohn, R.S., et al., The prognostic significance of DNA flow cytometry in breast cancer: results from 881 patients treated in a single centre. Br J Cancer, 1995. 71(1): p. 140-5.

51. Портной С.М., Рак молочной железы (факторы прогноза и лечение). 1997(Автореферат диссертации).

52. Clark, G.M., et al., Prognostic significance of S-phase fraction in good-risk, node-negative breast cancer patients. J Clin Oncol, 1992. 10(3): p. 428-32.

53. Holland, A.J. and D.W. Cleveland, Losing balance: the origin and impact of aneuploidy in cancer. EMBO Rep, 2012. 13(6): p. 501-14.

54. Giam, M. and G. Rancati, Aneuploidy and chromosomal instability in cancer: a jackpot to chaos. Cell Div, 2015. 10: p. 3.

55. van Jaarsveld, R.H. and G. Kops, Difference Makers: Chromosomal Instability versus Aneuploidy in Cancer. Trends Cancer, 2016. 2(10): p. 561571.

56. Cornelisse, C.J., et al., DNA ploidy and survival in breast cancer patients. Cytometry, 1987. 8(2): p. 225-34.

57. Tsuchiya, A., et al., The relationship of estrogen receptor status to DNA ploidy in breast cancer. Surg Today, 1992. 22(2): p. 105-9.

58. Wei, J.T., et al., Clinicopathological features and prognostic factors of young breast cancers in Eastern Guangdong of China. Sci Rep, 2014. 4: p. 5360.

59. Anders, C.K., et al., Breast cancer before age 40 years. Semin Oncol, 2009. 36(3): p. 237-49.

60. Chia, K.S., et al., Do younger female breast cancer patients have a poorer prognosis? Results from a population-based survival analysis. Int J Cancer, 2004. 108(5): p. 761-5.

61. Deng, J., et al., The survival decrease in gastric cancer is associated with the methylation of B-cell CLL/lymphoma 6 member B promoter. Open Biol, 2014. 4(7).

62. Zhuang, J., et al., The dynamics and prognostic potential of DNA methylation changes at stem cell gene loci in women's cancer. PLoS Genet, 2012. 8(2): p. e1002517.

63. Chang, J.C., Cancer stem cells: Role in tumor growth, recurrence, metastasis, and treatment resistance. Medicine (Baltimore), 2016. 95(1 Suppl 1): p. S20-5.

64. Toh, T.B., J.J. Lim, and E.K. Chow, Epigenetics in cancer stem cells. Mol Cancer, 2017. 16(1): p. 29.

65. Yoo, Y.D. and Y.T. Kwon, Molecular mechanisms controlling asymmetric and symmetric self-renewal of cancer stem cells. J Anal Sci Technol, 2015. 6(1): p. 28.

66. Kreso, A. and J.E. Dick, Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell, 2014. 14(3): p. 275-91.

67. Ishiwata, T., Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition:

Novel therapeutic targets for cancer. Pathol Int, 2016. 66(11): p. 601-608.

106

68. Wang, S.S., et al., Links between cancer stem cells and epithelialmesenchymal transition. Onco Targets Ther, 2015. 8: p. 2973-80.

69. Liu, S., et al., Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports, 2014. 2(1): p. 78-91.

70. Prat, A., et al., Phenotypic and molecular characterization of the claudin-low intrinsic subtype of breast cancer. Breast Cancer Res, 2010. 12(5): p. R68.

71. Malhotra, G.K., et al., Histological, molecular and functional subtypes of breast cancers. Cancer Biol Ther, 2010. 10(10): p. 955-60.

72. Prat, A. and C.M. Perou, Mammary development meets cancer genomics. Nat Med, 2009. 15(8): p. 842-4.

73. Pareja, F., et al., Triple-negative breast cancer: the importance of molecular and histologic subtyping, and recognition of low-grade variants. NPJ Breast Cancer, 2016. 2: p. 16036.

74. Yen, T.Y., et al., Glycoproteins in Claudin-Low Breast Cancer Cell Lines Have a Unique Expression Profile. J Proteome Res, 2017. 16(4): p. 13911400.

75. Eroles, P., et al., Molecular biology in breast cancer: intrinsic subtypes and signaling pathways. Cancer Treat Rev, 2012. 38(6): p. 698-707.

76. Thomas, V.T., S. Hinson, and K. Konduri, Epithelial-mesenchymal transition in pulmonary carcinosarcoma: case report and literature review. Ther Adv Med Oncol, 2012. 4(1): p. 31-7.

77. Wu, Y., M. Sarkissyan, and J.V. Vadgama, Epithelial-Mesenchymal Transition and Breast Cancer. J Clin Med, 2016. 5(2).

78. Heerboth, S., et al., EMT and tumor metastasis. Clin Transl Med, 2015. 4: p. 6.

79. Palma Cde, S., et al., Proteomic Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) Reveals Cross-talk between SNAIL and HDAC1 Proteins in Breast Cancer Cells. Mol Cell Proteomics, 2016. 15(3): p. 906-17.

107

80. Neve, R.M., et al., A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell, 2006. 10(6): p. 515-27.

81. Amata, I., M. Maffei, and M. Pons, Phosphorylation of unique domains of Src family kinases. Front Genet, 2014. 5: p. 181.

82. Roskoski, R., Jr., Src kinase regulation by phosphorylation and dephosphorylation. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 331(1): p. 1-14.

83. Formisano, L., et al., Epidermal growth factor-receptor activation modulates Src-dependent resistance to lapatinib in breast cancer models. Breast Cancer Res, 2014. 16(3): p. R45.

84. Shukla, D., et al., Activation pathway of Src kinase reveals intermediate states as targets for drug design. Nat Commun, 2014. 5: p. 3397.

85. Yeatman, T.J., A renaissance for SRC. Nat Rev Cancer, 2004. 4(6): p. 47080.

86. Okada, M., Regulation of the SRC family kinases by Csk. Int J Biol Sci, 2012. 8(10): p. 1385-97.

87. Glondu-Lassis, M., et al., PTPL1/PTPN13 regulates breast cancer cell aggressiveness through direct inactivation of Src kinase. Cancer Res, 2010. 70(12): p. 5116-26.

88. Elsberger, B., et al., Is expression or activation of Src kinase associated with cancer-specific survival in ER-, PR- and HER2-negative breast cancer patients? Am J Pathol, 2009. 175(4): p. 1389-97.

89. Kanomata, N., et al., Clinicopathological significance of Y416Src and Y527Src expression in breast cancer. J Clin Pathol, 2011. 64(7): p. 578-86.

90. Ito, Y., et al., Activation of c-Src is inversely correlated with biological aggressiveness of breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat, 2002. 76(3): p. 261-7.

91. Wilson, G.R., et al., Activated c-SRC in ductal carcinoma in situ correlates with high tumour grade, high proliferation and HER2 positivity. Br J Cancer, 2006. 95(10): p. 1410-4.

92. Fincham, V.J., et al., Translocation of Src kinase to the cell periphery is mediated by the actin cytoskeleton under the control of the Rho family of small Gproteins. J Cell Biol, 1996. 135(6 Pt 1): p. 1551-64.

93. Sabatier, R., et al., Claudin-low breast cancers: clinical, pathological, molecular and prognostic characterization. Mol Cancer, 2014. 13(1): p. 228.

94. Tryfonopoulos, D., et al., Src: a potential target for the treatment of triple-negative breast cancer. Ann Oncol, 2011. 22(10): p. 2234-40.

95. Guryanova, O.A., et al., Actin cytoskeleton remodeling by the alternatively spliced isoform of PDLIM4/RIL protein. J Biol Chem, 2011. 286(30): p. 26849-59.

96. Roggenbuck, B., et al., Human papillomavirus type 18 E6*, E6, and E7 protein synthesis in cell-free translation systems and comparison of E6 and E7 in vitro translation products to proteins immunoprecipitated from human epithelial cells. J Virol, 1991. 65(9): p. 5068-72.

97. Vanaja, D.K., et al., PDLIM4, an actin binding protein, suppresses prostate cancer cell growth. Cancer Invest, 2009. 27(3): p. 264-72.

98. Morris, M.R., et al., Identification of candidate tumour suppressor genes frequently methylated in renal cell carcinoma. Oncogene, 2010. 29(14): p. 2104-17.

99. Chiang, G.G. and B.M. Sefton, Phosphorylation of a Src kinase at the autophosphorylation site in the absence of Src kinase activity. J Biol Chem, 2000. 275(9): p. 6055-8.

100. Jeffrey D Bjorge, A.J., Donald J Fujita, Selected glimpses into the activation and function of Src kinase. Oncogene, 2000. 19(49): p. 5620-5635.

101. Badve, S., et al., Expression of invariant chain (CD 74) and major histocompatibility complex (MHC) class II antigens in the human fetus. J Histochem Cytochem, 2002. 50(4): p. 473-82.

102. Borghese, F. and F.I. Clanchy, CD74: an emerging opportunity as a therapeutic target in cancer and autoimmune disease. Expert Opin Ther Targets, 2011. 15(3): p. 237-51.

103. Wang, Z.Q., et al., CD74 and intratumoral immune response in breast cancer. Oncotarget, 2017. 8(8): p. 12664-12674.

104. Tian, B., et al., CD74: a potential novel target for triple-negative breast cancer. Tumour Biol, 2012. 33(6): p. 2273-7.

105. Metodieva, G., et al., CD74-dependent deregulation of the tumor suppressor scribble in human epithelial and breast cancer cells. Neoplasia, 2013. 15(6): p. 660-8.

106. MIF family cytokines in innate immunity and homeostasis. 1st edition. ed. pages cm.

107. Yamben, I.F., et al., Scrib is required for epithelial cell identity and prevents epithelial to mesenchymal transition in the mouse. Dev Biol, 2013. 384(1): p. 41-52.

108. Kravchenko D.S., L., Y.N., Kravchenko, J.E., Chumakov, S.P. and Frolova, E.I, Study of Molecular Mechanisms of PDLIM4/RIL in Promotion of the Development of Breast Cancer. Biol Med (Aligarh), 2016. 8(2): p. 2.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.