Онкосупрессорные свойства SCP фосфатаз при немелкоклеточном раке лёгкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Пузанов Григорий Андреевич

• Пузанов Григорий Андреевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Пузанов Григорий Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функции белков CTDSP1, CTDSP2, CTDSPL в клетках человека

1.1.1. Аминокислотные последовательности фосфатаз CTDSPL/1/2

1.1.2. Механизм действия SCP фосфатаз

1.1.3. Фосфорилирование ^концевого домена РНК-полимеразы II

1.1.4. Регуляция транскрипции нейронных генов

1.1.5. Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами

1.2. Функции SCP фосфатаз в различных опухолях

1.2.1. Механизмы нарушения экспрессии генов-супрессоров при НМРЛ

1.2.2. Белок pRb в регуляции клеточного цикла

1.2.3. Роль pRb в образовании различных опухолей

1.2.4. Влияние CTDSPL/1/2 на эпителиально-мезенхимальный переход

1.2.5. СТББРЬ/1/2 и их интронные микроРНК

1.2.6. Онкосупрессорная активность SCP фосфатаз в различных опухолях

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Образцы тканей

2.2. Клеточные культуры

2.3. Трансфекция клеток и плазмиды

2.4. Анализ образования колоний

2.5. Определение скорости роста отдельных клонов

2.6. Определение скорости роста «зеленых» клеток

2.7. Иммуноферментный анализ

2.8. Выделение РНК и количественная ПЦР

2.9. Биоинформатический анализ

2.10. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Биоинформатический анализ экспрессии CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ

3.2. Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и транскрипционных факторов при НМРЛ

3.3. Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ

3.4. Способность CTDSPL/1/2 подавлять рост опухолевых клеток in vitro

3.5. Морфологические изменения клеток А549 после трансформации

3.6. Статус фосфорилирования pRb в сайтах Ser-807/811, Ser-780 и Ser-795

3.7.1. Поиск регуляторных микроРНК для СТББРЬ/1/2

3.7.2. Сравнение профилей экспрессии СТББРЬ/1/2 и miR-183-96-182

3.8. Коэкспрессия генов СТББРЬ/1/2 и их интронных микроРНК miR-26a/b

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AKT - protein kinase B, белки семейства протеинкиназ В; CDK2 - cyclin-dependent kinase, циклин-зависимая киназа 2; CDK4/6 - cyclin-dependent kinasе, циклин-зависимые киназы 4 и 6; CTD - С-концевой домен (C-Terminal Domain);

CTDSCP - small C-terminal domain phosphatase, малая сериновая фосфатаза;

CTDSPL/1/2 - гены фосфатаз CTDSPL, CTDSP1, CTDSP2;

EGFP - enhanced green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок;

EGFR - epidermal growth factor receptor, ген рецептора эпидермального фактора роста;

FBS - fetal bovine serum, эмбриональная бычья сыворотка

FOXO - транскрипционные факторы forkhead box O;

GFP - green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок;

GST - glutathione S-transferase, глутатион^-трансфераза;

IR - inverted repeats, инвертированные повторы;

ORF - open reading frame, открытая рамка считывания;

PML - promyelocyte leukemia protein, белок промиелоцитарного лейкоза;

REST - RE1-Silencing transcription factor, транскрипционный комплекс REST;

SB - sleeping beauty, система транспозонов «Спящая Красавица»;

TGF-P - transforming growth factor beta, трансформирующий ростовой фактор бета;

АК - аденокарцинома лёгкого;

ИФА - иммуноферментный анализ;

НМРЛ - немелкоклекточный рак лёгкого;

микроРНК (miR) - малые некодирующие РНК;

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Рак легкого - одно из наиболее распространенных и смертоносных онкозаболеваний в мире [1]. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет приблизительно 85% от всех выявляемых случаев рака легкого [2]. При этом метастазы наблюдаются в ~ 40% вновь диагностированных случаев НМРЛ [3]. Прогноз НМРЛ по-прежнему остается неблагоприятным, а общая выживаемость на 5 лет составляет ~15% [4]. Из-за отсутствия клинических симптомов и эффективных маркеров большинство случаев рака легкого диагностируют на поздних стадиях. Для улучшения прогноза НМРЛ необходим поиск новых терапевтических подходов.

НМРЛ является сложным многофакторным заболеванием, при котором происходят многочисленные генетические и эпигенетические изменения в геноме. Эти изменения включают как генетические (мутации, делеции), так и эпигенетические (метилирование ДНК, модификация гистонов, микроРНК) факторы, влияющие на экспрессию генов. В последнее время актуальны персонифицированные подходы к лечению онкозаболеваний, основанные на учете конкретных изменений в геноме. Кроме того, для выбора лечения большое значение имеет точная классификация типа опухоли на основе уникальных гистологических и молекулярных особенностей. Поэтому такие молекулярные особенности как метилирование ДНК, экспрессия генов и микроРНК могут обеспечить жизненно важную клиническую информацию.

Эффективность лечения НМРЛ будет улучшена за счет внедрения надежных и конкретных биомаркеров [5]. В этом контексте клиническим потенциалом могут обладать малые некодирующие РНК (микроРНК) из-за их стабильности и устойчивых паттернов экспрессии [6]. Понимание изменений и процессов, происходящих в геноме опухолевых клеток, поможет в определении более точного диагноза и разработке новых эффективных биомаркеров.

Большая часть исследований НМРЛ в последние годы направлена на изучение генетических аномалий, происходящих в геноме опухолевой клетки. У пациентов с опухолями, содержащими специфические изменения в генах EGFR или ALK/ROS1, выживаемость выше при применении соответствующей таргетной терапии по сравнению с пациентами без указанных генетических аномалий на фоне традиционной химиотерапии [7]. Однако относительно быстрое возникновение устойчивости к таким методам лечения, значительно ограничивает их эффективность и остается серьезной проблемой для лечения онкозаболеваний.

Малые сериновые фосфатазы CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2 (CTDSP Ь/1/2) принадлежат к подсемейству SCP и участвуют в различных клеточных процессах, включая дефосфорилирование С-концевого домена РНК-полимеразы II, регуляцию транскрипции нейронных генов. Кроме хорошо известных функций (регуляция активности РНК-полимеразы II, участие в подавлении нейрон-специфичных генов) появляется все больше доказательств участия БСР фосфатаз в процессах, связанных с развитием и прогрессией опухолевых заболеваний -эпителиально-мезенхимальным переходом, ангиогенезом и контролем клеточной пролиферации.

Среди многих нарушений биологических процессов в опухолях легкого, одно из наиболее критичных - дерегуляция клеточного цикла [8]. Белок ретинобластомы (рЯЬ), известный ген-супрессор - один из ключевых регуляторов клеточного цикла при переходе от G1- к S-фазе [9]. В отличие от мелкоклеточного рака легкого, при котором локус, содержащий Ш1 (ген, кодирующий рЯЬ) часто подвержен делециям, при НМРЛ его уровень в большинстве случаев не снижен, а его дерегуляция опосредована изменениями в факторах, регулирующих его активность [10]. В ходе клеточного цикла этот белок подвергается множественному фосфорилированию и дефосфорилированию, что приводит к изменениям его активности и способности связывать транскрипционные факторы, такие как E2F [11].

В последние годы появляется всё больше данных о способности некоторых фосфатаз БСР подсемейства подавлять рост различных опухолевых клеток [12, 13]. Известно, что малая сериновая фосфатаза БСР семейства СТЭБРЬ способна связываться с белком pRb. Ген СТЭБРЬ, кодирующий эту фосфатазу, обладает свойствами гена-супрессора и подвержен частым мутациям или делециям во многих типах опухолей, включая рак лёгкого, печени, почки, молочной железы и др. [14-16]. Фосфатазы СГОБР1 и СТВБР2 обладают высокой гомологией с СТЭБРЬ по аминокислотной последовательности (~83%), и по трёхмерной структуре (RMSD ~ 0.6 А) [17], что указывает на общие функции белков. Однако их роль при НМРЛ изучена не достаточно.

Цели и задачи

Цель работы - поиск супрессорных свойств фосфатаз БСР подсемейства СТЭБРЬ, СГО8Р1 и СТВБР2 и выявление механизмов их регуляции при НМРЛ.

Поставленные задачи:

1. Формирование коллекции кДНК из парных образцов первичных опухолей легкого (НМРЛ).

2. Сравнительный количественный анализ профилей экспрессии генов СТЭБРЬ, СТЭБР1, СТЭБР2 и КБ1 при НМРЛ.

3. Корреляционный анализ экспрессии СТЭБРЬ, СТЭБР1, СТЭБР2, ЯБ1 и характеристик исследуемых образцов опухолей (гистологический тип, стадия, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы).

4. Проверка опухолеподавляющей активности фосфатаз СТЭБРЬ, СГОБР1 и СТВБР2 на клеточной линии аденокарциномы легкого (А549). Оценка скорости роста клеток полученных клонов.

5. Анализ статуса фосфорилирования рЯЬ в трансфицированных и исходных клетках методом иммуноферментного анализа.

6. Поиск потенциальных регуляторных микроРНК для СТЭБРЬ, СТЭБР1 и СТЭБР2 при НМРЛ.

7. Сравнение профилей экспрессии генов CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2 и их

интронных микроРНК (miR-26a/b).

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе данной работы на парных образцах первичных опухолей НМРЛ впервые показано частое и одновременное снижение экспрессии трех генов CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2. В опытах in vitro впервые выявлена супрессорная активность генов SCP фосфатаз - CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2. С помощью трансфекции клеточной линии аденокарциномы лёгкого А549 показано, что экспрессия каждого из генов в дополнение к подавлению роста вызывают увеличение доли клеток с эпителиальной морфологией. Обнаружено снижение уровня фосфорилированного по сайтам Ser-807/811, Ser-780 Ser-795 белка pRb в клонах А549. Обнаруженные эффекты характеризуют CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2 как гены-супрессоры.

Кроме того, обнаружена статистически достоверная разница в уровнях мРНК генов CTDSPL, CTDSP1 и RB1 между образцами АК с метастазами в лимфатических узлах и без них (P < 0.05), что позволяет предположить, что эти гены можно использовать в качестве биомаркеров метастатического статуса АК. Полученные данные могут способствовать дальнейшему пониманию различий в путях метастазирования в АК и ПКРЛ - наиболее распространенных гистологических типах НМРЛ.

С помощью биоинформатического анализа базы данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) и ресурсов для предсказания мишеней микроРНК (TargetScan, DIANA-microT, miRTarbase, PicTar, mirSVR) для трех генов фосфатаз идентфицированы потенциальные регуляторные микроРНК, входящие в онкогенный кластер miR-183-96-182. Методом ПЦР в реальном времени подтверждено усиление экспрессии этих микроРНК, наряду с падением

экспрессии генов CTDSPL/1/2. Эти данные указывают на потенциальное участие кластера miR-183-96-182 в инактивации генов фосфатаз при НМРЛ.

Результаты работы свидетельствуют о том, что, все три фосфатазы, обладая высокой гомологией, выполняют супрессорную функцию in vitro. Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов возникновения НМРЛ и могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на разработку новых подходов генной терапии рака лёгкого.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Онкосупрессорные свойства SCP фосфатаз при немелкоклеточном раке лёгкого»

Апробация работы

Материалы работы представлены на следующих российских и международных конференциях: "Molecular mechanisms of growth and progression of malignant neoplasms", посвященная 55-летию Института молекулярной биологии РАН и 120-летию со дня рождения В.А. Энгельгардта (Москва, Россия, 2014); XXII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2015»; 40th FEBS Congress, The Biochemical Basis of Life (Berlin, Germany, 2015); Научная конференция молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА (Москва, Россия, 2016); 41th FEBS Congress, Molecular and Systems Biology for a Better Life (Kusadasi, Turkey, 2016); II Всероссийская Конференция по молекулярной онкологии (Москва, Россия, 2016); II Всероссийская конференции с международным участием "Высокопроизводительное секвенирование в геномике" (Новосибирск, Россия, 2017); 43rd FEBS Congress, Biochemistry Forever (Prague, Czech Republic, 2018); V Всероссийская Конференция по молекулярной онкологии с международным участием (Москва, Россия, 2019).

Публикации

По материалам исследования опубликованы 4 статьи в рецензируемых российских и международных научных журналах и 10 тезисов.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 1 81 ссылку. Диссертация изложена на 98 страницах и содержит 13 рисунков и 5 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функции белков CTDSP1, CTDSP2, CTDSPL в клетках человека

Обратимое фосфорилирование белков, осуществляемое противоположным действием киназ и фосфатаз, представляет собой важный механизм передачи сигналов и регулирования активности ферментов во всех живых организмах. В эукариотических клетках фосфорилирование происходит главным образом на трех гидроксилсодержащих аминокислотах - серине, треонине и тирозине, из которых серин является преобладающей мишенью [18]. Серин/треониновые фосфатазы включают три основных семейства: фосфопротеиновые фосфатазы (PPP), металлозависимые протеиновые фосфатазы и фосфатазы на основе аспартата, представленные FCP/SCP семейством. Семейство FCP/SCP включает подсемейство трёх высоко гомологичных малых CTD-фосфатаз (CTDSP1, CTDSP2 и CTDSPL).

1.1.1. Аминокислотные последовательности фосфатаз CTDSPL/1/2

Белки подсемейства малых сериновых фосфатаз (SCP - Small C-terminal domain Phosphatase), к которым относятся CTDSP1, CTDSP2, CTDSPL и CTDSPL2, вовлечены в ряд важных процессов в клетке. Фосфатазы этого подсемейства локализованы в клеточном ядре, являются М£2+-зависимыми ферментами и могут играть роль регуляторов транскрипции некоторых генов, а также взаимодействовать с другими регуляторными белками. При этом гомология трёх аминокислотных последовательностей - CTDSP1, CTDSP2, CTDSPL выше, чем у каждой из этих трёх с CTDSPL2. Значительное сходство аминокислотных последовательностей (~83%) и трехмерных структур SCP фосфатаз указывает на сходные функции этих трех ферментов (Рис. 1). Эти белки имеют высокую гомологию в мотиве DXDX(T/V), отвечающем за фосфатазную активность, но имеют различия в N-концевых последовательностях, которые, как

13

предполагается, принимают участие в белок-белковых взаимодействиях. Важно отметить, что во всех трёх изоформах обнаружены идентичные характеристики во всех биофизических и кинетических исследованиях in vitro. Белки CTDSP1, CTDSP2 и CTDSPL у человека кодируются генами CTDSP1, CTDSP2 и CTDSPL, расположенными на 2-ой, 12-ой и 3-й хромосоме, соответственно. И хотя они расположены на разных хромосомах, профили тканеспецифичной экспрессии для трёх изоформ не отличаются друг от друга [19].

Рис. 1. Гомологичные участки аминокислотных последовательностей белков CTDSPL/1/2 (>90%) в фосфатазном домене. Скобкой показан консервативный домен; * - отмечены критические аспарагиновые основания, вовлеченные в фосфатазную активность.

1.1.2. Механизм действия 8СР фосфатаз

У ферментов этого подсемейства имеются отрицательные заряды,

присутствующие как на нуклеофильной, так и на основной аминокислоте

(аспартат), которые нейтрализуются ионами магния, необходимыми для

связывания субстрата и для ферментативной активности (Рис. 2). После

нуклеофильной атаки образуется промежуточное соединение фосфо-аспартила, а

после его взаимодействия с молекулой воды образуется дефосфорилированный

14

серин и неорганический фосфат. Формирование этого фосфо-аспартильного интермедиата является ключевой особенностью, которая отличает членов семейства FCP/SCP от других металло-зависимых фосфатаз [20].

Рис. 2. Механизм действия 8СР фосфатаз. Фосфатазы используют консервативный мотив DXDX(T/V) и ион магния для координации фосфорилированного серина. Аспарагиновая кислота действует как нуклеофил и образует промежуточное соединение аспартилфосфата, которое затем взаимодействует с молекулой воды.

Активность фосфатаз, действующих на ^концевой домен РНК-полимеразы II, впервые обнаружена во фракции клеток HeLa [21]. Белки в этом экстракте способны переводить гиперфосфорилированную РНК-полимеразу II в гипофосфорилированное состояние. Эта модификация позволяет РНК-полимеразе II связывать большой ранний промотор аденовируса-2 (Ad2-MLP), что явилось одним из первых доказательств того, что фосфорилированная форма С-концевого домена играет важную роль для узнавания промотора [22].

I.1.3. Фосфорилирование С-концевого домена РНК-полимеразы II

Динамический паттерн посттрансляционной модификации С-концевого хвоста РНК-полимеразы II называют CTD код [23]. Ферменты, такие как киназы и фосфатазы, определяют статус посттрансляционной модификации С-концевого домена, что является значимым для регуляторов транскрипции. В совокупности эти факторы обеспечивают правильное время транскрипционных процессов [24]. Интересно, что большинство CTD-киназ принадлежат к семейству циклин-зависимых киназ (CDK), что подразумевает связь между регуляцией клеточного цикла и транскрипцией [25].

Известно, что БСР фосфатазы предпочтительно дефосфорилируют фосфосерин-5 в гептапептидных повторах С-концевого домена РНК-полимеразы

II. Наибольшая субъединица РНК-полимеразы II содержит С-концевой домен, состоящий из множества повторов консенсусной последовательности Туг1 -Бег2-Рго3-ТЬг4-8ег5-Рго6^ег7, подвергающейся фосфорилированию и дефосфорилированию на различных стадиях транскрипции. На стадии пролонгации транскрипции наряду с фосфатазой FCP1, имеющей активный центр, похожий с активными центрами других членов БСР семейства, фосфатазы негативно регулируют активность РНК-полимеразы II. FCP1 является СГО/БСР фосфатазой, консервативной у эукариот с предпочтением Seг-2 С-концевого домена РНК-полимеразы II в качестве субстрата [26-28]. С другой стороны, SCP фосфатазы являются специфичными и присутствующими у высших эукариот [29], предпочтительно дефосфорилируют Бег-5, а не Seг-2. У человека СГО8Р1 обладает 24% идентичностью с FCP1 по аминокислотной последовательности в фосфатазном домене и сходной третичной структурой [30, 31].

С-концевой домен РНК-полимеразы II человека содержит 52 повтора гептапептидной последовательности Туг1-8ег2-Рго3-ТЬг4-8ег5-Рго6^ег7 и участвует в связывании с некоторыми белками. Этот уникальный домен

сохранился неизменным на протяжении эволюции [32], но количество повторов варьирует от 26-27 (в дрожжах) до 52 (у млекопитающих) [33]. Эта аминокислотная последовательность сильно обогащена сайтами потенциального фосфорилирования - каждый из пяти остатков в гептапептидном повторе, кроме пролина, может быть акцептором фосфата in vivo.

Статус фосфорилирования двух наиболее хорошо изученных остатков С-концевого домена, Ser-2 и Ser-5, коррелирует со стадиями транскрипции [34]. В зависимости от состояния фосфорилирования C-концевой домен может различать свои мишени для связывания и инициировать транскрипцию. Дефосфорилированный C-концевой домен связывает белки комплекса предварительной инициации, такие как TATA-связывающие белки. Фосфорилирование Ser-5 C-концевого домена циклин-зависимой киназой Cdk7 препятствует этим взаимодействиям. Фосфорилированный Ser-5 C-концевого домена РНК-полимеразы II способен инициировать транскрипцию, но не может войти в фазу элонгации и транскрибировать всю мРНК. Фосфорилирование Ser-2 C-концевого домена с помощью циклин-зависимой киназы Cdk9 генерирует новую форму РНК-полимеразы II, которая распознается факторами элонгации, такими как Elongator. В ходе элонгации транскрипции С-концевой домен РНК-полимеразы II подвергается гиперфосфорилированию. Кроме того, фосфорилированный в положениях Ser-2 и Ser-5 C-концевой домен РНК-полимеразы II распознается факторами сплайсинга и необходим для сборки сплайсосомы и для эффективных реакций сплайсинга в процессе элонгации.

Показано, что регуляция сплайсинга пре-мРНК, вызванного ультрафиолетовым излучением, происходит в зависимости от состояния фосфорилирования C-концевого домена РНК-полимеразы II [35]. В этом исследовании показано, что в клетках, содержащих мутантную форму РНК-полимеразы II, где каждый Ser-2 и Ser-5 в C-концевом домене заменен аланином, не подвергающимся фосфорилированию, альтернативный сплайсинг в ответ на УФ-облучение не происходит. Промежуточные комплексы, участвующие в

17

сплайсинге, обнаружены с помощью антител к фосфосерину-5 C-концевого домена. Следовательно, сплайсинг может происходить вместе с предпочтительным фосфорилированием в Ser-5 C-концевого домена РНК-полимеразы II [36]. Вероятно, положение фосфата С-концевого домена меняется в ходе элонгации от Ser-2 к Ser-5 при приближении к сайту сплайсинга и переходит обратно к Ser-2 после завершения сплайсинга. Таким образом, SCP фосфатазы выполняют функцию регуляции активности РНК-полимеразы II на стадии перехода от инициации транскрипции к элонгации, специфично дефосфорилируя фосфосерин-5 C-концевого домена самой большой субъединицы РНК-полимеразы II.

1.1.4. Регуляция транскрипции нейронных генов

Известно, что SCP фосфатазы являются эволюционно консервативными регуляторами экспрессии нейрон-специфичных генов [19]. Белки CTDSPL/1/2 -функциональные компоненты комплекса REST (RE1-Silencing Transcription factor), который специфично связывается с участком ДНК RE-1 (Repressor Element 1) длиной в 23 пары оснований, обнаруживающимся во многих нейронных генах (>1000). Взаимодействуя с REST, SCP фосфатазы участвуют в подавлении экспрессии нейронных генов. Установлено, что профиль экспрессии генов CTDSPL/1/2 сходен с паттерном экспрессии REST, который обнаруживается во всех клетках, кроме нейронных [37]. Показано, что активность нейронных генов в клетках человека и мышей зависит от активности микроРНК miR-124, предотвращающей экспрессию генов CTDSPL/1/2.

Имеются данные о том, что интронная микроРНК - miR-26b, регулирует экспрессию CTDSP2 во время дифференцировки нейронов в ранних стадиях развития рыбок Danio, а CTDSP2 является мишенью miR-26b, которая кодируется в интроне первичного транскрипта CTDSP2 и транскрибируется вместе со своим геном-хозяином [38]. Эта отрицательная обратная связь неактивна в нейронных стволовых клетках, поскольку биогенез miR-26b ингибируется на уровне

предшественника. Генерация зрелой miR-26b активируется во время нейрогенеза, при котором эта микроРНК подавляет экспрессию CTDSP2. Посттранскрипционная регуляция экспрессии miR-26b приводит к ингибированию CTDSP2, обеспечивая его ткане-специфичную регуляцию. Этот результат стал первым экспериментальным доказательством существования такой обратной связи, при которой экспрессия гена-хозяина регулируется посредством его интронной микроРНК.

Опыты с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши P19 выявили участие CTDSP1 в дифференцировке нейронов, индуцированной комплексом REST. Снижение экспрессии CTDSP1 приводило к клеточной дифференцировке с удвоенной скоростью. Эти результаты подтверждают важность роли CTDSP1 в инактивации генов нейронов при взаимодействии с комплексом REST [39]. В этой работе показано также, что профили одновременной экспрессии генов CTDSP1 и REST влияют на степень дифференцировки нейронов, ингибируя транскрипционный фактор основной структуры спираль-петля-спираль (bHLH) и нейрогенина-2 (Ngn2) (Рис. 3). Подавление экспрессии CTDSP1 и REST приводило к дифференцировке нейронов [39]. Этот результат показывает, что CTDSP1 играет жизненно важную роль в подавлении экспрессии генов нейронов при его коэкспрессии с REST.

1.1.5. Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами

Малые сериновые фосфатазы CTDSPL/1/2, в отличие от фосфатазы FCP1, способны дефосфорилировать Smad2 и Smad3 в N-концах и линкерных областях, усиливая сигнальный путь трансформирующего ростового фактора бета (TGF-beta) [40]. Этот фактор контролирует многие функции в клетке, включая пролиферацию и дифференцировку. Белки Smad являются преобразователями сигналов и транскрипционными модуляторами, которые опосредуют множество сигнальных путей, в том числе сигнал TGF-beta.

Фосфатазы CTDSPL/1/2 также дефосфорилируют Smadl в C-конце, тем самым отрицательно регулируя сигнальный путь костных морфологических белков BMP (Bone Morphogenetic Proteins) [41]. Smadl является сигнальным белком пути TGF-p/BMP, играющего фундаментальную роль в органогенезе костных тканей посредством активации рецепторов серин-треониновых киназ.

SCP фосфатазы также могут дефосфорилировать и стабилизировать белок Snail. Известно, что сверхэкспрессия этого белка приводит к рецидиву рака молочной железы, который сопровождается эпителиально-мезенхимальным переходом. Белок Snail является важным регулятором нескольких сигнальных путей, которые приводят к эпителиально-мезенхимальному переходу и миграции клеток [42].

Известна способность фосфатазы CTDSP1 дефосфорилировать белок, участвующий в подавлении экспрессии E-кадгерина - Twistl. Фосфорилирование серина в 68 положении N-конца этого белка способствует его деградации [43]. E-кадгерин регулирует клеточную адгезию и подвижность клеток. Его дерегуляция приводит к ингибированию инвазии и метастазирования опухолевых клеток.

Показано, что экспрессия CTDSCPL/1/2 повышена в сердечной ткани, а интронные микроРНК - miR-26b, miR-26a-2 и miR-26a-1, кодирующие последовательности которых содержатся в интронах этих генов, выполняют определенную функцию в сердце [44]. Для выяснения роли CTDSP1 и его miR-26b в кардиомиоцитах проведено исследование, результаты которого показали, что CTDSP1 может вызвать гипертрофию сердца, а оверэкспрессия CTDSP1 приводит к значительному увеличению площади поверхности клеток кардиомиоцитов и к повышению уровней экспрессии соответствующих генов [45]. Экспрессия

Рис. 3. Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами. Фосфатазы CTDSCPL/1/2 участвуют в сигнальном пути TGF-p/BMP посредством дефосфорилирования белка Smadl; в ингибировании нейрон-специфичных генов, взаимодействуя с комплексом REST; в регуляции клеточного цикла, по-видимому, дефосфорилируя белок pRb [14], [46].

CTDSP1 индуцирует сердечный гипертрофический фенотип, а экспрессия его интронной miR-26b имеет противоположный эффект по сравнению с эффектом оверэкспрессии CTDSP1 in vitro. Эти данные свидетельствуют о том, что CTDSP1 потенциально индуцирует сердечную гипертрофию, которая отрицательно регулируется его интронной miR-26b.

Таким образом, многофункциональные фосфатазы семейства SCP участвуют в регуляции сигнальных путей, а также транскрипции генов, и

выполняют ряд жизненно важных функций в различных биологических процессах.

I.2. Функции 8СР фосфатаз в различных опухолях

Кроме хорошо известных функций (регуляция активности РНК-полимеразы

II, участие в подавлении нейрон-специфичных генов) в последние годы появляется все больше доказательств участия БСР фосфатаз в процессах, связанных с развитием и прогрессией опухолевых заболеваний - эпителиально-мезенхимальным переходом, ангиогенезом и контролем клеточной пролиферации.

1.2.1. Механизмы нарушения экспрессии генов-супрессоров при НМРЛ

Опухоли легкого, как и другие эпителиальные злокачественные опухоли, возникают вследствие ряда мутаций, молекулярных аномалий и сопутствующих морфологических изменений. Канцерогенез легкого в большинстве случаев обусловлен генетическими и эпигенетическими повреждениями, вызванными хроническим воздействием канцерогенных веществ табака [47].

Высказано предположение [48], что всё многообразие генотипов раковых клеток сводится к шести существенным изменениям в клеточной физиологии, которые в совокупности определяют злокачественный рост: (а) самодостаточность сигналов роста; (б) нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост; (в) уклонение от запрограммированной гибели клеток (апоптоз); (г) безграничный репликативный потенциал; (д) ангиогенез и (е) способность к инвазии и метастазированию.

Образование опухоли является сложным процессом, включающим в себя генетические и эпигенетические изменения в ряде генов, включая гены-супрессоры, онкогены, гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и

апотпоза. Согласно одной из наиболее распространенных теорий канцерогенеза, возникновение первой опухолевой клетки происходит вследствие накопления мутаций в онкогенах, которые способствуют возникновению дальнейших мутаций, то есть формируется мутаторный фенотип. Такие первичные мутации, увеличивающие частоту последующих мутаций в клетке, называются драйверными и являются ранним событием в канцерогенезе. Одна из сложностей определения таких мутаций заключается в том, что некоторые мутации в зависимости от контекста могут приводить к активации как онкогенов, так и генов-супрессоров. Например, MYC обычно считается онкогеном, но иногда имеет характеристики опухолевого гена-супрессора [49]. Еще одна сложность при таком подходе возникла после открытия факта, что некоторые опухоли характеризуются внезапными генетическими изменениями [50], а не медленным накоплением мутаций.

Гены-супрессоры опухолей играют жизненно важную роль в контроле роста нормальных клеток. Они могут быть вовлечены в регуляцию разнообразных процессов клеточной активности и репарацию ДНК при ответе на её повреждение, участвовать в регуляции клеточного цикла, митогенной сигнализации, дифференцировке и миграции клеток [51]. Многие опухолевые супрессоры обладают активностью как в нормальных, так и в опухолевых клетках, тогда как другие, например, р53, неактивны в нормальных клетках и активируются только при потенциальном риске онкозаболевания [52].

Инактивация генов-супрессоров опухолей может быть вызвана и другими механизмами помимо мутаций, включая аберрантное метилирование промотора или делецию гена. Показано, что аллельные потери хромосомы 3р являются частыми молекулярными изменениями при раке легкого, происходящими в начале прогрессирования онкозаболевания [51, 53]. При раке легкого также обнаружены многочисленные хромосомные аномалии (анеуплоидия) и структурные цитогенетические аномалии, в том числе делеции и невзаимные транслокации [54].

Несмотря на интенсивные исследования онкогенеза и идентификацию множества опухолевых супрессоров [55], точные механизмы, посредством которых осуществляются функции опухолевых супрессоров, не всегда хорошо изучены. Идентификация новых генов-супрессоров и онкогенов, которые могут быть потенциальными мишенями при лечении НМРЛ, по-прежнему остается актуальной задачей.

1.2.2. Белок рЯЬ в регуляции клеточного цикла

Перед началом деления клетки проходят через тщательно контролируемую многоступенчатую процедуру. Программа деления клеток - клеточный цикл -необходима для предотвращения безудержного клеточного роста, что может привести к образованию опухоли. Белки, называемые циклинами, контролируют прогрессию в каждой фазе клеточного цикла, причем разные циклы работают на разных фазах. Во время фазы G1 клеточного цикла клетки увеличиваются в размере и продуцируют белки, которые являются необходимыми для копирования ДНК. Как только клетка проходит контрольную точку в конце фазы G1, она стремится к делению. Поэтому для клетки особенно важно контролировать события, происходящие во время фазы G1.

Контрольные точки клеточного цикла представляют собой пути передачи сигнала, отслеживающие успешное завершение событий в одной фазе клеточного цикла перед переходом к следующей фазе, содержат сенсорные белки, которые сканируют хроматин на предмет частично реплицированной ДНК, разрывов ДНК или других аномалий. Когда клеточное повреждение непоправимо, передача сигналов контрольной точки может устранить потенциально опасные клетки путем постоянной остановки клеточного цикла или апоптоза [56].

Контрольная точка клеточного цикла G1 предотвращает репликацию поврежденной ДНК и является наиболее понятной контрольной точкой в клетках млекопитающих. Комплексы циклина D-CDK4/6 способствуют раннему прогрессированию G1 фазы, но активность комплексов циклина E (и циклина А) с

CDK2/1 необходима для инактивации белка pRb посредством гиперфосфорилирования, чтобы пройти точку рестрикции в позднюю фазу G1 [57].

К семейству генов ретинобластомы относится ген ретинобластомы (RB1), который является одним из наиболее изученных генов-супрессоров опухолей, и два родственных гена, p130 и p107, транскрипты которых, как было показано, структурно и функционально сходны с pRb [58]. Белок ретинобластомы (pRb) является ключевым игроком в регулировании фазы G1. Белки pRb связывают факторы транскрипции, которые необходимы для прогрессии клеточного цикла. Инактивация pRb приводит к высвобождению транскрипционных факторов E2F и индукции генов, специфичных для поздней фазы G1, включая гены дигидрофолатредуктазы (DHFR), уникального белка F-бокса 5 (Emil) и циклина A [59].

Рис. 4. Регуляция активности рЯЬ в ходе клеточного цикла вследствие фосфорилирования. Гипофосфорилированая форма pRb остается активной для связывания с E2F. При переходе клеточного цикла от G1- к S фазе - комплекс CDK и циклинов дополнительно фосфорилирует pRb для достижения гиперфосфорилированного статуса и освобождает pRb от связывания с E2F, что способствует продвижению клеточного цикла.

Существование гена RB1 предсказано в 1971 году по эпидемиологическим данным семейства ретинобластомы [60], а сам ген RB1 идентифицирован более 15-ти лет спустя [61]. Первоначальную характеристику функции pRb определяли в исследованиях ДНК-содержащих опухолевых вирусов [62], которые указывали на роль pRb как регулятора перехода G1/S [63]. В настоящее время известно, что фазы G1/S и G2/M клеточного цикла млекопитающих контролируются сложным молекулярным путем (Рис.4), в который вовлечены факторы связывания промотора E2 (E2F) [64], партнер димеризации [65], pRb [62], циклин-зависимые киназы (CDK), циклины [66] и ингибиторы CDK [67]. Этот механизм нарушен в большинстве солидных опухолей, а, возможно, и во всех [68].

Продукты генов RB1, RBL1 и RBL2 - белки pRb, p130 и p107, соответственно, относятся к семейству карманных белков. Белки p107 и p130 обладают высокой гомологией с pRb в области карманного домена и также участвуют в регуляции клеточного цикла. До сих пор неясно, зачем нужно так много членов семейства pRb и E2F, однако показано, что конкретные члены семейства pRb взаимодействуют преимущественно с конкретными членами семейства E2F во время определенных фаз клеточного цикла. Например, pRb взаимодействует в основном с E2F1, E2F2 и E2F3 и наиболее активен при фазовом переходе G1-S [69], в то время как p130 взаимодействует в основном с E2F4 и E2F5 и наиболее активен в G0-фазе покоя клеточного цикла [70]. Показано, что белки семейства pRb связываются с фрагментом внутри области активации транскрипции E2F, эффективно подавляя их активность [71, 72]. Кроме преимущественного взаимодействия с членом семейства карманных белков pRb, E2F1, E2F2 и E2F3 также обладают сайтом связывания для циклинов в аминоконцевой области, что позволяет соответствующим циклин-зависимым киназам (главным образом, Cdk2) регулировать активность E2F1, E2F2 и E2F3 [73]. E2F4 и E2F5 не имеют такого способа регуляции [70]. Хотя все белки семейства E2F, кроме E2F7 и E2F8, способны гетеродимеризоваться с белком семейства DP с образованием функционального комплекса E2F, только E2F1-3

обладают достаточно сильной активностью, чтобы стимулировать активную транскрипцию и вход в S-фазу покоящихся клеток [74].

Белок рЯЬ является супрессором, регулирующим множество жизненно важных процессов в клетке, включая регуляцию клеточного цикла, ответ на повреждения ДНК, выход из клеточного цикла, дифференцировку [75]. Этот белок подавляет экспрессию генов, регулируемых фактором транскрипции Е2Б, связываясь с белками семейства Е2Б (Рис. 4). Тем не менее, биохимические исследования показали, что Е2Б является лишь одной из множества мишеней белка рЯЬ. На сегодняшний день обнаружено более сотни белков, способных взаимодействовать с рЯЬ [76]. Поэтому для понимания причин инактивации рЯЬ в результате фосфорилирования необходимо понять каким образом его структура влияет на взаимодействие с белками и как фосфорилирование влияет на изменение его структуры.

Активность рЯЬ регулируется посттрансляционными модификациями, причем преобладающей модификацией является фосфорилирование, которое осуществляется с помощью CDK4-циклина D и CDK2-циклина Е способствует прогрессии S-фазы клеточного цикла [77, 78].

Белок рЯЬ содержит два независимо сложенных домена, каждый из которых состоит из двух субдоменов. Известно о 16-ти предполагаемых сайтах фосфорилирования рЯЬ посредством СЭК, расположенных по всему белку (Рис. 5). Предполагается, что рЯЬ существует в трех обобщенных изоформах: (1) -нефосфорилированный рЯЬ; (2) - гипофосфорилированный рЯЬ (или частично фосфорилированный рЯЬ) и (3) - неактивный, гиперфосфорилированный рЯЬ, присутствующий в поздних фазах 01, Б, 02 и М. Последний можно идентифицировать с помощью электрофореза в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия как более медленно мигрирующую фракцию [75]. Исследования показали, что фосфорилирование влияет на междоменные взаимодействия внутри рЯЬ таким образом, что он не способен

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пузанов Григорий Андреевич, 2020 год

Список литературы:

1. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D. M., Forman D., Bray F. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 // Int J Cancer. - 2015. - T. 136, № 5. - C. E359-86.

2. Gridelli C., Rossi A., Carbone D. P., Guarize J., Karachaliou N., Mok T., Petrella F., Spaggiari L., Rosell R. Non-small-cell lung cancer // Nat Rev Dis Primers. - 2015. - T. 1. - C. 15009.

3. Goldstraw P., Crowley J., Chansky K., Giroux D. J., Groome P. A., Rami-Porta R., Postmus P. E., Rusch V., Sobin L. The IASLC Lung Cancer Staging Project: proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM Classification of malignant tumours // J Thorac Oncol. - 2007. - T. 2, № 8. - C. 706-14.

4. Siegel R. L., Miller K. D., Jemal A. Cancer statistics, 2018 //. - 2018. - T. 68, № 1. -C. 7-30.

5. Ahmadzada T., Kao S., Reid G., Boyer M., Mahar A., Cooper W. A. An Update on Predictive Biomarkers for Treatment Selection in Non-Small Cell Lung Cancer // J Clin Med. - 2018. - T. 7, № 6.

6. Lan H., Lu H., Wang X., Jin H. MicroRNAs as potential biomarkers in cancer: opportunities and challenges //. - 2015. - T. 2015. - C. 125094.

7. Chan B. A., Hughes B. G. M. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future // Translational lung cancer research. -2015. - T. 4, № 1. - C. 36-54.

8. Eymin B., Gazzeri S. Role of cell cycle regulators in lung carcinogenesis // Cell adhesion & migration. - 2010. - T. 4, № 1. - C. 114-123.

9. Burkhart D. L., Sage J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene // Nat Rev Cancer. - 2008. - T. 8, № 9. - C. 671-82.

10. Reissmann P. T., Koga H., Takahashi R., Figlin R. A., Holmes E. C., Piantadosi S., Cordon-Cardo C., Slamon D. J. Inactivation of the retinoblastoma susceptibility gene in

non-small-cell lung cancer. The Lung Cancer Study Group // Oncogene. - 1993. - T. 8, № 7. - C. 1913-9.

11. Heilmann A. M., Dyson N. J. Phosphorylation puts the pRb tumor suppressor into shape // Genes Dev. - 2012. - T. 26, № 11. - C. 1128-30.

12. Lin Y. C., Lu L. T., Chen H. Y., Duan X., Lin X., Feng X. H., Tang M. J., Chen R. H. SCP phosphatases suppress renal cell carcinoma by stabilizing PML and inhibiting mTOR/HIF signaling // Cancer Res. - 2014. - T. 74, № 23. - C. 6935-46.

13. Wang W., Liao P., Shen M., Chen T., Chen Y., Li Y., Lin X., Ge X., Wang P. SCP1 regulates c-Myc stability and functions through dephosphorylating c-Myc Ser62 // Oncogene. - 2016. - T. 35, № 4. - C. 491-500.

14. Zhu Y., Lu Y., Zhang Q., Liu J. J., Li T. J., Yang J. R., Zeng C., Zhuang S. M. MicroRNA-26a/b and their host genes cooperate to inhibit the G1/S transition by activating the pRb protein // Nucleic Acids Res. - 2012. - T. 40, № 10. - C. 4615-25.

15. Kashuba V. I., Li J., Wang F., Senchenko V. N., Protopopov A., Malyukova A., Kutsenko A. S., Kadyrova E., Zabarovska V. I., Muravenko O. V., Zelenin A. V., Kisselev L. L., Kuzmin I., Minna J. D., Winberg G., Ernberg I., Braga E., Lerman M. I., Klein G., Zabarovsky E. R. RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - T. 101, № 14. - C. 4906-11.

16. Senchenko V. N., Anedchenko E. A., Kondratieva T. T., Krasnov G. S., Dmitriev A. A., Zabarovska V. I., Pavlova T. V., Kashuba V. I., Lerman M. I., Zabarovsky E. R. Simultaneous down-regulation of tumor suppressor genes RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21 and RASSF1A in primary non-small cell lung cancer // BMC Cancer. -2010. - T. 10. - C. 75.

17. Almo S. C., Bonanno J. B., Sauder J. M., Emtage S., Dilorenzo T. P., Malashkevich V., Wasserman S. R., Swaminathan S., Eswaramoorthy S., Agarwal R., Kumaran D., Madegowda M., Ragumani S., Patskovsky Y., Alvarado J., Ramagopal U. A., Faber-Barata J., Chance M. R., Sali A., Fiser A., Zhang Z. Y., Lawrence D. S., Burley S. K. Structural genomics of protein phosphatases // J Struct Funct Genomics. - 2007. - T. 8, № 2-3. - C. 121-40.

18. Olsen J. V., Blagoev B., Gnad F., Macek B., Kumar C., Mortensen P., Mann M. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks // Cell. - 2006. - T. 127, № 3. - C. 635-48.

19. Yeo M., Lee S. K., Lee B., Ruiz E. C., Pfaff S. L., Gill G. N. Small CTD phosphatases function in silencing neuronal gene expression // Science. - 2005. - T. 307, № 5709. - C. 596-600.

20. Zhang M., Yogesha S. D., Mayfield J. E., Gill G. N., Zhang Y. Viewing serine/threonine protein phosphatases through the eyes of drug designers // Febs j. -2013. - T. 280, № 19. - C. 4739-60.

21. Allen K. N., Dunaway-Mariano D. Phosphoryl group transfer: evolution of a catalytic scaffold // Trends Biochem Sci. - 2004. - T. 29, № 9. - C. 495-503.

22. Chesnut J. D., Stephens J. H., Dahmus M. E. The interaction of RNA polymerase II with the adenovirus-2 major late promoter is precluded by phosphorylation of the C-terminal domain of subunit Ila // J Biol Chem. - 1992. - T. 267, № 15. - C. 10500-6.

23. Buratowski S. The CTD code // Nat Struct Biol. - 2003. - T. 10, № 9. - C. 679-80.

24. Jeronimo C., Bataille A. R., Robert F. The writers, readers, and functions of the RNA polymerase II C-terminal domain code // Chem Rev. - 2013. - T. 113, № 11. - C. 8491-522.

25. Mayfield J. E., Burkholder N. T., Zhang Y. J. Dephosphorylating eukaryotic RNA polymerase II // Biochimica et biophysica acta. - 2016. - T. 1864, № 4. - C. 372-387.

26. Archambault J., Chambers R. S., Kobor M. S., Ho Y., Cartier M., Bolotin D., Andrews B., Kane C. M., Greenblatt J. An essential component of a C-terminal domain phosphatase that interacts with transcription factor IIF in Saccharomyces cerevisiae // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -1997. - T. 94, № 26. - C. 14300-14305.

27. Cho E. J., Kobor M. S., Kim M., Greenblatt J., Buratowski S. Opposing effects of Ctk1 kinase and Fcp1 phosphatase at Ser 2 of the RNA polymerase II C-terminal domain // Genes Dev. - 2001. - T. 15, № 24. - C. 3319-29.

28. Hausmann S., Shuman S. Characterization of the CTD phosphatase Fcpl from fission yeast. Preferential dephosphorylation of serine 2 versus serine 5 // J Biol Chem. - 2002. - T. 277, № 24. - C. 21213-20.

29. Yeo M., Lin P. S., Dahmus M. E., Gill G. N. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5 // J Biol Chem. - 2003. - T. 278, № 28. - C. 26078-85.

30. Ghosh A., Shuman S., Lima C. D. The structure of Fcpl, an essential RNA polymerase II CTD phosphatase // Mol Cell. - 2008. - T. 32, № 4. - C. 478-90.

31. Zhang Y., Kim Y., Genoud N., Gao J., Kelly J. W., Pfaff S. L., Gill G. N., Dixon J. E., Noel J. P. Determinants for dephosphorylation of the RNA polymerase II C-terminal domain by Scpl // Mol Cell. - 2006. - T. 24, № 5. - C. 759-770.

32. Barron-Casella E., Corden J. L. Conservation of the mammalian RNA polymerase II largest-subunit C-terminal domain // Journal of Molecular Evolution. - 1992. - T. 35, № 5. - C. 405-410.

33. Corden J. L., Cadena D. L., Ahearn J. M., Jr., Dahmus M. E. A unique structure at the carboxyl terminus of the largest subunit of eukaryotic RNA polymerase II // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1985. - T. 82, № 23. - C. 7934-8.

34. Bataille A. R., Jeronimo C., Jacques P. E., Laramee L., Fortin M. E., Forest A., Bergeron M., Hanes S. D., Robert F. A universal RNA polymerase II CTD cycle is orchestrated by complex interplays between kinase, phosphatase, and isomerase enzymes along genes // Mol Cell. - 2012. - T. 45, № 2. - C. 158-70.

35. Munoz M. J., Perez Santangelo M. S., Paronetto M. P., de la Mata M., Pelisch F., Boireau S., Glover-Cutter K., Ben-Dov C., Blaustein M., Lozano J. J., Bird G., Bentley D., Bertrand E., Kornblihtt A. R. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation // Cell. - 2009. - T. 137, № 4. - C. 708-20.

36. Nojima T., Gomes T., Grosso A. R. F., Kimura H., Dye M. J., Dhir S., Carmo-Fonseca M., Proudfoot N. J. Mammalian NET-Seq Reveals Genome-wide Nascent Transcription Coupled to RNA Processing // Cell. - 2015. - T. 161, № 3. - C. 526-540.

37. Visvanathan J., Lee S., Lee B., Lee J. W., Lee S. K. The microRNA miR-124 antagonizes the anti-neural REST/SCP1 pathway during embryonic CNS development // Genes Dev. - 2007. - T. 21, № 7. - C. 744-9.

38. Dill H., Linder B., Fehr A., Fischer U. Intronic miR-26b controls neuronal differentiation by repressing its host transcript, ctdsp2 // Genes & development. - 2012.

- T. 26, № 1. - C. 25-30.

39. Su X., Kameoka S., Lentz S., Majumder S. Activation of REST/NRSF target genes in neural stem cells is sufficient to cause neuronal differentiation // Mol Cell Biol. -2004. - T. 24, № 18. - C. 8018-25.

40. Wrighton K. H., Willis D., Long J., Liu F., Lin X., Feng X. H. Small C-terminal domain phosphatases dephosphorylate the regulatory linker regions of Smad2 and Smad3 to enhance transforming growth factor-beta signaling // J Biol Chem. - 2006. -T. 281, № 50. - C. 38365-75.

41. Knockaert M., Sapkota G., Alarcon C., Massague J., Brivanlou A. H. Unique players in the BMP pathway: small C-terminal domain phosphatases dephosphorylate Smad1 to attenuate BMP signaling // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. - T. 103, № 32. - C. 11940-11945.

42. Wu Y., Evers B. M., Zhou B. P. Small C-terminal domain phosphatase enhances snail activity through dephosphorylation // The Journal of biological chemistry. - 2009.

- T. 284, № 1. - C. 640-648.

43. Sun T., Fu J., Shen T., Lin X., Liao L., Feng X. H., Xu J. The Small C-terminal Domain Phosphatase 1 Inhibits Cancer Cell Migration and Invasion by Dephosphorylating Ser(P)68-Twist1 to Accelerate Twist1 Protein Degradation // J Biol Chem. - 2016. - T. 291, № 22. - C. 11518-28.

44. Leeper N. J., Raiesdana A., Kojima Y., Chun H. J., Azuma J., Maegdefessel L., Kundu R. K., Quertermous T., Tsao P. S., Spin J. M. MicroRNA-26a is a novel regulator of vascular smooth muscle cell function // J Cell Physiol. - 2011. - T. 226, № 4. - C. 1035-43.

45. Decker R. S., Rines A. K., Nakamura S., Naik T. J., Wassertsrom J. A., Ardehali H. Phosphorylation of contractile proteins in response to alpha- and beta-adrenergic stimulation in neonatal cardiomyocytes // Transl Res. - 2010. - T. 155, № 1. - C. 27-34.

46. R H. R., Kim H., Noh K., Kim Y. J. The diverse roles of RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase SCP1 // BMB Rep. - 2014. - T. 47, № 4. - C. 192-6.

47. Hirsch F. R., Franklin W. A., Gazdar A. F., Bunn P. A., Jr. Early detection of lung cancer: clinical perspectives of recent advances in biology and radiology // Clin Cancer Res. - 2001. - T. 7, № 1. - C. 5-22.

48. Hanahan D., Weinberg R. A. The hallmarks of cancer // Cell. - 2000. - T. 100, № 1. - C. 57-70.

49. Liu H., Radisky D. C., Yang D., Xu R., Radisky E. S., Bissell M. J., Bishop J. M. MYC suppresses cancer metastasis by direct transcriptional silencing of alphav and beta3 integrin subunits // Nat Cell Biol. - 2012. - T. 14, № 6. - C. 567-74.

50. Stephens P. J., Greenman C. D., Fu B., Yang F., Bignell G. R., Mudie L. J., Pleasance E. D., Lau K. W., Beare D., Stebbings L. A., McLaren S., Lin M. L., McBride D. J., Varela I., Nik-Zainal S., Leroy C., Jia M., Menzies A., Butler A. P., Teague J. W., Quail M. A., Burton J., Swerdlow H., Carter N. P., Morsberger L. A., Iacobuzio-Donahue C., Follows G. A., Green A. R., Flanagan A. M., Stratton M. R., Futreal P. A., Campbell P. J. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development // Cell. - 2011. - T. 144, № 1. - C. 27-40.

51. Wistuba, II, Behrens C., Virmani A. K., Mele G., Milchgrub S., Girard L., Fondon J. W., 3rd, Garner H. R., McKay B., Latif F., Lerman M. I., Lam S., Gazdar A. F., Minna J. D. High resolution chromosome 3p allelotyping of human lung cancer and preneoplastic/preinvasive bronchial epithelium reveals multiple, discontinuous sites of 3p allele loss and three regions of frequent breakpoints // Cancer Res. - 2000. - T. 60, № 7. - C. 1949-60.

52. Sun W., Yang J. Functional mechanisms for human tumor suppressors // Journal of Cancer. - 2010. - T. 1. - C. 136-140.

53. Wistuba, II, Montellano F. D., Milchgrub S., Virmani A. K., Behrens C., Chen H.,

Ahmadian M., Nowak J. A., Muller C., Minna J. D., Gazdar A. F. Deletions of

82

chromosome 3p are frequent and early events in the pathogenesis of uterine cervical carcinoma // Cancer Res. - 1997. - T. 57, № 15. - C. 3154-8.

54. Fong K. M., Sekido Y., Minna J. D. Molecular pathogenesis of lung cancer // J Thorac Cardiovasc Surg. - 1999. - T. 118, № 6. - C. 1136-52.

55. Lane D. P., Hupp T. R. Drug discovery and p53 // Drug Discov Today. - 2003. - T. 8, № 8. - C. 347-55.

56. Baldi A., De Luca A., Esposito V., Campioni M., Spugnini E. P., Citro G. Tumor suppressors and cell-cycle proteins in lung cancer // Pathology research international. -2011. - T. 2011. - C. 605042-605042.

57. Boddy M. N., Russell P. DNA replication checkpoint // Curr Biol. - 2001. - T. 11, № 23. - C. R953-6.

58. Paggi M. G., Baldi A., Bonetto F., Giordano A. Retinoblastoma protein family in cell cycle and cancer: a review // J Cell Biochem. - 1996. - T. 62, № 3. - C. 418-30.

59. Aleem E., Kiyokawa H., Kaldis P. Cdc2-cyclin E complexes regulate the G1/S phase transition // Nat Cell Biol. - 2005. - T. 7, № 8. - C. 831-6.

60. Knudson A. G., Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1971. - T. 68, № 4. - C. 820-3.

61. Fung Y. K., Murphree A. L., T'Ang A., Qian J., Hinrichs S. H., Benedict W. F. Structural evidence for the authenticity of the human retinoblastoma gene // Science. -1987. - T. 236, № 4809. - C. 1657-61.

62. Chellappan S. P., Hiebert S., Mudryj M., Horowitz J. M., Nevins J. R. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein // Cell. - 1991. - T. 65, № 6. -C. 1053-61.

63. Sellers W. R., Kaelin W. G., Jr. Role of the retinoblastoma protein in the pathogenesis of human cancer // J Clin Oncol. - 1997. - T. 15, № 11. - C. 3301-12.

64. Kovesdi I., Reichel R., Nevins J. R. Role of an adenovirus E2 promoter binding factor in E1A-mediated coordinate gene control // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1987. -T. 84, № 8. - C. 2180-4.

65. La Thangue N. B. DP and E2F proteins: components of a heterodimeric transcription factor implicated in cell cycle control // Curr Opin Cell Biol. - 1994. - T. 6, № 3. - C. 443-50.

66. Ewen M. E., Sluss H. K., Sherr C. J., Matsushime H., Kato J., Livingston D. M. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins // Cell. - 1993. - T. 73, № 3. - C. 487-97.

67. Sherr C. J., Roberts J. M. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression // Genes Dev. - 1999. - T. 13, № 12. - C. 1501-12.

68. Kaelin W. G., Jr. Functions of the retinoblastoma protein // Bioessays. - 1999. - T. 21, № 11. - C. 950-8.

69. Beijersbergen R. L., Bernards R. Cell cycle regulation by the retinoblastoma family of growth inhibitory proteins // Biochim Biophys Acta. - 1996. - T. 1287, № 2-3. - C. 103-20.

70. Cobrinik D. Regulatory interactions among E2Fs and cell cycle control proteins // Curr Top Microbiol Immunol. - 1996. - T. 208. - C. 31-61.

71. Qin X. Q., Livingston D. M., Ewen M., Sellers W. R., Arany Z., Kaelin W. G., Jr. The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action // Mol Cell Biol. -1995. - T. 15, № 2. - C. 742-55.

72. Kaelin W. G., Jr., Krek W., Sellers W. R., DeCaprio J. A., Ajchenbaum F., Fuchs C. S., Chittenden T., Li Y., Farnham P. J., Blanar M. A., et al. Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastoma-binding protein with E2F-like properties // Cell. -1992. - T. 70, № 2. - C. 351-64.

73. Kitagawa M., Higashi H., Suzuki-Takahashi I., Segawa K., Hanks S. K., Taya Y., Nishimura S., Okuyama A. Phosphorylation of E2F-1 by cyclin A-cdk2 // Oncogene. -1995. - T. 10, № 2. - C. 229-36.

74. DeGregori J., Leone G., Miron A., Jakoi L., Nevins J. R. Distinct roles for E2F proteins in cell growth control and apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1997. - T. 94, № 14. - C. 7245-50.

75. Henley S. A., Dick F. A. The retinoblastoma family of proteins and their regulatory functions in the mammalian cell division cycle // Cell Div. - 2012. - T. 7, № 1. - C. 10.

84

76. Morris E. J., Dyson N. J. Retinoblastoma protein partners // Adv Cancer Res. -2001. - T. 82. - C. 1-54.

77. Rubin S. M. Deciphering the retinoblastoma protein phosphorylation code // Trends Biochem Sci. - 2013. - T. 38, № 1. - C. 12-9.

78. Lundberg A. S., Weinberg R. A. Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes // Mol Cell Biol. - 1998. - T. 18, № 2. - C. 753-61.

79. Burke J. R., Deshong A. J., Pelton J. G., Rubin S. M. Phosphorylation-induced conformational changes in the retinoblastoma protein inhibit E2F transactivation domain binding // J Biol Chem. - 2010. - T. 285, № 21. - C. 16286-93.

80. Chow K. N., Dean D. C. Domains A and B in the Rb pocket interact to form a transcriptional repressor motif // Mol Cell Biol. - 1996. - T. 16, № 9. - C. 4862-8.

81. Hu Q. J., Dyson N., Harlow E. The regions of the retinoblastoma protein needed for binding to adenovirus E1A or SV40 large T antigen are common sites for mutations // The EMBO journal. - 1990. - T. 9, № 4. - C. 1147-1155.

82. Huang P. S., Patrick D. R., Edwards G., Goodhart P. J., Huber H. E., Miles L., Garsky V. M., Oliff A., Heimbrook D. C. Protein domains governing interactions between E2F, the retinoblastoma gene product, and human papillomavirus type 16 E7 protein // Mol Cell Biol. - 1993. - T. 13, № 2. - C. 953-60.

83. Dick F. A., Dyson N. pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities // Mol Cell. - 2003. - T. 12, № 3. - C. 639-49.

84. Narasimha A. M., Kaulich M., Shapiro G. S., Choi Y. J., Sicinski P., Dowdy S. F. Cyclin D activates the Rb tumor suppressor by mono-phosphorylation // Elife. - 2014. -T. 3.

85. Brehm A., Miska E. A., McCance D. J., Reid J. L., Bannister A. J., Kouzarides T. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription // Nature. -1998. - T. 391, № 6667. - C. 597-601.

86. Strobeck M. W., Knudsen K. E., Fribourg A. F., DeCristofaro M. F., Weissman B. E., Imbalzano A. N., Knudsen E. S. BRG-1 is required for RB-mediated cell cycle arrest // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - T. 97, № 14. - C. 7748-53.

87. Nielsen S. J., Schneider R., Bauer U. M., Bannister A. J., Morrison A., O'Carroll D., Firestein R., Cleary M., Jenuwein T., Herrera R. E., Kouzarides T. Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters // Nature. - 2001. - T. 412, № 6846. - C. 561 -5.

88. Grunstein M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription // Nature. - 1997. - T. 389, № 6649. - C. 349-52.

89. Zhang H. S., Dean D. C. Rb-mediated chromatin structure regulation and transcriptional repression // Oncogene. - 2001. - T. 20. - C. 3134.

90. Thomas D. M., Yang H. S., Alexander K., Hinds P. W. Role of the retinoblastoma protein in differentiation and senescence // Cancer Biol Ther. - 2003. - T. 2, № 2. - C. 124-30.

91. Manning A. L., Dyson N. J. pRB, a tumor suppressor with a stabilizing presence // Trends Cell Biol. - 2011. - T. 21, № 8. - C. 433-41.

92. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways // Nature. - 2008. - T. 455, № 7216. - C. 1061-8.

93. O'Connor M. J., Martin N. M., Smith G. C. Targeted cancer therapies based on the inhibition of DNA strand break repair // Oncogene. - 2007. - T. 26, № 56. - C. 781624.

94. Dyson N. J. RB1: a prototype tumor suppressor and an enigma // Genes & development. - 2016. - T. 30, № 13. - C. 1492-1502.

95. Luo R. X., Postigo A. A., Dean D. C. Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription // Cell. - 1998. - T. 92, № 4. - C. 463-73.

96. Gouyer V., Gazzeri S., Bolon I., Drevet C., Brambilla C., Brambilla E. Mechanism of retinoblastoma gene inactivation in the spectrum of neuroendocrine lung tumors // Am J Respir Cell Mol Biol. - 1998. - T. 18, № 2. - C. 188-96.

97. Shimizu E., Coxon A., Otterson G. A., Steinberg S. M., Kratzke R. A., Kim Y. W., Fedorko J., Oie H., Johnson B. E., Mulshine J. L., et al. RB protein status and clinical

correlation from 171 cell lines representing lung cancer, extrapulmonary small cell carcinoma, and mesothelioma // Oncogene. - 1994. - T. 9, № 9. - C. 2441-8.

98. Niederst M. J., Sequist L. V., Poirier J. T., Mermel C. H., Lockerman E. L., Garcia A. R., Katayama R., Costa C., Ross K. N., Moran T., Howe E., Fulton L. E., Mulvey H. E., Bernardo L. A., Mohamoud F., Miyoshi N., VanderLaan P. A., Costa D. B., Janne P. A., Borger D. R., Ramaswamy S., Shioda T., Iafrate A. J., Getz G., Rudin C. M., Mino-Kenudson M., Engelman J. A. RB loss in resistant EGFR mutant lung adenocarcinomas that transform to small-cell lung cancer // Nat Commun. - 2015. - T. 6. - C. 6377.

99. Bhateja P., Wildey G., Fu P., Lipka M. B., Ardeshir-Larijani F., Sharma N., Dowlati A. Retinoblastoma mutation to predict poor outcomes in non-small cell lung cancer (NSCLC) // Journal of Clinical Oncology. - 2017. - T. 35, № 15_suppl. - C. 90609060.

100. Bhateja P., Chiu M., Wildey G. Retinoblastoma mutation predicts poor outcomes in advanced non small cell lung cancer //. - 2019.10.1002/cam4.2023.

101. Ianari A., Natale T., Calo E., Ferretti E., Alesse E., Screpanti I., Haigis K., Gulino A., Lees J. A. Proapoptotic function of the retinoblastoma tumor suppressor protein // Cancer cell. - 2009. - T. 15, № 3. - C. 184-194.

102. Du W., Searle J. S. The rb pathway and cancer therapeutics // Curr Drug Targets. -2009. - T. 10, № 7. - C. 581-9.

103. Liu H., Knabb J. R., Spike B. T., Macleod K. F. Elevated poly-(ADP-ribose)-polymerase activity sensitizes retinoblastoma-deficient cells to DNA damage-induced necrosis // Mol Cancer Res. - 2009. - T. 7, № 7. - C. 1099-109.

104. Derenzini M., Donati G., Mazzini G., Montanaro L., Vici M., Ceccarelli C., Santini D., Taffurelli M., Trere D. Loss of retinoblastoma tumor suppressor protein makes human breast cancer cells more sensitive to antimetabolite exposure // Clin Cancer Res. - 2008. - T. 14, № 7. - C. 2199-209.

105. Agerbaek M., Alsner J., Marcussen N., Lundbeck F., von der Maase H. Retinoblastoma protein expression is an independent predictor of both radiation response and survival in muscle-invasive bladder cancer // British journal of cancer. -2003. - T. 89, № 2. - C. 298-304.

106. Weinberg R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control // Cell. - 1995. -T. 81, № 3. - C. 323-30.

107. Knudsen E. S., Knudsen K. E. Retinoblastoma tumor suppressor: where cancer meets the cell cycle // Exp Biol Med (Maywood). - 2006. - T. 231, № 7. - C. 1271-81.

108. Chen H. Z., Tsai S. Y., Leone G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control // Nat Rev Cancer. - 2009. - T. 9, № 11. - C. 785-97.

109. Beroukhim R., Mermel C. H., Porter D., Wei G., Raychaudhuri S., Donovan J., Barretina J., Boehm J. S., Dobson J., Urashima M., Mc Henry K. T., Pinchback R. M., Ligon A. H., Cho Y. J., Haery L., Greulich H., Reich M., Winckler W., Lawrence M. S., Weir B. A., Tanaka K. E., Chiang D. Y., Bass A. J., Loo A., Hoffman C., Prensner J., Liefeld T., Gao Q., Yecies D., Signoretti S., Maher E., Kaye F. J., Sasaki H., Tepper J. E., Fletcher J. A., Tabernero J., Baselga J., Tsao M. S., Demichelis F., Rubin M. A., Janne P. A., Daly M. J., Nucera C., Levine R. L., Ebert B. L., Gabriel S., Rustgi A. K., Antonescu C. R., Ladanyi M., Letai A., Garraway L. A., Loda M., Beer D. G., True L. D., Okamoto A., Pomeroy S. L., Singer S., Golub T. R., Lander E. S., Getz G., Sellers W. R., Meyerson M. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers // Nature. - 2010. - T. 463, № 7283. - C. 899-905.

110. Thomas D. M., Carty S. A., Piscopo D. M., Lee J. S., Wang W. F., Forrester W. C., Hinds P. W. The retinoblastoma protein acts as a transcriptional coactivator required for osteogenic differentiation // Mol Cell. - 2001. - T. 8, № 2. - C. 303-16.

111. Shew J. Y., Lin B. T., Chen P. L., Tseng B. Y., Yang-Feng T. L., Lee W. H. C-terminal truncation of the retinoblastoma gene product leads to functional inactivation // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1990. - T. 87, № 1. - C. 6-10.

112. Sherr C. J., McCormick F. The RB and p53 pathways in cancer // Cancer Cell. -2002. - T. 2, № 2. - C. 103-12.

113. Cano A., Pérez-Moreno M. A., Rodrigo I., Locascio A., Blanco M. J., del Barrio M. G., Portillo F., Nieto M. A. The transcription factor Snail controls epithelialmesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression // Nature Cell Biology. -2000. - T. 2. - C. 76.

114. Montserrat N., Gallardo A., Escuin D., Catasus L., Prat J., Gutierrez-Avigno F. J., Peiro G., Barnadas A., Lerma E. Repression of E-cadherin by SNAIL, ZEB1, and TWIST in invasive ductal carcinomas of the breast: a cooperative effort? // Human pathology. - 2011. - T. 42, № 1. - C. 103-110.

115. Vega S., Morales A. V., Ocana O. H., Valdes F., Fabregat I., Nieto M. A. Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death // Genes & development. -2004. - T. 18, № 10. - C. 1131-1143.

116. Wrighton K. H., Willis D., Long J., Liu F., Lin X., Feng X.-H. Small C-terminal domain phosphatases dephosphorylate the regulatory linker regions of Smad2 and Smad3 to enhance transforming growth factor-beta signaling // The Journal of biological chemistry. - 2006. - T. 281, № 50. - C. 38365-38375.

117. Kloet D. E., Polderman P. E., Eijkelenboom A., Smits L. M., van Triest M. H., van den Berg M. C., Groot Koerkamp M. J., van Leenen D., Lijnzaad P., Holstege F. C., Burgering B. M. FOXO target gene CTDSP2 regulates cell cycle progression through Ras and p21(Cip1/Waf1) // Biochem J. - 2015. - T. 469, № 2. - C. 289-98.

118. Kim V. N., Han J., Siomi M. C. Biogenesis of small RNAs in animals // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2009. - T. 10, № 2. - C. 126-39.

119. Han J., Denli A. M., Gage F. H. The enemy within: intronic miR-26b represses its host gene, ctdsp2, to regulate neurogenesis // Genes & development. - 2012. - T. 26, № 1. - C. 6-10.

120. Dang X., Ma A., Yang L., Hu H., Zhu B., Shang D., Chen T., Luo Y. MicroRNA-26a regulates tumorigenic properties of EZH2 in human lung carcinoma cells // Cancer Genet. - 2012. - T. 205, № 3. - C. 113-23.

121. Yano M., Toyooka S., Tsukuda K., Dote H., Ouchida M., Hanabata T., Aoe M., Date H., Gazdar A. F., Shimizu N. Aberrant promoter methylation of human DAB2 interactive protein (hDAB2IP) gene in lung cancers // Int J Cancer. - 2005. - T. 113, № 1. - C. 59-66.

122. Ku J. L., Kang S. B., Shin Y. K., Kang H. C., Hong S. H., Kim I. J., Shin J. H., Han I. O., Park J. G. Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene

expression in colorectal cancer cell lines // Oncogene. - 2004. - T. 23, № 40. - C. 673642.

123. Yanagawa N., Tamura G., Oizumi H., Takahashi N., Shimazaki Y., Motoyama T. Promoter hypermethylation of tumor suppressor and tumor-related genes in non-small cell lung cancers // Cancer Sci. - 2003. - T. 94, № 7. - C. 589-92.

124. Zabarovsky E. R., Lerman M. I., Minna J. D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers // Oncogene. -2002. - T. 21, № 45. - C. 6915-35.

125. Ganly P. S., Jarad N., Rudd R. M., Rabbitts P. H. PCR-based RFLP analysis allows genotyping of the short arm of chromosome 3 in small biopsies from patients with lung cancer // Genomics. - 1992. - T. 12, № 2. - C. 221-8.

126. Pandis N., Jin Y., Limon J., Bardi G., Idvall I., Mandahl N., Mitelman F., Heim S. Interstitial deletion of the short arm of chromosome 3 as a primary chromosome abnormality in carcinomas of the breast // Genes Chromosomes Cancer. - 1993. - T. 6, № 3. - C. 151-5.

127. Zheng Y. S., Zhang H., Zhang X. J., Feng D. D., Luo X. Q., Zeng C. W., Lin K. Y., Zhou H., Qu L. H., Zhang P., Chen Y. Q. MiR-100 regulates cell differentiation and survival by targeting RBSP3, a phosphatase-like tumor suppressor in acute myeloid leukemia // Oncogene. - 2012. - T. 31, № 1. - C. 80-92.

128. Beniaminov A. D., Krasnov G. S., Dmitriev A. A., Puzanov G. A., Snopok B. A., Senchenko V. N., Kashuba V. I. Interaction of two tumor suppressors: Phosphatase CTDSPL and Rb protein // Molecular Biology. - 2016. - T. 50, № 3. - C. 438-441.

129. Chakraborty C., Roychowdhury A., Samadder S., Roy A., Mandal R. K., Basu P., Roychoudhury S., Panda C. K. Association of P16-RBSP3 inactivation with phosphorylated RB1 overexpression in basal-parabasal layers of normal cervix unchanged during CACX development // Biochem J. - 2016. - T. 473, № 19. - C. 3221-36.

130. Justice J. F. t., Morgan R. W., Beemon K. L. Common Viral Integration Sites Identified in Avian Leukosis Virus-Induced B-Cell Lymphomas // MBio. - 2015. - T. 6, № 6. - C. e01863-15.

131. Winans S., Flynn A., Malhotra S., Balagopal V., Beemon K. L. Integration of ALV into CTDSPL and CTDSPL2 genes in B-cell lymphomas promotes cell immortalization, migration and survival //. - 2017. - T. 8, № 34. - C. 57302-57315.

132. Gurrieri C., Capodieci P., Bernardi R., Scaglioni P. P., Nafa K., Rush L. J., Verbel D. A., Cordon-Cardo C., Pandolfi P. P. Loss of the tumor suppressor PML in human cancers of multiple histologic origins // J Natl Cancer Inst. - 2004. - T. 96, № 4. - C. 269-79.

133. Bernardi R., Pandolfi P. P. Role of PML and the PML-nuclear body in the control of programmed cell death // Oncogene. - 2003. - T. 22, № 56. - C. 9048-57.

134. Giorgi C., Ito K., Lin H. K., Santangelo C., Wieckowski M. R., Lebiedzinska M., Bononi A., Bonora M., Duszynski J., Bernardi R., Rizzuto R., Tacchetti C., Pinton P., Pandolfi P. P. PML regulates apoptosis at endoplasmic reticulum by modulating calcium release // Science. - 2010. - T. 330, № 6008. - C. 1247-51.

135. Bernardi R., Guernah I., Jin D., Grisendi S., Alimonti A., Teruya-Feldstein J., Cordon-Cardo C., Simon M. C., Rafii S., Pandolfi P. P. PML inhibits HIF-1alpha translation and neoangiogenesis through repression of mTOR // Nature. - 2006. - T. 442, № 7104. - C. 779-85.

136. Alcalay M., Tomassoni L., Colombo E., Stoldt S., Grignani F., Fagioli M., Szekely L., Helin K., Pelicci P. G. The promyelocytic leukemia gene product (PML) forms stable complexes with the retinoblastoma protein // Molecular and cellular biology. -1998. - T. 18, № 2. - C. 1084-1093.

137. Liao P., Wang W., Li Y., Wang R., Jin J., Pang W., Chen Y., Shen M., Wang X., Jiang D., Pang J., Liu M., Lin X., Feng X. H., Wang P., Ge X. Palmitoylated SCP1 is targeted to the plasma membrane and negatively regulates angiogenesis //. - 2017. - T. 6.

138. Shi Y. Serine/threonine phosphatases: mechanism through structure // Cell. - 2009. - T. 139, № 3. - C. 468-84.

139. Alonso A., Sasin J., Bottini N., Friedberg I., Friedberg I., Osterman A., Godzik A., Hunter T., Dixon J., Mustelin T. Protein tyrosine phosphatases in the human genome // Cell. - 2004. - T. 117, № 6. - C. 699-711.

140. Brognard J., Sierecki E., Gao T., Newton A. C. PHLPP and a second isoform, PHLPP2, differentially attenuate the amplitude of Akt signaling by regulating distinct Akt isoforms // Mol Cell. - 2007. - T. 25, № 6. - C. 917-31.

141. Mumby S. M. Reversible palmitoylation of signaling proteins // Curr Opin Cell Biol. - 1997. - T. 9, № 2. - C. 148-54.

142. Ayad N. G., Rankin S., Murakami M., Jebanathirajah J., Gygi S., Kirschner M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC // Cell. - 2003. -T. 113, № 1. - C. 101-13.

143. Su Y. A., Lee M. M., Hutter C. M., Meltzer P. S. Characterization of a highly conserved gene (OS4) amplified with CDK4 in human sarcomas // Oncogene. - 1997. -T. 15, № 11. - C. 1289-94.

144. Reifenberger G., Ichimura K., Reifenberger J., Elkahloun A. G., Meltzer P. S., Collins V. P. Refined mapping of 12q13-q15 amplicons in human malignant gliomas suggests CDK4/SAS and MDM2 as independent amplification targets // Cancer Res. -1996. - T. 56, № 22. - C. 5141-5.

145. Ping Y., Deng Y., Wang L., Zhang H., Zhang Y., Xu C., Zhao H., Fan H., Yu F., Xiao Y., Li X. Identifying core gene modules in glioblastoma based on multilayer factor-mediated dysfunctional regulatory networks through integrating multidimensional genomic data // Nucleic Acids Res. - 2015. - T. 43, № 4. - C. 1997-2007.

146. Venkataramani V., Tanev D. I., Strahle C., Studier-Fischer A., Fankhauser L., Kessler T., Korber C., Kardorff M., Ratliff M., Xie R., Horstmann H., Messer M., Paik S. P., Knabbe J., Sahm F., Kurz F. T., Acikgoz A. A., Herrmannsdorfer F., Agarwal A., Bergles D. E., Chalmers A., Miletic H., Turcan S., Mawrin C., Hanggi D., Liu H.-K., Wick W., Winkler F., Kuner T. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression // Nature. - 2019. - T. 573, № 7775. - C. 532-538.

147. Zeng Q., Michael I. P., Zhang P., Saghafinia S., Knott G., Jiao W., McCabe B. D., Galvan J. A., Robinson H. P. C., Zlobec I., Ciriello G., Hanahan D. Synaptic proximity enables NMDAR signalling to promote brain metastasis // Nature. - 2019. - T. 573, № 7775. - C. 526-531.

148. Zhang L., He X., Li F., Pan H., Huang X., Wen X., Zhang H., Li B., Ge S., Xu X., Jia R., Fan X. The miR-181 family promotes cell cycle by targeting CTDSPL, a phosphatase-like tumor suppressor in uveal melanoma // J Exp Clin Cancer Res. - 2018. - T. 37, № 1. - C. 15.

149. Derheimer F. A., Chang C. W., Ljungman M. Transcription inhibition: a potential strategy for cancer therapeutics // Eur J Cancer. - 2005. - T. 41, № 16. - C. 2569-76.

150. Lam L. T., Pickeral O. K., Peng A. C., Rosenwald A., Hurt E. M., Giltnane J. M., Averett L. M., Zhao H., Davis R. E., Sathyamoorthy M., Wahl L. M., Harris E. D., Mikovits J. A., Monks A. P., Hollingshead M. G., Sausville E. A., Staudt L. M. Genomic-scale measurement of mRNA turnover and the mechanisms of action of the anti-cancer drug flavopiridol // Genome Biol. - 2001. - T. 2, № 10. - C. Research0041.

151. Stellrecht C. M., Chen L. S. Transcription inhibition as a therapeutic target for cancer // Cancers (Basel). - 2011. - T. 3, № 4. - C. 4170-90.

152. Morachis J. M., Huang R., Emerson B. M. Identification of kinase inhibitors that target transcription initiation by RNA polymerase II // Oncotarget. - 2011. - T. 2, № 12. - C. 18-28.

153. Travis W. D., Brambilla E., Nicholson A. G., Yatabe Y., Austin J. H. M., Beasley M. B., Chirieac L. R., Dacic S., Duhig E., Flieder D. B., Geisinger K., Hirsch F. R., Ishikawa Y., Kerr K. M., Noguchi M., Pelosi G., Powell C. A., Tsao M. S., Wistuba I. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification // J Thorac Oncol. - 2015. - T. 10, № 9. - C. 1243-1260.

154. Ivics Z., Izsvak Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering // Mob DNA. - 2010. - T. 1, № 1. - C. 25.

155. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. - 2001. - T. 25, № 4. - C. 402-8.

156. Souza P. P., Völkel P., Trinel D., Vandamme J., Rosnoblet C., Heliot L., Angrand P.-O. The histone methyltransferase SUV420H2 and Heterochromatin Proteins HP1

interact but show different dynamic behaviours // BMC cell biology. - 2009. - T. 10. -C. 41-41.

157. Joaquin M., Watson R. J. The cell cycle-regulated B-Myb transcription factor overcomes cyclin-dependent kinase inhibitory activity of p57(KIP2) by interacting with its cyclin-binding domain // J Biol Chem. - 2003. - T. 278, № 45. - C. 44255-64.

158. Kim S., Kim T. M., Kim D. W., Go H., Keam B., Lee S. H., Ku J. L., Chung D. H., Heo D. S. Heterogeneity of genetic changes associated with acquired crizotinib resistance in ALK-rearranged lung cancer // J Thorac Oncol. - 2013. - T. 8, № 4. - C. 415-22.

159. Fabian K., Nemeth Z., Furak J., Tiszlavicz L., Papay J., Krenacs T., Timar J., Moldvay J. Protein expression differences between lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma with brain metastasis // Anticancer Res. - 2014. - T. 34, № 10. - C. 5593-7.

160. Croce M. V., Colussi A. G., Price M. R., Segal-Eiras A. Identification and characterization of different subpopulations in a human lung adenocarcinoma cell line (A549) // Pathol Oncol Res. - 1999. - T. 5, № 3. - C. 197-204.

161. Knudsen E. S., Wang J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation // Molecular and cellular biology. - 1997. - T. 17, № 10. - C. 5771-5783.

162. Kitagawa M., Higashi H., Jung H. K., Suzuki-Takahashi I., Ikeda M., Tamai K., Kato J., Segawa K., Yoshida E., Nishimura S., Taya Y. The consensus motif for phosphorylation by cyclin D1-Cdk4 is different from that for phosphorylation by cyclin A/E-Cdk2 // The EMBO journal. - 1996. - T. 15, № 24. - C. 7060-7069.

163. Gius D. R., Ezhevsky S. A., Becker-Hapak M., Nagahara H., Wei M. C., Dowdy S. F. Transduced p16&lt;sup&gt;INK4a&lt;/sup&gt; Peptides Inhibit Hypophosphorylation of the Retinoblastoma Protein and Cell Cycle Progression Prior to Activation of Cdk2 Complexes in Late G&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt // Cancer Research. - 1999. - T. 59, № 11. - C. 2577.

164. Rubin S. M., Gall A. L., Zheng N., Pavletich N. P. Structure of the Rb C-terminal domain bound to E2F1-DP1: a mechanism for phosphorylation-induced E2F release // Cell. - 2005. - T. 123, № 6. - C. 1093-106.

165. Zarkowska T., Mittnacht S. Differential phosphorylation of the retinoblastoma protein by G1/S cyclin-dependent kinases // J Biol Chem. - 1997. - T. 272, № 19. - C. 12738-46.

166. Krasnov G. S., Dmitriev A. A., Melnikova N. V., Zaretsky A. R., Nasedkina T. V., Zasedatelev A. S., Senchenko V. N., Kudryavtseva A. V. CrossHub: a tool for multi-way analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) in the context of gene expression regulation mechanisms // Nucleic Acids Res. - 2016. - T. 44, № 7. - C. e62.

167. Dambal S., Shah M., Mihelich B., Nonn L. The microRNA-183 cluster: the family that plays together stays together // Nucleic Acids Res. - 2015. - T. 43, № 15. - C. 7173-88.

168. Ren L. H., Chen W. X., Li S., He X. Y., Zhang Z. M., Li M., Cao R. S., Hao B., Zhang H. J., Qiu H. Q., Shi R. H. MicroRNA-183 promotes proliferation and invasion in oesophageal squamous cell carcinoma by targeting programmed cell death 4 // British journal of cancer. - 2014. - T. 111, № 10. - C. 2003-2013.

169. Kundu S. T., Byers L. A., Peng D. H., Roybal J. D., Diao L., Wang J., Tong P., Creighton C. J., Gibbons D. L. The miR-200 family and the miR-183~96~182 cluster target Foxf2 to inhibit invasion and metastasis in lung cancers // Oncogene. - 2016. - T. 35, № 2. - C. 173-86.

170. Liu B., Wu X., Liu B., Wang C., Liu Y., Zhou Q., Xu K. MiR-26a enhances metastasis potential of lung cancer cells via AKT pathway by targeting PTEN // Biochim Biophys Acta. - 2012. - T. 1822, № 11. - C. 1692-704.

171. Lin G., Liu B., Meng Z., Liu Y., Li X., Wu X., Zhou Q., Xu K. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3beta in human lung cancer cells // Exp Cell Res. - 2017. - T. 352, № 2. - C. 364-374.

172. Krasnov G. S., Puzanov G. A., Kudryavtseva A. V., Dmitriev A. A., Beniaminov A. D., Kondratieva T. T., Senchenko V. N. [Differential expression of an ensemble of

the key genes involved in cell-cycle regulation in lung cancer] // Mol Biol (Mosk). -2017. - T. 51, № 5. - C. 849-856.

173. Beniaminov A. D., Krasnov G. S., Dmitriev A. A., Puzanov G. A., Snopok B. A., Senchenko V. N., Kashuba V. I. [Interaction of two tumor suppressors: Phosphatase CTDSPL and Rb protein] // Mol Biol (Mosk). - 2016. - T. 50, № 3. - C. 504-8.

174. Mitra S., Mazumder Indra D., Bhattacharya N., Singh R. K., Basu P. S., Mondal R. K., Roy A., Zabarovsky E. R., Roychoudhury S., Panda C. K. RBSP3 is frequently altered in premalignant cervical lesions: clinical and prognostic significance // Genes Chromosomes Cancer. - 2010. - T. 49, № 2. - C. 155-70.

175. Kashuba V. I., Pavlova T. V., Grigorieva E. V., Kutsenko A., Yenamandra S. P., Li J., Wang F., Protopopov A. I., Zabarovska V. I., Senchenko V., Haraldson K., Eshchenko T., Kobliakova J., Vorontsova O., Kuzmin I., Braga E., Blinov V. M., Kisselev L. L., Zeng Y. X., Ernberg I., Lerman M. I., Klein G., Zabarovsky E. R. High mutability of the tumor suppressor genes RASSF1 and RBSP3 (CTDSPL) in cancer // PLoS One. - 2009. - T. 4, № 5. - C. e5231.

176. Sinha S., Singh R. K., Alam N., Roy A., Roychoudhury S., Panda C. K. Frequent alterations of hMLH1 and RBSP3/HYA22 at chromosomal 3p22.3 region in early and late-onset breast carcinoma: clinical and prognostic significance // Cancer Sci. - 2008. -T. 99, № 10. - C. 1984-91.

177. Knudsen E. S., Wang J. Y. Differential regulation of retinoblastoma protein function by specific Cdk phosphorylation sites // J Biol Chem. - 1996. - T. 271, № 14. - C. 8313-20.

178. Dmitriev A. A., Kashuba V. I., Haraldson K., Senchenko V. N., Pavlova T. V., Kudryavtseva A. V., Anedchenko E. A., Krasnov G. S., Pronina I. V., Loginov V. I., Kondratieva T. T., Kazubskaya T. P., Braga E. A., Yenamandra S. P., Ignatjev I., Ernberg I., Klein G., Lerman M. I., Zabarovsky E. R. Genetic and epigenetic analysis of non-small cell lung cancer with NotI-microarrays // Epigenetics. - 2012. - T. 7, № 5. -C. 502-13.

179. Li P., Sheng C., Huang L., Zhang H., Huang L., Cheng Z., Zhu Q. MiR-183/-96/-182 cluster is up-regulated in most breast cancers and increases cell proliferation and migration // Breast Cancer Res. - 2014. - T. 16, № 6. - C. 473.

180. Ma Y., Liang A. J., Fan Y. P., Huang Y. R., Zhao X. M., Sun Y., Chen X. F. Dysregulation and functional roles of miR-183-96-182 cluster in cancer cell proliferation, invasion and metastasis // Oncotarget. - 2016. - T. 7, № 27. - C. 4280542825.

181. Liang N., Zhou X., Zhao M., Zhao D., Zhu Z., Li S., Yang H. Down-regulation of microRNA-26b modulates non-small cell lung cancer cells chemoresistance and migration through the association of PTEN // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). -2015. - T. 47, № 7. - C. 530-8.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своему научному руководителю Вере Николаевне Сенченко за помощь в написании статей, критические замечания и содействие на всех этапах работы. Также автор выражает глубокую благодарность Егору Евгеньевичу Егорову и Хаве Александровне Вишняковой за помощь в работе с культивированием клеток и подсчетом скорости роста клонов, а также Эрдему Баировичу Дашинимаеву за помощь в трансфекции и сортинге клеток. Автор выражает благодарность Георгию Сергеевичу Краснову за помощь и предоставление данных биоинформатического анализа, полученных при помощи оригинальной программы СгоБвНиЬ. Автор признателен Артемию Давидовичу Бениаминову за ценные советы при планировании экспериментов и обсуждение результатов. Сотрудникам НМИЦ онкологии им. Блохина и Татьяне Тихоновне Кондратьевой за предоставленные первичные образцы опухолей. Автор также выражает благодарность заведующей лаборатории структурно-функциональной геномики Людмиле Юрьевне Фроловой за оказанную поддержку и всем сотрудникам лаборатории за дружественную обстановку.