Роль микроРНК miR-204-5p в ремоделировании внутренних органов мышей С57Bl6 с трансплантированной меланомой В16 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Земцов Данил Сергеевич

• Земцов Данил Сергеевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Земцов Данил Сергеевич

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Актуальные проблемы противоопухолевой терапии

1.2. Роль опухолевого микроокружения в метастазировании

1.3. Формирование преметастатических ниш

1.4 Экспериментальная противоопухолевая терапия на основе применения

антисмысловых олигонуклеотидов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Дизайн исследования

2.2 Культивирование клеток меланомы и имплантация опухоли

2.3 Ингибирование микроРНК miR-204-5p in vivo

2.4 Оценка динамики роста опухоли

2.5 Окончание эксперимента и выделение органов

2.6 Иммуногистохимическое исследование

2.7 Выделение микроРНК, мРНК, постановка реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени

2.8. Иммуноцитохимическое исследование

2.9. Анализ миграционной активности (scratch-test) после воздействия ингибитора miR-204-5-p

2.8 Профилирование мРНК

2.9 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Оценка динамики опухолевого роста

3.2 Оценка уровня Ki-67 в ткани опухоли меланомы

3.3 Анализ миграционной активности после воздействия ингибитора ш1Я-204-5-р

3.4 Определение уровня экспрессии ш1Я-204-5р и ш1Я-211-5р в тканях опухоли и органах мишенях (печень, легкие) после воздействия ингибитором ш1Я-204-5р

3.5 Оценка уровня экспрессии генов-мишеней ш1Я-204-5р БШТ1 и БСЬ2 в опухолевом узле и тканях печени и легких на фоне воздействия ингибитором ш1Я-204-5р

3.6 Определение уровня СЭ3+ и СЭ8+ клеток в тканях органов-мишеней метастазирования меланомы В16

3.7 Профилирование мРНК ткани легких мышей с трансплантированной меланомой В16 после введения ингибитора ш1Я-204-5р

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

AP-1 - активирующий белок-1

BRAF -серин/треониновая протеинкиназа B-raf

CD31 (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки

COX2 - циклооксигеназа-2

CTLA-4 - цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 FDA - ассоциация пищевых продуктов и медикаментов США FGFs - факторы роста фибробластов

HIF1a, HIF2a - гипоксия индуцибельный фактор 1а, гипоксия индуцибельный фактор 2а,

IFN-а - интерферон-альфа IL-2- интерлейкин-2 miR - микроРНК

MITF - меланоцит-индуцирующий р транскрипционный фактор NGS - секвенирование нового поколения

NK-клетки - иммунные клетки-киллеры, цитотоксические лимфоциты

PD-L1 - лиганд запрограммированной гибели клеток-1

TGFP - трансформирующий фактор роста бета

TME (Tumor microenvironment) - опухолевое микроокружение

Treg - регуляторные Т-клетки

VEGF (vascular endothelial growth factor) - фактор роста сосудистого эндотелия

a -SMA ^lpha-smooth muscle actin) - альфа-актин гладких мышц

ААТ - антиангиогенная терапия

АСО - антисмысловые олигонуклеотиды

АФК - активные формы кислорода

ВМ- васкулогенная мимикрия

ИЛ - интерлейкин

МАРК (mitogen-activated protein kinase kinase) - внутриклеточный сигнальный путь митоген-активированных протеинкиназ

МК - меланома кожи

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

нкРНК - некодирующая рибонуклеиновая кислота

ОСК - опухолевые стволовые клетки

ПН - преметастатические ниши

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР КГ - ПЦР с обратной транскрипцией

ТАМ - опухоль-ассоциированные макрофаги

ЭМ - экстрацеллюлярный матрикс

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль микроРНК miR-204-5p в ремоделировании внутренних органов мышей С57Bl6 с трансплантированной меланомой В16»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Меланома кожи (МК) - злокачественное новообразование кожи с высоким уровнем гетерогенности и устойчивостью к современной противоопухолевой терапии (Имянитов Е.Н., 2012; Ning N. 2020). Несмотря на успехи в области создания новых терапевтических стратегий в отношении лечения опухоли, заболевание остается потенциально смертельным злокачественным новообразованием (Ahmed B. 2020 Watt K. et al., 2020). Меланома кожи составляет от 5% до 10% среди выявленных злокачественных новообразований кожи, но из всех случаев онкологических заболеваний кожи, на меланому кожи приходится более 80% смертельных исходов (Watt K. et al., 2020).

Меланома кожи характеризуется значительными генетическими и эпигенетическими изменениями, включая выраженные нарушения экспрессии и функционирования некодирующих РНК. Ранее было определено, что микроРНК miR-204-5p относится к одной из наименее экспрессируемых микроРНК при меланоме (Komina A. et al., 2016). Установлено, что низкие уровни miR-204-5p ассоциированы с высокоагрессивным фенотипом опухоли (Hong BS. et al., 2019). Вместе с тем, повышенная экспрессия miR-204-5p увеличивает способность к миграции, инвазии и метастазированию клеток рака молочной железы (Hong BS. et al., 2019). miR-204-5p и miR-211-5p, являющиеся гомологами, экспрессируются в зависимости от фенотипа клеток меланомы и связаны с различными процессами: в клетках меланомы, бедных пигментом меланином, экспрессируется miR-204-5p и участвует в подавлении клеточной подвижности; miR-211-5p экспрессируется в клетках меланомы, богатых меланином и опосредует повышение пигментации и дифференцировки клеток. Высокие уровни miR-204-5p и miR-211-5p в клетках меланомы связывают, с одной стороны, с онкосупрессорной функцией, с другой стороны - эти

микроРНК ассоциированы с резистентностью к селективным ингибиторам BRAF (Vitiello M. et al., 2017).

Диссеминированная форма меланома кожи характеризуется высокой летальностью - медиана выживаемости пациентов не превышает 9 месяцев на фоне лечения стандартными методами химиотерапии (Maverakis E. et al., 2015). По данным на 1 марта 2019 года, меланома находится на двадцатом месте по распространённости видов злокачественных новообразований в мире, с 287723 новых случаев в 2018 году с прогнозом до 466914 случаев в 2040 году. Средняя заболеваемость меланомой составляет 12.7 тысяч на 100 тыс. человек. Меланома является причиной более 60 тысяч смертей в год в мире (Bray F. et al., 2018).

Ранее изучено, что органы-мишени метастазирования МК динамично изменяются под действием первичной опухоли раньше, чем произошла диссеминация опухолевых клеток и формирование метастазов в них (Peinado H. et al., 2017). Для обеспечения этого процесса первичная опухоль секретирует экстраклеточные везикулы, которые содержат многочисленные белки, РНК, выполняющие, в свою очередь, важные функции, в том числе, такие как взаимодействие между клетками, избегание эффектов иммунной системы, способствуя формированию так называемого опухолевого микроокружения (ОП) в органах-мишенях, и дальнейшей инвазии опухолевых клеток в эти ткани (Mannavola F. et al., 2016).

Таким образом, микроРНК могут выступать в роли модуляторов опухолевой прогрессии, регулируя экспрессию генов, ассоциированных с канцерогенезом (Peng Y., 2016).

Цель исследования

Определить изменения в опухоли и органах-мишенях метастазирования после введения ингибитора miR-204-5p на модели меланомы in vivo.

Задачи исследования

1. Определить уровни экспрессии микроРНК miR-204-5p и miR-211-5p в клетках меланомы и паренхиматозных органов - мишеней метастазирования меланомы после введения ингибитора miR-204-5p микроРНК;

2. Определить уровни экспрессии генов-мишеней miR-204-5p в клетках меланомы и паренхиматозных органов - мишеней метастазирования меланомы после введения ингибитора miR-204-5p;

3. Осуществить анализ динамики роста опухоли после ингибирования miR -204-5p;

4. Оценить выраженность изменений характера лимфоцитарной инфильтрации в органах-мишенях метастазирования меланомы на фоне воздействия ингибитором miR-204-5p;

5. Оценить профиль экспрессии мРНК в легких мышей с меланомой В16 после экспериментальной терапии ингибитором miR-204-5p.

Научная новизна

1. Впервые осуществлена экспериментальная терапия меланомы посредством системного введения селективного ингибитора микроРНК miR-204-5p на основе антисмысловых олигонуклеотидов с замкнутыми нуклеиновыми кислотами.

2. Впервые показано, что гены SIRT1 и BCL-2 являются функциональными генами-мишенями miR-204-5p в клетках легких и печени в модели меланомы B16 in vivo.

3. Впервые показано, что при парентеральном введении ингибитора микроРНК miR-204-5p в легких животных с трансплантированной меланомой В16 происходит усиление экспрессии генов - компонентов механизмов передачи сигнала, связанных с активацией иммунной системы и провоспалительных факторов.

Теоретическая и практическая значимость

1. Использование антисмысловых олигонуклеотидов - синтетических аналогов микроРНК может быть применено для управления процессом метастазирования в органах-мишенях метастазирования меланомы in vivo и в дальнейшем рассмотрено как возможный терапевтический подход при диссеминированных формах злокачественных новообразований.

2. Ингибирование miR-204-5p вызывает изменение провоспалительных механизмов внутриклеточной сигнализации во внутренних органах, что может быть применено для регуляции иммунопатологических процессов.

Методология и методы исследования

Работа носит экспериментальный характер. Для достижения обозначенных ранее задач были выполнены следующие лабораторно-инструментальные исследования: проведен экспрессионный анализ на основе ПЦР в реальном времени с определением уровня экспрессии микроРНК и генов-мишеней; иммуногистохимическое исследование; микрочипирование с определением профиля мРНК. Объектами исследования мыши линии C57Bl6 c трансплантированной меланомой В16 на фоне парентерального введения

ингибитора микроРНК miR-204-5p в качестве опытной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение специфического ингибитора микроРНК miR-204-5p in vivo вызывает изменение экспрессии данной микроРНК в легких, а генов-мишеней miR-204-5p BCL2 и SIRT1 в легких и печени - органах, характеризующихся частым поражением клетками меланомы в процессе метастазирования.

2. В ткани легких и печени происходит снижение уровней экспрессии микроРНК miR-204-5p, которая оказывает неканонические эффекты на гены-мишени - приводит к снижению экспрессии генов BCL2 и SIRT1.

3. При снижении уровня экспрессии микроРНК miR-204-5p наблюдается повышение пролиферации клеток меланомы in vitro, а также происходят изменения в легких, характерные для активации иммунной системы и фибробластов.

4. Вне зависимости от уровня экспрессии микроРНК miR-204-5p метастазирование меланомы В16 сопряжено с перепрограммированием органов-мишеней - и в легких, и в печени при метастазировании происходит повышение уровня фактора сосудистого роста (VEGFA), в печени - альфа-актина гладких мышц (SMA-a), кластера дифференцировки 31 (CD31), что свидетельствует об изменении выраженности ангиогенеза, активации фибробластов.

Степень достоверности и апробация результатов

Применение современных и точных методов исследования и диагностики, большой объём экспериментального материала и проведение адекватного статистического анализа, свидетельствует о высокой достоверности выполненной работы. Все результаты были подвергнуты современному статистическому анализу. Материалы и результаты исследования представлены

и обсуждены на XXII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2019 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 5 работ опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов исследований работ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, а так же списка литературы, который включает 217 источников, из них 11 отечественных источника и 206 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 рисунками, 4 таблицами.

Личный вклад соискателя

Автор разработал дизайн исследования, лично проводил эксперименты с животными, культивирование клеток и имплантацию животным, выделение органокомплекса животных, провел биоинформатический анализ, ПЦР в реальном времени, совместно с коллегами выполнил иммуногистохимические исследования, самостоятельно провел обзор зарубежной и отечественной литературы. По итогам полученных результатов провел статическую обработку и осуществил написание статей по теме диссертации и написание самой диссертационной работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Проблемы системной терапии

Для лечения диссеминированных форм меланомы кожи применяются химиотерапевтические средства хотя их эффективность недостаточна (Davies H. et al., 2002; Atkins M.B. et al., 2008). На ранних стадиях заболевания эффективная терапия новообразования заключается в хирургическом лечении. Резекция новообразования в пределах здоровых тканей приводит к полному выздоровлению, но такой метод малоэффективен в отношении диссеминированной формы МК, поэтому и по настоящее время, диссеминированные формы МК остаются одной из главных проблем современной онкологии. Пятилетняя выживаемость пациентов с МК III стадии составляет 50%, а у пациентов с IV стадией этот показатель значительно ниже и составляет всего 10-20% (Чулкова С.В. и др., 2019; Ascierto, P. A. Et al., 2014). Стандартным подходом до 2011 года считалось применение цитостатического препарата дакарбазин в комбинации с иммунотерапией интерфероном-альфа (IFN-a) . Этот вариант терапии не был достаточно эффективен и сопровождался развитием выраженных токсических явлений (Орлова К.В. и др., 2016). Такая терапия плохо переносилась больными и давала много побочных эффектов. Оценка эффективности низких доз интерферона не показала существенного различия общей и безрецидивной выживаемости в сравниваемых группах больных с хирургическим методом лечения: 5-летняя безрецидивная выживаемость в группе больных, получавших интерферон в малых дозах, составила 28,3% (22,4%-34,5%), в контрольной группе - 29,2% (23,1%-35,5%) (р=0,47), общая выживаемость - соответственно 35,9% и 38,5% (р=0,73) (Bray F. et al., 2018). IFN-a представляет собой белок, в основном вырабатываемый эндогенно макрофагами человека, и известен своей противовирусной и противоопухолевой активностью. Это единственный белок, который

продемонстрировал некоторые положительные терапевтические эффекты в группе пациентов с МК (ТИеоШороШоБ Л.М е1 а1., 2005). Побочные эффекты, возникающие при лечении, усиливаются и создают финансовую нагрузку для пациентов, когда он используется совместно с химиотерапевтическими препаратами (МооеШп Б. е1 а1., 2010). Другой препарат иммунной терапии интерлейкин-2 (1Ь-2). 1Ь-2 обладает комплексными биологическими эффектами и оказывает противоопухолевое действие, усиливая лизис цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров. Внутривенное введение высоких доз ГЬ-2 (100-150x106 МЕ/м2/сут) более токсично, чем низких доз (106 МЕ/м2/сут) (КогеШ J. е1 а1., 2014; Оио I. е1 а1., 2015). Подкожное введение IL-2 менее токсично, чем внутривенная инфузия ^ио J. et а1., 2015). Внутривенная струйная инфузия, в свою очередь, более токсична, чем внутривенное капельное введение и характеризуется развитием синдрома повышенной проницаемости капилляров и гриппоподобных симптомов в качестве побочных эффектов ^ио J. е1 а1., 2015). На настоящий момент ассоциация по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрила Ш№а и ГЬ-2 в качестве адъювантной терапии при злокачественной меланоме ^ио J. е1 а1., 2015; Ка1аНе 1.1. е1 а1., 2017).

Открытие группой британских ученых из Сангеровского института мутации в гене БЯЛЕ в 2002 году стало предпосылкой к существенному успеху целенаправленной (таргетной) терапии меланомы (Вау1еБ Н. е1 а1., 2002). Эта мутация играет ключевую роль в активации сигнального каскада митоген-активированных протеинкиназ (МАРК) и выявляется у 50% больных с МК (БашоШ М., е1 а1. 2004; МаШопаёо, 1Ъ. е1 а1., 2003). Одной из основных мутаций' в гене БЯЛЕ при меланоме кожи является У600Е - эта мутация характеризуется заменой валина на глутаминовую кислоту в шестисотом кодоне, что ведет за собой увеличение активности белка БЯЛЕ, который непосредственно взаимодействует с киназой МЕК в сигнальном пути МАРК. По литературным данным известно и о других видах мутаций в гене БЯЛЕ, У600К, У600Я

uV600D, но которые встречаются значительно реже (Орлова К.В., и др. 2016). После обнаружения данной мутации появилась надежда на новые успехи в терапии МК и в 2008 году было разработано лекарственное вещество PLX4032, действие которого заключается в индукции апоптоза клеток меланомы в BRAF-позитивных опухолях (Tsai J. et al., 2008). Как отмечено выше, до 2011 года золотым стандартом являлась терапия на основе цитостатических средств и интерферона-а. Применение лекарственных препаратов на основе BRAF-ингибиторов позволило добиться увеличения общей выживаемости пациентов и на 56% снизить летальность по сравнению с применением дакарбазина и производных интерферона. Кроме того, вемурафениб на 74% снижал риск прогрессирования заболевания (McArthur G.A. et al., 2014). Однако несмотря на такие обнадеживающие результаты, в скором времени стало очевидно, что у 50% пациентов на фоне терапии ингибиторами BRAF через 6-7 месяцев после начала лечения вновь развивается прогрессирование заболевания, появляется резистентность приобретенного характера (McArthur G.A. et al., 2014; Орлова К.В. и др., 2016).

Детальное изучение механизмов возникновения резистентности, выявленных в начале лечения и при прогрессировании заболевания, определило широкий спектр генетических измененийпримерно у 51 -58% пациентов с диссеминированной BRAF V600-позитивной меланомой, получавших вемурафениб. Эти генетические изменения в основном были связаны с реактивацией сигнального каскада MAPK (RAS/RAF/MEK/ERK сигнальный путь) (Amaral T. et al., 2017; Hugo W. et al., 2015; Johnson D.B. et al., 2015; Wagle N. et al., 2014). Стоит отметить, что в некоторых случаях появление резистентности не может быть полностью объяснено известными генетическими механизмами (Hugo W. et al., 2015). Активация других киназ сигнального пути MAPK, а именно киназы MEK, которая находится ниже BRAF в каскаде MAPK, была расценена как одна из причин развития резистентности к BRAF-ингибиторам. Применение препаратов на основе

ингибитора МЕК показало улучшение выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости при BRAF У600-позитивной меланоме (включающей как V600E, так и V600K мутации) (Falchook G.S. et al., 2012; Flaherty K.T. et al., 2012.). Известно, что ингибирование МЕК может способствовать преодолению некоторых механизмов резистентности, однако проблемы токсичности ограничили использование ингибиторов МЕК, так как применение МЕК вынуждает либо снижать дозы, либо вовсе прерывать лечение (Gray-Schopfer V. et al., 2007). Сочетание BRAF и МЕК ингибиторов показало лучшую выживаемость, чем применение монотерапии, но такая комбинация также ограниченна токсическими эффектами, вплоть до летальных исходов на фоне развивавшихся сердечной и почечной недостаточности (Moriceau, G. et al., 2015). В 2014 году группой американских ученых были предложены новые способы определения факторов резистентности посредством РНК-секвенирования, что на сегодняшний день представляет собой ставший стандартным, высокочувствительный и точный инструмент для изучения траскриптома (Wagle N. et al., 2014).

Патогенетический подход, нацеленный на одновременное блокирование эффектов мутации генов BRAF и МЕК, казался обоснованным и очень перспективным способом повышения эффективности терапии заболевания. Тем не менее, эффективность данной терапии у многих пациентов ограничена в среднем шестью месяцами из-за развития резистентности и токсических эффектов. Таким образом, сохраняется актуальность поиска новых терапевтических мишеней. В настоящее время ведущим направлением персонализированной медицины является разработка таргетных методов терапии, а также лечения, основанного на узкоспецифическом воздействии в очаге поражения с наименьшими побочными эффектами для макроорганизма. Одним из весьма перспективных экспериментальных исследований в данном отношении является направленное воздействие на молекулярные мишени,

включая эпигенетические клеточные регуляторы, к которым относятся микроРНК.

1.2 Роль опухолевого микроокружения в метастазировании

Опухолевое микроокружение (TME) образуется путем взаимодействия опухолевых клеток и здоровых (нормальных) клеток различных органов и тканей (Олейник Е.К., и соавт., 2020). Результаты исследований свидетельствуют, что первичная опухоль перепрограммирует микроокружение, способствуя быстрой диссеминации в ближайшие и отдаленные органы и ткани и возникновению метастазов (Олейник Е.К., и соавт., 2020). ТМЕ включает в себя стромальные и мезенхимальные клетки, внеклеточный матрикс, фибробласты, инфильтрирующие опухоль иммунные клетки, кровеносные и лимфатические сосуды (Wang J-J., et al., 2018; Xie H-Y., et al., 2017; Chou J., et al., 2013. Chew V., 2012). В недавнем исследовании было выявлено, что микрофлора организма, отдельных органов, способствует формированию преметастатических ниш (ПН) и дальнейшему развитию и метастазированию опухоли. Это происходит путем прямого содействия онкогенезу через усиление мутагенеза, а также регуляции онкогенов или онкогенных путей для уменьшения или усиления прогрессирования опухоли путем модуляции иммунной системы хозяина (Wong-Rolle A. et. al., 2021).

Экстрацеллюлярный (внеклеточный) матрикс (ЭМ) — это внеклеточные структуры, которые наделены специфичными функциями и особенностями для каждого типа тканей. В свою очередь, внеклеточный матрикс составляет основу соединительной ткани, обеспечивает механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ. ЭМ содержит цитокины, факторы роста и гормоны, секретируемые стромальными и опухолевыми клетками. ЭМ состоит из коллагена, ламинина, фибронектина и других белков. Гетерогенность ЭМ связана с дальнейшей диссеминацией опухолевых клеток. ЭМ активно

взаимодействует с клетками опухоли, что приводит к фенотипическим изменениям стромальных и опухолевых клеток. В ЭМ формируется гипоксическая среда, а она, как известно, ведет к развитию ацидоза, тем самым, способствуя сохранению наиболее жизнеспособных субклонов опухолевых клеток. Все это создает условия для наиболее быстрой прогрессии и диссеминации опухолевых клеток (Gattazzo F. et al., 2014).

По данным исследований известно, что в клетках меланомы компоненты ЭМ усиливают пролиферацию и инвазию опухолевых клеток путем активации сигнального пути Wnt/TFGp, опосредованной фактором транскрипции MITF в зависимости от фенотипа клеток меланомы - клетки с низким уровнем MITF обладают инвазивным фенотипом, тогда как клетки с более высоким уровнем MITF характеризуются пролиферативным фенотипом (Kim IS. et al., 2017).

Кровеносные и лимфатические сосуды, формирующиеся в опухоли, играют важную роль в жизнедеятельности опухолевых клеток, обеспечивая кислородом, необходимыми нутриентами и способствуя выведению продуктов их жизнедеятельности. Ангиогенез опухоли, в том числе формирование лимфатических сосудов опухоли - это непрерывный процесс, крайне важный для роста опухоли (Birbrair A. et al., 2014). Исследовано, что лимфатические сосуды обеспечивают взаимосвязь первичной опухоли с лимфатическими узлами, что, в свою очередь, способствует быстрому метастазированию в регионарные лимфатические узлы (Wang Y. et al., 2017).

Выделяют так называемые ассоциированные с опухолью макрофаги (ТАМ). ТАМ имеют выраженный гетерогенный характер фенотипа. Макрофаги с противовоспалительной и протуморогенной активностью изменяют опухолевое микроокружение, что ведет к росту опухоли, проникновению, адгезии опухолевых клеток в окружающие органы и ткани и дальнейшему метастазированию. ТАМ регулируют ангиогенез, повышают резистентность опухоли к химиотерапии и лучевой терапии, что создает прекрасные условия деактивации иммунной защиты организма. ТАМ секретируют различные

противовоспалительные цитокины и хемокины, такие как интерлейкин-10 (ИЛ-10), простагландин Е2, CCL2, CCL17 и CCL22, они регулируют процесс вовлечения регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), которые персистируют в участках хронического воспаления, способствуя развитию фиброза, аберрантного ангиогенеза и неоплазии (Богданова И.М. и др. 2019). Известно, что для подавления действия цитотоксических T-клеток ТАМ выделяют цитокины ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-23. (Dwyer A.R. et al., 2017). ИЛ-10 является сильным иммуносупрессором, и по литературным данным известно, что этот цитокин может способствовать прогрессированию опухоли (Hatanaka H. et al., 2000). Главная функция ТАМ - обеспечение иммуносупрессорного опухолевого микроокружения. Одними из основных цитотоксических T-клеток являются CD8+ T-лимфоциты, которые относятся к основным компонентам противоопухолевого иммунитета. Их цитотоксический эффект заключается в распознавании опухолевых клеток, после чего происходит активация проапоптотических процессов через PD-рецепторы, что ведет к выделению, как говорилось ранее, провоспалительных цитокинов и хемокинов, которые в свою очередь, участвуют в формировании опухолевого микроокружения. ТАМ играют важную роль в защите опухолевых клеток. ТАМ осуществляют инактивацию CD8+ клеток путем внутриклеточных механизмов, таких как нарушение внутриклеточного синтеза важных для CD8+ аминокислот - L-аргинина и L-триптофана, необходимых для развития T-клеток (Petty A.J. et al., 2017; Heusinkveld M. et al., 2011). Как говорилось ранее, ТАМ путем секреции различных цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, подавляют функцию CD4+- и CD8+-Т-клеток как напрямую, так и путем вовлечения в процесс модифицированных под действием ТАМ регуляторных T-клеток (nTreg) в опухолевое микроокружение, регулируют силу и продолжительность иммунного ответа (Curiel T.J. et al., 2004). ТАМ способствуют нарушению функционирования лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль путем экспрессии лигандов ингибиторных иммунных рецепторов - PD-1 и CTLA-4. Активация

этих рецепторов способствует инактивации цитотоксических функций Т-клеток (Kuang D.M. et al., 2009). Tregs в определенных условиях под воздействием опухолевого окружения деактивируют пролиферацию и эффекторные функции CD4+ и СD8+Т-клеток. Tregs в опухолевом микроокружении практически полностью подавляют противоопухолевый иммунитет. У большинства пациентов со злокачественными новообразованиями выявляется большое количество инфильтрирующих опухоль FoxP3- положительных Tregs, что по литературным данным связанно с неблагоприятным прогнозом у пациентов со злокачественными новообразованиями (Tanaka A. et al., 2017; Tanaka A. et al.,2019).

Воспаление является одним из наиболее важных процессов при формировании иммунологического окружения в ТМЕ. Большинству новообразований способствует длительное воспаление в участке будущей опухоли, можно сказать хронического, рецидивирующего, усугубляющего иммунологическую картину по мере прогрессирования в месте будущей опухоли (Lasry A. et all., 2016). Таким образом, участки ткани новообразований, возникших на фоне хронического воспаления, могут содержать важные прогностические данные об иммунологическом статусе в этой ткани (Wellenstein M.D. et al., 2018) и в дальнейшем могут быть использованы как существенная характеристика злокачественной опухоли (Bottazzia B. et al., 2018). Так, например, обнаруживающиеся макрофаги в опухолевом микроокружении рассматриваются как маркер прогноза развития опухоли, а также как терапевтическая мишень (Mantovani A.F. et al., 2017). ТМЕ содержит и другие иммунные клетки, связанные с воспалением. Помимо макрофагов, опухолевое окружение включает в себя клетки лейкоцитов - нейтрофилы, эозинофилы, базофилы (Galdiero M.R. et al., 2018).

Известно, что органы-мишени метастазирования меланомы еще задолго до метастазирования в них, трансформируются или перепрограммируются клетками опухоли для содействия последующему метастазированию (Peinado

H. et al., 2017). Первичный опухолевый узел вырабатывает специфичные для каждой ткани и органа вещества и экзосомы, связанные с ангиогенезом, содержащие набор разнообразных белков и микроРНК, которые путем взаимодействия с нормальными клетками, формируют провоспалительное ТМЕ в этих тканях и создавая, тем самым, основу для опухолевой адгезии в дистантные органы-мишени (Mannavola F. et al., 2016). Согласно некоторым исследованиям известно, что ряд злокачественных новообразований, таких как опухоли молочной железы, толстого кишечника, а также меланома, системно воздействуют путем описанных выше механизмов на микроокружение дистантных органов, в частности, легких, с целью формирования в этом органе вторичных очагов опухолевого роста. Таким образом, важным благоприятным фактором метастазирования является формирование локальных, так называемых, преметастатических ниш в органах-мишенях метастазирования [Peinado H., et al., 2017].

Опухолевые стволовые клетки (ОСК) впервые были обнаружены в 1994 году у пациентов, больных острым миелолейкозом. Согласно одной из теорий, опухолевые стволовые клетки выполняют главную роль в канцерогенезе, представляя собой триггер для начала развития первичной опухоли. ОСК — это относительно небольшая популяция опухолевых клеток, которые наделены индивидуальными функциями, такими как возможность избегания апоптоза, а также дальнейшей дифференцировки. Главная особенность ОСК, отличающая их от других видов стволовых клеток, заключается в их возможности инициировать процесс канцерогенеза в организме (Toh T.B. et al., 2017). Опухолевые клетки с фенотипом, схожим с фенотипом стволовых клеток, характеризуются высоким, бесконечным репликативным потенциалом. Опухолевые стволовые клетки, как и обычные стволовые клетки, несут на себе мембранные маркеры CD133, CD44, CD90, что может свидетельствовать, что они несут в себе не только проканцерогенную функцию, но и выполняют функции нормальных стволовых клеток (Ayob A.Z. et al., 2018; Beck B. et al.,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Земцов Данил Сергеевич, 2024 год

- ••

% _ I

* "Ч

• 4 * * * *

с

9 * # • * \

1« Ф >

» • « V

♦

• 4

к .

М *

"л до I «

ё I

Кг

" • »

9 Чк''

«

«, „•

1: 11 ш® т рШ ш тШ Шш ■

жттШФЖшткШ'Ш

Рисунок 4А - Единичные лимфоциты в синусоидах. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. 4Б - цепочки лимфоцитов в синусоидах. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200

Вместе с тем, согласно проведенному иммуногистохимическому анализу, в легких и печени у животных, имеющих метастазы вне зависимости от локализации, наблюдались изменения, связанные с активацией ангиогенеза, активацией опухоль ассоциированных фибробластов (Таблица 1).

Таблица 1

Уровни экспрессии УЕОБ, СБ31, БМЛ-а, СВ45Яо, К1-67 в дистантных органах - легких и печени в зависимости от наличия метастазирования

Легкие

Без метастазирова-ния (% положительно окрашенных клеток) С метастазированием (% положительно окрашенных клеток)

УЕОБЛ 27,8±8,3 65,9±10, 5*

СБ31 0,5±0,2 1,33±0,5

БМЛ-а 81,2±2,7 78,27±2,6

СБ45Яо 5,9±1,3 4,17±0,8

Печень

Без метастазирова-ния (% положительно окрашенных клеток) С метастазированием (% положительно окрашенных клеток)

УЕОБЛ 8,0±3,9 16,3±7,1

СБ31 0,8±0,2 4,1±1,0**

БМЛ-а 22,9±2,9 44,1±6,6***

СБ45Яо 7,6±1,5 6,4±1,4

Опухоль

К1-67-отрицательные клетки 39,4±8,5 54,0±11,8

* - Р=0,016, ** - Р=0,03, *** - Р=0,014 по отношению к показателю в группе без метастазирования

3.2 Оценка уровня Ki-67 в клетках меланомы после воздействия

ингибитором miR-204-5-p

Прогрессия меланомы зависит от многих факторов, но отражением ее интенсивности может служить выраженность клеточной пролиферации, одним из основных маркеров которой является Ki-67. По литературным данным известно, что высокий уровень Ki-67 является крайне неблагоприятным прогностическим фактором при различных опухолях (Sobecki M. et al., 2016). Известно, что уровни экспрессии маркера Ki-67 тесно связаны с выживаемостью при меланоме кожи (Ilmonen S. et al., 2005). При оценке уровня экспрессии Ki-67, было выявлено увеличение Ki-67 положительных клеток меланомы В16 на фоне применения ингибитора miR-204-5p in vitro, что соотносится с литературными данными, где говорится об онкосупрессорной роли данной микроРНК в ткани опухоли.

При проведении иммуноцитохимического исследования уровня экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67 установлено, что при воздействии ингибитором микроРНК miR-204-5p на клетки меланомы происходит увеличение процента Ki-67-положительных клеток в ткани опухоли, что говорит о повышении пролиферации клеток меланомы В16 (рисунок 5 А, 5Б, 5 С).

m

» m

100 |jm

5C 60

в

Щ 50

<о к

| 40

0

Control

Negative control

LNA anti-204-5p

Рисунок 5. 5А - Кь67-позитивные клетки меланомы в контрольной группе, 5Б -Кь67-позитивные клетки меланомы в группе, подвергнутой воздействию ингибитором микроРНК ш1К-204-5р, 5С - % Кь67-позитивных клеток меланомы после воздействия ингибитором микроРНК ш1Я-204-5р. * -достоверные различия по сравнению с контролем, негативным контролем (Р

3.3 Анализ миграционной активности (scratch-test) после воздействия

ингибитором miR-204-5-p

Анализ миграционной активности клеток меланомы В16 после трансфекции ингибитора miR-204-5p, в других сериях эксперимента -негативного контроля, в третьей серии экспериментов - после трансфекции фосфатно-солевого раствора выявил отсутствие различий in vitro в скорости зарастания полосы/царапины (рисунок 6).

<0,05).

Рисунок 6 - Миграционная активность клеток меланомы В16 после воздействия ингибитором ш1Я-204-5р, определяемая по скорости «зарастания» царапины на

дне чашки Петри.

3.4 Определение уровня экспрессии miR-204-5p и miR-211-5p в тканях опухоли и в органах-мишенях метастазирования меланомы (печень, легкие) после воздействия ингибитором miR-204-5-p

Таким образом, исходя из выявленного влияния ингибитора микроРНК miR-204-5p на пролиферацию клеток меланомы in vitro, определялись биологические эффекты ингибирования miR-204-5p in vivo. Первоначально после введения специфического ингибитора микроРНК miR-204-5p in vivo оценивалась эффективность трансфекции посредством оценки на основе ПЦР в реальном времени уровней экспрессии микроРНК miR-204-5p и ее гомолога miR-211-5p в ткани опухоли, а также в тканях легких и печени, являющихся

органами-мишенями метастазирования меланомы В16. Определялись уровни экспрессии БШТ1 и БСЬ2 - генов-мишеней ш1Я-204-5р.

При определении уровней экспрессии вышеуказанных микроРНК было выявлено отсутствие изменений уровня экспрессии ш1Я-204-5р и ш1Я-211-5р в ткани опухоли (рисунок 7).

А

Б

Рисунок 7 - Уровень экспрессии ш1Я-204-5р (А) и 211-5р (Б) в ткани опухоли после воздействия ингибитором miR-204-5p.

Аналогичная картина в отношении экспрессии микроРНК ш1Я-204-5р и ш1Я-211-5р наблюдалась в ткани печени во всех трех исследуемых группах - в контроле, негативном контроле и в группе животных, которым вводился ингибитор ш1Я-204-5р: уровни микроРНК сохранялись без изменений (рисунок 8).

А

и; .

Ч к х

Г U

О

о 1)

й р, Is

0,0001 0,00009 0,00008 0,00007 Ц 0,00006 g 0,00005 5 0,00004 0,00003 0,00002 0,00001 о

Б

0,006

I

3 1 0,005 об о

s £0,004

о л

Control Negative LNA anticontrol 204-5p

л Я

ж е

Й

и ш

О. Л

>7^'

0,003 0,002 0,001 0,000

Control Negative LNA anti-204-control 5p

Рисунок 8 - Уровни экспрессии miR-204-5p (А) и miR-211-5p (Б) в ткани

печени.

В ткани легких наблюдалось снижение уровня экспрессии уровня miR-204-5р по сравнению с экспрессией в легких в группах животных, которым вводился контроль, негативный контроль. Уровень miR-211-5p не изменялся (рисунок 9). Легкие являются типичной локализацией при метастазировании в мышиной модели меланомы B16 и одним из наиболее распространенных органов-мишеней для метастазирования меланомы у людей (Giavazzi R. et б!. 2014).

А

Б

3

(N ■

ОЙ

В

л ее

Я М

(U н

СЕ ш

о ™

См Сч

0,000100 0,000090 0,000080 0,000070 0,000060 0,000050 0,000040 0,000030 0,000020 0,000010 0,000000

Control

Negative control

LNA"anti 204-5p

Control

Negative control

LNA anti-204-5p

Рисунок 9 - Уровень экспрессии miR-204-5p и miR-2П-5p в легких мышей С57В16/В16 после введения ингибитора miR-204-5p. А - Уровень экспрессии miR-204-5p в легких. * - достоверно по отношению к отрицательному контролю (Р <0,05). Б - Уровень экспрессии miR-211-5p в легких.

3.5 Оценка экспрессии генов-мишеней ш1Я-204-5р ЗШТ1 и БСЬ2 в опухоли

и дистантных органах - печени и легких

Согласно биоинформатическому анализу, Б1ЯТ1 и БСЬ2 являются генами-мишенями ш1Я-204-5р. Вместе с тем, проведение экспрессионного анализа показало отсутствие изменений в экспрессии БСЬ2 и Б1ЯТ1 в ткани опухоли меланомы В16 (рисунок 10)

А

Б

Рисунок 10 - Уровень экспрессии BCL2 и SIRT1 в клетках меланомы В16 in vivo после воздействия ингибитором miR-204-5p А- Экспрессия BCL2 Б - Экспрессия SIRT1

В легких животных, которым вводился специфический ингибитор микроРНК ш1Я-204-5р, отмечалось снижение уровней экспрессии БШТ1 по сравнению с показателями их экспрессии у животных группы негативного контроля и контроля (рисунок 11).

А

Б

Negative control

LNA anti 204-5p

Control

Negative control

LNA anti-204-5p

Рисунок 11 - А -Уровень экспрессии БСЬ2 в легких после воздействия ингибитором miR-204-5p, негативным контролем, контролем. Б - Уровень экспрессии Б1ЯТ1 в легких животных после воздействия специфическим ингибитором miR-204-5p. * - достоверные различия по сравнению с контролем,

негативным контролем (Р <0,05)

При определении уровней экспрессии Б1ЯТ1 и БСЬ2 в печени было выявлено снижение уровня Б1ЯТ1, БСЬ2 у животных, которым осуществлялось введение ингибитора ш1Я-204-5р по сравнению с показателями у животных группы, которым осуществлялось введение негативного контроля (рисунок 12)

А

Б

0,016 (О '

р 0,014 & п 0,012 | g 0,01 У 1 0,008

0 jjjj 0,006

2 I 0,004

1 е 0,002 !■ 0

Control

Negative control

LNA anti-204-5p

Control

Negative control

LNA anti-204-5p

Рисунок 12 - Экспрессия генов-мишеней ш1Я-204-5р Б1ЯТ1 и БСЬ2 в ткани печени после воздействия ингибитором miR-204-5p. А - Уровень экспрессии Б1ЯТ1. * - достоверно по сравнению с отрицательным контролем (Р <0,05). Б -Уровень экспрессии БСЬ2. * - достоверно по сравнению с отрицательным

контролем (Р <0,05).

3.6 Определение уровня СБ3+ и СБ8+ клеток в тканях органов-мишеней

метастазирования меланомы

При определении доли СЭ3+ лимфоцитов на фоне применения ингибитора ш1Я-204-5р, выявлено отсутствие изменений в уровне СЭ3+ лимфоцитов в тканях легких и печени (рисунок 11).

А СПЗ+

Б

В

* 1-40

I 1-20

| 1.00

+ 0,80

О 0.60

" 0.40

В 0.20

о 0.00

о.

С

I

РВ8

Негатив

контроль

ЬЫА

ингибитор

ж*

- - • >,

• •: & »3 »

* -и

- 3®»

. г

Рисунок 11 - Доля СЭ3+ клеток после воздействия специфическим ингибитором miR-204-5p. А - Процент СБ3+ клеток в ткани печени. Б - СБ3+ в ткани печени животных, подвергнутых воздействию отрицательным контролем, Ув 400. В - СЭ3+ клетки в печени животных, получавших экспериментальную терапию ингибитором микроРНК ш1Я-204-5р. Увеличение

х100.

При определении содержания СЭ8+ клеток в печени животных с трансплантированной меланомой В16 и получавших терапию специфическим ингибитором микроРНК ш1Я-204-5р, получен схожий результат: выявлено отсутствие изменений в процентном содержании СЭ8+ клеток в ткани легкого

по сравнению с группой животных, которым вводился отрицательный контроль (рисунок 12).

А

о 0.14 | 0.12 * 0.10 оо 0.08 и о.об

CD8+

х

8 0.02

о. 0.00 С

I I

Control Negative LNA anticontrol 204-5p

Б

ш<

fi" Л • ».

» • » . 9.. ••

.О t 5>. 1 # © '■■ 'ч' г ■■ ■ "/• ■> »■ % ф

/ 1 i О ■ »* ' * к- -1 * 1 «

4 ШяШ I . > J? ш

В

Рисунок 12 - Доля СЭ8+ клеток после воздействия специфическим ингибитором miR-204-5p. А - Доля СБ8+ клеток в ткани печени. Б - СБ8+ клетки в ткани печени животных, получавших отрицательный контроль, Ув. 400. В - СЭ8+ в печени животных, подвергнутых воздействию ингибитором микроРНК ш1Я-204-5р. Увеличение *100.

3.7 Профилирование мРНК

После приведённого анализа профиля мРНК в легких получен следующий результат: после введения специфического ингибитора ш1Я-204-5р, в сравнении с отрицательным контролем, в легких определялись измененные уровни 3262 мРНК (рисунок 13). Повышение мРНК регистрировалось в отношении 1891 генов. В последующем были определенны сигнальные пути, регулируемые генами с измененной экспрессией в легких после воздействия специфическим ингибитором ш1Я-204-5р (таблица 4).

1 МсдаНуе СопИЫ 2 - I МЛ апП 204 5р

Рисунок 13 - Профилирование мРНК легочной ткани. Тепловая карта с иерархической кластеризацией: 1 - отрицательный контроль. 2 -экспериментальная группа после воздействия специфическим ингибитором ш1Я-204-5р. Цвет от зеленого до красного отражает относительный уровень

экспрессии мРНК

К наиболее низкоэкспресируемым можно отнести следующие гены: CDH1,

TGFb1, ITGA, Scgb1a1, Sftpc, Sftpb, Cyp2f2, СЫ13, СЬг2, ^011, Slc34a2, 1пт^ Cxcl15 (таблица 2). Таблица 2

мРНК со сниженной экспрессией в легочной ткани мышей С57В16/В16 после

введения специфического ингибитора шiR-204-5p

№ Наименование мРНК Кратность различий уровней экспрессии мРНК в экспериментальной группе по сравнению с группой отрицательного контроля Уровень значимости Р

1 Scgb1a1 -598,18 0,000000998

2 Sftpc -341,35 0,000005

3 Sftpb -185,2 0,000012

4 СЫ13 -158,62 0,00006

5 СЬг2 -131,47 0,000002

6 Sftpa1 -130,7 0,000065

7 ^1с34а2 -123,65 0,000087

8 Inmt -118,77 0,001141

9 Схс115 -109,99 0,002037

10 CDH1 -30,83 0,000139

11 TGFb1 -7,48 0,001175

12 тА -4,39 0,001584

Повышение экспрессии в ткани легких животных с меланомой В16 после введения им специфического ингибитора шiR-204-5p было зарегистрировано в отношении мРНК 1371 гена.

Самыми высокоэкспресируемыми генами были: FGFs (Fgf12, Fgf13, Fgf14), Snap25, Slc6a11, СФ1, Ые/1, Р1р1, Gria2, Ттет130, AF357355, Sst (таблица 3).

Таблица 3

мРНК с повышенной экспрессией в легочной ткани мышей С57В16/В16 после введения специфического ингибитора шiR-204-5p

№ Наименование мРНК Кратность различий уровней экспрессии мРНК в опытной группе в сравнение с контролем Уровень значимости, Р

1 Snap25 298,16 0,000000384

2 ^1с6а11 186,16 0,000028

3 Сйг1 164,97 0,000000474

4 ЫеА 146,12 0,000015

5 Р1р1 120,68 0,00003

6 Gria2 89,18 0,000068

7 Ттет130 85,76 0,000008

8 AF357355 81,97 0,000161

9 SST 76,44 0,000001

10 Fgf12 21,52 0,000101

11 Fgf14 15,72 0,000038

12 Fgf13 5,24 0,003237

Таблица 4

Сигнальные пути, насыщенные измененными транскриптами в клетках легочной ткани после воздействия ингибитором шiR-204-5р

№ Наименования сигнальных путей (согласно биоинформатическому ресурсу KEGG pathway) Число измененных генов Уровень значимости, p

1 XPodNet - protein-protein interactions in the podocyte expanded by STRING 192 0

2 Focal Adhesion-PI3K-Akt-mTOR-signaling pathway 56 0,000013

3 PodNet: protein-protein interactions in the podocyte 54 0,008952

4 Focal Adhesion 51 0,000282

5 Non-odorant GPCRs 50 0,00016

6 Calcium Regulation in the Cardiac Cell 49 0,000021

7 Myometrial Relaxation and Contraction Pathways 45 0,001549

8 Chemokine signaling pathway 44 0,000065

9 B Cell Receptor Signaling Pathway 40 0,000065

10 T Cell Receptor Signaling Pathway 35 0,000034

11 Insulin Signaling 34 0,000002

12 Regulation of Actin Cytoskeleton 34 0

13 MAPK signaling pathway 34 0

14 MAPK signaling pathway 34 0

15 TNF-alpha NF-kB Signaling Pathway 22 0,000643

В целом, изменения механизмов передачи сигнала после ингибирования ш1Я-204^ связаны с дисрегуляцией процессов фокальной адгезии, хемокиновой

сети, функционирования В- и Т-клеточных рецепторов и фактора некроза опухоли а.

Таким образом, при введении ингибитора микроРНК miR-204-5p мышам линии C57B16 с трансплантированной меланомой В16 in vivo наблюдалось изменение экспрессии генов-мишеней данной микроРНК в дистантных органах - в печени и легких.

ГЛАВА 4

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

МикроРНК являются важными медиаторами канцерогенеза, обеспечивая взаимодействия между опухолевыми клетками и опухолевым микроокружением путем регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Известно об участии микроРНК в регуляции процессов развития и прогрессии меланомы, происходящих в самих опухолевых клетках - пролиферация и переход в «дормантное» состояние, апоптоз, аутофагия, стимуляция ангиогенеза (Peng Y., 2016, Ruksha T., 2019, Aksenenko M., 2019). Опубликованные на сегодняшний день результаты многочисленных экспериментальных работ показывают ключевую роль микроРНК в регуляции прогрессии онкологических заболеваний, в том числе при диссеминированой форме меланомы кожи, что позволяет рассматривать их в качестве диагностических и/или прогностических маркеров, а также терапевтических мишеней при МК (Díaz-Martínez M. et al., 2018; Paraiso K.H. et al., 2010). МикроРНК участвуют в регуляции различных метаболических процессов при формировании злокачественных новообразований, включая МК, например, в метаболическом перепрограммировании опухолевых клеток и переключении метаболизма с аэробного на аэробный (Romano G. et. al., 2017). Прогрессия меланомы напрямую зависит от степени клеточной пролиферации, одним из основных маркеров данного процесса является Ki-67. По литературным данным известно, что высокий индекс Ki-67 является крайне неблагоприятным прогностическим фактором при различных опухолях (Шишкин М.А., 2016). Ki-67 экспрессируется в активно делящихся клетках, и для активного роста опухоли необходим стабильный высокий уровень Ki-67 (Sobecki M. et al., 2016). Поэтому он используется для определения активности пролиферации в тканях опухоли пациентов. Повышенный уровень Ki-67 клеток прямо связан с неблагоприятным прогнозом для больных с МК (Ilmonen S. et

al., 2005). При оценке уровня экспрессии Ki-67, нами было выявлено повышение уровня Ki-67-позитивных клеток в опухоли В16 на фоне применения ингибитора miR-204-5p, что соотносится с литературными данными, где говориться об онкосупрессорной роли данной микроРНК в ткани опухоли.

Данное исследование было сосредоточено на определении влияния ингибирования микроРНК на ход, прогрессию опухолевого процесса. В данном исследовании проводилась модуляция уровней miR-204-5p, оценка биологических эффектов ингибитора микроРНК miR-204-5p, в том числе, влияния на прогрессию меланомы и диссеминацию опухоли in vivo путем воздействия специфическим ингибитором miR-204-5p. Проводилась оценка уровней микроРНК miR-204-5p и ее гомолога miR-211-5p непосредственно в самой в опухоли, а также в тканях дистантных органов - легких и печени, являющихся органами-мишенями метастазирования меланомы В16. Также оценивались уровни экспрессии генов-мишеней данной микроРНК - SIRT1 и BCL2. Определено, что при наличии изменения уровней экспрессии miR-204-5р, у животных не изменялся уровень экспрессии miR-211, что свидетельствует о селективности воздействия ингибитором.

На следующем этапе осуществлялся экспрессионный анализ генов-мишеней микроРНК. Было установлено, что в опухоли не происходило изменения экспрессии генов-мишеней miR-204^ при ее ингибировании -экспрессия SIRT1 и BCL2 сохранялась без изменений. Это свидетельствует об отсутствии эффекта ингибитора на опухолевые клетки. Действительно, известен целый ряд механизмов лекарственной устойчивости, среди которых выделяют активное выведение веществ из клетки, а также недостаточное поступление лекарственного вещества в клетку. Такие процессы могут наблюдаться из-за нескольких причин. В частности, васкулярная мимикрия, которая была описана при меланоме В16, ассоциирована со снижением поступления лекарственных веществ в клетки опухоли. Точный механизм этого

процесса до сих пор остается малопонятным. Помимо этого, выведение веществ из клеток осуществляют специфические молекулы-транспортеры.

Вместе с тем, наблюдалось снижение уровня генов-мишеней miR-204-5p в легких и печени. С одной стороны, это свидетельствует об эффектах микроРНК в дистантных органах - легких и печени. С другой стороны, под воздействием ингибитора микроРНК наблюдалось снижение уровня ее генов-мишеней, что может рассматриваться как неканонические эффекты микроРНК.

В дальнейшем выполнялся анализ динамики роста опухоли после ингибирования miR-204-5p, оценивались выраженность лимфоцитарной инфильтрации в органах-мишенях метастазирования на фоне введения специфического ингибитора miR-204-5p. Выбор микроРНК обусловлен многочисленными данными (Díaz-Martínez M. et al., 2018; Vitiello M. et. al., 2017, Aksenenko M. A. et. al., 2019; Лаврентьев С.Н. и др., 2019; Palkina N. V. et. al., 2018; Палкина Н. В. и др., 2018), свидетельствующими об участии микроРНК miR-204-5p в процессах, связанных с прогрессией меланомы и ее метастазированием. Известно, что miR-204-5p участвует в онкогенезе посредством влияния на экспрессию генов-мишеней, которые, в свою очередь, ассоциированы с развитием опухолей. Экспрессия miR-204-5p подавляется при некоторых типах злокачественных новообразований (Zhang B. et al., 2015; Yin Y. et al., 2014). В проведенном ранее исследовании (Лапкина Е.З., и др., 2022) говорится о применении синтетического аналога микроРНК miR-204-5p -мимика/имитатора in vitro, его способности снижать пролиферативную активность и жизнеспособность клеток опухоли. Основываясь на данных профилирования экспрессии опухолевых тканей желудочно-кишечного тракта, miR-204-5p является одной из наиболее значительно подавляемых микроРНК, и дальнейшие исследования показали, что miR-204-5p ингибирует пролиферацию опухолевых клеток желудка, в то время как ингибирование miR-204-5p вызывает повышение пролиферативной активности опухолевых клеток при раке желудка (Zhang B. et al., 2015; Liang Y. et al., 2020).

Считается, что в большинстве опухолей экспрессия микроРНК miR-204-5p подавляется и, исходя из этого, она функционирует как супрессор опухолей при различных злокачественных новообразованиях человека. miR-204-5p снижается в клетках меланомы по сравнению с доброкачественными меланоцитарными новобразованиями - меланоцитарными невусами (Palkina N. V. et. al., 2018). Эти данные соответствуют результатам нескольких других исследований, где показано участие miR-204-5p в клеточной пролиферации при злокачественных новообразованиях - плоскоклеточном раке полости рта, колоректальном раке и раке щитовидной железы. Несмотря на то, что экспрессия miR-204-5p снижается в тканях меланомы, ее биологическая роль в молекулярных механизмах развития меланомы кожи остается неясной (Luan W. et. al., 2017; Fattore L. et. al., 2020). Интересно, что повышенная экспрессия miR-204-5p в клетках меланомы отмечается при развитии резистентности к терапии опухоли BRAF и MEK ингибиторами (Vitiello M. et. al., 2017; Díaz-Martínez M. et al., 2018). MiR-204-5p является онкосупрессором и при других типах опухолей человека, таких как глиобластома, опухоли предстательной железы и немелкоклеточный рак легкого (Song S. et. al., 2016; Lin YC. et. al., 2016; Wang P. et. al., 2016). В клетках глиомы miR-204-5p подавляет клеточную пролиферацию, миграцию и инвазию посредством ингибирования белка активации транскрипционного фактора-2 ATF2 (Song S. et. al., 2016), который, в свою очередь, является ключевой молекулой, участвующей в прогрессировании и развитии опухоли (Lau E. et. al., 2012). ATF2 является одним из шестнадцати факторов транскрипции семейства Atf/Creb и важным компонентом транскрипционного комплекса активирующего белка-1 (AP-1), который регулирует нормальный клеточный рост и развитие клеток. ATF2 регулирует программы экспрессии генов, участвующие в контроле клеточного цикла, экспрессии цитокинов и гибели клеток (Lopez-Bergami et al., 2010).

В опухолевых клетках немелкоклеточного рака легкого повышенная экспрессия miR-204-5p приводила к снижению инвазивных и миграционных характеристик опухолевых клеток путем ингибирования экспрессии белков JAK2 (Wang P. et. al., 2016). Сигнальный путь JAK является общим сигнальным путем для многих цитокинов и играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и апоптозе. JAK2, член семейства JAK, является важнейшим внутриклеточным медиатором передачи сигналов, и его экспрессия напрямую связанна с прогрессированием опухоли. В опухолевых клетках рака предстательной железы miR-204-5p является минимально экспрессируемой сравнению с нормальными эпителиальными клетками предстательной железы. При данном типе опухоли miR-204-5p ингибирует антиапоптотический белок BCL2, что, в свою очередь, снижает жизнеспособность опухолевых клеток. Эти данные соотносятся с другим исследованием, где также отмечается, что экспрессия miR-204-5p была ниже в опухолевых тканях, однако miR-204-5p может усиливать пролиферацию и стимулировать диссеминацию клеток плоскоклеточного рака полости рта. Эти результаты еще раз показали, что miR-204-5p может функционировать как опухольсупрессирующая молекула (Wang X. et. al., 2016). Все вышеизложенное свидетельствует, что микроРНК miR-204-5p может рассматриваться в качестве возможной мишени для терапии злокачественных новообразований (Lin YC. et. al., 2016).

Как указывалось выше, в генезе развития меланомы микроРНК miR-204-5p рассматривается преимущественно как онкосупрессорная микроРНК. Поэтому увеличение пролиферации клеток меланомы при попытке ее ингибирования является закономерным и, вероятно, может быть связанно с более быстрым течением заболевания. Можно предположить несколько механизмов, каким образом исследуемая микроРНК может регулировать пролиферацию: ранее было показано, что геном-мишенью miR-204-5p является транскрипционный фактор FOXC1 (Zhou Y., et al., 2021; Дубовцева И.Ю. и др., 2021). Это регуляторный белок, ответственный за пролиферацию клеток

меланомы, реализующийй свои эффекты путем активизации сигнального пути PI3K-Akt-mTOR (Chen F., et al., 2021).

Действительно, нами было выявлено изменение в уровне miR-204-5p в ткани легких и печени, но не в опухолевых клетках В16 in vivo при воздействии ее специфическим ингибитором, что может быть связано, как уже указывалось ранее, с феноменом васкулогенной мимикрии. Хорошо известно, что кровоснабжение опухолей происходит через измененную сосудистую сеть (White P.J., et al., 2009; Nishide S., et al., 2020). Клетки меланомы В16 характеризуются развитием феноменом васкулогенной мимикрии in vivo (Zhang S., et al., 2007), что вероятно усиливает лекарственную устойчивость (Andonegui-Elguera M.A., et al., 2020; Vartanian A., et al., 2017; Lezcano C., et al., 2014). Васкулогенная мимикрия (ВМ) — это феномен неоваскуляризации, который отличается от традиционного ангиогенеза с участием эндотелия сосудов. Он включает в себя формирование микрососудистых каналов, состоящих из опухолевых клеток. ВМ считается новой моделью для формирования кровеносных сосудов в агрессивных опухолях и может способствовать кровоснабжению для роста опухоли. Многие исследования показали, что в последние годы некоторые клинические методы лечения ангиогенеза были неудовлетворительными из-за ряда причин, включая, возможно, развитие ВМ (Wei X., et al., 2021). Таким образом, клетки меланомы обладают способностью образовывать в опухолях васкулогенные структуры, богатые внеклеточным матриксом, способные переносить функциональные эритроциты и плазму, и поставлять питательные вещества растущим опухолям. Эти сосуды не имели какого-либо эндотелия, они были выстланы опухолевыми клетками (Maniotis AJ., et al., 1999; Angara K., et al., 2017). Стоит отметить, что антиангиогенная терапия (ААТ) была разработана в качестве дополнения к стандартным модулям лечения (Chinot OL., et al., 2014). Однако развитие резистентности спустя несколько месяцев от начала лечения и последующая патологическая гиперваскуляризация, наблюдаемая в этих опухолях,

потребовали изучения механизмов неоваскуляризации в опухолях в ответ на терапию. Один из используемых препаратов терапии - ваталаниб, который воздействует на сигнальный путь VEGF-VEGFR2 для ингибирования классического ангиогенеза (Mross K., et al., 2005). Однако большое количество рецидивов опухоли с последующей прогрессией роста опухоли также указывают на развитие резистентности к AAT (Wong E.T., Brehm S. 2017; Thompson EM., et al., 2011; Wong E.T., et al., 2011; Grabner G., et al., 2012). Было показано, что 45% первичных увеальных меланом имели участки ВМ (Spiliopoulos K. et al., 2015). Было установлено, что развитие ВМ у пациентов со злокачественными опухолями является независимым негативным прогностическим фактором. Пациенты с меланомой, образующими каналы (структуры) ВМ, имели худший прогноз и более низкую выживаемость, чем те пациенты, опухоли, которых не содержали признаков развития ВМ. Интересно, что BCL2, являющийся геном-мишенью miR-204-5p, также может быть вовлечен в индукцию сети ВМ гипоксией в клетках меланомы (Zhao N. et al., 2012). И хотя механизмы, лежащие в основе ВМ, до конца не выяснены, предполагается, что одной из основных причин феномена ВМ, является гипоксическая среда в солидных опухолях (Wei X., et al., 2021). Она индуцирует выработку множества факторов, в том числе, фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа (HIFla), активные формы кислорода (АФК) и VEGF. Как уже говорилось, тканевая гипоксия выполняет одну из главных ролей в прогрессии злокачественных заболеваний и формировании сети ВМ. При этом гипоксия индуцирует высвобождение факторов, например, факторы транскрипции, которые чувствительны на изменения содержания кислорода в тканях. Гипоксия индуцирует повышение активности HIF1a, который регулирует большое количество молекул, в том числе - VEGF. Это обеспечивает индукцию ангиогенеза в условиях недостатка кислорода. Из литературных данных известно, что гипоксия приводит к повышению HIF1a, MMP2 и VEGF, вызывая образование ВМ in vivo (Spiliopoulos K. et al., 2015).

Описан транскрипционный фактор Twist, регулируемый HIFla, как один из немногих, чья экспрессия может подавлять экспрессию множества эпителиальных белков и активировать экспрессию эндотелиальных (Tang L. et al., 2020). Последнее может являться одной из причин отсутствия изменения уровня miR-204-5p в опухолевых клетках меланомы in vivo в нашем исследовании. Еще одной возможной причиной отсутствия изменений в уровне экспрессии miR-204-5p в тканях опухоли является нестабильность АСО, затруднительная доставка в клетки и разрушение под действием РНКаз, так как синтетические олигонуклеотиды являются чужеродными для клеток, в которые они введены, поэтому они становятся мишенью для эндогенных нуклеаз (Singh J. et al., 2011). Нуклеиновые кислоты плохо связываются с белками плазмы крови и быстро экскретируются почками. Таким образом, оптимальное использование антисмысловых олигонуклеотидов в качестве основных лекарственных препаратов может быть затруднено из-за их нестабильности в физиологических жидкостях (плазма, ликвор, слюна и тд), выраженной чувствительности к РНКазам, плохой биодоступности в тканях. Более того, известно, что АСО могут кумулироваться преимущественно в органах, обеспечивающих выведение веществ - печени, почках и кишечнике. Такой факт может приводить к введению больших доз для достижения необходимой концентрации, но повышать вероятность токсических эффектов (Sardane V. et al., 2017; Bedi D. et al., 2013). Из этого можно сделать вывод, что АСО обладают хорошей избирательностью, но достижение этого эффекта и воздействие на таргетную молекулу в опухолевых клетках может быть затруднено и требует оптимизации доставки АСО (Winkler M. et al., 2021).

Эти данные подтверждаются различными исследованиями. Так, в одной из работ демонстрируется положительный эффект АСО на основе микроРНК в лечении глиобластомы как in vitro, так и in vivo. В этом исследовании с помощью специфичных АСО ингибировали трансформирующий фактор роста бета (TGFP), снижая его уровень экспрессии, что вызывало снижение миграции

и инвазии клеток глиомы (Papachristodoulou A. et al., 2019). Еще одна работа демонстрирует положительный эффект на фоне введения АСО, воздействующих на протоокногенный белок, фактор транскрипции (MYC), который регулирует экспрессию до 15% всех генов человека. Эти АСО индуцировали снижение уровня мРНК MYC (Gill T. et al., 2021).

В рамках представленной работы было дополнительно исследовано, индуцирует ли miR-204-5p изменения в провоспалительных клетках в легких. На примере мышиной модели рака молочной железы установлено, что B-лимфоциты продуцируют высокие уровни полифункционального цитокина -TGFp. В этом же исследовании было показано, что эти клетки посредством TGFp способствуют дифференцировке проопухолевых Tregs, которые, в дальнейшем, играют критическую роль в развитии метастазирования в легких (Olkhanud PB. et al., 2011). Хорошо известно, что более высокое количество CD8+, но не CD4+, было связано с увеличением выживаемости при диссеминированных формах меланомы (Erdag G. et al., 2012). В этом же исследовании отмечалось достоверное изменение уровня CD8+ клеток в органах метастазирования (лимфатические узлы, мягкие ткани, тонкий кишечник). Фридман и соавт. объединили данные из 200 ранее опубликованных работ, посвященных анализу различных типов злокачественных опухолей, где, было отмечено, что повышенная экспрессия Т-клеток (CD3+, CD8+, CD4+) в опухоли, органах-мишенях метастазирования была ассоциирована с более благоприятным исходом (Fridman WH. et al., 2017). CD8+ Т-клетки играют центральную роль в адаптивном иммунном ответе при развитии злокачественных новообразований (Gonzalez H. et al., 2018; Martinez-Lostao L. et al., 2015), непосредственно распознавая и уничтожая злокачественные трансформированные клетки (Gonzalez H. et al., 2018; Martinez-Lostao L. et al., 2015). Наличие внутриопухолевых CD8+ Т-клеток в метастатических лимфатических узлах коррелирует с улучшением клинических исходов при меланоме кожи (Jacquelot N. et al., 2016). Повышенная

концентрация CD8+ Т-клеток при метастатических формах меланомы (III и IV стадии) положительно связана с выживаемостью (Erdag G. et al., 2012; Kakavand H. et al., 2015).

Основываясь на биораспределении антисмысловых олигонуклеотидов (White P.J. et al., 2015), органами с их самыми высокими концентрациями являются печень и почки. В настоящем исследовании было показано, что модуляция экспрессии микроРНК под воздействием ингибитора происходит в легких и печени. Легкие часто поражаются во время диссеминации опухолевых клеток, в том числе меланомы. Специфическая роль miR-204-5p в регуляции дифференцировки лейкоцитов еще не полностью выяснена. Однако на иммунодефицитной мышиной модели рака молочной железы было выявлено, что после повышения уровня miR-204-5p наблюдалось увеличение числа CD4+ и CD8+ клеток в микроокружении опухоли. Эти процессы по мнению авторов были результатом прямой активации сигнального пути PI3K/Akt посредством miR-204-5p (Hong BS. et al., 2019). Более того, было выявлено, что оверэкспрессия miR-204-5p способствует дифференцировке стволовых клеток опять же опосредованно через сигнальный путь PI3K/Akt (Liu X. et al., 2020). Таким образом, описанная способность miR-204-5p влиять на характер присутствия иммунокомпетентных клеток в микроокружении опухоли, изменение уровня генов-мишеней miR-204-5p в легких и печени послужили предпосылкой для оценки наличия иммунокомпетентных клеток в дистантных органах, органах-мишенях метастазирования меланомы. Вместе с тем, уровень CD3+, CDS+клеток после ингибирования miR-204-5p оставался без изменений.

Однако с учетом способности микроРНК менять уровень экспрессии большого количества генов, было выполнено профилирование мРНК в легких животных, подвергнутых воздействию ингибитора. По результатам проведенного профилирования мРНК на основе микрочипирования определенно, что одними из низкоэкспрессируемых генов в легких животных после введения специфического ингибитора miR-204-5p были CDH1, TGFbl,

ITGA, Scgb1a1, Sftpc, Sftpb, Qp2/2, CM3, Cbr2, Sftpa1, Slc34a2, Inmt, Cxcl15. В целом, введение ингибитора miR-204-5p вызывало изменение экспрессии 1371 генов. К наиболее высокоэкспрессируемым относились факторы роста фибробластов, FGFs (Fgf12, Fgf13, Fgf14), а также Snap25, Slc6a11, Cdr1, Nefl, Plp1, Gria2, Tmem130, AF357355, Sst, AF357355. Согласно биоинформатическому анализу, гены с измененной экспрессией являлись основными компонентами механизмов внутриклеточной сигнализации «MAPK signaling pathway», «Focal Adhesion-PI3K-Akt-mTOR-signaling pathway», «EGFR1 Signaling Pathway», «TGF-beta Receptor Signaling Pathway», «Focal Adhesion», «B Cell Receptor Signaling Pathway», «T Cell «Receptor Signaling Pathway», «XPodNet - protein-protein interactions in the podocyte expanded by STRING».

Гены с измененной экспрессией участвуют в регуляции функционирования нескольких сигнальных каскадов. Так, FGFs являются компонентами в сигнальных каскадах MAPK и PI3K/AKT, которые, в свою очередь, играют большую роль в онкогенезе мелонамы. Нарушение регуляции передачи сигналов посредством изменения экспрессии данной группы генов может быть связано с последующей активацией этих сигнальных путей (Wheler JJ. et al., 2015), внося вклад в развитие резистентности к терапии меланомы. Другие гены-компоненты сигнальных путей - мембраносвязанный белок бета-рецептора TGF (TGFBR1) и интегрин альфа-2 (ITGA), относились к низкоэкспрессируемым. Эти молекулы, в свою очередь, являются вышестоящими регуляторами в PI3K/Akt сигнальном пути, координируют ряд эффектов нижестоящих генов, в том числе белка BCL2. В свою очередь, VEGF способствует развитию ВМ путем воздействия на сигнальный каскад PI3K. VEGF может индуцировать развитие ВМ путем активации сигнального пути PI3K/Akt (Xu X. et al., 2019).

Экспрессия еще одного гена, SST (соматостатин), была повышена на фоне введения специфического ингибитора miR-204-5p. По литературным данным

известно, SST принимает участие в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода при раке желудка и способствует миграции опухолевых клеток в органы-мишени (Wang G.H., et al., 2020, Cui J. et al., 2014). Соматостатин действует главным образом как ингибирующий фактор клеточной пролиферации и секреции гормонов с эндокринной, паракринной и аутокринной активностью (Ruscica M. et al., 2013). SST экспрессируется при различных типах злокачественных новообразований, включая меланому кожи (Treszl A. et al., 2013).

Также при профилировании мРНК в легких после воздействия ингибитором miR-204-5p определено 100 дифференциально экспрессируемых генов, включая хемокины CCL и CXCL и медиаторы и межклеточной адгезии, такие как ICAM1, CLDN1, CCN3, ITGA1 и ITGA11 (Cioanca AV. et al., 2021). мРНК этих генов являлись минимально экспрессируемыми в легких животных после введения ингибитора miR-204-5p. Вместе с тем, вышеуказанные гены являются компонентами ряда сигнальных каскадах, в том числе и в PI3K-Akt-mTOR. Функциональная аннотация генов показала, что эти гены контролируют воспалительные процессы, транспорт иммунных клеток, межклеточную адгезию, взаимодействие с внеклеточным матриксом и кровеносными сосудами, ангиогенез и переходы от эпителия к мезенхиме (Cioanca AV. et al., 2021). Известно, что киназа ERK1/2 участвует в регуляции одних из важнейших сигнальных каскадов для опухолевых клеток, в том числе и меланомы, таких как пути MAPK, mTOR, HIF-1 и PI3K-Akt (Betancourt LH. et. al., 2021). Результаты профилирования мРНК подтверждают эти данные. Высокороэкспрессируемыми генами были члены семейства факторов роста фибробластов, а именно: гена FGF12, FGF13 и FGFf14. Эти гены регулируют процессы дифференцировки и миграции клеток, изменения экспрессии этих генов отмечается при многих злокачественных заболеваниях. В том числе, показано, что увелечение FGF13 ведет к неблагоприятным исходам при раке поджелудочной железы и шейки матки (Yu L., et. al., 2016). FGF, полученный

из опухолевых клеток, а также стромальных клеток, играет ключевую роль в формировании микроокружения опухоли. Ген FGF, наравне с VEGF, является одним из основных стимуляторов ангиогенеза опухоли (Katoh M. 2016). Manfredi J.J., и соавторами отмечают, что есть так называемые молекулы-активаторы, которые стимулируют пролиферацию злокачественных клеток. К таким молекулам относят ген FGF13 (Manfredi J.J., 2017). FGF был обнаружен также в здоровой коже, он секретируются фибробластами в дермальном слое кожи и кератиноцитами в эпидермисе и способствует стимуляции пигментации и пролиферации меланоцитов. Из этого было высказано предположение, что более высокий уровень FGF в микроокружении меланоцитов, полученных из меланоцитарных невусов, позволяет меланоцитам адаптироваться к росту в дерме, что может быть важно для развития меланомы (Czyz M. et. al., 2019).

В клетках меланомы гены семейства FGFs характеризуются повышенной экспрессией, однако их высокие уровни связаны с более неблагоприятным прогнозом и снижением выживаемости. На примере мышиной меланомы B16 in vitro и in vivo показано, что модуляция уровней FGFs подавляет онкогенную активность клеток B16, а в эксперименте in vitro снижение уровня экспрессии FGFs показало способность ингибировать рост клеток B16 (Rezzola S. et. al., 2019). Было продемонстрировано, что клетки меланомы стимулируют выработку FGFRs аутокринным образом (Czyz M. et. al., 2019). Показано, что FGF13, член подсемейства FGF, высоко экспрессируется в опухолевых клетках, таких как клетки рака предстательной железы, меланомы, глиомы и множественной миеломы. Однако механизм функционирования FGF13 в опухоли остается крайне мало изученным. FGF13 обладает особенностями, отличающими его от других FGF. Он не секретируется нормальными клетками организма, не регулируется ни одним из известных рецепторов FGF (FGFRs) (Lu H. Et al., 2020). Другой ген этого семейства, который так же был повышен по нашим данным микрочипирования легочной ткани, FGF14. Известно, что FGF14 функционирует как онкосупрессор, который индуцирует апоптоз клеток

посредством ингибирования механизма передачи сигналов PI3K /AKT /mTOR. Повышенная экспрессия FGF14 в значительной степени способствовала угнетению жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками колоректальной опухоли (Su T. Et al., 2020).

Таким образом, на основании данных экспериментов, выполненных в этом исследовании, определено, что снижение уровня микроРНК miR-204-5p в клетках мышиной меланомы B16 in vivo не оказывает влияния на прогрессию опухолевого роста. Но в тоже время, модуляция ее уровней ведет к изменениям экспрессии ее генов генов-мишеней SIRT1 и BCL2, а именно ингибирование уровня микроРНК miR-204-5p приводит к снижению экспрессии ее генов SIRT1 и BCL2 в ткани легкого, печени, но отсутствию изменений - в ткани опухоли меланомы B16. Ингибирование экспрессии микроРНК miR-204-5p ведет к повышению пролиферации опухолевых клеток меланомы В16 in vitro. Отдельно стоит отметить, что при развитии изменений в дистантных органах происходят специфические изменение, связанные с активацией иммунной системы, активацией фибробластов в легких. Снижение уровня miR-204-5p не вызывает статистически достоверных изменений уровней CD8+ и CD3+ клеток в ткани печени. Таким образом, при ингибировании путем применения специфического ингибитора микроРНК miR-204-5p снижается уровень экспрессии ее генов-мишеней, что сопровождается изменением профиля экспрессии целого ряда генов, вовлеченных в развитие, в первую очередь, провоспалительных процессов в органах-мишенях метастазирования меланомы. Результаты настоящего исследования продемонстрировали, что специфический для miR-204-5p LNA-ингибитор изменяет характер экспрессии генов в дистантных органах, но не в опухоли. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения специфической роли miR-204-5p в иммунных клетках, поскольку избирательное воздействие на микроРНК может быть применено для комбинированной терапии распространенных форм новообразований, в том числе, через воздействие на микроокружение опухолевых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных данных, можно сделать вывод, что ингибиторы микроРНК на основе антисмысловых олигонуклеотидов с замкнутыми нуклеиновыми кислотами в большей степени кумулируются в паренхиматозных органах, чем первичной опухоли, что может быть обусловлено наличием в опухоли более эффективных систем выведения химических веществ, инактивацией мишеней, развитием биологического феномена васкулогенной мимикрии. Вместе с тем, в дистантных органах, являющихся органами-мишенями метастазирования меланомы, определялось изменение экспрессии генов-мишеней ш1Я-204-5р и в легких, и в печени.

В представленном исследовании определено, что изменение уровня ш1Я-204-5р не влияет на выраженность метастазирования в органы-мишени. Вместе с тем, характер изменений в дистантных органах в зависимости от наличия/отсутствия в них метастазов включал изменение уровня экспрессии УЕОБЛ, экспрессии СЭ31, являющегося маркером эндотелиоцитов. В дистатных органах, в которых определялись метастазы, наблюдалась активация фибробластов.

Профилирование ткани легких в зависимости от ингибирования ш1Я-204-5р определило изменение экспрессии генов и сигнальных каскадов, связанных с реализацией воспаления, иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Ингибирование miR-204-5p на модели меланомы В16 in vivo вызывает изменение уровня ее генов-мишеней в органах-мишенях метастазирования меланомы - в легких, печени;

2. После введения специфического ингибитора микроРНК miR-204-5p в клетках меланомы В16 повышается процент Ki-67-положительных клеток, что свидетельствует о регуляции miR-204-5p пролиферации клеток меланомы;

3. В ткани печени и легких мышей с меланомой В16 определено снижение экспрессии генов-мишеней микроРНК miR-204-5p SIRT1 и BCL-2, являющихся функциональными мишенями miR-204-5p в клетках меланомы;

4. Показано, что при введении специфического ингибитора miR-204-5p не происходит изменений уровня CD8+ и CD3+ клеток в дистантных органах - легких и печени мышей C57B16/B16;

5. Профилирование мРНК легочной ткани мышей линии C57B16/B16 показало, что после введения специфического ингибитора miR-204-5p происходит изменение экспрессии генов, связанных с регуляцией процессов воспаления и функционирования системы иммунобиологического надзора.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Богданова, И.М. Ключевая роль опухоль-ассоциированных макрофагов в прогрессировании и метастазировании опухолей / И.М. Богданова, М.Н. Болтовская, А.Л. Рахмилевич, [и др.]. // - 2019. - Т. 40, № 4. - P. 41-47.

2. Дубовцева, И.Ю. FOXC1-опосредованное влияние микроРНК miR-204-5p на пролиферацию клеток меланомы / И. Ю. Дубовцева, М. Б. Аксененко, Е. Д. Николаева, [и др.]. // Молекулярная биология. - 2021. - Т. 55, № 4. -C. 667-675.

3. Имянитов, Е. Н. Эпидемиология и биология опухолей кожи / Е. Н. Имянитов // Практическая онкология. - 2012. - Т. 13, № 2. - С. 61-68.

4. Лаврентьев, С.Н. Повышение уровня экспрессии miR-204-5p в клетках меланомы под воздействием дакарбазина / С.Н. Лаврентьев, М.Б. Аксененко, А.С. Аверчук, [и др.]. // Сибирский онкологический журнал. -2019. - Т. 18, №3. - С. 45-53.

5. Лапкина Е.З. Оценка противоопухолевых, токсических эффектов и характера экспрессии генов-мишеней miR-204-5p при применении ее имитатора на модели меланомы B-16 in vivo / Е.З. Лапкина, Н.В. Палкина, А.С. Аверчук [и др.]. // Сибирский онкологический журнал. - 2022. - Т. 21, №3. - С. 61-69.

6. Олейник, Е.К. Микроокружение опухоли: формирование иммунного профиля / Е.К. Олейник, М.И. Шибаев, К.С. Игнатьев, [и др.]. // Медицинская иммунологияю. - 2020. - Т. 22, № 2. - C. 207-220.

7. Орлова, К.В. Персонализированная терапия метастатической меланомы кожи / К.В. Орлова, Г.Ю. Харкевич, И.А. Утяшев, [и др.]. // "ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ. Онкология, гематология и радиология." - 2016. - № 39. C. 16-21.

8. Палкина, Н.В. Жизнеспособность клеток меланомы B16 in vitro и токсичности ингибитора miR204-5 p (LNA™) in vivo при модуляции экспрессии miR-204-5p у мышей / Н.В. Палкина, А.В. Комина, М.Б. Аксененко, [и др.]. // Цитология. - 2018. - Т. 3, №60. - С. 180-187.

9. Рукша, Т.Г. Злокачественные новообразования кожи: анализ заболеваемости в Красноярском крае, проблемы профилактики и совершенствования ранней диагностики / Т.Г. Рукша, М.Б. Аксененко, С.Н. Гырылова // Вестник дерматологии и венерологии. 2010. № 4. С. 4-9.

10. Чулкова, С. В. Перспективы использования микроРНК в качестве диагностических и прогностических биомаркеров меланомы / С. В. Чулкова, Д. А. Рябчиков, И. А. Дудина [и др.]. // Российский биотерапевтический журнал. - 2019. - Т. 18, № 4. - С. 51-56.

11. Шишкин, М. А. Особенности иммуногистохимической экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67 в опухолевых и стромальных клетках. колоректальной аденокарциномы / М. А. Шишкин // Потология -2011. - Vol. 2 №. 37 - P. 76-81.

12. Ahmed, B. Malignant Melanoma: Skin Cancer-Diagnosis, Prevention, and Treatment / B. Ahmed, MI. Qadir, S. Ghafoor // Crit Rev Eukaryot Gene Expr.

- 2020. - Vol. 30, № 4. - P. 291-297.

13. Aksenenko, M. MiR-204-5p modulators application in vitro and in vivo in melanoma cells / M. Aksenenko, N. Palkina, A. Komina, [et al.]. // Journal of Investigative Dermatology. - 2019. - Vol. 139, № 9. - P. 300.

14. Alnasser, SM. Review on mechanistic strategy of gene therapy in the treatment of disease / SM. Alnasser // Gene. - 2021. - Vol. 769. - P. 145246.

15. Amaral, T. The mitogen-activated protein kinase pathway in melanoma part I

- activation and primary resistance mechanisms to BRAF inhibition / T. Amaral, T. Sinnberg, F. Meier, [et al.]. //European Journal of Cancer. - 2017. -Vol. 73. - P. 93-101.

16. Andonegui-Elguera, M.A. An Overview of Vasculogenic Mimicry in Breast Cancer / M.A. Andonegui-Elguera, Y. Alfaro-Mora, R. Caceres-Gutierrez, [et al.]. // Front Oncol. - 2020. - Vol. 10. - P. e220

17. Ankara, K. Vascular Mimicry: A Novel Neovascularization Mechanism Driving Anti-Angiogenic Therapy (AAT) Resistance in Glioblastoma / K. Angara, TF. Boring, AS. Arbab // Transl Oncol. - 2017. - Vol. 10, № 4. - P. 650-660.

18. Ascierto, P. A. What have we learned from cancer immunotherapy in the last 3 years? / P. A. Ascierto, F. M. Marincola, // J. Transl. Med. - 2014. - Vol. 12. - P. 141.

19. Atkins, M.B. Phase III trial comparing concurrent biochemotherapy with cisplatin, vinblastine, dacarbazine, interleukin-2, and interferon alfa-2b with cisplatin, vinblastine, and dacarbazine alone in patients with metastatic malignant melanoma (E3695): a trial coordinated by the Eastern Cooperative Oncology Group/ M.B. Atkins, J. Hsu, S. Lee, [et al.]. // Eastern Cooperative Oncology Group. // J Clin Oncol. - 2008. - Vol. 26, № 35. - P. 5748-54.

20. Ayub, A.Z. Cancer stem cells as key drivers of tumour progression / AZ. Ayub, TS. Ramasamy // J Biomed Sci. - 2018. - Vol. 25, № 1. - P. 20.

21. Bader, AG. Developing therapeutic microRNAs for cancer / AG. Bader, D. Brown, J. Stoudemire, [et al.]. Gene Ther. - 2011. - Vol. 18, № 12. - P. 11216.

22. Bajan, S. RNA-Based Therapeutics: From Antisense Oligonucleotides to miRNAs / S. Bajan, G. Hutvagner // Cells. - 2020. - Vol. 9, № 1. - P. 137.

23. Barnes, TA. HYPE or HOPE: the prognostic value of infiltrating immune cells in cancer. TA. Barnes, E. Amir // Br J Cancer. - 2017. - Vol. 117, № 4. - P. 451-460.

24. Bayraktar, R. miR-155 in cancer drug resistance and as target for miRNA-based therapeutics / R. Bayraktar, K. Van Roosbroeck // Cancer Metastasis Rev. - 2018. - Vol. 37, № 1. - P. 33-44.

25. Beck, B. Unravelling cancer stem cell potential / B. Beck, C. Blanpain // Nat Rev Cancer. - 2013. - Vol. 13, № 10. - P. 727-38.

26. Bedi, D. Targeted delivery of siRNA into breast cancer cells via phage fusion proteins / D. Bedi, JW. Gillespie, VA. Petrenko, [et al.]. // Mol Pharm. - 2013.

- Vol. 10, № 2. - P. 551-559.

27. Betancourt, LH. The Human Melanoma Proteome Atlas-Complementing the melanoma transcriptome / LH. Betancourt, J. Gil, A. Sanchez, [et al.]. // Clin Transl Med. - 2021. - Vol. 11, № 7. - P. e451.

28. Birbrair A. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis /A. Birbrair, T. Zhang, ZM. Wang, [et al.]. // Am J Physiol Cell Physiol. -2014. - Vol. 307, № 1. - P. 25-38.

29. Bhagyashree, RG. Antisense Oligonucleotides as Therapeutics and their Delivery / RG. Bhagyashree, G. Srinivasan // Curr Sci. - 2017. - Vol. 112, № 3.

- p. 490-498.

30. Bonneau, E. How close are miRNAs from clinical practice? A perspective on the diagnostic and therapeutic market / E. Bonneau, B. Neveu., E. Kostantin, [et al.]. // Ejifcc. - 2019. - Vol. 30, № 2. - P. 114-127.

31. Bottazzi, B. Aging, inflammation and cancer / B. Bottazzi, E. Riboli, A. Mantovani // Sem. Immunol. - 2018. - Vol. 40. - P. 74-82.

32. Boumahdi, S. SOX2 controls tumour initiation and cancer stem-cell functions in squamous-cell carcinoma /S. Boumahdi, G. Driessens, G. Lapouge, [et al.]. // Nature. - 2014. - Vol. 511, № 7508 - P. 246-250.

33. Boyle, SE. CD271 expression on patient melanoma cells is unstable and unlinked to tumorigenicity /SE. Boyle, CG. Fedele, V. Corbin, [et al.]. // Cancer Res. - 2016. Vol. 76, № 13. - P. 3965-3977.

34. Bray, F. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries / F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram I, [et al.]. // Cancer J Clin. - 2018. - Vol. 68, №6. - P. 394-424.

35. Bustelo, XR.Intratumoral stages of metastatic cells: a synthesis of ontogeny, Rho/Rac GTPases, epithelial-mesenchymal transitions, and more / XR. Bustelo // Bioassays. - 2012. - Vol. 34, № 9. - P. 748-59.

36. Cavalcante, P. MicroRNA signature associated with treatment response in myasthenia gravis: A further step towards precision medicine / P. Cavalcante, T. Mizrachi, C. Barzago, [et al.]. // Pharmacol. Res. - 2019. - Vol. 148. - P. 104388.

37. Chan, S.H. miR-21 microRNA expression in human gastric carcinomas and its clinical association / S.H. Chan, C.-W. Wu, A.F.Y. Li, C.-W. Chi, W.-C. Lin. Anticancer Res. 2008. - Vol. 28. - P. 907 - 911.

38. Chen, F. Down-regulated expression of miR-582 predicts poor prognosis and facilitates melanoma progression by targeting FOXC1 / F. Chen, D. Zhang // Arch Dermatol Res. - 2021. - № 10. - P. 1007.

39. Chen, Y. Bottleneck limitations for microRNA-based therapeutics from bench to the bedside / Y. Chen., H. Zhao, X. Tan, [et al.]. // Pharmazie. - 2015. - Vol. 70, № 3. - P. 147-154.

40. Chen, YS. Vasculogenic mimicry: a novel target for glioma therapy / YS. Chen, ZP. Chen // Chin J Cancer. - 2014. - Vol. 33, № 2. - P. 74-9.

41. Chew V. Immune Microenvironment in Tumor Progression: Characteristics and Challenges for Therapy / V. Chew, H.C. Toh, J.P. Abastado// J Oncol. -2012. - Vol. 2012. - P. 1-10.

42. Chinot, OL. The future of antiangiogenic treatment in glioblastoma // OL. Chinot, DA. Reardon Curr Opin Neurol. - 2014. - Vol. 27. - P. 675-682.

43. Chou J. microRNA-mediated regulation of the tumor microenvironment /J. Chou, P. Shahi, Z. Werb // Cell Cycle. - 2013. - Vol.12, № 20. - P. 32623271.

44. Cioanca AV. The role of melanocytes in the human choroidal microenvironment and inflammation: Insights from the transcriptome / AV.

Cioanca, CS. Wu, R. Natoli, [et al.]. // Pigment Cell Melanoma Res. - 2021. -Vol. 34, № 5. - P. 928-945.

45. Contador-Roca, M. Dioxin receptor regulates aldehyde dehydrogenase to block melanoma tumorigenesis and metastasis /M. Contador-Troca, A. Álvarez-Barrientos, J. Merino, [et al.]. // Mol Cancer. - 2015. - Vol. 14: 148.

46. Cui, J. Mechanisms and pathways of innate immune activation and regulation in health and cancer / J. Cui, Y. Chen, H.Y. Wang, [et al.]. Hum. Vaccine. Immunother. - 2014. - Vol. 10, № 11. - P. 3270-3285.

47. Curiel, T.J. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predict reduced survival / T.J. Curiel, G. Coukos, L. Zou, [et al.]. // Nat. Med. -2004. - Vol. 10, №9. - P. 942-49.

48. Czyz, M. Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Skin Cancers / M. Czyz // Cells. - 2019. - Vol. 8, № 6. - P. 540.

49. Daniotti, M. BRAF alterations are associated with complex mutational profiles in malignant melanoma / M. Daniotti, M. Oggionni, T. Ranzani, [et al.]. // Oncogene. - 2004. - Vol. 23, № 35. - P. 5968-77.

50.Davies, H. Mutations of the BRAF gene in human cancer/ H. Davies, G.R. Bignell, C. Cox, [et al.]. // Nature. - 2002. - Vol. 417. - P. 949-954.

51. De Guire, V. Circulating miRNAs as sensitive and specific biomarkers for the diagnosis and monitoring of human diseases: Promises and challenges / V. De Guire, R. Robitaille, N. Tétreault, [et al.]. // Clin. Biochem. - 2013. - Vol. 46, № 10-11. - P. 846-860.

52. Díaz-Martinez, M. miR-204-5p and miR-211-5 p Contribute to BREAK Inhibitor Resistance in Melanoma / M. Díaz-Martinez, L. Benito-Jardin, L. Alonso, [at el.]. // Cancer Res. - 2018. - Vol. 78, № 4. - P. 1017-1030.

53. Doglioni, G. Interactions in the (Pre)metastatic Niche Support Metastasis Formation / G. Doglioni, S. Parik, SM. Fendt // Front Oncol. - 2019. - Vol. 20, № 9. - P. 219.

54. Domains, R. Systemic T Cells Immunosuppression of Glioma Stem Cell-Derived Exosomes Is Mediated by Monocytic Myeloid-Derived Suppressor Cells / R. Domenic, D. Cesselli, D. Toffoletto, [et al.]. // PLoS One. - 2017. -Vol. 12, № 1. - P. e0169932.

55. Duda, DG. Premetastatic lung "niche": is vascular endothelial growth factor receptor 1 activation required? / DG. Duda, RK. Jain // Cancer Res. - 2101. -Vol. 70, № 14. - P. 5670-3.

56. Dwyer, A.R. Promotion of tumor invasion by tumor-associated macrophages: the role of CSF-1- activated phosphatidylinositol 3 kinase and Src family kinase motility signaling / A.R. Dwyer, E.L. Greenland, F.J. Pixley // Cancer (Basal). - 2017. - Vol. 9, № 6. - P. 68.

57. Erdag, G. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma / G. Erdag, JT. Schaefer, ME. Smolkin, [et al.]. // Cancer Res. -2012. - Vol. 72, № 5. - P. 1070-80.

58. Enkelmann, A. Specific protein and miRNA patterns characterise tumour-associated fibroblasts in bladder cancer / A. Enkelmann, J. Heinzelmann, F. von Eggeling, [et al.]. // J Cancer Res Clin Oncol. - 2011. - Vol. 137, № 5. - P. 751-9.

59. Erfani, E. Comparative expression analysis of putative cancer stem cell markers CD44 and ALDH1A1 in various skin cancer subtypes / E. Erfani, R. Roudi, A. Rakhshan, [et al.]. // Int J Biol Markers. - 2016. - Vol. 31, № 1. - P. 53-61.

60. Esau, CC. Therapeutic potential for microRNAs / CC. Esau, BP. Monia // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2007. - Vol. 59, № 2-3. - P. 101-114.

61. Falchook, GS. Activity of the oral MEK inhibitor trametinib in patients with advanced melanoma: a phase 1 dose-escalation trial / GS. Falchook, KD. Lewis, JR. Infante, [et al.]. // Lancet Oncol. - 2012. - Vol. 13. - P. 782-89.

62. Fattore, L. In Vitro Biophysical and Biological Characterization of Lipid Nanoparticles Co-Encapsulating Oncosuppressors miR-199b-5p and miR-204-5p as Potentiators of Target Therapy in Metastatic Melanoma / L. Fattore, V. Campani, CF. Ruggiero, [et al.]. // Int J Mol Sci. - 2020. - Vol. 21, № 6. - P. 1930.

63. Flaherty, KT. Improved survival with MEK inhibition in BRAF-mutated melanoma / KT. Flaherty, C. Robert, P. Hersey, [et al.]. // N Engl J Med. -2012. - Vol. 367. - P. 107-14.

64. Fridman, WH. The immune contexture in cancer diagnosis and treatment / WH. Fridman, L. Zitvogel , C. Sautès-Fridman C, [et al.]. // Nat Rev Clin Oncol. - 2017. - Vol. 14, № 12. - P. 717-734.

65. Galdiero, M.R. Marone G. Roles of neutrophils in cancer growth and progression / M.R. Galdiero, G. Varricchio, S. Loffredo // J. Leukoc. Biol. -2018. - Vol. 103, № 3. P. 457-464.

66. Gao, X. L. Cancer cell dormancy: mechanisms and implications of cancer recurrence and metastasis /X. L. Gao, M. Zhang, YL. Wang, [et al.]. // Onco Targets Ther. - 2017. - Vol. 10. - P. 5219-5228.

67. Gattazzo, F. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche / F. Gattazzo, A. Urciuolo, P. Bonaldo // Biochim Biophys Acta. - 2014. - Vol. 1840, № 8. - P. 2506-2519.

68. Giavazzi, R. Syngeneic murine metastasis models: B16 melanoma / R. Giavazzi, A. Decio // Methods Mol Biol. - 2014. - Vol. 1070. - P. 131-40.

69. Gill, T. Selective targeting of MYC mRNA by stabilized antisense oligonucleotides / T. Gill, H. Wang, R. Bandaru // Oncogene. - 2021. - Vol. 40, № 47. - P. 6527-6539.

70. Gonzalez, H. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression / H. Gonzalez, C. Hagerling, Z. Werb // Genes Dev. -2018. - Vol. 32, № 19-20. - P. 1267-1284.

71. Grabner, G. Longitudinal strain imaging of five malignant glioma patients treated with bevacizumab using susceptibility-weighted magnetic resonance imaging at 7 T / G. Grabner, I. Nobauer, K. Elandt, [et al.]. // Magn Reson Imaging. - 2012. - Vol. 30, № 1. - P. 139-147.

72. Gray-Schopfer, V. Melanoma biology and new targeted therapy / Gray-Schopfer V., Wellbrock C., Marais R. //Nature. - 2007. - Vol. 445, № 7130. -P. 851-857.

73. Guo, J. Chinese Guidelines on the Diagnosis and Treatment of Melanoma / J. Guo, S. Qin, J. Liang, [et al]. // (2015 Edition). Chin Clin Oncol. - 2016. - Vol. 5, № 4. - P. 57.

74. Harries, L.W. RNA biology provides new therapeutic targets for human disease / L.W. Harries // Front. Genet. - 2019. - Vol 10. - P. 1-12.

75. Hatanaka, H. Clinical implication of interleukin (IL)-10 induced by non-small-cell lung cancer / H. Hatanaka, Y. Abe, T. Kamiya, [et al.]. // Ann. Oncol. -2000/ - Vol. 9, № 5. - P. 815-9.

76. Heusinkveld, M. Identification and manipulation of tumor associated macrophages in human cancers / M. Heusinkveld, SH. van der Burg // J. Transl. Med. - 2011. - Vol. 16, № 9. - P. 216.

77. Hong, BS. Tumor Suppressor miRNA-204-5p Regulates Growth, Metastasis, and Immune Microenvironment Remodeling in Breast Cancer // BS. Hong, H. Ryu, N. Kim, [et al.]. // Cancer Res. - 2019. - Vol. 79, № 7. - P. 1520-1534.

78. Hodi, FS. Nivolumab plus ipilimumab or nivolumab alone versus ipilimumab alone in advanced melanoma (CheckMate 067): 4-year outcomes of a multicentre, randomised, phase 3 trial / FS. Hodi, V. Chiarion-Sileni, R. Gonzalez, [et al.]. // Lancet Oncol. - 2018. - Vol. 19. - P. 1480-1492.

79. Hugo, W. Non-genomic and immune evolution of melanoma acquiring MAPKi resistance / W. Hugo, H. Shi, L. Sun, [et al.]. // Cell. - 2015. - Vol. 162, № 6. - P. 1271-1285.