Роль марк- и PI3K-зависимых сигнальных каскадов в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Лянгузова, Мария Сергеевна

• Лянгузова, Мария Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лянгузова, Мария Сергеевна

Оглавление

Введение

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Обзор литературы

Эмбриональные стволовые клетки

История получения эмбриональных стволовых клеток 8 Происхождение и основные свойства ЭСК мыши: плюрипотентность и самообновление

Молекулы, необходимые для поддержания недифференцированного состояния

LIF-Stat3 путь

Транскрипционный фактор Oct 3/

Транскрипционный фактор Nanog

Клеточный цикл

Структура клеточного цикла

Регуляция активности циклин-зависимых киназ

Регуляция перехода G1-.S ростовыми факторами

Особенности пролиферации ЭСК

Р13К-зависимый путь

Общее описание

Фосфатаза PTEN - негативный регулятор Р13К-зависимого пути

Семейство PI3K

PI3K I класса

PI3K II класса

PI3K III класса

Ингибиторы Р13-киназы

Вортманнин

Киназа PKB/Akt - ключевое звено в передаче сигнала от PI3K

Механизмы, которые обеспечивают антиапоптотическое действие киназы

PKB/Akt 39 Механизмы, с помощью которых киназа PKB/Akt стимулирует пролиферацию

Р13К-зависимый путь в ЭСК.

Роль PI3K в поддержании недифференцированного состояния ЭСК

Роль фосфатазы PTEN

ЭСК-специфичный белок Eras

Материалы и методы

Клеточные линии, их культивирование и дифференцировка

Построение кривых роста популяций.

Проточная цитофлуориметрия ДНК.

Оценка жизнеспособности популяций (МТТ тест)

Вестерн-блоттинг.

In vitro анализ киназной активности.

Обратная транскрипция и ПЦР.

Анализ экспрессии маркера старения $А ¡5-Gal

Люциферазная активность in vitro

Количественная ПЦР

Анализ активности каспазы

Реаультаты

Влияние сывороточного голодания на активность ERK- и Р13К-зависимых сигнальных каскадов и структуру клеточного цикла в ЭСК

Влияние ингибиторов сигнальных каскадов на распределение ЭСК мыши по клеточному циклу.

Анализ распределения ЭСК мыши по фазам клеточного цикла при сочетании сывороточного голодания и инактивации ERK и Р13К-зависимых сигнальных ка скадов.

Влияние сывороточного голодания и обработки LY294002 на содержание и активность белков, регулирующих G1—S переход в ЭСК мыши.

Анализ влияния инактивации cdk2 на G1->S переход ЭСК мыши

Негативное влияние LY2940Q2 на рост популяции ЭСК мыши

Индукция апоптотической гибели ЭСК мыши в результате сывороточного голодания и обработки LY

Сравнение эффектов двух ингибиторов PI3K LY294002 и вортманнина на ЭСК мыши

Дифференцировка ЭСК мыши

Старение ЭСК мыши

Обсуждение

Действие сывороточного голодания на ЭСК мыши

Действие ингибитора Р13К-зависимого каскада 1У294002 на ЭСК мыши

Сравнение действия ингибиторов Р13К ЬУ294002 и вортманнина на ЭСК мыши

Дифференцировка ЭСК мыши

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Лянгузова, Мария Сергеевна

Выводы

1. Удаление ростовых факторов из среды культивирования снижает активность Егк- и Р13К-зависимых каскадов в эмбриональных стволовых клетках мыши, но не вызывает остановки пролиферации; при этом в клетках не происходит снижения активности комплексов циклин Е/сс1к2.

2. Ингибирование активностей МАРК-каскадов (Егк, ЖК, р38) не приводит к изменению распределения эмбриональных стволовых клеток мыши по фазам клеточного цикла, в то время как ингибитор Р13-киназы ЬУ294002 вызывает накопление клеток в фазе и снижение доли клеток в фазе синтеза ДНК. Антипролиферативный эффект ингибитора усиливается в условиях сывороточного голодания.

3. Ингибитор Р13-киназы ЬУ294002 вызывает в эмбриональных стволовых клетках мыши снижение активности транскрипционного фактора Е2Р1, а также активности комплексов циклин Е/с<1к2, что, однако, не сопровождается накоплением ингибитора циклин-киназных комплексов р271ар.

4. Как сывороточное голодание, так и обработка ингибитором Р13-киназы ЬУ294002 вызывают апоптотическую гибель и негативно влияют на рост популяции эмбриональных стволовых клетках мыши. список работ. опубликованных по теме диссертации

1. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Поспелов В.А. 2004. Необходимость активации Р13-киназы для пролиферации клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9. Цитология. 46 (1):26-34.

2. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Нордхайм А., Поспелов В.А. 2006. Фармакологические ингибиторы Р13-киназы вортманнин и LY294002 оказывают различное действие на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши. Цитология. 48 (7):560-568.

3. Lianguzova M.S. Chuykin I.A., Nordheim A., Pospelov V.A. 2007. Phosphoinositide 3-Kinase inhibitor LY294002 but not serum withdrawal suppresses proliferation of murine embryonic stem cells. Cell Biol Int. 31:330-337.

4. Liangouzova M. S. Tchuikin I. A., Pospelov V. A. Proliferation of early embryonic cells depends on PI3 kinase activity but not MAP kinases activity. 14th European Student Conference at Charite (Берлин, Германия, 4-9 ноября 2003 г.). Abstract book. 405.

5. Поспелов B.A., Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Малашичева А.Б. Механизмы автономной пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши. Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 25- 27 октября 2004 г.).

6. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Поспелов В.А. Влияние ингибитора PI3 Киназы LY294002 на регуляцию перехода G1/S в эмбриональных стволовых клетках мыши. VI Международная конференция "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 12-16 декабря 2005 г.). Сборник тезисов конференции, 98-99.

7. Lianeuzova M.S. Nordheim A., Pospelov V.A. Influence of PI3-kinase inhibitor LY294002 and serum deprivation on the proliferation of murine embryonic stem cells. FEBS/EMBO Workshop "Spatial and Temporal Regulation of Signaling" (Осло, Норвегия, 21-24 сентября 2006 г.).

Заключение

Полученные данные приводят нас к заключению, что пролиферация ЭСК мыши может быть стимулирована несколькими независимыми друг от друга сигнальными путями. Во-первых, ЭСК мыши способны пролиферировать в отсутствие ростовых факторов в среде культивирования, что свидетельствует о существовании эндогенной митогенной активности. Наши исследования показали, что эту митогенную активность можно подавить ингибитором Р13К ЬУ294002 или ингибитором С(1к2 росковитином. Следует отметить, что подавление пролиферации ЬУ294002 сопровождается снижением активности транскрипционных факторов Е2Р1 и сс1к2-содержащих комплексов. Во-вторых, несмотря на способность ЭСК к пролиферации в отсутствие ростовых факторов, сыворотка, тем не менее, может стимулировать пролиферацию ЭСК, о чем свидетельствует увеличение доли клеток в фазе в при добавлении сыворотки клеткам, обработанным ЬУ294002 или росковитином.

Поскольку полученные данные свидетельствуют о том, что при сывороточном голодании в ЭСК мыши содержание и активность белков, положительно регулирующих пролиферацию (циклин 01, с<Ис2, Е2Р1), остаются на высоком уровне, а негативный регулятор пролиферации, р27кФ, наоборот, не накапливается, можно заключить, что в ЭСК не функционирует ставшая классической для клеток других типов цепь передачи сигнала "ростовые факторы -регуляторы клеточного цикла". Интересно, что активность сигнальных каскадов Егк и Р13К в ЭСК мыши зависит от присутствия сыворотки в среде культивирования, а значит, упомянутая цепь разомкнута "ниже по течению" сигнала. На каком звене цепи возникает автономность митотического сигнала в

ЭСК, и как происходит восстановление зависимости пролиферации от ростовых факторов в результате дифференцировки клеток - вопрос, который должен стать предметом исследований в ближайшее время.

Как отсутствие ростовых факторов, так и ингибитор Р13К ЬУ294002 вызывают апоптоз ЭСК мыши. По-видимому, сыворотка снабжает ЭСК сигналами к выживанию, которые опосредованы в частности, Р13К-зависимым каскадом. Это предположение также требует более детального изучения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лянгузова, Мария Сергеевна, 2007 год

1. Малашичева А.Б., Кислякова Т.В., Саватьер П., Поспелов В.А. 2002. Эмбриональные стволовые клетки не вступают в арест клеточного цикла под воздействием ДНК-повреждающих факторов. Цитология. 44(7):643-8.

2. Досон Р., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. 1991. Москва, «Мир».

3. Розанов Ю.М. Проточная цитометрия. 1988. Методы культивирования клеток, с.221-231 Ленинград. Изд.Наука.

4. Alessi D. R., Caudwell F. В., Andjelkovic М., Hemmings В. A., Cohen, P. 1996. Molecular basis for the substrate specificity of protein kinase B: comparison with MAPKAP kinase-1 and p70 S6 kinase. FEBS Lett. 399:333-338.

5. Alt JR, Cleveland JL, Hannink M, Diehl JA. 2000. Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin Dl-dependent cellular transformation. Genes Dev. 14:3102-3114.

6. Bellacosa A, Testa JR, Staal SP, Tsichlis PN: A retroviral oncogene, akt, encoding a serine-threonine kinase containing an SH2-like region. Science 1991; 254:274-277.

7. Brunet A., Bonni A., Zigmond M. J., Lin M. Z., Juo P., Hu L. S., Anderson M. J., Arden К. C., Blenis J. and Greenberg M. E. 1999 .Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell. 96: 857-868.

8. Buchou Т., Vernet M, Blond O, Jensen HH, Pointu H. 2003. Disruption of the Regulatory |3 Subunit of Protein Kinase CK2 inMice Leads to a Cell-Autonomous Defect and Early Embryonic Lethality. Mol Cell Biol. 908-915

9. Burdon T, Smith A, Savatier P. 2002. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol. 12:432-438.

10. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A. 2003. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113:643-55.

11. Chen WS, Xu P, Gottlob K, Chen M, Sokol K, Shiyanova T, Roninson I, Weng W, Suzuki R, Tobe K, Kadowaki T, Hay N. 2001. Growth retardation and increased apoptosis in mice with homozygous disruption of the aktl gene. Genes Dev. 15:22032208.

12. Cheng A., Ross K.E., Kaldis P., Solomon M.J. 1999. Dephosphoiylation of cyclin-dependent kinases by type 2C protein phosphatases. Genes Dev. 13:29462957.

13. Cho H, Mu J, Kim JK, Thorvaldsen JL, ChuQ, Crenshaw EB III, Kaestner KH, Bartolomei MS, Shulman Gl, Birnbaum MJ. 2001. Insulin Resistance and a Diabetes Mellitus-Like Syndrome in Mice Lacking the Protein Kinase Akt2 (PKBß). Science. 292:1728-1731

14. Ciemerych MA, Sicinski P. 2005. Cell cycle in mouse development. Oncogene. 24:2877-2898.

15. Cross, D. A., Alessi, D. R., Cohen, P., Andjelkovich, M. and Hemmings, B. A. 1995. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. Nature. 378:785-789

16. Daheron L, Opitz SL, Zaehres H, Lensch WM, Andrews PW, Itskovitz-Eldor J, Daley GQ. 2004. LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22:770-8.

17. Datta S.R., Dudek H., Tao X., Masters S., Fu H., Gotoh Y., Greenberg M.E. 1997. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery, Cell, 91:231-241.

18. Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. 2000. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351:95-105.

19. Del Peso L., Gonzalez-Garcia M., Page C., Herrera R., Nunez G. 1997. Interleukin-3-induced phosphorylation of BAD through the protein kinase Akt, Science, 278:687-689

20. Dey, B. R.; Furlanetto, R. W.; Nissley, S. P. 1998. Cloning of human p55-gamma, a regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase, by a yeast two-hybrid library screen with the insulin-like growth factor-I receptor. Gene. 209: 175-183

21. Di Cristofano A., Pesce B., Cordon-Cardo C., Pandolfi P.P. 1998. Pten is essential for embryonic development and tumour suppression. Nat. Genet. 19:348-355

22. Diehl JA, Cheng M, Roussel MF, Sherr CJ. 1998. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin Dl proteolysis and subcellular localization. Genes Dev. 12:3499-511.

23. Dimova DK, Dyson NJ. 2005. The E2F transcriptional network: old acquaintances with new faces. Oncogene. 24:2810-26.

24. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I., Pereira-Smith O. 1995. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. PNAS. 92:9363-9367.

25. Domin J, Pages F, Volinia S, Rittenhouse SE, Zvelebil MJ, Stein RC, Waterfield MD. 1997. Cloning of a human phosphoinositide 3-kinase with a C2 domain that displays reduced sensitivity to the inhibitor wortmannin.Biochem J. 326:139-147.

26. Downward J. 2004. PI 3-kinase, Akt and cell survival. Seminars in Cell & Dev Biol. 15:177-182

27. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. 1981. Nature. 292(5819): 154-6.

28. Faast R, White J, Cartwright P, Crocker L, Sarcevic B, Dalton S. 2004. Cdk6-cyclin D3 activity in murine ES cells is resistant to inhibition by pl6(INK4a). Oncogene. 23:491-502.

29. Fluckiger A, Marcy G, Marchand M, Negre D, Cosset F, Mitalipov S. 2006. Cell cycle features of primate embiyonic stem cells. Stem Cells; 24: 547-56.

30. Fujii-Yamamoto H, Kim JM, Arai K, Masai H. 2005. Cell cycle and developmental regulations of replication factors in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 280:12976-12987.

31. Gearing DP, Gough NM, King JA, Hilton DJ, Nicola NA, Simpson RJ, Nice EC, KelsoA, Metcalf D. 1987. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF). EMBO J. 6:3995-4002

32. Gilbert S.F. Developmental biology, Sixth edition, 2000, Sinauer associates, inc., Publishers Sunderland, Massachusetts, CI1IA.

33. Gille H, Downward J. Multiple ras effector pathways contribute to G(l) cell cycle progression. 1999. J Biol Chem. 274:22033-22040.

34. Gilley J, Coffer PJ, Ham J. 2003. FOXO transcription factors directly activate bim gene expression and promote apoptosis in sympathetic neurons. J Cell Biol. 162:613-622

35. Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R. 1986. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. PNAS. 83:9065-9069.

36. GrossVS, Hess M, Cooper GM. 2005. Mouse Embryonic Stem Cells and Preimplantation Embryos Require Signaling Through the Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway to Suppress Apoptosis. Mol Reprod and Dev. 70:324-332

37. Hay DC, Sutherland L, Clark J, Burdon T. 2004. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 22:225-235.

38. Jones SM, Kazlauskas A. 2001Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression. FEBS Lett 490:110-116

39. Jones SM, Klinghoffer R, Prestwich GD, Toker A, Kazlauskas A. 1999. PDGF induces an early and a late wave of PI 3-kinase activity, and only the late wave is required for progression through Gl. Curr Biol. 9 :512-521.

40. Khwaja A, Rodriguez-Viciana P, Wennstrom S, Warne PH, Downward J. 1997. Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway. EMBO J. 16:2783-2793.

41. Malumbres M, Sotillo R, Santamaria D, Galan J, Cerezo A, Ortega S, Dubus P,Barbacid M. 2004. Mammalian cells cycle without the D-type cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6. Cell. 118:493-504.

42. Martin GR. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. PNAS. 78:7634-8.

43. Matsuda T, Nakamura T, Nakao K, Arai T, Katsuki M, Heike T, Yokota T. 1999 STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J. 18:4261-4269

44. Mazumder S, Gong B, Chen Q, Drazba J A., Buchsbaum JC., Almasan A. 2002. Proteolytic Cleavage of Cyclin E Leads to Inactivation of Associated Kinase Activity and Amplification of Apoptosis in Hematopoietic Cells. Mol and Cell Biol. 22: 23982409

45. Medema, R. H.; Kops, G. J. P. L.; Bos, J. L.; Burgering, B. M. T. 2000. AFX-like forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27(kipl). Nature. 404:782-787.

46. Meikrantz W., Schle R. 1996. Suppression of Apoptosis by Dominant Negative Mutants of Cyclin-dependent Protein Kinases. JBC. 27:10205-10209

47. Metcalf D. The Unsolved Enigmas of Leukemia Inhibitory Factor. 2003. Stem Cells. 21:5-14

48. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S. 2003. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113:631-42.

49. Mueller PR, Coleman TR, Kumagai A, Dunphy WG. 1995. Mytl: a membrane-associated inhibitory kinase that phosphorylates Cdc2 on both threonine-14 and tyrosine-15. Science. 270:86-90.

50. Murakami M, Ichisaka T, Maeda M, Oshiro N, Hara K, Edenhofer F, Kiyama H, Yonezawa K, Yamanaka S. 2004. mTOR is essential for growth and proliferation in early mouse embryos and embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 24:6710-6718

51. Nichols J, Evans EP, Smith AG. 1990. Establishment of germ-line-competent embryonic stem (ES) cells using differentiation inhibiting activity. Development. 110:1341-1348.

52. Nilsson I, Hoffmann I. 2000. Cell cycle regulation by the Cdc25 phosphatase family. Prog Cell Cycle Res. 4:107-114

53. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. 2000. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet. 24:372-376.

54. Niwa H. 2001. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells. Cell structure and function. 26:137-148.

55. Ohtani, K.; DeGregori, J.; Nevins, J. R. 1995. Regulation of the cyclin E gene by transcription factor E2F1. PNAS. 92:12146-12150.

56. Ortega S, Prieto I, Odajima J, Martin A, Dubus P, Sotillo R, Barbero JL, Malumbres M, Barbacid M. 2003. Nat Genet. 35:25-31. Cyclin-dependent kinase 2 is essential for meiosis but not for mitotic cell division in mice.

57. Ozes О. N., Mayo L. D., Gustin J. A., Pfeffer S. R., Pfeffer L. M., Donner D. B. 1999. NF-kB activation by tumour necrosis factor requires the Aky serine-threonine kinase. Nature, 401(6748):82-85.

58. Paling N, Wheadon H, Bone H, Welham M. 2004. Regulation of Embryonic Stem Cell Self-renewal by Phosphoinositide 3-Kinase-dependent Signaling. J Biol Chem. 279:48063-48070.

59. Pardee AB. 1974. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. PNAS. 71:1286-1290.

60. Parker LL, Piwnica-Worms H. 1992. Inactivation of the p34cdc2-cyclin В complex by the human WEE1 tyrosine kinase. Science. 257:1955-1957.

61. Pesce M, Scholer HR. 2001. Oct-4: Gatekeeper in the Beginnings of Mammalian Development. Stem Cells; 19:271-278

62. Poon R.Y., Hunter T. 1995. Dephosphorylation of Cdk2 Thrl60 by the cyclin-dependent kinase-interacting phosphatase КАР in the absence of cyclin. Science. 270:90-93

63. Roach ML, McNeish JD, Metods for the isolation and Maintenance of murine Embryonic stem cells, c. 1-16 в кн. Embryonic Stem Cells. Metods and Protocols. Humana Press Inc., 2002.

64. Romashkova JA., Makarov SS. 1999. NF-kB is a target of AKT in antiapoptotic PDGF signalling. Nature. 401:86-90

65. Sarbassov DD, Guertin DA, Ali SM, Sabatini DM. 2005. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science. 307:1098-1101

66. Savatier P, Huang S, Szekely L, Wiman KG, Samarut J. 1994. Contrasting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts. Oncogene. 9:809-818.

67. Schulze M, Ungefroren H, Bader M, Fandrich F. 2006. Derivation, maintenance, and characterization of rat embryonic stem cells in vitro. Methods Mol Biol. 329:4558.

68. Sherr C.J., Roberts J.M. 1999. CDK inhibitors: positive and negative regulators of Gl-phase progression. Genes Dev. 13:1501-1512.

69. Smith AG, Hooper ML. 1987. Dev Biol. 121:1-9. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells.

70. Stambolic V., Suzuki A., de la PompaJ.L., Brothers G.M., Mirtsos C., Sasaki T., Ruland J., Perminger J.M., Siderovski D.P., Mak, T.W. 1998. Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN. Cell; 95:29-39

71. Stead E, White J, Faast R, Conn S, Goldstone S, Rathjen J, Dhingra U, Rathjen P, Walker D, Dalton S. 2002. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities. Oncogene. 21:8320-8333.

72. Stein RC, Waterfield MD. 2000. PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today. 6:347-57

73. Stephens L.R., Jackson T.R., Hawkins P.T. 1993. Agonist-stimulated synthesis of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate: a new intracellular signalling system? Biochim. Biophys. Acta. 1179:27-75

74. Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ. 1992. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. Nature. 359:76-79.

75. Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S. 2003. Role of ERas in promoting tumourlike properties in mouse embryonic stem cells. Nature. 423(6939):541-545.

76. Takahashi K, Murakami M, Yamanaka S. 2005. Role of the phosphoinositide 3-kinase pathway in mouse embryonic stem (ES) cells. Biochemical society transactions. 33:1522-1525.

77. Thomas KR, Capecchi MR. 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embiyo-derived stem cells. Cell. 51:503-512.

78. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science. 282:1145-7.

79. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP. 1995. Isolation of a primate embryonic stem cell line. PNAS. 92:7844-8

80. Tomida M, Yamamoto-Yamaguchi Y, Hozumi M. 1984. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic Ml cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259:10978-10982

81. Understanding Stem Cells: An Overview of the Science and Issues from the National Academies. 2007. National Academy of Sciences. Washington, D.C.

82. Vanhaesebroeck B, Alessi DR. 2000. The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB.Biochem J. 346:561-76.

83. Vanhaesebroeck B, Leevers S.J., Ahmadi K., Timms J., Katso R., Driscoll P.C., Woscholski R., Parker P.J., Waterfield M.D. 2001. Synthesis and function of 3-phosphorylated inositol lipids. Annu. Rev. Biochem. 70:535-602.

84. Virbasius JV, Guilherme A, Czech MP. 1996. Mouse pi70 is a novel phosphatidylinositol 3-kinase containing a C2 domain. J. Biol. Chem. 271:13304— 13307.

85. Vlach J, Hennecke S, Amati B. 1997. Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. EMBO J. 16:5334-5344.

86. Walker EH, Pacold ME, Perisic 0, Stephens L, Hawkins PT, Wymann MP, Williams RL. 2000. Structural Determinants of Phosphoinositide 3-Kinase Inhibition by Wortmannin, LY294002, Quercetin, Myricetin, and Staurosporine. Mol Cell. 6: 909-919.

87. Wang S, Tang X, Niu Y, Chen H, Li B, Li T, Zhang X, Hu Z, Ji W. 2007. Generation and Characterization of Rabbit Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 25:481-9.

88. Watcharasit P, Bijur GN, Zmijewski JW, Song L, Zmijewska A, Chen X, Johnson GV, Jope RS. 2002. Direct, activating interaction between glycogen synthase kinase-3beta and p53 after DNA damage.PNAS. 99:7951-7955

89. Williams RL, Hilton DJ, Pease S, Willson TA, Stewart CL, Gearing DP, Wagner EF, Metcalf D, Nicola NA, Gough NM. 1988. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336:684-687.

90. Zhou B. P., Liao, Y., Xia, W., Spohn B., Lee M. H., Hung M. C. 2001. Cytoplasmic localization of p21Cipl/WAFl by Akt-induced phosphorylation in HER-2/neu-overexpressing cells. Nat. Cell Biol. 3:245-252.1. Благодарности