Роль гормонов в быстрой реакции растений пшеницы на неблагоприятные воздействия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Веселов, Дмитрий Станиславович

• Веселов, Дмитрий Станиславович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Веселов, Дмитрий Станиславович

1.1.Характеристика цитокининов и АБК

1.1.1 .Цитокинины

1.1.1.1 .Биосинтез цитокининов

1.1.1.2.Метаболизм цитокининов

1.1.2. Абсцизовая кислота (АБК)

1.1.2.1 .Биосинтез

1.1.2.2.Дальнейшие превращения АБК

1.1.2.3.Влияние обмена веществ на физиологическую активность

1.1.2.4. Локализация и регулирование метаболизма

1.2. Гормоны как регуляторы водного баланса

1.2.1 .Гормоны и поведение устьиц

1.2.1.1.Образование и распределение абсцизовой кислоты в связи с функционированием устьиц

1.2.1.2.Механизм действия АБК на устьица

1.2.1.3.Цитокинин ы

1.2.2.Гормоны и интегрированный ответ растений на водный стресс

1.2.2.1.Корн и

1.2.2.2. Листья

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Условия выращивания растений и проведения экспериментов

2.2. Методы исследования

2.2.1 Измерение роста растений

2.2.3. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов

2.2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

2.2.5.Определение содержания гормонов в ксилемном соке

2.2.6.0пределение активности кислой пероксидазы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Динамика содержания цитокининов в связи с регуляцией поглощения и потери воды у растений на фоне действия токсичных концентраций Ионов кадмия

3.2.Динамика содержания гормонов и физиологических показателей у растений пшеницы при действии ПЭГ

3.2.1. Быстрые реакции на ПЭГ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

2

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль гормонов в быстрой реакции растений пшеницы на неблагоприятные воздействия»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Общепризнанно, что гормоны играют важную роль в адаптации растений к условиям обитания. Предполагается, что они выполняют функцию химических мессенджеров, которые транспортируются из одной части растения в другую, обеспечивая скоординированную реакцию на организменном уровне (Jackson, 1993). Физиологическая роль гормонов в основном реализуется через изменение их концентрации. Известно, что при неблагоприятных условиях обычно снижается концентрация гормонов стимулирующего типа действия (например, цитокининов) и возрастает концентрация гормонов - ингибиторов роста (например, АБК) (Salisbury, Marinos, 1985; Жолкевич, Пустовойтова, 1993). Полагают, что эти изменения концентрации гормонов приводят к торможению роста, снижению транспирации и другим процессам, которые обеспечивают выживание растений при неблагоприятных условиях. Поэтому не удивителен интерес исследователей к изучению о механизма регуляции концентрации гормонов. Значение гормонального контроля транспирации при стрессе связано с тем, что при большинстве неблагоприятных воздействий возникает проблема поддержания водного баланса. Не прекращаются дискуссии о месте синтеза АБК, которая в, частности^ регулирует закрытие устьиц (Härtung et al, 1988; Zhang, Davies, 1991; Zong et al, 1996), а также о том, реагируют ли устьица на изменение концентрации АБК в ксилемном соке или более важна скорость доставки гормона из корней за единицу времени (Tardieu, Davies, 1992; Gowing et al, 1993; Jarvis, Davies , 1997; Zhang et al, 1997). Все чаще обсуждается возможная роль дальнейших превращений АБК в регуляции ее концентрации (Trejo et al, 1993). Пути метаболизма цитокининов изучены достаточно детально (Letham, 1983, Horgan, 1992; Binns, 1994). Тем не менее конкретных сведений о том, как при стрессе регулируется

3

концентрация цитокининов, не так уж много. Они, в основном, сводятся к информации о снижении содержания данных гормонов в ксилемном соке растений при ряде неблагоприятных воздействий (Кулаева, 1962; Jackson; 1993).

Весьма важно также получить ответ на вопрос о том, насколько быстро может меняться концентрация гормонов в растении. В некоторых случаях ответная реакция появляется уже через несколько десятков минут после введения экзогенного гормона в растение (Шакирова и др., 1982; Silverman et al, 1998; Guilfoyle, 1998). Может ли с такой же скоростью изменяться концентрация эндогенного гормона, запускающая быструю ответную реакцию? По последним данным, скорость полураспада в листе АБК, поступающей из корней , составляет всего несколько десятков минут (Zhang et al, 1997). Поэтому можно предполагать, что снижение скорости распада гормона даже при неизменном уровне синтеза должно приводить к быстрому накоплению АБК. Однако большинство исследователей анализировали содержание гормонов в лучшем случае через несколько часов после воздействия, и лишь немногие занимались изучением быстрых изменений концентрации гормонов (Кудоярова и др., 1990; Полевой и др. 1996; Tillberg, 1999).

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучить механизм и функциональное значение быстрых изменений концентрации цитокининов и АБК при действии осмотика полиэтиленгликоля (ПЭГ) и токсичной концентрации кадмия на проростки пшеницы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение влияния кадмия на скорость роста, транспирацию, поглощение элементов питания и содержание цитокининов в побегах и корнях и ксилемном экссудате проростков пшеницы.

4

2. Оценить влияние добавления ПЭГ в питательную среду на скорость роста, транспирацию и содержание цитокининов и АБК в побегах и корнях проростков пшеницы и их ксилемном экссудате.

3. Сопоставить динамику содержания АБК у проростков пшеницы с живыми и убитыми корнями в ответ на осмотический шок для выявления роли побегов и корней в регуляции содержания АБК.

4. На основе определения концентрации цитокининов в ксилемном соке и скорости транспирации рассчитать скорость поступления гормонов из корней в побег.

5. Сопоставить продолжительность периода, в течение которого в ответ на внешние воздействия появляются изменения в содержании цитокининов в побеге, со скоростью поступления цитокининов из корней, что позволит оценить роль транспорта гормонов в контроле быстрых гормональных реакций у растений.

Научная новизна. Показано, что первоначальное снижение концентрации цитокининов в проростках пшеницы в ответ на действие ионов кадмия в токсичной концентрации сопровождается снижением транспирации, ингибированием роста и поглощения ионов калия и нитратов. Восстановление активности перечисленных процессов происходило на фоне резкого возрастания содержания цитокининов как в побегах и корнях, так и ксилемном соке и, по всей видимости, было их следствием. Обнаружено, что быстрое торможение роста побега при добавление ПЭГ в питательную среду связано со столь же быстрым снижением содержания цитокининов в побеге, в то время как резкое ингибирование транспирации в большей степени обусловлено накоплением АБК.

Установлено, что 8-дневные проростки пшеницы сорта Безенчукская 139 в течение около 1 ч получают из корней количество цитокининов, равное их содержанию в побеге.

5

Обнаружено, что повышенное содержание АБК в побегах растений при добавлении ПЭГ в питательную среду характерно не только для растений с живыми, но и убитыми корнями, что свидетельствует о роли побега в обеспечении накопления гормона.

Практическая ценность. Изучение динамики концентрации эндогенных гормонов при действии стрессовых факторов может быть полезным для разработки рекомендаций по применению гормонов в качестве регуляторов устойчивости растений. Опыты с экзогенным зеатином свидетельствуют о целесообразности использования цитокининов для повышения устойчивости растений к токсичным металлам.

Апробация работы. Основные положения представлены на 5 симпозиуме международного общества по исследованию корней (СНА, Южная Каролина, 1996), 3 симпозиуме Российского общества физиологов растений «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), Научно-практической конференции «Биологические проблемы в высшей школе. Проблемы и решения» (Бирск, 1998), 11 Конгрессе Федерации Европейских Обществ Физиологов растений (Варна, 1998), IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

6

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Характеристика цитокининов и АБК.

1.1.1 .Цитокинины

Первый природный цитокинин был выделен в 1963 Letham (Letham, 1963) из незрелых семян Zea mays. После его идентификации вещество получило название зеатин. Цитокинины являются производными 6-аминопурина с замещением по аминогруппе при шестом атоме углерода пуринового кольца. Они образуются главным образом в кончике корня растения и транспортируются по ксилеме в надземные органы, о чем свидетельствует то, что эти гормоны обнаружили в пасоке растений (Henson, Wareing, 1984). Цитокинины были определены (Whitty, and Hall, 1974) «как вещества, которые в комбинации с ауксином стимулируют деление клеток и которые взаимодействуют с ауксином, определяя направления диффе-ренцировки клеток». Разнообразие эффектов цитокининов привело к формированию представления о том, что они (цитокинины) играют важную роль практически на всех этапах жизни растений (Horgan, 1992). Наиболее специфическим действием цитокининов является стимуляция клеточного деления. Они также стимулируют рост боковых побегов (Aung, 1986; Li, Bangerth, 1990), активируют прорастание семян и задерживают процессы старения (Kende, 1964; Тао et al., 1983), ингибируют рост корней в длину (Блохин, 1986; Van Staden, Harty, 1988) и формирование боковых корней (Дерфлинг, 1985), оказывают влияние на фотосинтетический аппарат, световые реакции фотосинтеза и метаболизм углерода (Чернядьев, 1993), транспорт ассимилятов (Борзенкова, Зорина, 1990) влияют на биосинтез нуклеиновых кислот и белков (Кулаева, 1982; Шакирова и др., 1982; Palni, 1983; Van Staden, Drewes, 1991), метаболизм азота (Кузнецов и др., 1986).

7

1.1.1.1.Биосинтез цитокинтов Регуляция концентрации гормонов на клеточном уровне - важный аспект функционирования гормональной системы. Концентрация гормонов зависит от скорости их синтеза, метаболизма и быстроты поступления в клетки и выхода из них.

Общепризнано, что биосинтез цитокининов начинается с присоединения диметилаллилпирофосфата в Н6 положении аденозинмонофосфата (АМФ) при помощи изопентенилтрансферазы (1р^, с образованием цито-кининриботида, Ы6У2-изопентенилАМР ([913.-5 Т]1Р). У бактерий Agrobacterium Штг/ааепз идентифицирован ген, кодирующий фермент, который катализирует эту реакцию (АЫуобЫ е1 а1, 1984; ВисИтапп е1 а1, 1985). Изопентенилтрансферазная активность обнаружена в тканях многих растений (Но^ап, 1992). Однако до сих пор не удалось добиться достаточной степени очистки этого фермента из растений, которая позволила бы охарактеризовать его субстратную специфичность и идентифицировать соответствующий ген.

Поскольку субстратом для данного фермента является фосфорили-рованное производное аденита, предполагается, что цитокинины могут появляться в растении в процессе модификации рибонуклеиновых кислот (Мс Оа\у, 1987; МагесЬа1-Бгоиагс1 е! а1., 1993). Это предположение подтверждает присутствие цитокининов в составе некоторых транспортных и рибосомальных РНК. Гидролиз модифицированных РНК может быть источником появления свободных цитокининов в растении. Известно, что в составе РНК содержатся в основном цис-формы гормона, в то время как свободные цитокинины - это в основном транс-формы. Однако этот факт не может служить опровержением того, что синтез свободных цитокининов идет через модификацию нуклеиновых кислот. Дело в том. что по последним данным возможно взаимопревращение цис- и транс-форм цитокини-

8

нов (Binns, 1994). Тем не менее этот вопрос остается открытым. Против данной гипотезы свидетельствует тот факт, что клетки, которые при культивировании in vitro не могли расти без добавления экзогенных цитокини-нов, тем не менее содержали достаточно цитокининов в составе их РНК (Letham, Palm, 1983).

1.1.1.2.Метаболизм цитокининов

Формирование свободных цитокининов начинается с биосинтеза [9R-5'P] iP (нуклеотида изопентениладенина) Это соединение может рассматриваться как предшественник остальных двадцати или около того свободных цитокининов. По всей видимости [9R-5'P]iP быстро и стереоспеци-фически гидроксилируются с образованием производных зеатина (Z). Это гидроксилирование является первым важным метаболическим превращением. С него начинаются многие метаболические реакции с последовательным образованием агликонов, глюкозидов, рибозидов, риботидов, конъюгатов аминокислот, а также продуктов его восстановления и окисления. Эти метаболические события могут быть подразделены на четыре большие группы, а именно: конъюгирование, гидролиз, восстановление и окисление. Локализация этих процессов обсуждается с использованием информации о ферментах, катализирующих специфические реакции. Кроме того сделана попытка определить роль различных метаболитов в регулировании проявления цитокининовой активности.

Конъюгаты

Рибозиды и Риботиды

Рибозиды цитокинина и их 5!моно ди- и три- фосфаты - вероятно, наиболее часто встречающиеся в природе цитокинины (Letham et al., 1983; McGaw et al., 1984; Scott, Horgan 1984). Рибоза всегда присоединяется в 9 положении пуринового кольца. Когда меченный по углероду зеатин вводили в растения, основными продуктами его превращения в растении были

9

[9R]Z (рибозид зеатина), и [9R-5'P]Z (нуклеотид зеатина) (Laloue, Fox, 1989). Дальнейшие исследования показали, что нуклеотиды являются доминирующими метаболитами сразу же после введения зеатина, но затем может происходить быстрый гидролиз этих соединений с образованием более устойчивых и менее активных продуктов (то есть, N-глюкозидов или продуктов окисления боковой цепи). Также был изучен метаболизм введенных извне [9R]Z и [9R]iP. Показано, что вновь за фосфорилированием следовал гидролиз и дальнейшие метаболические превращения (Letham et al., 1982; Chen, 1982). Процессы взаимного превращения основания цито-кинина, рибозидов и нуклеотидов имеют чрезвычайно большое значение для всех изученных тканей растений, и имеется доказательство, что их может катализировать та же самая система ферментов, которая метаболизи-рует основание, рибозид и нуклеотид аденина. Однако, участвующие в этих реакциях ферментативные системы были намного хуже охарактеризованы, чем приведенные выше процессы биосинтеза или процессы деградации, которые обсуждаются далее. Метаболические превращения, катализируемые 5 '-нуклеотидазой и нуклеозидазой, были обнаружены в экстрактах семян пшеницы (Chen, Kristopeit, 1981; Chen, Kristopeit, 1981), а также листьев и корней томатов (Burch, Stuchbury, 1986; Burch, Stuchbury, 1986), но в каждом случае ферменты имели более низкое сродство к Ш-замещенному пурину чем к немодифицированным азотистым основаниям и их производным. То что взаимные превращения цитокинина катализируют ферменты, метаболизирующие пурины, также было подтверждено с помощью исследования результатов введения экзогенных цитокининов in vivo (Laloue, Pethe, 1982). Тем не менее мы все еще понимаем очень немного относительно контроля этих процессов in vivo. В частности концентрации аденина, аденозина и аденозинмонофосфата (АМФ) в клетках обычно намного выше, чем соответствующих цитокининов. Однако, было высказано пред-

10

положение, что даже те ферменты, которые имеют довольно низкое сродство к цитокининам, тем не менее все же могут катализировать их взаимопревращение с достаточно высокой скоростью, принимая во внимание низкое содержание этих гормонов в растениях (Stuchbury, Burch, 1987).

Фермент аденинфосфорибозилтрансфераза, вероятно, играет главную роль в превращении аденина в AMP в растениях. Фермент, катализирующий фосфорибозилирование цитокинина, был выделен из таких растительных источников как семена пшеницы (Chen et al., 1982), помидора (Burch, Stuchbury, 1987), Arabidopsis íhaliana (Moffatt et al., 1991), и Acer pseudoplatanus (Sadorge et al., 1970; Doree, Guern, 1973). И вновь сродство фермента к основанию цитокинина было ниже, чем к аденину.

Поглощение клетками внесенных извне оснований цитокинина было связано с быстрым формированием соответствующего нуклеотнда (Auer et al., 1992), в процессе фосфорибозилирования с помощью связанной с клеточной стенкой аденинфосфорибозилтрансферазой. (АФРТ). Однако, важность АФРТ в поглощении внесенных извне оснований цитокинина была подвергнута сомнению в работе, выполненной на мутантах Arabidopsis thaliana, дефицитных по данному ферменту, (Moffatt, Somerville, 1988), у которого синтетический цитокинин бензиламинопурин (БАП) эффективно превращается в рибозиды и глюкозиды, хотя образование БАП в значительной степени подавлено (Moffatt et al., 1991). Не исключено, конечно, что у мутантных растений реализуется альтернативный путь, в то время как у исходных растений осуществляются превращения, катализируемые АФРТ.

Вероятный альтернативный путь для превращения оснований цитокинина в нуклеотид - двухэтапная реакция, катализируемая аденозинфос-форилазой и аденозинкиназой. Оба фермента были частично очищены из экстракта семян пшеницы и было показано рибозилирование основания

11

цитокинина с помощью аденозинфосфорилазы (Chen, Petschow, 1978), и фосфорилирование цитокининрибозида, с получением соответствующего нуклеотида (фермент - аденозинкиназа) (Chen, Eckert, 1977). Снова сродство обоих ферментов к Nö-замещенному пурину было меньше, чем к адени-ну .

У АФРТ-дефицитного Arahidopsis thaliana (Moffatt et al., 1991) обнаружена высокая активность аденозинфосфорилазы, которая может обеспечивать образование рибозида. Аденозинкиназная активность, которая приводит к превращению [9R]BATI в соответствующий нуклеотид, по всей видимости понижена или даже отсутствует у мутантов, дефицитных по АФРТ, поскольку у них обнаружено лишь незначительное образование [9R]BAII. Хотя действие АФРТ , вероятно, сводится к обеспечению поглощения цитокинина, эксперименты с АФРТ-мутантами показали, что имеются альтернативные пути поглощения цитокинина, которые могут функционировать параллельно с АФРТ.

Рибозиды и агликоны зеатина и изопентениладенина чрезвычайно активны в биотестах (Letham et al., 1983). В следствие той легкости, с которой все эти соединения взаимопревращаются при их внесении извне, до сих пор не известно, одно из них или они все являются активными молекулами. То же самое можно сказать и о их нуклеотидах, которые легко гид-ролизуются. При ряде воздействий обнаружено быстрое изменение соотношения нуклеотида зеатина и его свободной формы. Так например, при дегидратации листьев пшеницы у них снижается содержание нуклеотида зеатина, что обеспечивает поддержание уровня свободного зеатина в условиях ингибирования поступления цитокининов из корней (Мустафина и др., 1997).

12

Глюкозиды

В отличие от образовании рибозидов глюкозилирование не ограничивается девятым положением пуринового кольца. 7- и 9-глюкозиды и конъюгаты, образовавшиеся в результате гликолизирования гидроксила боковой цепи, являются основными цитокининами в некоторых тканях. 3-глюкозиды (Letham et al., 1982; McGaw et al., 1984) также были идентифицированы в качестве метаболитов внесенных извне цитокининов. N-глюкозилирование изучалось детально на модели тканей редьки , где преобладающим цитокинином был [7G] Z . Из семядолей редьки были частично очищены две глюкозилтрансферазы, которые разделялись на колонке с ДЕАЕ-носителем (Entsch, Letham, 1979). Оба фермента катализировали образование 7 и 9-глюкозидов, используя уридиндифосфоглюкозу или ури-динтрифосфоглюкозу в качестве источника сахара. Однако, соотношение их продуктов ([7G] БАЩ90]БАП) сильно различалось: приблизительно 10 к 1,5. Была изучена способность данного фермента гликозилировать большое количество различных природных и синтетических цитокининов (Entsch et al., 1979). Во всех случаях была определена скорость гликозили-рования и соотношение [7G]/[9G] продуктов. Интересно, что некоторые цитокинины (например, цис-Z и транс-Z и БАЛ) дали заметное количество 9-глюкозидов, но из других (например, дигидрозеатин(сШ) Z и (OG) Z) образовались только следы 9-глюкозил продуктов. Общие скорости реакции N-гликозилирования этих цитокининов различались незначительно. В тканях редьки N-глюкозилирование является преобладающим способом превращением внесенного извне цитокинина. Однако, в отличие от бесклеточной системы, образование [9G] Z не было зарегистрировано, когда меченный зеатин вносили извне in vivo (McGaw et al., 1985). Существует возможность, что другие, пока еще неидентифицированные, ферментативные системы также включаются в образование глюкозидов цитокинина.

13

Глюкозиды многих соединений скапливаются в вакуолях, где они оказываются изолированными от процессов, которые происходят в цитоплазме. Обнаружено, что накопление цитокининов в корнях в виде глюко-зидов приводит к ингибированию оттока гормонов из корней в побег (Митриченко, 1999).

Конъюгирование с образованием N-гликозидов играет важную роль в регулировании активности цитокинов. 7- и 9- гликозиды биологически неактивны (Letham et al., 1983), и чрезвычайно стабильны (то есть, не гид-ролизуются с образованием их активного агликона) в тканях, в которых они образуются (Parker, Letham, 1973). Однако, N-глюкозиды цитокининов, по всей видимости, являются источником активных цитокининов в растительных клетках, трансформированных с помощью Ri плазмиды Agrobacte-rium rhizogenes (Ri плазмида). В геноме этих клеток есть трансгены (rol С), кодирующие Р-глюкозидазы, которые способны гидролизовать N-глюкозиды цитокининов (Estruch et al., 1991). Некоторые ткани растений, по-видимому, не образуют N-глюкозиды (как в виде эндогенных соединений, так и метаболитов внесенных извне цитокининов) и в этих случаях реализуются другие способы инактивации (то есть, окисление боковой цепи или образование конъюгатов с аминокислотами).

Напротив, О-гликозиды являются скорее кандидатами на роль запасных форм цитокининов, чем формой инактивирования цитокининов подобно N-глюкозидам. По всей видимости, они обладают высокой биологической активностью, или непосредственно в форме глюкозидов или как продукты гидролиза, катализируемого Р-глюкозидазой. Действительно, исследование метаболических превращений(МсОалу et al., 1984; McGaw et al., 1985), меченного (OG)Z показывает, что он быстро гидролизуются с образованием агликона. Однако, в нескольких других экспериментах было показано, что применение меченного экзогенного Z может привести к

14

формированию больших количеств 0-гликозил производных, которые длительное время не метаболизируются (Parker et al., 1978). Эти результаты дают основание предполагать, что О-глюкозиды могут быть формой запасания цитокининов, отличающейся устойчивостью и все же способной быстро метаболизироваться при некоторых условиях, когда требуются биологически активные цитокинины. Дальнейшее подтверждение этой точки зрения было найдено в работе с эндогенными цитокининами Phaseolus vulgaris на различных стадиях развития (Palmer et al., 1981). Декапитадия этих растений, ведет к быстрому повышению количества (diHOG) Z в их листьях. В результате развития боковых почек уровень этого соединения резко снижается.

Конъюгаты аминокислот

[9А1а] Z (люпиновая кислота) и (diH)9AlaJZ (дигидролюпиновая кислота) являются минорными эндогенными цитокининами в незрелых стенках стручках и корневых клубеньках Lupinus luteus (Summons et al., 1981). 9-аланил конъюгаты Z и БАП были идентифицированы при внесении этих цитокининов извне в ткани Lupinus spp. (Parker et al., 1978), незрелые семена яблок и проростки Phaseolus с отрезанными корнями(ЬеЙ1ат, Palni, 1983).

Из развивающихся семян Lupinus luteus был выделен и охарактеризован фермент, р-(6-аллиламинопурин-9-ил)аденин синтаза, (Entsch et al., 1979). Этот фермент использует О-ацетил серин как донор аланинового остатка, но способен к конъюгации большого количества различных пури-новых субстратов (хотя присутствие N6- замещения значительно увеличивает скорость конъюгации).

Роль этих конъюгатов, вероятно, подобна роли N-глюкозил цитоки-нина. Это биологически неактивные (Letham et al., 1983), и чрезвычайно устойчивые соединения (Parker et al., 1978). Как и гликозилирование, обра-

15

зование конъюгатов аминокислот - это общий ответ тканей растения на ксенобиотики и, возможно, их превращение в более растворимые в воде соединения, облегчает проникновение цитокининов в вакуоли.

Гидролиз

Гидролиз рибозидов и риботидов цитокинина - главный компонент метаболизма внесенных извне цитокининов, особенно на ранних стадиях экспериментов, связанных с поглощением. Из семян пшеницы были выделены и охарактеризованы две формы 5 '-рибонуклеотидазы (отличающиеся по молекулярной массе), которые катализируют гидролиз [9R-5'P] iP с образованием [9R] iP (Chen, Kjistopeit, 1981), и нуклеозидаза аденина (Chen, Kristopeit, 1981), которая превращает [9R] iP в iP. В отличие от конъюгации ферментов, Ш-замещение слабо влияет на сродство субстрата к ферменту (то есть, АМФ и аденозин в такой же степени подходили в качестве субстратов, как и [9R-5'P] iP или [9R] iP). N-глюкозид и N-аланин конъюгаты чрезвычайно устойчивы (Parker, Letham, 1973; Parker et al., 1978) в тканях, в которых они синтезируются, и поэтому не найдены ферменты, способные катализировать гидролиз этих соединений. В некоторых случаях, однако, 0-глюкозиды легко гидролизуются. Выделенная р- глюкозидаза миндаля (эмульсин) может расщеплять 0-глюкозильную группу в этих соединениях (хотя не способна к гидролизу N-глюкозил конъюгатов). Так как 0-глюкозиды могут выполнять ключевую роль в качестве запасной формы цитокининов, их изучение является важной областью гормонологии. Исследования в будущем могут быть направлены на попытку управления ростом / развитием растения через контроль размера пула активных цитокининов.

Восстановление

В тканях растения часто обнаруживают производные дигидрозеати-на ((diH)Z). Они также часто образуются, как метаболиты экзогенного Z

16

(обычно конъюгирование идет с образованием 9-риботидов, или 0-глюкозидов) (Letliam, Palni, 1983; McGaw et al., 1984). В биотестах (diH)Z и его конъюгаты столь же активны, как и их зеатиновые аналоги (Letham et al., 1983). В экспериментах, где (diH) Z был введен в растение извне, он оказался более устойчивым чем Z (Palmer et al., 1981). Это могло быть следствием того, что дигидрозеатин не является субстратом для цитокинин оксидазы (фермент, который расщепляет N6- боковую цепь - смотри следующий раздел). В качестве более «защищенной» формы цитокининов (diH) Z возможно играет важную роль в сохранении уровня активности ци-токинина в тканях с высоким окислительным потенциалом. Фермент, который преобразовывает Z в (diH) Z, был частично выделен из эмбрионов Phaseolus и охарактеризован как NADPH-зависимая Z редуктаза. Фермент имел высокую специфичность к Z, в то время как его сродство к iP и [9R) Z было незначительным, что подтверждает решающую роль данного свободного основания, как активного цитокинина (Мок et al., 1990).

Окисление

Окислительное расщепление боковой цепи внесенных извне Z, iP, [9R] Z и [9R] iP с образованием аденина, аденозина и нуклеотидов аденина - главный путь превращения этих цитокининов во многих тканях (McGaw et al., 1984). Подобно формированию N-глюкозил или N-аланил конъюга-тов, расщепление боковой цепи ведет к необратимой потере активности цитокинина и может играть важную роль в регуляции его активности. Фермент цитокининоксидаза был частично выделен из ткани растений табака, зерновок кукурузы и ткани галлов Vinca rosea (McGaw, Horgan, 1983), пшеницы (Laloue, Fox, 1989), Phaseolus vulgaris (Härtung et al., 1981). В некоторых из этих тканей, специфичность фермента была исследована с помощью большого количества природных и синтетических цитокининов. Z [9R] Z, iP, [9R] iP, [7G] Z, [9G] Z и [9Ala] Z - все оказались субстратами

17

для данного фермента, однако восстановление в боковой цепи (то есть производные (diH) Z), замена функциональных групп (то есть бензиладе-нин, кинетин) и присутствие 0-глюкозил группы придают цитокининам устойчивость к окислению. Некоторые ткани (особенно редька), по-видимому, неспособны к расщеплению N6- боковой цепи. В этих случаях N-глюкозилирование является единственным механизмом, с помощью которого контролируется активность цитокининов. В других тканях, например Lupinus spp., используются оба пути инактивации (McGaw et al., 1984).

Механизм окислительного расщепления до конца не ясен, но 3-метил-2-бутеналь (Crocoll et al., 1991), и аденин (McGaw, Horgan, 1983), были идентифицированы с помощью газожидкостной хроматографии в сочетании как продукты действия оксидазы цитокинина на iP.

Работа с Phaseolus spp. (Härtung et al., 1981; Kaminek, Armstrong, 1990), подтверждает то, что уровни оксидаз могут регулироваться путем введения в растения цитокининового субстрата: после введения экзогенного цитокинина в тканях наблюдалось быстрое увеличение активности оксидазы. Было накоплено много информации относительно биохимии оксидазы (теперь известна медь содержащая аминоксидаза (Davies, Jones, 1991), в Z. Mays), но все еще неясна ее роль in vivo ; особенно местонахождение в тканях с высоким уровнем цитокинина и высокой относительной активностью фермента (например колоски, Z. mays и ткани опухоли Vinca rosea (McGaw, Horgan, 1983)). Иммуногистохимическое использование антител к оксидазе цитокинина может помочь получить ответ на некоторые из этих вопросов.

Таким образом, очистка и идентификация оснований цитокинина, рибозидов и нуклеотидов теперь стали относительно доступны. С развитием физико-химических методов и иммуноанализа мы теперь способны точно определить количество цитокинина, присутствующего в крайне низкой

18

концентрации. Впервые, поэтому, стало возможно изучить эндогенный метаболизм цитокинина без применения искусственного меченного гормона. Методами генной инженерии были получены мутанты с модификацией генов, ответственных за биосинтез цитокинина (McGaw, et al, 1994). С их помощью можно получить важную информацию относительно биохимии / физиологии цитокинина. Это дает основание надеяться, что применение такого подхода в конечном счете приведет к пониманию механизма действия и местонахождения активных цитокининов. Если будет достигнуто количественное определение цитокинина на клеточном уровне, это будет еще одним подходом к изучению регуляции уровня активных цитокининов.

1.1.2. Абсцизовая кислота (АБК).

АБК - это сесквитерпеноид, относящийся к классу терпенов. Она участвует во многих жизненно важных процессах, протекающих в растениях: принимает участие в регуляции функционирования устьиц (Blackman, Davies, 1983), определяет покой почек и семян (Wareing, 1978), влияет на рост побегов и корней (Leopold, Nooden, 1984; Кефели и др., 1989; Москалева, Каравайко, 1990;). Показано, что АБК способствует переходу семян в состояние покоя, подавляет преждевременное прорастание незрелых семян (Karrssen, Lacka, 1986; Neill et al., 1986). Считается, что абсцизовая кислота принимает участие в процессах адаптации растений к неблагоприятным условиям внешней среды (Пустовойтова, 1978; Дерфлинг, 1985; Кефели и др., 1989; Жолкевич, Пустовойтова, 1993; Jackson, 1993; Jones et al, 1997). При этом накопление АБК в листьях сопровождается закрытием устьиц и снижением транспирации (Zeevaart, Creelman, 1988). Абсцизовая кислота также может изменять гидравлическую проводимость корней (Collins, Kerrigan, 1974; Ludewig et al., 1988; Лялин, Лукоянова, 1993). АБК может

19

быть антагонистом цитокининов при их действии на многие процессы у растений (Кулаева, 1982; Jacqmard et al., 1995)

Уровень АБК может резко возрастать или падать в ответ на действие разнообразных факторов внешней среды и в процессе развития растения (Walton, Li, 1995). Во время водного стресса концентрация абсцизовой кислоты может увеличиваться в 50 раз за несколько часов благодаря уве= личению скорости биосинтеза, и наоборот, после восстановления нормального водного режима ее уровень быстро снижается. Во время развития семян различных растений концентрация АБК увеличивается в 100 раз в течение нескольких дней, а после созревания семян вновь падает до начального уровня.

На содержание эндогенной АБК влияет комбинация таких процессов, как биосинтез, метаболизм, экспорт и импорт в различных тканях. Чтобы узнать, каким образом регулируется концентрация абсцизовой кислоты на уровне биосинтеза и метаболизма, нужно выяснить, какие соединения участвует в процессах, обусловливающих изменение содержания гормона. Биосинтез АБК изучен достаточно детально. Правда, пока недостаточно информации относительно ферментов, участвующих в этом процессе.

1.1.2.1.Биосинтез

АБК является производным мевалоновой кислоты (МВК). Известно, что абсцизовая кислота в высших растениях образуется в результате распада ксантофилла. Работы по изучению биосинтеза были сильно затруднены из-за очень низкого содержания гормона в растениях и низкой скорости образования АБК из предшественников в случае введения их в растения в радиоактивной форме.

Первое описание пути биосинтеза абсцизовой кислоты приходится на 1965 год (Walton, Li, 1965). В результате фотооксиления виолоксантин

20

превращается в ксантоксин, который обнаружен во многих растениях. При введении в растения томатов и бобовые его радиоактивный изотоп легко превращался в АБК (Taylor, Burden, 1973). Несмотря на это еще долгое время не было получено прямых доказательств, что АБК образуется из ксантоксина. В 1977 году было сделано открытие, что гриб Cercospora rosicola продуцирует большое количество природных изомеров АБК (Asante et al., 1977), которое дало толчок интенсивным исследованиям путей биосинтеза абсцизовой кислоты. В результате этих исследований было доказано образование АБК из ксантофилла. Из среды, на которой росли грибы, была выделена 1-деоксиАБК (Neill et al., 1981). При введении обратно в ткань гриба она превращался в абсцизовую кислоту. АБК и 1-деокси АБК отличаются друг от друга только гидроксильной группой в 1 положении, поэтому логично предположить, что 1-деокси АБК является прямым непосредственным предшественником абсцизовой кислоты. Сходные с 1-деокси АБК соединения, такие как а-ионилиден уксусная кислота и 4-гидрокси-а-ионилиден уксусная кислота превращались в грибах как в 1 - деокси АБК, так и в абсцизовую кислоту (Neill et al., 1984). Эти два предшественника были введены в радиоактивной форме в ткани некоторых высших растений, но там они не могли превратиться в АБК из-за отсутствия у высших растениях специфических ферментов (Neill et al., 1984). Это означает, что путь биосинтеза абсцизовой кислоты в высших растениях иной.

В отличие от грибов, для растений характерен непрямой путь биосинтеза АБК через каротиноиды. Этот факт был подтвержден в опытах на мутантах с низким уровнем синтеза каротиноидов (Moore, Smith, 1985) и в опытах с использованием ингибиторов синтеза каротиноидов (таких как флуридон и норфлуразон), (Henson, 1984., Moore, Smith, 1984). В обоих случаях способность накапливать АБК снижалась. Для доказательства то-

го, что абсцизовая кислота синтезируется из виолоксантина, в последний была введена метка в виде 180. И действительно, у полученной АБК был найден меченный кислород (Li, Walton, 1987). В дальнейшем была проведена серия экспериментов (Taylor, 1987; Parry et al, 1988; Taylor et al, 1988; Sindhu et al, 1990; Duckham et al, 1991; Rock and Zeevaart, 1991; Parry et al, 1992; Parry and Horgan, 1992), которые позволили более подробно раскрыть путь синтеза абсцизовой кислоты в высших растениях. Упрощенно его можно представить следующим образом. Виолоксантин может превращаться либо в 9-цис-виолоксантин, либо в неоксантин. Оба этих соединения дают начало 9-цис-неоксантину, который в свою очередь превращается в ксантоксин. Ксантоксин служит источником для образования альдегида АБК, из которого и синтезируется АБК.

1.1.2.2.Дальнейшие превращения АБК

Исследование метаболизма абсцизовой кислоты, которое началось вскоре после открытия этого гормона, было успешным в плане идентификации метаболитов АБК. Этот успех частично можно объяснить тем, что в руках у исследователей очень быстро оказался препарат абсцизовой кислоты, меченный по радиоактивному углероду, и также благодаря тому, что при его введении в растение шло быстрое образование большого количества метаболитов.

При обсуждении метаболических превращений, необходимо дифференцировать метаболиты, которые образуются в результате превращения природного (эндогенного) гормона, и те, которые являются продуктом метаболизма только введенного извне экзогенного гормона (Леманн, 1981). Это различие особенно важно в случае АБК, в случае которой в большинстве опытов в растение вводили рацемическую смесь натуральных S-стереоизомеров и искусственных R-стереоизомеров. Имеется доказательство, что эти два стереоизомера метаболизируются не только с разными ско-

22

ростями, но и в некоторых случаях с образованием различных соединений. Нужно проявлять осторожность, чтобы решить, какой именно метаболит фактически был получен из активного Б-стереоизомера. В конечном счете, выделение метаболита как естественно встречающегося компонента растения требует доказательства что это соединение - не артефакт. Ряд метаболитов встречаются в естественных условиях, в то время как другие - являются лишь продуктами превращения экзогенных соединений.

Первыми описанными метаболитами абсцизовой кислоты были сложный эфир глюкозы и АБК (АБК-ГЭ), фазеевая кислота (ФК) и 6-гидроксиметил АБК (ГМ-АБК). Сложный эфир глюкозы АБК был сначала идентифицирован в плодах Ьиртш 1Шет как встречающееся в естественных условиях соединение, и затем было обнаружено, что он продуцируется в ответ на введение 14С-АБК в некоторые растения (КозЫгшги & а1., 1968). Хотя это соединение - естественно встречающийся метаболит абсцизовой кислоты, опыты с введением меченой по углероду смеси стереоизомеров (ЛБ) АБК возможно преувеличивают его значимость, так как именно неприродный Я-стереоизомер часто превращается преимущественно в сложный эфир глюкозы. ГМ-АБК была выделена из побега томатов, в который вводили 14С-АБК. Это соединение было выделено только однажды, очевидно из-за легкости, с которой оно превращается в ФК. Фазеевая кислота фактически была выделена до открытия АБК, но ее истинная структура была определена только как продукт перестройки ГМ-АБК (МЛЬоттош, 1969). Обнаружение того, что ГМ-АБК, быстро превращалась в ФК в отсутствии ферментов, поставило вопрос о том, была ли ФК естественным метаболитом абсцизовой кислоты или артефактом выделения. Идентификация фазеевой кислоты как продукта распада дигидрофазеевой кислоты (ДФК) в семенах бобовых, позволила предположить, что ФК является естественно встречающимся и^таболитом АБК, объектом дальнейшего обмена

23

веществ (Walton et al., 1973). Начиная с начальных описаний ФК и ДФК, эти соединения были найдены во многих растениях, и их образование, по всей видимости, являются главным путем метаболизма АБК. Было показано, что эпимер ДФК, эпи-ДФК - также встречающийся в природе метаболит АБК, хотя он обычно присутствует в более низких концентрациях, чем дигидрофазеевая кислота (Zeevaart, Milborrow, 1976). Хотя ДФК обнаружен в высоких концентрациях в некоторых тканях, ясно что это не обязательный конечный продукт обмена веществ. 4 -глюкозид ДФК (ДФК-ГЗ ) был выделен из нескольких тканей (Milborrow and Vaughan, 1982., Hirai and Koshimizu, 1983) и имеются доказательства из опытов по введению 14С-АБК, что даже это соединение может в дальнейшем метаболизироваться.

Другие встречающиеся в природе метаболиты АБК - Г-гликозид АБК (АБК-ГЗ), который по всей видимости широко распространен в растениях, хотя вероятно в более низкой концентрации, и З-гидрокси-З-метнл глютарил ГМГ-АБК, который пока был выделен только из семян псевдоакации Robinia (Loveys, Milborrow, 1984). Опыты по введению 14C-RS АБК показывают, что другие метаболиты могут быть образованы в виде конъю-гатов ФК, ДФК и эпи-ДФК. Эти соединения еще не были охарактеризованы и не найдены в природе (Loveys, Milborrow, 1984}^

1.1.2.3.Влияние обмена веществ на физиологическую активность

Идентификация метаболитов и выяснение метаболических путей веществ вызывает понятный интерес. В случае гормона, однако, физиолог растений больше заинтересован в выяснении той роли, которую обмен веществ играет в регуляции уровня активности гормона. Обмен веществ реализует эту регуляцию разными способами, включая активацию и инактивацию гормонов и их превращения в запасную и/или транспортную формы. К сожалению, часто трудно оценить влияние обмена веществ на активность гормона. Эффективность любого введенного вещества будет зависеть от

разных факторов помимо его собственной активности. Они будут включать скорость его поглощения клеткам, превращение в более или менее активные соединения после поглощения, и скорости его поступления в соответствующий компартмент клетки.

Мы часто не знаем, являются ли наблюдаемые эффекты от введения гормона в ткани растения показателем его роли в растении, так как трудно оценить значение наблюдаемых изменений в активности метаболитов. Тем не менее все же полезно обсудить, как обмен веществ может воздействовать на физиологическую активность.

Инактивация

Когда аналоги абсцизовой кислоты сравнивались с АБК по их способности воздействовать на различные физиологические процессы, было найдено, что почти любое изменение в структуре абсцизовой кислоты уменьшает ее активность. Активность АБК во всех биологических тестах зависит от присутствия свободной карбоксильной группы, 2-цис, 4-транс-пентодиеновой боковой цепи, 4 -кетон и двойной связи в циклогексановом кольце (Walton, 1983), хотя несколько синтетических соединений проявляют активность без всех этих атрибутов. Многие из описанных метаболитов, не имеют одной или нескольких из этих функциональных групп. АБК - ГЗ лишена свободного карбоксила, ФК- кольцевой двойной связи, и ДФК, и его более далекие метаболиты не имеют и кольцевой двойной связи, и 4 '-кето группы. ГМ-АБК, ее З-гидрокси-З-метил глютарил производное и АБК -1 '-глюкозид имеют необходимые функциональные группы интакт-ной абсцизовой кислоты. Ни ФК, ни ДФК, не замедляют удлинение клетки в различных тканях, что указывает, что присутствие 4 '-кетон группы и кольцевой двойной связи необходимо для осуществления гормональной регуляции этого процесса. Сложный эфир глюкозы абсцизовой кислоты замедляет удлинение клетки, но по всей видимости его активность являет-

25

ся результатом его гидролиза с освобождением АБК, как было показано в случае других сложных эфиров абсцизовой кислоты. З-гидрокси-З-метил конъюгат ГМ-АБК замедляет удлинение клетки. Не понятно, правда, обладает ли активностью само вещество или продукты ее гидролиза. ФК проявляет активность на уровне примерно 10 % от активности АБК в биотестах на опадение листьев, имеет низкую активность в биотестах с закрытием устьиц у нескольких видов растений, и не закрывает устьица V. /аЬа. Ди-гидрофазеевая кислота не проявлял активности ни в одном из биотестов. Кажется разумным предположить, что синтез ДФК и его дальнейших метаболитов является первичным способом инактивации абсцизовой кислоты.

Хотя фазеевая кислота неактивна или имеет значительно меньшую активность, в несколько биотестах по сравнению с абсцизовой кислотой, она столь же активна, как и АБК, в замедлении ГАз-стимулированного синтеза а-амилазы в алейроновом слое ячменя (Цкпез, Но, 1984). ДФК, однако, не активна в этом тесте, что свидетельствует о том, что для проявления данной активности, очевидно, необходима 4-кето группа, а не двойная связь внутри кольца. Одно из возможных объяснений активности фазеевой кислоты в этом биотесте состоит в том, что как абсцизовая кислота, так и ФК одинаково хорошо способны связывать и активизировать необходимый рецептор. Второе объяснение - это то, что ФК является активной молекулой, и что обнаруженная активность АБК является результатом ее превращения в фазеевую кислоту, которое происходит в айлероновом слое ячменя.

ГМ-АБК содержит все функциональные группы абсцизовой кислоты и имеет кроме того гидроксильную группу в 6 -метил положении. Одна интригующая возможность состоит в том, что именно ГМ-АБК, а не АБК является активной молекулой во многих из биотестов с абсцизовой кисло-

26

той. Так как все ткани, в которые была введена 14С-АБК продуцировали ФК, и следовательно у них же образовывалась ГМ-АБК, нельзя исключить возможную активность ГМ-АБК. Также невозможно напрямую проверить ее активность. Даже если это соединение можно было бы выделить из тканей, обработанных абсцизовой кислотой, было бы трудно предотвратить его превращение в ФК в процессе любого биотестирования.

Запасные и транспортные формы

Одно из требований, предъявляемых к метаболиту, являющемуся запасной или транспортной формой абсцизовой кислоты - это то, что он должен снова превращаться в АБК. Из различных метаболитов, которые были описаны, только, АБК - ГЭ и АБК-ГЗ способны выполнить это требование, поскольку с помощью эстераз и глюкозидаз соответственно они могут превращаться в абсцизовую кислоту. Нет доказательств того, что ФК или ДФК могут вновь превращаться в АБК. При введении в растения томатов экзогенной АБК-ГЭ, наблюдали образование абсцизовой кислоты. Однако трудно определить, имеет или место гидролиз эндогенной АБК-ГЭ. Полученные данные указывают на то, что АБК-ГЭ по крайней мере не является главным источник АБК и запасается в вакуолях (Härtung, Gimmler, 1982). Когда растения были подвергнуты ряду стрессов, во время которых наблюдалась потеря воды тканями растений, концентрация АБК-ГЭ продолжала увеличиваться в процессе регидредздии (Boyer, Zeevaart,1982). Было показано, что АБК-ГЭ присутствует во флоэме и ксилеме. Если бы это соединение подвергалось гидролизу, когда достигало ткани акцептора, то его можно было бы рассматривать в качестве транспортной формы абсцизовой кислоты. Было показано, что АБК также присутствует в ксилеме и флоэме, так что кажется маловероятным, что АБК-ГЭ необходима как форма транспорта абсцизовой кислоты на большие расстояния. Нет никаких сведений о судьбе АБК-ГЗ. Так как это минорный метаболит, пред-

27

ставляется маловероятным, что АБК-ГЗ играет главную роль как форма хранение или транспорта АБК (Loveys, Milborrow, 1984).

1.1.2.4.Локализация и регулирование метаболизма Способность метаболизировать введенную извне абсцизовую кислоту широко распространена в тканях растения. Было показано, что 14С-АБК метаболизируется листьями, стеблями, корнями, семенами и плодами, и метаболиты АБК были выделены из всех этих тканей (Loveys, Milborrow, 1984). Поскольку метаболиты абсцизовой кислоты также были найдены в ксилеме и флоэме, присутствие метаболитов в специфической ткани не обязательно указывает, что они были в ней синтезированы. Имеется меньшее количество сведений относительно субклеточной локализации метаболизма абсцизовой кислоты. На основе опытов с бесклеточной системой, полученной из жидкости эндосперма Echinocystis lobata предполагается, что в превращении АБК в ГМ-АБК участвует оксигеназа со смешанной функцией (Gillard, Walton, 1976). Данные о том, что кислород, который включается в абсцизовую кислоту в процессе образования ГМ-АБК получен из О2, являются следующими свидетельствами участия оксигеназы (Creelman, Zeevaart, 1984). Известно также, что оксигеназная активность локализована в эндоплазматической сети, что предполагает цитоплазмати-ческое местоположение для начального этапа метаболизма абсцизовой кислоты. Система превращение ФК в ДФК в Е. lobata включает в себя малорастворимый фермент, возможно также цитоплазматического происхождения. Тот факт, что превращение АБК протопластами мезофилла шпината в ФК и ДФК происходит вне пластид, показал, что хлоропласт не метаболи-зирует АБК (Härtung, Ginimler, 1982). Фермент, который катализирует перемещение глюкозы от АДФ-глюкозы с образованием АБК-ГЭ, был выделен из культуры клеточной суспензии Macleayci microcarpa (Lehmann, Schutte, 1980). Возможно, что фермент имеет цитоплазматическое проис-

28

хождение. Поскольку немногое известно относительно ферментов, метабо-лизирующих абсцизовую кислоту, наши знания о регулировании метаболизма также ограничены. Было высказано предположение о возможном механизме регулирования метаболизма АБК в алейроновом слое растений ячменя. Если этот объект предварительно обрабатывать 10"5М АБК в течение нескольких часов, то в последующем метаболизм экзогенной абсцизо-вой кислоты будет идти в 2-5 раз быстрее, чем это было бы без предварительной обработки (икпеБ, Но, 1984). Увеличение скорости метаболизма может быть элиминировано ингибиторами синтеза белков и нуклеиновых кислот. В результате обработки также исчезают несколько новых белков, которые появляются после предварительной обработки АБК. Было высказано предположение, что именно АБК стимулирует синтез АБК-гидроксилирующих ферментов в этой ткани, так как фазеевая кислота не вызывает ни появления новых белков, ни увеличения уровня метаболизма абсцизовой кислоты. Выделение гидроксилирующих ферментов из алейронового слоя закончилось неудачно, так что не было возможности продемонстрировать увеличение количественного содержания фермента.

1.2. Гормоны как регуляторы водного баланса.

Выживание растений возможно благодаря их способности продол- 0

<

жать рост в условиях дефицита воды. Исследованиями последних лет установлена важная роль гормонов растений в экономном использовании воды. Влияя на состояние устьиц, они могут контролировать расход воды и, регулируя рост и активность корней, - контролировать ее поглощение. Прогресс в области наших знаний о роли гормонов в регуляции устьичной проводимости сейчас наиболее заметен. Менее изучена роль фитогормонов в жизнедеятельности корней, но тем не менее признается важная роль корней в регуляции тех физиологических процессов в побеге, которые обеспе-

29

чивают контроль водного обмена у растений.

1.2.1 .Гормоны и поведение устьиц.

1.2.1.1. Образование и распределение абсцизовой кислоты в связи с функционированием устьиц.

■yt K.'4jt7 и ■

$Райт и Хайн (Wright, Hiron, 1969), обнаружили, что содержание АБК в листьях пшеницы увеличивается в 40 раз в течение 30 мин, когда их отделяют от растения и подвергают действию достаточно жесткого дефицита воды. Последующие исследования показали, что содержание АБК в листьях многих видов растений резко возрастает по мере того, как их водный потенциал опускается ниже 1 мП (Mansfield, McAinsh, 1995). Водный потенциал, при котором увеличивается продукция АБК, примерно одинаков у растений многих видов. У растений на фоне дефицита минерального питания продукция абсцизовой кислоты по-видимому происходит при меньших значениях отрицательного водного потенциала (Radin, 1984). АБК ингибирует открытие устьиц у многих видов растений (Reid, Wample, 1985). При этом концентрация калия в среде, окружающей эпидермис, имеет большое значение для действия абсцизовой кислоты на устьица. Это представляется естественным, принимая во внимание механизм действия АБК на замыкающие клетки устьиц. Накопление эндогенной абсцизовой кислоты в листьях может легко ингибировать открытие устьиц, и нет сомнений в том, что листья обладают способностью контролировать тем самым свой собственный водный статус. Тем не менее ясно, что у растений существует механизм, благодаря которому продукция АБК листом, по всей видимости, не играет важной роли до той поры, пока содержание воды в почве не снизиться до критических значений. Данные литературы свидетельствуют также о том, что включение механизма закрытия устьиц для

30

предотвращение потери воды растением, вероятно, в большей степени важно для растений на ранних стадиях развития (Зауралов и др., 1987).

Сейчас известно, что АБК может синтезироваться в корнях (Cornish, Zeevaart, 1985; Кислин, Кефели, 1985). Когда корни контактируют с высыхающей почвой, они продуцируют больше абсцизовой кислоты. Подобный эффект был также обнаружен при локальном питании растений, при котором часть корней вступает в контакт с раствором с пониженным водным потенциалом (Иванов и др; 1993). АБК поступает в ксилему и транспортируется в листья, где ингибирует открытие устьиц (Zhang, Davies, 1989). Это происходит прежде, чем недостаток почвенной влаги вызовет какие-либо заметные изменения в водном статусе листьев. Полагают, что тем самым абсцизовая кислота, которая транспортируется в качестве химического сигнала из корней, вызывает уменьшение транспирации и препятствует снижению водного потенциала или потере тургора (Davies, Zhang, 1989). Эти открытия делают необходимым переоценку физиологических показателей, с помощью которых раньше оценивали степень водного стресса, испытываемого растением. Раньше для определения таких факторов практиковался сбор листьев, в которых определяли водный потенциал или относительное содержание воды. Предполагалось, что полученные данные являются индикатором водного статуса почвы, и в случае полевых культур этот подход был использован для оценки потребности в орошении. Существование сигнала корень-побег, который инициирует защитные механизмы в побеге, указывает на то, что такие измерения дают менее точную информацию, чем предполагалось. Исследования Тардью и др. (Tardieu et al., 1992), на растущей в поле кукурузе показали тесную корреляцию между проводимостью устьиц и концентрацией АБК в ксилемном соке. Этот показатель, по-видимому лучше всего характеризует водный статус корней, поскольку у кукурузы обнаружена слабая корреляция между устьичной

31

проводимостью и общей концентрацией абсцизовой кислоты в листе. Предполагается, что растение более эффективно использует запасы воды в почве благодаря тому, что оно может реагировать на изменение водного потенциала в разных частях своей корневой системы. Представляет интерес тот факт, что растения, выращенные на локальном фоне минерального питания отличались способностью к повышенной продукции АБК (Трапезников и др, 1999) и в то же время были устойчивыми к засухе (Усов и др., 1988).

Мансфилд и Мае Эйнс выделяют 4 типа поведения устьиц, различающихся по характеру использования воды (Mansfield, McAinsh, 1995). 1. Пессимистический не реагирующий, при котором фиксированный размер не полностью открытой устьичной щели обеспечивает экономное использование исходного запасы воды в почве с тем, чтобы его хватило до конца сезона. 2. Оптимистический не реагирующий, при котором устьица также открываются до фиксированного размера, но в этом случае он слишком велик, и растение использует воду быстрее, чем это оправдано, исходя из первоначального содержания воды в почве. 3. Пессимистичный реагирующий, при котором устьица отзываются на изменения окружающей среды с тем и регулируют использование воды таким образом, чтобы ее запасов хватило до конца сезона 4) первоначально оптимистический реагирующий, при котором потребление воды начинается как во втором случае, но растение сШ«*>бно уменьшать степень открытия устьиц для того, чтобы препятствовать сильной потере воды. Чтобы понять, каким образом осуществляется выбор между названными типами поведения устьиц и его контроль, необходимы детальные знания о гормональной регуляции тургора замыкающих клеток устьиц.

32

1.2.1.2.Механизм действия АБК на устьица.

Движение устьиц является результатом изменения в тургоре пары клеток, которые окружают устьичную щель. Эти изменения запускаются потоком катионов и анионов (в основном, калия, который балансируется током анионов хлора и малата через цитоплазматическую мембрану и то-нопласт) (Schroeder, Hedrich, 1989; McAinsh et al., 1990; Hetherington, Quatrano, 1991; MacRobbie, 1992). Открытие устьиц является результатом накопления ионов калия в цитоплазме, а закрытие связано с уменьшением их концентрации. Открытие и закрытие устьиц следует рассматривать как отдельные процессы, в которых участвуют различные ионные каналы. Закрытие устьиц происходит благодаря стимуляции оттока калия, а не только является результатом прекращения притока ионов. Приток ионов обеспечивает открытие устьиц. Существуют как катионные каналы, включающие те, через которые калий заходит в клетку и выходит из нее, так и анионные каналы (Schroeder, Hedrich, 1989; McAinsh et al., 1990; Hetherington, Quatrano, 1991; MacRobbie, 1992; Blatt, Thiel, 1993). АБК уменьшает устьичную щель, закрывая ее или ингибируя открытия (Mittlehauser, van Steveninck, 1969). Недавние электро-физиологические исследования целых клеток показали, что АБК воздействует как на приток, так и на отток калия в устьичных клетках. Абсцизовая кислота ингибирует направленный внутрь калиевый канал, и в то же время активирует направленный наружу калиевый канал (MacRobbie, 1992). Экзогенная АБК вызывает закрытие устьиц с той же эффективностью при pH 8, при которой она не может поступать в клетки, как и при pH 5, при которой она быстро проникает в клетку (Härtung, 1983). Таким образом, по всей видимости, гормону не нужно проникать в цитозоль замыкающих клеток для того, чтобы индуцировать изменение ионных потоков через плазматическую мембрану. Это значит, что место действия АБК должно быть локализовано на внешней

33

поверхности клеток. Существуют доказательства, что абсцизовая кислота может взаимодействовать с фосфолипидами и тем самым способствовать изменению проницаемости цитоплазматической мембраны (Slillwell et al., 1989). Хорнберг и Уайлер (Homberg, Weiler, 1984), показали, что в цитоплазматической мембране замыкающих клеток устьиц локализованы протеины, которые имеют высокое сродство к АБК. Со времени этой публикации до сих пор не удалось выделить рецептор к абсцизовой кислоте. Тем не менее Мае Робби показал, что замыкающие клетки устьиц могут потерять чувствительность к АБК, что свидетельствует о существование специфической клеточной системы узнавания физиологически активной абсцизовой кислоты (MacRobbie, 1990).

Показано, что ионные каналы в плазматической мембране замыкающих клеток устьиц чувствительны к электрическому потенциалу. В то же время их функционирование зависит от присутствия ионов кальция. Са2+ ингибирует работу канала, по которому калий поступает внутрь клетки. На эти же каналы может действовать и АБК (Schroeder, Hedrich, 1989; McAinsh et al., 1990; Hetherington, Quatrano, 1991; MacRobbie, 1992; Blatt, Thiel, 1993). Канал же, по которому калий выходит наружу не чувствителен к кальцию (MacRobbie, 1992; Blatt, Thiel, 1993). Известно, что кальций участвует в регуляции многих клеточных процессов у животных в качестве вторичного переносчика, являясь звеном в цепочке событий, с помощью которых внеклеточный сигнал превращается в физиологический ответ (Berridge, Irvine, 1989). Поскольку известно, что кальций влияет на многочисленные физиологические и биохимические процессы в растениях (Hepler, Wayne, 1985; Allan, Trewavas, 1987; Poovaiah, Reddy, 1987; Медведев и др., 1989), становится все более очевидным, что он может играть роль вторичных переносчиков в клетках растения (Poovaiah, Reddy, 1993). Многие компоненты предполагаемого пути передачи сигнала с использо-

34

ванием кальция были идентифицированы у растений, включая такие каль-ций-связывающие протеины, как кальмодулин (Allan, Trewavas, 1987; Poovaiah, Reddy, 1987), кальмодлин-зависимые ферменты (Poovaiah, Reddy, 1987; Hethcrington et al., 1990), кальциевые каналы (Hetherington et al., 1992; Медведев и др, 1993), Са-зависимые АТФазы (Evans et al., 1991) и G-белки (Einspahr, Thompson, 1990). В последние годы начали появляться доказательства, что кальций может запускать внутриклеточный механизм, ответственный за инициацию многих физиологических ответов на гормоны растений (Mansfield, McAinsh, 1995).

В последние 10 лет усиленно изучалась роль кальция в механизме действия АБК. Давно известно, что кальций ингибирует открытие устьиц у некоторых растений (De Silva et al., 1985). После того, как было обнаружено, что при низкой концентрации абсцизовой кислоты ее способность ин-гибировать открытие устьиц зависит от присутствия кальция, Де Сильва с соавторами предположил, что кальций может действовать как вторичный мессенджер во время АБК-стимулированного закрытия устьиц. И в последствии возникло предположение, что это может быть взаимосвязано с метаболизмом фосфоинозитида (Schroeder, Hedrich, 1989; McAinsh et al., 1990; Hetherington, Quatrano, 1991; MacRobbie, 1992). Для того, чтобы доказать, что кальций действует как вторичный мессенджер во время ответа устьиц на АБК, важно определить способность гормона растения к модуляции концентрации свободного кальция в цитозоле устьичных клеток. Приток кальция в изолированные замыкающие клетки устьиц был показан с использованием радиоактивного изотопа кальция (MacRobbie, 1989). Однако до недавнего времени не было убедительных доказательств изменения концентрации цитозольного кальция под действием АБК. Для решения этого вопроса Майк Айне и другие использовали флюоресцентную технику, которая позволяет оценивать изменения концентрации кальция в усть-

35

ичных клетках в ответ на АБК (McAinsh et al.,. 1990). Было показано, что характер стимулированного гормоном увеличения концентрации цитозоль-ного кальция заметно изменяется, включая его быстрое кратковременное увеличение (McAinsh et al., 1990; Gilroy et al., 1991; McAinsh et al., 1992). АБК-стимулированное увеличение концентрации цитозольного кальция в устьичных клетках может быть результатам притока апопластного кальция и/или его освобождения из внутриклеточных запасов. Вместе с тем, эксперименты с протопластами устьичных клеток свидетельствуют о том, что нет абсолютной зависимости ответа на АБК от внеклеточного кальция (Smith, 1988). Сходным образом эксперименты с радиоактивным кальцием показали отсутствие продолжительного АБК-стимулированного увеличения в притоке кальция через клеточную мембрану (MacRobbie, 1989; MacRobbie, 1992). Однако этими техническими приемами сложно обнаружить освобождение кальция из внутриклеточных запасов. Исследования, в которых проверяли действие ЭГТА и блокаторов кальциевых каналов на устъичные клетки в отделенном эпидермисе, свидетельствуют, что как приток кальция извне, так и его освобождение из внутриклеточных запасов обеспечивают АБК-стимулированное увеличение цитозольного кальция в устьичных клетках (De Silva et al., 1985; McAinsh et al., 1991). Флуоресцентная техника позволяет наблюдать пространственное распределение цитозольного кальция в пределах клетки (Gilroy et al., 1991). Ее использовали для выяснения источника АБК-стимулированного увеличения концентрации цитозольного кальция. Было показано, что кальций, увеличение концентрации которого стимулирует АБК, неравномерно распределяется по цитозолю устьичной клетки (McAinsh et al., 1992). Распределение кальция изменялось во времени. Эта пространственная и временная локализация АБК-стимулируемого увеличения концентрации цитозольного кальция может отражать как приток кальция из апопласта, так и освобождения

36

кальция из внутриклеточных запасов. Очевидно, что увеличение концентрации кальция в цитозоле является частью ответа замыкающих клеток устьиц на АБК. Однако необходимо заметить, что канал, выводящий калий наружу не чувствителен к кальцию (MacRobbie, 1992; Blatt, Thiel, 1993). Это указывает на возможность того, что путь трансдукции АБК-ового сигнала может не включать кальций. Показано, что АБК стимулирует увеличение pH цитозоля (Irving et al, 1992). Поэтому pH цитозоля может быть дополнительным кандидатом на роль мессенджера в трансдукции гормонального сигнала, модифицируя физиологический ответ цитозольного кальция на АБК. Этот механизм действия АБК на устьичные клетки важен для лучшего понимания того, каким образом растения выживают при различных условиях доступности воды в почве.

1.2.1.3.Цитокинины.

Начиная с 1977 г. получено много доказательств того, что цитоки-нины являются важными регуляторами движения устьиц. Когда кинетин наносили на изолированный эпидермис, он вызывал открытие устьиц (Incoll, Whitelam, 1977). Возраст листьев может быть решающим фактором, поскольку в опытах на горохе показано, что устьица не реагируют на кинетин, когда листья только что закончил свой рост, но 15 дней спустя наблюдается стимуляция открытия устьиц под влиянием экзогенного гормона (Incoll, Jewer, 1985). Сходным образом устьица молодых листьев кукурузы не реагируют на кинетин (Blaekman, Davies, 1984). Но в старых листьях они открываются шире в результате обработки кинетином. Таким образом, уровень эндогенных цитокининов может определять степень открытия устьиц в листьях различных возрастов. Отсутствие ответа на цитокинины можно объяснить тем, что у растений уже имеется адекватный запас эндогенного цитокинина и/или тем, что эксперимент, проводится при условиях, благоприятных для открытия устьиц. Только когда имеются факторы, ог-

37

раничивающие открытие, можно наблюдать четкий ответ на цитокинины. Кинетин и зеатин не оказывали прямого действия, когда их наносили на молодые листья кукурузы, однако в случае их совместного применения с АБК, цитокинины нейтрализовали ингибирующий эффект этого гормона (Blackman, Davies, 1983). У кукурузы характер ответа на углекислый газ определяется как зеатином, так и АБК (Blackman, Davies, 1984). Ирвин и др. обнаружил, что кинетин может влиять как на pH цитозоля, так и на кальциевый статус устьичных клеток, и это может быть основой гормонального взаимодействия (Irving et al., 1992). Мансфилд и Мак Эйнс считают, что от физиологов растений в ближайшем будущем требуется определение эндогенного содержания цитокининов и ауксинов в растениях при водном стрессе и обнаружение того, какое они имеют отношение к движению устьиц. Роль АБК в физиологических ответах на водный стресс установлена, и поведение АБК во время цикла стресс-репарация хорошо изучена. Однако имеется мало информации для цитокининов и ауксинов.

1.2.2.Гормоны и интегрированный ответ растений на водный стресс.

В настоящее время мы знаем гораздо больше о действии гормонов на устьичную проводимость, чем об их влиянии на другие процессы в растении, которые могут регулировать водный баланс. Эта несбалансированность в имеющейся информации частично объясняется тем вниманием, которое уделяется устьицам. Ее также можно объяснить той ролью, которую устьица играют в регуляции потери воды. Тем не менее уместно вспомнить некоторые другие ответы, которые могут помогать растениям в их приспособлении к условиям водного стресса.

1.2.2.1.Корни.

АБК увеличивает водную проницаемость тканей корня моркови (Glinka, Reinhold, 1972). Сходные результаты были получены в ходе изуче-

38

ния экссудации изолированных корней кукурузы (Collins, Kerriean, 1983). Действие абсцизовой кислоты на скорость экссудации может быть результатом как изменения ионного потока, так и гидравлической проницаемости.

Считают, что изменение корневого давления не играет существенной роли в регуляции потока воды по ксилеме многих растений (Mansfield, McAinsh, 1995). Однако у многих травянистых растений движение сока по сосудам ксилемы прекращается из-за их закупорки пузырьками воздуха, когда они подвергаются водному стрессу, и ночью корневое давление может быть важным фактором в повторном наполнении поврежденных сосудов. В связи с этим Мансфилд и Мак Эйнс считают возможным, что АБК, образующаяся в побегах при водном стрессе, транспортируется в корни, где она увеличивает корневое давление.

Рост и развитие корня могут тоже оказаться под воздействием гормональных изменений, индуцированных водным дефицитом (Пустовой то-ва, 1981). Опираясь на данные экспериментов, в которых использовали ингибиторы биосинтеза каротиноидов, а также мутанты с пониженной способностью к синтезу каротиноидов в качестве средства манипуляции эндогенным уровнем АБК (Raschke, Hedrich, 1985; Saab et al., 1990), и опытов по использованию экзогенной абсцизовой кислоты было показано, что АБК лимитирует рост побега и усиливает рост корней при снижении водного потенциала. Этим можно объяснить уменьшение отношения побег/корень, которое часто обнаруживается в растениях, подвергнутых водному стрессу. Гартунг и Дэвис (Gowing et al., 1990), предположили, что АБК играет особую роль в корнях, когда они должны проникать в уплотненную почву. Было обнаружено, что увеличение концентрации абсцизовой кислоты вызывает преимущественный радиальных рост сразу же после корневого чех-лика и образование большого количества корневых волосков, которые мо-

39

гут действовать как якорь, помогаю проникновению через физический барьер. Эти морфологические эффекты абсцизовой кислоты могут быть очень важны, т.к. они помогают растению обнаружить новые источники воды в уплотненных почвах.

1.2.2.2.Листья.

АБК ингибирует активный выход протонов, ответственных, как полагают, за котранспорт сахарозы при загрузке флоэмы (Maiek, Baker, 1978). Уменьшение скорости транспорта Сахаров из листьев дает возможность сохранить осмотики, что важно для сохранения тургора. Тургор необходим для продолжения роста, но ясно, что при водном стрессе нежелательно формирование большой площади листьев. Было обнаружено, что АБК ингибирует стимулированное светом растяжение листьев (Van Volkenburg, Davies, 1983; Кефели и др., 1989). Это может быть важным механизмом для ограничения роста листьев растяжением, когда растение испытывает недостаток воды. Сейчас начинают появляться доказательства того, что скорость роста листа и проводимость устьиц сильно зависят от ингибитора (вероятно, АБК), продуцируемого корнями при дефиците влаги в почве (Gowing et al., 1990).

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiaiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiaiiiiiiiiiiiiiiiiini

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что изменение концентрации гормонов играет важную роль в адаптации растений к условиям обитания. Вместе с тем имеющиеся сведения не достаточны для полного понимания того, каким образом растение регулирует концентрацию своих гормонов и как это связано с конкретными процессами, обеспечивающими приспособление растений к неблагоприятным условиям.

40

2. Объект и методы исследования

2.1. Условия выращивания растений и проведения экспериментов.

Исследования проводили на растениях яровой твердой пшеницы

(ТгШсшп (Зигит Ь., сорта Безенчукская 139) в лабораторных условиях на водной культуре. Семена проращивали в темноте в течении 2 сут на дистиллированной воде с добавлением 10"5 М СаСЬ, при температуре 24° С. На третьи сутки проростки пересаживали на 10 %-ную среду Хогланда-Арнона-1 и выращивали при освещенности 18000 лк и 14-часовой продолжительности светового дня. Опыты проводили с 8-суточными проростками.

Условия опытов с кадмием

В питательную среду добавляли ацетат кадмия до конечной концентрации 10 мг/л питательного раствора. В некоторых случаях за 2 ч до внесения кадмия в питательную среду вводили зеатин так, чтобы его конечная концентрация составляла 1 мг/л. Через 1 ч после внесения кадмия с помощью селективных электродов по убыли ионов калия и нитратов из питательной среды определяли скорость их поглощения растениями.

Условия проведения опытов с ПЭГ.

В опытах по изучению влияния осмотика использовали 15 %-ный раствор ПЭГ 6000. У части растений перед добавлением ПЭГ корни убивали, погружая их на 30 сек в кипящую воду. При этом побег защищали от повреждения горячим воздухом, заворачивая его в фольгу.

Определение транепирации.

Транспирацию определяли весовым методом. / ,

2.2. Методы исследования

2.2.1 Измерение роста растений

Для регистрации роста использовали аналоговый индуктивный электромеханический датчик перемещений, представляющий собой измери-

41 РОЗСИЙСКАЯи, ^

государстзеншЦ} '

тельный дифференциальный линейный трансформатор с подвижным сердечником (Дедов, 1997). Механическая связь сердечника с верхним концом второго листа растений осуществлялась с помощью тонкой лавсановой нити (диаметр 0,1 мм), перекинутой через одношкивный блок. Измерительный сигнал датчика непрерывно записывали на самопишущем приборе типа КСП-4.

2.2.3. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов

Для определения содержания гормонов растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80 %-ным этанолом. Спиртовой экстракт отделяли центрифугированием и упаривали до водного остатка.

Цитокинины, содержащиеся в аликвоте водного остатка, концентрировали на картридже С-18, с которого их элюировали, пропуская через картридж 5 мл 80 %-ного этанола. После упаривания спирта досуха образец растворяли в минимальном объеме 80 %-ного спирта и наносили на пластину для тонкослойной хроматографии (ТСХ), которую проводили в системе растворителей бутанол: аммиак: вода (6:1:2). Положение на хромато-грамме зеатина, его рибозида, 91Я-глюкозида и нуклеотида определяли с помощью соответствующих метчиков. После элюции гормонов в течение ночи из соответствующих зон фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) их содержание определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Экстракцию АБК из аликвоты водного остатка проводили после его подкисления до рН 2-3 1 н НС1 дважды диэтиловым эфиром в соотношении 1:5 (органическая фаза/водная фаза). Из объединенной органической фазы АБК реэкстрагировали 1 %-ным гидрокарбонатом натрия, взятым в соотношении 1:3 (водная фаза/органическая фаза). Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной (после подкисления до рН 2-3) вновь дважды извлекали гормон диэтиловым эфиром и метилировали их диазо-метаном (Кислин и др., 1982).

42

2.2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) Иммуноферментный анализ проводили в лунках полистеролового планшета. На первом этапе конъгогат гормона сорбировали на твердой фазе в течение 1,5 ч при 37° С. После 3-кратной промывки физиологическим раствором, содержащим 0,05 % твина 20, в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащим 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина 20, вместе с раствором стандарта гормона или растительным экстрактом. После инкубации в течение 1 ч при 37° С количество антител, специфически связанных на планшете, определяли с помощью бараньих антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой. Для оценки активности пероксидазы использовали смесь следующего состава: 0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,06 М фосфатном буфере рН 5,3, содержащим 0,006 % перекиси водорода. Оптическую плотность раствора после фиксации серной кислотой измеряли на микрофотометре (Titertek Uniscan) при 492 нм.

2.2.5.Определение содержания гормонов в ксилемном соке Для определения содержания гормонов в ксилемном соке проростки разрезали и побег соединяли с корнями с помощью силиконовой трубочки. Эту операцию проводили под водой, чтобы избежать попадания воздуха в сосуды и трубочки. Данная процедура существенным образом не влияла на скорость транспирации растений. Концентрацию гормонов в корневом экссудате, собранном из силиконовой трубочки, измеряли с помощью ИФА. Интенсивность поступления гормона рассчитывали по формуле Vn= С'Утр, где Vn- скорость доставки цитокининов из корней (нг цитокини-нов/растение в час), С - концентрация цитокининов в ксилемном соке (нг/мкл пасоки), а V тр- скорость транспирации (мкл воды/растение в час) (Jackson, 1993).

44

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.Динамика содержания цитокининов в связи с регуляцией поглощения и потери воды у растений на фоне действия токсичных концентраций ионов кадмия.

Изучению действия на растения токсичных металлов уделяется много внимания в связи с усиливающимся загрязнением ими окружающей среды (Lindberg and Wingstrand, 1985; Somashekaraiah et al, 1992; Ferret et al, 1993;Феник др., 1995; Larsson et al, 1998). Выявлено, что в первую очередь мишенью для их повреждающего действия становятся корни (ингибирует-ся рост корней и нарушается поглотительная активность), обнаружено также снижение активности фотосинтеза и других процессов в побегах. Одним из защитных механизмов, выработанных растениями, является связывание и обезвреживание токсичных ионов различными соединениями (специальными белками и пептидами, органическими кислотами, полиаминами) (Мельничук, 1990). При этом изменениям концентрации гормонов в растениях уделялось недостаточно внимания (Бессонова и др., 1985; Zizarova, Holub, 1993; Masson et al, 1994). Пытаясь восполнить дефицит знаний по данному вопросу, мы провели сравнительное изучение динамики содержания цитокининов и некоторых других физиологических показателей у проростков пшеницы. Выбор цитокининов в качестве теста был связан с тем, что по данным литературы (Бессонова и др., 1985) эти гормоны повышают устойчивость растений к тяжелым металлам.

В предварительных опытах была подобрана концентрация кадмия. Мы остановили выбор на той концентрации, которая вызывала быстрое (заметное уже через 1 ч) ингибирование роста растений пшеницы. Вместе с тем необходимо было подобрать такую концентрацию, при которой возможно было восстановление ростовых процессов.

45

Таблица 3.1.1.

Влияние добавления ацетата кадмия в питательную среду на прирост

побега проростков пшеницы (данные получены с помощью высокочувствительного датчика роста)

Концентрация ацетата кадмия, мг/л Объем питательного раствора, Мл Скорость роста, % от контроля

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Веселов, Дмитрий Станиславович, 1999 год

Список использованной литературы:

Бессонова В.П., Лыженко И.И., Михайлов О.Ф., Кулаева О.Н. Влияние кинетина на рост проростков гороха и содержание пигментов при избытке цинка в питательном растворе // Физиол. раст. - 1985. - Т. 32, № 1. -С. 153-159.

Блохин В.Г. Концентрационная зависимость влияния 6-бензиламинопурина на рост корней растений разных видов// Физиол. раст. -Т. 33,№6.-С. 1084-1089.

Борзенкова P.A., Зорина М.В. Влияние кинетина и абсцизовой кислоты на фотосинтез, отток и распределение 14С-ассимилятов у растений картофеля// Физиология растений,- 1990,- Т.37, В.З.- С.546-552.

98

Веселов С.Ю. Использование антител для количественного определения, очистки и локализации регуляторов роста растнеий и х метаболитов. Автореф. дисс. докт. биол. н./БашМУ - Уфа, 1999. 48 с.

Дедов A.B. Датчик вертикального роста растения ДЛТ-1. // Леса Башкортостана: Современное состояние и перспективы. Материалы научно практической конференции / Уфа.- 1997. - С. 72-74.

Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. - М.: Мир, 1985,-206 с.

Жолкевич В.Н., Пустовойтова Т.Н. Рост листьев Cucumbus sativus L. и содержание в них фитогормонов при почвенной засухе// Физиол. раст. -1993,- Т.40, № 4,- С.676-680.

Зауралов O.A., Жидкин В.И. Влияние охлаждения на содержание ауксинов и абсцизовой кислоты в растениях проса // Физиол. раст. - 19826.

- Т.29, вып.З. - С.605.

Зауралов O.A., Пустовойтова Т.Н., Чернавина М.В. Изменение содержания фитогормонов в листьях пшеницы при завядании// Физиол. раст.

- 1987. - Т. 34, № 3. - С. 564-568.

Иванов И. И., Трапезников В.К., Кудоярова Г.Р. Цитокинины абсци-зовая кислота в корнях пшеницы при локальном повышении концентрации ионов в питательной среде//Физиол. биохим. культ, расст. - 1993. - № 1. -С. 325-331.

Казарян В.О., Даниелян Т.С., Арустамян A.B. Баланс цитокининов в корнях и листьях растений в зависимости от уровня минерального питания // Биол. журн. Армении. - 1988.- Т.41, N 10. - С. 811-816.

Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин E.H. Природный ингибитор роста - абсцизовая кислота. М.: Наука, 1989. - 484 с.

99

Кислин E.H., Кефели В.И. Образование абсцизовой и индолил-3-уксусной кислот в побегах и корнях винограда и гороха//Известия РАН (сер. биол.) - 1985. - № 3. - С. 375-382.

Кудоярова Г.Р., Усманов И.Ю., Гюли-Заде В.З., Фаттахутдинов Э.Г., Веселов С.Ю. Взаимодействие пространственно разобщенных органов: соотношение электрических и гормональных сигналов// Доклады АН СССР. -Т. 310,N6.-С. 1511-1514.

Кудоярова Г.Р., Фархутдинов Р.Г., Митриченко А.Н., Теплова И.Р., Дедов A.B., Веселов С.Ю., Кулаева О.Н. Быстрые изменения скорости роста и содержания цитокининов в надземных органах растений пшеницы в ответ на резкое охлаждение корней. // Доклады Академии наук,- 1999, т.365, № 2, с. 260-262.

Кузнецов Вл.В., Шиман Й., Заальбах И., Кулаева О.Н. Ншратредук-тазы зародышей пшеницы куколя, индуцированные цитокинином и нитратом: очистка, характеристика, возможные функции// Физиол. раст.- 1986.-Т.ЗЗ,- N 2,- С.234-243.

Кулаева О.Н. Влияние корней на обмен веществ листьев в связи с проблемой действия на лист кинетина // Физиол. раст. - 1962 - Т.9, N 2. - С. 229-239.

Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973.

263 с.

Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка: 410е Тимирязевское чтение.- М.: Наука, 1982,- 82 с.

Кулаева О.Н., Хохлова В.А., Фофанова Т.А. Цитокинины и абсцизо-вая кислота в регуляции роста и процессов внутриклеточнойдифференци-ровки // Гормональная регуляция онтогенеза растений. -М.: Наука, 1984. -С. 71-86.

100

Леманн X. Конъюгация абсцизовой кислоты // Рост растений и диф-ференцировка (Кефели В.И. ред.). - М.: Наука, 1981. - С. 126-132.

Лялин О.О., Лукоянова С.А. Влияние кинетина и АБК на параметры корневой экссудации// Физиол. раст. - 1993.- Т.40, вып.З.- С.406-413.

Медведев С.С., Маркова И.В., Батов А.Ю., Максимов Г.Б. Полярные потоки ионов кальция и рост растительных тканей//Физиол. раст. - 1989. -Т. 36, №5.-С. 990-997.

Мельничук Ю.П. Влияние ионов кадмия на клеточное деление и рост растений. -Киев: Наука думка, 1990. - 148 с.

Митриченко А.Н. Динамика содреанрия горомнов в проростках пшеницы при изменении температуры. - Автореф. дисс. канд. биол. н./БашГУ - Уфа, 1999.23 с.

Москалева О.В., Каравайко H.H. Динамика эндогенных фитогормонов в развивающихся проростках кукурузы //Физиол. растен. -1990. - Т. 37, № 6. - С. 1113-1120.

Мустафина А.Р., Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р. Изменение спектра цитокининов в обезвоженных проростках пшеницы и кукурузы//Известия РАН. -1997. - N 6. - С. 750-754.

Опритов В. А. Распространяющееся возбуждение у высших растений// Успехи современ. Биолог. - 1976. - Т. 83. - С. 442-458.

Опритов В.А. Функональные аспекты биоэлектрогенеза у высших растений. Тимерязевские чтения. - Новгород: Изд-во НГУ, 1998. - 45 с.

Полевой A.B., Танкелюн О.В., Полевой В.В. Быстрая дистанционная передача сигнала о локальном стрессовом воздействии у проростков кукурузы // Физиол. раст. - 1997. - Т.44, №.5. - С.645-651.

Пустовойтова Т.Н. Рост растений в период засухи и его регуляция// проблемы засухоустойчивости растений. - М.: Наука. 1978.-С. 129-165.

101

Пустовойтова Т.Н. Стрессовые воздействия и изменение уровня регуляторов роста растений // Рост растений и дифференцировка (Кефели В.И. ред.). - М.: Наука, 1981. - С. 225-244.

Пустовойтова Т.Н., Еремин Г.В., Рассветаева Э.Г., Жданова Н.Е., Жолкевич В.Н. Засухоустойчивость, репарационная способсность и содержание фитогормонов в листьях полиплоидных растени сливы//Физиол. раст. - 1996. - Т. 43, № 2. - С. 267-271.

Роговин В.В., Муштаков В.М., Фомина В.А. Действие некоторых ксенобиотиков на пероксидазозависимый механизм иммунитета растений // Науч. конф. Ин-та хим. физ. им. ак. H.H. Семенова РАН, Москва, 20 марта, 1997. - М., 1997. - С. 22.

Серегин И.В., Иванов В.Б. Гистохимические методы изучения распределения кадмия и свинца в растениях// Физиол. раст. - 1997. - Т. 44, № 6.-С. 915-921.

Симонян М.В. Использование иммуноанлиза цитокининов для определения активности цитокининоксидазы. Автореф. дисс. канд. биол. н./БашГУ - Уфа, 1999. 23 с.

Стоянова Ю.С. Влияние относительной влажности воздуха нарост и содержание фитогормонов // Физиол. раст. - 1997. - 44, № 5. - С. 756-761.

Трапезников В.К., Иванов И.И. Тальвинская Н.Г. Локальное питание растений. - Уфа: Гилем, 1999. - 260 с.

Усов В.П., Иванов И.Й., Трапезников В.К., Тальвинская Н.Г., Шен-дель Г.В. Зависимость урожайности и качества зерна яровой пшеницы от условий выращивания на фоне комплекса воздействий в онтогене-зе//Агрохимия,- 1988, N. 12.- С.46-52.

Феник С.И., Трофимяк Т.Б., Блюм Я.Б. Механизмы формирования устойчивости растений к тяжелым металлам// Успехи совр. биологии,-1995.- Т. 115, вып.З,- С.261-275.

102

Чернядьев И.И. Фотосинтез и цитокинины // Прикл. биохимия и микробиология.- 1993,- Т. 29, вып. 5.- С. 644-673.

Шакирова Ф.М., Конрад К., Клячко Н.Л., Кулаева О.Н. Связь между действием цитокинина на рост изолированных семядолей тыквы и синтезом в них РНК и белка// Физиол. раст,- 1982,- Т.29, №1,- С.52-61.

Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Шаяхметов И.Ф. Влияние теплового стресса на динамику накопления АБК и лектина в клетках каллуса пшеницы// Физиол. раст. - 1995. - Т. 42, № 5. - С. 700-702.

Якушкина Н.И., Пузина Т.Н., Бахтенко Е.Ю., Кириллова И.Г. Значение гормонального баланса в реакции растений картофеля на формы азотного питания / // Физиол. раст. - 1997. - Т. 44, № 6. - С. 926-930.

Яхин О.И. Исследование физиологической активности препарата стифун на растениях яровой пшеницы и картофеля. Автореф. дисс. канд. биол. н./БашГУ - Уфа, 1999. 23 с.

Akiyoshi D.E., Klee Н., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. T-DNA of Agrobacterium tunjefaciens encodes enzyme of cytokinin biosyntheses//Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1984. - V. 81. - P. 5994-5998.

Allan E.F., Trewavas A.J. The role of calcium in metabolic control// In. The Biochemistry of Plants. A Comprehensive Treatise (vol. 12), (Stumpf P.K., Conn E.G., eds.).- Academic Press., New York.- 1987.- P. 117-149.

Allan A.C., Trewavas A.J. Abscisic acid and gibberellin perception: Inside or out?//Plant Physiol. -1994. - V. 104, N 4. - P. 1107-1108.

Asante G., Merlini, Nasini G. (+)-Abscisic acid, a metabolite of the fungus Cercospora rosicola// Experientia.- 1977 V.33.- P. 1556.

Auer C.A., Cohen J.D., Laloue M., Cooke T.J. Comparison of benzi-ladenine metabolism in two Petunia hibrida lines differing in shoot organogenesis//Plant Physiol.- 1992,- V.98.- P.1035-1041.

103

Aung L.H. Action of cytokinins and anticytokinins on cotyledonary bud growth of Lycopersicum esculentum Mill.// Biol. Plant.- 1986.- V. 28, № 6 - P. 407-411.

Bandurski R.S. Homeostatic control of concentration of indole-3-acetic acid// Plant Growth Substances (ed. J.F.Skoog). -Berlin etc.: Springer-Verlag, 1979.-P. 37-49.

Barcelo J., Poschenrieder C., Gunze B. Effects of low pH on water transport of Zea mays roots// Plant Physiol. Biochem. - 1996. - SI. - P. 233.

Benidge M.T., Irvine R.F. Inositol phosphates and cell signalling// Nature." 1989,- V.341.- P. 197-205.

Binns A.N. Cytokinin accumulation and action: Biochemical, Genetic, and Molecular Approaches// Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1994. -V.45.-P.173-196.

Blackman P.G., Davies W.J. The effects of cytokinins and ABA on stomatal behaviour of maize and Commelina/I J. of Exp. Bot.- 1983.- V.34, N 149.-P.1619-1626.

Blatt M. R. Thiel G. Hormonal control of ion channel gating// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 1993,- V.44.- P.543-567.

Boyer G.L., Zeevaart J.A.D. Isolation and quantitation of p-D-glucopyranosyl abscisate from leaves of Xanthium and spinach// Plant Physiol. -1982,- V.70.- P.227-231.

Britt E. Anderson, John M. Ward, Julian I, Schroeder. Evidence for an extracellular reception site for abscisic acid in Commelina guard cells//Plant Physiol.- 1994. - V. 104, N 4. -P.l 177-1183.

BrownleeB.G., Hall R.H., Whitty C.D. 3-Methyl-2-butenal: an enzimatic product of the cytokinin, N6-(A2-isopentenyl) adenine// Can J. Biochem.- 1975.-V.53.- P.37-41.

104

Buchmann I., Maraer F-J., Schreder G., Vaffenschmidt C.H., Schreder J. Tumor genes in plants: T-DNA encoded cytokinin biosynthesis//EMBO Journal. - 1985. - V. 4 , N 5. - P. 853-859.

Burch L., Horgan R. The purification citokinin oxidase from Z. mays kernels//Phytochemistry.-1989,-V.28.-P.1313-1319.

Burch L.R., Stuchbuiy T. Activity and distribution of enzymes that interconvert purine bases, ribosides for cytokinin metabolism// Physiol. Plant.-1987,- V.69.- P.283-288.

Burch L.R., Stuchbury T. Metabolism of purine nucleotides in the tomato plant//Phytochemistry.- 1986.-V.25.- P.2445-2449.

Burch L.R., Stuchbury T. Purification and properties of adenosine nucleosidases from tomato {Lycopersicon esculentum) roots and leaves// J. Plant Physiol.- 1986.- V.125.- P.267-273.

Chatfield J.M., Armstrong D J. Regulation of eytokinin ox idase activity in callus tissue of Phaseolus vulgaris L.H cv Great Northern. Plant Physiol.- 1986,-V.80.- P.493-499.

Chazen O., Neumann P.M. Hydraulic signals from the roots and rapid cellwall hardening in growing maize (Zea mays L.) leaves are primary responses to polyethylene clycol-induced water deficits/ZPlant. Physiol. - 1994.- V.104.- N 6. -P. 1385-1392.

Chen C-M. Cytokinin biosynthesis in cell-free systems // In: Plant growth substances (Wareing P.F., ed.).- Academic Press, London New York.- 1982,-P.155-164.

Chen C-M., Eckert R.I.. Phosphorylation of cylokinin by adenosine kinase from wheat genn// Plant Physiol.-1977.- V.59.- P.443-447.

Chen C-M., Kristopeit S.M. Metabolism of cytokinin: dephosphorylation of cytokinin ribonucleotide by 5"-nucleotidase from wheat germ cytosol// Plant Physiol.-1981.-V.67.- P.494-498.

105

Chen C-M., Melitz D.K. Clough F.W. Metabolism of cytokinin:phosphoribosylation of cytokinin bases by adenine phosphoribosyltransferase from wheat germ// Archives of Biochemistry and Biophysics.- 1982,- V.214.-P.634-641.

Chen C-M., Petschow B. Metabolism of cytokinin: ribosylation of cytokinin bases by adenine phosphorylase from wheat germ// Plant Physiol.- 1978,-V.62.- P.871-874.

Chen C-M.. Kristopeit S.M. Metabolism of cytokinin:deribosylat ion of cytokin.n ribonuclcosidc by adenine nucleosidase from wheat germ cells// Plant Physiol.- 1981,- V.68.- P. 1020-1023.

Clijsters H., Weckx J., Vangronsveld J., Cuypers A. Similar or different responses of higher plants to several heavy metals //Plant Physiol. Biochem. -1996.-SI.-P.232

Collins J.C., Kerrigan A.P. The effect of kinetin and abscisic acid on water and ion transport in isolated maize roots// New Phytol. - 1974,- V.73, N 2. -P.309-312.

Cornish. K, Zeevaart J.A.D. Abscisic acid accumulation by roots of Xanthium strumarium E. and Lycopersicon vsculenlum Mill in relation to water stress// Plant Physiol.- 1985,- V.79.- P.653-658.

Creelman R.A., Zeevaart J.A.D. Incorporation of oxygen into abscisic acid and phaseic acid from molecular oxygen// Plant Physiol.- 1984,- V.75.- P. 166169.

Creelman R.A., Zeevaart J.A.D. Abscisic acid accumulation in spinach leaf slices in the presence of penetrating and non-penetrating solutes/ZPlant l*hysiol. -1985.-V. 77, N 1. - P. 25-28.

Daeter W., Hartung W. Stress-dependent redistribution of abscisic acid (ABA) in Hordeum Vulgare L. leaves: the role epidermal ABA metabolism, the

106

tonoplastic transport and the cortical// Plant Cell Environ. - 1995. - V. 18. - P. 1367-1376.

Davies W.J., Metcalfe J., Lodge T.A., Costa A.R. Plant Growht substances and the regulation of growth under drought// Aust. J. Plant Physiol. -1986.-V. 13,N 1. -P.105-125.

Davies W..I., Zhang J. Pool signals and the regulation of growth and development of plants in drying soil// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol-1991,- V.42.- P.55-76.

Davies W.J., Jones H.G. Abscisic Acid: Physiology and Biochemistry// Bios Scientific Publishers, Oxford.-1991.

De Silva D.L.R., Hetheringlon A.M., Mansfield T.A. Synergism calcium ions and abscisic acid in preventing stomatal opening// New Phytol.- 1985,-V.100.-P. 473-482.

Doree M., Guern J. Short term metabolism of some exogenous cytokinins in Acer pseudoplatanus cells// Biochim. Biophys. Acta.- 1973,- V.304.- P.611-622.

Duckham S.C., Linforth R.S.T., Taylor. I.B Abscisic-acid-deficient mutants at the aba gene locus of Arabidopsis thaliana are impaired in the epoxidation of zeaxanthin// Plant, Cell and Envir.-1991,- V.14.- P.601-606.

Einspahr K.J., Thompson G.A.. Transmembrane signalling via phosphatidylinositol 4.5-bisphosphate hydrolysis in plants// Plant Physiol.- 1990.-V.93.-P. 361-366.

Else M.A., Hall K.C., Arnold G.M., Davies WJ., Jackson M.B. Export of abscisic acid, 1-aminocyclopopane-l-carboxylic acid, phosphate and nitrate from roots to shoots of flooded tomato plants/ZPlant Physiol. - 1995. - V. 107, M 2. -P. 377-384.

Entsch B., Letham D.S. Enzymatic glucosylation of the cytokinin, 6-benzylaminopurine//Plant Sci. Lett.- 1979.. V.14.- P.205-212.

107

Entsch B., Letham D.S., Parker C.W., Summons R.E. Preparation and characterisation, using high performance liquid chromatography, of an enzyme forming glucosides of cytokinins// Biochim. Biophys. Acta.- 1979,- V.570.-P.124-139.

Entsch B., Letham D.S., Parker C.W., Summons R.E., Gollnow B.E. Metabolism of cytokinins// In: Plant Growth Regulation (Skoog F., ed.).-Springer, Berlin, Heidelberg, New York.- 1979,- P. 109-115.

Estruch J.J., Chriqui D., Grossmann K., Schell J., Spena A. The plant oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucose conjugates// EMBO Journal.-1991,- V.10.- P.2889-2895.

Evans MX. Function of hormones at the cellular level oforganization/ZEncycl. Plant. Physiol. 10 (Pirson A., Zimmermann M.H eds.). -Berlin etc.: Springer-Verlag, 1984. - P. 23-79.

Evans D.E., Briars S-A., Williams I-.A. Active calcium transport by plant cell membranes// J. Exp. Bot.-1991,- V.42.- P.285-303.

Evans, D.E., Briars, S-A., Williams, I-.A. (1991) Active calcium transport hriant cell membranes. J. Exp. Hot. 42,285-303.

Ferret M., Ghisi R., Merlo L., Dalfa V F., Passera C. Effect of cadmium on photosynthesis and enzymes of photosynthetic sulphate and nitrate assimilation pathways in maize {Zea mays L. )//Photosynthetica. - 1993. - V. 92, N 1. - P. 4954.

Fromm J., Fei H. Electrical signaling and gas exchange in maize plants of drying soil // Plant Science. -1998. - V. 113. - P. 203-213.

Fußeder A., Wartinger A., Härtung W., Schulze E.-D., Heilmeier H. Cytokinins in the xylem sap of desert grwon almond (Prunus dulcis) trees: Daily courses and their possible interaction with abscisic acid and leaf conduc-tance//New Phytol. - 1992. - V. 122, № 1. - P. 45-52.

108

Guilfoyle T.J.A Aux/IAA proteins and auxin signal transduction//Trends in Plant Science. - 1998. - V. 3, N 6. - P.205-207.

Gillard D.F., Walton D.C. Abscisic acid metabolism by a cell-free preparation from Echinocyslis lobata liquid endosperm// Plant Physiol.- 1976.-V.58.- P.790-795.

Gilroy S., Fricker M., Read N.D., Trewavas A.J. Role of calcium .in signal transduction of Commelina guard cells// The Plant Cel.-1991,- V.3.- P.333-344.

Gowing D.J.C., Davies W.J., Jones H.G. A positive root-sourced signal as an indicator of soil drying in apple. Mains domeslica Borkh// J. Exp. Bot.- "1990.-V.41.- P.1535-1540.

Gowing, D.J.G., Davies, W.J., Trejo, C.L. & Jones, H.G.. Xylem-transported chemical signals and the regulation of plant growth and physiology// Philosophical Transactions of the Royal Society: Biological Sciences. - 1993. -V. 341. -Pv 41-47.

Griffiths A., Parry A.D., Jones H.G., Tomos A.D. Abscisic acid and turgor presure regulation in tomato roots//J. Plant Physiol. 1996. - V. 149. - P. 372-376.

Griffiths A., Jones H.G., Tomos A.D. Applied abscisic acid root growth and turgor pressure responses of roots of wild-type and the ABA-deficient mutant, Notabilis, of tomato// J. Plant Physiol. - 1996. - V. 151, N 1. - P. 60-62.

Hare P.D., Van Staden J. Cytokinin oxidase: biochemical features and physiological significance // Physiol. Plant.- 1994,- V.91.- P. 128-136.

Härtung W. The site of action of abscisic acid at the guard cell plasmalemma of Naierianella locuslall Plant. Cell & Environment.- 1983,- V.6.- P.427-428.

Härtung W., Gimmler H. The compartmentation of abscisic acid (ABA), of ABA-biosynthesis.ABA-metabolism and ABA-conjugation// In. Plant Growth Substances, (Wareing. P.P., ed.).- Academic Press. London.- 1982,- P.324-333.

109

Hartung W., Radin J.W., Hemdrix D.L. Abscisic acid movement into the apoplastic solution of water-stressed cotton leaves. Role of apoplastic pH//Plant Physiol.- 1988. - V. 86, N 3. - P.908-913

Henson I.E. Abscisic acid and the water relations of rice (Oryza sativa L.): sequential responses to water stress in the leaf/ Ann. Bot. - 1982. - V. 50, N 1. -P. 9-24.

Henson I.E. Inhibition of abscisic acid accumulation in seedling shoots of pearl millet (Pennisetum amencanum L.) following induction of chlorosis by norflurazon. Z//Pflanzenphysiol.- 1984.- V.114.-P.35-43.

Henson I.E., Wareing P.F. Cytokinins in Xanthium strumarium L.: The metabolism of cytokinins in detached leaves and buds in relation to photoperiod// New Phytol.- 1977.-V.78.-P.27-33

Hepler P.K., Wayne R.O. Calcium and plant development// Annu. Rev. Plant Physiol.- 1985.- V.35.- P.397-439.

Hetherington A.M., Battey N.H., Millner P.A. Protein kinases// In: Mrihodsin Plant Biochemistry, (Lea P.J. ed.).- Academic Press. London.- 1990,-P.371-384.

Hetherington A.M., Graziana A.. Mazars C., Thuleau P., Ranjeva R. The biochemistry and pharmacology of plasma-membrane calcium channels in plants// Phil Trans. R. Soc. Lond.- B 338.-1992.- P.91-96.

Hetherington A.M., Quatrano R.S. Mechanisms of action of abscisic acid at the cellular level// New Phytol.-1991.- V.l 19,- P.9-32.

Hirai N., Koshimizu K. A new conjugate of dihydrophaseic acid from avocado fruit// Agric. Biol. Chem.- 1983,- V.47.- P.365-371.

Horgan R.// Physiology and biochemistry of cytokinins in plants/ Eds. Kaminek M., Mok D.W.S.,Zazimalova E., The Hague:Academic Publishing, 1992. P. 3-12.

110

Hornberg C., Weiler E.W. High affinity binding sites for abscisic acid on the plasmalemma of Viciafaba guard cells// Nature.- 1984,- V.310.- P.321-324.

Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R. Cadmium-sensitive, cadi mutats of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient //Plant Physiol. - 1995. -V. 107. №5.-P. 1059-1066.

Incoll L.D., Jewer P.C. Cytokinins and Water Relations of Whole Plants// Plant Hormones in Search of a Role. Monograph 14/ Eds Horgan R., Jeffcoat B. Bristol: British Plant Growth Regula- tion Group, 1987. P. 85-97.

Irving H.R., Gehring C.A., Parish R.W. Changes in cytosolic pH and calcium of guard cells precede stomatal movements// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1992,-V.89.-P. 1790-1794.

Ivanova A., Djilianov D., Van Onchelen H., Atanasov A. Abscisis acid chnages in opsmotic stressed leaves of Alfalfa genotypes varying in drought tolerance//!. Plant Physiol. - 1997.-V. 150, N1.-P. 224-227.

Jackson M. Are plants hormones involved in root to shoot communication? / In: Advanced in Botanical Research, 1993,- V.19 (ed. by J.A.Callow), Academic Press. P.103-187.

Jacqmard A., Houssa C., Bernier G. Abscisic acid antagonizes the effect of cytokinin on DNA-replication origins// Experimental Botany J.- 1995,- V.46, №287.- P.663-666.

Jarvis A.J., Davies W.J. Whole-plant ABA flux and the regulation of water loss in Cedrella odorata/ZPlant, Cell, Environ. - 1997. - V. 20. - P.521-527.

Jones H.G. New concepts in plant water relations: Relevance to horticultural production. Proceedings of 2nd International Symposium on Irrigation of Horticultural Crops, Ed. K.S.Chartzoulakis// Acta Horticulturae- 1997,- V.449.-P.371-378.

Ill

Jones H., Leigh R.A., Tomos A.D. Jones R.G.W. the effect of abscisic acid on cell turgor pressure solute content and growth of wheat roots//Planta. -1987. - V 170, N 2. - P. 257-262.

Kamboj J.S., Blake P.S., Baker D.A. Cytokinins in the vascular saps of Ricinus communis //Plant Growth Regulation. - 1998. - V.25, - P. 123-126.

Kaminck M., Armstrong D.J. Genotypic variation in cytokinin oxidase from Phaseolus callus cultures// Plant Physiol.-1990,- V.93.- P.1530-1538.

Karssen C.M., Lacka E. A revision of the hormone balance theory of seed dormancy: studies on gibberellin and/or abscisic acid deficient mutants of Arabidopsis thalianall In: Plant growth substances (Ed. M.Bopp. B.)-Heidelberg: Springer, 1986.- P.315-323.

Kende H. Preservation of in leaf sections by substanses obtained from root exudate // Science.- 1964,- V. 145.- P. 1066-1067.

Koshimizu K., Inui M., Hukui II., Mitsui T. Isolation of (+)-abscisyl-p-D-glucopyranosid from immaturu fruit of Lupinus luteusll Agric. Biol. Chem.-1968,- V.32.- P.789-791.

Kuiper D., Schuit J., Kuiper P.J.C. Effects of internal and external cytokinin concentration on root growth and shoot to ratio of Plantago maior ssp pleiosperma at different nutrient conditions//Plant and Soil.- 1988,- v.Ill, N 1. -P.231-236.

Laloue M., Fox J.E. Cytokinin oxidase from wheat: Partial purification and general properties/ZPlant Physiol.- 1989,- V.90.- P.899-906.

Laloue M., Pethe C. Dynamics of cytokinin metabolism in tobacco cells// In: Plant Growth Substances (Wareing P.F. ed.).- Academic Press, New York.-1982,- P.185-195.

Larsson E.H., Bornman J.F., Asp H. Infulence of UV-B radiation and Cd2+ on chlorophyll fluorescence , growth and nutrient content in Brassica napus// J. Exp. Bot. -1998. - V. 49, 1031-1039.

112

Lehmann H., Schutle H.R. Purification and characterization of an abscisic asid glucosylating enzyme from cell suspension cultures of Mcicieaya micro-carpall Pflanzenphysiol.- 1980,- V.96- P.277-280.

Leopold A.C., Nooden L.D. Hormonal regulatory systemes in plants// Hormonal Regulation of Development. II.- Berlin etc.: Springer-Verlag, 1984.-P.4-22.

Letham D.S. Zeatin. a factor inducing cell division from Zea mays!7 Life Sci.- 1963.-V.8- P.569-573

Letham D.S., Palni L.M.S. The biosynthesis and metabolism of cytokines// Ann. Rev. Plant Physiol.- 1983,- V.34.- P.163-197.

Letham D.S., Palni L.M.S., Tao G.Q., Gollnow. B.I., Bates C.M. Regulators of cell division in plant tissues. XXIX. The activities of cytokinin glucosides and alanine conjugates in cytokinin bioassay// J. Plant Growth Regulation.- 1983 .-V.2.- P.103-115.

Letham D.S., Tao G.Q., Parker C.W. An overview of cytokinin metabolism// In: Plant growth substances (Wareing P.P., ed.).- Academic Press, London.- 1982,-P.143-153.

Li C.J., Bangerth F. The possible role of cytokinins, ethylene and indoleacetic acid in apical dominance // Progress in Plant Growth Regulation (Eds. Karssen C.M., Van Loon L.C., Vreugdenhil D.). The Netherlands: Kluwer Academic Publishers., 1990,- P. 431-436.

Li Y., Wallon D.C. Xanthophylls and abscisiec acid biosynthesis in water-stressed bean leaves// Plant Physiol.- 1987.- V.85- P.910-915.

Liang J., Zhang J., Wang M.H. How do roots control xylen sap ABA concentration in response to soil diying?//Plant Cell Physiol., 1997. - V. 38, N 1. -P. 10-16.

113

Lindberg S, Wingstrand G. Mechanism for Cd 2+ inhibition of (K+ +Mg2+) ATPase activity and K+ (86Rb+) uptake join roots of sugar beet (Beta vulgaris)!I Physiologia Plantarum. - 1985. - V. 63, N 1. - P. 181-186.

Loveys, U.K., Milborrow B.V. Metabolism of abscisic acid// In: The Biosynthesis and Metabolism of Hormones, (Crozier A., Hillman J.R., eds.).-Cambridge Univ. Press, Cambridge.- 1984.-P.71-104.

Ludewig M., Dorffling K., Seifert H. Abscisic acis and water transport in sunflowers//Planta. - 1988,- V.175, N 3,- P.325-328.

MacRobbie E.A.C. Calcium and ABA-induced stomalal closure// Phil. Trans. R.Soc. Lond.- B 338.-1992,- P.5-18.

MacRobbie E.A.C. Calcium influx at the plasmalemma of isolated guard cells of Commelina communis. Effects of abscisic acid// Planta.- 1989,- V.178.-P.231-241.

MacRobbie E.A.C. Calcium-dependent and calcium-independent events in the initiation of stomatal closure by ahscisic acid// Proc. R. Soc. Lond.- B 241.1990,- P.214-219.

Malek, T., Baker, D.A. Effect ol fusicoccin on proton co-transport of sugars in the phloem loading of Ricinus communis// Plant Sci. Lett.- 1978 V.ll, P.233-39.

Mansfield T..A., Hetherington A.M., Atkinson C..I. Some current aspects of stomatal physiology// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 1990.- V.41-P.55-75.

Mansfield T.A., McAinsch M.R. Hormones as regulators of water balance// Plant Hormones/ Davies P.J., eds. Dortrecht Berlin London: Kluwer Academic Pubhsher, 1995. P. 598-616.

Marechal-Drouard L., Weil J.H., Dietrich A. Transfer RNAs and transfer RNA genes in plants// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1993.-V.44,-P.13-32.

114

Masson N, Poschenrieden C., Barcelo J. Aluminium-induced increase of zeatin riboside and dihydrozeatin riboside in Phaseolus vulgaris L. cultivars// J. of Plant Nutrition. - 1994. - V. 17, N 1. - P. 255-265.

Massot N., Nicander B., Tillberg E. Aluminium treatment induced changed cytokinin profile and enhanced ethylene production in Phaseolus vulgaris seedlings/ Biologia plantarum. -1999. - V.42, № S.- P. 76.

McAinsh M.R., Brownlee C., Hetherington A.M. (1991) Partial inhibition of ABA-induced stomatal closure by calcium channel blockers// Proc. R. Soc. Lond.- B 243,- 1991,- P.195-201.

McAinsh M.R., Brownlee C., Hetherington A.M. Abscisic acid-induced elevation of guard cell cytosolic Ca2' precedes stomatal closure// Nature.- 1990.-V.343.- P.186-188.

McAinsh M.R.,. Brownlee C., Hetherington A.M. Visualizing changes in cytosolic-free Ca21 during the response of stomatal guard cells to abscisic acid// The Plant Cell.- 1992,- V.4.- P. 1113-1122.

McGaw B.A. Cytokinin metabolism // Plant Hormones in Search of a role. Monograph 14 ( R.Horgan and B.Jeffcoat, eds.). - Bristol: British Plant Growth Regulation Group, 1987,- P. 9-17.

McGaw B.A., Heald J.K., Horgan R. Dihydrozeatin metabolism in radish seedlings//Phytochemistry.- 1984,- V.23.- P.1373-1377.

McGaw B.A., Horgan R. Cytokinin catabolism and cytokinin oxidase// Phytochemistry.- 1983,-V.22.-P.1103-1105.

McGaw B.A., Horgan R. Cytokinin oxidase from Zea mays kernels and Vinca rosea crown gall tissue// Planta.- 1983. -V.159.- P.30-37.

McGaw B.A., Horgan R., Heald J.K. Cytokinin metabolism and the modification of cytokinin activity in radish// Phytochemistry.- 1985,- V.24.- P.9-13.

115

McGaw B.A., Scott I.M., Horgan R. Cytokinin biosynthesis and metabolism// In: The Biosynthesis and Metabolism of Plant Hormones( Crozier, A., Hillman J.R., eds.).- Cambridge University Press, Cambrige.- 1984,- P. 105133.

Milborrow B.V. Identification of metabolite C from abscisic acid and a new structure for phaseic acid// Chem. Commun.-1969 - P.966-967.

Milborrow B.V., Vaughan G.T. (1982) Characterization of dihydrophaseic acid r-(3-l)-glucopyranoside as a major metabolite of abscisic acid. Australian Journal of PI n( Physiology. 9, 361-372.

Misra J., Pandey V., Singh N. Effects of some heavy metals on root growth of germinating seeds of Vicia faba // J. Environ. Sei and Health. - 1994,- V. 29. №10. -P. 2229-2234.

Mittlehauser C.G., van Stcveninck R.F.M. Stomatal closure and inhibition of transpiration induced by RS-abscisic acid// Nature.- 1969,- V.221.- P.281-282.

Moffatt B., Pethe C., Laloue M. Metabolism of benzyladenine is impaired in amutant of Arabidopsis thaliana lacking adenine phosphoribosyltransferase activity// Plant Physiol.-1991.- V.95.- P.900-908.

Moffatt B.. Somerville C. Positive selection for male-sterile mutants of Arabidopsis lacking adeninephosphorihosyi transferase activity// Plant Physiol.-1988,- V.86.-P.1150-1154.

Mok D.W.S., Mod M.C., Shaw, G., Dixon S.C., Martin R.C. Genetic differences in the enzimatic regulation of zeatin metabolism in Phaseolus embryos// In.Plant Growth Substances (Pharis R.P., Rood S.B. eds.).- SpringerVerlag, Berlin.- 1988,- P.267-274.

Moore R, Smith J. Growth, graviresponsiveness and abscisic acid content of Zea mays seedlings treated with fluridone// Planta.-1984,- V.162- P.342-344.

116

Moore R., Smith J.D. Graviresponsiveness and abscisic acid content of roots of carotenoid-deficient mutants of Zea mays// Planta.- 1985,- V.164.-P.126-128.

Moran N.P., Becana M., Iturbe-Ormaetxe I., Frechilla S., Klucas R.V., Aparicio-Tejo P. Drough induced oxidative stress in pea plants/ZPlanta. - 1994. -V. 194, N2.-P. 346-352.

Neil S.J., Horgan R., Parry A.D. The carotenoid abscisic acid cjntent of vivarous kernels and seedlings of Zea mays ~L.II Planta.- 1986,- V.169.- P.87-96.

Neill S.J., Horgan R„ Lee T.S., Walton D.C. 3-methyl-5-(4*-oxo-2', 6",.6' -trimethylcyclohex-2'-en-yl)-2, 4-pentadienoic acid, a putative precursor of abscisic acid from Cercospora rosicolall FEBS Lett.-1981,- V.128.- P.30-32.

Neill S.J., Horgan R.. Walton D.C. Biosynthesis of abscisic acid. I I In The Biosynthesis and Metabolism of Hormones, (Crozier A., Hillman J.R., eds.).-Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.- 1984.-P.43-70.

Palmer M.V., Horgan R., Wareing P.F. Cytokinin metabolism in Phaseolus vulgaris L. I. Variation in cytokinin levels in leaves of decapitated plants in relation to bud outgrowth// J. Exp. Bot.-1981,- V.32.- P.1231-1241.

Palmer M.V., Scott I.M., Horgan R. Cytokinin metabolism in Phaseolus vulgaris L. II. Comparative metabolism of exogenous cytokinins by detached leaves// Plant Sci. Lett.-1981,- V.22.-P.187-195.

Palni I.M.S., Horgan R., Darral N.M., Stuchbury N., Warieng P.F. Cytokinin biosynthesis in crown-gall tissue of Vicea rosea. The significance of nucleotides // Planta.- 1983,- V. 159,- P. 50-59.

Parker C.W., Letham D.S. Regulators of cell division in plant tissues. XVI. Metabolism of zeatin by radish cotyledons and hypocotyls// Planta.- 1973.-V.114.- P.199-218.

117

Parker C.W., Letham D.S., Gollnow B.I., Summons R.E., Duke C.C., MacLeod J.K Regulators of cell division in plant tissues. XXV. Metabolism of zeatin in lupin seedlings// Planta.- 1978,- V. 142,- P.239-251.

Parry A.D, Horgan R. Abscisic acid biosynthesis in higher plants// In: Progress in Plant Growth Regulation, (Karssen CM., Van Loon L.C., Vreugdenhil D., eds.J. - Kluwer Academic Pub, Netherlands. -1992. -P. 160-172.

Parry A.D., Griffiths A., Horgan R. Abscisic acid biosynthesis in roots. II. The effects of water-stress in wild-type and abscisic-acid-deficient mutant (no-tabilis) plant of Lycopersicon esculenlum Mill// Planta.- 1992,- V.187.- P. 192197.

Parry A.D., Neill S., Horgan R. Xanthoxin levels and metabolism in the wild type and wilty mutants of tomato// Planta.- 1988,- V.173.- P.397-404.

Passiura J.B. Root signals control leaf expansion in wheat seedlings growing in drying soil//Aust. J. Plant Physiol. - 1988. - V. 15, N 4. - P. 687-693.

Pierce M., Raschke K. Correlation between loss of turgor and accumulation of abscisic acid in detached leaves// Planta, 1980. - V. 148, N 1. - P. 174182.

Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. Calcium and signal transduction in plants// CRC Critical Rev. Plant Sci.- 1993,- V.12.- P.185-211.

Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. Calcium messenger systems in plants// CRC Critical Rev. Plant Sci.- 1987,- V.6.- P.47-103.

Radin J.W. Stomatal responses to water stress and to abscisic acid in phosphorus-deficient cotton plants// Plant Physiol- 1984- V.76- P.392-394.

Reid D.M., Wample R.L. Water relation and plant hormones //Hormonal regulation of development. III. - Berlin etc.,; Springer-Verlag, 1985. - P. 513-577.

118

Ribaut G-M., Pilet P-E. Effects of water stress on growth osmotic potential and abscisic acid content of maize roots// Physiol. - 1991. - V. 81, N 1. - P. 156162.

Rock C.D., Zeevaart J.A.D. The aha mutant ofArabidopsis thaliana is impaired in epoxy-carotenoid biosynthesis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991.-V.88.- P.7496-7499.

Saab I.N., Sharp R.E., Pritchard J. and Voetberg G.S. Increased endogenous abscisic acid maintains primary root growth and inhibits shoot growth of maize seedlings at low water potentials// Plant Physiol. - 1990. - V.93, N 4,-P.1329-1336.

Sadorge P., Doree M., Terrine C., Guern J. Absorption and utilisation of exogenous adenine by plant tissue. I. Technique for the measurement of adenini pyrophosphoribosyi transferase activity// Physiol. Veg.- 1970,- V.8- P.499-514.

Salisbury F.B., Marinos N.G. The ecological role of plant growth substances/ZHormonal regulation of development. III. Berlin etc.: SpringerVerlag, 1985. - P. 707-764.

Schroeder J.I., Hedrich R. Involvement of ion channels and active transport in osmoregulation and signaling in higher plant cells// Trends Biochem. Sci.-1989,- V.14.- P.187-192.

Scott I.M., Horgan R. Mass spectrometric quantification of cytokinin nucleotides and glycosides in tobacco crown gall tissue// Planta.- 1984,- V.161.-P.345-354.

Sharshidhar V.R., Prasad T.G. Sudharshan L. Hormaone sygnals from roots to shoots of sunflower (Helianthus annuus L.). Moderate soil dying increases delivery od abscisic acid and depresses delivery of cytokinins in xylem sap//Annals of Botany. - 1996. - V. 78, № 1. -P.151-155.

119

Silverman P.F., Assiamah A.A., Bush D.S. Membrane transport and cytokinin action in root hairs of Medicago sativa// Planta. - 1998. - V. 205, N 1. -P. 23-31.

Sindhu R.K., Griffin D.H., Walton DC. Abscisic aldehyde is an intermediate in the enzymatic conversion of xanthoxin to abscisic acid in Phaseolus vulgaris leaves// Plant Physiol.- 1990,- V.93- P.689-694.

Smigocki A.C. Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by reconstructed isopentenyl transferase gene//Plant. Mol. Biol. — 1991. — V. 16,N1.-P. 1-5-115.

Smith G.N., Willmer C.M. Effects of calcium and abscisic acid on volume changes of guard cell protoplasts of Commelina commuiusll J. Exp. Bot.- 1988.-V.30.- P.1529-1539.

Somashekaraiah B.V., Padmaja K., Prasad A.R.K. Phytotoxicity of cadmium ions on germinating seedlings of mung bean (Phaseolus vulgaris): involvement of lipid peroxides in chlorophyll degradation.//Physiologia Plantarum. -1992.-V. 85,N 1. - P. 85-89.

Stillwell W., Brengle B., Hester P., Wassail S.R. Interaction ofabscisic acid with phospholipid membranes// Biochemistry.- 1989,- V.28.- P.2798-2804.

Stuchbury T., Burch L.R. Enzymology of cytokinin and purine metabolism// In: Cytokinins - plant hormones in search of a role (monograph 14), (Horgan, R., Jeffcoat, B., eds.).- British Plant Growth Regulator Group, Bristol.-1987,-P. 19-24.

Summons R.E., Letham D.S., Gollnow B.I., Parker C.W., Entsch B., Johnson L.P., MacLeod J.K., Rolfe B.G. Cytokinin translocation and metabolism in species of the Leguminoscac: studies in relation to shoot and nodule development// In; Metabolism and Molecular Activities of Cytokinins (Guern J., Peaud-Lenoel C. eds.).- Springer, Berlin, Heidelberg, New York.- 1981,- P.69-80.

Tao G.Q., Letham D.S., Palni M.S., Summons R.E. Cytokinins biochemistry in relation to leaf senescence. I. The metabolism of 6-benzylaminopurine and zeatin in oat leaf segments // J. Growth Regul.- 1983,- V. 2,- P. 89-102.

Tardieu F., Zhang J., Kalerji N., Bethenod O., Palmer S., Davies, V..I. Xylem ABA controls the .slomatal conductance of field-grown maize subjected lo soil compaction or soil drying// Plant. Cell & Environment.- 1992,- V.15- P.193-197.

Taylor H.F., Burden R.S. Preparation and metabolism of 2-14C-cis, trans xanthoxin//J. Exptl. Bot- 1973,- V.24-P.873-880.

Taylor I.B. ABA-deficient tomato mutants// In: Developmental Mutants in Higher Plants, (Thomas H., Grierson D., eds.).- S.K.B. Seminar Series, Cambridge University Press, Cambridge.- 1987.

Taylor I.B., Linforth R.S.T., AI-Naieb R.J., Bowman W.R., Marples B.A. .The wilty tomato mutants flacca and sitiens are impaired in the oxidation of ABA-aldehyde to ABA//Plant, Cell and Environment.- 1988,- V.ll.- P.739-745.

Tester M. The control of long-distance K+ transport by ABA//Trends Plant Sci. - 1999. - V.4, N 8. - P. 5-6.

Trejo C.L., Davies W.J., Ruiz L.M.P. Sensitivity of stomata to ABA. An effect of the mesophyll/Mant Physiol. - 1993. - V. 102, N 2. - P. 487-502.

Uknes S. J., .Ho, T.H.D. Mode of action of abscisieacid in barley aleurone layers: abscisic acid induces its own conversion to phaseic acid// Plant Physiol.-1984,-V.75.-P.1126-1132.

Van Staden J., Drewes F.E. The biological activity of cytokinin derivatives in the soybean callus bioassay // Plant Growth Regulation.- 1991.- V. 10,- P. 109-

121

Van Staden J., Harty R. Cytokinins and adventitious root formation // In: Adventitious root formation in cuttings. (Eds. T.D.Davies, B.E.Haissig, N.Sankhila). - Dioscorides Press, 1988,- V. 2.- P. 185-201.

Van Volkenburg E., Davies W.J. Inhibition of light-stimulated leaf expansion by abscisic acid// J. Exp. Bot.- 1983,- V.34.- P.835-845.

Wagner B.M., Beck E. Cytokinins in Urtica Dionica plants: production, metabolism and fluxes// Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants (M.Kaminek, D.W.S. Mok, E.Zazimalova eds.). Proc. Int. Symp.- Amsterdam: Kluwer Publ., 1992.-P. 53-57.

Walton D.C. Structure-activity relationships of abscisic acid analogs and metabolites// in: Abscisic Acid, (Addicott F.T., ed.).- Praeger, New York.- 1983.-P.l 13-146.

Walton D.C., Dora B., Fey .L. The isolation of an abscisic acid metabolite, 4'-dihydrophaseic acid, from non-imbibed Phaseolus vulgaris seed// Planta.-1973.- V.l 12.- P.87-90.

Walton D.C., Li Y. Abscisic acid niosynthesis and metabolism/ZPlant Hormones (Davies J.P.ed.). - Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1995. - P. 140158.

Wang J.J., Zhou R., Zhou Y. Endogenous levels of ABA and cytokinins and their relation to stomatal behavior in dayflower (Commelina communos L.)//J. Plant Physiol. - 1994. - V. 144, N 1. - P. 45-48.

Wareing P.F. Abscisic acid as a natural growth regulation// Phil. Trans. Roy. Soc. London. B.- 1978,- P.483-498.

Whitty C.£>., Hall R.H. A cytokinin oxidase in Zea maysll Can. J. Biochem.- 1974,- V.52- P.781-799.

Wright S.T.C., Hiron R.W.P. ( + ) abscisic acid, the growth inhibitor induced in detached wheat leaves by a period of wilting// Nature.- 1969,- V.224.-P.719-720.

122

Zeevaart J.A.D., Creelman R.A. Metabolism and physiology of abscisic acid// Arniu. Rev. Plant Physiol.- 1988,- V.39.- P.439-473.

Zeevaart J.A.D., Milborrow B.V. Metabolism of abscisic acid and the occurrence of epi-dihydrophaseic acid in Phaseolus vulgaris I I Phytochemistry.-1976,- V.15.- P.493-500.

Zhang J., Davies W.J. Abscisic acid produced in dehydrating roots may enable the plant to measure the water status of the soil// Plant, Cell & Environment.- 1989,- V.12.- P.73-81.

Zhang J., Jia W., Zhang D. Export and metabolism of xylem-delivered ABA in detached maize leaves under different transpirational fluxes and xylem ABA concentration//Exp. Bot. - 1997. - V. 48, N 313. - P. 1557-1564.

Zhong W., Härtung W., Comor E., Schobert C. Phloem transport of abscisic acid i Ricinus communos L. seedlings/ZPlant, cell, Envisron. - 1996. -V. 19.-P. 471-477.

Zizarova G., Holub Z. The effect of heavy metal stress on growth and level of phytohormones of grass roots Agrostis stoloniphera // Struct, and Func. Roots: 4th Int. Symp. Stara Lesna, June 20-26, 1993: Book Abstr. and program. Bratislava, 1993. P. 110.