Клонирование кДНК и функциональный анализ нового белка человека СВР1, принадлежащего к классу КН-доменных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Лукьянова, Татьяна Ивановна

• Лукьянова, Татьяна Ивановна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лукьянова, Татьяна Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Полифункциональные белки: связь между транскрипционными 9 и пост-транскрипционными процессами в клетке

II. Особенности структуры ЬпВМР белков

1. ЛВВ/ЕРМ/1иЧР-С8 домен

2. ЯСС мотив

3. К-Ното1(^у домен

4. Дополнительные домены

III. Пост-транскрипционные и пост-трансляционные 16 модификации

IV. Свойства и функции Ьп1йЧР белков

1. Специфичность связывания с нуклеиновыми кислотами

2. Роль 1т1№Р белков в упаковке мРНК

3. Спаривание цепей РНК

4. Взаимодействие с другими белками

5. Роль ИпШЧР белков в сплайсинге

6. Роль 1тШЧР белков в транспорте зрелой мРНК из ядра

в цитоплазму

7. Специфическая экспрессия ЬпККР белков в различных

типах клеток и участие из в развитии заболеваний

V. Класс КН-доменных белков

1. Связывание ИпИЧР К с нуклеиновыми кислотами

2. КН-домен - основной структурный и функциональный

элемент класса КН-доменных белков

VI. Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ферменты и реактивы

Выделение плазмидной ДНК

Агарозный гель-электрофорез ДНК и выделение

фрагментов ДНК из геля

Плазмиды и клонирование

Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Культуры клеток

Штаммы бактерий

Трансформация клеток Е. соИ плазмидной ДНК

Выделение тотальной РНК и очистка поли-(А) + РНК

Фракционирование РНК в агарозном геле,

содержащем формальдегид

Перенос РНК на нейлоновую мембрану НуЬопй 14+

Нозерн-блот гибридизация 55 Радиоактивное мечение ДНК-зонда с

использованием рассеянной затравки

Выделение геномной ДНК из клеток человека и

анализ ее по Саузерну

Клонирование кДНК СВР1 с помощью стратегии

вычитания

Полимеразная цепная реакция

Обратная транскрипция 64 Получение делеционных конструкций с

помощью экзонуклеазы BAL31

in vitro транскрипция и трансляция

Анализ связывания белка СВР1 и его делеционных

вариантов с олиго-й( С ) последовательностью

Компьютерная обработка результатов и

использованные базы данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Клонирование кДНК нового белка человека СВР1 70 Анализ нуклеотидной последовательности

клонированной кДНК

Экспрессия гена СВР1 в различных тканях человека

Экспрессия гена СВР1 в различных клеточных

линиях человека

Экспрессия белка СВР1 in vitro

Изучение копийности гена СВР1 в геноме человека

Функциональный анализ белка СВР1

Изучение структуры "вариабельного" участка мРНК СВР1

Определение функциональной значимости

различных участков белка СВР1

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

hnRNP - heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (complex)

snRNP - small nuclear ribonucleoprotein

TBP - the TATA-binding protein

NLS - nuclear localization sequence

HIV- human immunodefficiency vims

snRNP - small nuclear ribonucleoprotein

SDS - додецил сульфат натрия

TFIIIA - transcription factor IIIA

cpm - counts per minute

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РТ-ПЦР - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

DMEM - Dulbecco's modified Eagle's medium

FBS - Fetal Bovine Serum

MOPS - 3-[N-morpholino]propane sulfonic acid

ТЛЕ - tris-acetate-EDTA buffer

TBE - tris-borate-EDTA buffer

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование кДНК и функциональный анализ нового белка человека СВР1, принадлежащего к классу КН-доменных белков»

ВВЕДЕНИЕ

Как показали многочисленные исследования, структурные и функциональные нарушения в регуляторных белках лежат в основе многих заболеваний, таких как рак, атеросклероз, анемия, различные дефекты развития. Ежегодно от этих заболеваний умирают миллионы людей. Поэтому изучение регуляторных молекул стало одним из наиболее приоритетных направлений современных исследований. Недавно было показано, что многие регуляторные белки обладают множественными функциями. Они осуществляют связь между транскрипционными и пост-транскрипционными событиями в клетке.

Одним из известных семейств полифункциональных регуляторных белков являются 1тК№ белки. Изначально считали, что их единственная функция - участие в упаковке первичных транскриптов в рибонуклеопротеиновые комплексы и регуляция их доступности для факторов сплайсинга и ядерно-цитоплазматического транспорта. Впоследствии было показано, что ЬпИ^ЧР белки могут сами осуществлять сплайсинг, а также являются транскрипционными факторами. Многие 1т1ШР белки циркулируют между ядром и цитоплазмой, участвуя в транспорте мРНК. Было также показано участие этих белков в передаче сигналов внутри клетки.

Один из ЬпЯЫР белков, ЬпЯЫР К, дал начало новому классу КН-доменных белков. Белки этого класса объединяет присутствие в молекуле канонических последовательностей - КН-доменов, и основанное на этом функциональное родство. Так, характерной особенностью всех этих белков является способность с высокой специфичностью и аффинностью связываться с поли-(С) последовательностями ДНК и РНК. Были получены многочисленные свидетельства, включая настоящую работу, что именно КН- домены ответственны за эту функцию. В результате изучения КН-доменных белков была выявлена роль многих из них в развитии таких тяжелых заболеваний человека, как рак поджелудочной и молочной желез, мелкоклеточный рак легкого, наследственная умственная отсталость и анемия.

КН-доменные белки были найдены как в высших эукариотах, так и в дрожжах и прокариотах. В этих организмах такие белки участвуют в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и являются рибосомальными белками.

К сожалению, в настоящее время КН-доменные белки еще мало изучены по сравнению с другими регуляторными белками, такими как, например, многие транскрипционные факторы или белки сплайсинга. Однако, основываясь на их полифункциональности, становится ясно, что дальнейшее изучение этих белков откроет новые перспективы для более полного понимания регуляции многих процессов в клетке, таких как процессинг и транспорт

транскриптов, работа сигнальных каскадов, транскрипция и трансляция, регуляция времени жизни молекул. Это, в свою очередь, позволит разработать новые подходы к диагностике и лечению уже известных синдромов, связанных с нарушениями в КН-доменных белках, и, возможно, определить молекулярные основы многих других заболеваний.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ: СВЯЗЬ МЕЖДУ ТРАНСКРИПЦИОННЫМИ И ПОСТ-ТРАНСКРИПЦИОННЫМИ ПРОЦЕССАМИ В КЛЕТКЕ

Данные, накопленные в результате многолетних исследований, указывают на тесную взаимосвязь между транскрипционными и пост-транскрипционными событиями в клетке. Известно, что специфические промоторы определяют дальнейшую пост-транскрипционную судьбу транскриптов (Neuberger and Williams, 1986; Neuberger and Williams, 1988). Это указывает на взаимосвязь между белковыми комплексами, связанными с ДНК, и первичными транскриптами РНК. Во-вторых, все большее число белков оказываются полифункциональными и участвуют как в транскрипционных, так и в посттранскрипционных событиях.

Классическим примером служит TFIIIA, который необходим как для транскрипции 5S гРНК, так и для укладки ее в рибонуклеопротеиновые комплексы (Pieler and Theunissen, 1993; Shastry, 1996, Hayes and Tullius, 1992). Известно также, что белки, содержащие Y-box связываются с ДНК, активируя или ингибируя транскрипцию, а так же с РНК, участвуя в упаковке мРНК (Goldstein et al., 1990; Jones et al., 1992; Jiang et al., 1997; Graumann and Marahiel, 1996; Sommerville and Ladomery, 1996; Ladomery and

Somerville, 1995; Tafuri and Wolffe, 1992; Sommerville and Ladomery, 1996; Ting, 1994). Супрессор опухолей WT1 вначале также считался типичным транскрипционным фактором. Впоследствии была показана его роль также и в сплайсинге первичных транскриптов (Hastie, 1994; Reddy and Licht, 1996; Larsson, 1995; Wansink et al., 1994; Yuryev et al, 1996; Steinmetz, 1997).

Еще одной большой группой полифункциональных белков являются hnRNP белки. Как известно, первичные транскрипты РНК упакованы в цепи однородных 30S, 20 нм частиц, называемые hnRNP комплексами, которые под электронным микроскопом выглядят как "бусинки на нитке" (Samarina, 1996). Эти частицы содержат hnRNP белки, которых известно как минимум 20 классов в клетках млекопитающих (Choi and Dreyfuss, 1984; Dreyfuss et al., 1993; Matunis et al., 1992). Эти белки были классифицированы по буквенной системе от А до U. Считают, что они необходимы для упаковки пре-мРНК, регулируя ее доступность для факторов сплайсинга и ядерно-цитоплазматического транспорта. Показано, что некоторые hnRNP белки могут сами осуществлять сплайсинг: так, hnRNP Al определяет выбор альтернативных 5'-сплайс-сайтов, конкурируя за них с фактором сплайсинга ASF/SF2 (Yang et al., 1994).

Многие hnRNP белки также способны циркулировать между ядром и цитоплазмой, и, по-видимому, участвуют в транспорте мРНК, в то время как белок hnRNP С локализуется исключительно

в ядре (Siomi et al, 1993; Siomi et al., 1994; Tomonaga and Levens, 1995).

IL ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ hnRNP БЕЛКОВ

Все hnRNP белки содержат один или несколько РНК-связывающих домена совместно с набором других более или менее изученных мотивов (Burd and Dreyfuss, 1994). Всего в настоящее время известно три типа РНК-связывающих доменов (Рис. 1): 1) RBD/RPM/RNP-CS (RNA-binding domain/RNA-recognition motif/RNP-consensus motif); 2) RGG box; 3) K-Homology domain (КН-домен). Необходимо заметить, что эти мотивы найдены не только в hnRNP белках (Burd and Dreyfuss, 1994).

1. RBD/RPM/RNP-CS домен

RBD/RPM/RNP-CS домен является наиболее хорошо охарактеризованным РНК-связывающим доменом. Он состоит из 90 аминокислотных остатков, среди которых выделяются две коротких высоко консервативных последовательности: октапептид и гексапептид, названные, соответственно, RNP1 и RNP2 (Dreyfuss et. al., 1993). В составе RBD/RPM/RNP-CS домена они разделены участком длиной около 30 аминокислот. Была определена 3-мерная структура некоторых RBD доменов (Nagai et al., 1990; Wittekind et al., 1992). В ней элементы вторичной структуры образуют 4-х цепочечный антипараллельный /3-слой и две перпендикулярные друг

другу а-спирали. В этой структуре RNP1 и RNP2 последовательности находятся на центральных /31 и /32 цепях. Предполагается, что именно они осуществляют прямой контакт с РНК. /3-слой создает платформу для связывания РНК, находясь на которой, она доступна для взаимодействий с белками процессинга (Merrill et al., 1988). Специфичность связывания обеспечивается за счет петель, соединяющих Д-слои и N- и С-концевых участков (Burd and Dreyfuss, 1994; Gorlach et. al, 1992).

2. RGG мотив

RGG мотив содержит повторы кластера аминокислот Arg-Gly-Gly (RGG). Между этими повторами находятся чаще всего ароматические аминокислоты. Число и расстояние между RGG повторами различаются у разных белков. В белке hnRNP U RGG мотив является единственным РНК-связывающим элементом (Kiledjian and Dreyfuss, 1992), в то время как в hnRNP Al этот мотив найден в комбинации с другими РНК-связывающими мотивами (Biamonti and Riva, 1994; Ghisolfi et al., 1992). Трехмерная организация RGG мотива до конца неизвестна, однако, предполагается, что она представляет собой /3-спиральную структуру (Ghisolfi et al., 1992). Остается неясным, обеспечивает ли RGG мотив специфичность связывания определенных

последовательностей РНК, но, по-видимому, hnRNP U способен

ШР2

ЯВО/ЯВМ/ЯЫР-СЗ домен

ИИ.

МИР А1 <\ЕЕКЕРВ21Ж врсаньтакк МЯ®> С1/С2 КГОРВ£»1Ж

консенсус

вторичная структура

[ИШЬ п\газ1 оттсиь

-ЗРЕЯТ КЕСГЕ

тотк

ТОО/ ЕОТЕ

-\лэс

имшилгао

«ижзазкк ль-

взгерда

АТОЕЕУПА ССВДЗУПК

КЕРАТОУ МЕНЖИА

М№ЖРИК-гаокжг-

I 0 в В1

йзизлоор I* та у

а1

р2

Явй мотив

ЬпШР и М ВОЗ да— ваз ж? н юз ж воз

ЬгШР А1 в ваз №эз ваз газ юз аз таз

Шс1еоХш в воз -ТОЗ ВОЗ в воз гоз го а*з

консенсус |юз|

(33

КН домен

0

а2

ВУУЕР1ФА НИСЕИЖА ЗУШЩЬА

134

ЬпШР К Г-И >

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Лукьянова, Татьяна Ивановна

выводы

1. Клонирована кДНК нового белка СВР1 из лимфоидных клеток человека.

2. мРНК СВР1 дифференциально экспрессирована в различных тканях и клеточных линиях человека.

3. Показана уникальность гена СВР1 в геноме человека.

4. На основе анализа первичной структуры и функционального изучения белок СВР1 отнесен к классу КН-доменных белков.

5. Получены первые свидетельства в пользу того, что КН-домены ответственны за связывание с нуклеиновыми кислотами и обладают поли-(С) специфичностью.

6. Проведен структурно-функциональный анализ белка СВР1: показано, что для связывания с поли-(С) последовательностями необходимыми являются только КН-домены, а "вариабельный" участок не оказывает качественного влияния на эту функцию белка in vitro.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лукьянова, Татьяна Ивановна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Aasheim, H.-C., Loukianova, T., Deggerdal, A., Smeland, E. (1994) Tissue specific expression and cDNA structure of a human transcript encoding a nucleic acid binding [oligo(dC)] protein related to the pre-mRNA binding protein K. Nucleic Acids Res. 22, 959-964.

2. Ben-David, Y., Bani, M.R., Chabot, B., De Koven, A. and Bernstein, A. (1992). Retroviral insertion downstream of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 gene in erylhroleukemia cells: evidence that A1 is not essential for cell growth. Mol. Cell. Biol. 12, 4449-4455.

3. Bennett, R., Pinol-Roma, S., Stakins, D., Dreyfuss, G. and Reed, R. (1992). Differential binding of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins to mRNA precursors prior to spliceosome assembly in vitro. Mol. Cell. Biol. 12, 3165-3175.

4. Biamonti, G. (1993). Human hnRNP protein A1 gene expression: structural and functional characterization of the promoter. J. Mol. Biol. 230, 77-89.

5. Biamonti, G., Ruggiu, M., Saccone, S., Delia Valle, G. and Riva, S. (1994). Two homologous genes, originated by duplication encode the human hnRNP proteins A2 and Al. Nucleic Acids Res. 22, 1996-2002.

6. Biamonti, G. and Riva, S. (1994). New insights into the auxiliary domain of eucaryotic RNA binding proteins. FEBS Lett. 340, 1-8.

7. Blyn, L., Towner, J., Semler, B., Ehrenfeld, E. (1997) Requirement of poly(rC) binding protein 2 for translation of poliovirus RNA. /. Biol. Chem. 71, 6243-6246.

8. Bomsztyk, K., Van Seuningen, I., Suzuki, H., Denisenko, O., Ostrowski, J. (1997) Diverse molecular interactions of the hnRNP K protein. FEBS letters 403, 113-115.

9. Bouvet, P., Matsumoto, K. and Wolffe, A. P. (1995). Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins - an essential role for the cold-shock domain. J. Biol. Chem. 270, 28297-28303.

10. Buckanovich, R., Posner, J., Darnell, R. (1993) Nova, the paraneoplastic Ri antigen, is homologous to an RNA-binding protein and is specifically expressed in the developing motor system. Neuron 11 657-672.

11. Burd, C.G., Swanson, M.S., Gorlach, M. and Dreyfuss, G. (1989). Primary structures of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2, Bl, and CI proteins: a diversity of RNA binding proteins is generated by small peptide inserts. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 9788-9792.

12. Burd, C.G. and Dreyfuss, G. (1994). RNA binding specificity of hnRNP Al: significance of hnRNP Al high-affinity binding sites in pre-mRNA splicing. EMBO /.13.1197-1204.

13. Burd, C.G. and Dreyfuss, G. (1994). Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 265, 615-621.

14. Buvoli, M., Cobianchi, F., Biamonti, G. and Riva S. (1990). Recombinant hnRNP protein Al and its N-terminal domain show preferential affinity for oligonucleotides homologous to intron/exon acceptor sites. Nucleic Acids Res. 18, 6595-6600.

15. Buvoli, M. (1990). Alternative splicing in the human gene for the core protein Al generates another hnRNP protein. EMBO J. 9, 1229-1235.

16. Buvoli, M„ Cobianchi, F. and Riva, S. (1992). Interaction of hnRNP Al with snRNPs and pre-mRNAs: evidence for a possible role of Al annealing activity in the first steps of spliceosome assembly. Nucleic Acids Res. 20, 5017-5025.

17. Caceres, J.F., Stamm, S., Helfman, D.M. and Krainer, A.R. (1994). Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science 265, 1706-1709.

18. Calvio, C, Neubauer, G., Mann, M., Lamond, A.I. (1995). Identification of hnRNP P2 as TLS/FUS using electrospray mass spectrometry. RNA 1 724-733.

19. Cartegni, L. (1996) hnRNP Al selectively interacts through its Gly -rich domain with different RNA-binding proteins. J. Mol. Biol. 437, 38-43.

20. Choi, Y. D. and Dreyfuss, G. (1984). Isolation of the heterogenous nuclear RNA-ribonucleoprotein complex (hnRNP): a unique supramolecular assembly. Proc. Natl Acad. Sci. USA 81. 7471-7475.

21. Chomczynsky, P. and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 162, 156-159.

22. Cobianchi, F., Calvio, C., Stoppini, M., Buvoli, M. and Riva, S. (1993). Phosphorylation of human hnRNP protein Alabrogates in vitro strand-annealing activity. Nucleic Acids Res. 21, 949-955.

23. Datar, K.V., Dreyfuss, G. and Swanson, M.S. (1993). The human hnRNP M proteins: identification of a methionine/arginine-rich repeat motif in ribonucleoproteins. Nucleic Acids Res. 21, 439-446.

24. Dejgaard, K. (1994). Identification, molecular cloning, expression and chromosomal mapping of a family of transformation upregulated hnRNP K proteins derived by alternative splicing. J. Mol. Biol. 236, 33-48.

25. Didier, D., Schiffenbauer, J., Woulfe, S., Zacheis, M. and Schwartz, B. D. (1988). Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibility complex class II Ybox. Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 7322-7326.

26. Dreyfuss, G., Matunis, M. J., Pinol-Roma, S. and Burd. C. G. (1993). hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA. Annu. Rev. Biochem. 62, 289-321.

27. Forne, T. (1995). Disruption of base-paired U4-U6 small nuclear RNAs induced by mammalian heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J. Biol. Chem. 270, 16476-16481.

28. Funke, B., Zuleger, B., Benavente, R., Schuster, T., Goller, M., Stevenin, J., Horak., 1.(1996) The mouse poly(C)-binding protein exists in multiple isoforms and interacts with several RNA-binding proteins. Nucleic Acids Res. 24, 3821-3828.

29. Ghetti, A., Pinol-Roma, S., Michael, W.M., Morandi, C. and Dreyfuss, G. (1992). HnRNP I, the polypyrimidine tract-binding protein: distinct nuclear localization and association with hnRNAs. Nucleic Acids Res., 20, 3671-3678.

30. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. (1994). The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J. Biol. Chem. 269. 23074-23078.

31. Gorlach, M., Wittekind, R.A., Beckman, L., Mueller, L. and Dreyfuss, G. (1992) Interactions of the RNA-binding domain of the hnRNP C proteins with RNA. EMBO J. 11, 3289-3295.

32. Grisolfi, L., Joseph, G., Amalric, F. and Erard, M. (1992). The glycine-rich domain of nucleolin has an unusual supersecondary structure responsible for its RNA-helix-destabilizing properties. J. Biol. Chern. 267, 2955-2959.

33. Goldstein, J., Poll it, S. and Inouye, M. (1990). Major cold shock protein of Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87. 283-287.

34. Hastie, N. D. (1994). The genetics of Wilm's tumour - a case of disrupted development. Ann. Rev. Genet. 28. 523-558.

35. Hayes, J. J. and Tullius, T. D. (1992). Structure of the TFIIIA-5S DNA complex. J. Mol. Biol. 111. 407-417.

36. Herschlag, D., Khasle, M. Tsuchlhashi, Z. and Karpel, R.L. (1994). An RNA chaperone activity of non-specific RNA binding proteins in hammerhead ribozyme catalysis. EM BO J. 13, 2913-2924

37. Huang, M. (1994). The C-protein tetramer binds 230-240 nucleotides of pre-mRNA and nucleates the assembly of 40S heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particles. Mol. Cell. Biol. 14, 518-533.

38. Idriss, HL, Kumar, A., Casas-Finet, J.R., Guo, H., Damuni, Z. and Wilson, S.H. (1994). Regulation of in vitro nucleic acid strand annealing activity of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein protein AI by reversible phosphorylation. Biochem. 33, 11382-11390.

39. Kamrna, H., Portman, D.S. and Dreyfuss, G. (1995). Cell type-specific expression of hnRNP proteins. Exp. Cell Res. 221, 187-196.

40. Kiledjian, M. and Dreyfuss, G. (1992). Primary structure and binding activity of the hnRNP U protein: binding RNA through RGG box. EMBO J. 11, 2655-2664.

41. Kiledjian, M., Xiaoming, W., Liebhaber, A. (1995) Identification of two KH-domain proteins in the ct-globin mRNA stability complex. EMBO J. 14, 4357-4364.

42. Kozac, M. (1989) The scanning model for translation: an update. J. Cell Biol. 108, 229-241.

43. Kumar, A. (1990). Mammalian heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al. Nucleic acid binding properties of the COOH-terminal domain. J. Biol. Chem. 265,17094-17100.

44. Kumar, A. and Wilson, S.H. (1990). Studies of the strand-annealing activity of mammalian hnRNP complex protein Al. Biochem. 29, 10717-10722.

45. Ladomery, M. (1997) Multifunctional proteins suggest connections between transcriptional and post-transcriptional processes. BioEssays 19, 903-909.

46. Lamond, A. I. (1995). Wilm's tumour - the splicing connection? Curr. Biol. 5, 862-865.

47. Larsson, S. H. (1995). Subnuclear localization of WTI in splicing or ascription factor domains is regulated by alternative splicing. Cell 81, 391- 401.

48. Lee, M.-H., Mori, S. and Raychaudhuri, P. (1996). Trans-activation by the hnRNP K protein involves an increase in RNA synthesis from the reporter genes. J. Biol. Chem. 271, 3420-3427.

49. Leser, G.P. and Martin, T. E. (1987). Changes in heterogeneous nuclear RNP core polypeptide complements during the cell cycle. J. Cell Biol. 105, 2083-2094.

50. Liu, Q. and Dreyfuss, G. (1995). In vivo and in vitro arginine methylation of RNA binding proteins. Moi Cell. Biol. 15, 2800-2808.

51. Liu, X. and Mertz, J.E. (1995). hnRNP L binds a cis-acting RNA sequence element that enables intron-independent gene expression. Genes Dev. 9, 1776- 1780.

52. Loukianov, E., Loukianova, T., Periasamy, M. (1997) Cloning of DNA fragments between two adjacent/overlapping restriction sites using a "positive stuffer". Biotechniques 22: 912-915.

53. Лукьянова, Т. И., Киселев, С. Л., Гнучев, Н. В. (1999) Структурно-функциональный анализ белка СВР1 человека, родственного белкам аппарата сплайсинга группы К. Доклады академии наук, принята в печать.

54. Ma, К. (1993). A Y chromosome gene family with RNA-binding protein homology: candidates for azoospermia factor AZF controlling human spermatogenesis. Cell 15, 1287-1295.

55. Matunis, M.J., Xing, J. and Dreyfuss, G. (1994). The hnRNP F protein: unique primary structure, nucleic acid-binding properties and subcellular localization. Nucleic Acids Res. 22, 1059-1067.

56. Matunis, E.L., Matunis, M.J. and Dreyfuss, G. (1993). Association of individual hnRNP proteins and snRNPs with nascent transcripts. J. Cell Biol. 121. 219-228.

57. Matunis, E.L., Matunis, M.J. and Dreyfuss, G. (1992). Characterization of the major hnRNP proteins from Drosophila melanogaster. ,/. Cell Biol. 116, 257-269.

58. Matunis, M. J., Michael, W. M. and Dreyfuss, G. (1992). Characterization and primary structure of the poly(C)-binding heterogenous nuclear ribonucleoprotein complex K protein. Moi Cell. Biol. 12, 164-171.

59. Mayeda, A., Munroe, S.H., Caceres, J.F. and Krainer, A.R. (1994). Function of conserved domains of hnRNP A1 and other hnRNP A/B proteins. EMBO J. 13, 5483-5495.

60. Mayeda, A.K., Helfman, D.M. and Krainer, A.R. (1993). Modulation of exon skipping and inclusion by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 and pre-mRNA splicing factor SF2/ASF. Mol. Cell. Biol. 13, 2993-3001.

61. Mayrand, S.H. and Pederson, T. (1990). Cross-linking of hnRNP proteins to pre-mRNA requires U1 and U2 snRNPs. Nucleic Acids Res. 18, 3307-3318.

62. Mehlin, H., Daneholt, B. and Skoglund, U. (1995). Structural interaction between the nuclear pore complex and a specific translocating RNA particle. J.Cell. Biol. 129, 1205-1216.

63. Merrill B.M., Stone, K.L., Cobianchi, F., Wilson, S.M. and Williams, K.R. (1988). Phenylalanines that are conserved among several RNA-binding proteins form part of a nucleic-acid binding pocket in the Al heterogeneous nuclear ribonucleoprotein. J. Biol. Chem. 263, 3307-3313.

64. Michael, W.M., Choi, M. and Dreyfuss, G. (1995). A nuclear export signal in hnRNP Al: a signal mediated, temperature-dependent nuclear protein export pathway. Cell 83, 415-422.

65. Michelotti, E.F., Tornonaga, K., Krutzsch, H. and Levens, D. (1995). Cellular nucleic acids binding protein regulates the CT-element of the human c-myc proto-oncogene. Biol. Chem. 270, 9494-9499.

66. Michelotti, G. A., Michelotti, E. F., Pullner, A., Duncan, R. C., Eick, D. and Levens, D. (1997). Multiple single-stranded cis-elements are associated with activated chromatin of the human c-myc gene in vivo. Mol. Cell. Biol. 16. 2656- 2669.

67. Michelotti, E. F., Michelotti, G. A., Aronsohn, A. I. and Levens, D. (1996). Heterogenous nuclear ribonucleoprotein K is a transcription factor. Mol. Cell. Biol. 18, 2350-2360.

68. Min, H., Chan, R.C. and Black, D.L. (1995). The generally expressed hnRNP F is involved in a neuronal-specific pre-mRNA splicing event. Genes Dev. 9, 26592671.

69. Municio, M.M., Lozano, J., Sanchez, P., Moscat, J. and Diaz-Meco, M.T. (1995) Identification of heterogeneous ribonucleoprotein A1 as a novel substrate for protein kinase C zeta. J. Biol. Chem. 270, 15884-15891.

70. Mueller-Pillasch, F., Lacher, U., Wallrapp, C., Micha, A., Zimmerhack, F., Hameister, H., Varga, G., Friess, H., Buchler, M., Beger, H. G., Vila, M., Adler, G.,Gress, T. (1997) Cloning of a gene highly overexpressed in cancer coding for a novel KH-domain containing protein. Oncogene 14, 2729 -2733.

71. Munroe, S.H. and Dong, X.F. (1992). Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 catalyzes RNA-RNA annealing. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89, 895-899.

72. Nagai, K., Oubridge, C., Jessen, T.M., Li, J. and Evans, P.R. (1990). Crystal structure of the RNA-binding domain of the U1 small nuclear ribonucleoprotein A. Nature 346, 515-520.

73. Pandolfo, M., Valentini, O., Biamonti G„ Rossi, P. and Riva, S. (1987). Large-scale purification of hnRNP proteins from HeLa cells by affinity chromatography on ss-DNA cellulose. Eur. J. Biochem. 162, 213-220.

74. Pieler and Theunissen, 0. (1993).TFIIIA: nine fingers - three hands? Trends Biochem. Sci. 18, 226-230.

75. Pinol-Roma, S. and Dreyfuss, G. (1993). Cell-cycle regulated phosphorylation of the pre-mRNA binding (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) C proteins. Mol. Cell Biol. 13, 5762-5770.

76. Pinol-Roma, S. and Dreyfuss, G. (1991). Transcription-dependent and transcription-independent nuclear transport of hnRNP proteins. Science 253, 312314.

77. Pinol-Roma, S. and Dreyfuss, G. (1992). Shuttling of pre-mRNA binding proteins between nucleus and cytoplasm. Nature 355, 730-732.

78. Pinol-Roma, S., Choi, Y.D., Matunis, M. J. and Dreyfuss G. (1988). Immunopurification of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particles reveals an assortment of RNA-binding proteins. Genes Dev. 2, 215-227.

79. Pontius, B.W. and Berg, P. (1990). Renaturation of complementary DNA strands mediated by purified mammalian heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al: implications for a mechanism for rapid molecular assembly. Pros. Natl Acad. Sei. USA 87, 8403-8407.

80. Portman, D.S. and Dreyfuss, G. (1994). RNA annealing activities in HeLa nuclei. EMBO J. 13, 213-221.

81. Reddy, J. C. and Licht, J. D. (1996). The WT1 Wilm's tumour suppressor gene -how much do we really know. Biochim. Biophys. Acta 1287, 1-28.

82. Samarina. 0. P. (1996). hnRNP particles. BioEssays 18. 595-601.

83. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual. 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ann Arbor, MI.

84. Shastry, B. S. (1996). Transcription factor IIIA (TFmA) in the 2-nd decade. J. Cell Sci. 109. 535-539.

85. Singh, R., Valcarcel, J. and Green, M.R. (1995). Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science 268,1173-1176.

86. Siomi, H., Matunis, M.J., Micheal, W.M. and Dreyfuss, G. (1993a). The pre-mRNA binding K protein contains a novel evolutionary conserved motif. Nucleic Acids Res. 21, 1193-1198.

87. Siomi, H., Siami, M.C., Nussbaurn R.L. and Dreyfuss, G. (I 993b). The protein product of the fragile X gene, FMR 1, has characteristic of an RNA binding protein. Cell 74, 291-298.

88. Siomi, H. and Dreyfuss, G. (1995). A nuclear localization domain in the hnRNP AI protein. J. Cell Biol. 129, 551-560.

89. Siomi, H., Choi, ml, Siomi, M.C., Nussbaum, R.l. and Dreyfuss, G. (1994). Essential role for KH domains in RNA binding: impaired RNA binding by a mutation in the KH domain of FMR1 that causes fragile X syndrome. Cell 77, 33-39.

90. Swanson, M.S. (1995). Functions of nuclear pre-rnRNWmRNA binding proteins. In Pre-rnRNA Processing (ed. A.I. Lamond), pp. 17-33. Landes Co. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg.

91. Steinmetz, E. J. (1997). Pre-mRNA processing and the CTD of RNA polymerase II: the tail that wags the dog? Cell 89, 491-494.

92. Sommerville. J. and Ladomery, M. (1996). Transcription and masking of messenger RNA in germ cells - involvement of Y-box proteins. Chromosoma 104, 469-478.

93. Soulard, M. (1993). HnRNP G: sequence and characterization of a glycosylated RNA-binding protein. Nucleic Acids Res. 21, 4210-4217.

94. Swanson, M.S. and Dreyfuss, G. (1988). RNA binding specificity of hnRNP proteins: a subset binds to the 3'-end of introns. EMBO. J. 7, 3519-3529.

95. Takimoto, M. (1993). Specific binding of heterogenous ribonucleoprotein particle protein K to the human c-myc promoter in vitro. J. Biol. Chem. 268, 18249-18258.

96. Ting, j. P.-Y. (1994). YB-1 DNA-binding protein represses interteron -y activation of class II major histocompatibility complex genes. J. Exp. Med. 179, 16051611.

97. Tomonaga, T. and Levens, D. (1995). Heterogenous nuclear ribonucleoprotein k is a DNA-binding transactivator. J. Biol. Chem. 270. 4875- 4881.

98. Visa, n. (1996) A pre-mRNA-binding protein accompanies the RNA from the gene through the nuclear pore and into the polysomes. Cell 84, 253-264.

99. Wansink, D., van Driel, R. and de Jong, L. (1994). Organization of pre-mRNA metabolism in the cell nucleus. Mol. Biol. Reports 20, 45-55.

100. Weighardt, F., Biamonti, G. and Riva, S. (1995). Nucleo-cytoplasmic distribution of human hnRNP proteins: a search for the targeting domains in hnRNP Al. J. Cell Sci. 108, 545-555.

101. Weighardt, F., Biamonti, G., Riva S. (1996) The roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) in RNA metabolism. Bio Essays 18, 747-756.

102. Wen, W., Meinkoth, J.L., Tsien, R.Y. and Taylor, S.S. (I 995). Identification of a signal for rapid export of proteins from the nucleus. Cell, 82, 463-473.

103. Wilk, H.E., Werr, H., Friedrich, D., Kiltz, H.H. and Schaefer, K.P. (1985). The core proteins of 35 S hnRNP complexes: characterisation of nine different species. Eur. J.Biochem. 146, 71-81.

104. Wilson, S.M., Datar, K.V., Paddy, M.R., Swediow, J.R. and Swanson, M.S. (1994). Characterization of nuclear polyadenylated RNA binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 127,1173-1184.

105. Wittekind, M., Gorlach, M., Friedrichs, M. and Dreyfuss, G. (1992). lH, 13C and ,5N NMR assignments and global folding pattern of the RNA-binding domain of the human hnRNP C proteins. Biochem. 31, 6254-6265.

106. Yang, X. M., Bani, M. R., Lu, S. J., Rowan, S., Bendavid, Y. and Chabot, B. (1994). The Aland Al (B) proteins of heterogenous nuclear ribonucleoparticles modulate 5'- splite-site selection in vivo. Proc. Nati Acad. Sci. USA 91, 6924-6928.

107. Yang, X., Bani, M.R., Lu, S.J., Rowan, S., Ben-David, Y. and Chabot, B. (1994). The Al and A1(B) proteins of heterogeneous nuclear ribonucleoparticles modulate 5' splice site selection in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 6924-6928.

108. Yuryev. A. (1996). The C-terminal domain of the largest subunit of RNA polymerase II interacts with a novel set of serine/arginine-rich proteins. Proc. Natl Acad Sci. USA 93, 6975-6980.

109. Zahler, A.M., Neugebauer, K.M., Stolk, J.A. and Roth, M. B. (1993). Distinct functions of SR proteins in alternative pre-mRNA splicing. Science 260, 219-222.

110. Zhou, J. (1996) Purification and characterization of a protein that permits early detection of lung cancer. J. Biol. Chem. 271, 10760-10766.

Автор благодарит Г. П. Георгиева, Н. В. Гнучева и С. JI. Киселева за постоянное внимание к работе и научное руководство, а также всех сотрудников лаборатории молекулярной генетики рака за помощь и советы, а также за атмосферу дружбы и взаимопонимания, в которой автору было очень приятно работать. Особенно хотелось бы отметить неоценимую помощь А. Кибардина и С Ларина в оформлении иллюстраций работы.

Автор также благодарит коллег из Institute for Cancer Research at the Norwegian Radium Hospital (Осло, Норвегия) Drs. E. Smeland, S. Funderud, H.-C. Aasheim и A. Deggerdal за помощь в выполнении ряда экспериментов и опубликовании части данной работы.