Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Латышев, Олег Евгеньевич

• Латышев, Олег Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Латышев, Олег Евгеньевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общая характеристика Р-адреностимуляторов.

2.2. Метаболизм кленбутерола.

2.3. Методы определения Р-адреностимуляторов.

2.4. Скрининг-методы.

2.5. Иммуноферментный анализ.

2.5.1. Гетерогенный иммуноферментный анализ.

2.5.2. Получение иммобилизованных антигенов и антител.

2.5.2.1. Носители, применяемые в ИФА.

2.5.2.2. Иммобилизация антигенов.

2.5.3. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Используемые реактивы и материалы.

3.2. Методы исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Получение конъюгатов кленбутерола с белками.

4.2. Получение специфических иммунных сывороток.

4.3. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА.

4.3.1. Определение активности и специфичности иммунных сывороток

4.3.2. Выбор конъюгата в качестве твердофазного антигена для сенсибилизации иммунологического планшета.

4.3.3. Выбор оптимальной концентрации твердофазного антигена.

4.3.4. Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшетов твердофазными антигенами.

4.3.5. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА.

4.3.6. Выбор оптимальных условий инкубации антител с твердофазным антигеном в НТК ИФА.

4.3.7. Проверка чувствительности реакции НТК ИФА для определения кленбутерола.

4.3.8. Определение специфичности тест-системы.

4.4. Разработка способов подготовки биологического материала для определения кленбутерола методом ИФА.

4.4.1. Подготовка образцов мышечной ткани и печени.

4.4.2. Подготовка образцов шерсти.

4.4.3. Извлечение кленбутерола из сетчатой оболочки глаза.

4.4.4. Извлечение кленбутерола из корма.

4.4.5. Подготовка образцов мочи.

4.4.6. Определение оптимального разведения экстрактов.

4.4.7. Определение предела обнаружения.

4.4.8. Комиссионные испытания.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах»

З-адреностимуляторы - группа синтетических фармакологических препаратов, структурных аналогов катехоламинов, которые применяются в качестве стимуляторов роста продуктивных животных, так как обладают сильным антикатаболическим и жиросжигающим действием. Это приводит к увеличению мышечной массы животного, уменьшению количества жировой ткани вследствие ингибирования липогенеза, и, как следствие, получению постного мяса, пользующегося большим спросом на потребительском рынке. Такое действие этих препаратов обуславливает их широкое использование в промышленном животноводстве в качестве стимуляторов роста продуктивных сельскохозяйственных животных. Наиболее широко применяемым препаратом этой группы является кленбутерол (КБ) [3, 7].

Помимо фармакологического эффекта эти вещества обладают и токсическим действием, поэтому, потребление людьми в пищу мяса и субпродуктов животных, получавших такие препараты с кормом для стимуляции роста, может вызвать отравление, проявляющееся в таких клинических признаках, как нарушение сердечного ритма, мышечный тремор, гипокалиемия, тахифилаксия, головные боли, мышечные спазмы, повышение артериального давления. Особенно опасно потребление таких продуктов людьми с заболеваниями сердца и сердечно-сосудистой системы. В различных странах зафиксированы массовые случаи отравления людей при потреблении мяса и говяжьей печени, содержащей остаточные количества этих препаратов[45,46].

В России опубликованы результаты исследований, в которых рекомендуется применять КБ в качестве стимулятора роста при выращивании крупного рогатого скота. При этом риск воздействий остаточного содержания

КБ в продукции животноводства на здоровье потребителей не оценивался [1,2,

3].

Использование Р-адреностимуляторов в качестве стимуляторов роста для повышения продуктивности животных запрещено в Российской Федерации и странах Европейского союза (35, 36). Этот запрет связан с риском негативного воздействия остаточного содержания этих препаратов в продукции животноводства на здоровье потребителей [105].

Негативные воздействия остаточного содержания Р-адреностимуляторов в продукции животноводства на здоровье людей, особенно кленбутерола -наиболее опасного препарата этой группы, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга за их использованием. Такой мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования экспрессных иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.

Для обеспечения выполнения работ по мониторингу необходимо создание чувствительной и специфичной тест-системы для быстрого определения КБ и других препаратов этой группы в биологических образцах. Наиболее перспективным является использование иммунохимических методов для скрининга препаратов этой группы, поскольку такие методы обладают высокой чувствительностью, простотой проведения анализа, низкой себестоимостью, и позволяют проводить анализ большого количества образцов за короткий промежуток времени [37, 40, 84, 16].

Цель и задачи исследований

Целью нашей работы являлось создание чувствительной и специфичной тест-системы для контроля за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животноводства экспресс-методом ИФА.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.Получить иммунореагенты: конъюгаты КБ с высокомолекулярными белками-носителями и специфические антитела для определения КБ иммунохимическим методом.

2.11а основе полученных иммунореагентов оптимизировать условия проведения процедуры непрямого твердофазного конкурентного ИФА (НТК ИФЛ) для определения КБ в биологическом материале. Определить чувствительность и специфичность метода.

3.Разработать простые и эффективные способы подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.

4.0сновываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных обосновать выбор биосубстратов для контроля за применением КБ на стадии выращивания животных, а также определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения.

5.Провести комиссионные испытания разработанной тест-системы.

6.Разработать нормативную документацию и зарегистрировать в РФ тест-систему для определения КБ в кормах и биологических субстратах методом ИФА.

Научная новизна работы

Впервые в Российской Федерации получены высокоспецифичные иммунореагенты - конъюгаты КБ с белками-нисителями и специфические антитела.

На основе полученных иммунореагентов создана чувствительная и специфичная тест-система, для обнаружения КБ в биологических субстратах на основе НТК ИФА.

Разработаны простые и экономичные методы экстракции КБ из кормов, биологических жидкостей, органов и тканей животных, позволяющие не применять дополнительную очистку экстрактов методом твердофазной экстракции (ТФЭ) и обеспечивающие высокую чувствительность определения КБ методом ИФЛ.

Основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за применением КБ в животноводстве.

Практическая значимость работы

Впервые в Российской Федерации создана тест-система для определения КБ в кормах, биологических жидкостях, органах и тканях животных методом НТК ИФЛ.

Тест-система позволяет определять не только кленбутерол, но и адреностимуляторы фенольного (сальбутамол ) и резорцинового (тербуталин) тина.

На тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система зарегистрирована в РФ и налажено серийное производство наборов для выявления КБ в биологических образцах методом ИФА.

Тест-система может быть использована для мониторинга за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на:

1. 11-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003).

2. 11 -ом съезде «Общества биотехнологов России» (Москва, 2004).

3. 3-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).

4. XIV Всероссийского ветеринарного конгресса (Москва, 2006).

5. Международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Получение специфических иммунореагентов и подбор, на их основе, оптимальных условий проведения НТК ИФА для определения КБ.

2. Разработка простых и эффективных способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.

3. Результаты комиссионных испытаний разработанной тест-системы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в различных изданиях с изложением основных положений и выводов диссертационной работы, в том числе в ведущих научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературных источников и приложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 117 источников, в том числе 109 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Латышев, Олег Евгеньевич

6. ВЫВОДЫ

1. Впервые в РФ были получены высокоспецифичные иммунореагенты, обеспечивающие высокую чувствительность определения кленбутерола (0,01 нг/мл) в биосубстратах методом непрямого твердофазного конкурентного ИФА. Чувствительность определения кленбутерола с помощью разработанной тест-системы существенно превышает показатели зарубежных аналогов. Тест-система позволяет, наряду с Р-адреностимуляторами анилинового типа (кленбутерол), определять препараты фенольного (сальбутамол) и резорцинового (тербуталин) типа.

2. Па основе полученных иммунореагентов были оптимизированы условия проведения процедуры непрямого твердофазного конкурентного ИФА для определения кленбутерола в биосубстратах: подобрана структура и концентрация твердофазного антигена (Ж-КБ, 0,05 мкг/мл), время и температура сорбции его на полистироле (18 часов при 4°С) и инкубации антител (1 час при 37°С).

3. Разработаны эффективные и экономичные способы экстракции кленбутерола из биосубстратов на основе жидкостной экстракции водой, неорганическими кислотами и органическим растворителями, без использования метода твердофазной экстракции для дополнительной очистки проб. Эффективность разработанных способов экстракции кленбутерола подтверждена путём анализа международных аттестованных стандартных образцов, а так же биологических жидкостей, органов и тканей экспериментальных животных, получавших кленбутерол.

4. Определены пределы обнаружения кленбутерола методом НТК ИФА в мышечной ткани, печени, сетчатке, моче (0,09 мкг/кг(л)), шерсти (0,8 мкг/кг) и кормах (1,0 мкг/кг).

5. Исходя из полученных данных по фармакокинетике кленбутерола в организме сельскохозяйственных и лабораторных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за его применением на стадии выращивания животных (шерсть, моча), и в продукции животноводства (глазное яблоко, печень).

6. Высокая эффективность разработанной тест-системы для определения кленбутерола в биосубстратах, кормах и продукции животноводства методом иммуноферментного анализа подтверждена в условиях комиссионных испытаний.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и внедрена в практику тест-система для экспрессного определения кленбутерола в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа. Тест-система успешно прошла комиссионные испытания, организованно и налажено её серийное производство в РФ. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на опытную партию на тест-систему «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» (ТУ 9398-001-00494189-2004).

2. Временное наставление по применению тест - системы «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» для количественного определения кленбутерола методом иммуноферментного анализа, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 07.05.2004г., № 13-5-02/1060.

3. Технические условия на тест-систему «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» (ТУ 9398-030-11361534-2005).

4. Инструкция по применению тест - системы «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01471).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Латышев, Олег Евгеньевич, 2006 год

1. Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Нго и Г.Ленхоффа / Пер. с англ. -М.: Мир, 1988.-446 с.

2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д Машковский. 14-е изд. Т. 1. - М.: ООО «Издательство Новая Волна», 2001. - С.230-243.

3. Рактопамин: Оценка остаточных количеств некоторых ветеринарных препаратов в пище / Сороковой доклад Объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ ио пищевым добавкам. Серия технических докладов ВОЗ. 1994. № 832. - С.56-68.

4. Тагиров, Н.С. Гормональный статус у бычков в переходный период выращивания и при применении кленбутерола: Автореф. дис. Канд.биол.наук: 03.00.13 / Н.С.Тагиров; Боровск. ВНИИ физиологии, биох. и пит. с-х жив-ых. Боровск, 1994. - 25 с.

5. Теория и практика иммуноферментного анализа / В.Т. Егоров, А.П Осипов, Б.Б Дзантиев, Е.М Гаврилова. М.: Высш. Шк., 1991.

6. Тернон М. Новые методы иммуноанализа / Тернон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. // Пер. с англ.; Под ред. А.М.Егорова. М.: Мир, 1991. - 280 с.

7. Указание Главного государственного ветеринарного инспектора по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения № 13-7-1/900 от 04.10.99г.

8. Adam, A. Detection of clenbuterol residues in hair / Adam A., Gervais N., Panoyan A. // The Analyst. 1994. - Vol.119. - P.2663-2666.

9. Ansari, A.A. ELISA solid phase: stability and binding characteristics / Ansari A.A., Ilattikudur N.S., Joshi S.R., Medeira M.A. // J. Immunol. Meth. 1985. -Vol.84.-P. 117-124.

10. Avrameas, S. Enzyme Immunoassays and related techniques: Development and limitations / Immunochemistry. 1969. - V.6 - P.43-52.

11. Baker, P.K. Phenylethanolamine derivatives and acid addition salts thereof for enhancing the growth rater of meat-producing animals and improving the efficiency of feed utilization thereby / Baker P.K., Kiernan J.A. // U.S. Patent 4,404,222. -1983.

12. Bosh, A.M.G. Specificity, sensitivity and reproductibility of enzyme immunoassays. In: Enzyme labeled immunoassay of hormones and drugs / Bosh A.M.G., Van Hell H., Brands J. et al // S.B.Pal, ed., Water de Gruyter. Berlin. -1978. - P. 175-187.

13. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion linked to solid phase extraction for beta agonists in liver samples: An update / Boyd D., O'Keeffe M., Smyth M.R. // Analytical Proceedings. 1995. - Vol.32. - P.301-303.

14. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion linked to immunoassay techniques for the determination of clenbuterol in bovine liver samples / Boyd D., Shearan P., IIopkins J.P. et al. // Anal. Proc. 1993. - Vol.30. - P. 156-157.

15. Boyd, D. Application of matrix solid-phase dispersion for the determination of clenbuterol in liver samples / Boyd D., Shearan P., Hopkins J.P. et.al. // Analytics Chimica Acta. 1993. - Vol.275. - P.221-226.

16. Boyd, D. Methods for the determination of p-agonists in biological matrices / Boyd D, O'Keeffe M., Smyth M.R. // The Analyst. 1996. - Vol.121. - P.1R-10R.

17. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion (MSPD) as a multiresidue extraction technique for P-agonists in bovine liver tissue / Boyd D., O'Keeffe M., Smyth M.R. // Analyst. 1994. - Vol. 119. - P. 1467-1470.

18. Cantarero, L.A. The adsorptive characteristics of protein for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays / Cantarero L.A., Butler J.E., Osborne J. W. // Anal.Biochem. 1980. - Vol. 105. - P.375-382.

19. Collins, S. Multi-residue analysis for P-agonists in urine and liver samples using mixed phase columns with determination by radioimmunoassay / Collins S., O'Keeffe M., Smyth M.R. // The Analyst. 1994. - Vol.119. -P.2671-2674.

20. Courtheyn, D. Multiresidue enzyme immunoassays for screening beta-agonists in faeces and feeds / Courtheyn D., Bakeroot V., de Voider F. et al. // Food Agric. Immunol. 1994. - Vol.6. - P. 131 -139.

21. Cristino, A. Control of the illegal use of clenbuterol in bovine production / Cristino A., Ramos F., da Silveira M.I.N. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. - Vol.32. - P.311 -316.

22. Degand, G. Determination of clenbuterol in bovine tissues and urine by enzyme immunoassay / Degand G., Bemes-Duyckaerts A., Maghuin-Rogister G. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. - Vol.40. - P.70.

23. Dcgroodt, J.M. Immunoaffinity chromatography purification of salbutamol in liver and HPLC-fluorometric detection atrace residue level / Degroodt J.M., Wyhowski-de-Bukanski B., Srebrnik S. // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1992. -Vol.195.-P.566-568.

24. Delahaut, Ph. Development of a specific radioimmunoassay for the detection of clcnbuterol residues in treated cattle / Delahaut Ph., Dubois M., Pri-Bar I. et al. // Food Additives and Contaminants. 1991. - Vol.8. - P.43-53.

25. Detection of clenbuterol residues in bovine liver, muscle, retina and urine using gas chromatography/mass spectrometry / Blanchflower W.J., Hewit S.A., Cannavan A., et al. // Biol. Mass Spectrom. 1993. - Vol.22. - P.326-330.

26. Determination of beta agonists in tissue / Canadian Food Inspection Agency. Centre for Veterinary Drug Residues. Health of Animals Laboratory. 2000. -Version BAGS-SP01. - 13p.

27. Dutch consumer orgahisation, Consumentengids, February. 1995. - P. 104107.

28. Dutch consumer organisation, Consumentengids, June. 1993. - P.348-352.

29. Elliott, C.T. Observations on the effects of long-term withdrawal on carcass composition and residue concentrations in clenbuterol-medicated cattle / Elliott C.T., Crooks S.R.H., McEvoy J.D.G. et al. // Vet. Res. Commun. 1993. - Vol.17. -P.459-468.

30. Elliott, C.T. Effective laboratory monitoring for the abuse of the beta-agonist clenbuterol in cattle / Elliott C.T., Mc Evoy J.D.G., McCaughey W.J. and Shortt II.D. // The Analyst. 1993. - Vol.118. - P.447-448.

31. Elliott, C.T. Improved detection of the P-agonists clenbuterol by analysis of retina extracts / Elliott C.T., McEvoy J.D.G., McCaughey W.J., Crooks S.R.H. and I lewitt S.A. // Veterinary record. 1993. - Vol. 132. - P.301 -392.

32. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitatie assay for immunoglobulin G / Engvall E., Perlmann P. // Immunochem. 1971. - Vol.8 -P.871-874.

33. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA.III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-linked antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes / Engvall E., Perlmann P. // J. Immunol. 1972. - Vol. 109. - P. 129-135.

34. Food poisoning following consumption of clenbuterol-treated veal in Italy / Brambilla G., Loizzo A., Fontana M. et al. // Journal American Med. Assoc. 1997. - Vol.278.-P.635.

35. Gaillard, Y. Detection of illegal clenbuterol use in calves using hair analysis / Gaillard Y., Balland A., Doucet F. et al // Application in meat quality control. Journal of Chromatography B. 1997. - Vol.703. - P.85-95.

36. Gleixner, A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen / Gleixner A., Sauerwein H., and Meyer H.H.D. // Archiv fUr Lebensmittelhygiene. 1996. - Vol.47. - P. 131 -135.

37. Haasnoot, W. A fast immunoassay for the screening of p-agonists in hair / I Iaasnoot W., Stouten P., Schilt R. et al // Analyst. 1998. - Vol. 123. - P.2707-2710.

38. Haasnoot, W. Fast clenbuterol residue analysis in urine by HPLC with on-line automated sample processing using immunoaffinity chromatography / Haasnoot W., Ploum M.E., Paulussen R.J. A et al. // Journal of Chromatography. 1990. - Vol.519. -P.323.

39. Hahnau, S. Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and other P-agonists / Hahnau S., Julicher B. // Food additives and contaminants. 1996. - Vol.13. - P.259-274.

40. Harry, J. Mersmann. Overview of the effects of p-adrenergic receptor agonists on animal growth including mechanisms of action / American Society of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P. 160-172.

41. Hawkins, D.R. The disposition of the combination product 14C-NAB 365 CL/trimethoprim/suIphadiazine in dairy cows / Hawkins D.R., Elsom L.F., de-Salis

42. C.M. et al // Unpublished report No. HRC/BOI 111/84680A from Huntingdon Research Centre. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1985.

43. Hernandez-Carrasquilla, M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of ß-agonists compounds in bovine hair: evaluation of hair extraction procedures // Analytica Chimica Acta. 2001. - Vol.434. - P.59-66.

44. Hernandez-Carrasquilla, M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of ß2-agonists in bovine retina // Analytica Chimica Acta. 2000. - Vol.408. -P.285-290.

45. Hernandez-Carrasquilla, M. External contamination of bovine hair with ß2-agonists compounds: evaluation of decontamination strategies // Journal of Chromatography. 2002. - Vol.767. - P.325-243.

46. Howard, C.B. The effect of surface charge on non-specific binding of rabbit immunoglobulin G in solid-phase immunoassays.// Journal of Immunological Methods 1988. - Vol. 111. - P. 157-166.

47. Intoxicación por Clenbuterol. Datos clinicos y analiticos en un brote en Mostoles / Bilbao-Garay J., Hoyo-Jimenez J.F., Lopez-Jimenez M. et.al. // Rev. Clin. Esp.- 1997.- Vol.197. -P.92-95.

48. Jimenez-Carmona, M.M. Ion-pair/supercritical fluid extraction of clenbuterol from samples / Jimenez-Carmona M.M., Tena M.T. // Journal of Chromatography. -1995.-Vol.711.-P.269-276.

49. Kopitar, Z. Pharmacokinetic investigations with 14C.-N-AB 365 CL in rats. / Unpublished report No. U69-0109. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1970.

50. Kopitar, Z. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol bei der Ratte / Kopitar Z., Zimmer A. // Arzneim. Forsch. Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P.1435-1441.

51. Kuiper, H.A. Illegal use of ß-adrenergic agonists / Kuiper H.A., Noordam M.Y., van Dooren-Flipsen M.M.H. et al. // European Community. Journal of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P. 195-207.

52. Meyer, H.H.D. The pharmacokinetics and residues of clenbuterol in veal calves / Meyer H.H.D., Rinke L.M. // Journal of Animal Science. 1991. - Vol.69. -P.4538-4544.

53. Mitchell, G.A. Illegal use of ß-adrenergic agonists in the United States / Mitchell G.A., Dunnavan G. // Journal of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P.208-211.

54. Monroe, D. Enzyme Immunoassay. / Anal. Chem. 1984. - Vol.56. - P.921A-931 A.

55. Morgan, D.J. Clinical pharmacokinetics of ß-agonists. Clin. Pharm. 1990. -Vol.18. -P.270-294.

56. O'Keeffe, M.J. Supercritical fluid extraction (SFE) as a multi-residue extraction procedure for P-agonists in bovine liver tissue / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. and Glennon J.D. // The Analyst. 1999. - Vol. 124. - P. 1355.

57. O'Keeffe, M.J Supercritical fluid extraction of veterinary drug residues from meat / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. // The National Food Centre. Research report No. 19. -Dublin.- 1999. 18p.

58. Ostrowski, J.M. Mutagenesis of the (32-adrenergic receptor: How structure elucidates function / Ostrowski J.M., Kjelsberg A., Caron M.G. and Lefkowitz R.J. / Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992. - Vol.32. - P. 167-183.

59. Polettini, A. Determination of p2-agonists in hair by gas chromatography/mass spectrometry / Polettini A., Montagna M., Segura J. // Journal Mass Spectrom. -1996.- Vol.31. -P.47-54.

60. Polettini, A. Clenbuterol and beta-adrcnergic drugs detected in hair of treated animal by ELISA / Polettini A., Segura J., Gonzalez G. et al. // Clin. Chem. 1995. -Vol.41.-P.945-946.

61. Rang, H.P Adrenergic transmission / Rang 11.P., Dale M.M. // Pharmacology, Churchill Livingstone. Edinburgh. - 1987. - P.6-176.

62. Rubenstein, K.E. «Homogeneous» enzyme immunoassay / Rubenstein K.E., Schneider R.S. et al // New Immunochemical technique, Biochem., Biophes. Res. Commun. 1972. - Vol.81. - P.846-851.

63. Ruffolo, R.R. Chirality in a- and 0- adrenoceptor agonists and antagonists // Tetrahedron. 1991. - Vol.47. - P.9953-9980.

64. Salbutamol radioimmunoassay: synthesis and properties of the benzylic succinate of salbutamol / Beaulieu N., Charette C., Loo J.C.K., et al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 1985. - Vol.3. - P.575-579.

65. Sauer, M.J. Determination of clenbuterol residues in bovine liver, urine and eye be enzyme immunoassay / Sauer M.J., Pickett R.J.H., MacKenzie A.L. // Anal. Chim. Acta. 1993. - Vol.275. - P. 195-203.

66. Schmid, J. Plasma levels and residue analysis in cows and calves / Unpublished report No. U90-0092. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1990.

67. Schmid, J. CL in the cows milk after oral and intramuscular administration / Unpublished report No. U90-0099. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1990.

68. Schmid, J. Biotransformation of clenbuterol / Schmid J., Prox A., Zimmer Z. et al. // Fresenius J. Anal. Chem. 1990. - Vol.337. - P. 121.

69. Screening and confirmatory method for the determination of 3-agonists in retina with GC-MSD. / EU Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs. -2000. Version 2. - 24p.

70. Shelver, W. Evaluation of commercial immunoassays for cross-reactivity to clenbuterol stereoisomers and bovine metabolites / Shelver W., Smith J.D. // Food Additives and Contaminants. 2000. - Vol.17. - P.837-845.

71. Shepherd, M.J. Analysis of Veterinary Drug Residues in Edible Animal Products / Shepherd M.J., C.S. Creaser and R. Purchase. / Food Contaminants. Sources and Surveillance, The Royal Society of Chemistry, Cambridge. 1991. -P. 176.

72. Simultaneous determination of Zilpaterol and other ^-agonists in calf eye by gas chromatography/tandem mass spectrometry / Bocca B., Fiori M., Cartoni C. et al. // Journal of AOAC International. 2003. - Vol.86. - P.8-14.

73. Smith, D.J. Distribution, Elimination, and Residues of 14C.Clenbuterol HCL in Holstein Calves / Smith D.J., and Paulson G.D. // Journal of Animal Science. -1997.- Vol.75. -P.454-461.

74. Stoffel, B. Effects of the (^-adrenergic agonist clenbuterol in cows: lipid metabolism, milk production, pharmacokinetics and residues / Stoffel B., Meyer H.H.D. // Journal of Animal Science. 1993. - Vol.71. - P. 1875-1881.

75. Urbanek, R. Use of the enzyme linked immunosorbent assay for measurement of specific antibodies / Urbanek R., Kemeny D.M., Samuel D. // J. Immunol. Meth. -1985.-Vol.79.-P. 123-131.

76. Van Ginkel, L.A. New Trends in Veal Calf Production / Van Ginkel L.A., Stephany R.W., van Rossum I I.J. // In: (by ed. J.II.M. Metz and C.M. Groenestein). EAAP publication. 1991. - Vol.52. - P. 192-197.

77. Sawaya, W. N. Screening for p-agonists in sheep urine and eyes by an enzyme-linked immunosorbent assay in the state of Kuwait / Sawaya W.N., Lone K., Husain A. // Food Control 2000. - Vol. 11. - P. 1 -5.

78. Wood, W.G. Polystyrene coated with poly(phenylalanine/lysine) and chemically activated with glutaraldehyde / Wood W.G., Gadow A. // J. Clin. Chem. Biochem. 1983. - Vol.21. - P.789-797.

79. Yalow, R.S. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods / Yalow R.S., Berson S.A. // Nature. 1959. - Vol. 184. - P. 1648-1649.

80. Yamamoto, I. Enzyme immunoassay for clenbuterol, a p2-adrenergic stimulant / Yamamoto I., Iwata K. //Journal of Immunoassay. 1982.-Vol.3 - P. 155-171.

81. Yang, Y.T. Multiple action of ^-adrenergic agonists on skeletal muscle and adipose tissue / Yang Y.T., McElligott M.A. // Biochem. J. 1989. - Vol.261. - P.l-10.

82. Zalko, D. Metabolic fate of clenbuterol in calves / Zalko D., Bories G. and Tulliez J. // Journal Agnc. Food Chemistry. 1998. - Vol.46. - P. 1935-1943.

83. Zalko, D. Proceedings of the EuroResidue III Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food / Zalko D., Debrauwer L. and Tulliez J. ( by ed. N. Haagsma and A. Ruiter). Veldhoven, The Netherlands. - 1996. - P.367-371.

84. Zalko, D. Comparative Metabolism of Clenbuterol by Rat and Bovine Liver Microsomes and Slices / Zalko D., Perdu-Durand E., Debrauwer L. et al. // Drug Metabolism and Disposition. 1998. - Vol.26. - P.28-35.

85. Zalko, D. Evidence for a New and Major Metabolic Pathway of Clenbuterol Involving in Vivo Formation of an N-IIydroxyarylamine / Zalko D., Debrauwer L., Bones G. and Tulliez J. // Chcm. Res. Toxicol. 1997. -Vol. 10. - P. 197-204.

86. Zimmer, A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen // Arzneim. Forsch./Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P. 1446-14550.

87. Zimmer, A. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Kaninchen und bein Hund // Arzneim. Forsch./Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P. 1442-1445.