Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Вылегжанина, Александра Владимировна

• Вылегжанина, Александра Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вылегжанина, Александра Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Стимуляторы роста.

2.2. Кортикостероиды.

2.3. Дексаметазон.

2.4. Фармакокинетика дексаметазона.

2.5. Фармакодинамика дексаметазона.

2.6. Определение приемлемой суточной дозы потребления ДМ.

2.7. Расчет максимально допустимого уровня остатков ДМ.

2.8. Период ожидания после применения ДМ.

2.9. Скрининг-методы.

2.10. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.11. Гетерогенный ИФА.

2.12. Принципы иммобилизации биомолекул.

2.13. Ферментативные метки в ИФА.

2.14. Выбор подходящего субстрата в ИФА.

2.16. Арбитражные методы.

2.17. Предел определения метода.

2.18. Получение иммуногенов и иммунореагентов.

2.19. Иммунная система млекопитающих.

2.20. Синтез АГ.

2.21. Количество АГ для иммунизаций.

2.22. Основные свойства адъювантов.

2.23. Выбор адъюванта.

2.24. Выбор животного для продукции поликлональных AT.

2.25. Пути введения и количество инъекций для первичной иммунизации.

2.26. Повторные поддерживающие иммунизации.

2.27. Программы иммунизаций.

2.28. Определение следов органических соединений.

2.29. Жидкостно-жидкостная экстракция.

2.30. Технология экстракции.

2.31. Методы экстракции дексаметазона.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Используемые реактивы и материалы.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Получение гаптена и конъюгатов дексаметазона с белками.

3.2.2. Получение специфических поликлональных сывороток.

3.2.3. Сенсибилизация лунок планшета.

3.2.4. Определение активности иммунных сывороток.

3.2.5. Определение специфичности и константы аффинности иммунных сывороток.

3.2.6. Определение специфичности тест-системы.

3.2.7. Определение концентрации белка по методу Лоури.

3.2.8. Экстракция ДМ из биологических субстратов.

3.2.8.1. Подготовка образцов мышечной ткани КРС.

3.2.8.2. Подготовка образцов мышечной ткани свиньи.

3.2.8.3. Подготовка образцов печени.

3.2.8.4. Подготовка образцов почек.

3.2.8.5. Подготовка образцов мочи.

3.2.8.6. Подготовка образцов корма.

3.2.8.7. Подготовка образцов молока.

3.2.9. Проведение ВЭЖХ-МС-МС анализа.

3.2.10. Определение концентрации ДМ в исследуемых образцах.

3.2.11. Определение эффективности экстракции ДМ из биологических субстратов.

3.2.12. Расчет метрологических характеристик НТК ИФА.

3.2.12.1. Расчет пределов обнаружения и определения ДМ в образцах.

3.2.12.2. Воспроизводимость результатов анализа.

3.2.12.3. Сходимость результатов анализа.

3.2.13. Обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Получение специфических иммунореагентов.

4.2. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА.

4.2.1. Получение специфических иммунных сывороток.

4.2.2. Определение активности иммунных сывороток в НТ ИФА.

4.2.3. Определение специфичности иммунных сывороток в НТК ИФА.

4.2.4. Определение констант аффинности AT в НТК ИФА.

4.2.5. Выбор ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета.

4.2.6. Выбор оптимальной концентрации ТФА.

4.2.7. Определение оптимального времени сенсибилизации и оптимальной температуры инкубации ТФА с полистиролом.

4.2.8. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА.

4.2.9. Определение оптимального времени и температуры инкубации ТФА с AT в НТК ИФА.

4.2.10. Определение чувствительности предлагаемого метода для определения ДМ.

4.2.11. Определение специфичности тест-ситемы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах»

Актуальность темы

Дексаметазон (ДМ) - синтетический глюкокортикоид, который широко используется в ветеринарии в качестве противовоспалительного средства [128, 137, 164]. ДМ применяется также в качестве стимулятора роста продуктивных животных [43, 48, 44, 150, 18, 39]. Остаточное содержание этого глюкокорти-коида в животноводческой продукции может оказывать эмбриотоксическое и генотоксическое действие на организм человека [168, 169, 140, 82]. В России и странах Европейского Союза введен запрет на использование гормональных стимуляторов роста, в том числе ДМ, в животноводстве [53; 9]. Терапевтическое применение ДМ регламентировано максимально допустимым уровнем (МДУ), установленным для этого гормона в продукции животного происхождения [36, 12].

В 2003-2005 годах в Европе были проведены мониторинговые исследования нелегального использования гормональных стимуляторов роста в животноводстве. По данным Европейской Комиссии ДМ является гормоном, остатки которого чаще всего обнаруживают в животноводческой продукции. В 2003 г. было зарегистрировано 130 случаев нелегального применения ДМ в Европе; в 2004 г. - 64 случая; в 2005 г. - 186 случаев [130].

Возможное негативное влияние ДМ на здоровье людей, а также частое обнаружение остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга его использования. Мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования быстрых иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.

Для обеспечения в Российской Федерации мониторинга использования ДМ в кормах и продукции животноводства необходимо создание чувствительного и специфичного экспресс-метода. Наиболее перспективным для этих целей является использование непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (НТК ИФА), обладающего следующими преимуществами: низкая стоимость, простота проведения анализа и возможность тестирования большого количества образцов за короткий промежуток времени [163].

Среди арбитражных методов, используемых для подтверждения остаточного содержания глюкокортикоидов в образцах, показавших положительный результат в ИФА, наиболее перспективным является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС-МС) [18, 148,20].

Цель и задачи исследований

Целью работы явилось создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе непрямого твердофазного конкурентного иммунофер-ментного анализа для экспрессного определения ДМ в биосубстратах. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

• синтезировать карбоксипроизводное ДМ и создать иммуноге-ны путем конъюгации его с белками;

• получить поликлональные кроличьи сыворотки на синтезированные иммуногены;

• провести скрининг полученных сывороток в ИФА с целью выявления наиболее активных и специфичных из них;

• оптимизировать условия постановки непрямого конкурентного твердофазного ИФА для определения ДМ в биосубстратах;

• разработать простые и экономичные способы подготовки биологических образцов для экспрессного определения в них ДМ; оценить чувствительность и специфичность метода;

• провести комиссионные испытания тест-системы ИФА для определения ДМ в биосубстратах; утвердить нормативную документацию на тест-систему и зарегистрировать ее в Российской Федерации;

• подтвердить результаты экспрессного определения остаточного содержания ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС.

Научная новизна

Впервые в Российской Федерации синтезированы иммуногены путем конденсации ДМ с янтарным ангидридом и конъюгированием дексаметазон-21-гемисукцината с белками, что позволило получить высокоаффинные поликло-нальные антитела. Оптимизированы условия высокочувствительного и специфичного определения ДМ в биосубстратах экспресс-методом ИФА. С учетом показателей константы ионизации и липофильности молекулы ДМ выбраны системы органических растворителей, позволившие разработать эффективные способы извлечения этого гормона из биосубстратов. Оптимизированы условия арбитражной методики определения ДМ в биологических образцах с использованием ВЭЖХ-МС-МС.

Практическая значимость

Создана тест-система, предназначенная для определения остаточных количеств ДМ в продукции животноводства после терапевтического применения его в ветеринарии, а также для проведения государственного мониторинга незаконного использования этого гормона в качестве анаболического стимулятора роста. На тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система «Дексаметазон-ИФА» зарегистрирована в Российской Федерации, налажено серийное производство наборов реагентов для выявления ДМ в биологических образцах методом ИФА.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на: 1. Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИ ТИБП (Щелково, 2005);

2. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2005);

3. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2006);

4. XIV Всероссийском ветеринарном конгрессе (Москва, 2006);

5. 5th International Symposium on hormone and veterinary drug residue analysis (Antwerp, Belgium, 2006);

6. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2007).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: создание иммуногенов, получение и характеристика специфических им-мунореагентов; разработка эффективных способов экстракции ДМ из биосубстратов и оптимизация условий его определения методом ИФА; подтверждение результатов экспресс-определения ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературных источников и приложения. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 184 источника, в том числе 171 иностранный.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Вылегжанина, Александра Владимировна

6. ВЫВОДЫ

1. Созданы иммуногены путем конъюгирования ДМ-21-гемисукцината с белками карбодиимидным методом, позволившие получить высокоаффинные поликлональные антитела (Каф = 2*108 моль"1).

2. Оптимизированы условия проведения НТК ИФА (концентрация ТФА -0,05 мкг/мл, время и температура сорбции его на полистироле - 1час при 37 °С, время инкубации AT с ТФА - 1 час при 37 °С), обеспечившие специфичное определение ДМ с чувствительностью 0,02 мкг/л.

3. Подобраны системы растворителей для эффективного извлечения ДМ из биологических образцов с учетом физико-химических свойств молекулы гормона (константы ионизации, липофильности и площади полярной поверхности).

4. Разработана тест-система ИФА для экспрессного определения ДМ в биосубстратах с пределом определения: в мышечной ткани - 0,5 мкг/кг; в печени и моче - 0,8 мкг/кг (л); в молоке - 0,2 мкг/л; в корме - 1,7 мкг/кг. Высокая эффективность тест-системы подтверждена в результате комиссионных испытаний.

5. Предложены условия арбитражного анализа ДМ в биологических субстратах методом ВЭЖХ-МС-МС (способы извлечения, очистки, хромато-графического разделения и параметры тандемной масс-спектрометрии). Предел определения ДМ в матрицах методом ВЭЖХ-МС-МС составил 0,1 мкг/кг (л).

6. Установлено, что экспресс-метод ИФА и арбитражный метод ВЭЖХ-МС-МС позволяют получать сопоставимые результаты при определении ДМ в кормах, моче, печени и мышечной ткани животных.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и внедрена в практику тест-система для определения дексаметазона в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа. Тест-система предназначена для экспресс-определения дексаметазона в кормах и продукции животноводства при проведении государственного ветеринарного мониторинга.

Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на тест-систему «Дексаметазон-ИФА» (ТУ 9398-036-11361534-2005).

2. Инструкция по применению тест-системы «Дексаметазон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 06 декабря 2005 г, per. № ПВР-1-1.5/01487).

4.5.2. Заключение

Были оптимизированы условия подтверждающего ВЭЖХ-МС-МС метода определения ДМ в различных биосубстратах, чувствительность составила менее ОД мкг/кг(л) для всех исследованных матриц. Было показано, что скрининго метод НТК ИФА и арбитражный метод ВЭЖХ-МС-МС дают сопоставимые ре- v зультаты при определении ДМ в мышечной ткани, печени, моче и комбикорме.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ДМ широко используется в животноводстве в качестве лекарственного средства, а также нелегально используется в качестве стимулятора роста. Наличие остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства может отрицательно сказываться на здоровье потребителей [70].

Для контроля за применением ДМ в качестве нелегального стимулятора • роста необходимо было разработать экспресс-метод определения ДМ, а также оптимизировать условия арбитражного метода - высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС-МС), подтверждающего присутствие вещества в образцах, показавших положительный результат при определении экспресс-методом.

В нашей работе для определения ДМ был выбран метод ИФА, т.к. известно, что этот метод часто применятся для определения стероидов [176]. ИФА обладает рядом преимуществ, по сравнению с другими скрининг-методами (такими как РИА, рецепторный анализ и др.). ИФА - простой в исполнении, безопасный метод, обладающий высокой чувствительностью. Для ИФА характерна легкость способов визуальной и приборной регистрации, простота проведения анализа; доступность оборудования и реагентов [3].

При разработке ИФА, как и любого другого иммунохимического метода, наиболее ответственным этапом исследований является получение специфических иммунореагентов, определяющих чувствительность и специфичность анализа и получение высокотитражных, высокоаффинных антисывороток [81]. В ходе экспериментов были получены специфические иммунореагенты: твердофазный антиген и специфические поликлональные сыворотки.

Молекулярная масса ДМ составляет 392 Да. Т.к. вещество с такой молекулярной массой не обладает собственной иммуногенностью, то в целях создания иммуногена ДМ необходимо было конъюгировать с белками-носителями [63]. Белковые молекулы увеличивают вероятность создания хороших Т-клеточных эпитопов, и с большей вероятностью вовлекаются в процесс представления на поверхности специальных АГ-перерабатывающих/АГпрезентирующих клеток, даже при пороговых концентрациях АГ [81]. Из литературы известно, что БСА является одним из самых распространенных белков-носителей, применяемых для получения иммуногенов. Молекулярная масса БСА составляет 67 кДа, он обладает высокой растворимостью в воде, в молекуле БСА 59 аминокислотных остатков лизина, 30-35 из которых содержат первичные аминогруппы, способные вступать в реакции, например, в реакцию образования пептидных связей [182].

Для создания конъюгата на первом этапе был синтезирован гаптен, который в последствии присоединяли к белку-носителю. Анализ литературных данных показал, что при разработке методов иммуноферментного анализа ДМ (I) в качестве гаптена чаще всего используют эфиры янтарной кислоты (II) по окси-группе в положении 21 [102]. Затруднения, которые возникали при этом, обусловлены тем, что в процессе синтеза возможно образование диацильного производного (IV) по оксигруппе в положении 11 (рис. 18).

IV

Рисунок 18. Диацильное производное по оксигруппе в положении 11.

Обычно это препятствие преодолевают тем, что монооксиацильное производное получают в две стадии. В начале, в относительно жестких условиях, синтезируют диоксиацильное производное типа (IV), которое в мягких условиях (выдержка с разбавленным водноспиртовым раствором углекислого калия при 200 °С) превращают в моноацильное производное.

При проведении конъюгации гаптена с БСА следует отметить, что конденсация идет в водной среде при рН 8-9. Нужные значения рН поддерживают с помощью водных растворов сильных оснований, что не исключает создания более высоких значений рН при их передозировке. Этот фактор не важен при коньюгировании гаптенов, производных уксусной и аминоуксусной кислот. Однако при коньюгировании лабильных гемисукцинатов, это может играть определяющее значение. В этом случае необходимо работать в мягких условиях (рН 7,0-7,2, Т=4-50°С).

Были получены конъюгаты ДМ с высокомолекулярными белками (БСА, КСА, Ж и ЯА). Конъюгат БСА-ГсДМ был использован для получения специфических иммунных сывороток, конъюгаты БСА-ГсДМ, Ж-ГсДМ, ЯА-ГсДМ и КА-ГсДМ использовались как твердофазные антигены при отработке условий постановки ИФА.

Количество молекул гаптена, связанных с белком, можно определить различными методами [65]. Мы использовали в нашей работе метод УФ-спектроскопии. Эпитопная плотность ДМ составила 12 молей на один моль белка (БСА). Эпитопная плотность гаптена, связанного с белком-носителем, может влиять на иммунный ответ [63]. В исследованиях стероид-протеиновых конъюгатов в качестве иммуногенов для продукции анти-стероидных AT было показано, что при низкой плотности гаптенов образуются AT с низкими титрами; умеренная плотность является оптимальной, тогда как высокая плотность может препятствовать образованию AT [63]. Присоединение 10-20 небольших молекул к инородному белку-носителю, типа БСА, может быть эффективно в определенных пределах [81]. В наших экспериментах при эпитопной плотности 12 молекул гаптена ДМ на молекулу БСА был получен приемлемый титр для AT N4, N5, N51 (см. п.4.3.1. табл. 4.).

В целях получения поликлональных сывороток иммунизировали кроликов. Обычно от большинства кроликов можно получить сыворотки с высоким титром к вводимому АГ, однако некоторые кролики не дают необходимого ответа, поэтому для иммунизации использовали несколько животных (2 кролика в первой и 3 во второй серии экспериментов).

Для получения AT был выбран конъюгат ДМ с БСА. На конъюгат КСА-ГсДМ не получали антисыворотки, т.к. известно, что для получения сыворотки с высоким титром необходимо использовать белковый АГ для иммунизации животных филогенетически далекого вида. Это связано с тем, что чем больше различий и, следовательно, эпитопов, тем больше продукция AT [81]. На конъюгат Ж-ГсДМ также не получали антисыворотки, т.к. известно, что желатин не обладает собственной иммуногенностью [138]. Овальбумин обладает несколько меньшим молекулярным весом, чем БСА 45x103 Да, также на поверхности овальбумина меньше реакционноспособных первичных аминных групп - 20 на молекулу [117], он значительно реже чем БСА применяется для создания им-муногенов, хотя вполне применим для этого [135].

Для стимуляции иммунной системы кролика АГ вводят с адъювантом. Наиболее часто в качестве адъюванта используется адъювант Фрейнда [81]. В наших экспериментах для первичной иммунизации был выбран полный адъювант Фрейнда, дальнейшие поддерживающие иммунизации проводились без адъюванта.

Для иммунизации животных был выбран внутрикожный путь введения АГ. Известно, что внутрикожный путь предпочтителен, т.к. сосудистая абсорбция из этой области относительно низкая, а лимфоток относительно быстрый. В коже также находится большое количество дендритных клеток Лангерганса, которые способствуют быстрому переносу АГ к лимфатическим узлам [81].

АГ вводился в 30-40 точек в области спины для снижения риска возникновения патологического воспалительного ответа в областях иммунизации [81].

Для кроликов доза растворимого белка, вводимого вместе с ПАФ, находится в пределах от 50-1000 мкг [83]. В наших экспериментах была предложена концентрация (по белку) АГ 100 мкг (в ПАФ) на кролика для первичной иммунизации, для первой повторной иммунизации также использовали 100 мкг АГ (без адъюванта), дальнейшие поддерживающие иммунизации проводили 20 мкг

АГ (без адъюванта) на кролика (табл. 2). Иммунизации проводили с интервалом в месяц, сыворотку отбирали через неделю после иммунизации.

Цель состояла в том, чтобы получить большое количество высокоаффинных AT в ходе вторичного иммунного ответа, таким образом, высокий титр AT после первичной иммунизации необязателен [81]. Основанием для выбора схемы иммунизации явилась работа Goudie R.B. et al. [74], который в 1966 г предложил стратегию для отбора относительной концентрации АГ для первичной и вторичной иммунизаций. В этом случае применялась большая доза для первичной иммунизации. Возможно, большая первичная доза изначально стимулирует большее количество клонов В-клеток и тем самым дает обширную базу для последующих соматических мутаций. Процесс отбора, при условии снижения доступных АГ, должен обеспечить выживание только высоко-аффинных клонов. Эта стратегия также исходит из того, что клетки памяти стимулируются меньшим количеством АГ, чем нужно для первичной стимуляции В-клеток или Т-клеток [81].

Для определения ДМ был выбран вариант непрямого конкурентного твердофазного ИФА. Гетерогенный ИФА обладает большей чувствительностью, чем гомогенный анализ (чувствительность находится в районе микро-граммов-нанограммов концентраций белка в 1 мл) [11]. Известно также, что по сравнению с прямым методом, непрямой обладает следующими преимуществами:

- повышенная чувствительность, т.к. каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые связываются с вторичными антителами, за счет этого происходит усиление сигнала;

- иммунореактивность первичных антител не изменяется из-за присоединения метки [55] и др.

В качестве растворителя для приготовления калибровочных растворов ДМ и экстрактов использовали 20% метанол. Jourdan S.W. et al. [98] установил, что для проведения ИФА метанол является одним из лучших допустимых растворителей. Однако метанол может как угнетать связывание антител с антигенами, так и ускорять связывание (в зависимости от природы аналита). Haasnoot W. et al. [80] исследовал влияние концентрации метанола в различных видах имму-ноанализа. Было показано, что в ИФА для определения стероидов (нортесто-стерона, кортикостероидов, тестостерона и др.) оптимальной является концентрация метанола от 15 до 30% в лунке.

В ходе отработки условий проведения анализа была определена активность AT и установлено их рабочее разведение. Титру AT соответствует конечное разведение, при котором возможно определение активности в предлагаемом варианте ИФА [81]. В наших экспериментах определяли титр AT в непрямом твердофазном ИФА. За титр принимали такое разведение, при котором ОП45о = 1,0 + 0,2.

Для кроликов N4 и N5 характерны более высокие титры AT, чем для кроликов N49, N50, N51, что можно объяснить, в том числе, и индивидуальными особенностями животных. Для животных N4 и N5 максимальные титры AT были получены после 5-ого введения АГ.

Титры AT N49, N50, N51 не превышали 1:1600. Для животного N49 последующие иммунизации не приводили к увеличению титра сыворотки, титр сыворотки снижался, т.е. это животное не дало адекватного антительног ответа на введение АГ. Для животного N50 до шестого взятия титр соответствовал разведению 1:200, после шестого взятия титр увеличился всего в два раза, т.е. антительный ответ был недостаточным. У животного N51 после 10-ой иммунизаций был получен максимальный титр AT (1:800), сохранившийся при последующих иммунизациях.

Далее определяли специфичность иммунных сывороток в НТК ИФА. Из рисунка 7 видно, что для AT N49 при добавлении ДМ в концентрации 12,5 нг/мл процент связывания с ТФА не превышал 80%. В сыворотке N49 обнаруживалось мало высоко-аффинных AT (или много низко-аффинных) . Было показано, что количество AT в сыворотке N49 также невелико (см. пункт

4.3.1.). Можно утверждать, что у животного N49 иммунный ответ был недостаточным, как с точки зрения образования низко-аффинных, так и высокоаффинных клонов В-клеток.

Для AT N50 после второго введения АГ отмечена максимальная специфичность. Анализ специфичности сывороток от животного N50 в НТК ИФА показал, что специфичность уменьшилась после 3-6 введений АГ, тогда как после седьмого введения АГ образование специфических AT несколько увеличилось и вышло на плато. Процент связывания AT для 7-10 взятий в среднем составило 47%. В данном случае, в отличие от сыворотки N49, специфические AT образовывались, однако их количество было недостаточным (титр не более 1:400) (пункт 4.З.1.).

В ходе иммунизаций кролика N51 специфичность AT постепенно возрастала. После первых четырех введений АГ % связывания AT находился в пределах 72%; после пятого и шестого - 52%; после седьмого и восьмого - 64%; после девятого и десятого - 56%, и только после одиннадцатого и двенадцатого введений % CAT снизился до 41%, т.е. специфичность возросла. Титр AT ос-тепенно возрастал в ходе иммунизаций. Можно предполагать, что в течение года у кролика №51 происходило постепенное созревание и отбор высокоаффинных клонов В-клеток.

Аффинность, которая определяется константой аффинности (Каф), является важной характеристикой AT, показывая степень сродства с АГ (ДМ). Для иммунохимических методов наиболее интересны высоко аффинные AT, Каф которых больше или равна 108 моль'1. Для полной характеристики сыворотки оценивают оба значения - титр и аффинность AT, поскольку измерение только титра не полностью характеризует сыворотку [81]. Аффинность AT определяется количеством комплексов антиген-антитело, которые присутствуют в состоянии равновесия. Высокоаффинные AT (Каф = 1012 моль'1) связывают большее количество АГ за более короткий срок, чем низкоаффинные (Каф = 104 моль"1) [80]. Нужно также учитывать, что титр сыворотки находится в прямой зависимости от чувствительности анализа и сравнение титров возможно только для данных, полученных от аналогичных стандартизированных иммунофер-ментных систем.

Для AT N51-11 в НТК ИФА ИК5Ш ДМ сосавляет ~2 нг/мл и Каф = 2х 108 моль"1.

Из таблицы 5 видно, что AT N51-11 являются наиболее высокоаффинными, AT N4-6 обладают аффинностью примерно в три раза меньшей, чем AT N51-11.

Для разработки метода были выбраны AT N51-11 в рабочем разведении 1:800. Их можно считать высокоаффинными, для этих AT были получены лучшие показатели чувствительности и специфичности,.

В ходе работы отбирали ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета. Существуют данные, что структурные отличия АГ, применяемых для иммунизации и в качестве ТФА, в некоторых случаях увеличивают чувствительность ИФА [5]. В наших экспериментах большая чувствительность наблюдалась при использовании конъюгата БСА-ГсДМ в качестве иммуногена и ТФА. При этом важно, чтобы иммобилизованные на полистироле молекулы располагались монослоем, что увеличивает точность метода. При образовании монослоя снижается количество пустых областей на поверхности полистирола (которые образуются в случае, если концентрация слишком мала), или нестабильных многослойных образований, из-за взаимодействий между молекулами белков (при слишком высокой концентрации) [57]. В нашем случае, оптимальной концентрацией оказалась концентрация 0,05 мкг/мл.

Время и температура инкубации ТФА также имеют большое влияние на процесс иммобилизации белков на полистироле. Так, при 37 °С связывание белка примерно вдвое больше, чем при 4 °С [4]. Было показано, что наилучшими условиями инкубации для первичной иммобилизации являются 16 ч при 4 °С. Эти условия являются наиболее стабильными, длительное время инкубации способствует установлению равновесия между связавшейся и свободной формами белка [57]. В наших экспериментах для у инкубации в течение 16 ч при 4

С калибровочная кривая не была линейна. Это может быть связано с изменениями концентраций за счет испарения реагентов, особенно по краям планшета, что обычно значительно снижает точность измерений [57]. Для 2 часов при 37 °С также наблюдается некоторая нелинейность, что также может быть связано с «краевыми эффектами». График зависимости %САТ от концентрации ДМ был линеен для условий инкубации 1 час при 37 °С (рис. 12), эти условия являются оптимальными с точки зрения стабильности получаемых результатов. Было отмечено, что инкубация на верхней полке термостата дает более стабильные результаты, что согласуется с литературным данными о том, что в случае поступления тепла снизу планшета (в большей степени, чем с боков), возможно избежать краевых эффектов, вызванных температурным градиентом [57].

Установили чувствительность реакции НТК ИФА для определения ДМ. Она составила 0,02 мкг/л. График зависимости логарифма концентрации ДМ от % CAT линеен в области от 0,02 до 62,5 мкг/л Определение ДМ возможно в широком диапазоне концентраций (рис. 16).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вылегжанина, Александра Владимировна, 2007 год

1. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ / Байерман К. М.: Мир, 1987. - 462 с.

2. Будников Г.К. Определение следовых количеств веществ как проблема современной аналитической химии / Будников Г.К. // Химия. 2000. -28с.

3. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. М.: Высшая школа, 1991.-251 с.

4. Иммуноферментный анализ // Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988.- 173-243 с.

5. Кононенко Г.П. Применение твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения фумонизинов группы В / Кононенко Г.П., Буркин А.А., Зотова Е.В., Соболева Н.А. // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35. №2. - С. 206-211.

6. Кольман Я. Наглядная биохимия / Кольман Я., Рём К.-Г. М.: Мир.,2000.-366 с.

7. Коренман Я.И. Экстракция органических соединений / Коренман Я.И. // Химия. 1997. -http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/239.html

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. / Машковский М.Д. -14-е изд. М.: ООО «Издательство Новая Волна»: Издатель С.Б. Дивов,2001.-Т. 2.-31 с.

9. Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, № 604. 18.08. 1999.

10. Розен В.Б. Основы эндокринологии / Розен В.Б.; Под ред. Смирновой О.В. Издательство Московского Унверститета, 1994. - 115 с.

11. П.Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ / Самуилов В.Д. // Соросов-ский журнал, http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/896.html. 1999.

12. СанПиН 2.3.2.1078-01, М: ФГУП «ИнтерСЭН». - 2002. - 155 с.

13. Химическая информационная сеть. Физическая химия. Московский Университет // http://www.chem.msu.su/rus/olimpiad/russia/2006/reshvyb-phys.pdf

14. Abraham G. Possible role of dexamethasone in sensitizing the beta-adrenergic receptor system in vivo in calves during concomitant treatment with clenbuterol / Abraham G., Gottschalk J., Ungemach F. // Pharmacology. -2004. Vol. 72 №3. - P. 196-200.

15. Abraham G. Solid-phase radioimmunoassay of estradiol-17 / Abraham G. // J Clin Endocrinol Metab. 1969. - Vol. 29. - P. 866-870.

16. Allison A.C. Immunological adjuvants: Desirable properties and side-effects / Allison A.C., Byars N.E. // Molec. Immunol. 1991. - Vol. 28. - P. 297-384.

17. Altman A. Immunomodifiers in vaccines / Altman A., Dixon F.J. // Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine. 1989. - Vol. 33. - P. 301343.

18. Analitical strategies for residue analysis of veterinary drugs growth-promoting agents in food-producing animals a review / Stolker A.A.M., Brinkman U.A.Th. // J. Chromotogr. A. - 2005. - Vol. 1067. - P. 15-53.

19. Antignac J.P. Analytical strategies for the direct mass spectrometric analysis of steroid and corticosteroid phase II metabolites / Antignac J.P., Brosseaud A., Gaudin-Hirret I., Andre F., Bizec B.L. // Steroids. 2005. - Vol. 70 №3. - P. 205-216.

20. Antignac J.P. Study of natural and artificial corticosteroid phase II metabolites in bovine urine using HPLC-MS/MS / Antignac J.P., Bizec B.L., Monteau F., Andre F. // Steroids. 2002. - Vol. 67. №10. - P. 873-82.

21. Asensio C. Role of glucocorticoids in the physiopathology of excessive fat deposition and insulin resistance / Asensio C., Muzzin P., Rohner-Jeanrenaud F. // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2004. - Vol. 28 - P. 45-52.

22. Australian Government, Dep. Of Agric., Fisheries and Forestry http://www.affa.gov.au/corporatedocs/publications/pdf/animalplanthealth/nrs/ international/ pigmrlsaug06.pdf

23. Bennett B. A comparison of commercially available adjuvants for use in research / J. Immunol. Methods // Bennett В., Check I.J., Olsen M.R., Hunter R.L.- 1992.-Vol. 153.-P. 31-40.

24. Bevalot F. Analitical strategies for the screening of veterinary drugs and their residues / Bevalot F., Gaillard Y., Lhermitte M.A., Pepin G. J. // Chromatogr. В.-2000.-Vol. 740.-P. 227.

25. Caloni F. Determination of dexamethasone in milk of dairy cows by immuno-enzymatic assay / Caloni F., Belloli C., Crescenzo G., Ormas P., Archimbault P. // Vet. Hum. Toxicol. 2000. - Vol. 42. №6 - p. 345-348.

26. Carraway K.K. Carbodiimide modification of proteins / Carraway K.K., Kosland D.E. // Methods Enzymol. 1972. - Vol. 25. - P. 616.

27. Cartmill J.A. Effect of dexamethasone, feeding time, and insulin infusion on leptin concentrations in stallions / Cartmill J.A., Thompson D.L., Storer W.A., Crowley J.C., Huff N.K., Waller C.A. // J. Anim. Sci. 2005. - Vol. 83.-P. 1875-1881.

28. Cerni L. Dexamethasone and clenbuterol detection by enzyme immunoassay in bovine liver tissue: a new multiresidue extraction procedure / Cerni L., Bian-cotto G., Tondolo A., Bogoni P. // Food Agr. Immun. 1998. - Vol. 10 - P. 307-315.

29. Clemons D.J. Evaluation of the subcutaneous chamber as an alternative to adjuvant immunization for antibody production in rabbits. / Clemons D.J., Besch-Williford C., Riley L.K. // Lab. Anim. Sci. 1992. - Vol. 42. - P. 307311.

30. Codex Alimentarius Commission. Joint FAO/WHO Food Standards programme, 1993.

31. Codex Alimentarius Commission. Joint FAO/WHO Food Standards programme, 1998.

32. Contaminants and Target Biological Matrices // School of Advanced Residue Analysis in Food. http://www. saraf-educ. org. 2003. - P. 51.

33. Contiero L. Detection of dexamethasone residue in bovine livers and urines when used as growth promotoring agent / Contiero L., Neri В., Giannetti L., Bagnati R., Pozza G., Angeletti R. // 5th Int. Symp. Hormone And Veterinary

34. Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19, 2006. Abstract Book. Universiteit Gent. - 2006. - P. 71.

35. Coons A.H. Demonstration of pneumoccocal antigen in tissues by use of fluorescent antibody / Coons A. H., Creech H.J., Jones R.N., Berliner E. // J. Immunol. 1942.-Vol. 45.-P. 159-170.

36. Cooper P.D. The selective induction of different immune responses by vaccine adjuvants / Cooper P.D. // Strategies in Vaccine Design (by ed. Ada G.L.), Austin: R.G. Landes Company. 1994. - P. 125-158.

37. Cooper P.D The adjuvanticity of Algammulin, a new vaccine adjuvant / Cooper P.D., McComb C., Steele EJ. // Vaccine. 1991. - Vol. 9 - P. 408-415.

38. Courtheyn D. Misuse of growth promoters in livestock production / Courtheyn D., Vercammen J., Logghe M., Seghers H., De Wasch K., De Brander H. // Analytica Chimica Acta. 2002. - Vol. 473. - P. 71-82.

39. Current Protocols in Immunology / By eds. Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M., Strober W. New York: John Wiley & Sons, 1995.-P. 144.

40. Czock D. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Systemically Administered Glucocorticoids / Czock D., Keller F., Rasche F.M., Haussler U. // Clinical Pharmacokinetics 2005. - Vol. 44. № l. - p. 61-98.

41. De Wasch K. Detection of corticosteroids in injection sites and cocktails by MSn / De Wasch K., De Brabander H., Courtheyn D., Van Peteghem C. // Analyst. 1998. - Vol. 123 №12. - P. 2415-2422.

42. Dighe K.K. A solid phase radioimmnoassay for plasma progesterone / Dighe K.K., Hunter W.M. // Biochem. J. 1974. - P.143,219-231.

43. Dowling P. CgFARAD the Canadian Food Animal Residue Avoidance Database / Dowling P., Doucet M., Fortier S., Clark C. // www.canadianveterinarians.net /larounds.

44. Dray S. Allotype suppression / Dray S. // Ontogeny of Acquired Immunity, A Ciba Foundation Symposium. Amsterdam: ASP, Elsevier, North Holland. -1971.-P. 87-103.

45. Edwards R.W.H. The extraction and oxidation of urinary steroids conjugate / Edwards R.W.H., Kellie A.E., Wade A.P. // Memoirs of the Society for Endocrinology. 1953. - Vol. 2. - P. 53-63.

46. EEC Council Regulation 508/99/CCE // Off. J. Eur. Commission, L60 of 9-3.1999.

47. Eisen H.N. Variations in affinities of antibodies during the immune response / Eisen H.N., Siskind G.W. // Biochemistry. 1964. - Vol. 3. - P. 996-1008.

48. ELISA and ELISPOT Products Handbook and Technical Guide // http://www.piercenet.com/files/ELISAHB 1601158ptl.pdf

49. ELISA Technical Bulletin No. 1 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisal.pdf

50. ELISA Technical Bulletin No. 2 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisa2.pdf

51. ELISA Technical Bulletin No. 5 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisa5.pdf

52. Elliott C. Screening Methods / Elliott C. // School of Advanced Residue Analysis in Food. http://www. saraf-educ. org. 2003.

53. English J. The metabolism of dexamethasone in the rat effect of phenytoin / English J., Chakraborty J., Marks V. // J. Steroid Biochem. - 1975. - Vol. 6. -P. 65-68.

54. Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immuno-globulin G / Engvall E., Perlmann P.O. // Immunochemistry. -1971.-Vol. 8.-P. 871-875.

55. Enzyme-irnmunoassay / By ed Maggio E.T. Boca Raton, FL: CRC Press. -1980.-P. 105-34.

56. Erlanger B.F. The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: A survey / Erlanger B.F. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 85-104.

57. Erlanger B.F. Principles and methods for the preparation of drug protein conjugates for immunological studies / Erlanger B.F. // Pharmacol. Rev. 1973. -Vol. 25.-P. 271-280.

58. Euro-Diagnostica B.V. Corticosteroid EIA, The Netherland // 5081CORlp6.08.05

59. European Medicines Agency Veterinary Medicines and Inspections // http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/mrls/087403en.pdf. London. - 2004.

60. Fanger M.W. The oligosaccharide units of rabbit immunoglobulin G. Asymmetric attachment of C2-oligosaccharide / Fanger M.W., Smyth D.G. // Bio-chem. J. 1972. - Vol. 127. - P. 767-774.

61. Fearon D.T. The CD 19/CR2/TAPA-1 complex of В lymphocytes: Linking natural to acquired immunity / Fearon D.T., Carter R.H. // Annu. Rev. Immunol. 1995.-Vol. 13.-P. 127-149.

62. Food and Agriculture organization of the United Nation. 2006. -www.fao.org/docrep/meeting/005/X0203E/x0203e0e.htm

63. Fuentes M. Optimization of the modification of carrier proteins with aminated haptens / Fuentes M., Palomo J. M., Mateo C., Venteo A., Sanz A., Fernandez-Lafuente R., Guisan J.M. // Journal of Immunological Methods. 2005. - Vol. 307. № 1-2.-P. 144-149.

64. Gaignage P. Dexamethasone bovine pharmacokinetics / Gaignage P., Lognay G., Bosson D., Vertongen D., Dreze P., Marlier M., Severin M. // Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet. 1991. - Vol. 16 № 3. - P. 219-221.

65. Goidl E.A. The effect of antigen dose and time after immunization on the amount and affinity of anti-hapten antibody / Goidl E.A., Paul W.E., Siskind G.W., Benacerraf B. // J. Immunol. 1968. - Vol. 100. - P. 371-375.

66. Goudie R.B. A simple method for producing antibody specific to a single selected diffusible antigen / Goudie R.B., Home C.H.W., Wilkinson P.C. // Lancet. 1966. - Vol. 2. - P. 1224-1226.

67. Great Plains Veterinary Educational Center // http://gpvec.unl.edu/files/feedlot/internettempfiles/ResidueInfo-MRL/MRLVetDrugsJpEuUSJune2006DG-Pnt.htm.

68. Greco D.S. Dexamethasone pharmacokinetics in clinically normal dogs during low- and high-dose dexamethasone suppression testing / Greco D.S., Brown S.A., Gauze J.J., Weise D.W., Buck J.M. // Am. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 54. №4.-P. 580-585.

69. Grossman C.J. The regulation of the immune system by sex steroids / Grossman C.J. // Endocr. Rev. 1984. - Vol. 5. - P. 435-455.

70. Grossman C.J. Possible underlying mechanisms of sexual dimorphism in the immune response, fact and hypothesis / Grossman C.J. // J. Steroid. Biochem. -1989.-Vol. 34.-P. 241-251.

71. Haasnoot W. Residue Analysis in Food: Principles and Applications. Immunochemical and receptor technologies / Haasnoot W., Schilt R.; By ed. O'Keeffe M. Harwood Academic Publishers, The Netherlands, 1999. - P. 109-144.

72. Hanly W.C. Review of Polyclonal Antibody Production Procedures in Mammals and Poultry / Hanly W. C., Artwohl J.E., Bennett T.B. // ILAR Journal. -1995-Vol. 37. №3.

73. Hansen D.K. Pharmacokinetic considerations of dexamethasone-induced developmental toxicity in rats / Hansen D.K., LaBorde J.B., Wall K.S., Holson R.R., Young J.F. // Toxicological Sciences. 1999. - Vol. 48. - P. 230-239.

74. Harlow, E. Antibodies: A Laboratory Manual / Harlow E., Lane D. // Cold Spring Harbor, N.Y. 1988. - P. 215.

75. Herbert W.J. The mode of action of mineral-oil emulsion adjuvants on antibody production in mice / Herbert W.J. // Immunology. 1968. - Vol. 14. - P. 301-318.

76. Hirokawa K. Understanding the mechanism of the age-change of thymic function to promote T cell differentiation / Hirokawa K., Utsuyama M., Kasai M., Kurashima C., Ishimima S., Zeng Y-X. // Immunol. Lett. 1994. - Vol. 40. -P. 269-277.

77. Horbett T.A. Proteins at Interfaces: An overview, in Proteins at Interfaces II: Fundamentals and Applications (by ed. Horbettand T.A., Brash J.L.) / Horbett T.A., Brash J.L. // ACS Symposium Series, ACS Books, Washington, D.C. -1995.-P. 1-23.

78. Horbett T.A. The role of adsorbed adhesion proteins in cellural recognition of biomaterials / Horbett T.A. // BMES Bulletin. 1999. - Vol. 23 № 2. - P. 5-9.

79. Hu J-G. Studies on the optimal immunization schedule of the mouse as an experimental animal. The effect of antigen dose and adjuvant type / Ни J-G., Ide A., Yokoyama Т., Kitagawa T. // Chem. Pharm. Bull. 1989a. - Vol. 37. - P. 3042-3046.

80. Huetos O. Determination of dexamethasone in feed by TLC and HPLC / Hue-tos O., Ramos M., Martin de Pozuelo M., San Andres M., Reuvers M. // Analyst. 1999.-Vol. 124. №11. -P. 1583-1587.

81. Hum B.A.L. Production of reagent antibodies / Hum B.A.L., Chantler S.M. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 104-142.

82. Introduction of antibody Enzyme-Linked Immunosorbent assay // http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp

83. Janeway C.A.Jr. Immunobiology. / Janeway C.A.Jr., Travers P. New York: Garland Publishing Inc. - 1994. - IX. - P. 152.

84. Jones G.L. Peptide vaccines derived from a malarial surface antigen: Effects of dose and adjuvants on immunogenicity / Jones G.L., Spencer L., Lord R., Mol-lard R., Pye D. // Saul. Immunol. Lett. 1990.- Vol. 24. - P. 253-260.

85. Kenney J.S. Influence of adjuvants on the quantity, affinity, isotype and epitope specificity of murine antibodies / Kenney J.S., Hughes B.W., Masada M.P., Allison A.C.//J. Immunol. Methods- 1989.-Vol. 121.-P. 157-166.

86. Kundu N. Production of antisera against contraceptive steroids / Kundu N., Keenan S, Slaunwhite W.R. // Steroids. 1977. - Vol .30. - P. 85-96.

87. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Practice and theory of enzyme immunoassay / By eds. Burbon R.H., Knippenberg van P.H. Elsevier, Amsterdam. - 1985. - P. 1-549.

88. Leish Z. Studies on intravenously infused dexamethasone in sheep / Leish Z., Panaretto B. A. // Aust. J. biol. Sci. 1978. -Vol. 31. - P. 373-383.

89. Luo Y. Simultaneous analysis of twenty-one glucocorticoids in equine plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry / Luo Y., Uboho С. E., Soma L. R., Guan F. Y., Rudy J. A., Tsang D. S. // J. Agric. Food Chem. 2003. -Vol. 51.-P. 326-30.

90. Maletto B. Aging: The cellular immune response against autologous and foreign antigens is affected before the humoral response / Maletto, В., Pistoresi-Palencia M.C., Gruppi A. // Immunol. Lett. 1994. - Vol. 40. - P. 243-250.

91. Mallinson E. T. Determination of Dexamethasone in Liver and Muscle by Liquid Chromatography and Gas ChromatographyMass Spectrometry / Mallinson E. Т., Dreas J. S., Wilson R. Т., Henry A. C. // J. Agric. food Chem.1995.-Vol. 43.-P. 140-145.

92. Manne S. Kinetics of antigen-antibody reactions at solid-liquid interfaces / Manne S., Nygren H. // Journal of Immunological Methods 1988. - Vol. 113. -P. 3-15.

93. Maurer P.H. Protein and polypeptides as antigens / Maurer P.H., Callahan H.J. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 49-70.

94. Mayumi S. Correlation between plasma leptin concentration and body fat content in dogs / Mayumi S., Nakadomo F., Honjoh Т., Ishioka S., Saito M.// Am. J. Vet. Res. 2002. - Vol. 63. - P. 7-10.

95. MedecineNet // http://www.medicinenet.com/elisatests/article.htm

96. McCoy K.L. Tolerance defects in New Zealand Black and New Zealand Black and New Zealand White F1 mice / McCoy K.L., Kendrick L., Chused T.M. // J. Immunol. 1986.-Vol. 136.-P. 1217-1222.

97. Miller R.A. Aging and immune function: Cellular and biochemical analyses / Miller R.A. // Exp. Gerontology. 1992. - Vol. 29. - P. 21-25.

98. Mostl E. Measurement of glucocorticoid metabolite concentrations in faeces of domestic livestock / Mostl E., Messmann S., Bagu E., Robia C., Palme R. // Zentralbl Veterinarmed A. 1999. - Vol. 46. - P. 621-631.

99. Nisbet A.D. The complete amino-acid sequence of hen ovalbumin / Nisbet A.D., Saundry R.H., Moir A.J., Fothergill L.A., Fothergill J.E. // European Journal of Biochemistry. 1981 -Vol. 115.-P. 335-345.

100. Oka H. Chemical analysis for antibiotics used in agriculture / By eds. Oka H., Nakazawa H., Harada K-I., Macnel J.D. AOAC international, VA . - 1995. -P. 215.

101. O'Keeffe M.J. Supercritical fluid extraction of veterinary drug residues from meat / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. // The national food center. Research report No 19. Dublin. 1999 - ISBN I 841700762. - P. 18.

102. Official Jornal of the European Communites L221, 8-36, Commission Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002. Brussels, Belgium, 2002.

103. Paganelli R. Humoral immunity in aging /Paganelli, R., Scala E., Quinti I., Ansotegui I.J. // Aging Clin. Exp. Res. 1994. Vol.6. - P. 143-150.

104. Pagano G. An in vivo and in vitro study of the mechanism of prednisone-induced insulin resistance in healthy subjects / Pagano G., Cavallo-Perin P., Cassader M., et al. // J Clin Invest. 1983. - Vol. 72. - P. 1814-1820.

105. Peets E.A. Plasma binding of betamethasone-3H, dexamethasone-3H, and Cortisol-14C a comparative study / Peets E.A., Stam M., Symcowicz C. // Bio-chem. Pharmacol. - 1969.-Vol. 18.-P. 1655-1663.

106. Passingham B. Application of high-performance liquid chromatography to the measurement of Cortisol secretion rate / Passingham B. J.,Barton R. // Journal of Chromatography: Biomedical Applications. 1987. - Vol. 416. - P. 25-35.

107. Pham-Huu-Trung M.T. A direct determination of plasma aldosterone / Pham-Huu-Trung M.T., Corvol P. // Steroids. 1974. - Vol. 24. - P.587-598.

108. Philippe J. Cyclic adenosine monophosphate prevents the glucocorticoid-mediated inhibition of insulin gene expression in rodent islet cells / Philippe J., Giordano E., Gjinovci A., Meda P. // J. Clin. Invest. 1992. - Vol. 90. - P. 2228-2233.

109. Ramos M. Determination of dimetridazole residues in bovine tissue by liquid chromatography / Ramos M., Aranda A., Reuvers Th., Jimenez R. // Analytica Chimica Acta. 1993. - Vol. 275. - P. 317-321.

110. Reding J. Dexamethasone and flumethasone residues in milk of intramuscularly dosed cows / Reding J., Sahin A., Schlatter J., Naegeli H. // J. Vet. Pharmacol. Ther. 1997. - Vol. 20(3). - P. 198-203.

111. Report for 2004 on the results of residue monitoring in food of animal origin in the Member States // European Commission Health And Consumer Protection

112. Derictorate-General, Annex I (SANCO/3400/2005). http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/workdoc2004en.pdf. -2004.

113. Report for 2005 on the results of residue monitoring in food of animal origin in the Member States // European Commission Health And Consumer Protection Derictorate-General, Annex I (SANCO/3635/2006. http://ec.europa.eu/)

114. Rice M.J. The metabolism of dexamethasone in the rat / Rice M.J. Tredger J.M., Chakraborty J., Parke D.V. // Biochem. Soc. Transact., 53rd Meeting, Bristol. 1974.-Vol. 2.-P. 107-109.

115. Rubenstein K.E. Homogeneous enzyme immunoassay. A new immunochemical technique / Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E.F. // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1972. - Vol. 47. - P. 846-51.

116. Schnibbe T. Effectiveness of Different Common Carriers for the Immuno-genicity of Synthetic Peptides. 2000. - http://www.diss.fu-berlin.de/2000/148/indexe.html

117. Scippo M.L. Primary Extraction Technologies in : Residue analysis in Food -Principles and Applications / Scippo M.L., Maghuin-Rogister G.; by ed. O'Keefe M. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. - 2000.

118. Scippo M.L. Detection of illegal growth promoters in biological samples using receptor binding assays / Scippo M.L., Weerdt C.V.D., Willemsen P., Francois

119. J.-M., Rentier-Delrue F., Muller M., Martial J.A., Maghuin-Rogister G. // Analytica Chimica Acta. 2002. - Vol. 473. № 1. - P. 135-141.

120. Sela M. Studies on the chemical basis of the antigenicity of proteins. 1. Antigenicity of polypeptidyl gelatins / Sela M., Arnon R. // Biochem J. 1960. -Vol. 75.-P. 91-102.

121. Seuter E. Metabolism of systematically given corticosteroids / Seuter E. // Dermatologica. 1975-Vol. 151.-P. 129-134.

122. Singh H. In vitro and in vivo genotoxicity evaluation of hormonal drugs. II. Dexamethasone / Singh H., Singh J.R., Dhillon V.S., Bali D., Paul H. // Mutat Res. 1994. - Vol. 308. - P. 89-97.

123. Siskind, G.W. Studies on the control of antibody synthesis: II. Effect of antigen dose and of suppression by passive antibody on the affinity of antibody synthesized / Siskind, G.W., Dunn P., and Walker J.G. // J. Exp. Med. 1968. -Vol. 127.-P. 55-66.

124. Snapper C.M. Fundamental Immunology. Immunoglobulin class switching / Snapper, C.M., Finkelman F.D.; dy ed. Paul W.E. New York: Raven Press., 1993.-P. 837-863.

125. Strategies in Vaccine Design. The generation and maintenance of antibody and В cell memory: The role of retained antigen and follicular dendritic cells / by ed.Ada G.L. Austin Burton Tex.: R.G. Landes Company, 1994. - P. 35-49.

126. Stills, H.F. The Biology of the Laboratory Rabbit. Polyclonal antibody production / Stills, H.F. // By eds. Manning P.J., Ringler D.H., Newcomer C.E. San Diego: Academic Press., 1994. - P. 435-448.

127. Stills, H.F. The use of Freund's complete adjuvant / Stills, H.F., Bailey M.Q. // Lab. Anim. (US) -1991. Vol. 20. - P. 25-30.

128. Stolker A. A.M. Analysis of corticosteroids / Stolker A. A.M., Schwillens P.L., Ginkel L.A., Brinkman U.A.T. // J. Chromotogr. A. 2000. - Vol. 893 №1. - P. 55-67.

129. Surface Characterization of Biomaterials, Book Review / by ed. Ratner B. D. -Elsevier Science Publishers, 1988.-P. 124.

130. Tarantola M. Effects of low doses of dexamethasone on productive traits and meat quality of veal calves / Tarantola M., Schiavone A., Preziuso G., Russo C., Biolatti В., Bergero D. // Animal Science. 2004. - Vol. 79. - P. 93-98.

131. Tecna S.r.l. Kit ELISA per corticosteroidi, Italy // Cat N FA679.

132. The Europen Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Veterinary Medicines Evaluation Unit, Commettee for Veterinary Medicinal Products, Approach Towards Harmonization of Withdrawal Periods EMEA/CVMP/36/95.

133. The Extra Pharmacopoeia / By ed. Reyonolds J.E.F. Martindale: The Pharmaceutical Press, London, 1989. - P. 1895.

134. The Japan Food Chemical Research Foundation http://www.m5.ws001 .squarestart.ne.jp/foundation/search.html

135. Touma C. Measuring Fecal Glucocorticoid Metabolites in Mammals and Birds: The Importance of Validation Ann / Touma C., Palme R. // N.Y. Acad. Sci. -2005.-Vol. 1046.-P. 54-74.

136. Toutain P.L. Dexamethasone in cattle: pharmacokinetics and action on the adrenal gland / Toutain P.L., Brandon R.A., Alvinerie M., Garcia-Villar R., Ruckebusch Y // J. Vet. Pharmacol. Ther. 1982. - Vol. 5. - P. 33-43.

137. Toutain P.L. Pharmacokinetics of dexamethasone and its effect on adrenal gland function in the dog / Toutain P.L., Alvinerie M., Ruckebusch Y. // Am. J. Vet. Res. 1983. - Vol. 44. - P. 212-217.

138. Toutain P.L. Dexamethasone and prednisolone in the horse: pharmacokinetics and action on the adrenal gland / Toutain P.L., Brandon R.A., de Pomyers H., Alvinerie M., Baggot J.D. // Am. J. Vet. Res. 1984. - Vol.45. - P. 1750-1756.

139. Tsuei S.E. Disposition of synthetic glucocorticoids I. Pharmacokinetics of dexamethasone in healthy adults / Tsuei S.E., Moore R. G., Ashley J. J., McBride W.G. // Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 1979. -Vol. 7№3.

140. U.S. Government Printing Office // http://www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx06/21cfr55606.html.

141. Vaccine Biotechnology / By eds. Bittle J.L., Murphy F.L. New York: Academic Press. - 1999.-P. 151.

142. Van den Hauwe 0. Simultaneous determination of betamethasone and dexamethasone residues in bovine liver by liquid chromatography/tandem mass spectrometry / Van den Hauwe 0., Castro Perez J., Claereboudt J., Van Peteghem C.

143. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2002. -Vol. 15. - P. 857 -861.

144. Varma D.R. Anti-inflammatory and ulcerogenic effects and pharmacokinetics of dexamethasone in protein-deficient rats / Varma D.R., Mulay S. // J. Phar-maco. Exp. Ther. 1980. - Vol. 214. - P. 197-202.

145. Vranic M.L. Estimation the withdrawl period for veterinary drugs used in food producing animals / Vranic M.L., Marangunich L., Fernandez Courel H., Fernandez Saurez A. // Analytica Chimica Acta. 2003. - Vol. 483. - P. 251-257.

146. Walker B.E. Induction of cleft palate in rabbits by several glucocorticoids / Walker B.E. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967. - Vol. 125. - P. 1281-1284.

147. Walker B.E. Induction of cleft palate in rats with anti-inflammatory drugs / Walker B.E. // Teratology. 1971. - Vol. 4. - P. 39-42.

148. Warr G.W. IgY: Clues to the origins of modern antibodies / Warr G.W., Mator K.E., Higgins D.A. // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16. - P. 392-398.

149. Warren, H.S. Future prospects for vaccine adjuvants / Warren, H.S., Chedid L.A. // CRC Critical Reviews Immunol. 1988. - Vol. 8. - P. 83-101.

150. Weller Т.Н. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster, propagated in vitro / Weller Т.Н., Coons A.H. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. - Vol. 86. - P. 789-794.

151. Wikipedia on-line encyclopedia//http://146.107.217.178/lab/alogps/start.html.

152. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Corticosteroids.

153. Wikipedia on-line encyclopedia // http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/

154. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA.

155. Wikipedia on-line encyclopedia // http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/

156. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquidextraction.

157. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Polarsurfacearea.

158. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Steroid.

159. Wisdom G.B. Peptide Antigens / Wisdom G.B. // Oxford University Press, Oxford.- 1995.

160. Woodard, L.F. Bacterial Vaccines. Surface chemistry and classification of vaccine adjuvants and vehicles / Woodard, L.F.; by ed. A. Mizrahi. New York: Alan R. Liss., 1990. - P. 286-306.