Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 и bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Гайдеров, Андрей Александрович

• Гайдеров, Андрей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гайдеров, Андрей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА

1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния 9 здоровья организма хозяина

1.2. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы и их 12 классификация

ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ В ПРАКТИКЕ ЗДРАВО- 18 ОХРАНЕНИЯ

2.1. Пробиотики на основе Escherichia coli

2.2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus 20 ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Материалы

1.2. Методы

1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бакте- 25 рий рода Bacillus

1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств мик- 25 роорганизмов

1.2.3. Определение адгезивной активности

1.2.3.1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам

1.2.3.2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным 27 клеткам кишечника лабораторных животных

1.2.4. Определение антагонистической активности

1.2.5. Оценка количественного и качественного состава микро- 29 флоры

1.2.6. Моделирование экспериментального дисбиоза

1.2.7. Изучение органно-тканевой транслокации

1.2.8. Определение функциональной активности альвеолярных 30 макрофагов

1.2.9. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов

1.2.10. Определение уровня цитокинов

1.2.11. Методы изучения безопасности

1.2.11.1. Изучение острой и хронической токсичности

1.2.11.2. Изучение безвредности

1.2.11.3. Изучение вирулентности

1.2.11.4. Изучение токсичности

1.2.11.5. Изучение токсигенности 3 8 1.2.12. Методы статистической обработки результатов исследований

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И 39 БЕЗОПАСНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР IN VITRO И IN

2.1 Изучение культуральных, биохимических и морфологических 39 свойств

2.2 Изучение безопасности штаммов

2.3 Изучение антагонистических свойств 45 2.4. Выбор оптимальной композиции штаммов

ГЛАВА 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИО- 49 ЗА И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ ШТАММАМИ, А ТАКЖЕ ИХ КОМПОЗИЦИЕЙ

3.1. Моделирование дисбактериоза на мышах и его коррекция

3.2 Изучение адгезии микроорганизмов в условиях эксперимен- 52 тального дисбиоза

3.3 Изучение бактериальной транслокации в условиях экспери- 59 ментального дисбиоза

3.4. Изучение факторов неспецифического иммунитета на модели 61 экспериментального дисбиоза ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 и bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза»

В России более 90% населения страдает качественными и количественными нарушениями микробиоценоза кишечника, сопровождающимися ухудшением состояния здоровья человека (8,15). Указанный феномен связан с увеличением числа и выраженности этиологических факторов дисбиотиче-ских изменений (применение антибиотиков, инфекционные заболевания, ионизирующее излучение, стрессовые перегрузки, ухудшающаяся экология и др.), а также с недостаточной эффективностью существующих терапевтических средств (1,73,74,154).

Для коррекции измененного биоценоза желудочно-кишечного тракта применяются пробиотики, состоящие из живых микробных культур. Данные препараты содержат штаммы либо эндогенной микрофлоры (бифидо-, лакто-бактерии, кишечная палочка, др.) предназначенные для восстановления нор-мофлоры в организме-хозяине, либо штаммы транзиторных микроорганизмов (например, апатогенных представителей рода Bacillus), используемых для подавления патогенных и условно патогенных микробов (УПМ).

Первыми препаратами, введёнными в клиническую практику для коррекции дисбиозов, были пробиотики на основе кишечной палочки (49). Механизм их действия обусловлен выраженной антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно патогенных энтеробактерий и восстановлением колонизационной резистентности (1,9, 164). Показано, что применение пробиотических культур E.coli сопровождается стимуляцией факторов специфического и неспецифического иммунитета (24, 27). Несмотря на высокий лечебный эффект данных препаратов при кишечных инфекциях, в случаях, сопровождающихся персистенцией стафилококков и грибов рода Candida, они оказались неэффективными (45; 76).

При таких ситуациях показано применение пробиотиков на основе живых апатогенных спорообразующих бактерий, поскольку они обладают более широким спектром антагонистической активности к патогенным и условно патогенным бактериям и грибам. Выраженный антагонизм данные препараты проявляют в отношении Staphylococcus aureus и Candida albicans, которые в настоящее время являются этиологически значимыми в развитии микроэкологических нарушений, сопряженных с различными патологиями (45).

Некоторые авторы классифицируют споровые препараты как «природные антибиотики», ввиду продукции бациллами большого количества проте-олитических ферментов, биологически активных и антибиотикоподобных веществ, а также проявления иммуномодулирующих свойств (40,48, 62,73,74, 107, 108, 109, 110, 111).

В литературе отсутствуют исчерпывающие систематизированные сведения о влиянии пробиотиков на основе кишечной палочки и апатогенных бацилл на функциональное состояние макрофагов, нейтрофилов, уровень ци-токинов и иных факторов неспецифического иммунитета. Учитывая, что в нарушениях микробиоценоза причинно-значимыми являются различные ассоциации УПМ, в частности энтеробактерии, стафилококки и грибы рода Candida, изучение возможности создания комплексного препарата, содержащего кишечную палочку и бациллы, представляет большой научно-практический интерес.

Учитывая вышеизложенное, на этапе доклинического изучения целесообразно исследовать биологические свойства пробиотических штаммов и их композиций на модели экспериментального дисбиоза.

Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств E.coli М-17 и B.subtilis 1719 и их композиции на модели экспериментального дисбиоза.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать безопасность бактериальных культур E.coli М-17 и B.subtilis 1719 in vitro и in vivo.

2. Изучить адгезивную и антагонистическую активность штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719, а также их композиций в различных количественных соотношениях.

3. Изучить нарушения колонизационной резистентности (КР) (состав микрофлоры кишечника, адгезивную активность УПМ, транслокацию бактерий во внутренние органы и факторы неспецифического иммунитета) при экспериментальном дисбиозе.

4. Провести сравнительное изучение корригирующих свойств штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719, а также их оптимальной композиции, при экспериментальном дисбиозе.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение безопасности пробиотиче-ских штамма B.subtilis 1719 in vitro и in vivo.

Изучена антагонистическая и адгезивная активность различных соотношений пробиотических штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам. На основе сравнительной оценки биологических свойств, с учетом совместимости штаммов, сконструирована оптимальная композиция.

Впервые исследованы нарушения колонизационной резистентности при экспериментальном дисбиозе, вызванном пероральным введением антибиотика широкого спектра действия доксициклина, которые выразились следующим образом:

• в составе микрофлоры достоверно возрастало количество лактозонега-тивной кишечной флоры, энтеробактерий, грибов рода Candida, уменьшалось количество лактобацилл;

• возрастала адгезивная активность УПМ к кишечному эпителию за счет увеличения рецепторной способности последнего;

• лактозонегативная кишечная флора транслоцировалась во внутренние органы;

• наблюдался незавершенный фагоцитоз.

Использование модели экспериментального дисбиоза позволило выявить корректирующие особенности каждого пробиотического штамма и их оптимальной композиции.

Практическая значимость

Полученные данные расширяют представления о биологических свойствах пробиотических штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719, позволяют оптимизировать методические подходы при конструировании комплексного пробиотика, внедрение которого в практику здравоохранения позволит усовершенствовать медицинскую технологию коррекции дисбиозов различной этиологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Исследование биологических свойств пробиотических штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 in vitro и in vivo является необходимым условием подтверждения их безопасности.

2. На основе сравнительной оценки адгезивной и антагонистической активности штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 с учетом их совместимости сконструирована оптимальная пробиотическая композиция.

3. Доказательством развития экспериментального дисбиоза при ведении антибиотика доксициклина является нарушение колонизационной резистентности и факторов неспецифического иммунитета.

4. При сравнительном изучении свойств пробиотических штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 выявлены специфические особенности их корректирующего действия на разработанной модели экспериментального дисбиоза.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гайдеров, Андрей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Обоснована необходимость комплексного изучения биологических свойств пробиотических штаммов не только in vitro но и in vivo на модели экспериментального дисбиоза для подтверждения их безопасности и эффективности на доклиническом этапе на примере штаммов E.coli М-17, B.subtilis 1719 и их композиции.

2. Доказано, что экспериментальный дисбиоз, вызванный введением антибиотика широкого спектра действия доксициклина, сопровождался:

- нарушениями КР (увеличением количества и спектра УПБ, грибов р. Candida, снижением числа кишечной палочки и лактобацилл, увеличением адгезивности кишечного эпителия к УПМ, транслокацией лактозонегативной флоры в легкие и почки);

- изменениями параметров неспецифического иммунитета (снижением переваривающей способности альвеолярных макрофагов; активацией окислительно-восстановительного потенциала нейтрофилов и увеличением уровня TNF-a в периферической крови).

3. Показано, что при коррекции экспериментального дисбиоза про-биотическим штаммом E.coli М-17 суммарное количество лактобактерий и кишечных палочек нормализовалось, однако в пристеночной микрофлоре преобладали лактозонегативные формы; не элиминировались S. aureus и Candida; достоверно понижалась способность кишечного эпителия к адгезии; активировались факторы неспецифической резистентности (повышение уровня TNF-a, IL-10).

4. Выявлено, что при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотическим штаммом B.subtilis 1719 восстанавливалось до нормального уровня содержание лактобацилл. Количество кишечных палочек в пристеночной флоре достоверно снижалось относительно интактных животных, S.aureus и Candida эффективно элиминировались; адгезивная способность кишечного эпителия достоверно не отличалась от интактных животных, показатели функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте достоверно не отличались от интактных животных, содержание фактора некроза опухоли TNF-a при коррекции дисбиоза снижалось.

5. Доказано, что применение выбранного соотношения пробиоти-ческих штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 корригировало просветный и пристеночный микробиоценоз кишечника, снижало уровень адгезивности УПМ к кишечному эпителию; нормализовало показатели неспецифического иммунитета (окислительно-восстановительный потенциал нейтрофилов, содержание TNF-а, IL-10 и фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов).

6. Впервые обоснована целесообразность комбинированного применения пробиотических штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 для коррекции КР при экспериментальном дисбиозе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Новое направление совершенствования пробиотиков предусматривает создание комплексных биопрепаратов, включающих разные виды бактерий, взаимодополняющих друг друга по спектру антагонистической активности и по механизму действия на макроорганизм (1,9, 73).

В решении многих проблем биологии и медицины важную роль играют экспериментальные исследования на животных, позволяющие моделировать необходимые состояния, изучать динамику патологического процесса и тонкие метаболические процессы. Однако в настоящее время при проведении доклинических испытаний препаратов-пробиотиков отсутствуют стандартные модели экспериментального дисбактериоза на животных, необходимые для доказательства их эффективности (5, 47, 73).

Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств E.coli М-17 и B.subtilis 1719 и их композиции на модели экспериментального дисбиоза.

Штамм E.coli М-17 обладает выраженной антагонистической активностью против патогенных кишечных палочек, шигелл, низкой в отношении стафилококков, в том числе S.aureus, C.albicans, Streptococcus.spp.\ высокими адгезивными свойствами.

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus характеризуются рядом свойств, обуславливающих их определенное преимущество перед другими микроорганизмами, используемыми в качестве основы пробиотиков. Апатогенные бациллы безвредны для макроорганизма при наличии выраженного антимикробного действия, антагонистический спектр которого у различных штаммов может значительно отличаться (47). Это обстоятельство открывает возможности создания комплексных препаратов на основе отобранных культур, дополняющих друг друга по своим антимикробным свойствам.

Доклиническое изучение острой и хронической токсичности показало, что даже при введении доз, значительно превышающих человеческие, выбранные штаммы E.coli М-17 и B.subtilis 1719 не вызывали во внутренних органах и центральной нервной системе лабораторных животных изменений, указывающих на наличие токсического действия.

Полученные результаты подтвердили, что изученные штаммы E.coli М-17 и B.subtilis 1719 являются безопасными.

Одним из общепринятых ведущих показателей эффективности пробио-тиков является их антагонистическая активность (9, 73). Изучена антагонистическая активность нескольких вариантов композиций штаммов B.subtilis 1719 и E.coli М-17 (с разным количеством живых клеток в 1 дозе) в сравнении с монокультурами в отношении музейных штаммов и клинических патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных из разных источников. Оптимальными оказались композиции I и II, содержащие пробио-тические культуры в равных соотношениях в дозах 0,5x109 и 1,0x109 соответственно.

Изучены антагонистические и адгезивные свойства штаммов B.subtilis 1719 и E.coli М-17, а также их композиции на модели экспериментального дисбиоза.

Существует несколько методик моделирования экспериментального дисбактериоза у животных (5). Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стрессовых ситуаций, радиационного облучения, введения антибиотиков. Нами смоделирован «антибиотиковый» дис-биоз у мышей, который вызывали интрагастральным введением антибиотика доксициклина в дозе 2 мг в течение 5 сут. Дисбиоз диагностировали по изменению состава фекальной микрофлоры. Количество микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г фекалий.

После введения доксициклина в составе фекальной микрофлоры наблюдались следующие изменения: увеличение лактозонегативных E.coli (на 7 lg), увеличение количества грибов рода Candida (на 2 lg), снижение количества лактозопозитивных E.coli (на 4 lg) и лактобактерий. Количество бифи-добактерий осталось без изменения. Животные были внешне здоровы.

Коррекцию нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта подопытных мышей проводили внутрижелудочным введением монокультур E.coli М-17, B.subtilis 1719, а также и их композиций в вариантах I и II.

При коррекции ЭД E.coli М-17 в дозах 0,5 и 1,0 млрд. клеток/мл содержание лактофлоры восстанавливалось до уровня здоровых животных (до 109 КОЕ/г); вместе с тем наблюдалось дозозависимое увеличение содержания лактозоотрицательной кишечной палочки (до 53 и 94 % соответственно) и не элиминировались Candida и S. aureus. А при введении B.subtilis 1719 в дозах 0,5 и 1,0 млрд. клеток/мл, а также композиций штаммов E.coli М-17 + B.subtilis 1719 происходило восстановление нормофлоры и подавление Candida и S. aureus.

Исходя из общепринятого представления о лечебной дозе пробиотиков, соответствующей не менее 1 млрд. клеток, для дальнейшего изучения in vivo использовали композицию вариант II.

Адгезия микроорганизмов является первым этапом их взаимодействия с макроорганизмом и играет важную роль в колонизации биотопов последнего (18, 19, 20, 23,32).

Изучение адгезивной активности пробиотических штаммов B.subtilis 1719 и E.coli М-17 на эритроцитах человека выявило низкую адгезивность штамма B.subtilis 1719, и высокую - штамма Е. coli М-17.

Известно, что адгезия культур к формалинизированным эритроцитам является стандартной моделью, однако она не позволяет исследовать процессы взаимодействия микробов с естественными субстратами в макроорганизме. В связи с этим, представлялось целесообразным изучить адгезию штаммов на энтероцитах тонкого кишечника, являющихся непосредственными мишенями в организме, как у здоровых мышей, так и у животных с модельным дисбиозом. Полученные результаты свидетельствуют отсутствие достоверных различий между показателями адгезии для штаммов B.subtilis 1719 и

E.coli М-17, получаемых на эритроцитах человека и на энтероцитах животных (t<l). Это позволило сделать вывод о сопоставимости данных моделей.

Известно, что колонизация УПБ усиливается в организме больных, получающих антибиотики, особенно при нерациональной антибиотикотерапии (9, 15, 57, 73, 144). При ЭД наблюдалось достоверное повышение СПА штамма E.coli М-17 на 68,5% к кишечному эпителию (t=3,84), тогда как показатели адгезивности штамма B.subtilis 1719 достоверно не изменялись.

Нами было проведено сравнительное изучение адгезивной активности тест- штаммов условно патогенных бактерий к эпителиальным клеткам тонкого кишечника здоровых мышей и мышей с экспериментальным дисбактериозом. Выявлено достоверное повышение (р<0,05) рецепторной способности энтероцитов тонкого кишечника мышей с ЭД по сравнению с таковой у здоровых животных для изучаемых штаммов УПБ (от 56% до 105,1%).

Возможно, указанное явление связано с увеличением количества доступных рецепторов на цитоплазматической мембране энтероцитов для взаимодействия с адгезинами бактерий, как за счет экспрессии de novo, так и за счет вовлечения ранее неактивных рецепторов под влиянием изменившейся микробной популяции биотопов желудочно-кишечного тракта в условиях ЭД.

При коррекции ЭД изучено влияние пробиотических штаммов и композиции варианта II на рецепторную способность энтероцитов. В качестве тестового для адгезии использовали штамм S.xylosis 25. Не выявлено достоверных отличий в показателях адгезии штамма S.xylosis 25 к энтероцитам здоровых мышей, получавших B.subtilis 1719, а также композицию вариант II в сравнении с интактными животными. Вместе с тем наблюдалось значимое повышение рецепторной способности клеток кишечного эпителия к адгези-нам штамма S.xylosis 25 после приема E.coli М-17 по сравнению с интактными животными (t=4,98). На следующем этапе изучали адгезию штамма S.xylosis 25 к энтероцитам мышей после коррекции ЭД пробиотическими культурами В. subtilis 1719, E.coli М-17 и композицией вариант И. Установлено достоверно повышение СПА штамма S.xylosis 25 на энтероцитах кишечника мышей при ЭД (СПА=8,78±0,55) относительно интактных животных (СПА=4,74±0,22). СПА тестового штамма после введения композиции вариант II достоверно не различался по сравнению с интактными животными (4,38±0,57 и 4,74±0,22 соответственно, t=0,623).

Маркером нарушения КР у животных, получавших доксициклин, помимо изменений в составе фекальной микрофлоры, служит транслокация кишечной флоры во внутренние органы. На следующем этапе представляло интерес исследовать изменения проницаемости кишечной стенки для жизнеспособных микроорганизмов в условиях ЭД. Для изучения транслокации бактерий в асептических условиях у подопытных животных брали образцы печени, селезенки, легких, почек, тимуса, а также периферической крови. Гомогенизированную суспензию полученных образцов высевали на диагностические среды для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов и оценки их количества.

В высевах от мышей с ЭД наблюдался рост лактозоотрицательной флоры (преимущественно lac" E.coli). Наибольшее количество бактерий выявлено в легочной ткани (104 КОЕ/г), посевы из почек мышей содержали 102 КОЕ/г, образцы тимуса и печеночной ткани по 101 КОЕ/г; в крови и селезенке микробов не обнаружено. Для контроля делали высевы тех же органов от здоровых животных, при этом транслокации жизнеспособных бактерий не выявлено.

Бактериальная транслокация лактозонегативной кишечной палочки происходила на фоне достоверного повышения доли последней в просветной и, особенно, в пристеночной микрофлоре кишечника подопытных животных. Наиболее вероятными органами-мишенями для развития септических осложнений при дисбиозе, следует признать легкие и почки.

Полученные экспериментальные данные подтверждают факт увеличения проницаемости стенки желудочно-кишечного тракта для сапрофитных и условно патогенных микроорганизмов при ЭД кишечника, на фоне повышения адгезивной способности кишечного эпителия, что может свидетельствовать о снижении резистентности макроорганизма.

Поступление во внутреннюю среду организма микробных антигенов при ЭД не могло не изменить активность факторов неспецифического иммунитета, направленных на поддержание гомеостаза и элиминацию последних.

Изучена взаимосвязь между состоянием биотопа кишечника и функциональным состоянием фагоцитов, цитокинового профиля у здоровых животных при введении штаммов B.subtilis 1719, E.coli М-17, композиции вариант II, а также при ЭД и его коррекции.

Известно, что бактерии - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта при парентеральном введении повышают функциональную активность фагоцитов лабораторных животных (64).

Учитывая, что легкие являются основным органом-мишенью для бактериальной транслокации при ЭД, исследовано функциональное состояние альвеолярных макрофагов мышей при пероральном введении штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 и их комбинации вариант II у мышей с ЭД и здоровых животных.

Пероральное введение пробиотических штаммов у здоровых животных оказывало стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов, усиливая поглотительную и переваривающую способность клеток. При ЭД без коррекции отмечалось значительное снижение переваривающей способности альвеолярных макрофагов (ИПС) при сохранной поглотительной функции (ФЧ). Это может быть расценено как незавершенный фагоцитоз (36, 70).

Помимо макрофагальных клеток, исследовали состояние нейтрофилов периферической крови, а именно, их окислительно-восстановительную способность к NADPH-зависимой продукции активных форм кислорода в НСТ-тесте у здоровых животных, у мышей с ЭД, а также его коррекции.

Установлено достоверное повышение активности нейтрофилов при ЭД относительно интактных животных (на 30%). Уровень цитохимической активности нейтрофилов у здоровых животных и мышей с ЭД, получавших перо-рально B.subtilis 1719, а также композицию вариант П, достоверно не различался с таковым у животных, не получавших препараты.

Применение штамма E.coli М-17 в дозе 1,0х109 ОЕ/мл достоверно снижало способность к «кислородному взрыву» нейтрофилов здоровых животных и животных с ЭД.

С целью определения роли регуляторных медиаторов в реализации неспецифического ответа макроорганизма, исследовали цитокиновые события, происходящие при введении пробиотических культур, а также при ЭД и его коррекции.

На первом этапе изучали цитокиновый профиль (TNF-a, IL-1 (3, IL-6, IL-4, IL-12, IFN-y, IL-10, IL-2) в течение первых суток после введения пробиотических штаммов E.coli М-17, B.subtilis 1719 и композиции вариант II здоровым животным.

Исследование цитокинового профиля в течение первых суток после пе-рорального введения здоровым животным изучаемых пробиотических штаммов показало, что значимые цитокиновые события развивались не ранее 6 часов после введения культур. Установлена способность штамма B.subtilis 1719 индуцировать экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов, что свидетельствовало о его иммуностимулирующих и иммуномодулирую-щих свойствах.

Изучение экспрессии цитокинов при ЭД и его коррекции осуществляли на примере провоспалительного фактора некроза опухоли (TNF-a) и противовоспалительного интерлейкина IL-10. Фактор некроза опухоли TNF-a является ключевым провоспалительным медиатором системного действия и более чем трехкратное повышение его содержания при ЭД относительно ин-тактных животных (83,1+9,1 pg/ml и 23,5+3,2 pg/ml соответственно) может быть расценено как системная воспалительная реакция в ответ на микроэкологические нарушения в биотопах желудочно-кишечного тракта (3, 14, 56, 68, 70).

При коррекции ЭД пробиотическими штаммами E.coli М-17 и B.subtilis 1719 в дозе 1,0x109 ОЕ/мл, а также выбранной бактериальной композицией уровень фактора некроза опухоли достоверно снижался. При пероральном введении данных штаммов наблюдалось выраженное повышение содержания IL-10 относительно интактных животных и животных с нелеченным ЭД. Можно предположить, что коррекция ЭД пробиотическими культурами способствовала уменьшению воспалительной защитной реакции макроорганизма посредством стимулирования выработки регуляторного цитокина IL-10.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена сложная система влияния изучаемых штаммов и их композиции на состояние биотопов кишечника лабораторных животных в условиях ЭД. При изучении процессов, протекающих в организме на модели ЭД, под влиянием штаммов B.subtilis 1719 и E.coli М-17 и их композиции показано их корригирующее и иммуномодулирующее действие.

Следует отметить, что к основным факторам пробиотического действия штамма E.coli М-17 относятся высокая адгезия, приводящая к колонизации преимущественно толстого кишечника, антагонизм, наиболее выраженный к УПМ, относящихся к роду Enterobacteriaceae, а также конкуренция за питательные субстраты и иммуностимулирующий эффект ЛПС.

В отличие от кишечной палочки, основные эффекты B.subtilis 1719 определяются активным прорастанием спор и продукцией антибиотикоподоб-ных веществ, экзоферментов и других БАВ в просвете тонкого кишечника, что приводит к подавлению широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая грибы рода Candida и S. aureus, а также выраженным иммуномодулирующим эффектом.

Основываясь на дополняющих спектрах антагонистической активности и действии изучаемых штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 на разных уровнях ЖКТ, показана возможность создания комбинированного пробиотика на их основе, обладающего комплексным действием, перспективного для дальнейшего доклинического и клинического изучения.

79

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гайдеров, Андрей Александрович, 2007 год

1. Алешкин В.А., Тихонова Н.Т. и др. Новое направление бактериотера-пии комплексные пробиотики // Пробиотические микроорганизмы -современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. - М., 2002. - с.47.

2. Бабаева Т.А. Морфолого-культуральные и физиологические свойства спорообразующих бактерий // Уч. зап. Азерб. ун-та. Сер. биол. н. -1973. № 4. - с.22-28.

3. Бельмер С.В., Симбирцев А.С., Головенки О.В., Бубнова J1.B., Карпина J1.M., Щиголева Н.Е., Михайлова T.J1. «Значение цитокинов в патогенез воспалительных заболеваний толстой кишки у детей» // Русский медицинский журнал, 2003, 11(3), с. 116-119.

4. Бланков Б.И., Казьмина Ю.Г. Особенности антагонистической активности E.coli М-17// В кн.: Кишечные и воздушно-капельные инфекции. Труды МНИЭМ. 1969, Т.13. с.387.

5. Бонд В.М, Горская Е.М. Новые подходы к моделированию, диагностике и лечению дисбактериозов кишечника//Мед аспекты микробной экологии, 1992, вып 6.- с.23-26.

6. Бондаренко А.В., Бондаренко Вл.М., Бондаренко В.М. Пути совершенствования этиопатогенетической терапии дисбактериозов, // Журн. микробиол. -1998. № 5. - с.96 -101.

7. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника у взрослых//КМК Scientific Press. -М., 2003,- 220 с.

8. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотиче-ской функцией.//Журн.микробиол.- 2004. -№1. с.84-92.

9. Бондаренко В.М. и Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как кли-нико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы//М., -ГЭОТАР-Медиа», 2007.- 304 с.

10. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г., Воробьев А.А. Иммунорегуляция численности грамотрицательной микрофлоры кишечника. //Журн.микробиол.- 2004. -№4. с.90-93.

11. Бочков И.А., Трофимов О.Д., Дарбеева О.С. и др. Упрощенная методика подсчета микроорганизмов при изучении аутофлоры человека// Лаб Дело, -6.- с.43-47, 1988.

12. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.Б., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов //Лаб. Дело. -1986. -№ 4. -с.210-212.

13. Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Ковальчук Л.В. «Роль про- и противовоспалительных цитокинов в иммунной адаптации новорожденных детей», // Int. J. Immunorehabilit. 2000, 2 (1), с. 175-184.

14. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дис-бактериозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН. -1997. -№ 3. -с.3-9.

15. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунол. 1999. - № 6. - с.102 - 105.

16. Гатауллин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков // М., 2005, Автореф. канд. дисс., 24.с

17. Горская Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника. //Антибиотики и микроэкология человека. М. -1987. -с.79-82.

18. Горская Е.М., Манохина И.М., Горелов А.В., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Методические рекомендации по определению адгезии бактерийкишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника// М.- 1989.- 7 с.

19. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.// Научн. доклад на соискание степени док. мед. наук,- Москва.- 1994.- 53 с.

20. Грачева Н.М., Колганова Н.А., Щербаков И.Т. с соавт. Микробная экология и состояние слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями//Журн.микробиол,- 2004 -№2.- с.79-81.

21. Гриценко В. А., Бухарин О. В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека.// Журн.микробиол.- 2000.- № 3 -с. 92-99.

22. Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов// Итоги науки и техники.- ВИНИТИ.- Микробиология.- 1985.- Т. 16.- 107 с.

23. Зацепин Ю.К. Профилактическая и санирующая эффективность бифи-думбактерина и колибактерина при кишечных заболеваниях детей раннего возраста. / Автореф. канд. мед. н. М.-1972. - 27 с.

24. Запруднов A.M., Мазанкова JI.H. // Микробная флора кишечника и про-биотики. М., 1999.

25. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Бондаренко В.М. Модуляция иммунной системы лактобактериями.//Журн.микробиол., 2004, № 6, с.57-60.

26. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. //«Система цитоки-нов», М., 1999, с.74.

27. Коршунов В.М., Володин Н.Н., Ефимов Б.А. и др. // Микроэкология желудочно-кишечного тракта. Коррекция микрофлоры при дисбакте-риозах кишечника. М., 1999.

28. Колганова Т.В., Ватанабэ X., Далин М.В., Васильева Е.А., Осипова И.Г., Лившиц В.А., Лукьянова О.Ю., Евлашкина В.Ф. К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков. // Сб.тр.: Биомедицинские технологии. Вып. 16, М. -2001. - с.23-29.

29. Кочурко Л.И., Лиходед В.Г., Лобова ЕА. Показатели иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактерио-зах//Журн. микробиол.- 1998.- №5.-с.25-27.

30. Лахтин В.М., Алешкин В.А., Лахтин М.В. и др. Лектины, адгезины и лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидобактерий//Вестник РАМН. 2006. - №1. -с.28-35.

31. Леванов А.В. Феномен бактериальной транслокации условно патогенных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта // Антибиотики и химиотерапия. —2001. — Т. 46, № 5. — с.28 30.

32. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. с соавт. Состояние анти-эндотоксинового иммунитета при экспериментальном кишечном дис-бактериозе у мышей.// Журн. микробиол.-1998.- №4.- с.14-16.

33. Лыткова Е.А., Характеристика и алгоритм применения пробиотиков // Медицинский научный и учебно-методический журнал, 2005, № 27, с. 146-177.

34. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. // Очерки о нейтрофиле и макрофаге -Новосибирск: Наука, 1983- 257 с.

35. Малик Н.И., Панин А.Н., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био №3(18), март 2002.

36. Методические рекомендации: Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника. М., 1986. -23 с.

37. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. Лечебно-профилактический биопрепарат «Бактиспорин» // Патент РФ №2130316 , С12 N112011 (С 12N 1/20, С12 Rl:125) Заявка 23.01.97, опуб. 20.05.99. Был.№14

38. Никитенко В.И. Медицинский институт Оренбурга представляет препарат споробактерин // JAMA. 1991. - 64, № 1. - с.31.

39. Никитенко В.И., Захаров В.В., Бородин А.В. и др. Роль транслокации бактерий в патогенезе хирургических инфекций// Хирургия, 2001, №2, с 63-66.

40. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М., 2004; Роль цитокинов в модуляции иммунореактивности организма бактериями рода Lactoba-cillus./Журн.микробиол., 2004, №6, с.101-106.

41. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. // Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. -М. 2002 - с.608.

42. ОСТ 91500.11.0004-2003: «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» утв. МЗ РФ № 231 от 09.06.2003.

43. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля. // Ав-тореф. дисс. канд.биол.наук.- М., 1997.- 25 с.

44. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева JLВ.Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии,- 1998. №6. -с.68-70.

45. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков. // Автореф. дисс. докт.биол.наук.- М., 2006.- 48 с.

46. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И Б. и др.//Журн. микро-биол. 2003 - №3. - с. 113-119.

47. Перетц Л.Г. // Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М.: Медгиз, 1965, -435 с.

48. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.: Медицина, 1976. - 217 с.

49. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колонизационной резистентности.//Антибиотики и колонизационная рези-стентность./Труды ВНИИ антибиотиков .- М. -1990. -вып.Х1Х. с. 1525.

50. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бактериоце-ноза кишечника, их конструирование и применения. Автореф. докт.мед.наук. -М., 1979. 38 с.

51. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. с соавт. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека.//Иммунобиол. препараты. -М. -1989. с. 142-152.

52. РД 42-28-8-89 Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения/ М-во здравоохранения СССР. Москва, 1989. - 31с.

53. Резник С.Р., Слабоспицкая А.Т., Смирнов В.В. Некоторые биологические свойства бактерий рода Bacillus, выделенных из организма людей // Микробиол. журн. 1985. - 47, № 3. - с.53-59.

54. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., // Иммунология, пер. с англ. М.: Мир, 2000, 592 с.

55. Салливан А., Норд К. Место пробиотиков в терапии инфекций желудочно-кишечного тракта у человека.// Клинич.микробиол.и антимикробная химиотерапии.- 2003.-№3.- Т.5.- с.275-284.

56. Смирнов В.В., Резник С.Р. Бактерии рода Bacillus продуценты антибиотиков // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - М.: Медицина, 1982. - с.53.

57. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982. - 279 с.

58. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных// Киев.- 1983.- 51с.

59. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактериемии // Мик-робиол. журн. 1988. - 50, № 5 - с. 56-59.

60. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992.- 54, № 6. с.82-94.

61. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов//Антибиотики и химиотерапия, 1998, 43:2 с.20-23.

62. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиоти-ков/Дис.док.биол.наук., Киев., 1999., 180 с.

63. Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Терешкина Н.В., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Изучение безопасности бацилл-пробиотиков// Вестн.РАМН №1,2006.- с.50-54.

64. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования// Под ред. Биргера М.О. М.: Медицина, 1982. - с. 170-172.

65. Хавкин А.И. «Микробиоценоз кишечника и иммунитет». // Русский медицинский журнал, 2003, 11(3), с. 122-125.

66. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. «Иммунная система ЖКТ: особенности строения и функционирования в норме и патологии». // Иммунология, 1997, № 5: с.4-77.

67. Хромова С.С., Ефимов Б.А., Тарабрина Н.П., Шкопоров А.Н., Кафар-ская Л.И., Сепиашвили Я.Р., Иммунорегуляция в системе микрофлора- интестинальный тракт. // Аллергология и иммунология, М., 2004, т. 5, № 2, с.265-271.

68. Царегородцева Т.М., Серова Т.И. // Цитокины в гастроэнтерологии. М., «Анахарсис», 2003, 96 с.

69. Чупринина Р.П. Биопрепараты: требования к отбору производственных штаммов, оценка показателей, проблемы стандартизации // Пробиоти-ческие микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. - М ., 2002. - с. 10 -11.

70. Чупринина Р.П. Сб. "Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования". Межд. научно-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. - М. - 2002 - с. 10.

71. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., "Издательство Грантъ", 1998.- 287с.

72. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. T.III: Пробиотики и функциональное питание. М, 2001. -288с.

73. Шимчук Л.Ф. Стандартизация колибактерина.// Автореф. кан.биол.н. -М.-1983.-22 с.

74. Экология микроорганизмов человека. Под редакцией Бухарин О.В., Екатеринбург: УрО РАН, 2006, 479 с.

75. Aguillar-Nascimento JE., Prado S., Zaffani G., et al., Perioperative administration of probiotics effects on immune response, anastomotic resistance and colonic mucozal trophism; // Acta Cir Bras, 2006, 00; 21, p.80-83.

76. Albot G., Bernard-Bruker N. Nouvean traiment des diarrhes par les emulaions de Bacillus subtilis // Exrait. de la Semaine des Hop. de Paris. -1950. N 5. -p.613-623.

77. Alexopoulos C., Karagiannidis A., Kritas S. K., et al. Field Evaluation of a Bioregulator Containing live Bacillus cereus Spores on Health Status and Performance of Sows and their Litters// J. Vet. Med. 2001, A 48, p. 137-145.

78. Alvarez-Olmos M. I., Oberhelman R.A. Probiotic Agents and Infectious Diseases: A Modern Perspective on a Traditional Therapy//CID 2001:32 (1 June), p. 1567-1576.

79. Asahara T, Nomoto K, Watamiki M et al. Antimicrobial activity of intraure-ally administrated probiotic L.casei in a murine model of E.coli UTI// J.Antimicrob.Agents.Chemother., Jun 2001, 45(6):1751-1760.

80. Bai X, Liu X, Su Y. Inhybitory effects of intestinal mucus on bacterial adherence cells after surface .burns// Clin. Med. J., May, 2000, 113(5):449-450

81. Bailey MT, Сое CL. Maternal separation disrupts the integrity of the intestinal microflora in .infant rhesus monkeys// Dev Psychobiol Sep; 1999, 35(2): p. 146-55.

82. Baldson M.J. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases //Scand. J. Infect. Dis. -1983. -Suppl. 40. p. S101-S102.

83. Beaumont M. Flavouring composition prepared by fermentation with Bacillus spp.// International Journal of Food Microbiology 75 (2002) p. 189- 196.

84. Benedettini G., Delibero G., Pierotti R. et al Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1983. -62, N 6. - p.509-516.

85. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract: the role of probiotic flora. Gut 1998; 42: p.2-7.

86. Benno J., Mitsuoka T. Bifidobacteria and microflora // Development of intestinal microflora in human and animals. 1986.- 5, N1.-p. 13 -25.

87. Benoni G. Antibiotic administration and oral bacterial therapia in infants // Chemioterapia. 1984. - 3, N 5. - p.291-294.

88. Berg R.D. Bacterial translocation from the intestines//Jikken Dobutsu, 1985, 34:1 :p.l-16.

89. Berg R.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract//Appl. Enyi-ron. Microbiol. -1995. -Vol.3, №4. p.149-154.

90. Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology:Vol.l., 3 /Ed. N. R. Krieg, H. G. Holte- Baltimore etc.: Williams & Wilkins . 1986. p.965-1600.

91. Bernet M.F., Brassart D., Neeser J-R., Servin A. Adgesion of human bifidobacteria! strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interaction // Appl. Environm. Microbiol. 1993. - 59. -p.4121-4128.

92. Blum S., Alvares S., Haller D. «Intestinal microflora and the iteration with immunocompetent cells» // Antonie van Leewenhoek. 1999, 76, p. 199-205.

93. Cartman S.T. and La Ragione R.M. Spore probiotics as animal feed supplements //In: Bacterial SPORE Formers: Probiotics and Emerging Application (Ricca, E., Henrigues, A.O. and Cutting, S.M., Eds).- 2004. p. 155161.

94. Campbell N., Yio X.Y. «The intestinal epithelial cell: processing and presentation of the antigen to the mucosal immune system». // Immunol. Rev. 2000, 172: p.315-324.

95. Casula G, Cutting SM. Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2002;68:2344-52.

96. Claudia Di Giacinto, Mariarosaria Marinaro, Massimo Sanchez et al., Probiotics ameliorate recurrent Thl-mediated murine colitis by indusing IL-10 and IL-10-dependent TGF-(3-bearing regulatory cells, //The Journal of Immunology, 2005, 174, p.3236-3246.

97. Collins M.D., Gibson G.R.//Am.J.CIin.Nutr. 1999 -Vol. 69-pp. 10521057.

98. Coppi F.// Results of treatment with Bacillus subtilis spores (Enterogermina) after antibiotic therapy in 95 patients with infection calculosis // Chemi-oterapia. 1985.- 4, N 6. - p.467-470.

99. Cutting S.M. Spores as oral vaccines// Ricca E., Henriques A.O., Cutting S.M., eds. Bacterial spore formers: proboitics and emerging application. Narfolk, UK: Horizon Bioscences Press; 2004.- p.201-206.

100. Due L. H., Hong H. A., Barbosa T.M. et al. Characterization of Bacillus Probiotics available for human use.//App. and Environmental. Macrobiol., Apr. 2004, V.70, № 4, p.2161-2171.

101. Dunne С., O'Mahony L., Murphy L. et al. In vitro selection criteria for pro-biotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings J/Am J Clin Nutr 2001;73(suppl):386S-92S.

102. Elliott S.J., Krejany E.O., Mellies J.L. et al. Esp G., a novel type III system-secreted protein from Enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigella flexneri// Infect Immun, 2001, Jun, 69(6):4027-4033.

103. Fasoli S., Marzotto M., Rizzotti L. et al. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis/ International Journal of Food Microbiology 82 (2003), p. 59-70.

104. Fiorini G., Cimminello C., Chianese R. et al. Bacillus subtilis selectively stimulates the synthesis of membrane bound and secreted IgA // Chimi-oterapia. 1985. - 4. - p.310-315.

105. Fuller R. Probiotics in human medicine //Gut. 1991. - 32, N 4. - p.439-442.

106. Fuller R. // Probiotics: prospects of use in opportunistic infections. N.Y -1995.

107. Fuller R. History and development of probiotics // Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - p. 1-9.

108. Fuller R., Gibson G.R. Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - 32, Suppl. n 222. -p.28-31.

109. Green D.H., Wakeley P.R., Page A., et al. Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 1999;65:4288-91.

110. Guarner F., Malagelada J-R. «Gut flora in health and disease» // lancet, 2003, 361, p.512-519.

111. Havenaar R., Ten Brink В., Huis in't Veld JHJ. Selection of strains for pro-biotic use//Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - p.209-224.

112. Hentges D.J. (Ed.) Intestinal microflora in Health and Disease.-N.Y-1983.

113. Hefco G., Rugina V., Olteanu Z. et al. The influence of various carbon source on the fermentation with a-amylase producing strains of B. subtilis// An. sti. Univ. Iasi. Sci. 1996. - 42. - p. 141-146.

114. Henry R., Mielle F., Morh H. Le Bacillus subtilis en therapeutique intestinale // Gaz. Med. France. 1950. - 57, N 10. - p.537-541.

115. Hill M.J. «The normal Gut Bacterial Flora, On the Role of Gut Bacteria in Human Toxicology and Pharmacology» (London: Taylor&Francis) 3-17, 1995.

116. Hoa NT, Baccigalupi L, Huxham A, et al. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 2000; 60:5241—7.

117. Hoerr R.A., Bostwick E.F. Bioactive Proteins and Probiotic Bacteria: Modulators of Nutritional Health//Nutrition Volume 16, Numbers 7/8, 2000: p.711-713.

118. Holzapfel W.H., Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics.//Food Research International 35(2002).- p. 109-116.

119. Hong H.A. Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore as probiotics// FEMS Microbiol. Reviews 29 (2005).- p.813-835.

120. Hosoi T, Amenati A, Kiuchi K, Kaminogawa S. Changes in fecal microflora induced by intubation of mice with Bacillus subtilis (natto) spores are dependent upon dietary components. Can J Microbiol 1999;45: p.59-66.

121. Hunter J.O., Madden J.A//Br.J.Nutr. 2002 - 88 (suppl. 1)- p.67-72.

122. Ishibashi N, Yamazaki S. Probiotic and safety// Am J Clin Nutr, 2001, 73 (suppl), p.4659-4709.

123. Isolauri E. Probiotics in human disease// Am J. Clin Nutr 2001 ;73 (suppl): 1142S-6S.

124. Joint FAO/WHO group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. 2002. p. 1-11.

125. Kakkos S.K. et al. Nonabsorbable antibiotics reduce bacterial and endotoxin translocation in hepatectomised rats HPB// Surg, 1997, 10:5:283-289-291.

126. Kalliomaki M.A., Isolauri E., Probiotics and down-regulation of the allergic response, // Immunol Allegy Clin Am., 2004, Nov., 24 (4), p.739-752.

127. Kalliomaki M., Salminen S., Arvilommi H. et al. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trialIILancet 2001; 357: 1076-79.

128. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible function // Bacteriol. Rev. 1977. - 41, N 2. - p.449-474.

129. Kruis W et al. Double-blind comparison of an oral E.coli preparation and mesalazine in maintaining remission of ulcerative colitis. Aliment Prarmacol Ther. 1997:11: p.853-858.

130. Lammers К. M., Helwig U., Swennen E., et al. Effect of Probiotic Strains on Interleukin 8 Production by HT29/19A Cells//The Americ. of Gastroent. 2002- V.97. №5. - p. 1182-1186

131. Lawrence C., Nauciel C. Production of interleukin-12 by murine macrophages in response to bacterial peptidoglycan// Infect. Immun. 1998. - 66, N 10. - p.4947-4949.

132. Luc R.G. La importancia del Bacillus subtilis en la terapeutica intestinal // Med. Clin. 1958. - 31, N 9. - p.420-424.

133. Marteau P., Rambaud J-C. Potential for using lactic acid bacteria for therapy and immunomodulation in man // FEMS Microbiol Rev. 1993. - 12. - p. 207-220.

134. Marteau P., Seksik P. Jian R. Probiotics and intestinal health effects: a clinical perspective //British Journal of Nutrition (2002), 88, Suppl. 1, S51-S57

135. Marteau P., Boutron-Ruault M. C. Nutritional advantages of probiotics and prebiotics//British Journal of Nutrition (2002), 87, Suppl. 2, S153-S157.

136. Marshall J., Sweeney D. Microbial infection and the septic response in critical surgical illness: sepsis, non-infection, determines outcome. Arch Surg 1990; 125: p. 17-23.

137. Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal antigen presentation. Pedi-atr Gastroenterol Immunol 2000; 30(Suppl):S4-S12.

138. Mazza P. The use of Bacillus subtilis as an antidirrhoeal microorgan-ism//Boll. Chim. Farm. -1994. 133. -p.3-18.

139. Mcfarlane G, Cummings JH. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? BMJ 1999; 318: p.999-1003.

140. McGhee JR, Lamm ME, Strober W. Mucosal immune responses: an overview. In: Pearay LO, ed. Mucosal immunology. San Diego: Academic press, 1999: p.485-506.

141. Mombelli Barbara, Gismondo Maria Rita. The use of probiotics in medical practice, // International Journal of Antimicrobial Agents, 16 (2000), p.531-536.

142. Muscettola M., Grasso G., Migliaccio P., Gallo V.C. Plasma interferon-like activity in rabbits after oral administration of Bacillus subtilis spores // J. Chemother. 1991. - 3, Suppl. 3. - p.130-132.

143. Neutra M.R., Kraehenbuhl J-P. «Regional Immune Response to microbial pathogens» // «Immunology of Infections Disease» (Eds. S.H.E. Kaufmann, A.Sher, R. Ahmed) (Washington: ASM Press USA) 2002, p.495.

144. Nomoto K., Yokokura Т., Mitsuyama M. et al. Prevention of indigenous infection of mice with Escherichia coli by nonspecific immunostimulation // Antimicrob. Agents and Chemother. 1992. - 36, N 2. - p.361-367.

145. Nozaki-Renard J. Induction d'interferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - 129a, N 4. - p.525-543.

146. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Curr. Issue Intest.Microbiol. 2001 - 2(1) -p.27-42.

147. Perdigon G., Alvarez S., Rachid M. et al. Symposium: probiotic baceria for humans: clinical systems for evaluation of effectiveness. Immune system stimulation by probiotics // J. Dairy Sci. 1995. - 78, N 12. - p.1597-1606.

148. Perdigon G., Alvarez S., Nader de Macias M.E. Lactobacilli administered orally induce release of enzymes from peritoneal macrophages in mice // Milchwiss. 1986. - 41, N 6. - p.344-348.

149. Prokesova L., Novakova M., Mara M. Effect of Bacillus firmus and other sporulating aerobic microorganisms on in vitro stimulation of human lym-phocytis // Folia Microbiol. 1994. - 39. - p.501-504.

150. Quigley E.M., Flourie В., Probiotics and irritable bowel syndrome: a rationale for their use and an assessment of the evidence to date. // Neurogastroen-terol Motil, 19 (2007), p. 166-172.

151. Relid Gregor, Hammond Jo-Anne. Probiotics. Some evidence of their effectiveness, Canadian Family Physician, vol.51, November 2005, p.1487-1493.

152. Rocchietta J. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases // Minerva Med. 1969. - 60, N 3/4. - p.l 17-123.

153. Rodney D., Berg P.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract //Медицинские аспекты микробной экологии. -М., 1993/1994.- Вып. 7/8, 4.1. -р.53-70.

154. Salminen S, Isolauri Е, Salminen Е. Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 1996;70: p.47-58.

155. Sallustro F. «Chemokines and chemokine receptors in T-cell priming and Thl/Th2 mediated responses» // Immunol.Today 19: p.568-574.

156. Senesi S. Bacillus spores as probiotic products for human use// In: Ricca E., Henriques A.O., Cutting S.M., eds. Bacterial spore formers: probiotics andemerging application. Norfolk, uK: Horizon Bioscences Press; 2004. -p. 131-141.

157. Shanahan F.//Probiotics in inflammatory bowel disease. Gut. 2001 - 48 (5) - p.609.

158. Tannock G.W. The normal microflora: new concepts in health promotion // Microbiol. Sci. 1988. - 5, N1. - p.4-8.

159. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am.J.Clin.Nutr. 2001,73 (suppl):410-414.

160. Van der Waaij D. Antibiotic choice: The importance of colonization resis-tance.//N.Y.:Acadlmic Press. -1983. -p.298.

161. Wei H., Kan E. Bacillus cereus "Cereobiogen" as a growth promoter of Bifidobacterium in infantile diarrhea therapy// Recent advances in germfree research. Tokyo: Tokai University press, 1981. - p.475-480.

162. Wu C. Li Z., Xiong D. Relationship between enteric microelogic disbiosis and bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis// World J Gastroenterol, Jun 1998, 4(3) p.242-245.

163. Yasui Hisako, Kan Shida «Immunomodulatory function of lactic acid bacteria», // Antonie van Leewenhoek. 1999, 76: p.383-389.