Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.12, кандидат наук Абрамова, Светлана Леонидовна

• Абрамова, Светлана Леонидовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Абрамова, Светлана Леонидовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ПЦР в диагностике фитопатогенов

1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем,

основанным на методе ПЦР

1.1.2 Возможные ошибки и ограничения в применении метода

ПЦР для диагностики фитопатогенов

1.2 Метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH

1.3 Краткая характеристика биологических свойств и

вредоносности грибов, являющихся объектами

исследования, и трудности их идентификации

1.4 Системы идентификации исследуемых видов, основанные

на методе ПЦР

1.4.1 ПЦР-системы для идентификации видов S. tritici и S.

nodorum

1.4.2 ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, F.

culmorum, F. sporo trie hi о ides, F. avenaceum, F. tricinctum, F.

poae, F. langsethiae

1.4.3 ПЦР-системы для идентификации видов P. striiformis и P.

graminis

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.2 Методы

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка системы идентификации видов tritici и S.

nodorum

3.1.1 Подбор праймеров для идентификации видов S. tritici и S.

nodorum и проверка их видоспецифичности

3.1.2 Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной

детекции видов S. tritici и S. nodorum

DO

3.2 Разработка системы идентификации грибов рода Fusarium

3.2.1 Подбор праймеров для идентификации видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae и проверка их видоспецифичности

3.2.2 Подбор и проверка ПЦР-зондов для флуоресцентной детекции видов рода Fusarium

3.3 Подбор праймеров для идентификации видов Р. graminis и

Р. striiformis и проверка их видоспецифичности

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Та - температура отжига олигонуклеотида.

Тш — температура плавления олигонуклеотида.

ITS — Internal transcribed spacer (внутренний транскрибируемый

спейсер).

tefla - Tranclation elongation factor 1-alpha (фактор элонгации трансляции 1-альфа). рРНК - рибосомальная РНК. /3-tub — ген р-тубулина.

ГенБанк — база данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). п.н. - пар нуклеотидов.

dNTPs - deoxyribonucleotides (дезоксинуклеотидтрифосфаты). ВК — внутренний контроль.

FLASH — Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция).

К- - отрицательный контроль. К+ - положительный контроль.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Болезни сельскохозяйственных растений, вызываемые грибами, наносят существенный ущерб урожаю и приводят к экономическим потерям (Eyal, 1999; Санин и др., 2010). Применение интенсивных технологий при возделывании зерновых культур зачастую приводит к ухудшению фитосанитарной ситуации не только с наиболее распространенными и вредоносными грибами, такими как Septoria tritici и Stagonospora nodorum и возбудителями корневых гнилей и фузариоза колоса из рода Fusarium (Иващенко и др., 2004; Санин и др., 2010), но также способствует расширению ареала и увеличению вредоносности возбудителей ржавчины Puccinia striiformis и Р. graminis (Назарова и др., 2008).

Для своевременного применения средств защиты растений от болезней и контроля зараженности зерна фитопатогенными грибами на разных стадиях его производства и переработки необходима их детекция и точная идентификация (Kristensen et al., 2005; Lievens et al., 2005). В полевых условиях предварительный диагноз болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, ставят по проявлению симптомов заболевания, а точную идентификацию возбудителя проводят в лаборатории главным образом по морфологии спор и другим морфолого-культуральным признакам патогена с применением методов микроскопии и культивирования на питательных средах. Однако, морфологические характеристики спор у близкородственных видов микромицетов могут совпадать, а внутри одного вида значительно варьировать. Кроме того, симптомы болезни могут проявляться нетипично или заболевание может проходить в скрытой форме (Пыжикова, 1984; Иващенко и др., 2004; Shcherbakova, 2007). В связи с этим применение более чувствительных методов является актуальным и востребованным в диагностике фитопатогенов.

В последние годы для идентификации и детекции фитопатогенных микроорганизмов все чаще применяется метод ПЦР. Он превосходит

традиционные методы по специфичности, чувствительности, быстроте проведения анализа, производительности, и служит их существенным дополнением. Кроме того, его применение не требует глубоких знаний биологии и морфологии исследуемых микромицетов (McCartney et al., 2003; Lievens et al., 2005).

Усовершенствование методов секвенирования и создание электронных баз данных, хранящих информацию о структуре геномов различных фитопатогенов (Geiser et al., 2004; Geer et al., 2010), дает возможность при разработке видоспецифичных праймеров наиболее полно учитывать и использовать вариабельность анализируемых последовательностей нуклеотидов. Это обеспечивает высокую специфичность диагностическим системам, создаваемым на их основе.

Среди методов, основанных на полимеразной цепной реакции, одним из наиболее адаптированных для практического применения является метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция). Использование флуорогенных зондов повышает чувствительность метода. Детекцию флуоресценции проводят сразу после окончания амплификации, что существенно ускоряет процесс получения результатов, по сравнению с электрофорезом в геле. Кроме того, при соблюдении правил работы исключается возможность контаминации рабочей зоны продуктами амплификации, а программное обеспечение облегчает сбор и хранение информации о проводимых тестах. Наличие внутреннего контроля (ВК) прохождения реакции повышает надежность метода и позволяет контролировать появление ложноотрицательных результатов.

Метод FLASH-ПЦР ранее был применен для создания систем диагностики фитопатогенных вирусов, бактерий, нематод и грибов, в том числе и карантинных (Кулинич и др., 2008; Рязанцев, 2009; Рязанцев и Завриев,_2009).

Цель и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы являлась разработка праймеров и зондов для идентификации грибов -возбудителей септориоза (Septoria tritici, Stagonospora nodorum), фузариозов (Fusarium graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F. poae, F. langsethiae), желтой (Puccinia striiformis) и стеблевой (P. graminis) ржавчины зерновых культур. Основные задачи:

1. Выявить в геноме исследуемых грибов локусы, наиболее перспективные для их идентификации.

2. Разработать праймеры для идентификации и диагностики исследуемых видов.

3. Оптимизировать условия ПЦР с разработанными праймерами и проверить их специфичность на изолятах исследуемых видов грибов, собранных на территории РФ.

4. Разработать зонды и оптимизировать условия ПЦР для диагностики возбудителей септориоза и фузариоза в формате FLASH.

Научная новизна исследований. Разработаны высокоспецифичные праймеры для основанной на ПЦР идентификации и диагностики одиннадцати видов экономически значимых грибных патогенов зерновых культур. Для девяти из них сконструированы зонды и создана система детекции с помощью ПЦР в формате FLASH, что позволило сократить время анализов и обеспечить надежную и точную идентификацию фитопатогенов.

Практическая значимость исследований. Разработанные праймеры и зонды стали основой для создания и внедрения в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология» коммерческих наборов для идентификации и детекции возбудителей септориоза и фузариозов методом ПЦР в формате FLASH, а, впоследствии, и для наборов в формате ПЦР в реальном времени. Праймеры для идентификации возбудителей ржавчины подобраны с учетом требований к системам детекции в формате FLASH и могут быть

использованы для разработки таких систем.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Россия, 2008) и на семинаре «Школа молодых ученых и аспирантов по молекулярной биологии - NOVA» (Финляндия, 2008).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ПЦР в диагностике фитопатогенов

Со времени разработки в 1980-х годах, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) стал основным методом молекулярной диагностики фитопатогенов (КтгепБеп е1 а1., 2005; Ыеуеш е! а1., 2005). Тем не менее, хотя метод ПЦР широко используется в академических исследованиях, применение его в сельскохозяйственной практике все еще ограничено. Существует необходимость в разработке коммерчески доступных тест-систем для диагностики методом ПЦР карантинных объектов, а также экономически значимых фитопатогенов для принятия своевременных решений о проведении защитных мероприятий. Однако, до применения на практике, разработанные системы детекции должны быть приведены в соответствие с различными требованиями.

1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем, основанным на методе ПЦР

При разработке систем диагностически фитопатогенов на основе метода ПЦР для необходимо учитывать факторы, касающиеся специфичности, чувствительности и производительности диагностической системы. Кроме того, важны такие факторы, как быстрота проведения анализа, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов (Глеуеш, ТЬошша, 2005).

Специфичность. Применение любого метода диагностики рассчитано на специфичное определение патогена. Одним из существенных преимуществ молекулярных методов диагностики, по-сравнению с традиционными, является возможность различать близкородственные организмы. Для молекулярной диагностики фитопатогенов в качестве мишеней часто используются консервативные гены, нуклеотидные последовательности которых у близкородственных микроорганизмов

зачастую отличаются лишь несколькими нуклеотидными заменами (single-nucleotide polymorphism, SNP). Однако, высокая специфичность методов детекции нуклеиновых кислот, с использованием ПЦР-праймеров и (или) гибридизационных зондов, позволяет выявлять полиморфизм, связанный с этими незначительными различиями (Ward et al., 2004). Это особенно важно для различения близкородственных патогенов.

Очевидно, что специфичность методов детекции нуклеиновых кислот определяется выбором целевой нуклеотидной последовательности. Существует два подхода в выборе гена-мишени. Наиболее распространенный, заключается в выборе такого консервативного гена, для которого известна нуклеотидная последовательность, и который обладает достаточным полиморфизмом. В настоящее время, наиболее часто для диагностики грибов используется рибосомальная РНК (рРНК). Ее интенсивное использование в филогенетических исследованиях привело к накоплению в электронных базах данных нуклеотидных последовательностей этого региона генома для многих видов микроорганизмов (Atkins, Clark, 2004). Это дает возможность проводить более полное сравнение последовательностей и выявлять диагностические регионы, обладающие требуемым уровнем полиморфизма. Кроме того, высокая копийность генов рРНК в любом геноме обеспечивает высокую чувствительность ПЦР при диагностике фитопатогенов. В геноме грибов каждая копия рРНК представлена тремя генами, разделенными внутренними транскрибируемыми регионами (internal transcribed spacers, ITS), которые имеют особое значение для успешной идентификации возбудителей болезней растений. Регионы ITS содержат консервативные и вариабельные области, что позволяет проводить классификацию грибов на разных таксономических уровнях, иногда даже на внутривидовом уровне (Atkins et al., 2003). Тем не менее, нуклеотидные последовательности рРНК не всегда обладают достаточным уровнем вариабельности для различения отдельных видов (Tooley et al., 1996).

Поэтому, альтернативно или в дополнение к системам, основанным на различении ITS-регионов, интенсивно исследуется возможность использования генов «домашнего хозяйства», включая гены бета-тубулина (Fraaije et al., 1999), актина (Weiland, Sundsbak, 2000), и фактора элонгации трансляции 1-альфа (O'Donnell et al., 1998).

Другой подход в выборе целевой нуклеотидной последовательности для детекции фитопатогенов основан на скрининге произвольных частей генома и выявлении среди них последовательностей, потенциально пригодных для диагностических целей. Это достигается при использовании ряда методов, включая метод произвольно амплифицированной полиморфной ДНК (random amplified polymorphic DNA, RAPD) (Williams et al., 1990) и его аналог - метод полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (amplified fragment length polymorphism, AFLP) (Vos et al., 1995). Однако, локализация полученной таким образом нуклеотидной последовательности в геноме остается неизвестной. Для подтверждения специфичности выявленного фрагмента ДНК необходимо не только сравнение его последовательности с геномами других организмов, но и массовый скрининг коллекции близкородственных видов и видов, занимающих ту же экологическую нишу, что и исследуемый (Schaad, Frederick, 2002).

Чувствительность. Высокочувствительная детекция патогена до заражения растений или до развития симптомов болезни важна для предотвращения их инфицирования или сдерживания развития и распространения заболевания а, следовательно, и для уменьшения экономических потерь. Диагностические процедуры должны обладать достаточно высокой чувствительностью. До открытия методов амплификации нуклеиновых кислот, в частности ПЦР, для обнаружения конкретного организма использовались методы, основанные на применении специфичных гибридизационных зондов. Однако, из-за низкой

чувствительности такие методы зачастую приводили к получению «ложноотрицательных» результатов (Ward et al., 2004). Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР дает возможность детекции даже следовых количеств ДНК патогена (Ward et al., 2004). Однако, высокая чувствительность метода может приводить к получению «ложноположительного» результата. Поэтому, для обеспечения достоверности получаемых результатов необходимо строгое соблюдение правил постановки реакции, использование контролей, ограждение образцов и реактивов от возможной ДНК-контаминации через аэрозоли, а также наличие отдельных зон для процедур пробоподготовки и анализа продуктов ПЦР (Kwok, Higushi, 1989).

На практике, для принятия решений о проведении мер по защите урожая, методы более чувствительные, чем традиционная ПЦР, вряд ли потребуются, поскольку пороговый уровень инфекции может быть легко детектирован с помощью ПЦР. Однако, для обнаружения карантинных организмов могут потребоваться молекулярные методы, обладающие более высокой чувствительностью.

Мулътиплексность. Большинство молекулярных диагностических систем, используемых в фитопатологии, разработаны для определения лишь одного целевого патогена. Поскольку возделываемые культуры зачастую поражаются несколькими патогенами одновременно, разработка мультиплексных тестов, способных детектировать несколько микроорганизмов, стала бы существенным достижением. Первые стратегии применения мультиплексной ПЦР задействовали несколько наборов праймеров в одной реакции. Однако, разработка воспроизводимой мультиплексной системы с возможностью различать несколько ампликонов при гель-электрофорезе имеет серьезные технические затруднения (Henegariu et al., 1997; Elnifro et al., 2000). При ПЦР в реальном времени (Heid et al.,

1996) процесс амплификации отслеживается в динамическом режиме, при этом нет необходимости в различии размеров ампликонов. Возможность разработки мультиплексной системы диагностики в этом случае ограничена количеством детекторов флуоресценции в амплификаторе для ПЦР в реальном времени. В результате, при использовании этой стратегии на данный момент возможна одновременная детекция до семи патогенов в одной ПЦР-реакции (Kubista et al., 2006).

Проблема мультиплексности была в какой-то мере решена с появлением технологии гибридизационных чипов. Теоретически, ДНК-чипы, изначально разработанные для изучения экспрессии генов или для получения SNP профилей, могут быть использованы для одновременной детекции неограниченного количества различных организмов (Lévesque, 2001; Lievens et al., 2005; Martin et al., 2000). В фитопатологии этот подход был применен для идентификации оомицетов, нематод, бактерий, и грибов из чистых культур (Fessehaie et al., 2003; Lévesque et al., 1998; Uehara et al., 1999), вирусов (Boonham et al., 2003), a также для детекции патогенов в природных образцах (Nicolaisen et al., 2005; Lievens et al., 2003). Однако, на практике использование этого метода ограничено высокой стоимостью оборудования для детекции результатов и изготовления микрочипа.

Количественный анализ. Количественное определение патогенов в процессе их детекции и идентификации является важным аспектом, поскольку может быть использовано для расчета потенциального риска развития заболевания, распространения инокулюма в пространстве и предсказания экономических потерь, а также для принятия решения о проведении защитных мероприятий. Однако, учитывая нелинейную природу ПЦР амплификации, представляется затруднительным связать количество амплифицированного продукта в реакции с количеством целевой ДНК, изначально содержавшейся в образце. Тем не менее, было показано, что в

результате оптимизации условий ПЦР-методов возможно количественное определение продуктов амплификации в конечной точке.

Разработка ПЦР в реальном времени, при котором происходит измерение количества ампликонов в процессе их аккумуляции в результате каждого цикла реакции, упростило задачу. В настоящее время, ПЦР в реальном времени является наиболее используемой методикой для количественного определения фитопатогенов (Gachón et al., 2004; Schaad, Frederick, 2002), а также для наблюдения за развитием болезни (Brouwer et al., 2003). На данный момент стоимость оборудования для проведения ПЦР в реальном времени ограничивает использование этого метода на практике. Даже появившаяся недавно технология микрочипов имеет ограничения в отношении количественного определения микроорганизмов в комплексных природных образцах, поскольку сигналы, полученные в результате гибридизации, могут варьировать в зависимости от эффективности гибридизации и количества мишени (Wu et al., 2001).

Воспроизводимость. Диагностическая система должна обеспечивать получение воспроизводимого результата. Поэтому, тест-система должна быть оптимизирована и протестирована на целевых и таксономически родственных видах и изолятах фитопатогенов, выделенных с разных видов растений-хозяев или сортов культурных растений из разных географических зон (Lievens, Thomma, 2005). Однако, существуют специфические помехи, которые могут повлиять на воспроизводимость и производительность диагностических систем, основанных на методе ПЦР. Эффективность ПЦР может быть снижена или ингибирована различными природными компонентами, которые присутствуют в окружающей среде и могут попасть в препараты ДНК при ее выделении из образцов (Shcherbakova, 2007). Тем не менее, во многих случаях данные специфические проблемы удается преодолеть путем модификации методов экстракции нуклеиновых кислот

(McCartney et al., 2003) или с использованием оптимизированных наборов для экстракции, с помощью которых можно добиться получения высокоочищенной ДНК из природных образцов сложного состава. Для улучшения воспроизводимости, эффективность ПЦР можно контролировать, добавляя в реакцию экзогенную контрольную ДНК, которая может быть амплифицирована в той же реакции одновременно с тестируемой (Cubero et al., 2002) или параллельно (Lievens et al., 2005).

Достоверность. Во многих случаях, процедуры детекции патогенов разрабатываются для использования в специфических областях исследования. Как следствие, они зачастую бывают оценены лишь для работы в экспериментальных условиях. Шаги, необходимые для оценки новых методов детекции с целью их прямого применения на практике, предпринимаются редко. Эти шаги включают в себя проверку и стандартизацию. Они должны включать также проверку специфичности, чувствительности, воспроизводимости, точности и достоверности результатов детекции. Достоверность должна быть ясно продемонстрирована в слепых тестах в нескольких лабораториях, а интерпретация результатов должна быть четкой и однозначной. Предпочтительно, чтобы процесс проверки проходил под наблюдением международной организации (Stead, 1999).

Скорость. В то время как традиционные методы, основанные на анализе морфологических и культуральных признаков микроорганизмов, отнимают много времени и требуют больших затрат труда, методы молекулярной детекции позволяют получить точные результаты намного быстрее. В целом, большинство молекулярных анализов могут быть проведены в течение одного-двух дней, что, по сравнению с традиционными тестами, существенно сокращает время постановки диагноза (Shcherbakova, 2007).

Производительность. Еще одним требованием к практическому применению разработанных систем детекции является возможность тестирования большого количества образцов за короткий период времени. В настоящее время внедрение автоматизированных высокопроизводительных систем экстракции ДНК и применение 96- или 384- луночных плашек для ПЦР позволяет повышать производительность разрабатываемых систем детекции (Kubista et al., 2006).

Отсутствие необходимости в таксономической экспертизе.

Традиционно в идентификации фитопатогенов превалировали методы, основанные на оценке морфологических критериев, поэтому требовалось проведение таксономической экспертизы специально подготовленными квалифицированными специалистами. Однако, по морфологическим критериям многие патогены идентифицируются с трудом, поэтому данные методы зачастую приводили к постановке приблизительного или даже ложного диагноза (Shcherbakova, 2007). Исходя из этого, компании, предоставляющие диагностические услуги, интенсивно используют метод ПЦР для разработки диагностических тест-систем, которые просты в использовании и интерпретации даже для лаборантов с общими знаниями в молекулярной биологии (Лаптинов, 2007).

1.1.2 Возможные ошибки и ограничения в применении метода ПЦР для диагностики фитопатогенов

Разработка систем идентификации видов грибов может быть затруднена тем, что данные о родстве видов, полученные на основании морфологических и биологических признаков, не всегда соответствуют филогении, выстроенной на основе изучения нуклеотидных последовательностей генов тех же видов (Taylor et al., 2000). Кроме того, затруднения в разработке диагностических систем возникают из-за отсутствия необходимой информации о нуклеотидных последовательностях

целевого микроорганизма и близкородственных видов.

При использовании метода ПЦР в видовой идентификации фитопатогенных грибов необходимо учитывать, что штаммы одного вида могут отличаться по хозяйственно важным характеристикам. Так, у многих микромицетов, в том числе и у грибов рода Fusarium, отмечается наличие патогенных, и непатогенных (Recorbet et al., 2003), а также токсигенных и не образующих токсины штаммов (Paterson, 2006). Поскольку в таких случаях консервативные гены зачастую обладают недостаточным полиморфизмом для того, чтобы различать штаммы, в качестве мишеней предпочтительно использовать гены, отвечающие за эти признаки (Johnson et al., 2000; Paterson, 2006).

Нужно учитывать также, что в процессе ПЦР амплификация может происходить с ДНК не только живых, но и погибших или нежизнеспособных, организмов, что, следовательно, может приводить к получению ложноположительных результатов. Для исключения возможности детекции нежизнеспособных организмов было предложено перед ПЦР-диагностикой проводить культивирование микроорганизмов, содержащихся в образце. Этот этап приводит к накоплению биомассы только живых микроорганизмов, содержащихся в образце, и снижает вероятность попадания в ПЦР-реакцию ингибиторов, и в результате обеспечивает достоверность детекции и увеличивает чувствительность метода (González-Salgado et al., 2008). Однако, к недостаткам этого метода можно отнести увеличение затрат труда и времени, отсутствие возможности количественной оценки содержания патогена, поскольку первоначальное количество целевого организма изменяется, и невозможность детекции медленно растущих или неспособных расти на питательных средах организмов. Альтернативой служит использование РНК в качестве мишени вместо ДНК, в сочетании с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Однако, чувствительность системы в

таком случае может быть ниже, чем при детекции ДНК, вследствие высокой скорости деградации РНК и потерях ее при изолировании РНК из природных образцов (Wong, Medrano, 2005).

Нуклеотидные последовательности рРНК на данный момент широко используются для диагностических целей. Присутствие рРНК в геноме в большом количестве копий обеспечивает чувствительность системе детекции, однако затрудняет точное количественное определение патогена в природных образцах (Ma, Michailides, 2007).

При количественном определении содержания биомассы гриба в образце с помощью ПЦР не выясненным остается вопрос о том, как соотносятся структуры гриба (мицелий, разные виды спор) с количеством выделенной из образца ДНК.

Также недостаточно изученными являются вопросы величины образцов и процедуры их сбора, для получения статистически достоверного результата при анализе их методом ПЦР (Kang, Mills, 2006).

При всем многообразии методов, используемых для идентификации фитопатогенов, для практического применения больше подходят легкие в обслуживании и интерпретации результатов форматы, такие как FLASH-ПЦР.

1.2 Метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH

Метод FLASH — Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция) был использован для детекции фитопатогенных нематод и вирусов (Рязанцев, Завриев, 2009; Кулинич и др., 2008), а также широко применяется для разработки наборов для определения патогенов человека (Ёлов и др., 2005; Лаптинов, 2007).

Система внутреннего контроля (ВК). В этом формате, как и в других вариантах основанного на ПЦР-методе анализа ДНК патогенов, ВК позволяет оценивать адекватность получаемых результатов и судить о наличии в

образце ингибиторов ДНК-полимеразы (Zhang et al., 2009). Система ВК построена по принципу мультиплексной ПЦР, при которой происходит одновременная амплификация фрагмента генома ДНК патогена и ДНК ВК. ВК представляет собой какую-либо нецелевую нуклеотидную последовательность ДНК и специфические к ней праймеры и зонд. Концентрация ДНК и праймеров ВК подобраны таким образом, чтобы избежать ингибирования амплификации специфических фрагментов, поэтому при высокой концентрации в образце специфической ДНК уровень амплификации ВК может быть очень низким. Размер ампликона ВК больше размера специфичного ампликона, что позволяет при необходимости четко отличать их в геле (Рязанцев, 2009).

Поскольку системы диагностики в формате FLASH ориентированы на практическое применение, условия ПЦР приводятся к определенному стандарту за счет унификации требований к подбору праймеров и зондов.

Подбор праймеров. Для подбора специфичных праймеров проводят сравнение последовательностей нуклеотидов определенного региона ДНК близкородственных организмов. Участки, обладающие полиморфизмом, достаточным для разделения видов, используются при создании праймеров.

Длина праймеров должна составлять 18-25 пар оснований. Праймеры меньше 18 п.о. с большей вероятностью могут иметь несколько сайтов отжига в геноме, а праймеры больше 25 п.о. подвержены образованию вторичных структур с высокой температурой плавления. В составе праймера, особенно на 3'-конце, не должно быть комплиментарных последовательностей, образующих вторичные структуры. Прямой и обратный праймеры не должны быть комплиментарны друг другу, в противном случае это приведет к образованию димеров и снизит эффективность реакции. Праймер должен содержать в своем составе не более 40-55% GC нуклеотидов. Следует избегать повторения одного нуклеотида более трех раз подряд. Видоспецифичность праймеру обеспечивает наличие

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Абрамова, Светлана Леонидовна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Аблова, И. Б. Устойчивость озимой пшеницы к фузариозу колоса и возможности ее повышения селекционно-иммунологическими методами : автореф. дис. канд. биол. наук / И. Б. Аблова. - Краснодар, 1998.-24 с.

2. Азбукина, 3. М. Возбудители болезней сельскохозяйственных растений Дальнего Востока / 3. М. Азбукина. - М. : Наука, 1980. - 370 с.

3. Билай, В. И. Микроорганизмы-возбудители болезней растений : справочник / В. И. Билай, Р. И. Гвоздяк, И. Г. Скрипаль и др.; Под ред. В. И. Билай. - Киев : Наукова думка, 1988. - 550 с.

4. Валеев, А. Ш. Диагностика гриба Septoria nodorum Berk, в инфицированных тканях пшеницы с использованием гена хитин-дезацетилазы / А. Ш. Валеев, М. Б. Удалов, Г. М. Хайдар и др. // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Девятой Международной конференции. - М., 2008. - С. 269272.

5. Гаврилова, О. П. Fusarium langsethiae на территории России / О. П. Гаврилова, Т. Ю. Гагкаева // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - № 1. - С. 6.

6. Дьяков, Ю. Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов / Ю. Т. Дьяков. - М.: Муравей, 1998. - 382 с.

7. Ёлов, А. А. Количественная флуоресцентно-гибридизационная ПЦР на основе отечественной аппаратуры и тест-систем / А. А. Ёлов, Н. А. Федоров, Е. Б. Жибурт и др. // Здравоохранение и медицинская техника. - 2005. - № 2. - С. 10.

8. Иващенко, В. Г. Фузариоз колоса хлебных злаков / В. Г. Иващенко, Н. П. Шипилова, Л. А. Назаровская. - Спб. : ВИЗР, 2004. - 164 с.Кирай, 3. Методы фитопатологии / 3. Кирай, 3. Клемент, Ф. Шоймоши, Й. Вереш. ; пер. с англ. С. В. Васильевой и др. ; под ред. и с предисл. М. В.

Горленко. - М.: Колос, 1974. - 344 с.

9. Кулинич, О. А. Использование ПЦР-диагностики для идентификации карантинных видов нематод / О. А. Кулинич, А. Ю. Рысс, А. Ю. Чернецкая и др. // Защита и карантин растений. - 2008. - № 9. - С. 3638.

10. Лаптинов, И. А. ПЦР-диагностика без электрофореза / И. А. Лаптинов // Лабораторная диагностика России. - М. - 2004-2005. - С. 162-163.

11. Лекомцева, С. Н. Грибы рода Puccinia Pers. (Uredinales, Basidiomycota). Таксономический анализ / С. Н. Лекомцева // Новое в систематике грибов / под. ред. Ю. Т. Дьякова, Ю. В. Сергеева. - М. - 2003. - С. 402417.

12. Львова, Л. С. Санитарно-гигиеническое состояние фузариозного зерна пшеницы: его прием, хранение, переработка / Л. С. Львова, М. Д. Омельченко, Н. Ю. Орлова и др. // Вестник с.-х. науки. - 1990. - № 10. -С. 68-73.

13. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук ; пер. с англ. под. ред. А. А. Баева и К. Г. Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 479 с.

14. Назарова, Л. Н. Прогрессирующие болезни пшеницы, распространение и вредоносность / Л. Н. Назарова, Л. Г. Корнева, Т. П. Жохова и др. // 50 лет на страже продовольственной безопасности страны: сб. трудов. -Большие Вяземы : ГНУ ВНИИФ, 2008. - С. 163-171.

15. Наумов, Н. А. Ржавчина хлебных злаков в СССР / Н. А. Наумов. - М.-Л. : Сельхозгиз. - 1939. - 425 с.

16. Пыжикова, Г. В. Септориозы зерновых культур: метод, указания / Г. В. Пыжикова, А. А. Санина, Т. И. Курахтанова и др. - М. : ВАСХНИЛ, 1988.-58 с.

17. Райлло, А. И. Грибы рода Fusarium / А. И. Райлло. - М. : Сельхозгиз, 1950.-415 с.

18. Рязанцев, Д. Ю. Разработка систем идентификации фитопатогенов различных таксономических групп методом FLASH-ПЦР : автореф. дис. канд. биол. наук / / Д. Ю. Рязанцев. - М., 2009. - 30 с.

19. Рязанцев, Д. Ю. Эффективный метод диагностики и идентификации вирусных патогенов картофеля / Д. Ю. Рязанцев, С. К. Завриев // Мол. Биол. - 2009. - Т. 43, № 3. - С. 558-567.

20. Санин, С. С. Фитосанитарная обстановка на посевах пшеницы в Российской Федерации (1991-2008 г.г.) / С. С. Санин, Jl. Н. Назарова, Ю. А. Стрижекозин и др. // Защита и карантин растений. - 2010. - № 2. -20 С.

21. Судникова, В. П. Патогенный комплекс возбудителей септориоза пшеницы в центральном черноземье и среднем Поволжье России / В. П. Судникова, С. В. Артемова, Ю. В. Зеленева // Агро XXI. - 2007. - № 10-12.-С. 30-32.

22. Шипилова, Н. П. Видовой состав и биоэкологические особенности возбудителей фузариоза семян зерновых культур ПЦР : автореф. дис. канд. биол. наук / Н. П. Шипилова. - СПб., 1994. - 21 с.

23. Abd-Elsalam, К. A. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design / K. A. Abd-Elsalam // African Journal of Biotechnology. - 2003. -Vol. 2, №5.-P. 91-95.

24. Abd-Elsalam, K. Detection of Mycosphaerella graminicola in wheat leaves by a microsatellite dinucleotide specific-primer / K. Abd-Elsalam, A. H. Bahkali, M. Moslem et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2011. - Vol. 12, №1. - P. 682693.

25. Agodi, A. Detection of trichothecene producing Fusarium spp. by PCR: Adaptation, validation and application to fast food / A. Agodi, M. Barchitta, M. Ferrante et al. // Ital. J. Public Health. - 2005. - Vol. 2, № 1. - P. 7-11.

26. Aoki, T. Morphological and molecular characterization of Fusarium pseudog raminaearum sp. nov., formerly recognized as the group 1

population of F. graminearum / T. Aoki, K. O'Donnell 11 Mycologia. - 1999. - Vol. 91, № 4. - P. 597-609.

27. Atkins, S. D. Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biological control agent of root-knot nematodes / S. D. Atkins, L. Hidalgo-Diaz, I. M. Clark et al. // Mycol. Res. -2003. - Vol. 107, № 2. - P. 206-212.

28. Atkins, S. D. Fungal molecular diagnostics: a mini review / S. D. Atkins, I. M. Clark // J. Appl. Genet. - 2004. - Vol. 45, № 1. - P. 3-15.

29. Bakan, B. Identification by PCR of Fusarium culmorum strains producing large and small amounts of deoxynivalenol / B. Bakan, C. Giraud-Delville, L. Pinson et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol. 68, № 11. - P. 5472-5479.

30. Baner, J. Signal amplification of padlock probes by rolling circle replication / J. Baner, M. Nilsson, M. Mendel-Hartvig, U. Landegren // Nucleic Acids Res. - 1998. - Vol. 26, № 22. - P. 5073-5078.

31. Barnes, C. W. Detection and identification of four common rust pathogens of cereals and grasses using real-time polymerase chain reaction / C. W. Barnes, L. J. Szabo // Phytopathology. - 2007. - Vol. 97, № 6. - P. 717-727.

32. Barnes, C. W. Detection of Puccinia graminis spores in rain using a realtime PCR assay / C. W. Barnes, L. J. Szabo, J. L. Johnson et al. // Phytopathology. - 2005. - Vol. 95, S6.

33. Battilani, P. Yield losses in wheat infected by Fusarium avenaceum, F culmorum, F. graminearum and Microdochium nivale / P. Battilani, G. Chiusa, M. G. Jimenez Sanchez et al. // 6-th European Fusarium Seminar & Third Cost 835 Workshop of Agriculturally Important Toxigenic Fungi. -2000. - P. 75-76.

34. Baum, B. R. Rusts (Uredinales), of Triticae. Evolution and extent of coevolution a cladistic analysis / B.R. Baum, D. B. O. Savile // Bot. J. Soc. -1985. - Vol. 91, № 3. - P. 367-394.

35. Beck, J. J. Polymerase chain reaction assays for the detection of Stagonospora nodorum and Septoria tritici in wheat / J. J. Beck, J. M. Ligon // Phytopathology. - 1995. - Vol. 85, № 3. - P. 319-324.

36. Bluhm, B. H. Multiplex polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene- and fumonisin-producing species of Fusarium in cornmeal / B. H. Bluhm, J. E. Flaherty, M. A. Cousin, C. P. Woloshuk // J. Food Prot.-2002.-Vol. 65, № 12.-P. 1955-1961.

37. Boonham, N. Detection of potato viruses using microarray technology: Towards a generic method for plant viral disease diagnosis / N. Boonham, K. Walsh, P. Smith et al. // J. Virol. Methods. - 2003. - Vol. 108, № 2. - P. 181-187.

38. Booth, G. The Genus Fusarium / G. Booth. - Kew : Commonwealth Mycological Institute, 1971. - 237 p.

39. Brouwer, M. Quantification of disease progression of several microbial pathogens on Arabidopsis ihaliana using real-time fluorescence PCR / M. Brouwer, B. Lievens, W. Van Hemelrijck et al. // FEMS Microbiol. Lett. -2003. - Vol. 228, №2. - P. 241-248.

40. Burpo, F. J. A critical review of PCR primer design algorithms and cross-hybridization case study / F. J. Burpo // Biochemistry. - 2001. - Vol. 218. -P. 1-12.

41. Calderon, C. Detection of airborne fungal spores sampled by rotating-arm and Hirst-type spore traps using polymerase chain reaction assays/ C. Calderon, E. Ward, J. Freeman, H. A. McCartney // Journal of Aerosol Science. - 2002. - Vol. 33, № 2. - P. 283-296.

42. Cassells, A. C. 1992. Screening for pathogens and contaminating microorganisms in micropropagation / A. C. Cassells // Techniques for the Rapid Detection of Plant Pathogens / ed. by J. M. Duncan, L. Torrance. - Oxford, 1992. - P. 179-192.

43. Chelkowski, J. Identification of toxigenic Fusarium species using PCR

assays / J. Chelkowski, G. L. Bateman, C. J. Mirocha // J. Phytopathol. -1999.-Vol. 147, №5.-P. 307-311.

44. Chevrier, D. PCR product quantification by non radioactive hybridization procedures using an oligonucleotide covalently bount to microwells / D. Chevrier, S. R. Rasmussen, J. L. Gues-Jon // Mol. Cell. Probes. - 1993. -Vol. 7, № 3. - P. 187-197.

45. Cordo, C. A. Spore dispresal of leaf blotch pathogens of wheat (Mycosphaerella graminicola and Septoria tritci) / C. A. Cordo, M. R. Simon, A. E. Perello, A. E. Alippi // Septoria and Stagonospora Disease of Cereals: A Compilation of Global Research / ed. by M. van Ginkel, A. McNab, J. Krupinsky. - Mexico, 1999. - P. 98-104.

46. Cubero, J. An internal control for the diagnosis of crown gall by PCR / J. Cubero, J. van der Wolf, J.van Beckhoven, M. M. Lopez // J. Microbiol. Methods. - 2002. - Vol. 51, № 3. - P. 387-392.

47. Cunfer, B. Long term viability of Septoria nodorum in stored wheat seed / B. Cunfer // Cereal Research Communications. - 1991. - Vol. 19, № 3. - P. 347-349.

48. Dean, R. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology / R. Dean, J. A. L. Van Kan, Z. A. Pretorius et al. // Molecular Plant Pathology. -2012. - Vol. 13, № 4, - P. 414-430.

49. Demeke, T. Species-specific PCR-based assays for the detection of Fusari-um species and a comparison with the whole seed agar plate method and tri-chothecene analysis / T. Demeke, R. M. Clear, S. K. Patrick, D. Gaba // International Journal of Food Microbiology. - 2005. - Vol. 103, №. 3. - P. 271-284.

50. Edwards, S. G. PCR-based detection and quantification of mycotoxigenic fungi / S. G. Edwards, J. O'Callaghan, A. D. W. Dobson // Mycological Research. - 2002. - Vol. 106, № 9. - P. 1005-1025.

51. Elnifro, E. M. Multiplex PCR: Optimization and application in diagnostic

virology / E. M. Elnifro, A. M. Ashshi, R. J. Cooper, P. E. Klapper // Clin. Microbiol. Rev. - 2000. - Vol. 13, № 4. - P. 559-570.

52. Eyal, Z. Integrated control of Septoria diseases of wheat / Z. Eyal // Plant Disease. - 1981. - Vol. 65, № 9. - P. 763-768.

53. Eyal, Z. The Septoria/ Stagonospora blotch diseases of wheat: past, peresent, and future / Z. Eyal // Septoria and Stagonospora Disease of Cereal: A Compilation of Global Research / ed. by M. van Ginkel, A. McNab, J. Krupinsky. - Mexico, 1999.-P. 177-182.

54. Fessehaie, A. An oligonucleotide array for the identification and differentiation of bacteria pathogenic on potato / A. Fessehaie, S. H. De Boer, C. A. Lévesque // Phytopathology. - 2003. - Vol. 93, № 3. - P. 262269.

55. Fraaije, B. PCR-based assays to assess wheat varietal resistance to blotch (Septoria tritici and Stagonospora nodorum) and rust (Puccinia striiformis and Puccinia recóndita) diseases / B. Fraaije, D. Lovell, J. M. Coelho et al. // European Journal of Plant Pathology. - 2001. - Vol. 107, № 9. - P. 905-917.

56. Fraaije, B. Rapid detection and diagnosis of Septoria tritici epidemics in wheat using a polymerase chain reaction/PicoGreen assay / B. Fraaije, D. J. Lovell, E. A. Rohel, D. W. Hollomon // J. Appl. Microbiol. - 1999. - Vol. 86, №4.-P. 701-708.

57. Freeman, J. A polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of inoculum of Sclerotinia sclerotiorum / J. Freeman, E. Ward, C. Calderón, H. A. McCartney // European Journal of Plant Pathology. - 2002. - Vol. 108, № 9. - P. 877-886.

58. Gachón, C. Real-time PCR: What relevance to plant studies? / C. Gachón, A. Mingam, B. Charrier // J. Exp. Bot. - 2004. - Vol. 55, № 402. - P. 14451454.

59. Gagkaeva, T. Characterization of distribution, cultural characters and T-2

toxin production of F. sporotrichioides, F. poae and F. langsethiae from Russia / T.Gagkaeva, O.Gavrilova, M.Levitin et al. // European Fusarium Seminar. - Wageningen, 2006. - P. 49.

60. Geer, L. Y. The NCBI BioSystems database / L. Y. Geer, A. Machler-Bauer, R. C. Geer et al. // Nucleic Acids Research. - 2010. - Vol. 38, №. Database-I.

- P. 492-496.

61. Geiser, D. M. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium / D. M. Geiser, M. M. Jiménez-Gaseo, S. Kang et al. // European Journal of Plant Pathology. - 2004. - Vol. 110, № 5-6. - P. 473479.

62. Geiser, D. M. Practical molecular taxonomy of fungi / D. M. Geiser // Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Medicine and Agriculture / ed. by L. Lange, J. Tkacz. - Dordrecht, 2004. - P. 3-14.

63. Gerlach, W. The genus Fusarium, a pictorial atlas / W. Gerlach, H. Nirenberg ; ed. by G. Hagedorn, M. Burhenne, H. I. Nirenberg. - Berlin-Dahlem: Mitt. Biol. Bundesanst. Land-Forstw, 1982. - 209 p.

64. González-Salgado, A. Highly sensitive PCR-based detection method specific for Aspergillus flavus in wheat flour / A. González-Salgado, T. González-Jaén, C. Vázques, B. Patiño 11 Food Additives and Contaminants. - 2008. -Vol. 25, № 6. - P. 758-764.

65. Gubis, J. Molecular detection of Stagonospora nodorum and Septoria tritici

- causal agents of septoria leaf spot diseases in wheat / J. Gubis, M. Hudcovicová, S. Sliková, B. Vaneo // Biología. - 2005. - Vol. 60, № 6. - P. 681-684.

66. Gummins, G. B. The rust fungi of cereals, grasses and bamboos / G. B. Gummins. - New York; Heidelberg; Berlin : Springer-Verlag, 1971. - 570 p.

67. Haughland, R. A. Quantitative PCR analysis of selected Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces species / R. A. Haughland, M. M. Varma, L. J. Wymer, S. J. Vesper // Syst. Appl. Microbiol. - 2004. - Vol. 27, № 2. - P.

198-210.

68. Heid, C. A. Real time quantitative PCR / C. A. Heid, J. Stevens, K. J. Livak, P. M. Williams // Genome Res. - 1996. - Vol. 6, № 10. - P. 986-994.

69. Henegariu, O. Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-step Protocol / O. Henegariu, N. A. Heerema, S. R. Dlouhy et al. // BioTechniques. - 1997. -Vol. 23, №3.-P. 504-511.

70. Herdina, K. Persistence of DNA of Gaeumannomyces graminis var. tritici in soil as measured by a DNA-based assay/ K. Herdina, S. Neate, S. Jabaji-Hare, K. Ophel-Keller // FEMS Microbiol. Ecol. - 2004. - Vol. 47, № 2. - P. 143-152.

71. Hohn, T. M. Evidence of a gene cluster involving trichothecene-pathway biosynthetic genes in Fusarium sporotrichioides / T. M. Hohn, S. P. McCormick, A. E. Desjardin // Curr. Genet. - 1993. - Vol. 24, № 4. - P. 291295.

72. Jin, Y. Century-old mystery of Puccinia striiformis life history solved with the identification of Berberis as an alternate host / Y. Jin, L. Szabo, M. Carson // Phytopathology. - 2010. - Vol. 100, № 5. - P. 432-435.

73. Johnson, R. D. A polymerase chain-reaction based method to specifically detect Alternaria alternata apple pathotype (A. mali), the causal agent of Alternaria blotch of apple / R. D. Johnson, L. Johnson, K. Kohomoto et al. // Phytopathology. - 2000. - Vol. 90, № 9. - P. 973-976.

74. Kang, S. The effect of sample size in studies of soil microbial community structure / S. Kang, A. L. Mills // Journal of Microbiological Methods. -2006. - Vol. 66, № 2. - P. 242- 250.

75. Kimura, M. The trichothecene biosynthesis gene cluster of Fusarium graminearum F15 contains a limited number of essential pathway genes and expressed non-essential genes / M. Kimura, T. Tokai, K. O'Donnell et al. // FEBS Lett. - 2003. - Vol. 539, № 1-3. - P. 105-110.

76. Klemsdal, S. S. Development of a highly sensitive nested-PCR method

using a single closed tube for detection of Fusarium culmorum in cereal samples / S. S. Klemsdal, 0. Elen // Lett. Appl. Microbiol. - 2006. - Vol. 42, № 5. - P. 544-548.

77. Knoll, A. Application of a PCR protocol for the diagnosis of trichothecene producing Fusarium species in deoxynivalenol contaminated wheat / A. Knoll, L. Niessen, R. F. Vogel // Mycotoxin Res. - 2000. - Vol. 16, № 2. - P. 240-243.

78. Knoll, A. Identification of Fusarium graminearum in cereal samples by DNA Detection Test Strips™ / A. Knoll, R. F. Vogel, L. Niessen // Lett. Appl. Microbiol. - 2002. - Vol. 34, № 2. - P. 144-148.

79. Kristensen, R. Phylogeny and toxigenic potential is correlated in Fusarium species as revealed by partial translation elongation factor 1 alpha gene sequences / R. Kristensen, M. Torp, B. Kosiak, A. Hoist-Jensen // Mycological Research. - 2005. - Vol. 109, № 2. - P. 173-186.

80. Kristensen, R. Simultaneous detection and identification of trichothecene-and moniliformin-producing Fusarium species based on multiplex SNP analysis / R. Kristensen, K. G. Berdal, A. Hoist-Jensen // J. of Applied Microbiology. - 2007. - Vol. 102, № 4. - P. 1071-1081.

81. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction / M. Kubista, J. M. Andrade, M. Bengtsson et al. // Molecular Aspects of Medicine. - 2006. -Vol. 27, №2-3.-P. 95-125.

82. Kulik, T. Development of PCR assay based on ITS2 rDNA polymorphism for the detection and differentiation of Fusarium sporotrichioides / T. Kulik, G. Fordonski, A. Pszczolkowska, et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 2004. -Vol. 239, № i.-p. 181-186.

83. Kwok, S. Avoiding false positives with PCR / S. Kwok, R. Higushi // Nature. - 1989. - Vol. 339, № 6221. - P. 237-238.

84. Lee, T. Identification of deoxynivelenol- and nivalenol-producing chemotypes of Gibberella zeae by using PCR / T. Lee, D. W. Oh, H. S. Kim

et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, № 7. - P. 2966-2972.

85. Leonard, K. J. Stem rust - future enemy? / K. J. Leonard // Stem Rust of Wheat: from Ancient Enemy to Modern Foe / ed. by P. D. Peterson. - St. Paul, 2001.-P. 119-146.

86. Levesque, C. A. Identification of some oomycetes by reverse dot blot hybridization / C. A. Levesque, C. E. Harlton, A. W. A. M. Cock // Phytopathology. - 1998. - Vol. 88, № 3. - P. 213-222.

87. Levesque, C. A. Molecular methods for detection of plant pathogens-What is the future? / C. A. Levesque // Can. J. Plant Pathol. - 2001. - Vol. 23, № 4.-P. 333-336.

88. Lievens, B. Design and development of a DNA array for rapid detection and identification of multiple tomato vascular wilt pathogens / B. Lievens, M. Brouwer, A. C. R. C. Vanachter et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol. 223, № l.-P. 113-122.

89. Lievens, B. Recent developments in diagnostics of plant pathogens: A review / B. Lievens, T. J. M. A. Grauwet, B. P. A. Cammue, B. P. Thomma // Recent Res. Develop. Microbiol. - 2005. - Vol. 9, Part l.-P. 57-79.

90. Lievens, B. Recent developments in pathogen detection arrays: Implications for fungal plant pathogens and use in practice / B. Lievens, B. P. Thomma // Phytopathol. - 2005. - Vol. 95, № 12. - P. 1374-1380.

91. Liu, Z. H. Quantitative trait loci analysis and mapping of seedling resistance to Stagonospora nodorum leaf blotch in wheat / Z. H. Liu, J. D. Faris, S. W. Meinhardt, J. D. Faris // Phytopathology. - 2004. - Vol. 94, № 10. - P. 10617.

92. Liu, M. Taxonomic study of stripe rust, Puccinia striiformis sensu lato, based on molecular and morphological evidence / M. Liu, S. Hambleton // Fungal Biology. -2010. - Vol. 114, № 10. - P. 881-899.

93. Lucas, J. A. Detection and diagnosis of plant disease / J. A. Lucas // Institute of Arable Crops Research Report. - Harpenden, 2000-2001. - P. 20-23.

94. Ma, Z. Approaches for eliminating PCR inhibitors and designing PCR primers for the detection of phytopathogenic fungi / Z. Ma, T. J. Michailides // Crop Protection. - 2007. - Vol. 26, № 2. - P. 145-161.

95. Marasas, W. F. O. Toxigenic Fusarium species. Identity and mycotoxicology / W. F. O. Marasas, P. E. Nelson, T. A. Toussoun. - University Park, PA: The Pennsylvania State University Press, 1984. - 328 p.

96. Martin, R. R. Impacts of molecular diagnostic technologies on plant disease management / R. R. Martin, D. James, C. A. Lévesque // Annu. Rev. Phytopathol. - 2000. - Vol. 38. - P. 207-239.

97. McCartney, H. A. Molecular diagnostics for fungal plant pathogens / H. A. McCartney, S. J. Foster, B. A. Fraaije, E. Ward // Pest Manag. Sci. - 2003. -Vol. 59, №2.-P. 129-142.

98. McDonald, M. C. Phylogenetic and population genetic analyses of Phaeosphaeria nodorum and its close relatives indicate cryptic species and an origin in the Fertile Crescent / M. C. McDonald, M. Razavi, T. L. Friesen et al. // Fungal Genetics and Biology. - 2012. - Vol. 49, № 11. - P. 882-895.

99. Miller, J. D. Time course of fungal growth and production of deoxynivalenol and other mycotoxins / J. D. Miller, J. C. Joung, H. T. Trenholm // Can. J. Bot.- 1983. -Vol. 61, № 12. - P. 3080-3087.

100. Mishra, P. K. Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identification of pathogenic fusaria / P. K. Mishra, R. T. V. Fox, A. Culhan // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol. 218, № 2. - P. 329-332.

101. Mojerlou, Sh. Study of latent period and interactions between different septoria tritici genotypes and different wheat cultivars and lines in greenhouse / Sh. Mojerlou, N. Safaie, A. Alizadeh, F. Khelghatibana. // Trakia Journal of Sciences. - 2009. - Vol. 7, № 4. - P. 7-17.

102. Morgan, M. R. A. Monitoring safety of plant foods: Immunodiagnostics for mycotoxins and other bioactive compounds / M. R. A. Morgan // New Diagnostics in Crop Sciences. Biotechnology in Agriculture / ed. by J. H.

Skerritt, R. Appels. - Wallingford, 1995. - № 13. - P. 215-242.

103. Nicholson, P. Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays / P. Nicholson, D. R. Simpson, G. Weston et al. // Phys. Mol. Plant Pathol. - 1998. - Vol. 53, № 1. -P. 17-37.

104. Nicolaisen, M. An oligonucleotide microarray for the identification and differentiation of trichothecene producing and non-producing Fusarium species occurring on cereal grain / M. Nicolaisen, A. F. Justesen, U. Thrane et al. // J. Microbiol. Methods. - 2005. - Vol. 62, № 1. - P. 57-69.

105. Niessen, M. L. Group specific PCR-detection of potential trichothecene-producing Fusarium-species in pure cultures and cereal samples / M. L. Niessen, R. F. Vogel, // Syst. Appl. Microbiol. - 1998. - Vol. 21, № 4. - P. 618-631.

106. Niessen, M. L. Specific identification of Fusarium graminearum by PCR with gaoA targeted primers / M. L. Niessen, R. F. Vogel // Syst. Appl. Microbiol. - 1997. - Vol. 20, № 1. - P. 111-123.

107. Noviello, C. A simple technique for investigating stromal formation in Sclerotiniaceae / C. Noviello, R. P. Korf // Mycologia. - 1961. - Vol. 53, № 3.-P. 237-243.

108. Obradovic, D. A simplified method of DNA extraction for identification of Fusarium graminearum group 2 isolates by PCR / D. Obradovic, F. Bagi, S. Kevresan et al. //Acta Phytopathol. Entomol. Hung. - 2001. - Vol. 36, № 34. - P. 243-249.

109. O'Donnell, K. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous / K. O'Donnell, E. Cigelnik // Molecular and Phylogenetic Evolution. - 1997. -Vol. 7, № l.-P. 103-116.

110. O'Donnell, K. Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex / K. O'Donnell, E. Cigelnik, H. I. Nirenberg //

Mycologia. - 1998. - Vol. 90, № 3. - P. 465^193.

111. O'Donnell, K. Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of Fusarium graminearum, the fungus causing wheat scab / K. O'Donnell, H. C. Kistler, B. K. Tacke, H. H. Casper // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2000. - Vol. 97, № 14. - P. 7905-7910.

112. O'Donnell, K. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies / K. O'Donnell, H. C. Kistler, E. Cigelnik, R. C. Ploetz // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1998. - Vol. 95, № 5. - P. 2044-2049.

113. Oliver, R. P. Quantitative disease resistance assessment by real-time PCR using the Stagonospora nodorum-wheat pathosystem as a model / R. P. Oliver, K. Rybak, M. Shankar et al. // Plant Pathology. - 2008. - Vol. 57, № 3.-P. 527-532.

114. O'Reilly, P. Timing of fungicide applications in relation to the development of Septoria nodorum in winter wheat / P. O'Reilly, E. Bannon, A. Doyle // Proceedings of the British Crop Protection Conference-Pests and Diseases. -1988.-P. 929-34.

115. Palmer, C. L. Mycosphaerella graminicola: latent infection, crop devastation and genomics / C. L. Palmer, W. Skinner 11 Molecular Plant Pathology. -

2002. - Vol. 3, № 2. - P. 63-70.

116. Paterson, R. R. M. Identification and quantification of mycotoxigenic fungi by PCR / R. R. M. Paterson // Process Biochemistry. - 2006. - Vol. 41, № 7. -P. 1467-1474.

117. Recorbet, G. Wanted: Pathogenesis-related marker molecules for Fusarium oxysporum / G. Recorbet, C. Steinberg, C. Olivain et al. // New Phytol. -

2003.-Vol. 159, № 1.-P. 73-92.

118. Rees, R. G. Uredospore movement and observations on epidemiology of wheat rusts in north-eastern Australia / R. G. Rees // Aust. J. Agric. Res. -

1972. - Vol. 23, № 2. - P. 215-223.

119. Reeves, J. C. Molecular diagnostics for pathogen detection in seeds and planting materials / J. C. Reeves // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1998. - Vol. 52, № 1-2. - P. 33-39.

120. Reischer, G. H. Quantification of Fusarium graminearum in infected wheat by species specific real-time PCR applying a TaqMan probe / G. H. Reischer, M. Lemmens, A. Farnleitner // J. Microbiol. Methods. - 2004. -Vol. 59, № l.-P. 141-146.

121. Richardson, M. J. Septoria species on cereals—a note to aid their identification / M. J. Richardson, M. Noble // Plant Pathol. - 1970. - Vol. 19, №4.-P. 159-63.

122. Roelf, A. P. Rust Diseases of Wheat: Concepts and Methods of Disease Management/A. P. Roelf, R. P. Singh, E. E. Saari. - Mexico, DF: CIMMYT, 1992. - 81 p.

123. Romanowski, G. Persistence of free plasmid DNA in soil monitored by various methods, including a transformation assay / G. Romanowski, M. G. Lorenz, G. Sayler, W. Wackernagel // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. -Vol. 58, №9.-P. 3012-3019.

124. Rudi, K. A novel multiplex quantitative DNA array based PCR (MQDA-PCR) for quantification of transgenic maize in food and feed / K. Rudi, I. Rud, A. Hoick // Nucleic Acids Res. - 2003. - Vol. 31, № 11. - P. 62.

125. Saari, E. E. World distribution in relation to economic losses / E. E. Saari, J. M. Prescott // The cereal rusts / ed. by A. P. Roelfs, W. R. Boshell. -Orlando, 1985. - Vol 2. - P. 260-298.

126. Schaad, N. W. Real-time PCR and its application for rapid plant disease diagnostics / N. W. Schaad, R. D. Frederick // Can. J. Plant Pathol. - 2002. -Vol. 24, №3.-P. 250-258.

127. Schnerr, H. Real time detection of the tri5 gene in Fusarium species by LigthCycler-PCR using SYBR green 1 for continuous fluorescence

monitoring / H. Schnerr, L. Niessen, R. F. Vogel // Int. J. Food Microbiol. -2001.-Vol. 71, № l.-R 53-61.

128. Shcherbakova, L. A. Advanced methods of plant pathogen diagnostics / L. A. Shcherbakova // Comprehensive and molecular phytopathology / ed. by. Y. Dyakov, V. Dzhavakhiya, T. Korpela. - ELSEVIER, 2007. - P. 75-116.

129. Shipton, W. A. The common Septoria diseases of wheat / W. A. Shipton, W. J. R. Bord, A. A. Rosielle, B. L. Shearer // Bot. Rev. - 1971. - Vol. 37, №. -P. 231-62.

130. Snyder, W. C. Current status of taxonomy in Fusarium species and their perfect stages / W. C. Snyder, T. A. Toussoun // Phytopathology. - 1965. -Vol. 55, № 8. - P. 833-837.

131. Stead, D. E. Validation of diagnostic methods for diseases such as potato ring rot and potato brown rot for use within the European Union / D. E. Stead // Program Book, APS/CPS Joint Meeting. The American Phytopathological Society. - St. Paul, 1999. - P. 68.

132. Strausbaugh, C. A. Pathogenicity and real-time PCR detection of Fusarium spp. in wheat and barley roots / C. A. Strausbaugh, K. Overturf, A. C. Koehn // Can. J. Plant Pathol. - 2005. - Vol. 27, № 3. - P. 430-438.

133. Taylor, J. W. Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi / J. W. Taylor, D. J. Jacobson, S. Kroken et al. // Fungal Genet. Biol. -2000.-Vol. 31, № 1.-P. 21-32.

134. The Septoria diseases of wheat: concepts and methods of disease management / ed. by Z. Eyal, A. L. Scharen, M. J. Prescott, M. van Ginkel. -Mexico, D. F.: CIMMYT, 1987. - 46 p.

135. Thrane, U. Developments in the taxonomy of Fusarium species based on secondary metabolites / U. Thrane // Fusarium: Paul E. Nelson memorial symposium / B. A. Summereil. - St.Paul, 2001. - P. 29-49.

136. Tooley, P. W. Relationships among group IV Phytophthora species inferred by restriction analysis of the ITS2 region / P. W. Tooley, M. M. Carras, K. F.

Falkenstein // J. Phytopathol. - 1996. - Vol. 144, № 7-8. - P. 363-369.

137. Torp, M. Fusarium Icmgsethiae sp. nov. on cereals in Europe / M. Torp, H. I. Nirenberg // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95, № 3. - P. 247-256.

138. Uehara, T. Rapid and sensitive identification of Pratylenchus spp. using reverse dot blot hybridization / T. Uehara, A. Kushida, Y. Momota // Nematology. - 1999. - Vol. 1, № 5.-P. 549-555.

139. Ueno, Y. General Toxicology / Y. Ueno // Developments in food science. IV. Trichothecenes. Chemical, biological and toxicological aspects / ed. by Y. Ueno. - Amsterdam, 1983. - P. 307-316.

140. Vos, P. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker et al. // Nucleic Acids Res. - 1995. - Vol. 23, № 21. - P. 44074414.

141. Wang, K. Molecular Engineering of DNA: Molecular Beacons / K. Wang, Z. Tang, C. J. Yang et al. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2009. - Vol. 48, № 5. -P. 856-870.

142. Wang, X. The development of a PCR-based method for detecting Puccinia striiformis latent infections in wheat leaves / X. Wang, W. Zheng, H. Buchenauer et al. // Eur. J. Plant Pathol. - 2008. - Vol. 120, № 3. - P. 241247.

143. Ward, E. Plant pathogen diagnostics: immunological and nucleic acid-based approaches / E. Ward, S. J. Foster, B. A. Fraaije, H. McCartney // Ann. appl. Biol.-2004.-Vol. 145, № l.-P. 1-16.

144. Weiland, J. J. Differentiation and detection of sugar beet fungal pathogens using PCR amplification of actin coding sequences and the ITS region of the rRNA gene / J. J. Weiland, J. L. Sundsbak // Plant Dis. - 2000. - Vol. 84, № 4. - P. 475-482.

145. Williams, J. G. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J. G. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak et al // Nucleic Acids Res. - 1990.-Vol. 18, № 22.-P. 6531-6535.

146. Williams, K. J. The application of species-specific assays based on the polymerase chain reaction to analyse Fusarium crown rot of durum wheat / K. J. Williams, J. I. Dennis, C. Smyl, H. Wallwork //Australas. Plant Pathol. -2002.-Vol. 31, №2.-P. 119-127.

147. Williams, R Methods for integrated air sampling and DNA analysis for the detection of airborne fungal spores / R. Williams, E. Ward, H. A. McCartney // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - Vol. 67, № 6. - P. 2453-2459.

148. Wong, M. L. Real-time PCR for mRNA quantitation / M. L. Wong, J. F. Medrano // BioTechniques. - 2005. - Vol. 39, № 1. - P. 1-11.

149. Wu., L. Development and evaluation of functional gene array for detection of selected genes in the environment / L. Wu., D. K. Thompson, G. Li et al. //Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, № 12. - P. 5780-5790.

150. Yoder, W. T. Species-specific primers resolve members of Fusarium section Fusarium: Taxonomic status of the edible "Quorn" fungus reevaluated / W. T. Yoder, L. M. Christianson // Fung. Gen. Biol. - 1998. - Vol. 23, № 1. - P. 68-80.

151. Young, J. Ch. Effect of milling and baking on deoxynivalenol (Vomitoxin) content of eastern Canadian wheats / J. Ch. Young, R. G. Fulcher, J. H. Hayhoe // J. Acric. Food Chem. - 1984. - Vol. 32, № 3. - P. 659-664.

152. Zhang, Y. A multiplex PCR method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis with co-amplification of its host DNA / Y. Zhang, W. Yang, Y. Li et al. // Front. Agric. China. - 2009. - Vol. 3, № 2. -P. 140-145.

153. Zambino, P. J. Phylogenetic relationships of selected cereal and grass rusts based on rDNA sequence analysis / P. J. Zambino, L. J. Szabo // Mycologia. - 1993. - Vol. 85, № 3. - P. 401-414.

154. Zhao, J. A PCR-based assay for detection of Puccinia striiformis f. sp. tritici in wheat / J. Zhao, J. X. Wang, C. Q. Chen et al. // Plant Dis. - 2007. - Vol.

105,

91, № 12.-P. 1669-1674.