"Разработка синбиотического функционального ингредиента для пищевых продуктов с использованием экзополисахаридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Курбонова Маликахон Комилжоновна

• Курбонова Маликахон Комилжоновна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Курбонова Маликахон Комилжоновна

Реферат

Synopsis

Введение

ГЛАВА 1. Состояние проблемы по использованию экзополисахаридов при разработке синбиотического функционального ингредиента

1.1 Синбиотики, как продукты функционального питания

1.2 Пробиотики - эффективные функциональные продукты

1.3 Пребиотики, как компоненты продуктов синбиотиков

1.4 Молочнокислые бактерии

1.5 Экзополисахариды бактерий рода Lactobacillus

1.6 Влияние экологических стрессов на бактерии рода Lactobacillus и ЭПС

1.7 Влияние растительных экстрактов на рост молочнокислых бактерий

ГЛАВА 2. Постановка эксперимента. Объекты и методы исследования

2.1 Дизайн эксперимента

2.2 Объекты исследований

2.2.1 Характеристика пробиотических микроорганизмов

2.2.2 Характеристика растительных экстрактов с потенциальным пребиотическим эффектом

2.3 Методика экспериментов

2.3.1 Культивирование пробиотических микроорганизмов

2.3.2 Выделение и очистка ЭПС LGG

2.3.3 Исследование влияния pH на синтез ЭПС

2.3.4 Определение числа жизнеспособных микроорганизмов

2.3.5 Определение углеводов

2.3.6 Определения моносахаридного состава ЭПС LGG

2.3.7 Определение состава ЭПС LGG методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье

2.3.8 Морфологическое определение ЭПС LGG

2.3.9 Оценка пребиотической активности (PAS)

2.3.10 Определение структурно-механических характеристик полисахаридных гелей

2.3.11 Методика экстракции растительного сырья

2.3.12 Определение совместимости LGG с растительными экстрактами методом диффузии в агаровой пластине

2.3.13 Экспресс метод определения влияния растительных экстрактов на рост LGG

2.3.14 Определение антиоксидантной активности

2.3.15 Определение фенольных соединений в растительном экстракте

2.2.16 Методика пробоподготовки капсул

2.3.17 Морфологическая характеристика полученного ингредиента

2.3.18 Оценка эффективности инкапсулирования

2.3.19 Оценка выживаемости инкапсулированных пробиотических микроорганизмов в условиях желудочно-кишечного тракта

2.3.20 Определение параметров хранимоспособности функционального фитосинбиотичсекого пищевого ингредиента

2.3.21 Влияние фитосинбиотического функционального пищевого ингредиента на

органолептические показатели в составе пищевого продукт

2.3.23 Статистический анализ

ГЛАВА 3. Разработка фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов и его характеристика

3.1 Разработка способа выделение и очистки ЭПС LGG

3.2 Результаты исследования влияния рН на синтез ЭПС LGG

3.3 Результаты инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье

3.4 Результаты определения моносахаридного состава ЭПС LGG

3.5 Результаты морфологического исследования ЭПС LGG

3.6 Оценка пребиотической активности ЭПС LGG

3.7 Подбор состава капсул с использованием ЭПС LGG. Определение структурно-механических характеристик полисахаридных гелей

3.8 Получение растительного экстракта для внесения в состав

фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов

3.9 Совместимость LGG с растительными экстрактами методом диффузии в агаровой пластине

3.10 Экспресс метод определения влияния растительных экстрактов на рост LGG

3.11 Результаты определение антиоксидантной активности

3.12 Результаты определения фенольных соединений в растительном экстракте

3.13 Технологическая схема производства инкапсулированного фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов

3.14 Результаты морфологического исследования инкапсулированного фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов

3.15 Оценка эффективности инкапсулирования

3.16 Результаты выживаемости инкапсулированных пробиотических микроорганизмов в условиях желудочно-кишечного тракта

3.17 Обоснование сроков годности и параметров хранения фитосинбиотического функционального пищевого ингредиента

3.18 Исследование влияния функционального фитосинбиотического пищевого

ингредиента на органолептические показатели в составе йогурта

Заключение

Список использованных источников

Список публикаций по теме диссертации

Приложение А

Реферат

Актуальность темы. В государственных программах РФ отражены вопросы, связанные с желудочно-кишечными расстройствами, снижением активности пробиотической микрофлоры и дефицитом пребиотиков и биологически активных веществ в рационе питания, что требует усиления научно -исследовательской деятельности в направлении расширения ассортимента функциональных продуктов.

Микробиота кишечника человека играет решающую роль в поддержании общего состояния здоровья и благополучия. Использование фитосинбиотических составов, сочетающих пробиотики и пребиотики, показало многообещающие результаты в модулировании состава кишечной микробиоты и улучшении здоровья кишечника. Включение экзополисахаридов (ЭПС) в фитосинбиотики может обеспечить дополнительные преимущества, такие как усиленный рост и колонизация бактерий, улучшенная стабильность и адресная доставка.

Поэтому разработка рецептурных и технологических решений для фитосинбиотических продуктов с прогнозируемыми функциональными, пребиотическими свойствами и биологической активностью становится актуальной. Для достижения этой цели необходимо включать в рецептуры натуральные ингредиенты, которые содержат макро- и микронутриенты с биокорректирующим воздействием. Эти ингредиенты могут быть включены в различные пищевые продукты, такие как молочные продукты, напитки и добавки, для улучшения их функциональных свойств.

По мнению ученых, штаммы молочнокислых бактерий (МКБ), способные выделять ЭПС, демонстрируют повышенную устойчивость к агрессивной среде ЖКТ благодаря наличию ЭПС-капсулы, вероятно которая играет ключевую роль в колонизации и адгезии в кишечнике, способствуя накоплению МКБ в ЖКТ. Создавая фитосинбиотические ингредиенты с ЭПС, можно повысить выживаемость и жизнеспособность пробиотиков, тем самым обеспечив их эффективность и функциональность.

Существует растущий спрос на функциональные продукты питания, поскольку в настоящее время потребители желают покупать продукты питания не только для того, чтобы утолить голод и получить необходимые питательные вещества, но и также для предотвращения определенных типов заболеваний, связанных с обменом веществ, и для улучшения своего физического и психического здоровья.

Обогащение пищевых продуктов пробиотиками, а также пребиотиками является одним из важных технологических процессов для разработки различных функциональных пищевых продуктов. Рекомендуемый минимальный уровень пребиотиков в пище составляет около 6*109 КОЕ/г. Более того, количество пробиотиков в кишечнике и в пище можно поддерживать на желаемом уровне с помощью пребиотиков.

Обогащение пищевого продукта как пробиотиками, так и пребиотиками, а также приготовление добавок с обоими компонентами отражают фитосинбиотический продукт, который также является еще одной важной стратегией приготовления функциональных пищевых продуктов.

Цель работы - разработка фитосинбиотического функционального пищевого ингредиента с использованием растительных экстрактов флавоноидов, пробиотических микроорганизмов и их экзополисахаридов.

Для выполнения данной цели решались следующие задачи:

- Обосновать выбор пробиотических микроорганизмов для использования в составе функционального пищевого ингредиента;

- Исследовать состав и свойства экзополисахаридов выбранных микроорганизмов;

- Обосновать выбор растительного сырья в качестве источника флавоноидов в составе функционального пищевого ингредиента;

- Исследовать влияние растительных экстрактов на метаболическую активность пробиотических микроорганизмов;

- Определить технологические параметры получения инкапсулированного фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов;

- Обосновать сроки годности и параметры хранения фитосинбиотического функционального ингредиента;

- Исследовать влияние фитосинбиотического функционального пищевого ингредиента на органолептические показатели в составе пищевого продукта.

Методы исследования. В диссертации применялись микробиологические и физико-химические методы исследования. К микробиологическим методам относятся: культивирование пробиотических бактерий, выделение и очистка бактериальных ЭПС, определение влияние температуры и pH на выход ЭПС, оценка пребиотической активности, определение эффективности инкапсулирования, моделирование желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). К физико-химическим методам относятся: определение общего содержания углеводов, определение моносахаридного состава ЭПС методом ВЭЖХ, инфракрасная спектроскопия ЭПС с преобразованием Фурье, анализ сканирующей электронной микроскопии ЭПС, определение структурно -механических характеристик полисахаридных гелей, определение фенольных соединений в водно-спиртовом экстракте методом ВЭЖХ, определение антиоксидантной активности с помощью DPPH (2,2 -дифенил-1-пикрилгидразил).

Основные положения, выносимые на защиту:

Данные о синбиотическом пищевом ингредиенте, полученном с использованием LGG, и возможностях его дальнейшего применения в производстве функциональных продуктов питания.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «"Разработка синбиотического функционального ингредиента для пищевых продуктов с использованием экзополисахаридов»

Научная новизна работы.

Получены экспериментальные данные моносахаридного профиля выделенных экзополисахаридов LacticaseibacШus rhamnosus GG, где основными мономерами определены глюкоза (34,6 %) и галактоза (30,7 %), манноза (10,1 %), содержание рамнозы, глюкозамина, галактозамина и других моносахаридов в

сумме составляет менее 25 % (от 7,2 до 1,4 % для каждого).

Определена антиоксидантная способность экстрактов Camellia sinensis, Ziziphus spina-christi и Vaccinium oxycoccos (ингибирование свободных радикалов 68,4, 41,6 и 35,8 %, соответственно), а также способность стимулировать рост Lacticaseibacillus rhamnosus GG (7,2, 11,2 и 16,0 %, соответственно, после 48 ч культивирования по сравнению с контрольной питательной средой без внесения экстракта).

Экспериментально установлено количественное содержание пяти фенольных соединений в составе водно-спиртового экстракта Ziziphus spina-christi, обработанного ультразвуком: галловой кислоты (242,8 мкг/г), кофейной кислоты (9,8 мкг/мл), пирокатехола (19,6 мкг/г), кумаровой кислоты (11,9 мкг/г) и феруловой кислоты (16,2 мкг/г).

Полученный экзополисахарид Lacticaseibacillus rhamnosus GG впервые использован в составе фитосинбиотического функционального пищевого ингредиента.

Установлен пребиотический потенциал экзополисахаридов Lacticaseibacillus rhamnosus GG выше, чем у ксантана и альгината, а также способность формирования разветвленной микроструктуры и способность формировать гели с высокой силой в соотношении до 50 % с альгинатом натрия.

Теоретическая и практическая значимость.

Разработана технология фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием экзополисахаридов LGG и растительного экстракта Ziziphus spina-christi.

Обоснованы параметры биосинтеза и выделения ЭПС LGG при рН 4 с использованием ТХУ, диализом и центрифугированием с последующей лиофильной сушкой. Выход ЭПС LGG составил 0,45 г/л.

Степень достоверности и апробация результатов работы.

Исследования были выполнены с учетом трехкратного повторения. Полученные результаты обработаны при помощи математической статистики и

вычисления доверительного интервала при уровне доверия р=0.95 используя программные средства Microsoft Excel, SMath Studio и Origin.

Апробация результатов работы. Направления диссертационной работы и результаты научных исследований были представлены на конференциях различного уровня: L научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 1 - 4 февраля 2021 г.); X Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 14-17 апреля 2021 г.); LI научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2 - 5 февраля 2022 г.); XI Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 6-8 апреля 2022 г.); Пятьдесят вторая (LII) научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 31 января-3 февраля 2023 г.); XII Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 3-6 апреля 2023 г.); LIII научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 29 января-2 февраля 2024 г.).

Личный вклад автора.

Проведение аналитического обзора по состоянию проблемы по использованию экзополисахаридов при разработке фитосинбиотического функционального ингредиента, экспериментальные исследования, расчеты, автореферат и основные публикации автора по теме диссертации подтверждают ее личный вклад в получение защищаемых результатов исследования. Постановка цели и задач исследования, обобщение и обсуждение результатов, составление выводов и заключения осуществлялось автором совместно с научным руководителем. Подготовка материалов для научных публикаций и докладов на конференциях проводилась совместно с соавторами.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 4 публикациях. Из них 2 изданы в журналах, рекомендованных ВАК, 2 опубликованы в изданиях, индексируемых в базе цитирования Scopus и Web of Science.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 186 страницах (введение, три главы, заключение, список литературы и приложения) и содержит: 28 рисунков, 15 таблиц, в список литературы включены 107 наименований источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении раскрыта значимость и актуальность выбранного направления исследований, обозначены цель и задачи исследований, изложены научная новизна и практическая значимость полученных результатов и положения, выносимые на защиту.

В аналитическом обзоре проведен анализ проблемы, связанной с расширением ассортимента пробиотиченских продуктов современной пищевой промышленности. При этом на сегодняшний день практически отсутствуют синбиотические продукты, хотя по имеющимся данным такие продукты обладают особенно высокой биологической ценностью. Разработка и внедрение в промышленность синбиотических физиологически функциональных пищевых ингредиентов является возможным решением обозначенной проблемы. Особое внимание в первой главе уделено изучению влияния экзополисахаридов (ЭПС) на пробиотические микрооргнизмы. Участвуя в формировании внеклеточной матрицы биопленки, ЭПС обеспечивая защиту микробных культур от разнообразных неблагоприятных факторов, а именно колебания температуры, изменения уровня рН, воздействие антибиотиков, иммунные реакции и прочее. Литературный обзор показал, что пробиотики и полифенолы положительно воздействуют на здоровье кишечника. Кроме того, растительные полифенолы начинают рассматриваться как новые пребиотики благодаря их способности стимулировать рост полезной микрофлоры кишечника, что способствует повышению биодоступности самих полифенолов. Таким образом, в отличие от углеводных пребиотиков, растительные фенольные соединения обладают антиоксидантной активностью и оказывают синергетический эффект при взаимодействии с пробиотиками.

Объекты настоящего исследования, методы и схема проведения исследования представлены во второй главе. Исследования проводились на базе

лабораторий МНЦ «Биотехнологии третьего тысячелетия» факультета биотехнологий Университете ИТМО и «National and Local Joint Engineering Laboratory for Synthesis Transformation and Separation of Extreme Environmental Nutrients» института питания и охраны окружающей среды Харбинского политехнического университета.

Объектами исследования выступили:

- Пробиотик Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG), известного своими терапевтическими и иммуномодулирующими свойствами, а также способностью секретировать ЭПС, способствующие защите бактерий от неблагоприятных условий окружающей среды;

- Растительные экстракты включали Camellia sinensis (зеленый чай), Ziziphus spina christi (финик) и Vaccinium oxycoccos (клюква), известные своими антиоксидантными свойствами и способностью улучшать выживаемость пробиотиков.

Сначала проводилось раздельное исследование выбранных объектов, а затем создание на их основе фитосинбиотического ингредиента и исследование его свойств. Первым этапом было культивирование LGG в бульоне МРС при 37 °C в термостате. Вся посуда предварительно стерилизовалась при 121,0 °C в течение 15 мин, чтобы обеспечить стерильные условия.

Для извлечения и очистки ЭПС из LGG культуры, сначала проводили центрифугирование и концентрацию надосадочной жидкости. Затем ЭПС экстрагировали, осаждали и производили диализ с последующей обработкой этиловым спиртом для получения чистых образцов.

Исследование также включало изучение влияния pH на синтез ЭПС. LGG культивировали при стандартном pH 6.8 (контроль) и при pH 4.3 (кислотный стресс) в бульоне МРС при 37 °C. После этого исследовали выживаемость и синтез ЭПС микроорганизмов после процесса высушивания в лиофильной сушилке. Для оценки числа жизнеспособных микроорганизмов использовали метод посева на чашках Петри согласно стандарту ГОСТ 26670-91.

Определение содержания углеводов в ЭПС проводили с использованием фенол-сернокислотного метода и спектрофотометра UV-2600 для количественного анализа. Для количественной оценки результатов использовали спектрофотометр UV-2600. Этот прибор позволяет измерять оптическую плотность и анализировать концентрацию веществ в растворе, включая углеводы в ЭПС. Для установления моносахаридного состава ЭПС использовали газовую хроматографию с масс -спектрометрическим детектором. Этот метод позволяет идентифицировать и количественно анализировать углеводы в комплексных смесях. Данные о структуре ЭПС получали с использованием сканирующего электронного микроскопа. Также исследовали способность ЭПС действовать как пребиотик, поддерживая рост полезных микроорганизмов кишечника, таких как Lactobacillus spp. Определяли структурно-механические характеристики полисахаридных гелей на универсальной испытательной машины EZ-Test (Shimadzu, Япония).

Для приготовления растительных экстрактов с возможным пребиотическим эффектом были выбраны Camellia sinensis, Ziziphus spina-christi, Vaccinium oxycoccos. Экстракты готовились путем измельчения чайных листьев Camellia sinensis, измельчения плодов Vaccinium oxycoccos и Ziziphus spina-christi. Обезжиренные измельченные образцы экстрагировали 65 % этанолом в соотношение 50/50 при температуре 50 °C с помощью ультразвука (20 кГц) в течение 30 мин. Затем экстракт фильтровали и выпаривали с помощью роторного испарителя. Определение совместимости LGG с растительными экстрактами происходило с помощью метода диффузии в агаровой пластине. Влияние растительных экстрактов на рост LGG оценивали в микропланшетах (Extragen-96-луночный ELISA-планшет), рост бактерий определяли по оптической плотности (630 нм). Для оценки антиоксидантной активности применялся метод DPPH, который основан на способности антиоксидантов в образце связывать стабильный радикал DPPH. Определение фенольных соединений в растительном экстракте было с помощью ВЭЖХ-анализа, использовался прибор Agilent серии 1260.

Для внесения пробиотических микроорганизмов, ЭПС и растительных экстрактов в продукт было принято использовать их инкапсулированную форму.

Этот подход позволяет сохранить целостность пробиотических микроорганизмов, поскольку они упаковываются в защитную мембрану. Кроме того, инкапсуляция обеспечивает более эффективное производство и улучшает доставку биологически активных молекул, таких как антиоксиданты, пробиотики и ЭПС, в пищевые продукты. Целью инкапсуляции является поддержание стабильности биологически активных соединений во время обработки или хранения.

При внедрении в альгинатную матрицу некоторая часть клеток LGG могла быть потеряна или удалена с поверхности образованных капсул, что, вероятно, сказалось на общем КОЕ. Для оценки влияния этого процесса на число жизнеспособных микроорганизмов проводилось исследование эффективности инкапсуляции. Оценка выживаемости инкапсулированных пробиотических микроорганизмов анализировалась на модели in vitro в условиях желудочно -кишечного тракта.

Эти методы были использованы для достижения целей исследования и получения необходимых данных о свойствах и характеристиках ЭПС LGG.

Основные результаты экспериментальных исследований

ЭПС обладают пребиотическим действием, повышают выживаемость пробиотиков в агрессивной среде ЖКТ. В работе в качестве источников ЭПС использовались молочнокислые бактерии LGG. Параметры выделения и очистки показаны на рисунке 1.

Рисунок 1. Параметры синтеза и выделения ЭПС

Полученные после выделения и очистки ЭПС LGG представляли собой порошки светло-коричневого цвета, без запаха, не имеющие в своем составе клетки

бактерий (рисунок 2). Выход ЭПС LGG составил 0,45 г/л, что соответствует литературным данным, где выход ЭПС варьируется 0,155-1,15 г/л.

Рисунок 2 Образцы ЭПС LGG после лиофильной сушки

Исследование влияния температуры и рН на синтез ЭПС ЬСС

Одним из способов реакции на стрессовые факторы среды является выработка различных метаболитов, в частности ЭПС способствуют слипанию клеток, образованию агрегатов, в центре данных объектов условия окружающей среды являются более благоприятными. В работе посредством изменения оптимуму рН была исследована возможность идентификации синтеза ЭПС, что может способствовать увеличению выживаемости при температурном воздействии в условиях лиофильной сушки.

В результате исследования выживаемость LGG после лиофильной сушки при различных рН было установлено, что в кислой среде при рН 4 количество жизнеспособных микроорганизмов было почти в 1,5 раза выше.

Посев на чашки Петри показал (КОЕ):

Олиофилизации, рН4-"

Слиофилизации, рН7-" =35,5±1,4

В работе исследовали различные стрессовые факторы, чтобы повысить синтез ЭПС. Рассматривали влияние pH, предполагая, что негативные условия среды способствуют большему синтезу ЭПС и впоследствии большему выживанию при лиофильной сушке. Однако в процессе исследования обнаружили

обратную корреляцию выхода ЭПС и выживаемости при лиофильной сушке. Выживаемость после лиофильной сушки в подкисленной среде, была выше. Это может быть обусловлено иными факторами, возможно произошел гидролиз ЭПС. Результаты инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье

ИК-Фурье спектры ЭПС демонстрировали множество типичных пиков поглощения полисахаридов, как показано на рисунке 3. Были видны полосы примерно при 3293 см-1, 2923 см-1, 1733-1639 см-1, 1453-1200 см-1 и 1039 см-1 , которые являются общими для всех полисахаридов и представляют собой О -Н связь, С-Н связь групп С=О, СОО- и С-О-С, соответственно. Имеется широкий пик при 3293 см-1, который в основном вызван валентными колебаниями -ОН внутри и между молекулами полисахарида.

■1000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

_:сш-1 ■_

Рисунок 3. ИК-спектр ЭПС LGG

В районе 2923 появляется пик поглощения, который может быть связан с валентным колебанием насыщенного C-H. Есть пики около 1733 и 1639. Пики, появляющиеся в этих двух местах, соответственно относятся к карбонилу метилового эфира в полисахаридах. Валентное колебание основания C=O и асимметричное валентное колебание свободной карбоксильной группы -COO. Пик поглощения при 1453 может быть пиком симметричного валентного колебания C=O карбоксильной группы. Пики поглощения, находящиеся между 1453 и 1200 вызваны вибрацией CO. Причины этой вибрации включают C-O-H и гликозидную

связь С-О-С на сахарном кольце, а также С-О-Н и С-О-К карбоксильной группы галактуроновой кислоты. Пик при 1039 указывает на преобладание в -гликозидных связей.

Основываясь на результатах анализа ИК-Фурье спектроскопии, мы можем подтвердить, что ЭПС, полученный LGG в нашем исследовании, соответствует ранее опубликованным структурным исследованиям.

Результаты определения моносахаридного состава ЭПС ЬСС Моносахаридный состав ЭПС LGG определяли методом ионной хроматографии (рисунок 4), наибольшими значениями были галактоза (30,7 %) и глюкоза (34,6 %) (таблица 1). Жанг и др. инфицировали три пика ЭПС LGG как рамнозу, К-ацетил-Б-глюкозамин и галактозу.

Рисунок 4. Хроматограмма гидролизованного ЭПС ЬОО

Таблица 1. - Моносахаридный состав ЭПС ЬОО

Наименование Концентрация (%)

Галактозамина гидрохлорид 6,7

Рамноза 7,2

Арабиноза 1,8

Глюкозамина гидрохлорид 7,5

Галактоза 30,7

Глюкоза 34,6

Ксилоза 1,4

Манноза 10,1

Результаты морфологического исследования ЭПС ЬСС

Сканирующим электронным микроскоп (СЭМ) - инструмент для визуализации топографии поверхности таких материалов, как полимеры. Изображение СЭМ ЭПС LGG выявило шероховатую и неровную поверхность (рисунок 5), которая напоминала сообщенную морфологию ЭПС из Ь. delbrueckii 88р. Ьы^апст В3 и Ь. р1аШагпт ОБ2. При большем увеличении были видны дополнительные детали микроструктуры ЭПС, отличающейся разветвленностью и не линейным характером формирования пространственного каркаса (рисунок 5б).

а) б)

Рисунок 5. Микроизображения СЭМ ЭПС ЬОО

Оценка пребиотической активности ЭПС ЬСС

Пребиотики способствуют росту пробиотических микроорганизмов в кишечнике. Одним из механизмов действия пробиотиков является использования их в качестве субстрата, причем не пробиотические микроорганизмы не способны к их расщеплению. Для определения пребиотической активности ЭПС была исследована возможность использования его в качестве субстрата на обедненной простыми сахарами, где в качестве источника углерода были только полисахариды. Большая пробиотическая активность соединения, обуславливает более эффективное использование его пробиотическими микроорганизмами и менее способствовует росту патогенных микроорганизмов.

Рост МКБ был очень высоким для ЭПС и указывает на то, что он является альтернативным и превосходным источником пребиотиков. Утилизацию пребиотика пробиотиками дополнительно изучали с помощью подсчета жизнеспособных клеток. Количество клеток E.coli было очень низким по сравнению с другими субстратами, демонстрирующими селективную стимуляцию роста пробиотического организма. PAS полисахаридов показан на риснке 6. В этом исследовании PAS ЭПС оценивался как 0,1544. Потенциал стимуляции находится в следующем порядке: ЭПС > ксантан > альгинат. Полученный данные подтверждают неспособность молочнокислых бактерий расщеплять альгинаты, при этом известно, что альгиназы есть у других микроорганизмов, населяющих толстый кишечник человека, в частности, у бактероидов. Таким образом, альгинат может быть использован для инкапсулирования молочнокислых бактерий с сохранением их внутри капсул до достижения толстого отдела кишечника.

0,2 -,

о о

0,1 -

s £

го

о 0,0 ■

о <u т

-0,1

ю ф

Ci

£ -0,2 I

<u О

-0,3

ЭПС

Образцы

Рисунок 6. Результаты оценки пребиотической активности

ксантан

Подбор состава капсул с использованием ЭПС ЬСС. Определение структурно-механических характеристик полисахаридных гелей

Для оценки возможности формирования микрокапсул из исследуемых полисахаридов исследовались структурно-механические характеристики их гелей. Упругость приготовленных образцов определялась на одноколонной

универсальной испытательной машине. В качестве объектов исследования использовали плотные гели с ЭПС и коммерческими ПС. На рисунке 7 представлены полученные характеристики упругости исследуемых образцов, которые были рассчитаны на основе площадей соответствующих пиков. Гели из альгината натрия являлись наиболее плотными, отличающимися самой высокой силой гелей. Структурно-механические характеристики полисахаридных гелей оставались стабильными при частичной замене альгината натрия на ЭПС до 50 %, не претерпевая статистически значимых изменений. Гели остальных вариантов состава отличались во много раз более низкими структурно -механическими характеристиками.

2,0-| 1,8- "

1,6---

1,4— 1,2-X ,

га 1,0-

о 0,80,60,40,2- ^ _ 0,0^-1-Ц-1-1.1 , 1.1-1-Ц-1-1.1 , 1.1 1—1

1 2 3 4 5 6 7

Образцы

Рисунок 7. Результаты структурно-механических характеристик полисахаридных гелей

Получение растительного экстракта для внесения в состав фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием

экзополисахаридов

Анализ литературных данных показал, что пробиотики и полифенолы благоприятно влияют на здоровье кишечника. Более того, растительные

полифенолы приобретают статус новых пребиотиков благодаря их способности стимулировать рост полезной кишечной микробиоты, что, в свою очередь, увеличивает биодоступность полифенолов. Таким образом, растительные фенольные соединения отличаются от углеводных пребиотиков своей антиоксидантной активностью и синергическим эффектом с пробиотиками.

В качестве растительных объектов, содержащих наибольшее количество фенольных соединений были выбраны Camellia sinensis, Ziziphus spina-christi и Vaccinium oxycoccos. Из растительного сырья готовили водно-спиртовые экстракты (рисунок 8). Технология получения растительного экстракта представлена на рисунок 9.

ш : . •

Г2 < •

Рисунок 8. Образцы растительных экстрактов: 1-Camellia sinensis, 2-Ziziphus spina-christi, 3-Vaccinium oxycoccos

Растительный экстракт

I

Измельление сырья

Добавление к 10 г сырья 100 мл смеси этанол.'вода (50/50), Т=55=С, ультразвуковая мощность 20 кГц, 1=30 мин

;

Фильтрование раствора |

Выпаривание на роторном испарителе до 1/2 массы

Рисунок 9. Параметры получения растительного экстракта

Совместимость LGG с растительными экстрактами методом диффузии в агаровой пластине

Диффузионный метод на чашках с МРС агаром показал, что все протестированные растительные экстракты совместимы с LGG. Экспресс метод определения влияния растительных экстрактов на рост LGG

Влияние растительных экстрактов на рост LGG оценивали в полистироловых микропланшетах. Кривые роста при различных концентрациях растительных экстрактов показаны на рисунке 10. График показывает изменение оптической плотности при 630 нм в зависимости от времени культивирования. Все образцы показывают увеличение оптической плотности, что свидетельствует о росте культуры или увеличении концентрации вещества. Темп роста примерно одинаков для всех групп. После 12 ч наблюдается стационарная фаза, при этом опытные экстракты показывают немного более высокие значения по сравнению с контрольной группой без экстрактов. Это может указывать на то, что добавление растительных экстрактов имеет стимулирующий эффект на рост культуры.

1,8-

Контроль

Camellia sinensis Ziziphus spina-christi

0,2-

-Vaccinium oxycoccos

0,2-

-Vaccinium oxycoccos

1ч 2ч Зч 4ч 8ч 12 ч 30 ч 48 ч Время, ч

—,-,-1-,-1-,-1-,-1-,-1-,-1-,-1—

1ч 2ч Зч 4ч 8ч 12 ч 30 ч 48 ч

Время, ч

100%

75 %

50 % 25 %

Рисунок 10. Кривые роста ЬОО в зависимости от концентрации экстрактов

Результаты определение антиоксидантной активности

Результаты антиоксидантной активности полученных экстрактов показаны в таблице 2.

Полученные данные показывают число радикалов (%), которое осталось в растворе после взаимодействия с антиоксидантом, что показывает, что данные экстракты поглощают свободные радикалы в растворе, уменьшают окислительный стресс клеток, предотвращают свободнорадикальные каскадные реакции в организме. Для дальнейших исследований был выбран 2111ркш зрта-екпзИ.

Таблица 2. Антиоксидантная активность растительных экстрактов

№ Экстракты Ингибирование, %

1 СатеШа sinensis 68,4

2 Ziziphus spina-christi 41,6

3 Vaccinium oxycoccos 35,8

Определение фенольных соединений в растительном экстракте

Хроматограмма экстракта 21Х1ркт (рисунок 11) показала содержание пяти различных фенольных соединений, названных галловой кислотой (242,84 мкг/г), кофейной кислотой (9,75 мкг/мл), пирокатехолом (19,63 мкг/г), кумаровой

кислотой (11,92 мкг/г) и феруловой кислотой (16. 16 мкг/г) (таблица 3). Гафур и др. обнаружили, что рутин (15,88 мг/100 г) был основным фенольным соединением в метанольном экстракте Ziziphus, наряду с меньшим содержанием феруловой кислоты, хлорогеновой кислоты и п-гидроксибензойной кислоты.

Рисунок 11. Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений в водно-спиртовом экстракте, обработанном ультразвуком

Таблица 3. - Фенольные соединения, обнаруженные в ультразвуковом экстракте Ziziphus spina-christi

Производное/ соединение Концентрация (мкг/мл=мкг/22.5 мг) Концентрация (мкг/г)

Экстракция с помощью ультразвука

Галловая кислота 5.46 242.84

Кофейная кислота 0.22 9.75

Пирокатехол 0.44 19.63

Кумаровая кислота 0.27 11.92

Феруловая кислота 0.36 16.16

Технологическая схема производства инкапсулированного фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием

экзополисахаридов

Технологическая схема производства инкапсулированного фитосинбиотического функционального ингредиента с использованием ЭПС показана на рисунке 12 и включает несколько ключевых этапов:

1. Культивирование ЬОО;

2. Выделение и чистка ЭПС;

3. Получение растительного экстракта;

4. Инкапсулирование

Рисунок 12. Технологическая схема производства функционального

ингредиента

Полученные капсулы показаны на рисунке 13.

2 3 4 5 6 7

lllllll

Рисунок 13. Капсулы полученного функционального ингредиента

Форма полученных капсул округлая, неровная, часто напоминающая форму капли, поверхность шероховатая ввиду наличия пор на поверхности капсул из альгината натрия, характерных для экструзии эмульсии. Микрокапсулы склонны к образованию небольших легко разделяемых агломератов (рисунок 14).

Рисунок 14. Микрокапсулы полученного функционального пищевого ингредиента (цифровой микроскоп)

Анализ изображений поверхности капсул, полученных с помощью СЭМ, показал отсутствие бактериальных клеток на поверхности капсул и их равномерную структуру из альгината кальция (рисунок 15).

Рисунок 15. Изображение СЭМ полученных капсул

В составе продукта капсулы не изменяют вкуса и не придают ему дополнительного аромата, их вкусо-ароматические свойства оцениваются, как нейтральные.

Оценка эффективности инкапсулирования

При встраивании в альгинатную матрицу некоторые клетки LGG могли погибнуть или быть удалены с поверхности капсулы, что могло повлиять на количество жизнеспособных микроорганизмов. Для оценки этого эффекта была проведена проверка эффективности инкапсулирования, получены результаты, представленные в таблице 4.

Таблица 4 - Эффективность инкапсулирования культуры £00

Штамм микроорганизмов Размер микрокапсул, мкм Количество жизнеспособных микроорганизмов до инкапсулировани я, КОЕ/г Количество жизнеспособных микроорганизмо в после инкапсулирован ия, КОЕ/г Эффективность инкапсулирования, %

ьаа 1500±100 мкм (1,0±0,1)х1013 (9,6±0,5)х1012 95,5±4,4

Процент эффективности инкапсулирования составил 95,5±4,4 %. Таким образом, эффективность инкапсулирования в соответствии с предложенным протоколом была признана высокой и удовлетворяющей потребностям создания инкапсулированных форм пробиотических микроорганизмов.

Чтобы обеспечить пробиотический эффект необходимо внести 2,9 г ингредиента в продукт чтобы тот считался функциональным. Состав полученных капсул представлен в таблице 5.

Таблица 5. - Состав полученных капсул

Компоненты Общее количество в 100 г капсулы

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Курбонова Маликахон Комилжоновна, 2024 год

Литература

1 Pereira Р.М.С.С., Vicente A.F.R.B. Meat nutritional composition and nutritive role in the human diet // Meat Sci. 2013. V. 93. № 3. P. 586-592. doi: 10.1016/j.meatsci.2012.09.018

2 Ahmad R.S., hnran A., Hussain M B. Nutritional Composition of Meat // Meat Science and Nutrition. hitechOpen. 2018. P. 61-77.

3 Zhou G„ Zhang W„ Xu X. China's meat industry revolution: Challenges and opportunities for the future // Meat Sci. Elsevier. 2012. V. 92. № 3. P. 188-196. doi: 10.1016/j.meatsci.2012.04.016

4 Bonny S.P.F., Gardner G.E., Pethick D.W., Hocquette J.F. Artificial meat and the future of the meat industry // Anim. Prod. Sei. CSIRO, 2017. V. 57. № 11. P. 2216-2223. doi:10.1071/AN17307

5 Lynch S.A., Mullen A.M., O'Neill E., Drammond L. et al. Opportunities and perspectives for utilisation of co-products in the meat industry // Meat Sei. 2018. V. 144. P. 62-73. doi: 10.1016/j.meatsci.2018.06.019

6 Ng Q.X., Soh A.Y.S.. Loke W., Lim D.Y. et al. The role of inflammation in imtable bowel syndrome (IBS) // Journal of inflammation research. 2018. V. 11. P. 345-349. doi: 10.2147/JIR.S174982

7 Holtmann G. J., Ford A.C., Talley N J. Pathophysiology of irritable bowel syndrome // The lancet Gastroenterology & hepatology. 2016. V. 1.№2.P. 133-146. doi: 10.1016/S2468-1253(16)30023-1

8 Liu Y., TranD.Q., Rhoads J.M. Probiotics in Disease Prevention and Treatment // J. Clin. Pharmacol. 2018. V. 58. № S10. P. S164-S179. doi: 10.1002/jcph.ll21

9 Chua K.J. et al. Designer probiotics for the prevention and treatment of human diseases // Cuirent Opinion in Chemical Biology. 2017. V. 40. P. 8-1 б" doi: 10.1016/j.cbpa.2017.04.011

10 Wang Y. et al. Probiotics for prevention and treatment of respiratory tract infections in children: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials// Medicine (Baltimore). 2016. V. 95. № 31.

11 King S., Tancredi D., Lenoir-Wijnkoop I., Gould K. et al. Does probiotic consumption reduce antibiotic utilization for common acute infections? A systematic review and meta-analysis // European journal of public health. 2019. V. 29. № 3. P. 494^199. doi: 10.1093/eurpub/ckyl85

12 Olaimat A.N., Aolymat I., Al-Holy M., Ayyash M. et al. The potential application of probiotics and prebiotics for the prevention and treatment of COMD-19//npj Science of Food. 2020. V. 4. № 1. P. 1-7. doi: 10.1038/s41538-020-00078-9

13 Misra S., Pandey P.. Mishra H.N. Novel approaches for co-encapsulation of probiotic bacteria with bioactive compounds, their health benefits and functional food product development: A review // Trends in Food Science & Technology. 2021. V. 109. P. 340-351. doi: 10.1016/j.tifs.2021.01.039

14 Davis В.. Lockwood A.. Alcott P., Pantelidis I.S. Food and Beverage Management. Routledge, 2018. 404 p.

15 ГОСТ 32951-2014. Полуфабрикаты мясные и мясосодержапше. Общие технические условия. М.: Стандартпнформ, 2014. 20 с.

16 Chavarri М. et al. Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions // Int. J. Food Microbiol. 2010. V. 142. № 1-2. P. 185-189. doi: 10.1016 j.ijfoodmicro.2010.06.022

17 Erdogdu S.B., Erdogdu F., EkizH.I. Influence of Sodium Tripolyphosphate (stp) treatment and cooking time on cook losses and textural properties of red meats // J. Food Process Eng. 2007. V. 30. X? 6. P. 685-700. doi: 10.1111/j. 1745-4530.2007.00139.x

18 Jia Z.H., Guo Z.H., Wang W., Yi S.M. et al. Effect of compound phosphate on the water-holding capacity and nutritional quality of sea bass (Lateolabrax japonicus) fillets // Journal of Food Processing and Preservation. 2022. V. 46. № 6. P. el6511. doi: 10.1111/jfpp. 16511

19 Астафьева Б.В.. Бабииаев K.A., Курбонова M.K., Тютьков Н. и др. Исследование термостабильности функционального пробиотпческого пищевого ингредиента на основе инкапсулированных микроорганизмов Lactobacillus plantanmi SP-A3 // Вестник Международной академт1 холода. 2022. № 2. С. 42-47.

20 Речкнна Е.А.. Губаненко Г.А.. Рубчевская Л.П.. Машанов А.И. Исследование и разработка мясных рубленых полуфабрикатов // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. 2015. №. 8. С. 133-137.

References

1 Pereira Р.М.С.С., Vicente A.F.RB. Meat nutritional composition and nutritive role in the human diet. Meat Sei. 2013. vol. 93. no. 3. pp. 586-592. doi: 10.1016/j.meatsci.2012.09.018

2 Ahmad R.S., Imran A., Hussain M B. Nutritional Composition of Meat. Meat Science and Nutrition. IntechOpen. 2018. pp. 61-77.

3 Zhou G., Zhang W„ Xu X. China's meat industry revolution: Challenges and opportunities for the future. Meat Sei. Elsevier. 2012. vol. 92. no. 3. pp. 188-196. doi: 10.1016/j.meatsci.2012.04.016

4 Boimy S.P.F.. Gardner G.E.. Pethick D.W., Hocquette J.F. Artificial meat and the future of the meat industry. Anim. Prod. Sei. CSIRO, 2017. vol. 57. no. 11. pp. 2216-2223. doi:10.1071/AN17307

5 Lynch S.A., Mullen A.M, O'Neill E., Dnimmond L. et al. Opportunities and perspectives for utilisation of co-products in the meat industry. Meat Sei. 2018. vol. 144. pp. 62-73. doi: 10.1016/j.meatsci.2018.06.019

6 Ng Q.X.. Soh A.Y.S., Loke W., Lim D.Y. et al. The role of inflammation in imtable bowel syndrome (IBS). Journal of inflammation research. 2018. vol. 11. pp. 345-349. doi: 10.2147/nR.S174982

7 Holtmann G.J.. Fold A.C., Talley N.J. Pathophysiology of irritable bowel syndrome. The lancet Gastroenterology & hepatology. 2016. vol. 1. no. 2. pp. 133-146. doi: 10.1016/S2468-1253(16)30023-1

8 Liu Y., Tran D.Q., Rhoads J.M. Probiotics in Disease Prevention and Treatment. J. Clin. Pharmacol. 2018. vol. 58. no. S10. pp. S164-S179. doi: 10.1002/jcph.l 121

9 Chua K.J. et al. Designer probiotics for the prevention and treatment of human diseases. Current Opinion in Chemical Biology. 2017. vol. 40. pp. 8-16. doi: 10.1016/j.cbpa.2017.04.011

10 Wang Y. et al. Probiotics for prevention and treatment of respiratory tract infections in children: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Medicine (Baltimore). 2016. vol. 95. no. 31.

11 King S.. Tancredi D., Lenoir-Wijnkoop I., Gould K. et al. Does probiotic consumption reduce antibiotic utilization for common acute infections? A systematic review and meta-analysis. European journal of public health. 2019. vol. 29. no. 3. pp. 494^199. doi: 10.1093/eurpub/ckyl85

12 Olaimat A.N., Aolymat I.. Al-Holy M., Ayyash M. et al. The potential application of probiotics and prebiotics for the prevention and treatment of COMD-19. npj Science of Food. 2020. vol. 4. no. 1. pp. 1-7. doi: 10.1038/s41538-020-00078-9

ljMisra S., Pandey P., Mishra H.N. Novel approaches for co-encapsulation of probiotic bacteria with bioactive compounds, their health benefits and functional food product development: A review. Trends in Food Science & Technology. 2021. vol. 109. pp. 340-351. doi: 10.1016/j.tifs.2021.01.039

14Davis В., Lockwood A., Alcott P.. Pantelidis I.S. Food and Beverage Management. Routledge, 2018. 404 p.

15GOST 32951-2014. Semi-finished products meat and meat-containing. General specifications. Moscow, Standartinfonn, 2014. 20 p. (in Russian).

16 Châvarri M. et al. Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions. Int J. Food Microbiol. 2010. vol. 142. no. 1-2. pp. 185-189. doi: 10.1016j.ijfoodmicro.2010.06.022

17 Erdogdu S.B., ErdogduF., Ekiz H.I. Influence of Sodium Tripolyphosphate (stp) treatment and cooking time on cook losses and textural properties of red meats. J. Food Process Eng. 2007. vol. 30. no. 6. pp. 685-700. doi: 10.1111/j.l745-4530.2007.00139.x

18 Jia Z.H., Giro Z.H., Wang W., Yi S.M. et al. Effect of compound phosphate on the water-holding capacity and nutritional quality of sea bass (Lateolabrax japonicus) fillets. Journal of Food Processing and Preservation. 2022. vol. 46. no. 6. pp. el6511. doi: 10.1111/jfpp.l6511

lOAstafieva B.V., Babintsev K.A., Kurbonova M.K., Tyutkov N. et al. Study of the thennal stability of a functional probiotic food ingredient based on encapsulated microorganisms Lactobacillus plantamm SP-A3. Bulletin of the International Academy of Cold. 2022. no. 2. pp. 42-17. (in Russian).

20Rechkina E.A., Gubanenko G.A., Rubchevskaya L P., Mashanov A.I. Research and development of meat chopped semi-finished products. Bulletin of the Krasnoyarsk State Agrarian University. 2015. no. 8. pp. 133-137. (in Russian).

Сведения об авторах Бажена В. Астафьева аспирант, инженер, факультет биотехнологий, Университет ПТМО, ул. Ломоносова. 9. Санкт-Петербург, 191002. Россия, [e-mail] <ВЬ«р8://огс1Й. О1^0000-0002-8850-5710 Кирилл А. Бабиниев магистрант, инженер, факультет биотехнологий. Университет ПТМО. ул. Ломоносова. 9, Санкт-Петербург, 191002. Россия, [e-mail] ©https://orcid.org/0000-0003-2416-052X Маликахон К. Курбонова аспирант, ннженер, факультет биотехнологий. Университет ПТМО, ул. Ломоносова. 9. Санкт-Петербург. 191002. Россия, [e-mail] 5Ьйр5://огс1йог^0000-0003-47б4-1879 Никита Тютьков аспирант, инженер, факультет биотехнологий Университет ПТМО, ул. Ломоносова, 9, Санкт-Петербург, 191002, Россия, [e-mail] «¿ЪПрзУЛжМог^'ОО00-0002-7394-7524 Денис А. Бараненко к.т.н., доцент, факультет биотехнологий. Университет ПТМО, ул. Ломоносова, 9, Санкт-Петербург. 191002. Россия, [e-mail] https://orcid.org/0000-0002-9284-4379

Вклал авторов

Бажена В. Астафьева разработала функциональный продукт, проводила эксперименты, написала рукопись Кирилл А. Бабинцев обзор литературных источников по исследуемой проблеме, провёл эксперимент, выполнил расчёты Маликахон К. Курбонова консультация в ходе исследования, корректировка текста рукописи

Никита Тютьков написал рукопись, корректировал её до подачи в редакцию и несёт ответственность за плагиат Денис А. Бараненко обозначил проблематику, консультировал по выполнению и интерпретации данных эксперимента, отредактировал рукопись

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Information about authors Bazhena V. Astafleva postgraduate student, engineer, faculty of biotechnology, ITMO University, Lomonosova St., 9, Saint-Petersburg. 191002. Russia, [e-mail]

'https://orcid.org;0000-0002-8850-5710 Kirill A. Babintsev master student, engineer, faculty of biotechnology, ITMO University, Lomonosova St., 9. Saint-Petersburg. 191002. Russia, kirikbv@bkru

'https://orcid.org 0000-0003-2416-052X Malikakhon K. Kurbonova postgraduate student, engineer, faculty of biotechnology, ITMO University, Lomonosova st„ 9. Saint-Petersburg. 191002. Russia, [e-mail]

Shttps://orcid. or g'0000-0003-4764-1879 Nikita Tyutkov postgraduate student, engineer, faculty of biotechnology, ITMO University, Lomonosova St., 9, Saint-Petersburg. 191002. Russia, [e-mail] ©https://orcid.org/0000-0002-7394-7524 Denis A. Baianenko Cand. Sci. (Engin.). associate professor, faculty of biotechnology, ITMO University, Lomonosova St., 9. Saint-Petersburg, 191002. Russia, [e-mail] >https://orcid.org'0000-0002-9284-4379

Contribution

Bazhena V. Astafieva developed a functional product, conducted experiments, wrote the manuscript

Kirill A. Babintsev review of the literature on an investigated problem, conducted an experiment, performed computations Malikakhon K. Kiirbouova consultation during the study, correction of the manuscript text

Nikita Tyutkov wrote the manuscript, correct it before filing in editing and is responsible for plagiarism

Denis A. Baranenko outlined the problem, advised on die implementation and interpretation of experimental data, edited the manuscript

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Поступила 05/07/2022 После редакции 29/07/2022 Принята в печать 17/08/2022

Received 05/07/2022 Accepted in revised 29/07/2022 Accepted 17/08/2022